ES2347562T3 - Disagnosticos y terapias para enfermedades asociados con receptor emparejado de proteina g adipor1 (adipor1). - Google Patents

Abstract

Un método para diagnosticar cirrosis hepática en un mamífero que comprende los pasos de i) determinar la cantidad de un mARN de AdipoR1 en una muestra tomada de dicho mamífero, ii) determinar la cantidad de mARN de AdipoR1 en mamíferos saludables y/o enfermos; donde la muestra es una muestra de (a) tejido hepático, (b) tejido esplénico o (c) tejido pancreático y la cantidad de mARN de AdipoR1 en la muestra es indicativa del mamífero que tiene cirrosis hepática si: (a) AdipoR1 es sobreexpresado en tejido hepático, (b) AdipoR1 es sobreexpresado en tejido esplénico, o (c) AdipoR1 es subexpresado en tejido pancreático; en comparación con la expresión en mamíferos saludables.

Description

La presente invención está en el campo de la biología molecular, mas particularmente, la presente invención está relacionada con secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos de AdipoR1 humano y su uso para el diagnóstico de cirrosis de hígado. Antecedentes de la Invención Receptores Emparejados de Proteína G

AdipoR1 es un receptor emparejado de proteína G de siete transmembranas (GPCR) [Yamauchi et al., (2003), WO0112662, WO200190304]. Muchos procesos biológicos medicamente importantes son mediados por rutas de transducción de señal que involucran proteínas G [Lefkowitz, (1991)]. La familia de receptores emparejados de proteína G (GPCRs) incluye receptores para hormonas, neurotransmisores, factores de crecimiento, y virus. Ejemplos específicos de GPCRs incluyen receptores para agentes de tal diversidad como dopamina, calcitonina, hormonas adrenérgicas, endotelina, cAMP, adenosina, acetilcolina, serotonina, histamina, trombina, cinina, hormona estimulante de folículo, opsinas, gen-1 de diferenciación endotelial, rodopsinas, odorantes, citomegalovirus, las mismas proteínas G, proteínas efectoras tal como fosfolipasa C, adenil ciclasa, y fosfodiesterasa, y proteínas activadoras tales como proteína quinasa A y proteína quinasa C.

Las GPCRs poseen siete dominios conservados abarcados por membrana que conectan por lo menos ocho asas hidrofílicas divergentes. Las GPCRs, también conocidas como receptores de siete transmembrana, 7TM, han sido caracterizados por incluir estos siete tramos conservados como hidrofóbicos de aproximadamente 20 a 30 amino ácidos, conectando por lo menos ocho asas hidrofílicas divergentes. La mayoría de los GPCRs tienen residuos individuales de cisteína conservados en cada una de las primeras dos asas extracelulares, que forman enlaces disulfato que se cree que estabilizan la estructura funcional de la proteína. Las siete regiones transmembrana son designadas como TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6, y TM7. TM3 está siendo implicado con transducción de señal. Fosforilación y lipidación (pamitilación o farnesilación) de residuos de cisteína pueden influenciar la transducción de señal de algunos GPCRs. La mayoría de los GPCRs contienen sitios potenciales de fosforilación dentro de la tercera asa citoplásmica y/o el terminal carboxi. Para varios GPCRs, tales como el receptor beta-adrenérgico, la fosforilación por proteína quinasa A y/o quinasas de receptor específico es mediadora de la insensibilidad del receptor.

Para algunos receptores, los sitios de enlace de ligando de GPCRs se cree que comprenden alvéolos hidrofílicos formados por varios dominios de transmembrana GPCR. Los alvéolos hidrofílicos están rodeados por residuos hidrofóbicos de los GPCRs. El lado hidrofílico de cada hélice de transmembrana GPCR es postulado para tener el frente hacia adentro y formar un sitio de enlace ligando polar. TM3 está siendo implicado con varios GPCRs como teniendo un sitio de enlace ligando, tal como el residuo de aspartato TM3. Serinas TM5, una asparagina TM6, y fenilalaninas o tirosinas TM6 o TM7 también están implicadas en el enlace del ligando.

Los GPCRs están emparejados dentro de la célula por proteínas G heterotriméricas a varias enzimas intracelulares, canales de iones, y transportadores. Diferentes subunidades alfa de proteína G preferencialmente estimulan efectores particulares para modular varias funciones biológicas en una célula. La fosforilación de residuos citoplasmáticos de GPCRs es un mecanismo importante para la regulación de algunos GPCRs. Por ejemplo, en una forma de transducción de señal, el efecto de enlace de hormona es la activación de la enzima, adenilato ciclasa, dentro de la célula. Activación de enzimas por hormonas es dependiente de la presencia del nucleótido GTP. GTP también influencia enlace hormonal. Una proteína G conecta el receptor de hormona a adenilato ciclasa. La proteína G intercambia GTP por GDP enlazado cuando es activado por un receptor de hormona. La forma cargadora de GTP entonces se enlaza a adenilato ciclasa activada. La hidrólisis de GTP a GDP, catalizada por la misma proteína G, retorna a la proteína G a su forma basal, inactiva. Por lo tanto, la proteína G sirve un papel doble, como un intermedio que transmite la señal del receptor al efector, y como un reloj que controla la duración de la señal.

Por los últimos 15 años, casi 350 agentes terapéuticos que enfocan receptores 7TM han sido exitosamente introducidos en el mercado. Esto indica que estos receptores tienen una historia establecida, comprobada como objetivos terapéuticos. Claramente, hay una necesidad para identificación y caracterización de receptores adicionales que puedan jugar un papel en prevenir, mejorar, o corregir problemas o enfermedades incluyendo, pero no limitado a, infecciones tales como infecciones bacterianas, de hongos, de protozoos y virales, particularmente aquellas causadas por virus de VIH, cáncer, alergias incluyendo asma, enfermedades cardiovasculares incluyendo fallo cardiaco agudo, hipotensión, hipertensión, angina pectoris, infarto del miocardio, enfermedades hematológicas, enfermedades genito-urinarias incluyendo incontinencia urinaria e hiperplasia benigna de la próstata, osteoporosis, problemas del sistema nervioso periférico y central incluyendo dolor, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson, enfermedades respiratorias, enfermedades metabólicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades gastroenterológicas, enfermedades del sistema endocrino, enfermedades dermatológicas, enfermedades de músculos o del esqueleto, enfermedades inmunológicas, enfermedades de desarrollo o enfermedades del sistema reproductivo. Tecnología TaqMan / perfilamiento de expresión

TaqMan es una técnica recientemente desarrollada, en la cual la liberación de un pigmento fluorescente reportador de una sonda de hibridación en tiempo real durante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) es proporcional a la acumulación del producto de PCR.

La cuantificación está basada en la parte temprana, linear de la reacción, y determinando el ciclo umbral (CT), en el cual la fluorescencia encima del fondo es primero detectada.

Tecnologías de expresión de genes pueden ser útiles en varias áreas de descubrimiento y desarrollo de fármacos, tales como identificación de objetivo, optimización de guía, e identificación de mecanismos de acción. La tecnología TaqMan puede ser usada para comparar diferencias entre perfiles de expresión de tejido normal y tejido enfermo. Perfilamiento de expresión ha sido usado en identificación de genes, que son sobre-regulados o sub-regulados en una variedad de enfermedades. Una aplicación interesante de perfilamiento de expresión es monitoreo temporal de cambios en expresión de genes durante progresión de enfermedades y tratamiento con fármacos o en pacientes contra individuos saludables. La premisa en éste acercamiento es que cambios en el patrón de expresión de genes en respuesta a estímulos fisiológicos o ambientales (por ejemplo, fármacos) puede servir como claves indirectas sobre genes causantes de enfermedad u objetivos de fármacos. Además, los efectos de fármacos con eficacia establecida sobre patrones de expresión genética global pueden proveer una guía, o una firma genética, contra la cual puede ser comparado un nuevo candidato de fármaco. AdipoR1

La secuencia de nucleótido de AdipoR1 es accesible en bases de datos públicas con el número de acceso NM_015999 y es dado en SEQ ID NO:1. La secuencia de amino ácido de AdipoR1 es representada en SEQ will NO:2.

Los receptores de adiponectina, ADIPOR1 y ADIPOR2, sirven como receptores para adiponectina globular y de longitud completa y son mediadores de actividades aumentadas de ligando AMPK y PPARalfa, como también oxidación de ácidos grasos y absorción de glucosa por adiponectina [Yamauchi et al., (2003)]. Yamauchi et al. [Yamauchi et al., (2003)] aislaron cADNs codificando ADIPOR1 y ADIPOR2 por clonación de expresión.

El receptor AdipoR1 es publicado en [Yamauchi et al., (2003)].

Métodos para diagnosticar cirrosis de hígado, basado en biopsia de hígado, son conocidos en la técnica [Olga et al, 2003]. Resumen de la Invención

Aquí se revelan asociaciones novedosas de enfermedades de polipéptidos y polinucleótidos de AdipoR1. La invención comprende un método para diagnosticar cirrosis de Hígado de acuerdo a la reivindicación 1. Breve Descripción de los Dibujos

Fig. 1

muestra la secuencia de nucleótido de un polinucleótido de AdipoR1 (SEQ ID NO:1).

Fig. 2

muestra la secuencia de amino ácido de un polipéptido de AdipoR1 (SEQ ID NO:2).

Fig. 3

muestra la secuencia de nucleótido de un cebador útil para la invención (SEQ ID NO:3).

Fig. 4

muestra la secuencia de nucleótido de un cebador útil para la invención (SEQ ID NO:4).

Fig. 5

muestra una secuencia de nucleótido útil como una sonda para detectar proteínas de la invención

(SEQ ID NO:5).

Descripción detallada de la invención

Definición de términos

Un “oligonucleótido” es un tramo de residuos de nucleótido que tiene un número suficiente de bases a ser usadas como un oligómero, amplímero o sonda en una reacción de cadena de polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos son preparados de secuencia genómica o de cADN y son usados para amplificar, revelar, o confirmar la presencia de un ADN o ARN similar en una célula o tejido particular. Oligonucleótidos u oligómeros comprenden porciones de secuencia de ADN que tienen por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos y hasta aproximadamente 35 nucleótidos, preferiblemente aproximadamente 25 nucleótidos.

Las “Sondas” pueden ser derivadas de ácidos nucleicos que ocurren naturalmente o de cadena simple o doble recombinante o pueden ser sintetizados químicamente. Son útiles en detectar la presencia de secuencias idénticas o similares. Tales sondas pueden ser marcadas con moléculas reporteras usando traducción por muesca, reacción de relleno de Klenow, PCR u otros métodos bien conocidos en la técnica. Sondas de ácido nucleico pueden ser usadas en hibridaciones southern, northern o in situ para determinar si ADN o ARN codificando cierta proteína está presente en un tipo de célula, tejido, u órgano.

Un “fragmento de un polinucleótido” es un ácido nucleico que comprende toda o cualquier parte de una molécula de nucleótido determinada, teniendo el fragmento menos nucleótidos de aproximadamente 6 kb, preferiblemente menos de aproximadamente 1 kb.

“Moléculas reporteras” son radionucleótidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos que se asocian con una secuencia de nucleótido o amino ácido particular, así estableciendo la presencia de cierta secuencia, o permitiendo la cuantificación de cierta secuencia.

Moléculas “quiméricas” pueden ser construidas introduciendo toda o parte de la secuencia del nucleótido de esta invención en un vector que contiene secuencia de ácido nucleico adicional la cual puede esperarse que cambien cualquiera o varias de las siguientes características de AdipoR1: localización celular, distribución, afinidades de enlace ligando, afinidades entre cadena, índice de degradación/renovación, señalamiento, etc.

“Activo”, con respecto a un polipéptido de AdipoR1, se refiere a aquellas formas, fragmentos, o dominios de un polipéptido de AdipoR1 que retienen la actividad biológica y/o antigénica de un polipéptido AdipoR1.

“Polipéptido de AdipoR1 que ocurre naturalmente” hace referencia a un polipéptido producido por células que no han sido diseñadas genéticamente y contempla específicamente varios polipéptidos que emergen de modificaciones post-translacionales del polipéptido incluyendo pero no limitado a acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación.

“Derivados” se refiere a polipéptidos que han sido químicamente modificados por técnicas tales como ubiquitinación, marcado (véase arriba), ídem (formación de derivados con glicol de polietileno), e inserción química o sustitución de amino ácidos tales como ornitina que no ocurren normalmente en proteínas humanas.

“Sustituciones de amino ácido conservadoras” resultan de remplazar un amino ácido con otro que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como el remplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, o una treonina con una serina.

“Inserciones” o “anulaciones” están típicamente en el rango de aproximadamente 1 a 5 amino ácidos. La variación permitida puede ser determinada experimentalmente produciendo el péptido sintéticamente mientras se hacen sistemáticamente inserciones, anulaciones, o sustituciones de nucleótidos en la secuencia usando técnicas de recombinación de ADN.

Una “secuencia de señal” o “secuencia líder” puede ser usada, cuando se desea, para dirigir el polipéptido a través de una membrana de una célula. Tal secuencia puede estar naturalmente presente en los polipéptidos de la presente invención o provista de fuentes heterólogas por técnicas de recombinación de ADN.

Un “oligopéptido” es un tramo corto de residuos de amino ácido y puede ser expresado de un oligonucleótido. Los oligopéptidos comprenden un tramo de residuos de aminoácido de por lo menos 3, 5, 10 amino ácidos y como máximo 10, 15, 25 amino ácidos, típicamente de por lo menos 9 a 13 amino ácidos, y de suficiente longitud para demostrar actividad biológica y/o antigénica.

“Inhibidor” es cualquier sustancia que retrasa o previene una reacción o respuesta química o fisiológica. Inhibidores comunes incluyen pero no están limitados a moléculas antisentido, anticuerpos, y antagonistas.

“Expresión estándar” es una medida cuantitativa o cualitativa para comparación. Está basada en un número estadísticamente apropiado de muestras normales y es creado para usar como base de comparación cuando se realizan ensayos de diagnóstico, haciendo pruebas clínicas, o siguiendo perfiles de tratamiento de pacientes.

“Animal” como se usa aquí puede definirse para incluir la especie humana, especies domésticas (por ejemplo, gatos, perros, etc.), de agricultura (por ejemplo, vacas, caballos, ovejas, etc.) o de prueba (por ejemplo, ratón, rata, conejo, etc.).

Un “polinucleótido de AdipoR1” dentro del significado de la invención, debe ser entendido como una molécula de ácido nucleico seleccionada de un grupo que consiste de

(i)

Moléculas de ácido nucleico que codificanun polipéptido que comprende la secuencia de amino ácido de SEQ ID NO:2,

(ii)

Moléculas de ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1,

(iii) Moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia de SEQ ID NO:1,

(iv) Moléculas de ácido nucleico de la cadena complementaria que se hibrida bajo condiciones estrictas a una molécula de ácido nucleico de (i), (ii), o (iii); y

(v) Moléculas de ácido nucleico de la secuencia de la cual se diferencia de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (iii) debido a la degeneración del código genético; donde el polipéptido codificado por dicha molécula de ácido nucleico tiene actividad AdipoR1.

Un “polipéptido AdipoR1”, dentro del significado de la invención, debe ser entendido como un polipéptido seleccionado de un grupo que consiste de

(i)

Polipéptidos que tienen la secuencia de SEQ ID NO:2,

(ii)

Polipéptidos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO:2,

(iii) Polipéptidos codificados por polinucleótidos de AdipoR1; y

(iv) Polipéptidos que muestran por lo menos 99%, 98%, 95%, 90%, o 80% de homología con un polipéptido de (i), (ii), o (iii); donde dicho polipéptido tiene actividad AdipoR1.

Las secuencias de nucleótido codificando un AdipoR1 (o su complemento) tienen numerosas aplicaciones en técnicas conocidas a aquellos diestros en la técnica de biología molecular. Estas técnicas incluyen el uso de sondas de hibridación, uso en la construcción de oligómeros para PCR, uso para mapeo de cromosoma o gen, uso en la producción recombinante de AdipoR1, y uso en generación de ADN o ARN antisentido, sus análogos químicos y similares. Usos de nucleótidos que codifican un AdipoR1 revelado aquí son ejemplos de técnicas conocidas y no se pretende que se limite su uso en cualquier técnica conocida para una persona de destreza ordinaria en la técnica. Además, las secuencias de nucleótido reveladas aquí pueden ser usadas en técnicas de biología molecular que no han sido todavía desarrolladas, siempre que las nuevas técnicas cuenten con propiedades de secuencias de nucleótido que sean actualmente conocidas, por ejemplo, el código genético de triplete, interacciones especificas de reparación de base, etc.

Será apreciado por aquellos diestros en la técnica que como resultado de la degeneración del código genético, puede producirse una multitud de AdipoR1-que codifican secuencias nucleotídicas. Algunos de éstos solamente tendrán homología mínima a la secuencia de nucleótido de la AdipoR1 conocida y que ocurre naturalmente. La invención ha contemplado específicamente todas y cada una de las posibles variaciones de secuencias de nucleótidos que pueden hacerse seleccionando combinaciones basadas en posibles opciones de codón. Estas combinaciones son hechas de acuerdo con el código genético de triplete como se aplica a la secuencia de nucleótido del AdipoR1 que ocurre naturalmente, y todas dichas variaciones han de ser consideradas como siendo específicamente reveladas.

Aunque las secuencias de nucleótido que codifican un AdipoR1, sus derivadas o sus variantes son preferiblemente capaces de hibridarse a la secuencia de nucleótido del polinucleótido de AdipoR1 que ocurre naturalmente bajo condiciones estrictas, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótido que codifiquen polipéptidos de AdipoR1 o sus derivadas que posean un uso sustancialmente diferente del codón. Los codones pueden ser seleccionados para aumentar el índice al cual la expresión del péptido ocurre en un huésped de expresión procariótico o eucariótico de acuerdo con la frecuencia con la cual el huésped usa codones particulares. Otras razones para alterar sustancialmente la secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido de AdipoR1 y/o sus derivadas sin alterar la secuencia de amino ácido codificada incluyen la producción de transcripciones de ARN que tienen propiedades mas deseables, tales como mayor vida media, que transcripciones producidas de la secuencia que ocurre naturalmente.

Secuencias de nucleótido codificando un polipéptido AdipoR1 pueden ser unidas a una variedad de otras secuencias de nucleótido por medio de técnicas bien establecidas de ADN recombinante. Secuencias de nucleótido útiles para unirse a polinucleótidos de AdipoR1 incluyen una variedad de vectores de clonación como plásmidos, cosmidos, derivados de fagos lambda, fagémidos, y similares. Vectores de interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sonda, vectores de secuenciación, etc. En general, vectores de interés pueden contener un origen de replicación funcional en por lo menos un organismo, sitios sensibles convenientes de restricción de endonucleasa, y marcadores seleccionables para uno o más sistemas de célula huésped.

Otro aspecto del sujeto de la invención es proveer para sondas de hibridación específicas para AdipoR1 capaces de hibridarse con secuencias de nucleótido que ocurren naturalmente codificando AdipoR1. Tales sondas pueden también ser usadas para la detección de secuencias de codificación GPCR similares y deben preferiblemente mostrar por lo menos 40% de identidad de nucleótido para polinucleótidos de AdipoR1. Las sondas de hibridación del sujeto de la invención pueden ser derivadas de la secuencia de nucleótido presentada como SEQ ID NO:1 o de secuencias genómicas incluyendo promotores, mejoradores o intrones del gen nativo. Las sondas de hibridación pueden ser marcadas por una variedad de moléculas reporteras usando técnicas bien conocidas en la técnica.

Se reconocerá que diversos análogos de anulación o mutación de polinucleótidos de AdipoR1 serán sondas de hibridación efectivas para polinucleótidos de AdipoR1. Por consiguiente, la invención se relaciona a secuencias de ácido nucleico que se hibridan con dichas secuencias de ácido nucleico que codifican AdipoR1 bajo condiciones estrictas.

“Condiciones estrictas” hace referencia a condiciones que permiten la hibridación de secuencias de ácido nucleico sustancialmente relacionadas. Por ejemplo, tales condiciones generalmente van a permitir la hibridación de secuencia con por lo menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia, preferiblemente con por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, más preferible con por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia. Condiciones de hibridación y sondas pueden ser ajustadas de formas bien caracterizadas para lograr hibridación selectiva de sondas humano-derivadas. Condiciones estrictas, dentro del significado de la invención son 65 °C en un amortiguador que contiene 1 mM de EDTA,

0.5 M de NaHPO4 (pH 7.2), 7% (p/v) SDS.

Las moléculas de ácido nucleico que se van a hibridar a polinucleótidos de AdipoR1 bajo condiciones estrictas pueden ser identificadas funcionalmente. Sin limitación, ejemplos de usos para sondas de hibridación incluyen: usos histoquímicos como identificar tejidos que expresan AdipoR1; medir niveles de mARN, por ejemplo para identificar el tipo de tejido de una muestra o para identificar células que expresan niveles anormales de AdipoR1; y detectando polimorfismos de AdipoR1.

El PCR provee usos adicionales para oligonucleótidos basado en la secuencia de nucleótido que codifica AdipoR1. Tales sondas usadas en PCR pueden ser de origen recombinante, sintetizadas químicamente, o una mezcla de ambos. Los oligómeros pueden comprender secuencias de nucleótido discretas utilizadas bajo condiciones optimizadas para la identificación de AdipoR1 en tejidos específicos o uso diagnóstico. Los mismos dos oligómeros, un juego de oligómeros anidados, o inclusive un agrupamiento degenerado de oligómeros puede ser utilizado bajo condiciones menos estrictas para la identificación de ADNs o ARNs cercanamente relacionados.

Se han establecido reglas para el diseño de cebadores para reacción de cadena de polimerasa (PCR), como es revisado por Protocolos de PCR. Cebadores degenerados, es decir, preparaciones de cebadores que son heterogéneos en ciertas localizaciones de la secuencia, pueden ser diseñados para amplificar secuencias de ácido nucleico que son altamente homologas a, pero no idénticas con AdipoR1. Hay estrategias ahora disponibles que permiten que solo uno de los cebadores sea necesario para hibridarse específicamente con una secuencia conocida. Por ejemplo, cebadores de ácido nucleico apropiados pueden ser ligados al ácido nucleico que se busca amplificar para proveer el compañero de hibridación para uno de los cebadores. De esta forma, sólo uno de los cebadores necesita estar basado en la secuencia del ácido nucleico que se busca amplificar.

Los métodos de PCR para amplificar ácido nucleico utilizarán por lo menos dos cebadores. Uno de estos cebadores será capaz de hibridarse a una primera cadena de ácido nucleico que va a ser amplificada y de cebar síntesis de ácido nucleico dirigida por enzimas en una primera dirección. El otro será capaz de hibridar la secuencia recíproca de la primera cadena (si la secuencia que va a ser amplificada es de una sola cadena, ésta secuencia será inicialmente hipotética, pero será sintetizada en el primer ciclo de amplificación) y de cebar síntesis de ácido nucleico de esa cadena en la dirección opuesta de la primera dirección y hacia el sitio de hibridación para el primer cebador. Son bien conocidas las condiciones para conducir tales amplificaciones, particularmente bajo condiciones estrictas preferidas de hibridación.

Otros medios para producir sondas de hibridación especificas para AdipoR1 incluyen la clonación de secuencias de ácido nucleico codificando AdipoR1 o derivados de AdipoR1 en vectores para la producción de sondas de mARN. Tales vectores son conocidos en la técnica, están comercialmente disponibles y pueden ser usados para sintetizar sondas de ARN in vitro por medio de la adición de la polimerasa de ARN apropiada como T7 o polimerasa ARN SP6 y las moléculas reporteras apropiadas.

Es posible producir una secuencia de ADN, o porciones de la misma, solamente por química sintética. Después de la síntesis, la secuencia de ácido nucleico puede ser insertada en cualquiera de los muchos vectores de ADN disponibles y sus respectivas células huésped usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Además, la química sintética puede ser usada para introducir mutaciones en la secuencia del nucleótido. Alternativamente, una porción de la secuencia en la cual una mutación es deseada puede ser sintetizada y recombinada con una porción más larga de una secuencia ya existente genómica o recombinante.

Los polinucleótidos AdipoR1 pueden ser usados para producir un oligopéptido o polipéptido purificado usando métodos bien conocidos de tecnología recombinante de ADN. El oligopéptido puede ser expresado en una variedad de células huésped, procarióticas o eucarióticas. Células huésped pueden ser de la misma especie de la cual la secuencia nucleótida fue derivada o de una especie diferente. Ventajas de producir un oligonucleótido por tecnología recombinante de ADN incluyen obtener cantidades adecuadas de la proteína para purificación y la disponibilidad de procedimientos de purificación simplificados. Determinaciones cuantitativas de ácidos nucleicos

Un paso importante en el análisis genético molecular de enfermedades humanas es usualmente la enumeración del número de copia de un ácido nucleico o la expresión relativa de un gen en tejidos particulares.

Varios acercamientos diferentes son actualmente disponibles para hacer determinaciones cuantitativas de ácidos nucleicos. Técnicas basadas en cromosoma, tales como hibridación genómica comparativa (CGH) e hibridación in situ fluorescente (FISH) facilitan los esfuerzos para localizar citogenéticamente regiones genómicas que son alteradas en células tumorales. Regiones de alteración genómica pueden ser aun más reducidas usando análisis de pérdida de heterocigoticidad (LOH), en el cual el ADN de la enfermedad es analizado y comparado con ADN normal para la pérdida de un marcador heterocigótico polimórfico. Los primeros experimentos usaron restricción de polimorfismos de longitud de fragmento (RFLPs) [Johnson, (1989)], o ADN mini satélite hiper-variable [Barnes, 2000]. En años recientes LOH ha sido formado principalmente usando amplificación por PCR de marcadores de micro satélite y electroforesis de los marcados con radio [Jeffreys, (1985)] o productos PCR marcados fluorescentemente [Weber, (1990)] y comparado entre ADNs emparejados normales y enfermos.

Un número de otros métodos también han sido desarrollados para cuantificar ácidos nucleicos [Gergen, (1992)]. Más recientemente, métodos de PCR y RT-PCR han sido desarrollados los cuales son capaces de medir la cantidad de un ácido nucleico en una muestra. Un acercamiento, por ejemplo, mide la cantidad de producto PCR en la fase log de la reacción antes de la formación de mesetas de productos de reacción [Thomas, (1980)].

Una secuencia genética contenida en todas las muestras a cantidad relativamente constante es típicamente utilizada para normalización de eficiencia de amplificación de muestra. Este acercamiento, sin embargo, sufre de varias desventajas. El método requiere que cada muestra tenga iguales cantidades de entrada del ácido nucleico y que la eficiencia de amplificación entre las muestras sea idéntica hasta el tiempo de análisis. Además, es difícil usando los métodos convencionales de cuantificación de PCR tales como gel de electroforesis o hibridación de captura de placa para determinar que todas las muestras sean en realidad analizadas durante la fase log de la reacción como es requerido por el método.

Otro método llamado cuantitativo competitivo (QC)-PCR, como el nombre sugiere, cuenta con la inclusión de un competidor de control interno en cada reacción [Piatak, (1993), BioTechniques]. La eficiencia de cada reacción es normalizada para el competidor interno. Una cantidad conocida de competidor interno es típicamente agregada a cada muestra. El producto de PCR objetivo desconocido es comparado con el producto de PCR competidor conocido para obtener cuantificación relativa. Una dificultad con este acercamiento general yace en desarrollar un control interno que amplifique con la misma eficiencia que la molécula objetivo.

Ensayos de Nucleasa 5’Fluorogénica

Los ensayos de nucleasa fluorogénica son un método de cuantificación en tiempo real que usa una sonda para monitorear la formación de producto de amplificación. La base para éste método de monitorear la formación de producto de amplificación es medir continuamente la acumulación de producto de PCR usando una sonda oligonucleotida fluorogénica de doble marcado, un acercamiento al que se le hace referencia frecuentemente en la literatura simplemente como el “método TaqMan” [Piatak,(1993), Science; Heid, (1996); Gibson, (1996); Holland. (1991)].

La sonda usada en tales ensayos es típicamente un oligonucleótido corto (aproximadamente 20-25 bases) que es marcado con dos pigmentos fluorescentes diferentes. El terminal 5’ de la sonda es unido a un pigmento reportero y el terminal 3’ es unido a un pigmento de amortiguamiento, aunque los pigmentos también podrían estar unidos en otros lugares de la sonda. La sonda es diseñada para tener por lo menos complementariedad de secuencia sustancial con el sitio de enlace de la sonda. Los cebadores de PCR corriente arriba y corriente abajo que se enlazan a regiones del costado del locus son agregadas a la mezcla de reacción. Cuando la sonda está intacta, ocurre transferencia de energía entre dos fluoróforos y el amortiguador amortigua la emisión del reportero. Durante la fase de extensión de PCR, la sonda es cortada por la actividad de la nucleasa 5’ de una polimerasa de ácido nucleico tal como polimerasa Taq, de este modo liberando el reportero del oligonucleótido-amortiguador y resultando en un aumento de la intensidad de emisión del reportero que puede ser medida por un detector apropiado.

Un detector que está específicamente adaptado para medir emisiones de fluorescencia tales como aquellas creadas durante un ensayo fluorogénico es el ABI 7700 o 4700 HT fabricado por Applied Biosystems, Inc. En Foster City, Calif. El ABI 7700 usa fibra óptica conectada con cada pozo en una disposición de tubo de PCR de 96-o 384 pozos. El instrumento incluye un láser para excitar los marcadores y es capaz de medir la intensidad del espectro de fluorescencia de cada tubo con monitoreo continuo durante la amplificación de PCR. Cada tubo es re-examinado cada 8.5 segundos.

Un software de ordenador provisto con el instrumento es capaz de medir la intensidad de fluorescencia del reportero y del amortiguador durante el transcurso de la amplificación. Los valores grabados serán entonces usados para calcular el aumento en la intensidad de emisión de reportero normalizada de forma continua. El aumento en intensidad de emisión es trazado contra tiempo, es decir, el número de ciclos de amplificación, para producir una medida continua de amplificación. Para cuantificar el locus en cada reacción de amplificación, el trazado de amplificación es examinado a un punto durante la fase log de acumulación de producto. Esto se logra asignando una intensidad de umbral de fluorescencia por encima del fondo y determinando el punto en el cual cada trazado de amplificación cruza el umbral (definido como el número de ciclo de umbral o Ct). Las diferencias en el ciclo de umbral se usan para cuantificar la cantidad relativa de PCR objetivo contenido dentro de cada tubo. Asumiendo que cada reacción funciona a 100% de eficiencia de PCR, una diferencia de un Ct representa una diferencia doble en la cantidad de plantilla de inicio. El valor de fluorescencia puede ser usado junto con una curva estándar para determinar la cantidad de producto de amplificación presente. Métodos de Detección No-Basados-en Sonda

Una variedad de opciones están disponibles para medir los productos de amplificación mientras son formados. Un método utiliza marcadores, tales como pigmentos, que solo se enlazan a ADN de doble cadena. En este tipo de acercamiento, el producto de amplificación (que es de doble cadena) enlaza moléculas del pigmento en solución para formar un complejo. Con los pigmentos apropiados, es posible distinguir entre moléculas de pigmento libre en solución o moléculas de pigmento enlazadas a un producto de amplificación.

Por ejemplo, ciertos pigmentos solo son fluorescentes cuando se enlazan a un producto de amplificación. Ejemplos de pigmentos que pueden ser usados en métodos de este tipo general incluyen, pero no están limitados a, Syber Green.TM. y Pico Green de Molécular Probes, Inc. de Eugene, Oreg., bromuro de etidio, yoduro de propidio, cromomicina, acridina naranja, Hoechst 33258, Toto-1, Yoyo-1, DAPI (hidrocloruro 4’,6-diamidino-2-fenilindol).

Otra técnica de detección en tiempo real mide la alteración en transferencia de energía de energía fluorescente entre fluoróforos conjugados con cebadores PCR [Livak, (1995)]. Métodos de Detección Basados en Sondas

Estos métodos de detección involucran alguna alteración a la estructura o conformación de una sonda hibridada al locus entre el par cebador de amplificación. En algunas circunstancias, la alteración es causada por una extensión dependiente de plantilla catalizada por una polimerasa de ácido nucleico durante el proceso de amplificación. La alteración genera una señal detectable que es una medida indirecta de la cantidad de producto de amplificación formado.

Por ejemplo, algunos métodos involucran la degradación o digestión de la sonda durante la reacción de extensión. Éstos métodos son una consecuencia de la actividad de 5’-3’nucleasa asociada con algunas polimerasas de ácido nucleico. Las polimerasas que tienen esta actividad cortan mononucleótidos o pequeños oligonucleótidos de una sonda de oligonucleótidos formateada a su secuencia complementaria localizada dentro del locus.

El extremo 3’ del cebador corriente arriba provee el sitio de enlace inicial para la polimerasa de ácido nucleico. Mientras la polimerasa cataliza extensión del cebador corriente arriba y encuentra la sonda enlazada, la polimerasa de ácido nucleico desplaza una porción del extremo 5’ de la sonda y a través de su actividad de nucleasa corta mononucleótidos u oligonucleótidos de la sonda.

El cebador corriente arriba y la sonda pueden ser diseñados para que se conformen con la cadena complementaria en cercana proximidad una a la otra. De hecho, el extremo 3’ del cebador corriente arriba y el extremo 5’ de la sonda pueden colindar uno con el otro. En esta situación, la extensión de cebador corriente arriba no es necesaria para que la polimerasa de ácido nucleico comience a cortar la sonda. En caso de que nucleótidos intermedios separen el cebador corriente arriba y la sonda, la extensión del cebador es necesaria antes de que la polimerasa de ácido nucleico encuentre el extremo 5’ de la sonda. Una vez que ocurra el contacto y la polimerización continúe, la actividad de la exonucleasa 5’-3’ de la polimerasa de ácido nucleico comienza a cortar los mononucleótidos u oligonucleótidos del extremo 5’ de la sonda. La digestión de la sonda continúa hasta que la porción que permanece de la sonda se disocia de la cadena complementaria.

En solución, las dos secciones finales pueden hibridarse una con otra para formar un circuito capilar. En esta conformación, el reportero y el pigmento amortiguador están lo suficientemente cerca de forma que la fluorescencia del pigmento reportero es efectivamente amortiguada del pigmento amortiguador. La sonda hibridada, en comparación, resulta en una conformación linealizada en la cual el alcance de la amortiguación es disminuido. Por lo tanto, al monitorear los cambios de emisión para los dos pigmentos, es posible monitorear indirectamente la formación del producto de amplificación. Sondas

La sonda marcada es seleccionada para que su secuencia sea sustancialmente complementaria a un segmento del locus de prueba o un locus de referencia. Como se indico arriba, el sitio de ácido nucleico al cual la sonda se enlaza debe estar ubicado entre los sitios de enlace del cebador para los cebadores de amplificación corriente arriba y corriente abajo. Cebadores

Las sondas usadas en la amplificación son seleccionadas para que sean capaces de hibridarse a secuencias en regiones laterales del locus que está siendo amplificado. Los cebadores son elegidos para tener por lo menos complementariedad sustancial con las diferentes cadenas del ácido nucleico que está siendo amplificado. Cuando una sonda se utiliza para detectar la formación de productos de amplificación, los cebadores son seleccionados de forma que flanqueen la sonda, es decir son localizados corriente arriba y corriente abajo de la sonda.

El cebador debe tener suficiente longitud para que sea capaz de cebar la síntesis de productos de extensión en la presencia de un agente para polimerización. La longitud y composición del cebador depende de varios parámetros, incluyendo, por ejemplo, la temperatura en la cual la reacción de templado es realizada, proximidad del sitio de enlace de la sonda a aquella del cebador, concentraciones relativas del cebador y la sonda y la composición en particular de ácido nucleico de la sonda. Típicamente el cebador incluye 15-30 nucleótidos. Sin embargo, la longitud del cebador puede ser más o menos dependiente de la complejidad del sitio de enlace del cebador y los factores listados arriba. Marcadores para Sondas y Cebadores

Los marcadores usados para marcar las sondas o cebadores de la actual invención y que pueden proveer la señal que corresponde a la cantidad de producto de amplificación puede tomar una variedad de formas. Como se indicó arriba en relación al método de nucleasa 5’ fluorogénica, una señal fluorescente es una señal que puede ser medida. Sin embargo, las medidas pueden también ser realizadas, por ejemplo, monitoreando radioactividad, colorimetría, absorción, parámetros magnéticos, o actividad enzimática. Por lo tanto, marcadores que pueden ser utilizados incluyen, pero no están limitados a, fluoróforos, cromóforos, isótopos radioactivos, reactivos con densidad de electrones, enzimas, y ligandos que tienen compañeros de enlace específicos (por ejemplo, biotina-avidina).

Monitorear cambios en fluorescencia es una forma particularmente útil de vigilar la acumulación de productos de amplificación. Un cierto número de marcadores útiles para unirse a sondas o cebadores están disponibles comercialmente incluyendo fluoresceína y varios derivados de fluoresceína tales como FAM, HEX, TET y JOE (todos son disponibles de Applied Biosystems, Foster City, Calif.); amarillo Lucifer, y derivados de cumarina.

Marcadores pueden ser unidos a la sonda o cebador usando una variedad de técnicas y pueden ser unidos al extremo 5’, y/o al extremo 3’ y/o a un nucleótido interno. El marcador puede también ser unido a brazos espaciadores de varios tamaños que son unidos a la sonda o cebador. Estos brazos espaciadores son útiles para obtener una distancia deseada entre marcadores múltiples a la sonda o cebador.

En algunos casos, un único marcador puede ser utilizado; mientras, en otros casos, tales como con los ensayos de nucleasa fluorogénica 5’ por ejemplo, dos o más marcadores son unidos a la sonda. En casos donde la sonda incluye múltiples marcadores, es generalmente aconsejable mantener espacio entre marcadores que sea suficiente para permitir separación de los marcadores durante digestión de la sonda a través de la actividad de la nucleasa 5’-3’ de la polimerasa de ácido nucleico. Pacientes Exhibiendo-Síntomas de Enfermedad

Un cierto número de enfermedades están asociadas con cambios en el número de copias de cierto gen. Para pacientes que tienen síntomas de una enfermedad, el método de PCR de tiempo real puede ser usado para determinar si el paciente tiene alteraciones de número de copias que son conocidas por estar relacionadas con enfermedades que son asociadas con los síntomas que el paciente presenta. Expresión de AdipoR1 Proteínas de fusión de AdipoR1

Las proteínas de fusión son útiles para generar anticuerpos contra polipéptidos de AdipoR1 y para uso en varios sistemas de ensayo. Por ejemplo, proteínas de fusión pueden ser usadas para identificar proteínas que interactúan con porciones de polipéptidos de AdipoR1. La cromatografía de afinidad de proteínas o ensayos basados en biblioteca para interacciones proteína-proteína, tales como el sistema de doshibrido de levadura o sistema de exposición de fagos, pueden ser usados para este propósito. Tales métodos son bien conocidos en la técnica y también pueden ser usados como exploración de fármacos.

Una proteína de fusión AdipoR1 comprende dos segmentos de polipéptido fusionados el uno al otro por medio de un enlace péptido. El primer segmento polipéptido puede comprender por lo menos 54, 75, 100, 125, 139, 150, 175, 200, 225, 250 o 275 amino ácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2 o de una variante biológicamente activa, tal como aquellas descritas arriba. El primer segmento polipéptido también puede comprender AdipoR1 de longitud completa.

El segundo segmento de polipéptido puede ser una proteína de longitud completa o un fragmento de proteína. Proteínas comúnmente usadas en la construcción de proteínas de fusión incluyen, pero no están limitadas a β-glucuronidasa, proteína verde fluorescente (GFP), proteínas autofluorescentes, incluyendo proteína azul fluorescente (BFP), glutationa-S-transferasa (GST), luciferasa, peroxidasa de rábano (HRP), y cloramfenicol acetiltransferasa (CAT). Adicionalmente, etiquetas epítopas son usadas en construcciones de proteínas de fusión, incluyendo etiquetas de histidina (His), etiquetas FLAG, etiquetas de hemaglutinina influenza (HA), etiquetas Myc, etiquetas VSV-G, y etiquetas de tioredoxina (Trx). Otras construcciones de fusión pueden incluir proteínas de enlace de maltosa (MBP), S-etiqueta, fusiones de dominio de enlace Lex a ADN (DBD), fusiones de dominio de enlace de ADN GAL4, fusiones de proteína BP16 virus herpes simplex (HSV) y fusiones de G-proteína (por ejemplo G(alfa)16, Gs, Gi). Una proteína de fusión también puede ser diseñada para contener un sitio de corte localizado adyacente al AdipoR1. Preparación de Polinucleótidos

Un polinucleótido AdipoR1 que ocurre naturalmente puede ser aislado libre de otros componentes celulares tales como componentes de membrana, proteínas, y lípidos. Los polinucleótidos pueden ser hechos por una célula y aislados usando técnicas de purificación estándar de ácido nucleico, o sintetizados usando una técnica de amplificación, tal como la reacción de cadena de polimerasa (PCR), o usando un sintetizador automático. Métodos para aislar polinucleótidos son de rutina y son conocidos en la técnica. Cualquier técnica para obtener un polinucleótido puede ser usada para obtener polinucleótidos de AdipoR1 aislados. Por ejemplo, enzimas de restricción y sondas pueden ser usadas para aislar fragmentos de polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótido AdipoR1. Polinucleótidos aislados están en preparaciones que son libres o por lo menos 70, 80, o 90% libres de otras moléculas.

Las oléculas cADN AdipoR1 pueden ser hechas con técnicas estándar de biología molecular, usando mARN AdipoR1 como plantilla. Moléculas cADN AdipoR1 pueden a partir de entonces ser replicadas usando técnicas de biología molecular conocidas en la técnica. Una técnica de amplificación, tal como PCR, puede ser usada para obtener copias adicionales de polinucleótidos de la invención, usando ADN o cADN genómico humano como plantilla.

Alternativamente, pueden usarse técnicas de química sintética para sintetizar polinucleótidos de AdipoR1. La degeneración del código genético permite alternar secuencias nucleotídicas que van a ser sintetizadas que van a codificar AdipoR1 que tienen, por ejemplo, una secuencia de amino ácido mostrada en SEQ ID NO:2 o una variante biológicamente activa del mismo. Polinucleótidos de Extensión

Varios métodos basados en PCR pueden ser usados para extender secuencias de ácido nucleico que codifican AdipoR1 humano, por ejemplo para detectar secuencias corriente arriba de gen AdipoR1 tales como promotores y elementos reguladores. Por ejemplo, la PCR de sitio de restricción usa cebadores universales para recuperar secuencias desconocidas adyacentes a un locus conocido. ADN genómico es primero amplificado en la presencia de un cebador a una secuencia conectora y un cebador específico para la región conocida. Las secuencias amplificadas son entonces sometidas a una segunda ronda de PCR con el mismo cebador conector y otro cebador específico interno al primero. Productos de cada ronda de PCR son transcritos con una polimerasa ARN apropiada y secuenciados usando transcriptasa inversa.

La PCR inversa también puede ser usada para amplificar o extender secuencias usando cebadores divergentes basados en una región conocida. Los cebadores pueden ser diseñados usando software comercialmente disponible, tal como OLIGO 4.06 Primer Analysis software (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), para ser 22-30 nucleótidos de longitud, para tener un contenido GC de 50% o más, y para conformarse con la secuencia objetivo a temperaturas de aproximadamente 68-72 °C. El método utiliza varias enzimas de restricción para generar un fragmento adecuado en la región conocida de un gen. El fragmento es entonces circularizado por ligación intermolecular y usado como una plantilla PCR.

Otro método que puede ser usado es PCR de captura, que involucra amplificación por PCR de fragmentos de ADN adyacentes a una secuencia conocida en ADN de cromosoma artificial humano y de levadura. En este método, digestiones de enzimas de restricción múltiple y ligaciones también pueden ser usadas para colocar una secuencia diseñada de doble cadena en un fragmento desconocido de la molécula de ADN antes de realizar PCR.

Cuando se explora por cADNs de longitud completa, es preferible usar bibliotecas que han sido seleccionadas por tamaño para incluir cADNs más grandes. Las bibliotecas cebadas aleatoriamente son preferibles por que van a contener más secuencias que contienen las regiones 5’ de genes. El uso de una biblioteca cebada aleatoriamente puede ser especialmente preferible para situaciones en las cuales una biblioteca oligo d(T) no va a producir un cADN de longitud completa. Las bibliotecas genómicas pueden ser útiles para extensión de secuencia en regiones regulatorias no transcritas 5’.

Los sistemas de electroforesis capilar comercialmente disponibles pueden ser usados para analizar el tamaño o confirmar la secuencia de nucleótidos de PCR o productos de secuenciamiento. Por ejemplo, el secuenciamiento capilar puede utilizar polímeros fluidos para separación electroforética, cuatro pigmentos fluorescentes diferentes (uno para cada nucleótido) que son activados por láser, y detección de las longitudes de onda emitidas por una cámara de aparato emparejado de carga. La intensidad de salida/luz puede ser convertida a señal eléctrica usando equipo y software apropiados (por ejemplo, GENOTYPER y Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer), y todo el proceso de carga de muestras a análisis de computadora y presentación de datos electrónicos pueden ser controlados por computadora. La electroforesis capilar es especialmente preferible para el secuenciamiento de pedazos pequeños de ADN que pueden estar presentes en cantidades limitadas en una muestra particular. Obtención de Polipéptidos

AdipoR1 puede ser obtenido, por ejemplo, por purificación de células humanas, por expresión de polinucleótidos AdipoR1, o por síntesis química directa. Purificación de Proteína

AdipoR1 puede ser purificado de cualquier célula humana que expresa el receptor, incluyendo aquellas que han sido transfectadas con construcciones de expresión que expresan AdipoR1. Un AdipoR1 purificado es separado de otros compuestos que normalmente se asocian con AdipoR1 en la célula, tales como ciertas proteínas, carbohidratos, o lípidos, usando métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no están limitados a, cromatografía de exclusión de tamaño, fraccionamiento de sulfato de amonio, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de afinidad, y electroforesis de gel preparativa. Expresión de Polinucleótidos AdipoR1

Para expresar AdipoR1, polinucleótidos AdipoR1 pueden ser insertados en un vector de expresión que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traslación de las secuencias de codificación insertadas. Métodos que son bien conocidos para aquellos diestros en la técnica pueden ser usados para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican AdipoR1 y elementos de control transcripcional y traslacional apropiados. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo.

Una variedad de sistemas de vector/huésped de expresión pueden ser utilizados para contener y expresar secuencias que codifican AdipoR1. Éstas incluyen, pero no están limitadas a, microorganismos, tales como bacteria transformada con bacteriófagos recombinantes, plásmido, o vectores de expresión de ADN cósmido; levadura transformada con vectores de expresión de levadura, sistemas de célula de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus), sistemas de células de plantas transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) o con vectores de expresión de bacteria (por ejemplo, Ti o plásmidos pBR322), o sistemas de célula animal.

Los elementos de control o secuencias regulatorias son aquellas regiones no traducidas del vector – mejoradores, promotores, regiones 5’ y 3’ no traducidas – que interactúan con proteínas celulares del huésped para realizar transcripción y traslación. Tales elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y huésped utilizado, cualquier número de elementos apropiados de transcripción y traslación, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, pueden ser usados. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, promotores inducibles tales como el promotor híbrido lacZ del fagémido BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, Calif.) o plásmido pSPORT1 (Life Technologies) y similares pueden ser usados. El promotor polihedrina baculovirus puede ser usado en células de insecto. Promotores o mejoradores derivados de los genomas de células de plantas (por ejemplo, shock de calor, RUBISCO, y genes de proteínas de almacenamiento) o de virus de plantas (por ejemplo, promotores virales o secuencias líder) pueden ser clonados en el vector. En sistemas celulares de mamíferos, promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos son preferibles. Si es necesario generar una línea celular que contiene copias múltiples de una secuencia de nucleótido codificando AdipoR1, vectores basados en SV40 o EBV pueden ser usados con un marcador seleccionable apropiado. Sistemas de Expresión Bacteriana y de Levadura

En sistemas bacterianos, un número de vectores de expresión pueden ser seleccionados. Por ejemplo, cuando se necesita una cantidad grande de AdipoR1 para la inducción de anticuerpos, vectores que dirigen expresión de alto nivel de proteínas de fusión que son rápidamente purificadas pueden ser usados. Tales vectores incluyen, pero no están limitados a, vectores multifuncionales de E.coli de clonación y expresión tales como BLUESCRIPT (Stratagene). En un vector BLUESCRIPT, una secuencia codificando AdipoR1 puede ser ligada en el vector en esquema con secuencias para el Met amino-terminal y los 7 residuos subsecuentes de β-galactosidasa para que una proteína híbrida sea producida. Vectores pIN o vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) también pueden ser usados para expresar polipéptidos externos como proteínas de fusión con glutationa S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden ser fácilmente purificadas de células lisadas por adsorción a cuentas de glutatuona-agarosa seguidas por elución en la presencia de glutationa libre. Las proteínas hechas en tales sistemas pueden ser diseñadas para incluir heparina, trombina, o sitios de corte de proteasa factor Xa para que el polipéptido clonado de interés pueda ser liberado de la fracción GST cuando se desee. Sistemas de Expresión de Planta e Insecto

Si se usan vectores de expresión de planta, la expresión de secuencias que codifican AdipoR1 puede ser manejada por cualquiera de un número de promotores. Por ejemplo, los promotores virales tales como el promotor 35S y el promotor 19S de CaMV pueden ser usados solos o en combinación con la secuencia líder omega de TMV. Alternativamente, pueden usarse los promotores de plantas tales como la pequeña subunidad de RUBISCO o promotores de shock de calor. Éstas construcciones pueden ser introducidas en células de plantas por transformación de ADN directa o por transfección mediada por patógenos.

Un sistema de insecto también puede ser usado para expresar AdipoR1. Por ejemplo, en uno de esos sistemas, el virus polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV), se usa como un vector para expresar genes externos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichopulsia. Las ecuencias que codifican AdipoR1 pueden ser clonadas en una región no esencial del virus, tal como el gen polihedrina, y ubicadas bajo control del promotor polihedrina. La inserción exitosa de AdipoR1 hace inactivo al gen polihedrina y produce virus recombinante que carece de proteína de capa. Los virus recombinantes pueden entonces ser usados para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en los cuales AdipoR1puede ser expresado.

Sistemas de Expresión Mamífera

Un número de sistemas de expresión basados en virus pueden ser usados para expresar AdipoR1 en células huésped de mamífero. Por ejemplo, si un adenovirus es usado como un vector de expresión, secuencias que codifican AdipoR1 pueden ser ligadas en un complejo de transcripción/-traslación de adenovirus que comprende el promotor tardío y secuencia guía tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral puede ser usada para obtener un virus viable que es capaz de expresar AdipoR1 en células huésped infectadas [Engelhard, (1994)]. Si se desea, pueden usarse mejoradores de transcripción, tales como el mejorador de virus de sarcoma Rous (RSV), para aumentar la expresión en células huésped de mamífero.

Los cromosomas artificiales humanos (HACs) también pueden ser usados para entregar fragmentos más grandes de ADN que pueden ser contenidos y expresados en un plásmido. HACs de 6M a 10M son construidos y entregados a células a través de métodos de entrega convencionales (por ejemplo, liposomas, polímeros amino policatiónicos, o vesículas). Las señales de iniciación específicas también pueden ser usadas para lograr una traslación más eficiente de secuencias que codifican AdipoR1. Tales señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En casos donde las secuencias que codifican AdipoR1 , su codón de iniciación, y secuencias corriente arriba son insertadas en el vector de expresión apropiado, no se necesitan señales de control transcripcional o traslacional adicionales. Sin embargo, en casos donde solo la secuencia de codificación, o un fragmento del mismo, es insertado, señales de control traslacional exógenas (incluyendo el codón de iniciación ATG) deben ser provistas. El codón de iniciación deber estar en el marco de lectura correcto para asegurar traslación del inserto completo. Elementos exógenos traslacionales y codones de iniciación pueden ser de varios orígenes, tanto naturales como sintéticos. Células Huésped

Una cepa de célula huésped puede ser elegida por su habilidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar el AdipoR1 expresado en la forma deseada. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no están limitadas a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. Un procesamiento post-traslacional que corta una forma “prepro” del polipéptido también puede ser usado para facilitar inserción correcta, duplicación y/o función. Diferentes células huésped que tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para actividades post-traslacionales (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38), están disponibles de la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) y pueden ser elegidos para asegurar la modificación correcta y procesamiento de la proteína externa.

La expresión estable es preferida para la producción a largo plazo, de alto rendimiento, de proteínas recombinantes. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan establemente AdipoR1 pueden ser transformadas usando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo vector o uno separado. Seguido de la introducción del vector, se puede permitir a las células crecer por 1-2 días en un medio enriquecido antes de que sean cambiadas a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es el de dar resistencia a selección, y su presencia permite crecimiento y recuperación de células que expresan exitosamente las secuencias AdipoR1 introducidas. Los clones resistentes de células establemente transformadas pueden ser proliferadas usando técnicas de cultivo tisular apropiadas para el tipo de célula. Cualquier número de sistemas de selección puede ser usado para recuperar líneas celulares transformadas. Éstos incluyen, pero no están limitados a, genes de virus herpes simplex timidina quinasa [Logan, (1984)] y de adenina fosforibosiltransferasa [Wigler, (1977)] que pueden ser usados en células tk-o arprt -, respectivamente. También, resistencia antimetabolito, antibiótica, o herbicida puede ser usada como base para selección. Por ejemplo, dhfr confiere resistencia a metotrexato [Lowy, (1980)], npt confiere resistencia a los aminoglicosidos, neomicina y G-418 [Wigler, (1980)], y als y pat confiere resistencia a clorsulfuron y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente [Colbere-Garapin, 1981]. Genes seleccionables adicionales han sido descritos. Por ejemplo, trpB permite que las células utilicen indol en lugar de triptofan, o hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina. Marcadores visibles tales como antocianinas, βglucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, pueden ser usados para identificar transformantes y para cuantificar la cantidad de expresión de proteína transitoria o estable atribuible a un sistema vector específico.

Detectando Expresión de Polipéptido

Aunque la presencia de expresión de gen marcador sugiere que un nucleótido de AdipoR1 también está presente, su presencia y expresión puede tener que ser confirmada. Por ejemplo, si una secuencia codificando AdipoR1 es insertada dentro de una secuencia de gen marcador, células transformadas que contienen secuencias que codifican AdipoR1 pueden ser identificadas por la ausencia de la función de un gen marcador. Alternativamente, un gen marcador puede ser ubicado en tándem con una secuencia codificando AdipoR1 bajo el control de un único promotor. Expresión del gen marcador en respuesta a inducción o selección usualmente indica expresión de polinucleótido de AdipoR1.

Alternativamente, las células huésped que contienen un polinucleótido AdipoR1 y que expresan AdipoR1 pueden ser identificadas por una variedad de procedimientos conocidas para aquellos diestros en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no están limitados a, hibridaciones de ADN-ADN o ADN-ARN y técnicas de bioensayos de proteína o inmunoensayos que incluyen tecnologías basadas en membrana, solución o chip para la detección y/o cuantificación de ácido nucleico o proteína. Por ejemplo, la presencia de una secuencia de polinucleótido codificando AdipoR1 puede ser detectada por hibridación ADN-ADN o ADN-ARN o amplificación usando sondas o fragmentos o fragmentos de polinucleótidos codificando AdipoR1. Ensayos basados en amplificación de ácido nucleico involucran el uso de oligonucleótidos seleccionados de secuencias que codifican AdipoR1 para detectar transformantes que contienen un polinucleótido AdipoR1.

Una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de AdipoR1, usando anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para el polipéptido, son conocidos en la técnica. Ejemplos incluyen ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y clasificación de células activado por fluorescencia (FACS). Un inmunoensayo de dos sitios, con base monoclonal usando anticuerpos monoclonales reactivos a dos epitopos que no interfieren en AdipoR1 puede ser usado, o un ensayo de enlace competitivo puede ser usado.

Una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación son conocidas por aquellos diestros en la técnica y pueden ser usadas en varios ensayos de ácido nucleico y de amino ácidos. Medios para producir hibridación marcada o sondas de PCR para detectar secuencias relacionadas a polinucleótidos codificando AdipoR1 incluyen oligomarcado, traslación por muesca, marcado de extremo, o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. Alternativamente, secuencias codificando AdipoR1 pueden ser clonadas en un vector para la producción de una sonda mARN. Tales vectores son conocidos en la técnica, están disponibles comercialmente, y pueden ser usados para sintetizar sondas de ARN in vitro por adición de nucleótidos marcados y una polimerasa de ARN apropiada tal como T7, T3, o SP6. Estos procedimientos pueden ser realizados usando una variedad de juegos comercialmente disponibles (Amersham Pharmacia Biotech, Promega, y US Biochemical). Moléculas reporteras apropiadas o marcadores que pueden ser usados para facilidad de detección incluyen radionúclidos, enzimas, y agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, o cromogénicos, como también sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares. Expresión y Purificación de Polipéptidos

Células huésped transformadas con polinucleótidos AdipoR1 pueden ser cultivadas bajo condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína del cultivo celular. El polipéptido producido por una célula transformada puede ser secretado o contenido intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. Como será entendido por aquellos de destreza en la técnica, vectores de expresión que contienen polinucleótidos AdipoR1 pueden ser diseñados para contener secuencias de señal que dirigen la secreción de AdipoR1 soluble a través de una membrana celular procariótica o eucariótica o que dirigen la inserción de membrana de AdipoR1 dirigido a membrana.

Como discutido arriba, otras construcciones pueden ser usadas para unir una secuencia codificando AdipoR1 a una secuencia de nucleótido codificando un dominio de polipéptido que va a facilitar la purificación de proteínas solubles. Tales dominios de facilitación de purificación incluyen, pero no están limitados a, péptidos queladores de metal tales como módulos de histidina-triptofan que permiten la purificación en metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten purificación en inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). La inclusión de secuencias enlazadoras que se pueden cortar tales como aquellas especificas para Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y AdipoR1 también pueden ser usadas para facilitar la purificación. Un vector de expresión tal provee para expresión de una proteína de fusión que contiene AdipoR1 y residuos de histidina 6 que preceden una tioredoxina o un sitio de corte de enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación por IMAC (cromatografía de afinidad de ion de metal inmovilizado) Maddox, (1983)], mientras que el sitio de corte de enteroquinasa provee un medio para purificar AdipoR1 de la proteína de fusión [Porath, (1992)]. Síntesis Química

Secuencias que codifican AdipoR1 pueden ser sintetizadas, completas o en parte, usando métodos químicos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, el mismo AdipoR1 puede ser producido usando métodos químicos para sintetizar su secuencia de amino ácido, tal como por síntesis de péptido directa usando técnicas de fase solida. La síntesis de proteína puede ser realizada usando técnicas manuales o por automatización. Síntesis automatizada puede ser lograda, por ejemplo, usando Applied Biosystems 431 A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Opcionalmente, fragmentos de AdipoR1 pueden ser sintetizados separadamente y combinados usando métodos químicos para producir una molécula de tamaño completo.

El péptido recién sintetizado puede ser purificado sustancialmente por cromatografía liquida preparativa de alto rendimiento. La composición de un AdipoR1 sintético puede ser confirmada por análisis o secuenciamiento de amino ácido. Adicionalmente, cualquier porción de la secuencia de amino ácido de AdipoR1 puede ser alterada durante síntesis directa y/o combinada usando métodos químicos con secuencias de otras proteínas para producir un polipéptido variante o una proteína de fusión. Producción de Polipéptidos Alterados

Como será entendido por aquellos de destreza en la técnica, puede ser ventajoso producir polinucleótidos AdipoR1 que posean codones que no ocurren naturalmente. Por ejemplo, codones preferidos por un huésped particular procariótico o eucariótico pueden ser seleccionados para aumentar el índice de expresión de proteína o para producir una transcripción de ARN que tenga propiedades deseables, tales como una vida media que sea más larga que aquella de una transcripción generada de una secuencia que ocurre naturalmente.

Las secuencias nucleotidas a las que se hace referencia aquí pueden ser diseñadas usando métodos generalmente conocidos en la técnica para alterar polinucleótidos de AdipoR1 para una variedad de razones, incluyendo pero no limitado a, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento, y/o expresión del polipéptido o producto mARN. Mezclado de ADN por fragmentación aleatoria y re-ensamblaje por PCR de fragmentos genéticos y oligonucleótidos sintéticos puede ser usado para diseñar las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio puede ser usada para insertar nuevos sitios de restricción, alterar patrones de glicosilación, cambiar preferencia de codón, producir variantes de empalme, introducir mutaciones, y así sucesivamente.

Anticuerpos

Cualquier tipo de anticuerpo conocido en la técnica puede ser generado para enlazarse específicamente a un epítopo de AdipoR1.

“Anticuerpo” como es usado aquí incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, como también fragmentos del mismo, tales como Fab, F(ab’)2, y Fv, que son capaces de enlazar un epítopo de AdipoR1. Típicamente, por lo menos 6, 8, 10, o 12 amino ácidos contiguos son requeridos para formar un epítopo. Sin embargo, epítopos que involucran amino ácidos no contiguos pueden requerir más, por ejemplo, por lo menos 15, 25, o 50 amino ácidos. Un anticuerpo que se enlaza específicamente a un epítopo de AdipoR1 puede ser usado terapéuticamente, al igual que también en ensayos inmunoquímicos, tales como Western blots, ELISAs, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos, inmunoprecipitaciones, u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en la técnica. Tales inmunoensayos típicamente involucran la medición de formación de complejos entre un inmunogen y un anticuerpo que se enlaza específicamente al inmunogen de AdipoR1.

Típicamente, un anticuerpo que se enlaza específicamente a AdipoR1 provee una señal de detección de por lo menos 5-, 10-, o 20-veces más alta que una señal de detección provista con otras proteínas cuando son usadas en un ensayo inmunoquímico. Preferiblemente, anticuerpos que se enlazan específicamente a AdipoR1 no detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y pueden inmunoprecipitar al AdipoR1 de la solución.

AdipoR1 puede ser usado para inmunizar un mamífero, tal como un ratón, rata, conejo, cobayo, mono, o humano, para producir anticuerpos policlonales. Si es deseado, AdipoR1 puede ser conjugado a una proteína portadora, tal como albúmina de suero bovino, tiroglobulina, y hemocianina de lapa. Dependiendo de la especie huésped, varios adyuvantes pueden ser usados para aumentar la respuesta inmunológica. Tales adyuvantes incluyen, geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio), y sustancias de superficie activa (por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa, y dinitrofenol). Entre adyuvantes usados en humanos, BCG (bacilli Calmette-Guerin)y Corynebacterium parvum son especialmente útiles.

Anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente a AdipoR1 pueden ser preparados usando cualquier técnica que provea para la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Éstas técnicas incluyen, pero no están limitadas a, la técnica de hibridoma, la técnica de hibridoma célula B humana, y la técnica de EBV-hibridoma [Roberge, (1995)].

Adicionalmente, técnicas desarrolladas para la producción de “anticuerpos quiméricos”, el empalme de genes de anticuerpo de ratón a genes de anticuerpo humano para obtener una molécula con especificidad de antígeno y actividad biológica apropiadas, pueden ser usadas. Anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos también pueden ser “humanizados” para prevenir que un paciente monte una respuesta inmune contra el anticuerpo cuando es usado terapéuticamente. Tales anticuerpos pueden ser suficientemente similares en secuencia a anticuerpos humanos para ser usados directamente en terapia o pueden requerir alteración de algunos residuos clave. Diferencias de secuencia entre anticuerpos de roedor y secuencias humanas pueden ser minimizados remplazando residuos que difieren de aquellos en secuencias humanas por mutagénesis sitio dirigida de residuos individuales o hacer un enrejado de todas las regiones que determinan complementariedad. Anticuerpos que se enlazan específicamente a AdipoR1 pueden contener sitios de enlace de antígeno que son parcialmente o completamente humanizadas, como es revelado en U.S. 5,565,332.

Alternativamente, técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una cadena pueden ser adaptados usando métodos conocidos en la técnica para producir anticuerpos de una sola cadena que se enlazan específicamente a AdipoR1. Anticuerpos con especificidad relacionada, pero de distinta composición idiotípica, pueden ser generados por redistribución de cadena de bibliotecas de inmunoglobina combinatorias aleatorias. Anticuerpos de una cadena también pueden ser construidos usando un método de amplificación de ADN, tal como PCR, usando cADN hibridoma como una plantilla. Anticuerpos de una cadena pueden ser mono-o bi específicos, y puede ser bivalente o tetravalente. Se enseña la construcción de anticuerpos tetravalentes, bi específicos de una cadena. Una secuencia de nucleótido codificando un anticuerpo de una cadena puede ser construida usando síntesis de nucleótidos manual o automática, clonados en una construcción de expresión usando métodos de ADN recombinante estándar, e introducido en una célula para expresar la secuencia codificadora, como descrito arriba. Alternativamente, anticuerpos de una cadena pueden ser producidos directamente usando, por ejemplo, tecnología de fagos filamentosos.

Los anticuerpos que se enlazan específicamente a AdipoR1 también pueden ser producidos induciendo producción in vivo en la población de linfocitos o explorando bibliotecas de inmunoglobulina o paneles de reactivos de enlace altamente específicos. Otros tipos de anticuerpos pueden ser construidos y usados terapéuticamente en métodos de la invención. Por ejemplo, anticuerpos quiméricos pueden ser construidos como es revelado en WO 93/03151. Proteínas de enlace que son derivadas de inmunoglobulinas y que son multivalentes y multi-específicas, tales como los “anticuerpos” descritos en WO 94/13804, también pueden ser preparados.

Anticuerpos de acuerdo con la invención pueden ser purificados por métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, anticuerpos pueden ser purificados por afinidad por paso sobre una columna a la que está enlazada AdipoR1. Los anticuerpos enlazados pueden entonces ser eluídos de la columna usando un amortiguador con una alta concentración de sal. Oligonucleótidos Antisentido

Oligonucleótidos antisentido son secuencias de nucleótido que son complementarias a una secuencia especifica de ADN o ARN. Una vez introducidas en una célula, los nucleótidos complementarios se combinan con secuencias naturales producidas por la célula para formar complejos y bloquear transcripción o traslación. Preferiblemente, un oligonucleótido antisentido es por lo menos de 11 nucleótidos en longitud, pero puede ser de por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 o mas nucleótidos de largo. Secuencias más largas también pueden ser usadas. Moléculas de oligonucleótido antisentido pueden ser provistas en una construcción de ADN e introducidas en una célula como descrito arriba para disminuir el nivel de productos de gen AdipoR1 en la célula.

Oligonucleótidos antisentido pueden ser deoxiribonucleótidos, ribonucleótidos, o una combinación de ambos. Los oligonucleótidos pueden ser sintetizados manualmente o por un sintetizador automático, uniendo covalentemente el extremo 5’ de un nucleótido con el extremo 3’ de otro nucleótido con uniones internucleótido no-fosfodiéster tales como alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos, alquilfosfonotioatos, alquilfosfonatos, fosforamidatos, esteres de fosfato, carbamatos, acetamidato, esteres de carboximetil, carbonatos, y triésteres de fosfato.

Pueden obtenerse modificaciones de expresión de genes de AdipoR1 diseñando oligonucleótidos antisentido que van a formar duplos para las regiones de control, 5’, o regulatorias del gen de AdipoR1. Se prefieren oligonucleótidos derivados del sitio de iniciación de transcripción, por ejemplo, entre las posiciones -10 y +10 desde el sitio de inicio. Similarmente, la inhibición puede ser lograda usando metodología de emparejamiento de bases de “triple hélice”. Emparejamiento de tripe hélice es útil porque causa inhibición de la habilidad de la doble hélice para abrirse suficientemente para el enlace de polimerasas, factores de transcripción, o chaperones. Avances terapéuticos usando ADN triple han sido descritos en la literatura [Nicholls, (1993)]. Un oligonucleótido antisentido también puede ser diseñado para bloquear la traslación de mARN previniendo que la transcripción se enlace a los ribosomas.

No se requiere una complementariedad precisa para la formación exitosa de complejo entre un oligonucleótido antisentido y la secuencia de complementariedad de un polinucleótido AdipoR1. Oligonucleótidos antisentido que comprenden, por ejemplo, 2, 3, 4, o 5 o más trayectos de nucleótidos contiguos que son precisamente complementarios a un polinucleótido AdipoR1, cada uno separado por un trayecto de nucleótidos contiguos que no son complementarios a nucleótidos AdipoR1 adyacentes, pueden proveer suficiente especificidad de objetivo para mARN de AdipoR1. Preferiblemente, cada trayecto de nucleótidos contiguos complementarios es de por lo menos 4, 5, 6, 7, u 8 o más nucleótidos de longitud. Secuencias de intervención no complementarias son preferiblemente 1, 2, 3, o 4 nucleótidos en longitud. Alguien diestro en la técnica puede fácilmente usar el índice de fusión calculado de una pareja antisentidosentido para determinar el grado de desacoplamiento que será tolerado entre un oligonucleótido antisentido particular y una secuencia polinuecleotida de AdipoR1 particular. Oligonucleótidos antisentido pueden ser modificados sin afectar su habilidad para hibridarse a un polinucleótido AdipoR1. Éstas modificaciones pueden ser internas o en uno o ambos extremos de la molécula antisentido. Por ejemplo, uniones fosfato internucleosido pueden ser modificadas agregando fracciones colesteril o diamina con variados números de residuos de carbono entre los grupos amino y la ribosa terminal. Bases modificadas y/o azúcares, tales como arabinosa en lugar de ribosa, o un oligonucleótido 3’, 5’-sustituido en el cual el grupo 3’ hidroxilo o el grupo 5’ fosfato son sustituidos, también puede ser usado en un oligonucleótido antisentido modificado. Estos oligonucleótidos modificados pueden ser preparados por métodos bien conocidos en la técnica. Ribozimas

Las ribozimas son moléculas de ARN con actividad catalítica [Uhlmann, (1987)]. Las ribozimas pueden ser usadas para inhibir función genética cortando una secuencia de ARN, como es conocido en la técnica. El mecanismo de acción de ribozima involucra hibridación secuencia-específica de la molécula de ribozima a ARN objetivo complementario, seguido por corte endonucleolítico. Ejemplos incluyen moléculas de ribozima con motivo decorativo de cabeza de martillo que puede catalizar específica y eficientemente cortes endonucleolíticos de secuencias nucleótidas especificas. La secuencia codificadora de un polinucleótido de AdipoR1 puede ser usada para generar ribozimas que se van a enlazar específicamente a mARN transcrito de un polinucleótido de AdipoR1. Métodos para diseñar y construir ribozimas que pueden cortar otras moléculas de ARN en trans de una forma altamente secuencia específica han sido desarrollados y descritos en la técnica. Por ejemplo, la actividad de corte de ribozimas puede ser objetivizada a ARNs específicos diseñando una región de “hibridación” discreta en la ribozima. La región de hibridación contiene una secuencia complementaria al ARN objetivo y por lo tanto se hibrida específicamente con el ARN objetivo.

Se puede identificar sitios de corte de ribozima específicos dentro de un objetivo ARN AdipoR1 escaneando la molécula objetivo por sitios de corte de ribozima que incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU, y GUC. Una vez identificados, secuencias cortas de ARN de entre 15 y 20 ribonucleótidos que corresponden a la región del ARN objetivo que contienen el sitio de corte pueden ser evaluadas para características estructurales secundarias que pueden hacer que el objetivo sea inoperable. Apropiabilidad de candidatos de objetivos de ARN de AdipoR1 también puede ser evaluada probando la accesibilidad a hibridación con oligonucleótidos complementarios usando ensayos de protección de ribonucleasa. Las secuencias de nucleótido mostradas en SEQ ID NO:1 y su complemento proveen fuentes de secuencias de región de hibridación apropiadas. Secuencias complementarias más largas pueden ser usadas para aumentar la afinidad de la secuencia de hibridación al objetivo. Las regiones de hibridación y corte de la ribozima pueden ser relacionadas integralmente tal que al hibridarse al ARN objetivo a través de regiones complementarias, la región catalítica de la ribozima pueda cortar el objetivo.

Las ribozimas pueden ser introducidas a células como parte de una construcción de ADN. Métodos mecánicos, tales como micro inyección, transfección mediada por liposoma, electroporación, o precipitación de fosfato de calcio, pueden ser usadas para introducir una construcción de ADN que contiene ribozima en células en las cuales es deseado disminuir la expresión de AdipoR1. Alternativamente, si se desea que las células retengan establemente la construcción de ADN, la construcción puede ser suplida sobre un plásmido y mantenida como un elemento separado o integrado en el genoma de las células, como es conocido en la técnica. Una construcción de ADN que codifica para ribozima puede incluir elementos regulatorios transcripcionales , tales como un elemento promotor, un mejorador o elemento UAS, y una señal terminadora transcripcional, para controlar la transcripción de ribozimas en las células (U.S. 5,641,673). Ribozimas también pueden ser construidas para proveer un nivel adicional de regulación, para que la destrucción de mARN ocurra solamente cuando una ribozima y un gen objetivo sean inducidos en las células. Exploración/ Ensayos de Exploración

Reguladores

Los reguladores como son usados aquí, se refieren a compuestos que afectan la actividad de un AdipoR1 in vivo y/o in vivo. Reguladores pueden ser agonistas y antagonistas de un polipéptido de AdipoR1 y pueden ser compuestos que ejercen su efecto en la actividad de AdipoR1 a través de expresión, a través de modificaciones post-traslacionales o por otros medios. Agonistas de AdipoR1 son moléculas que, cuando se enlazan a AdipoR1, aumentan o prolongan la actividad de AdipoR1. Agonistas de AdipoR1 incluyen proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, moléculas pequeñas, o cualquier otra molécula que active AdipoR1. Antagonistas de AdipoR1 son moléculas que, cuando son enlazadas a AdipoR1, disminuyen la cantidad o la duración de la actividad de AdipoR1. Antagonistas incluyen proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, anticuerpos, pequeñas moléculas, o cualquier otra molécula que disminuye la actividad de AdipoR1.

El término “modular”, como aparece aquí, hace referencia a un cambio en la actividad de polipéptido de AdipoR1. Por ejemplo, modulación puede causar un aumento o una disminución en la actividad de proteína, características de enlace, u cualquier otra propiedad biológica, funcional, o inmunológica de AdipoR1.

Como es usado aquí, los términos “enlace especifico” o “enlazando específicamente” se refieren a aquella interacción entre una proteína o péptido y un agonista, un anticuerpo, o un antagonista. La interacción es dependiente de la presencia de una estructura particular de proteína reconocida por la molécula de enlace (es decir, el determinante antigénico o epítopo). Por ejemplo, si un anticuerpo es específico para el epítopo “A” la presencia de un polipéptido que contiene el epítopo A, o la presencia de A no marcado libre, en una reacción que contiene A marcado libre y el anticuerpo va a reducir la cantidad de A marcado que se enlaza al anticuerpo. Indicaciones Terapéuticas y Métodos

El presente solicitante ha encontrado que AdipoR1 es expresado en diversos tejidos humanos.

Enfermedades Gastrointestinales y de Hígado

Las enfermedades gastrointestinales comprenden enfermedades primarias y secundarias, agudas o crónicas de los órganos del tracto gastrointestinal que pueden ser adquiridas o heredadas, benignas o malignas o metaplásicas, y que pueden afectar los órganos del tracto gastrointestinal o el cuerpo completo. Éstas comprenden pero no están limitadas a 1) problemas del esófago como acalasia, acalasia vigorosa, disfagia, falta de coordinación cricofaríngea, disfagia pre-esofágica, espasmo esofágico difuso, sensación de globus, metaplasia de Barrett, reflujo gastroesofágico, 2) problemas del estómago y duodeno como dispepsia funcional, inflamación de la mucosa gástrica, gastritis, gastritis por estrés, gastritis crónica erosiva, atrofia de las glándulas gástricas, metaplasia de los tejidos gástricos, ulceras gástricas, ulceras duodenales, neoplasmas del estomago, 3) problemas del páncreas como pancreatitis aguda o crónica, insuficiencia de los tejidos exocrinos o endocrinos del páncreas como esteatorrea, diabetes, neoplasmas del páncreas exocrino o endocrino como 3.1) síndrome de neoplasia endocrina múltiple, adenocarcinoma ductal, cistadenocarcinoma, tumores de las células de islet, insulinoma, gastrinoma, tumores carcinoides, glucagonoma, síndrome de Zollinger-Ellison, síndrome de Vipoma, síndrome de mala absorción, 4) problemas del intestino como enfermedades crónicas inflamatorias del intestino, enfermedad de Crohn, ileus, diarrea y constipación, inercia colónica, megacolon, síndrome de mala absorción, colitis ulcerativa, 4.1) problemas funcionales del intestino como síndrome del intestino irritable, 4.2) neoplasmas del intestino como poliposis familiar, adenocarcinoma, linfoma maligno primario, tumores carcinoides, sarcoma de Kaposi, pólipos, cáncer de colon y recto.

Las enfermedades del hígado comprenden enfermedades primarias o secundarias, agudas o crónicas

o daño al hígado que puede ser adquirido o heredado, benigno o maligno, y que puede afectar el hígado o el cuerpo completo. Ellos comprenden pero no están limitados a problemas del metabolismo de bilirrubina, ictericia, síndromes de Gilbert, Crigler-Najjar, Dubin-Johnson y Rotor; colestasis intrahepática, hepatomegalia, hipertensión portal, ascitis, síndrome de Budd-Chiari, encefalopatía portal-sistémica, hígado graso, esteatosis, síndrome de Reye, enfermedades del hígado por alcohol, hepatitis alcohólica o cirrosis, fibrosis y cirrosis, fibrosis y cirrosis del hígado debido a errores de nacimiento de metabolismo o sustancias exógenas, enfermedades de almacenamiento, síndromes de Gaucher, Zellweger, Wilson-enfermedad, hepatitis aguda o crónica, hepatitis viral y sus variantes, condiciones inflamatorias del hígado debido a virus, bacteria, hongos, protozoa, helmintos; problemas del hígado inducidos por fármacos, enfermedades crónicas del hígado como colangitis esclerosa primaria, deficiencia de alfa1-antitripsina, cirrosis biliar primaria, problemas del hígado postoperatorios como colestasis intrahepática postoperatoria, granulomas hepáticos, problemas vasculares del hígado asociados con enfermedad sistémica, neoplasmas benignos o malignos del hígado, alteración del metabolismo del hígado en el recién nacido o en el nacido prematuro.

El AdipoR1 humano es altamente expresado en los siguientes tejidos del sistema gastroenterológico: estómago, tumor del estómago, intestino delgado, recto, tumor del recto. La expresión en los tejidos arriba mencionados demuestra que el AdipoR1 humano o mARN puede ser utilizado para diagnosticar los problemas gastroenterológicos. Adicionalmente la actividad del AdipoR1 humano puede ser modulada para tratar problemas gastroenterológicos. Diagnósticos

En otra modalidad, anticuerpos que específicamente enlazan a AdipoR1 pueden ser usados para el diagnóstico de problemas caracterizados por la expresión de AdipoR1 o en ensayos para monitorear pacientes siendo tratados con AdipoR1 o agonistas, antagonistas, e inhibidores de AdipoR1. Anticuerpos útiles para propósitos diagnósticos pueden ser preparados de la misma manera como aquellos descritos arriba para terapéuticos. Ensayos diagnósticos para AdipoR1 incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y un marcador para detectar AdipoR1 en fluidos del cuerpo humano o en extractos de células o tejidos. Los anticuerpos pueden ser usados con o sin modificación, y pueden ser marcados por uniones covalentes o no covalentes con una molécula reportera. Una amplia variedad de moléculas reporteras, varias de las cuales son descritas arriba, son conocidas en la técnica y pueden ser usadas.

Una variedad de protocolos para medir AdipoR1 incluyendo ELISAs, RIAs, y FACS, son conocidos en la técnica y proveen una base para diagnosticar niveles alterados o anormales de expresión de AdipoR1. Valores normales o estándar para expresión de AdipoR1 son establecidos combinando fluidos corporales o extractos de células tomadas de sujetos mamíferos normales, preferiblemente humanos, con anticuerpo para AdipoR1 bajo condiciones apropiadas para formación de complejos. La cantidad de formación de complejo estándar puede ser cuantificada por varios métodos, preferiblemente por medios fotométricos. Cantidades de AdipoR1 expresadas en muestras de sujetos de tejidos de biopsias son comparadas con los valores estándar. Desviación entre valores estándar y del sujeto establece los parámetros para el diagnóstico de enfermedad.

En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican AdipoR1 pueden ser usados para propósitos diagnósticos. Los polinucleótidos que pueden ser usados incluyen secuencias de oligonucleótidos, moléculas de ARN y ADN complementarias, y PNAs. Los polinucleótidos pueden ser usados para detectar y cuantificar la expresión genética en tejidos de biopsia en los cuales la expresión de AdipoR1 puede ser correlacionada con enfermedad. El ensayo diagnóstico puede ser usado para distinguir entre ausencia, presencia, y exceso de expresión de AdipoR1, y para monitorear la regulación de niveles de AdipoR1 durante intervención terapéutica.

Secuencias polinucleótidas codificando AdipoR1 pueden ser usadas para el diagnóstico de enfermedades cardiovasculares, enfermedades dermatológicas enfermedades gastroenterológicas, cáncer, enfermedades hematológicas, inflamación, enfermedades respiratorias, enfermedades neurológicas, y enfermedades urológicas asociadas con expresión de AdipoR1. Las secuencias polinucleótidas codificando AdipoR1 pueden ser usadas en análisis de Southern, Northern, o dot-blot, u otras tecnologías con base de membrana; en tecnologías de PCR; en regleta de medición, clavija, y ensayos ELISA; y en microdisposiciones utilizando fluidos o tejidos de biopsias de pacientes para detectar expresión alterada de AdipoR1. Tales métodos cualitativos o cuantitativos son bien conocidos en la técnica. La presente invención provee un método para el diagnóstico de cirrosis de hígado.

Las secuencias de nucleótido codificando AdipoR1 pueden ser útiles en ensayos que detectan la presencia de problemas asociados, particularmente aquellos mencionados arriba. Las secuencias de nucleótido que codifican AdipoR1 pueden ser marcadas por métodos estándar y agregadas a una muestra de fluído o tejido de un paciente bajo condiciones apropiadas para la formación de complejos de hibridación. Después de un periodo de incubación apropiado, la muestra es lavada y la señal es cuantificada y comparada con un valor estándar. Si la cantidad de señal en la muestra del paciente es alterada significativamente de aquella de una muestra control comparable, las secuencias de nucleótido se han hibridado con secuencias de nucleótido en la muestra, y la presencia de niveles alterados de secuencias de nucleótido codificando AdipoR1 en la muestra indica la presencia del problema asociado. Tales ensayos pueden también ser usados para evaluar la eficiencia de un régimen de tratamiento terapéutico particular en estudios animales, en ensayos clínicos, o en el monitoreo de tratamiento de un paciente individual.

Para poder proveer una base para el diagnóstico de enfermedades cardiovasculares, enfermedades dermatológicas, enfermedades gastroenterológicas, cáncer, enfermedades hematológicas, inflamación, enfermedades respiratorias, enfermedades neurológicas y enfermedades urológicas asociadas con la expresión de AdipoR1, un perfil normal o estándar para expresión es establecido. Esto puede ser logrado combinando fluidos corporales o extractos de células tomados de sujetos normales, tanto animales como humanos, con una secuencia, o un fragmento del mismo, codificando AdipoR1, bajo condiciones apropiadas para hibridación o amplificación. Hibridación estándar puede ser cuantificada comparando los valores obtenidos de sujetos normales con valores de un experimento en el que una cantidad conocida de un polinucleótido sustancialmente purificado es usada. Valores estándar obtenidos de muestras normales pueden ser comparados con valores obtenidos de muestras de pacientes que son sintomáticos para una enfermedad. Desviación de valores estándar es usada para establecer la presencia de una enfermedad.

Otra técnica para exploración de fármacos que puede ser usada provee para una exploración de alto rendimiento de compuestos que tienen afinidad de enlace adecuada para la proteína de interés como descrita en la aplicación PCT publicada WO84/03564. En este método, grandes números de diferentes compuestos pequeños de prueba son sintetizados en un sustrato sólido, tales como clavijas plásticas u otra superficie. Los compuestos de prueba son reaccionados con AdipoR1, o fragmentos del mismo, y lavados. AdipoR1 enlazado es entonces detectado por métodos bien conocidos en la técnica. AdipoR1 purificado puede también ser cubierto directamente sobre placas para usar en las técnicas de exploración de fármacos anteriormente mencionadas. Alternativamente, anticuerpos no neutralizantes pueden ser usados para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte solido.

En otra modalidad, uno puede usar ensayos de exploración de fármacos competitivos en los cuales anticuerpos neutralizantes capaces de enlazar AdipoR1 compiten específicamente con un compuesto de prueba para enlazar AdipoR1. De esta forma, anticuerpos pueden ser usados para detección.

Los ejemplos de abajo son provistos para ilustrar el sujeto de la invención. Estos ejemplos son provistos por medio de ilustración y no son incluidos para el propósito de limitar la invención.

La expresión de AdipoR1 humano en tejidos cardiovasculares y relacionados con inflamación (como descrito arriba) sugiere un uso particular – pero no limitado-de AdipoR1para el diagnóstico y modulación de inflamación y enfermedades cardiovasculares. Además la expresión arriba descrita sugiere una utilización – pero no limitada a – de AdipoR1 para enfermedades dermatológicas, enfermedades endocrinas, enfermedades metabólicas, cáncer, enfermedades gastroenterológicas y enfermedades hematológicas.

Ejemplos

Ejemplo 1: Búsqueda para secuencias homólogas en bases de datos de secuencia públicos

El grado de homología puede ser rápidamente calculado por métodos conocidos. Métodos preferidos para determinar homología son diseñados para dar el ajuste más grande entre las secuencias probadas, Métodos para determinar homología son codificados en programas de computador públicamente disponibles tales como BestFit, BLASTP, BLASTN, y FASTA. Los programas de BLAST están disponibles públicamente de NCBI y otras fuentes en el internet.

Para AdipoR1 los siguientes aciertos a secuencias conocidas fueron identificados usando el algoritmo de BLAST [Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ; Nucleic Acids Res 1997 Sep 1; 25(17): 3389-402] y los siguientes grupos de parámetros: matriz = BLOSUM62 y filtro de baja complejidad. Las siguientes bases de datos fueron exploradas: NCBI (base de datos no redundante) y DERWENT base de datos de patentes (Geneseq).

Se encontraron los siguientes aciertos: >gb|BC001594.2| receptor 1 de adiponectina de Homo sapiens, mARN (cADN clon MGC:710IMAGE:2988737), cds completo Longitud = 2084, Puntuación = 3905 bits (2031), Anticipado = 0.0, Identidades = 2050/2063 (99%), Espacios = 1/2063 (0%) >NA2002:ABL90322 Ab190322 Polinucleótido Humano SEQ ID NO 884. 5/2002 Longitud = 2155, Puntuación = 3897 bits (2027), Anticipado = 0.0, Identidades = 2048/2064 (99%), Espacios = 2/2064 (0%) >NA2001 A:AAF81745 Aaf81745 Proteína asociada a membrana humana MEMAP-5codificando cADN. 6/2001 Longitud = 2124, Puntuación = 3890 bits (2023), Anticipado = 0.0, Identidades = 2049/2063 (99%), Espacios = 2/2063 (0%) >emb|AX083500.1| Secuencia 42 de Patente WO0112662 Longitud = 2124, Puntuación = 3890 bits (2023), Anticipado = 0.0, Identidades = 2049/2063 (99%), Espacios = 2/2063 (0%) >NA2001A:AAK52767 Aak52767 Polinucleótido Humano SEQ ID NO 2296.11/2001 Longitud = 2025, Puntuación = 3794 bits (1973), Anticipado = 0.0, Identidades = 1993/2009 (99%) >NA2001A:AAH14354 Aah14354 Secuencia de cADN Humano SEQ ID NO:11748. 6/2001 Longitud = 1877, Puntuación = 3542 bits (1842), Anticipado = 0.0, Identidades = 1846/1848 (99%) >dbj|BD156346.1| Cebador para sintetizar cADN de longitud completa y uso del mismo Longitud = 1877, Puntuación = 3542 bits (1842), Anticipado = 0.0, Identidades = 1846/1848 (99%) >NA2000:AAZ65262 Aaz65262 Gen de proteína de secreción humana 13.3/2000 Longitud = 1583, Puntuación = 2913 bits (1515), Anticipado = 0.0, Identidades = 1540/1556 (98%), Espacios = 1/1556 (0%) >dbj|BD205645.1| 97 proteínas de secreción humana Longitud = 1583, Puntuación = 2913 bits (1515), Anticipado = 0.0, Identidades = 1540/1556 (98%), Espacios = 1/1556(0%) >NA2001A:AAK51783 Aak51783 Polinucleótido Humano SEQ ID NO 328. 11/2001 Longitud = 1347, Puntuación = 2546 bits (1324), Anticipado = 0.0, Identidades = 1326/1327 (99%)

Ejemplo 2: Perfilamiento de expresión

El ARN celular total fue aislado de células por uno de dos métodos estándar: 1) centrifugación de gradiente de densidad de guanidina isotiocianato/cloruro de Cesio [Kellogg, (1990)]; o con el protocolo de Tri-reactivo de acuerdo a las especificaciones del fabricante (Molecular Research Center, Inc., Cincinatti, Ohio). ARN total preparado por el protocolo de Tri-reactivo fue tratado con ADNse I para remover contaminación con ADN genómico.

Para cuantificación relativa de la distribución de mARN de AdipoR1, el ARN total de cada fuente de célula o tejido fue primero transcrito en inversa. 85 µg de ARN total fueron transcritos en inversa usando 1 µmol de cebadores hexámeros aleatorios, 0.5 mM cada uno de, dATP, dCTP, dGTP y dTTP (Qiagen, Hilden, Alemania), 3000 U RnaseQut (Invitrogen, Groningen, Países Bajos) en un volumen final de 680 µl. El primer amortiguador de síntesis de cadena y Omniscript transcriptasa inversa (2 u/µl) eran de (Qiagen, Hilden, Alemania). La reacción fue incubada a 37 °C por 90 minutos y enfriada sobre hielo. El volumen fue ajustado a 6800 µl con agua, produciendo una concentración final de 12.5 ng/µl de ARN inicial.

Para cuantificación relativa de la distribución de AdipoR1 mARN en células y tejidos el sistema de Detección de Secuencia HT Applied Biosystems 7900 o Biorad iCycler fue usado de acuerdo a las especificaciones y protocolos del fabricante. Se montaron reacciones de PCR para cuantificar AdipoR1 y los genes de mantenimiento HPRT (hipoxantina fosforibosiltransferasa), GAPDH (gliceraldehido-3 fosfato dehidrogenasa), β-actina, y otras. Cebadores hacia adelante e inversos y sondas para AdipoR1 fueron diseñadas usando el software Perkin Elmer ABI Primer ExpressTM y fueron sintetizados por TibMolBiol (Berlín, Alemania). La secuencia del cebador hacia adelante AdipoR1 era: Cebador1 (SEQ ID NO:3). La secuencia de cebador inverso AdipoR1 era Cebador2 (SEQ ID NO:4). Sonda1 (SEQ ID NO:5), marcado con FAM (carboxifluoresceina succinimidil éster) como el pigmento reportero y TAMRA (carboxitetrametilrodamina) como el amortiguador, es usado como una sonda para AdipoR1. Los siguientes reactivos fueron preparados en un total de 25 µl: 1x TaqMan amortiguador A, 5.5 mM MgCl2, 200 nM de dATP, dCTP, dGTP, y dUTP, 0.025 U/µl de AmpliTaq GoldTM, 0.01 U/µl de AmpErase y Sonda1 (SEQ ID NO: 4), cebadores hacia adelante e inversos de AdipoR1 cada uno a 200 nM, 200 nM de AdipoR1 FAM/TAMRA-sonda marcada, y 5 µl de plantilla de cADN. Parámetros de ciclado térmico fueron 2 min a 50 °C, seguido por 10 min a 95 °C, seguido por 40 ciclos de fusión a 95 °C por 15 seg y templado/extendido a 60 °C por 1 min. Cálculo de valores CT corregidos

El valor CT (ciclo umbral) es calculado como descrito en la sección “Determinación cuantitativa de ácidos nucleicos”. El valor CF (factor para la corrección de ciclo umbral) es calculado como sigue:

1.

Reacciones PCR fueron montadas para cuantificar los genes de mantenimiento (HKG) para cada muestra de cADN.

2.

Valores CTHKG (ciclo umbral para gen de mantenimiento) fueron calculados como descrito en la sección de “Determinación cuantitativa de ácidos nucleicos”.

3.

Valores CTHKG-media (valor media CT de todos los HKG probados en un cADNs) de todos los HKG para cada cADN son calculados (n = número de HKG):

4.

Valor media de CTpanel (valor media CT de todos los HKG en todos los cADNs probados) =

imagen1

imagen1

(y = número de cADNs)

5.

CFcDNA-n (factor de corrección para cADN n) = CTpanel-valor media -CTHKG-n-valor media

6.

CTcDNA-n (CT valor del gen probado para el cADN n) + CFcDNA-n (factor de corrección para cADN n) = CTcor-cDNA-n(valor CT corregido para un gen en cADN n)

Cálculo de expresión relativa

Definición: CTcor-ADN-n ≠ 40 más alto es definido como CTcor-cADN [alto] Expresión Relativa = 2(CTcor-cADN[alto] -CTcor-cADN-n)

Tejidos

La expresión de AdipoR1 fue investigada en los tejidos listados en la tabla 1.

Perfil de Expresión

Los resultados de la cuantificación de mARN (perfilamiento de expresión) son mostrados en la Tabla 1.

Tabla 1: Expresión relativa de AdipoR1 en varios tejidos humanos Corazón fetal 22 Corazón 18 Corazón 298 Corazón 246 Pericardio 516 Aurícula cardiaca (derecha) 134 Aurícula cardiaca (derecha) 27 Aurícula cardiaca (izquierda) 1113 Aurícula cardiaca (izquierda) 10 Ventrículo cardiaco (izquierda) 320 Ventrículo cardiaco (izquierda) 11 Ventrículo cardiaco (derecha)

989 Ventrículo cardiaco (derecha)

163 Ápice cardiaco

11 Fibras de Purkinje

10 Septo interventricular

120 Aorta fetal

12

Aorta 326

Aorta 2

Aorta 16

Válvula aórtica 1 Arteria 12 Arteria coronaria 38 Arteria coronaria 52 Arteria coronaria 446 Arteria pulmonar 7 Arteria carótida 10 Arteria mesentérica 3236 Arteria radialis 6 Vena 11 Válvula pulmonar 13 Vena (safena magna) 175 Vena (cava) 1722 Células endoteliales de arteria coronaria 4330 Células primarias de músculo liso de arteria coronaria 261 Células de músculo liso aórtico 6 Células de músculo liso de arteria pulmonar 6 Células endoteliales aórticas 5008 Células HUVEC 152 Células endoteliales de arteria pulmonar 5 Células endoteliales de arteria iliaca 22

Piel 2077

Glándula adrenal 1128 Tiroides 179 Tumor tiroideo 671 Páncreas 360 Cirrosis hepática páncreas 68 Esófago 54 Tumor esofágico 35 Estómago 1261 Tumor gástrico 56 Colon 103 Tumor de colon 124 Intestino delgado 3769 Íleo 44 Tumor del íleo 104 Inflamación crónica del íleo 18 Recto 1563 Tumor rectal 3397 Hígado fetal 27 Hígado 17 Hígado 95 Hígado 63 Cirrosis hepática hígado 111 Enfermedad de lupus hepática 24 Tumor hepático

86 Células HEP G2

671

Leucocitos (sangre periférica)

146 Jurkat (células T)

495 Raji (células B)

11 Medula ósea 229 Eritrocitos 2135 Nódulo linfático 22 Timo 5 Trombocitos 133 Células de estroma de medula ósea 10 Células CD71+ de medula ósea 304 Células CD33+ de medula ósea 7 Células CD34+ de medula ósea 189 Células CD15+ de medula ósea 162 Células CD71+ de sangre de cordón 338 Células CD34+ de sangre de cordón 2647 Neutrófilos de sangre de cordón 5185 Células T de sangre periférica CD4+ 237 Células T de sangre periférica CD8+ 86 Monocitos de sangre periférica CD14+ 105 Células B de sangre periférica CD19+ 52 Neutrófilos de sangre periférica 6383 Bazo 9 Cirrosis hepática bazo 260

Músculo esquelético 1698 Cartílago 14 Tejido conectivo óseo 16 Adiposo 231

Cerebro 530 Cerebelo 338 Corteza cerebral 119 Lóbulo frontal 139 Lóbulo occipital

276 Lóbulo parietal

501 Lóbulo temporal

304 Substancia nigra

91 Caudatum

32 Corpus callosum

96 Nucleus accumbens 2304 Putamen 6295 Hipocampo 326 Tálamo 311

Tálamo posteroventral

3822

Tálamo dorsomedial

7538

Hipotálamo

9

Ganglios de raíz dorsal

62

Médula espinal

142

Médula espinal (cuerno ventral)

6937

Médula espinal (cuerno dorsal)

4211

Células glial tumorales H4

252

Células neurales progenitoras

1160

Astrocitos

1003

Retina

3061

Pulmón fetal

154

Células IMR-90 de fribroblasto de pulmón fetal

84

Células MRC-5 de fribroblasto de pulmón fetal

10

Pulmón

38

Pulmón

119

Pulmón

21

Lóbulo pulmonar derecho superior

605

Lóbulo pulmonar derecho medio

168

Lóbulo pulmonar derecho inferior

523

Enfermedad de lupus pulmonar

2

Tumor pulmonar

320

COPD pulmonar

771

Tráquea

2135

Bronquios primarios

10809

Bronquios secundarios

2469

Células epiteliales bronquiales

7132

Células de músculo liso bronquiales

1323

Células epiteliales de vía respiratoria pequeña

66

Cérvix

77

Testículos

425

Células HeLa (tumor cervical)

43

Placenta

24

Útero

7

Tumor uterino

63

Ovario

265

Tumor ovárico

133

Ceno

508

Tumor mamario

220

Glándula mamaria

11

Próstata

2020

Próstata

1820

Próstata

7

Próstata BPH

996

Tumor prostático

452

Vejiga 77 Vejiga 19 Vejiga 20 Uréter 149 Pene 276 Corpus cabernosum

31 Riñón fetal 530 Riñón

9

Riñón 56

Riñón 44

Tumor renal 30

Células epiteliales renales 9

Células HEK 293 1097 Ejemplo 3: Análisis Antisentido

El conocimiento de la secuencia cADN correcta, completa que codifica para AdipoR1 permite su uso como una herramienta para tecnología antisentido en la investigación de la función de genes. Oligonucleótidos, cADN o fragmentos genómicos que comprenden la cadena antisentido de un polinucleótido codificando para AdipoR1 son usados in vitro o in vivo para inhibir la traslación del mARN. Tal tecnología es ahora bien conocida en la técnica, y moléculas antisentido pueden ser diseñadas en varias partes a lo largo de las secuencias de nucleótidos. Por el tratamiento de células o animales completos de prueba con tales secuencias antisentido, el gen de interés es efectivamente apagado. Frecuentemente, la función del gen es establecida observando el comportamiento a nivel intracelular, celular, tisular o de organismo (por ejemplo, letalidad, pérdida de función diferenciada, cambios en morfología, etc.).

Adicionalmente a usar secuencias construidas para interrumpir transcripción de un marco de lectura abierto en particular, modificaciones de expresión genética son obtenidas diseñando secuencias antisentido a regiones intrón, elementos promotores/mejoradores, o hasta operar genes regulatorios. Ejemplo 4: Expresión de AdipoR1

Expresión de AdipoR1 es lograda subclonando los cADNs en vectores de expresión apropiados y transfectando los vectores en huéspedes de expresión tales como, por ejemplo, E.coli. En un caso particular, el vector es diseñado para que contenga un promotor para β-galactosidasa, corriente arriba del sitio de clonación, seguido por la secuencia que contiene el amino terminal Metionina y los subsecuentes siete residuos de β-galactosidasa. Inmediatamente siguiendo estos ocho residuos es un promotor de bacteriófago diseñado, útil para cebado artificial y transcripción y para proveer un número de sitios de restricción de endonucleasa únicos para clonación.

Inducción de la cepa bacterial aislada, transfectada, con Isopropil-β-D-tiogalactopiranosido (IPTG) usando métodos estándar produce una proteína de fusión que corresponde a los primeros siete residuos de βgalactosidasa, aproximadamente 15 residuos de “enlazador”, y el péptido codificado dentro del cADN. Ya que inserciones de clon de cADN son generadas por un proceso esencialmente aleatorio, hay probabilidad de 33% que el cADN incluido va a encontrase en el marco de lectura correcto para adecuada traslación. Si el cADN no está en el marco correcto de lectura, es obtenido por supresión o inserción del número apropiado de bases usando métodos bien conocidos incluyendo mutagénesis in vitro, digestión con exonucleasa III o nucleasa de judías mung, o la inclusión de un enlazador de oligonocleótido de longitud apropiada.

El cADN de AdipoR1 es enviado a otros vectores conocidos por ser útiles para expresión de proteínas en huéspedes específicos. Cebadores oligonucleótidos que contienen sitios de clonación como también un segmento de ADN (aproximadamente 25 bases) suficientes para hibridar los tramos a ambos extremos del cADN objetivo es sintetizado químicamente por métodos estándar. Estos cebadores son entonces usados para amplificar el segmento de gen deseado por PCR. El segmento de gen resultante es digerido con enzimas de restricción apropiadas bajo condiciones estándar y aislado por electroforesis en gel, Alternativamente, segmentos de gen similares son producidos por digestión del cADN con enzimas de restricción apropiadas. Usando cebadores apropiados, segmentos de secuencia codificadora de más de un gen son ligadas juntas y clonadas en vectores apropiados. Es posible optimizar expresión por la construcción de tales secuencias quiméricas.

Huéspedes de expresión apropiados para tales moléculas quiméricas incluyen, pero no están limitados a, células mamíferas tales como Ovario de Hamster Chino (CHO) y células 293 humanas., células de insecto tales como células Sf9, células de levadura tales como Saccharomyces cerevisiae y células bacterianas tales como E.coli. Para cada una de estos sistemas celulares, un vector de expresión útil también incluye un origen de replicación para permitir propagación en bacteria. Adicionalmente, el vector puede incluir un segundo marcador seleccionable tal como el gen neomicina fosfotransferasa para permitir selección en células de huésped eucariótico transfectado. Vectores para uso en huéspedes de expresión eucarióticos requieren elementos de procesamiento de ARN tales como secuencias 3’ poliadenilación si tales no son parte del cADN de interés.

Adicionalmente, el vector contiene promotores o mejoradores que aumentan la expresión genética. Tales promotores son huésped específicos e incluyen MMTV, SV40, y promotores metalotionina para células CHO; trp, lac, tac y promotores T7 para huéspedes de bacteria; y factor alfa, alcohol oxidasa y promotores PGH para levadura. Mejoradores de transcripción, tales como el mejorador rous sarcoma virus, son usados en células huésped de mamíferos. Una vez que cultivos homogéneos de células recombinantes son obtenidos a través de métodos de cultivo estándar, grandes cantidades de AdipoR1 producido recombinantemente son recuperados del medio condicionado y analizados usando métodos cromatográficos conocidos en la técnica. Por ejemplo, AdipoR1 puede ser clonado en el vector de expresión pcADN3, como es ejemplificado aquí. Este producto puede ser usado para transformar, por ejemplo, HEK293 o COS por metodología estándar en la técnica. Específicamente, por ejemplo, usando transferencia de genes mediada por Lipofectamina (Gibco BRL catálogo no. 18324-020). Ejemplo 5: Aislamiento de AdipoR1 Recombinante

El AdipoR1 es expresado como una proteína quimérica con uno o más dominios de polipéptido adicionales agregados para facilitar purificación de proteína. Tales dominios de facilitación de purificación incluyen, pero no están limitados a, péptidos quelatadores de metal tales como módulos de histidina-triptofan que permiten la purificación en metales inmovilizados [Appa Rao, 1997] y el dominio utilizado en el sistema de purificación extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Washington). La inclusión de una secuencia de enlazador cortable tal como Factor Xa o enteroquinasa (Invitrogen, Groningen, Países Bajos) entre el dominio de purificación y la secuencia de AdipoR1 es útil para facilitar expresión de AdipoR1. Ejemplo 6: Prueba de GPCRs Quiméricos

Los GPCRs quiméricos funcionales son construidos combinando las secuencias extracelulares receptivas de una nueva isoforma con la transmembrana y segmentos intracelulares de una isoforma conocida para propósitos de prueba. Este concepto fue demostrado por Kobilka et al. (1988), Science 240:1310-1316) quien creó una serie de receptores (AR) α2-β2 adrenérgicos quiméricos insertando cantidades progresivamente más grandes de secuencia α2-AR transmembrana en β2-AR. La actividad de enlace de agonistas conocidos cambió mientras la molécula cambió de tener más conformación α2 que β2, y construcciones intermedias demostraron especificidad mezclada. La especificidad para enlazar antagonistas, sin embargo, estaba correlacionada con la fuente del dominio VII. La importancia del dominio VII T7G para reconocimiento del ligando también fue encontrado en quimeras utilizando dos receptores de α-factor de levadura, y es significativo porque los receptores de levadura son clasificados como receptores misceláneos.

Por lo tanto, el papel funcional de dominios específicos parece ser preservado a través de la familia GPCR sin importar la categoría.

De forma paralela, segmentos internos o dominios citoplásmicos de una isoforma particular son intercambiados con los dominios análogos de GPCRs conocidos y usados para identificar los determinantes estructurales responsables de emparejar los receptores a proteínas G triméricas. Un receptor quimérico en el que los dominios V, VI, y el anillo conector intracelular de β2-AR fueron sustituidos en α2-AR fue mostrado que enlaza ligandos con especificidad α2-AR, pero para estimular adenilato ciclasa en la forma de β2-AR. Esto demuestra que para receptores tipo adrenérgicos, reconocimiento de proteína G está presente en dominios V y VI y su anillo conector. La situación opuesta fue predicha y observada para una quimera en la cual el anillo V->VI de α1-AR remplazó el dominio correspondiente en β2-AR y el receptor resultante enlazó ligandos con especificidad β2-AR y renovación de proteína G activada mediada por fosfatidilinositol de la forma α1-AR. Finalmente, quimeras construidas de receptores muscarínicos también demostraron que el anillo V->VI es el principal determinante para especificidad de actividad de proteína G.

Los GPCRs quiméricos o modificados que contienen sustituciones en las regiones extracelulares y transmembrana han mostrado que estas porciones del receptor determinan especificidad de enlace de ligando. Por ejemplo, dos residuos de Serina conservados en el dominio V de todas las GPCRs adrenérgicas y D catecolainina son necesarias para actividad agonista potente. Estas serinas se cree que forman enlaces de hidrógeno con la fracción catecol de los agonistas dentro del sitio de enlace de GPCR. Similarmente, un residuo Asp presente en el dominio III de todos los GPCRs que enlazan aminas biogénicas se cree que forma un par de ion con el grupo amina del ligando en el sitio de enlace GPCR.

Los GPCRs funcionales, clonados son expresados en sistemas de expresión heterólogos y su actividad biológica es determinada. Un sistema heterólogo introduce genes para un GPCR mamífero y una proteína G mamífera en células de levadura. Se muestra que el GPCR tiene especificidad de ligando apropiada y afinidad y apropiada iniciación de activación biológica (terminación de crecimiento y cambios morfológicos) de células de levadura.

Un procedimiento alternativo para probar receptores quiméricos está basado en el procedimiento que utiliza el receptor purinérgico (P2u). La función es fácilmente probada en células de leucemia humana K562 cultivadas porque estas células carecen de receptores P2u. Células K562 son transfectadas con vectores de expresión que contienen P2u normal o quimérico y cargado con fura-a, sonda fluorescente para Ca++ . Activación de receptores P2u adecuadamente ensamblados y funcionales con UTP o ATP extracelular moviliza Ca++ intracelular que reacciona con fura-a y es medido espectrofluorometricamente.

Como con los GPCRs arriba, genes quiméricos son creados combinando secuencias para segmentos receptivos extracelulares de cualquier nuevo polipéptido GPCR con los nucleótidos para la transmembrana y segmentos intracelulares de la molécula P2u conocida. Bañar las células K562 transfectadas en micropozos que contienen disparadores ligandos enlazando y efectores que definen la actividad fluorescente de la molécula GPCR. Una vez el ligando y la función son establecidos, el sistema P2u es útil para definir antagonistas o inhibidores que bloquean el enlace y previenen tales reacciones fluorescentes. Ejemplo 7: Producción de Anticuerpos Específicos de AdipoR1

Se utilizan dos acercamientos para elevar anticuerpos a AdipoR1, y cada acercamiento es útil para generar anticuerpos policlonales o monoclonales. En un acercamiento, proteína desnaturalizada de separación HPLC de fase inversa es obtenida en cantidades de hasta 75 mg. Esta proteína desnaturalizada es usada para inmunizar ratones o conejos usando protocolos estándar; aproximadamente 100 µg son adecuados para inmunizar un ratón, mientras que hasta 1 mg puede ser usado para inmunizar un conejo. Para identificar hibridomas de ratón, la proteína desnaturalizada es radioyodinada y usada para explorar hibridomas de célula B de murina potenciales para aquellos que producen anticuerpo. Este procedimiento requiere solamente pequeñas cantidades de proteína, de forma que 20 mg es suficiente para el marcado y exploración de varios miles de clones.

En el segundo acercamiento, la secuencia de amino ácido de un dominio AdipoR1 apropiado, como es deducido de la traslación de cADN, es analizada para determinar regiones de alta antigenicidad. Oligopéptidos que comprenden regiones hidrofílicas apropiadas son sintetizadas y usadas en protocolos de inmunización adecuados para elevar anticuerpos. Las secuencias de amino ácido optimas para inmunización están usualmente en el C-terminal, el N-terminal y aquellas regiones de intervención, hidrofílicas del polipéptido que tienen la probabilidad de ser expuestas al ambiente externo cuando la proteína está en su conformación natural.

Típicamente, los péptidos seleccionados, aproximadamente 15 residuos en longitud, son sintetizados usando un Applied Biosystems Peptide Synthesizer Modelo 431A usando química fmoc y emparejado a hemocianina de lapa (KLH; Sigma, St. Louis, MO) por reacción con éster M-maleimidobenzoil-Nhidroxisuccinimida, MBS. Si es necesario, se introduce una cisteína en el N-terminal del péptido para permitir emparejamiento a KLH. Conejos son inmunizados con el complejo péptido-KLH en adyuvante de Freund completo. Los antisueros resultantes son probados para actividad antipéptido enlazando el péptido a plástico, bloqueando con albúmina de suero bovino al 1%, reaccionando con antisuero, lavando y reaccionando con IgG anti-conejo de cabra específico, marcado (radioactivo o fluorescente), y purificado por afinidad.

Los hibridomas son preparados y explorados usando técnicas estándar. Hibridomas de interés son detectados por exploración con AdipoR1 marcado para identificar aquellas fusiones que producen el anticuerpo monoclonal con la especificidad deseada. En un protocolo típico, pozos de placas (FAST; Becton-Dickinson, Palo Alto, CA) son recubiertos durante incubación con anticuerpos anti-ratón (o antiespecies apropiadas 1g) de conejo específicos, purificados por afinidad a 10 mg/ml. Los pozos recubiertos son bloqueados con albumina de suero bovino al 1%, (BSA), lavados e incubados con sobrenadantes de hibridomas. Después de lavar los pozos son incubados con AdipoR1 marcado a 1 mg/ml. Sobrenadantes con anticuerpos específicos enlazan mas AdipoR1 marcado que el que es detectable en el fondo. Después clones produciendo anticuerpos específicos son expandidos y sometidos a dos ciclos de clonación a dilución limitante. Hibridomas clonados son inyectados en ratones tratados con pristano para producir ascitis, y anticuerpo monoclonal es purificado de fluido ascítico de ratón por cromatografía de afinidad en Proteína A. Anticuerpos monoclonales con afinidades de por lo menos 108 M-1, preferiblemente 109 a 1010 M-1 o más fuertes, son típicamente hechos por procedimientos estándar. Ejemplo 8: Prueba Diagnóstica Usando Anticuerpos Específicos de AdipoR1

Anticuerpos de AdipoR1 particulares son útiles para investigar la transducción de señal y el diagnóstico de condiciones infecciosas o hereditarias que son caracterizadas por diferencias en la cantidad o distribución de AdipoR1 o productos corriente debajo de una cascada de señalización activa.

Las pruebas diagnósticas para AdipoR1 incluyen métodos que utilizan anticuerpo y un marcador para detectar AdipoR1 en fluidos humanos corporales, membranas, células, tejidos o extractos de tales. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención son usados con o sin modificación. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos son marcados uniéndolos, covalentemente o no covalentemente, con una sustancia que provee para una señal detectable. Una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación son conocidas y han sido reportadas extensivamente tanto en la literatura científica como la de patentes. Marcadores apropiados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromogénicos, partículas magnéticas y similares.

Una variedad de protocolos para medir AdipoR1 soluble o enlazado a membrana, usando anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para la proteína, son conocidos en la técnica. Ejemplos incluyen ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación fluorescente de células activadas (FACS). Un inmunoensayo basado en monoclonal de dos sitios utilizando anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopos que no interfieren en AdipoR1 es preferido, pero un ensayo de enlace competitivo puede ser usado. Ejemplo 9: Purificación de AdipoR1 Nativo Usando Anticuerpos Específicos

El AdipoR1 nativo o recombinante es purificado por cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para AdipoR1. En general, una columna de inmunoafinidad es construida emparejando covalentemente el anticuerpo anti TRH a una resina cromatográfica activada.

Las inmunoglobulinas policlonales son preparadas de sueros inmunes por precipitación con sulfato de amonio o por purificación en Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway N.J.). De igual forma, anticuerpos monoclonales son preparados de fluido ascítico de ratón por precipitación de sulfato de amonio o cromatografía en Proteína A inmovilizada. Inmunoglobulina purificada parcialmente es covalentemente unida a una resina cromatográfica tal como Sefarosa CnBr activada (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo es emparejado a la resina, la resina es bloqueada, y la resina derivada es lavada de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Tales columnas de inmunoafinidad son utilizadas en la purificación de AdipoR1 preparando una fracción de células que contienen AdipoR1 en una forma soluble. Esta preparación es derivada por solubilización de células completas o de una fracción sub-celular obtenida a través de centrifugación diferencial (con o sin adición de detergente) o por otros métodos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, AdipoR1 soluble que contiene una secuencia de señal es secretado en cantidad útil en el medio en el cual las células crecen.

Una preparación soluble que contiene AdipoR1 es pasada sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna es lavada bajo condiciones que permiten la absorbancia preferencial de AdipoR1 (por ejemplo, amortiguadores de alta fuerza iónica en la presencia de detergente). Entonces, la columna es eluída bajo condiciones que perturban el enlace anticuerpo/proteína (por ejemplo, un amortiguador de pH 2-3 o una alta concentración de un chaotropo tal como urea o ion de tiocianato), y se recolecta AdipoR1.

Referencias

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4,522,811

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5,283,317

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5,565,332 WO 84/03564 WO 92/01810 WO 93/03151 WO 94/13804 WO 01/04297 WO 01/12662 WO 01/90304 Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ; Nucleic Acids Res 1997 Sep 1; 25 (17): 3389-402 Appa Rao et al., 1997, Protein Expr Purif Nov, 11(2): 201-8 Barnes, 2000, Chest, 117:10S14S Botstein et al., 1980 , Am J Hum Genet. 32: 314-31 Colbere-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150, 1-14 Engelhard et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci. 91, 3224-3227 Gergen and Weiss , 1992, Am Rev Respir Dis 146:823-824

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Bayer AG, BHC

<120> Diagnostics and Therapeutics for Diseases Associated with G-Protein Coupled Receptor AdipoR1 (AdipoR1) (Diagnóstico y Terapéutica para Enfermedades Asociadas con Receptor emparejado de Proteína G AdipoR1 (AdipoR1))

<130> Le A 36 901

<160> 5

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2100

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 375

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

imagen1

<210> 3

<211> 19

<212> ADN

<213> secuencia artificial <220>

<223> cebador hacia adelante

<400> 3 gagaagggca aacgggtaa 19

<210> 4 <211> 19

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> cebador inverso

5 <400> 4 ctcttcttcc tggggcact 19

<210> 5

<211> 24

<212> ADN <213> secuencia artificial

<220>

<223> sonda

<400> 5 cccacccaaa gctgaagaag agca 24

Claims (1)

1. Reivindicaciones

   1. Un método para diagnosticar cirrosis hepática en un mamífero que comprende los pasos de i) determinar la cantidad de un mARN de AdipoR1 en una muestra tomada de dicho mamífero,

   5 ii) determinar la cantidad de mARN de AdipoR1 en mamíferos saludables y/o enfermos; donde la muestra es una muestra de (a) tejido hepático, (b) tejido esplénico o (c) tejido pancreático y la cantidad de mARN de AdipoR1 en la muestra es indicativa del mamífero que tiene cirrosis hepática si:

   (a) AdipoR1 es sobreexpresado en tejido hepático, (b) AdipoR1 es sobreexpresado en tejido esplénico, o

   (c) AdipoR1 es subexpresado en tejido pancreático; en comparación con la expresión en mamíferos saludables.