ES2352171T3 - Procedimiento para la evaluación y la monitorización de la variabilidad genética de especies vegetales. - Google Patents
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Abstract
Secuencias oligonucleotídicas 5'-TCTGGTGCTGGTAACTGG-3' (TubB16sp./fw) y 5'-GAGAATGTCAGCATCATGCG-3' (TubB16sp./rev) que pueden asociarse con la secuencia génica de la b-tubulina de plantas.
Description
Procedimiento para la evaluación y la
monitorización de la variabilidad genética de especies
vegetales.
La presente invención se refiere a cebadores
para la evaluación y la monitorización de la variabilidad genética
de especies vegetales la monitorización de variabilidad genética de
especies vegetales.
La presente invención también se refiere a un
kit para reconocer las diferentes variedades de especies
vegetales.
El desarrollo de sistemas eficaces, sencillos y
rigurosos para la monitorización de la variabilidad genética que
existe entre las diferentes especies vegetales, por ejemplo, entre
plantas cultivadas y plantas silvestres presentes dentro del
territorio, es uno de los objetivos más importantes de la
agrobiología moderna. De hecho, se desea proporcionar un
instrumento eficaz para el reconocimiento y la tipificación de las
variedades de vegetales cultivadas que tienen un interés económico,
con el fin de proteger su identidad, salvaguardarlas frente a
posibles problemas de contaminación y fraude y también con el fin de
seguir el desarrollo de programas de cruzamiento genético. De
hecho, dada la extrema sofisticación de la demanda y la oferta del
mercado agroalimentario, se requieren controles cada vez más
rigurosos para proteger las variedades comercializadas. Además, al
utilizar los sistemas anteriores, es posible establecer un modelo
experimental que permita la monitorización de las especies
vegetales cultivadas y silvestres que existen dentro de un
territorio determinado, con el fin de protegerlas frente al peligro
de la extinción o la erosión genética.
El problema de la conservación de la
biodiversidad tal como se define internacionalmente por el Convenio
de Río de Janeiro (1992) se ha convertido en uno de los principales
argumentos presentados a la atención de la opinión pública en todo
el mundo, ya que en una fase caracterizada por una excesiva
uniformidad de cultivos, es necesario conservar aquellos genes,
genotipos y reservas genéticas que son potencialmente útiles en
procedimientos de producción que pueden lograrse mediante métodos
tradicionales de mejora genética o métodos de innovación tales como
los biotecnológicos. Las propias normas emitidas por la Unión
Europea, sensibles a la protección de productos típicos de
tradiciones populares y medioambientales, pueden acelerar (si se
utilizan adecuadamente por las regiones en colaboración con
institutos de investigación y asociaciones de agricultores) el logro
de los objetivos dirigidos a detener el proceso de erosión genética
en las áreas más interesantes, obteniendo al mismo tiempo la
valorización de productos minoritarios, con la posibilidad de
estimular los nuevos procedimientos de diversificación de las
especies utilizadas. Por tanto, la monitorización y la determinación
de la variabilidad genética que existe entre organismos vegetales
son objetos estrictamente asociados con el desarrollo de una
agricultura competitiva y con visión de futuro.
El problema de la evaluación de la variabilidad
genética que existe entre las plantas cultivadas y silvestres de
una manera fiable y rápida se siente profundamente. La genética
molecular es en la actualidad la disciplina más adecuada para
satisfacer tal necesidad, mediante los procedimientos de diagnóstico
de ADN. Debido a su propia naturaleza, la variabilidad genética
está intrínsecamente unida a los polimorfismos presentes en la
molécula de ADN que, sin embargo, deben identificarse correctamente
y asociarse unívocamente con una especie vegetal determinada y
también con características específicas de relevancia agroeconómica
de la planta que está examinándose.
Los métodos genéticos moleculares son rápidos,
dúctiles y fiables, y el análisis de diagnóstico de ADN ha
encontrado grandes campos de aplicación en la ciencia médica así
como la forense.
La genética molecular ofrece en la actualidad
tres soluciones principales para el problema de la monitorización
de la variabilidad genética en las especies vegetales, los
procedimientos aplicados se indican con las siguientes
abreviaturas: RFLP (polimorfismos de longitud de fragmento de
restricción), RADP (ampliación al azar de ADN polimórfico), MRP
(polimorfismos de repetición de microsatélites).
La técnica de RFLP usa un procedimiento para la
identificación de polimorfismos de ADN mediante métodos de
transferencia de los mismos sobre soportes de nailon y la
hibridación molecular posterior. La técnica es eficaz si se tiene
un gran número de sondas moleculares y se desea construir con ellas
mapas genéticos enteros. Si esto se adopta teniendo el único
objetivo de identificar la variabilidad genética, la técnica es
laboriosa y requiere el uso de una gran cantidad de ADN genómico,
no puede automatizarse y también requiere el marcaje radioactivo de
las sondas. La técnica de RAPD y sus variantes
(AP-PCR, DAF) son técnicas de bajo coste, muy
rápidas que necesitan poco ADN genómico y ninguna sonda radioactiva.
Sin embargo, estas técnicas tienen un riesgo bastante alto de no
reproducibilidad que produce pruebas de posibles polimorfismos que a
menudo, si no siempre, carecen de cualquier característica de
interés agrónomo. Esto sustancialmente es una mera ampliación de
regiones no conocidas y aleatorias de ADN genómico.
La técnica de MRP se basa en la ampliación de
las regiones que contienen secuencias de ADN repetidas que tiene un
alto contenido de dinucleótidos específicos (por ejemplo, AT).
También en este caso, el análisis es rápido y no requiere el uso de
compuestos radioactivos o grandes cantidades de ADN genómico. Sin
embargo, la identificación de los productos ampliados puede ser
laboriosa, ya que es necesario reemplazar el gel de agarosa por un
gel de acrilamida, y es poco informativa dado que las secuencias
repetidas en el genoma no siempre se dispersan o están ubicadas
cerca de genes que son importantes para la planta. Además esta
técnica así como el RFLP parecen ser más adecuadas para la
construcción de mapas genéticos que para el análisis puro y sencillo
de la existencia de variabilidad genética.
Koga-Ban et al. (DNA
Resaerch, 1995, 2, 21-26) dan a conocer una
comparación entre secuencias de ADNc que se derivan de tres tipos
de b-tubulinas de arroz. El objetivo del estudio es
identificar la resistencia a una enfermedad específica de la planta
con el fin de modificar genéticamente plantas no resistentes
similares para hacer que también sean resistentes a la
enfermedad.
Breviario et al. (Plant Physiology, 1995,
108 (2), 823-4) dan a conocer la caracterización de
la familia del gen de b-tubulina de arroz mediante
la evaluación de los ADNc correspondientes.
El objeto de la presente invención es
proporcionar cebadores según las reivindicaciones 1 y 2 para la
evaluación y la monitorización de la variabilidad genética de
especies vegetales tales como para permitir establecer un índice de
diversidad entre las especies cultivadas de importancia
agrónoma.
Otro objeto de la invención es proporcionar
dichos cebadores para la evaluación y la monitorización de la
variabilidad genética de especies vegetales tale como para permitir
el reconocimiento de contaminaciones de variedades y/o infestación
y de especies que resisten de manera natural a agentes patógenos o
al estrés ambiental. Otro objeto de la invención es proporcionar
dichos cebadores para la evaluación y la monitorización de la
variabilidad genética de especies vegetales que pueden utilizarse
para el desarrollo de nuevos programas de cruzamiento genético y
remezcla de caracteres.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar dichos cebadores para la evaluación y la monitorización
de la variabilidad genética de especies vegetales que pueden
asociarse a programas con la intención de mantener la biodiversidad
natural típica de un territorio o nicho ecológico.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar dichos cebadores para la evaluación y la monitorización
de la variabilidad genética de especies vegetales que es rápida,
económica, precisa y ampliamente aplicable.
Todavía un objeto adicional de la invención es
proporcionar un kit para el reconocimiento de la variabilidad
genética de especies vegetales tal como para permitir efectuar una
evaluación rápida, fiable y económica de la variedad.
Estos y todavía otros objetos y ventajas
relacionadas que se aclararán mejor mediante la siguiente
descripción se logran con los cebadores y el kit para la
determinación y la monitorización de la variabilidad genética de
especies vegetales que comprende el estudio de polimorfismos
genéticos en tubulinas de plantas.
En particular, se usan los cebadores en un
procedimiento basado en la realización de un análisis molecular tal
como para permitir proporcionar pruebas de la presencia de
polimorfismos genéticos asociados, a su vez, con la presencia de
isoformas de \beta-tubulina que son específicas
para determinadas variedades vegetales. Dicho procedimiento emplea
la familia génica de las \beta-tubulinas de
plantas como una fuente natural de la variabilidad genética.
El procedimiento representa un nuevo sistema
molecular genético que combina la ductilidad del sistema RAPD con
la precisión del sistema RFLP, se indica con la abreviatura TBP
(polimorfismos basados en tubulina) y se basa en la existencia,
extendida a todas las plantas, de formas polimórficas naturales de
\beta-tubulina, una proteína codificada por
diferentes componentes de una misma familia multigénica.
El procedimiento ha demostrado ser rápido,
económico, preciso y ampliamente aplicable.
Dicho sistema está asociado con la investigación
mediante PCR (reacciones en cadena de la ADN polimerasa) que es
altamente eficaz siempre que se identifiquen secuencias importantes
y por tanto mantenidas en el interior de los genomas vegetales.
Estas secuencias génicas deben ser caracterizables por la presencia
de zonas ampliamente conservadas intercaladas con zonas de alta
variabilidad. Las primeras actúan como secuencias diana para la
construcción de secuencias de cebadores que activan la reacción de
PCR, mientras que las últimas actúan como fuente de variabilidad.
Según la presente invención, se encontró que la familia génica de
\beta-tubulina de plantas era un sistema
excelente para examinar y aplicar la estrategia ilustrada. La
familia génica es de pequeño tamaño en número y en su interior
pueden identificarse diferentes isotipos. La diferencia entre los
isotipos se restringe en zonas génicas bien definidas, dado que no
puede manifestarse en otra parte debido a las numerosas funciones
desarrolladas por las tubulinas que son esenciales para la célula.
Por tanto, las \beta-tubulinas son secuencias
genómicas precisas que también contienen elementos polimórficos de
variabilidad que pueden identificarse. Las secuencias de ADN no son
al azar y representan moléculas que son absolutamente necesarias
para la germinación, el crecimiento y desarrollo de la planta.
Las características del procedimiento de TBP son
tales como para hacer que sea aplicable a todas las especies
vegetales de importancia agroeconómica o ecológica, siempre que
contengan un número suficiente, desde 5 hacia arriba, de genes que
codifican \beta-tubulinas, cuyo requisito se
satisface en gran medida en todas las plantas superiores
estudiadas. El procedimiento se basa en la capacidad de presentar,
mediante reacciones de PCR, la diferencia nucleotídica que existe
en las zonas hipervariables de las secuencias que codifican
\beta-tubulinas, incluyendo también secuencias de
intrones y secuencias de las zonas promotoras. Las secuencias
altamente conservadas adyacentes a cada una de estas zonas
hipervariables también actúan como puntos de activación de la
reacción de PCR. La evaluación del resultado y la verificación
correspondiente de la diversidad genética tiene lugar mediante un
análisis en gel de agarosa de los productos de PCR.
El procedimiento anterior ha permitido obviar
los principales problemas de los procedimientos de la técnica
conocida, es decir la complicación de los procedimientos, el uso de
grandes cantidades de ADN que va a utilizarse para cada evaluación
individual, la duración excesiva del análisis, el uso de sondas
radioactivas, los altos costes para obtener las sondas e iniciar la
configuración, la no reproducibilidad de los resultados, la
disociación de los parámetros de importancia agroeconómica. El
procedimiento tiene las siguientes ventajas: permite realizar
análisis rápidos, reproducibles y sencillos y que pueden extenderse
para incluir todas las especies vegetales; es económico, requiere
el empleo de una baja cantidad de ADN (aproximadamente 10 ng para
cada análisis) y no requiere compuestos radioactivos; permite la
asociación de los resultados con parámetros que son de relevancia
desde un punto de vista agrobiológico, tales como por ejemplo, el
crecimiento y el desarrollo de la planta.
En particular, el procedimiento se ha diseñado y
configurado para el análisis de aproximadamente una docena de
variedades cultivadas de arroz. La elección del arroz como especie
vegetal modelo se basa en que se caracteriza por su genoma de
tamaño pequeño, la presencia de un bajo porcentaje de secuencias
repetidas y la presencia de al menos 8/9 de secuencias del genoma
que codifican para \beta-tubulinas que pueden
explotarse como una fuente de variabilidad. Además, desde un punto
de vista agroeconómico, el arroz es un cereal de amplio consumo, el
65% de la producción de arroz europea procede de Italia, y el valor
de la producción de arroz puede estimarse entre 600 y 1000 billones
de liras/año. Los experimentos de control llevados a cabo tanto en
maíz como en arroz han demostrado la fiabilidad del procedimiento,
ya que en ambos casos era posible, operando según las
especificaciones experimentales, ampliar la secuencia deseada y
específica para esa isoforma de tubulina determinada. Cuando se
lleva a cabo el experimento para permitir la ampliación de varias
bandas (índice de polimorfismo supuesto en la organización de genes
de tubulina de arroz) se obtienen diferentes imágenes de ampliación
según la variedad de arroz analizado. En algunos casos también se
verificó la identidad de las bandas ampliadas mediante la
secuenciación nucleotídica que confirmó que se trataba de diferentes
secuencias asociadas con diferentes isoformas de
\beta-tubulina. Con el fin de utilizar el sistema
para la identificación de posibles contaminantes en lotes de
semillas de una determinada variedad, también se llevaron a cabo
experimentos de combinación artificial de ADN genómico procedente
de dos variedades de arroz diferentes. El procedimiento de TBP ha
permitido identificar la contaminación.
Ventajosamente, el procedimiento de TBP anterior
también se realiza empleando como material el ADN extraído de
variedades de arroz cultivadas y de infestación, por ejemplo
cariopses de arroz. De hecho, tal como se mencionó, se emplea arroz
como un modelo para estudios y evaluaciones adicionales en el
sistema de análisis de polimorfismos, tales como por ejemplo el uso
de pares de oligonucleótidos nuevos y diferentes; el uso como
secuencias diana de otras zonas de hipervariabilidad presentes en
las secuencias genómicas de \beta-tubulinas, y
tales como para actuar como secuencias diana adecuadas; la mejora de
algunos parámetros técnicos de la reacción de PCR. El procedimiento
también puede realizarse ventajosamente con otras variedades de
arroz así como de maíz y trigo, plantas que son de un notable
interés económico y cuya organización genómica es muy similar al
arroz tomado, tal como se mencionó, como modelo experimental. El
procedimiento anterior puede emplearse ventajosamente para la
determinación y la monitorización de la variabilidad genética de
plantas cultivadas importantes tales como plantas hortícolas y
forestales, así como para tipificar algunas variedades silvestres,
de infestación y nativas.
Siempre según la invención, es posible realizar
un kit para el reconocimiento de la diversidad genética existente
entre especies vegetales cultivadas, basándose en cebadores objeto
de la invención, que puede utilizarse en arroz y cereales y otras
plantas de interés agrícola, desde las hortícolas hasta las
forestales. Por ejemplo, el kit puede usarse ventajosamente para la
monitorización de las variedades vegetales que existen dentro de un
territorio determinado, con el fin de proteger la riqueza
naturalística y la biodiversidad natural.
Tal como se ha dicho, el kit según la invención
produce pruebas de la diversidad existente entre las variedades
vegetales de la misma planta, la explotación de la heterogeneidad
molecular que está presente en los genes que codifican la
\beta-tubulina, una proteína que es esencial para
la vida, el crecimiento y el desarrollo de la planta. Las
principales características que se explotan son dos. En cada planta,
la \beta-tubulina se codifica por un determinado
número de genes y no un único gen, lo que es una primera fuente de
variabilidad. En cada gen que codifica
\beta-tubulinas, se pueden reconocer secuencias
nucleotídicas conservadas y secuencias variables y las últimas son
la segunda fuente de variabilidad. En resumen, el kit según la
presente invención está compuesto de una fuente de variabilidad
representada por el ADN genómico extraído de la planta, dos
secuencias oligonucleotídicas (cebadores) que pueden asociarse a
las secuencias del gen de \beta-tubulina cercanas
a la zonas de variabilidad, una reacción enzimática que puede
ampliar la secuencia de ADN contenida entre los cebadores, un gel
de agarosa mediante el cual es posible señalar las bandas de ADN
ampliado, posiblemente diferentes para las diferentes variedades
analizadas.
A continuación se notifican algunos ejemplos de
realización práctica a modo de ejemplo no limitativo de la presente
invención.
Puede extraerse ADN genómico de cualquier tejido
de la planta. Los resultados se notifican basándose en la extracción
del ADN de coleóptilos de arroz.
El protocolo de extracción incluye pulverización
en frío (en presencia de nitrógeno líquido) de 1 g de coleóptidos y
la transferencia posterior del polvo en un tubo que contiene 6 ml de
un tampón de extracción compuesto tal como sigue: urea al 48%,
cloruro de sodio 0,35 M, Tris-HCl 0,05 M pH 7,5,
EDTA 0,02 M pH 8, sarcosil al 2%, ARNasa 100 mg/ml. Tras la
disolución del polvo en el tampón, se extrae el ADN con una mezcla
de fenol/cloroformo (25 partes de fenol/24 partes de cloroformo/1
parte de alcohol isoamílico), ajustada previamente a pH 8 con
Tris-HCl. La extracción se siguió por centrifugación
a 3000 r durante 10 min., lo que permite que la separación de la
fase acuosa que contiene ADN de la orgánica. Se transfiere la fase
acuosa a un vaso de precipitados pequeño y se precipita por
percolación el ADN con alcohol etílico absoluto frío. Se recoge
literalmente el ADN en los extremos de varillas de vidrio de la
misma forma que con una pequeña bola de lana (técnica de
enrollado).
Habiéndose secado al aire durante un corto
periodo de tiempo, se resuspende el ADN en agua bidestilada y se
lleva su concentración hasta 1 mg/ul. Estas reservas de ADN,
obtenidas de cada variedad, se conservan entonces a -20ºC hasta su
utilización.
\vskip1.000000\baselineskip
En el kit desarrollado hasta ahora, se hace que
la activación coincida con las secuencias nucleotídicas próximas al
codón 132-1 de los genes que codifican
\beta-tubulina, que reconocen en este punto la
aparición de una posible variabilidad, asociada a la presencia
constante en todas las plantas analizadas hasta ahora de un intrón o
secuencia no codificante. En la actualidad, se han desarrollado dos
tipos de pares de cebadores.
El primer par está compuesto de dos secuencias,
una en el sentido de 5' (Tub16sp./fw) y una en el sentido de 3'
(Tubl6sp./rev) del codón 132-1 de un gen específico
de la familia de \beta-tubulinas de arroz (isotipo
TubB16, clonado por los inventores). Este par de cebadores permite
la ampliación de la secuencia nucleotídica hipervariable específica
para el gen TubB16.
Las secuencias de cebadores son:
- ubB16sp./fw:
- 5'-TCTGGTGCTGGTAACTGG-3'
- TubB16sp./rev:
- 5'-GAGAATGTCAGCATCATGCG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
El segundo par está compuesto de secuencias que
siempre están en el sentido de 5' (BTKd1-fw) y el
sentido de 3' (BTKd1-rev) del codón
132-1, pero pueden, en virtud de un pequeño cambio
de base, provocar la aparición de una imagen de variabilidad que ya
no es específica sólo para el gen TubB16.
En este caso las secuencias son:
- BTKd1-fw:
- 5'AGGCTGAGAACTGCGACTGC-3'
- BTKd1-rev:
- 5'GAGAATGTGAGCATCATGCG-3'
\vskip1.000000\baselineskip
Todas las secuencias de los cebadores se
conservan como disoluciones madre a -20ºC y a la concentración de 2
mg/ul.
\vskip1.000000\baselineskip
Mezcla de desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP,
TTP) empleada a la concentración final, para cada desoxinucleótido,
de 187,5 mM para cada ensayo de análisis. Cloruro de magnesio
(MgCl_{2}): empleado a la concentración final de 1,5 mM para cada
ensayo de análisis.
Taq polimerasa: 0,25 unidades de enzima para
cada ensayo de análisis en un tampón de reacción que contiene
cloruro de potasio (KCl) 50 mM, Tris-HCl 10 mM pH 9
y Tritón X-100 al 0,1%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se notifican dos ejemplos, uno que utiliza
condiciones más estrictas (PCR1-BTKd), y el otro que
utiliza condiciones más moderadas (PCR2-BTKd).
El protocolo de ampliación
PCR1-BTKd incluye las siguientes etapas:
- 1.
- 95ºC durante 3 min., 1 ciclo
- 2.
- 95ºC durante 20 seg
- 3.
- 58ºC durante 20 seg
- 4.
- 72ºC durante 2 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repiten las etapas 2-4
durante 5 ciclos
- 5.
- 95ºC durante 20 seg.
- 6.
- 56ºC durante 20 seg.
- 7.
- 72ºC durante 2 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repiten las etapas 5-7
durante 5 ciclos
- 8.
- 95ºC durante 20 seg.
- 9.
- 54ºC durante 20 seg.
- 10.
- 72ºC durante 2 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repiten las etapas 8-10
durante 20 ciclos
- 11.
- 72ºC durante 20 min., 1 ciclo
- 12.
- 60ºC durante 10 min., 1 ciclo
- 13.
- 15ºC hasta la recogida de los tubos y el análisis de los productos
\vskip1.000000\baselineskip
El protocolo de ampliación
PCR2-BTKd incluye las siguientes etapas:
- 1.
- 6 min. hasta alcanzar 91ºC
- 2.
- 95ºC durante 3 min., 1 ciclo
- 3.
- 95ºC durante 20 seg.
- 4.
- 54ºC durante 20 seg.
- 5.
- 72ºC durante 2 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Se repiten las etapas 3-5
durante 30 ciclos
- 6.
- 72ºC durante 20 min., 1 ciclo
- 7.
- 60ºC durante 10 min., 1 ciclo
- 8.
- 15ºC hasta la recogida de los tubos y el análisis de los productos.
\newpage
Se realiza la visualización de las bandas de ADN
ampliado separándolas en placas de gel de agarosa, a una
concentración de las últimas de desde el 1,4% hasta el 1,8%, según
los requisitos experimentales. Se visualiza el ADN mediante tinción
con bromuro de etidio usado a la concentración final de 100
ng/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
1. La figura 1 muestra la ampliación de una
banda de aproximadamente 900 pares de bases específica para el gen
TubB16 de \beta-tubulina de arroz.
Se llevó a cabo este experimento para demostrar
la viabilidad del enfoque experimental cuando también se tiene en
consideración la ampliación de una única secuencia de un único gen
de \beta-tubulina. La figura muestra que esto es
posible tanto en el maíz (posiciones 1 y 2) como en el arroz
(posiciones 3-8).
La banda de 419 pares de bases obtenida del
análisis de 100 ng o 1 mg de gen de genoma de maíz es la esperada
para un intrón en la posición 132-1 de 89 pares de
bases (ya descrito en la bibliografía). El análisis en el maíz se
ha llevado acabo obviamente con cebadores que son específicos para
esta planta y para un gen de \beta-tubulina
específico (ZmTubB4). La banda de aproximadamente 900 pares de bases
presente desde la posición 3 hasta la 8 representa, en cambio, la
secuencia de intrón del gen TubB16 en 6 variedades de arroz que no
se conocía previamente. Los datos de secuenciación de bandas que
pudieron obtenerse demuestran irrefutablemente que era el intrón del
gen TubB16 de arroz.
En lo que se refiere al arroz, se llevó a cabo
el análisis usando 1 mg de ADN genómico, el par de cebadores
específicos (Tub16sp./fw y Tub16sp./rev) y el protocolo de
ampliación (PCR1-BTKd). Las variedades de arroz
analizadas en este experimento son respectivamente, comenzando en la
posición 3: Arborio, 4 Roma, 5 Ariete, 6 IR72, 7 Thaibonnet, 8
Elio, M = marcador de referencia para el tamaño molecular. 2. La
figura 2 muestra la ampliación de varias bandas que constituyen una
imagen molecular específica para cinco variedades de arroz
diferentes.
Se llevó a cabo este experimento a una
concentración del ADN genómico de 1 mg, par de cebadores
BTKd1-fw y BTKd1-rev, protocolo de
ampliación PCR1-BTKd. Las variedades de arroz
analizadas en este experimento son respectivamente:
- 1.
- M2O2, 2. IR72, 3. Arborio, 4. Ariete, 5. Roma, M = marcador de referencia para el tamaño molecular.
- 3.
- La figura 3 muestra la ampliación de varias bandas que constituyen una imagen molecular específica para siete variedades de arroz diferentes. La figura también muestra una muestra de ADN de maíz (posición 8).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo este experimento reduciendo la
cantidad de ADN genómico de partida desde 1 mg hasta 100 ng. Par de
cebadores BTKd1.fw y BTKd1.rev., protocolo de ampliación PCR1- BTKd.
Las variedades de arroz analizadas en este experimento son
respectivamente:
- 1.
- Arborio, 2. Roma, 3. Ariete, 4. IR72, 5. Thaibonnet, 6. M203, 7. Elio, M = marcador de referencia para el tamaño molecular.
- 4.
- Ampliación de varias bandas que constituyen una imagen molecular específica para siete variedades de arroz diferentes.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 4 muestra las mismas variedades de
arroz de la figura 3 que se han analizado con el protocolo de
ampliación PCR2-BTKd.
Las variedades de arroz analizadas en este
experimento son respectivamente:
- 1.
- Arborio, 2. Ariete, 3. Roma, 4. IR72, 5. Elio, 6. Thaibonnet, 7. M203, M = marcador de referencia para el tamaño molecular
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 5 muestra la prueba de identificación
mediante el uso del kit de contaminación de TBP entre dos variedades
de arroz diferentes (Elio y Roma).
Se preparó el experimento mezclando diferentes
cantidades de ADN genómico obtenido de las dos variedades cultivadas
Roma y Elio. El protocolo de ampliación usado fue
PCR2-BTKd con el par de cebadores
BTKd1-fw y BTKd1-rev
- pos. 1 100 ng de Roma
- pos. 2 50 ng de Roma + 100 ng de Elio
- pos. 3 20 ng de Roma + 100 ng de Elio
- pos. 4 100 ng de Elio
- M = marcador de referencia para el tamaño molecular.
\vskip1.000000\baselineskip
El kit de TBP según la presente invención tal
como se desarrolla permite producir pruebas de una imagen específica
para variedades de arroz cultivadas asociadas con la presencia de
bandas distintivas de ADN ampliado (figura 4). Tal como se ha
demostrado, la imagen de diversidad es más o menos evidente según
las condiciones experimentales utilizadas. Esto deja abierta la
posibilidad de estudios adicionales asociados con la introducción y
la modificación de parámetros tales como:
- -
- Identificación de secuencias diana conocidas por ser variables en el gen de \beta-tubulina de planta,
- -
- identificación de pares de cebadores tales como para producir pruebas de diversidades distintas o iguales,
- -
- configuración de condiciones modificadas de la reacción de ampliación asociadas con diferentes temperaturas, ciclos, cantidad de enzimas y concentraciones salinas.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento de TBP se utiliza para
reconocer diferentes variedades de arroz pero también puede
aplicarse a muchas especies vegetales, siempre que contengan la base
fundamental de la variabilidad indicada en este kit, es decir varios
genes que codifican \beta-tubulina.
Claims (4)
1. Secuencias oligonucleotídicas
5'-TCTGGTGCTGGTAACTGG-3'
(TubB16sp./fw) y
5'-GAGAATGTCAGCAT
CATGCG-3' (TubB16sp./rev) que pueden asociarse con la secuencia génica de la b-tubulina de plantas.
CATGCG-3' (TubB16sp./rev) que pueden asociarse con la secuencia génica de la b-tubulina de plantas.
2. Secuencias oligonucleotídicas
5'-AGGCTGAGAACTGCGACTGC-3'
(BTKdl-fw) y
5'-GAGAATGTGAG
CATCATGCG-3' (BTKdl-rev) que pueden asociarse con la secuencia génica de la b-tubulina de plantas.
CATCATGCG-3' (BTKdl-rev) que pueden asociarse con la secuencia génica de la b-tubulina de plantas.
3. Kit para el reconocimiento de las diferentes
variedades de especies vegetales que comprende una o más secuencias
oligonucleotídicas según las reivindicaciones 1 ó 2.
4. Uso del kit según la reivindicación 3 para la
determinación de las diferentes variedades.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITMI98A2789 | 1998-12-23 | ||
| IT1998MI002789A IT1304795B1 (it) | 1998-12-23 | 1998-12-23 | Procedimento per la valutazione ed il monitoraggio della variabilita'genetica di specie vegetali. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2352171T3 true ES2352171T3 (es) | 2011-02-16 |
Family
ID=11381314
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Country Status (8)
| Country | Link |
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| EP (1) | EP1144691B1 (es) |
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| AU (1) | AU2000800A (es) |
| DE (1) | DE69942726D1 (es) |
| DK (1) | DK1144691T3 (es) |
| ES (1) | ES2352171T3 (es) |
| IT (1) | IT1304795B1 (es) |
| WO (1) | WO2000039334A1 (es) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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1998
- 1998-12-23 IT IT1998MI002789A patent/IT1304795B1/it active
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1999
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- 1999-12-20 ES ES99963667T patent/ES2352171T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-20 EP EP99963667A patent/EP1144691B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| DK1144691T3 (da) | 2011-01-03 |
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| EP1144691B1 (en) | 2010-09-01 |
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