ES2347399B1 - Planta transgenica rc15 resistente al frio y estres salino productorade tmao, elementos necesarios para su obtencion y uso de composiciones que contienen tmao para inducir tolerancia al frio y estres salino. - Google Patents
Planta transgenica rc15 resistente al frio y estres salino productorade tmao, elementos necesarios para su obtencion y uso de composiciones que contienen tmao para inducir tolerancia al frio y estres salino. Download PDFInfo
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Abstract
Planta transgénica RC15 resistente al frío y
estrés salino productora de TMAO, elementos necesarios para su
obtención y uso de composiciones que contienen TMAO para inducir
tolerancia al frío y estrés salino.
La presente invención describe una planta
transgénica resistente al frío y al estrés salino basada en el uso
de un nuevo gen, el gen RC15, codificante de una enzima monoxigenasa
que induce la aparición de TMAO. Además la invención proporciona
secuencia de nucleótidos, vectores y células necesarias para llevar
a cabo el procedimiento para obtener dichas plantas transgénicas.
Finalmente, se añade el uso de composiciones que contienen TMAO para
la mejora de la tolerancia al estrés salino de las plantas afectadas
mediante la aplicación exógena de dichas soluciones sobre la planta
o semilla, por ejemplo pulverización o inyección.
Description
Planta transgénica RCI5 resistente al frío y
estrés salino productora de TMAO, elementos necesarios para su
obtención y uso de composiciones que contienen TMAO para inducir
tolerancia al frío y estrés salino.
La presente invención se refiere a un método
para aumentar la tolerancia al frío y al estrés salino de una planta
alterando la expresión del gen RCI5. En particular, la
presente invención proporciona una planta transgénica que tiene un
mayor nivel de la proteína RCI5 en relación con una planta no
transgénica, y el uso de composiciones que contienen TMAO para la
mejora de la tolerancia al estrés salino de las plantas afectadas,
mediante la aplicación de las soluciones que contengan dicho
compuesto por cualquier vía que ponga en contacto la composición de
la invención con cualquier parte de la planta y/o semillas.
Las temperaturas de congelación constituyen uno
de los principales factores ambientales que limitan el crecimiento,
productividad y distribución geográfica de las plantas (Boyer,
1982). Muchas especies de climas templados han adquirido a lo largo
de la evolución una respuesta adaptativa que les permite enfrentarse
a las temperaturas de congelación. Por medio de esta respuesta,
conocida como aclimatación al frío (Levitt, 1980), las plantas
adquieren una tolerancia a las temperaturas de congelación después
de un tiempo de exposición a temperaturas bajas no congelantes. La
aclimatación a frío constituye un ejemplo representativo de la
interacción de las plantas con su entorno y de como esta interacción
ha condicionado la evolución de algunas especies. El esclarecimiento
de los mecanismos moleculares que controlan este proceso adaptativo
no es solo interesante desde el punto de vista básico, para entender
como crecen y se desarrollan las plantas, sino que además tiene un
gran potencial biotecnológico en la obtención de herramientas
moleculares para mejorar la tolerancia a la congelación de cultivos
muy importantes. Hay que resaltar que, diferentes trabajos han
mostrado que la aclimatación a las temperaturas bajas también
aumenta la tolerancia de las plantas a otros estreses abióticos como
deshidratación y estrés salino. Por tanto, el estudio de la
aclimatación a frío debería aportar información esencial de como las
plantas responden de manera coordinada a diferentes condiciones
ambientales adversas.
El proceso de aclimatación a frío es muy
complejo y conlleva numerosos cambios a nivel bioquímico y
fisiológico, incluyendo cambios en la membrana lipídica (Uemura
et al., 1995), síntesis de nuevas proteínas (Kawamura y
Uemura, 2003), incremento del contenido endógenos de ABA (Lang et
al., 1994), y la acumulación de solutos compatibles (Wanner y
Junttila, 1999). Cada vez hay mas pruebas que muestran que la
mayoría de estos cambios son controlados a través de una extensa
reprogramación de la expresión génica (Salinas 2002;
Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 2006; Welling y
Palva, 2006). De hecho, estudios recientes usando la tecnología de
microarrays han revelado que la expresión de cientos de genes cambia
en respuesta a las temperaturas bajas, indicando que la aclimatación
a frío esta mediada por múltiples rutas (Fowler y Thomashow, 2002;
Kreps et al., 2002; Seki et al., 2002; Maruyama et
al., 2004; Vogel et al., 2005; Lee et al., 2005;
Oono et al., 2006; Matsui et al., 2008; Chawade et
al., 2007). Muchos de estos genes también son regulados por
deshidratación y salinidad (Matsui et al., 2008), confirmando
a nivel molecular la estrecha relación existente en las repuestas de
la planta a estos estreses abióticos. Como ejemplo de esto sirve un
grupo de genes que contienen el motivo CCGAC en su promotor, que es
la secuencia central del elemento de regulación en cis CRT/DRE
(C-repeat/dehydration-responsive
element) (Baker et al., 1994;
Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994). El motivo
CCGAC es suficiente para mediar la respuesta de la expresión génica
a frío, deshidratación y estrés salino (Baker et al., 1994;
Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994), e
interacciona específicamente con la familia de factores
transcripcionales denominados CBF/DREB (C-repeat
Binding Factor/DRE Binding protein) (Stockinger et al., 1997;
Liu et al., 1998). Tres genes correspondientes a miembros de
esta familia (CBF1/DREB1B, CBF2/DREB1C, CBF3/DREB1A) son inducidos
rápidamente por temperaturas bajas (Gilmour et al., 1998; Liu
et al., 1998; Medina et al., 1999), mientras que la
expresión de otros dos (DREB2A, DREB2B) responde principalmente a
deshidratación y estrés salino (Liu et al., 1998).
Desafortunadamente, sin embargo, a pesar del
gran número de genes que se han identificado cuya expresión es
regulada por frío, las funciones celulares y metabólicas de la
mayoría de los mismos, así como su implicación en la aclimatación a
frío, son todavía desconocidos. El análisis de las secuencias de
algunos de estos genes sugiere que deben estar implicados en la
protección de la célula produciendo proteínas funcionales, mientras
que otros genes codificarían proteínas con alguna función en la
regulación de la expresión génica y en la transmisión de la señal
(Fowler y Thomashow, 2002; Kreps et al., 2002; Seki et
al., 2002; Maruyama et al., 2004; Vogel et al.,
2005; Lee et al., 2005; Oono et al., 2006; Matsui
et al., 2008; Chawade et al., 2008). Las proteínas
funcionales incluyen enzimas para la producción de osmolitos
compatibles, enzimas relacionadas con el quenching de especies
reactivas de oxigeno (ROS), chaperonas que protegerían las proteínas
y las membranas, y canales iónicos y de agua para el mantenimiento
de la homeostasis iónica y del agua. Entre las proteínas
reguladoras, además de los factores de transcripción, se encuentran
proteínas de unión a RNA, de unión a calcio, proteínas kinasas y
fosfatasas, encimas implicadas en el reciclaje de fosfoinositoles y
otras moléculas señalizadoras (Matsui et al., 2008). La
caracterización de la función de los genes regulados por frío y de
su implicación en el proceso de aclimatación debería contribuir al
entendimiento de los mecanismos que gobiernan este proceso
adaptativo.
\newpage
Estreses abioticos ambientales, como las
temperaturas de congelación y el estrés salino, se encuentran entre
los problemas más importantes para una agricultura sostenible a
nivel mundial. En los últimos años, se han realizado grandes
esfuerzos para entender la respuesta a nivel molecular a estos
estreses, lo cual a facilitado la identificación de genes implicados
en la tolerancia a las temperaturas de congelación y al estrés
salino (Hasegawa et al., 2000; Zhu et al., 2007). Sin
embargo, aun se ha de aclarar como son percibidas las señales
físicas y como son convertidas en señales bioquímicas.
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Un aspecto de la invención lo constituye una
planta transgénica tolerante al frío y al estrés salino, en adelante
planta transgénica RCI5 de la invención, que comprende una secuencia
de nucleótidos que permite la expresión de una proteína con
actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del siguiente grupo:
i.- la secuencia de nucleótidos del gen RCI5 de
SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; y
ii.- una secuencia de nucleótidos análoga a la
secuencia definida en a).
\vskip1.000000\baselineskip
Un aspecto particular de la presente invención
lo constituye una planta transgénica de la presente invención en la
que la secuencia de nucleótidos, que permite la expresión de una
proteína con actividad monooxigenasa (FMO), es el gen RCI5 de
SEQ ID NO: 1. Una realización particular de ésta es la planta
transgénica de Arabidopsis RCI5-OE generada
en la presente invención (ver Ejemplo 1.2 y Materiales y
Métodos).
Otro aspecto de la invención lo constituye un
procedimiento de obtención de la planta transgénica RCI5, en
adelante procedimiento de obtención de una planta transgénica de la
invención, que consiste en la introducción en una planta de una
secuencia de nucleótidos constituida por:
i.- una secuencia de nucleótidos codificante de
proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del
siguiente grupo:
- la secuencia de nucleótidos del gen
RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; o una
secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a),
y
ii.- una secuencia de nucleótidos promotora que
permite y regula la expresión de la secuencia de i.- y la aparición
de una proteína con actividad monooxigenasa en el interior de la
célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Una realización particular de la presente
invención lo constituye un procedimiento de obtención de plantas de
la invención que comprende los siguientes pasos:
a) obtención de un vector de expresión que
contiene una secuencia de nucleótidos del gen RCI5 SEQ ID NO:
1,
b) obtención de microorganismos portadores del
vector a), y
c) transformación de las plantas con el vector
de a) o con el microorganismo de b).
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto de la presente invención lo
constituye una secuencia de nucleótidos, en adelante secuencia de la
presente invención, que permite la expresión de una proteína con
actividad monooxigenasa en las células de planta y que está
constituida por una de las posibilidades siguientes:
a) una secuencia de nucleótidos codificante de
una proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del
siguiente grupo: la secuencia de nucleótidos del gen RCI5 de
SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; o una secuencia de
nucleótidos análoga a la secuencia definida en a), con o sin
b) una secuencia de nucleótidos promotora que
permite y regula la expresión de la secuencia de a) y la aparición
de una proteína con actividad monooxigenasa en el interior de la
célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto particular de la presente invención
lo constituye una secuencia de nucleótidos de la invención en la que
la secuencia de nucleótidos codificante de una proteína con
actividad monooxigenasa está constituida por la secuencia de
nucleótidos RCI5 de SEQ ID NO: 1, un fragmento de la misma o
una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definidas
anteriormente.
\newpage
Otro aspecto particular de la presente invención
lo constituye una secuencia de nucleótidos de la invención en la que
la secuencia de nucleótidos promotora es cualquier secuencia de
nucleótidos promotora capaz de regular la expresión génica en
plantas como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el
alcance de la invención, un promotor fuerte constitutivo, como por
ejemplo el promotor del virus del mosaico 35S, o un promotor que se
exprese en respuesta a distintos tipos de estrés abiótico, como por
ejemplo el del gen RD29A (Kasuga et al, 1999).
La invención también se refiere a un vector de
expresión que comprende la secuencia de nucleótidos RCI5 de
la invención, en adelante vector de expresión de la presente
invención, y que permite la transformación o transfección de
microorganismos y células y la posterior obtención de las plantas
transgénicas de la invención. Como realizaciones particulares del
vector de expresión de la invención se han generado los vectores
GST::RCI5 (ver Ejemplo 1) y el vector 35S::RCI5 (ver
ejemplo 2).
Otro aspecto de la invención lo constituye un
microorganismo o célula, en adelante célula de la invención, que
contiene la secuencia de nucleótidos RCI5 de la invención o el
vector de expresión de la invención.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye una semilla de una planta que comprende una secuencia de
nucleótidos, codificante de una proteína con actividad
monooxigenasa, constituida por la secuencia de nucleótidos
RCI5 de SEQ ID NO: 1, un fragmento de la misma o una
secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definidas
anteriormente.
Finalmente, otro aspecto de la presente
invención es el uso de las secuencias de nucleótidos, vectores de
expresión, células transformadas, y del procedimiento de la presente
invención para la obtención de plantas transgénicas de interés
comercial.
Además, otro aspecto de la invención se basa en
el uso de una composición por ejemplo, acuosa, que comprende el
compuesto óxido de trimetilamina (TMAO) o un derivado del mismo, en
adelante uso de una composición de la invención, para inducir
tolerancia al estrés salino y al frío en las plantas y/o
semillas.
Otro aspecto particular de la presente invención
se basa en el uso de una composición de la invención donde la
composición acuosa comprende el compuesto TMAO en una concentración
comprendida entre 1 \muM y 100 mM, preferentemente entre 50 \muM
y 1 mM, y más preferentemente a 100 \muM.
Una realización particular de la presente
invención lo constituye el uso de una composición de la invención en
el que la concentración de TMAO es de 100 \muM.
La concentración de los componentes activos de
las composiciones dependerá del tipo de planta, fase de desarrollo
de la misma, así como de la frecuencia y forma de aplicación de las
composiciones.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye el uso de una composición de la invención para inducir
tolerancia al estrés salino en las plantas mediante su aplicación a
la parte aérea mediante pulverización.
Los principios fisiológicos del transporte de
los compuestos absorbidos por las hojas mediante pulverización, son
similares a los que ingresan en las plantas por la absorción vía
radicular, sin embargo, el movimiento de los compuestos aplicados
sobre las hojas no es el mismo en tiempo y forma que el que se
realiza desde las raíces al resto de la planta. La absorción foliar
es más efectiva cuando las condiciones de absorción desde el suelo
son adversas como por ejemplo en caso de sequía, estrés salino,
temperaturas extremas u otros estreses. Además, es mucho más fácil
obtener una distribución uniforme, a diferencia de la aplicación de
granulados o en mezclas físicas.
Otro aspecto particular de la presente invención
lo constituye el uso de una composición de la invención para inducir
tolerancia al estrés salino y al frió en las plantas mediante su
aplicación al tallo por inyección.
Otro aspecto particular de la presente invención
lo constituye el uso de una composición de la invención que se
aplica al suelo u otro sustrato de cultivo, al agua de riego (o
solución de cultivo) o por inmersión del sistema radicular de las
plantas y/o de semillas.
La aplicación de las composiciones acuosas por
medio de la inmersión de la parte radicular de la planta así como de
semillas se realiza por un tiempo y con una concentración que
depende del tipo de planta, estado de desarrollo así como de la
frecuencia y forma de aplicación de las composiciones. En el caso de
semillas que requieran un tratamiento especial de escarificación o
eliminación de determinadas cubiertas para facilitar su germinación,
el proceso de inmersión en las composiciones acuosas de la presente
invención, se podrá realizar de forma más efectiva después de la
eliminación de las cubiertas para facilitar la absorción de los
compuestos activos. Asimismo, también se podrán sumergir las
semillas en cualquier estadio de germinación.
Las formas de aplicación que se han citado hasta
ahora no limitan otro tipo de aplicaciones de las composiciones que
contienen TMAO a las plantas.
Los usos de una composición de TMAO descritos
anteriormente pueden comprender además un aditivo seleccionado de
entre fertilizantes orgánicos o inorgánicos, insecticidas,
nematocidas, fungicidas, bactericidas o herbicidas. De esta manera,
al aplicar las composiciones que contienen TMAO junto con aditivos,
ya sea para aportar nutrientes o para tratar determinadas
infecciones o plagas, se consigue no aumentar los costos de los
tratamientos al hacerlo de forma coordinada.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se enfrenta al problema de
proporcionar nuevas plantas transgénicas capaces de adaptarse a
situaciones limitantes del medio ambiente, preferentemente por su
tolerancia al estrés salino y al frío, así como a la necesidad de
aportar nuevas composiciones para mejorar la tolerancia de las
plantas al estrés.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en que los inventores han aislado, identificado y caracterizado
un nuevo gen que codifica una flavina monooxigenasa (FMO), en
adelante RCI5 (SEQ ID NO: 1), es decir, un nuevo gen
RCI, que es inducido por estrés salino y el frío. La
sobreexpresión constitutiva de la proteína RCI5 (SEQ ID NO: 2 en
Arabidopsis condujo a la expresión incrementada de diferentes genes
inducibles por estrés, incluyendo el regulon CBF y genes
codificantes de proteínas implicadas en la eliminación de especies
reactivas de oxigeno, con lo que se provoca una mejora de la
tolerancia a la congelación y al estrés salino.
En animales, la monooxigenasas (FMOs) están
implicadas en la síntesis de óxido de trimetilamina (TMAO) que
funciona como un importante osmoprotector (Yancey et al.,
2004). Además, los datos presentados demuestran, por primera vez,
que las plantas también contienen TMAO y proteína RCI5 endógenos
involucrados en la biosíntesis de TMAO. De acuerdo con esto, los
niveles de TMAO en Arabidopsis se incrementan cuando la proteína
RCI5 es sobreexpresada en respuesta a las temperaturas bajas y al
NaCl, la cual es capaz de oxidar el metabolito endógeno TMA a
TMAO.
El gen RCI5 se identificó buscando nuevos
genes en Arabidopsis implicados en la aclimatación al frío. Al igual
que otros genes inducidos por frío, el gen RCI5 está sometido
a una compleja regulación. Bajo condiciones controladas, durante
estadios tempranas del desarrollo de Arabidopsis, su expresión es
muy baja y se encuentra limitada al tejido vascular de todos los
tejidos. En plantas adultas, sin embargo, RCI5 únicamente se
expresa, y en niveles muy bajos, en las venas de las hojas. En
respuesta a temperaturas bajas, los niveles de expresión de
RCI5 se inducen de forma intensa, principalmente en la
vasculatura de las hojas. Esta inducción no se ve afectada en
mutantes deficientes en ABA ni en plantas que no expresan
CBFs, indicando que la regulación de RCI5 por frío se
lleva a cabo mediante vías de transducción de señales independientes
de ABA y los CBFs. RCI5 es además inducido por el tratamiento
con NaCl a través de una vía independiente de ABA. Los niveles de
expresión inducidas por NaCl son idénticos al los causados por las
temperaturas bajas. Es interesante el hecho de que el efecto del
NaCl no es debido a su componente osmótico sino que es específico
del iónico. La deshidratación, sin embargo, no tiene efecto alguno
en la expresión de RCI5. El genoma de Arabidopsis contiene
mas de 50 genes cuya expresión es regulada, al igual que
RCI5, por las temperaturas bajas y por NaCl pero no por
deshidratación (Fowler y Thomashow, 2002; Kreps et al., 2002;
Seki et al., 2002; Maruyama et al., 2004; Vogel et
al., 2005; Lee et al., 2005; Oono et al., 2006;
Matsui et al., 2008), poniendo de manifiesto la existencia de
una importante interacción entre las vías de señalización de frío y
sal.
La sobreexpresión constitutiva de RCI5
incrementa de forma significativa la tolerancia a la congelación en
Arabidopsis, antes y después de la aclimatización al frío, lo que
sugiere fuertemente que RCI5 regula de forma positiva tanto la
respuesta a la aclimatización al frío como la tolerancia a la
congelación. Más aún, plantas transgénicas de Arabidopsis que
sobreexpresan la proteína RCI5 son significativamente más tolerantes
a altas concentraciones de NaCl y LiCl que las plantas salvajes
originales, demostrando que RCI5 actúa como un regulador positivo en
la tolerancia al estrés salino en Arabidopsis. Por el contrario, la
proteína RCI5 parece que no está implicado en la tolerancia de esta
especie al estrés producido por la deshidratación y por el
tratamiento con manitol. Por lo tanto, los resultados de la presente
invención indican que RCI5 no juega un papel general en el
desarrollo de tolerancia en plantas a estrés abiótico, sino que
presenta una función más específica en la tolerancia al frío y al
estrés salino, lo que se corresponde con el hecho que la expresión
de la proteína RCI5 se induce como respuesta a bajas
temperaturas, NaCl y LiCl, pero no por deshidratación ni por
manitol.
Además, los datos de la presente invención
demuestran que la proteína RCI5 regula positivamente la expresión
génica inducida por estrés. De hecho, bajo condiciones control y/o
de estrés (frío y estrés salino), las plantas
RCI5-OE muestran niveles altos de transcritos
correspondientes a diferentes genes inducibles por estrés, entre los
que se encuentran los CBFs, KIN1, LTI78, COR15A, COR47, CAT2
y SOD2. Por contra, la expresión de RAB18 y
RCI1A no esta alterada en las líneas
RCI5-OE, evidenciando de nuevo que la
proteína RCI5 no opera como un regulador positivo general de la
expresión génica inducida por estrés. Por otro lado, es importante
destacar que se ha descrito que la expresión de CBFs, KIN1,
LTI78, COR15A, COR47, CAT2 y SOD2 es capaz de mejorar la
supervivencia a estrés abiótico (Jaglo-Ottosen et
al., 1998; Liu et al., 1998; Kasuga et al., 1999;
Gilmour et al., 2000; Catala et al., 2003; Maruyama
et al., 2004; Gilmour et al., 2004; Novillo et
al., 2004; McKersie et al., 1996; Van Breusegem et
al., 1998; Apel y Hirt, 2004). Por tanto, el incremento de la
tolerancia a las temperaturas de congelación, antes y después de la
aclimatación a frío, y al estrés salino mostrado por las plantas
RCI5-OE debe ser atribuido a la alta
expresión de estos genes.
El gen RCI5 codifica una proteína con
actividad monooxygenasa como se evidencia por la caracterización de
la proteína recombinante obtenida y el análisis de la oxidación de
NADPH en extractos de las plantas transgénicas
RCI5-OE. Sin embargo, esta proteína contiene
todos los motivos típicos característicos de las enzimas FMO,
incluyendo un punto de unión a FAD, un motivo identificativo de FMO,
y un dominio de unión a NADPH (Cashman, 1994). Los motivos FMOs se
han descrito en distintos organismos, desde bacterias a humanos,
siendo los de origen eucariota los mejor caracterizados. Este motivo
FMO se une al cofactor FAD y cataliza la oxigenación de metabolitos
endógenos que contienen nitrógeno nucleofílico, fósforo, azufre, o
selenio a expensas de NADPH. En plantas, se ha descrito que las
proteínas FMOs juegan un papel en la biosíntesis de auxinas en
petunia y Arabidopsis (Zhao et al., 2001;
Tobeña-Santamaria et al., 2002; Cheng et
al., 2007). Además, en Arabidopsis, las FMOs son requeridas en
la respuesta de defensa frente a patógenos (Bartsch et al.,
2006; Koch et al., 2006; Mishina y Zeier, 2006) y se han
implicado en la biosíntesis de glucosinolatos (Hansen et al.,
2007). Los resultados descritos en esta invención indican claramente
que estos dominios FMOs de la proteína de la invención RCI5 en
plantas presentan una función en respuestas al estrés abiótico,
principalmente en respuestas al estrés por frío o estrés salino.
Finalmente, RCI5 presenta una propiedad funcional en las respuestas
de la planta a patógenos aunque deberá ser investigado en un
futuro.
Por último, la aplicación exógena del compuesto
TMAO reproduce parcialmente los perfiles de expresión génica
inducida por bajas temperaturas y estrés salino, así como los
fenotipos originados por la sobreexpresión de RCI5 (ver
Ejemplo 3), indicando que el TMAO es una nueva molécula señalizadora
en plantas que media la tolerancia a frío y al estrés salino
mediante la regulación positiva de la expresión de genes inducidos
por estrés. Hay que señalar que los fenotipos de tolerancia
inducidos por el TMAO son muy similares a los manifestados por las
plantas transgénicas RCI5-OE, como cabria
esperar de estar RCI5 implicado en la biosíntesis de TMAO.
En resumen, los resultados presentados en la
presente invención son la primera evidencia de que las plantas
también contienen el metabolito TMAO, cuya síntesis está inducida
por la proteína RCI5 y que las plantas transgénicas
RCI5-OE que contienen mayores niveles de RCI5
son mas tolerantes al frío y al estrés salino que las plantas
silvestres; y que la aplicación exógena en plantas del compuesto
TMAO las protege del frío y del estrés salino.
Por lo tanto, un aspecto de la invención lo
constituye una planta transgénica tolerante al frío y al estrés
salino, en adelante planta transgénica RCI5 de la invención, que
comprende una secuencia de nucleótidos que permite la expresión de
una proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del
siguiente grupo:
i.- la secuencia de nucleótidos del gen
RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; y
ii.- una secuencia de nucleótidos análoga a la
secuencia definida en a).
\vskip1.000000\baselineskip
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análoga" pretende incluir a cualquier secuencia de
nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base a la
secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ. ID N01, por ejemplo,
mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos
conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o
más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera
de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más
nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la
secuencia.
En general, una secuencia de nucleótidos análoga
es sustancialmente homologa a la secuencia de nucleótidos
identificada como la SEQ ID NO: 1. En el sentido utilizado en esta
descripción, la expresión "sustancialmente homologa" significa
que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de
identidad, a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%,
preferentemente de, al menos un 85%, o más preferentemente de, al
menos, un 95%.
Un aspecto particular de la presente invención
lo constituye una planta transgénica de la presente invención en la
que la secuencia de nucleótidos, que permite la expresión de una
proteína con actividad monooxigenasa (FMO), es el gen RCI5 de
SEQ ID NO: 1. Una realización particular de ésta es la planta
transgénica de Arabidopsis RCI5-OE generada
en la presente invención (ver Ejemplo 1.2 y Materiales y
Métodos).
Además, la presente invención se refiere a un
procedimiento de obtención de mejora de la tolerancia de plantas a
salinidad y frío mediante ingeniería genética de plantas. La técnica
ha sido desarrollada en la planta modelo Arabidopsis thaliana
y puede ser aplicada a plantas de interés agronómico y comercial
-entre otras, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la
presente invención: arroz, trigo, soja, maíz, tomate, tabaco, judía,
así como diferentes especies frutales (naranjo, limonero, etc.)-
mediante distintas técnicas de ingeniería genética conocidas por un
experto en la materia. Ello es posible porque las secuencias de
nucleótidos ortólogas u homologas de la secuencia descrita en la
presente invención (SEQ ID NO: 1) están conservados en plantas de
interés agronómico y existe tecnología adecuada para su aislamiento
y uso en ingeniería genética de plantas.
Secuencias de nucleótidos homologas a la
descrita en la presente invención (SEQ ID NO: 1) pueden encontrarse
como formas homologas en otras especies de plantas superiores de
interés comercial donde pueden estar de forma natural o en otro
caso, también podrían estar como resultado de un proceso de
transformación génica en el que el organismo transformado reproduzca
dichas moléculas de ADN. Estas formas homologas de la invención
pueden ser aisladas, mediante técnicas convencionales, a partir del
ADN de cualquier planta que las contengas y mediante el empleo de
sondas o de oligonucleótidos, preparados gracias a la información de
las secuencias de nucleótidos de dichas moléculas de ADN
proporcionadas en esta invención, por cualquier experto en la
materia.
\newpage
Así, otro aspecto de la invención lo constituye
un procedimiento de obtención de la planta transgénica RCI5, en
adelante procedimiento de obtención de una planta transgénica de la
invención, que consiste en la introducción en una planta de una
secuencia de nucleótidos constituida por:
i.- una secuencia de nucleótidos codificante de
proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del
siguiente grupo:
- la secuencia de nucleótidos del gen
RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; o una
secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a),
y
ii.- una secuencia de nucleótidos promotora que
permite y regula la expresión de la secuencia de i.- y la aparición
de una proteína con actividad monooxigenasa en el interior de la
célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Una realización particular de la presente
invención lo constituye un procedimiento de obtención de plantas de
la invención que comprende los siguientes pasos:
a) obtención de un vector de expresión que
contiene una secuencia de nucleótidos del gen RCI5 SEQ ID NO:
1,
b) obtención de microorganismos portadores del
vector a), y
c) transformación de las plantas con el vector
de a) o con el microorganismo de b).
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de nucleótidos, vectores de
expresión y células o microorganismos transformados, desarrollados y
necesarios para la puesta en práctica del procedimiento de obtención
de las plantas transgénicas de la presente invención, así como su
empleo para la producción de dichas plantas, constituyen aspectos
adicionales de la presente invención.
Así, otro aspecto de la presente invención lo
constituye una secuencia de nucleótidos, en adelante secuencia de la
presente invención, que permite la expresión de una proteína con
actividad monooxigenasa en las células de planta y que está
constituida por una de las posibilidades siguientes:
b) una secuencia de nucleótidos codificante de
una proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del
siguiente grupo: la secuencia de nucleótidos del gen RCI5 de
SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; o una secuencia de
nucleótidos análoga a la secuencia definida en a), con o sin
b) una secuencia de nucleótidos promotora que
permite y regula la expresión de la secuencia de a) y la aparición
de una proteína con actividad monooxigenasa en el interior de la
célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto particular de la presente invención
lo constituye una secuencia de nucleótidos de la invención en la que
la secuencia de nucleótidos codificante de una proteína con
actividad monooxigenasa está constituida por la secuencia de
nucleótidos RCI5 de SEQ ID NO: 1, un fragmento de la misma o
una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definidas
anteriormente.
Otro aspecto particular de la presente invención
lo constituye una secuencia de nucleótidos de la invención en la que
la secuencia de nucleótidos promotora es cualquier secuencia de
nucleótidos promotora capaz de regular la expresión génica en
plantas como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el
alcance de la invención, un promotor fuerte constitutivo, como por
ejemplo el promotor del virus del mosaico 35S, o un promotor que se
exprese en respuesta a distintos tipos de estrés abiótico, como por
ejemplo el del gen RD29A (Kasuga et al, 1999).
La secuencia de nucleótidos RCI5 de la
invención puede ser utilizada, en general, en la generación de un
vector de expresión que permite la expresión de estas proteínas en
una amplia gama de células huésped.
Por lo tanto, la invención también se refiere a
un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos
RCI5 de la invención, en adelante vector de expresión de la
presente invención, y que permite la transformación o transfección
de microorganismos y células y la posterior obtención de las plantas
transgénicas de la invención. Como realizaciones particulares del
vector de expresión de la invención se han generado los vectores
GST::RCI5 (ver Ejemplo 1) y el vector 35S::RCI5 (ver
ejemplo 2).
En general, el vector de expresión de la
presente invención comprende, al menos, una secuencia de la
invención y, al menos, un promotor que dirige la transcripción del
gen de interés (en este caso se indica el cDNA del gen como
secuencia de nucleótidos codificante representativa del propio gen)
al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o
apropiadas para la transcripción del gen de interés y su regulación
adecuada en tiempo y lugar, por ejemplo, señales de inicio y
terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de
replicación, activadores transcripcionales (enhancers),
silenciadores transcripcionales (silencers), etc. Ejemplos de
vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con
las condiciones y necesidades de cada caso concreto entre plásmidos
de expresión de plantas (Rothstein et al, 1987; Potrykus, I,
1991), virus ("Plant Virology Protocols" From Virus Isolation
to Transgenic Resistance Edited by: Gary D. Foster University of
Bristol, Bristol, UKPublished: 1998), que pueden contener, además,
un origen bacteriano o de levadura de replicación para que pueda ser
amplificado en bacterias o levaduras, así como un marcador
utilizable para seleccionar las células transfectadas diferente al
gen o genes de interés. Para la transformación de las plantas se
pueden utilizar diferentes métodos - vectores plasmidicos,
liposomas, electroporación, microinyección, etc - descritos en
diversos manuales (ver por ejemplo: (Plant Gene Transfer and
Expression Protocols Jones, Heddwyn University of Hertfordshire,
Hatfield, UK. Human Press Publishers). La elección del vector
dependerá de la célula hospedadora y de la planta en la que se va a
introducir posteriormente.
Otro aspecto de la invención lo constituye un
microorganismo o célula, en adelante célula de la invención, que
contiene la secuencia de nucleótidos RCI5 de la invención o el
vector de expresión de la invención.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye una semilla de una planta que comprende una secuencia de
nucleótidos, codificante de una proteína con actividad
monooxigenasa, constituida por la secuencia de nucleótidos RCI5 de
SEQ ID NO: 1, un fragmento de la misma o una secuencia de
nucleótidos análoga a la secuencia definidas anteriormente.
Finalmente, otro objeto de la presente invención
es el uso de las secuencias de nucleótidos, vectores de expresión,
células transformadas, y del procedimiento de la presente invención
para la obtención de plantas transgénicas de interés comercial.
Además, otro aspecto de la invención se basa en
el uso de una composición por ejemplo, acuosa, que comprende el
compuesto óxido de trimetilamina (TMAO) o un derivado del mismo, en
adelante uso de una composición de la invención, para inducir
tolerancia al estrés salino y al frío en las plantas y/o
semillas.
Otro aspecto particular de la presente invención
se basa en el uso de una composición de la invención donde la
composición acuosa comprende el compuesto TMAO en una concentración
comprendida entre 1 \muM y 100 mM, preferentemente entre 50 \muM
y 1 mM, y más preferentemente a 100 \muM.
Una realización particular de la presente
invención lo constituye el uso de una composición de la invención en
el que la concentración de TMAO es de 100 \muM.
La concentración de los componentes activos de
las composiciones dependerá del tipo de planta, fase de desarrollo
de la misma, así como de la frecuencia y forma de aplicación de las
composiciones.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye el uso de una composición de la invención para inducir
tolerancia al estrés salino en las plantas mediante su aplicación a
la parte aérea mediante pulverización.
Los principios fisiológicos del transporte de
los compuestos absorbidos por las hojas mediante pulverización, son
similares a los que ingresan en las plantas por la absorción vía
radicular, sin embargo, el movimiento de los compuestos aplicados
sobre las hojas no es el mismo en tiempo y forma que el que se
realiza desde las raíces al resto de la planta. La absorción foliar
es más efectiva cuando las condiciones de absorción desde el suelo
son adversas como por ejemplo en caso de sequía, estrés salino,
temperaturas extremas u otros estreses. Además, es mucho más fácil
obtener una distribución uniforme, a diferencia de la aplicación de
granulados o en mezclas físicas.
Otro aspecto particular de la presente invención
lo constituye el uso de una composición de la invención para inducir
tolerancia al estrés salino y al frió en las plantas mediante su
aplicación al tallo por inyección.
Otro aspecto particular de la presente invención
lo constituye el uso de una composición de la invención que se
aplica al suelo u otro sustrato de cultivo, al agua de riego (o
solución de cultivo) o por inmersión del sistema radicular de las
plantas y/o de semillas.
La aplicación de las composiciones acuosas por
medio de la inmersión de la parte radicular de la planta así como de
semillas se realiza por un tiempo y con una concentración que
depende del tipo de planta, estado de desarrollo así como de la
frecuencia y forma de aplicación de las composiciones. En el caso de
semillas que requieran un tratamiento especial de escarificación o
eliminación de determinadas cubiertas para facilitar su germinación,
el proceso de inmersión en las composiciones acuosas de la presente
invención, se podrá realizar de forma más efectiva después de la
eliminación de las cubiertas para facilitar la absorción de los
compuestos activos. Asimismo, también se podrán sumergir las
semillas en cualquier estadio de germinación.
Las formas de aplicación que se han citado hasta
ahora no limitan otro tipo de aplicaciones de las composiciones que
contienen TMAO a las plantas.
Los usos de una composición de TMAO descritos
anteriormente pueden comprender además un aditivo seleccionado de
entre fertilizantes orgánicos o inorgánicos, insecticidas,
nematocidas, fungicidas, bactericidas o herbicidas. De esta manera,
al aplicar las composiciones que contienen TMAO junto con aditivos,
ya sea para aportar nutrientes o para tratar determinadas
infecciones o plagas, se consigue no aumentar los costos de los
tratamientos al hacerlo de forma coordinada.
Figura
1
En las hibridaciones de tipo Northern se utilizó
la sonda de RCI5 y GUS. Cada carril contiene 20 \mug
de RNA total. Como controles de tratamiento y carga se emplearon las
sondas correspondientes a los genes KIN1 y 18S rRNA,
respectivamente.
a) RNAs procedentes de plantas de 3 semanas
crecidas a 20ºC (C), o expuestas adicionalmente a 4ºC los tiempos
indicados.
b) RNAs procedentes de raíces, hojas, tallos,
flores y silicuas de plantas de 8 semanas crecidas a 20ºC (C), o
expuestas 1 día adicional a 4ºC.
c) RNAs procedentes de plantas Ler,
aba1-1, Col, cbf2,
CBF1-AS3 de 3 semanas crecidas a 20ºC (C),
expuestas 1 día adicional a 4ºC (4ºC), o tratadas con NaCl 250 mM
recogiendo el material un día mas tarde (NaCl).
d) RNAs procedentes de plantas de 3 semanas
crecidas a 20ºC (C), expuestas un día adicional a 4ºC (4ºC), regadas
con NaCl 250 mM recogiendo el material 24 h después (NaCl),
deshidratadas hasta perder el 50% de su peso fresco (D), regadas con
LiCl 20 mM (LiCl) o manitol 500 mM (Manitol) recogiendo el material
a las 24 h.
e) RNAs procedentes de plantas transgénicas
RCI5::GUS de 3 semanas crecidas a 20ºC (C), expuestas 1 día
adicional a 4ºC (4ºC) o regadas con NaCl 250 mM (NaCl) recogiendo el
material a las 24 h.
f) Localización histoquímica de la actividad GUS
en semillas, plántulas y distintos órganos de plantas transgénicas
RCI5::GUS de 8 semanas crecidas a 20ºC (C), o expuestas un
día adicional a 4ºC (4ºC). En la respuesta a deshidratación se
obtuvo el mismo patrón de actividad GUS que las plantas control (C).
En el caso de tratamiento con NaCl se obtuvo el mismo patrón que el
mostrado en las plantas expuestas a 4ºC (4ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
a) Tinción con Coomassie de un gel
SDS-PAGE al 12% conteniendo las distintas fracciones
obtenidas al purificar RCI5. El primer carril incluye un extracto de
bacterias conteniendo el vector de expresión de proteínas (pGEX), el
segundo carril incluye un extracto de bacterias conteniendo el
plásmido de expresión pGEX::RCI5
(pGEX-RCI5), el tercer carril incluye la
proteína de fusión GST::RCI5 después de ser purificada por medio de
una columna de glutation sepharosa 4B (GST-RCI5), y
el ultimo carril contiene la proteína RCI5 purificada a partir de
GST::RCI5 mediante digestión con trombina (RCI5). Cada carril
contiene 20 \mug de proteína.
b) Medidas de actividad monooxigenasa de las
fracciones proteicas que se muestran en el panel (a). La gráfica
muestra los \mumoles de NADPH consumidos por hora a 24ºC. En todos
los casos, los experimentos se realizaron con 100 ug de proteína.
Los datos corresponden a medias \pmSE de tres experimentos
independientes.
c) Niveles de mRNAs de RCI5 en plantas
transgénicas 35S::RCI5. Las hibridaciones de tipo Northern
fueron realizadas con RNA total (20 \mug) aislado de plantas de
Arabidopsis de 3 semanas y cuatro líneas transgénicas independientes
(1T-4T) conteniendo la fusión 35S::RCI5
(RCI5-OE) crecidas en condiciones control.
Como control de carga se empleó la sondas correspondiente a al gen
18S rRNA.
d) La gráfica muestra el NADPH consumido por
hora a 24ºC en plantas de Arabidopsis control (WT) y en las cuatro
líneas transgénicas (1T-4T) que contienen la fusión
35S::RCI5 (RCI5-OE) crecidas en condiciones
control.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
3
a) Porcentaje de plantas Col y transgénicas
35S::RCI5 (linea 1T1) crecidas durante 2 semanas a 20ºC que
sobreviven tras ser expuestas 6 h a distintas temperaturas de
congelación. Los datos corresponden a medias \pmSE de tres
experimentos independientes, con un número mínimo de 50 plantas de
cada genotipo por experimento.
b) Porcentaje de plantas Col y transgénicas
35S::RCI5 (linea 1T1) crecidas durante 2 semanas a 20ºC y
aclimatadas durante 7 días a 4ºC, que sobreviven tras ser expuestas
6 h a distintas temperaturas de congelación. Los datos corresponden
a medias \pmSE de tres experimentos independientes, con un número
mínimo de 50 plantas de cada genotipo por experimento.
\global\parskip0.950000\baselineskip
c) Plantas Col y transgénicas 35S::RCI5
(Línea 1T1) crecidas 2 semanas a 20ºC, después de ser congeladas a
-6ºC durante 6 h.
d) Plantas Col y transgénicas 35S::RCI5
(Línea 1T1) crecidas 2 semanas a 20ºC y aclimatadas durante 7 días a
4ºC, después de ser congeladas a -8ºC durante 6 h.
e) Tolerancia a NaCl, LiCl y Manitol. Número de
hojas verdes y porcentaje de peso fresco inicial en plantas Col y
transgénicas 35S::RCI5 (línea 1T1) expuestas a
concentraciones crecientes de NaCl (50 mM-200 mM),
LiCl (5 mM-20 mM) o manitol (100
mM-400 mM), durante 2 días a cada concentración,
respecto a los mismos parámetros en plantas Col a las que no se les
ha aplicado el tratamiento. Los datos corresponden a medias \pmSE
de tres experimentos independientes, con un número mínimo de 20
plantas de cada genotipo por experimento.
f) Plantas Col y transgénicas 35S::RCI5
(linea 1T1) después de ser expuestas a concentraciones crecientes de
NaCl (50 mM-200 mM), LiCl (5 mM-20
mM) o manitol (100 mM-400 mM), durante 2 días a cada
concentración.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
4
Las gráficas muestran los \mumoles de TMAO por
cada kg de peso fresco. Los datos corresponden a medias \pmSE de
cinco experimentos independientes y en cada experimento se
incluyeron un mínimo de 50 plantas.
a) Plantas Col crecidas a 20ºC durante 3 semanas
y expuestas 1 día adicional a 4ºC, regadas con NaCl 250 mM
recogiendo el material al cabo de 1 día, o deshidratadas hasta
perder el 50% de su peso fresco.
b) Plantas Col y transgénicas 35S::RCI5
crecidas a 20ºC durante 3 semanas.
c) Plantas col y transgénicas 35S::RCI5
crecidas a 20ºC durante 3 semanas y expuestas 1 día a 4ºC o regadas
con NaCl 250 mM recogiendo el material al cabo de un día.
d) \mumoles de TMAO obtenidos mediante una
reacción in vitro usando diferentes concentraciones (50, 100
y 200 \muM) de RCI5 purificado de E. coli.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
5
Hibridaciones de tipo Northern utilizando sondas
específicas para (a y c) KIN1, LTI78, COR15A, COR47, RAB18,
RCI1A, CAT2, SOD2 y RCI5 (esta último solo en c); (b y d)
CBF1, CBF2 y CBF3 y GUS. Cada carril contiene 20
\mug de RNA total. En todos los casos se usaron sondas específicas
para cada gen. Como control de la carga se empleó la sonda
correspondiente a 18S rRNA.
a) Hibridaciones tipo Northern con las sondas
anteriormente mencionadas de muestras procedentes de plantas Col
(WT) y transgénicas 35::RCI5 (RCI5-OE)
crecidas durante 3 semanas a 20ºC (C), expuestas 1 día adicional a
4ºC o tratadas con NaCl 250 mM recogiendo el material al cabo de 1
día.
b) Hibridaciones tipo Northern con las sondas
anteriormente mencionadas de muestras procedentes de plantas Col
(WT) y transgénicas 35::RCI5 (RCI5-OE)
crecidas durante 3 semanas a 20ºC (C), expuestas 3 horas adicionales
a 4ºC o tratadas con NaCl 250 mM recogiendo el material al cabo de 3
horas.
c) Hibridaciones tipo Northern con las sondas
anteriormente mencionadas de muestras procedentes de plantas Col
crecidas durante 3 semanas a 20ºC (C), tratadas con TMAO 100 \muM
(TMAO), expuestas a 4ºC o tratadas con NaCl 250 mM recogiendo el
material al cabo de 1 día.
d) Hibridaciones tipo Northern con las sondas
anteriormente mencionadas de muestras procedentes de plantas Col
crecidas durante 3 semanas a 20ºC (C), tratadas con TMAO 100 \muM
(TMAO), expuestas a 4ºC o tratadas con NaCl 250 mM recogiendo el
material al cabo de 3 horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
6
a) Porcentaje de plantas Col crecidas a 20ºC (C)
y tratadas con TMAO 100 \muM 3 días antes de la congelación
(TMAO), no aclimatadas (NA) y aclimatadas 7 días a 4ºC (A), que
sobreviven tras ser expuestas 6 horas a -6ºC o -8ºC,
respectivamente. Los datos corresponden a medias \pmSE de tres
experimentos independientes, con un número mínimo de 50 plantas de
cada genotipo por experimento.
\global\parskip1.000000\baselineskip
b) Porcentaje de número de hojas verdes en
plantas Col crecidas en MS (C) y Col crecidas en MS suplementado con
TMAO 100 \muM (TMAO), expuestas posteriormente a concentraciones
crecientes de NaCl (50 mM-200 mM), LiCl (5
mM-20 mM) o manitol (100 mM-400 mM)
durante 2 días a cada concentración, respecto al número de hojas
verdes en plantas Col a las que no se les ha aplicado el
tratamiento. Los datos corresponden a medias \pmSE de tres
experimentos independientes, con un número mínimo de 20 plantas de
cada genotipo por experimento.
c) Plantas Col crecidas a 20ºC (C) y tratadas
con TMAO 100 \muM 3 días antes de la congelación (TMAO), no
aclimatadas (NA) y aclimatadas 7 días a 4ºC (A), que sobreviven tras
ser expuestas 6 horas a -6ºC o -8ºC, respectivamente.
d) Plantas Col crecidas en MS (C) o en MS
suplementado TMAO 100 \muM (TMAO) después de ser expuestas a
concentraciones crecientes de NaCl (50 mM-200 mM),
LiCl (5 mM-20 mM) o manitol (100
mM-400 mM) durante 2 días a cada concentración.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
7
a) Mapa de restricción del fragmento de DNA
genómico que contiene el gen RCI5. Se indican los sitios de
corte de las enzimas de restricción EcoRI (E), XbaI
(X) y HindIII (H). ATG indica el inicio de la traducción de
RCI5 y los rectángulos grises sus regiones codificantes. La
línea de puntos marca la región utilizada como sonda.
b) Hibridación de tipo Southern con 5 \mug de
DNA genómico de Arabidopsis digerido con EcoRI (E),
XbaI (X) y HindIII (H), utilizando la sonda de RCI5. A
la derecha se indican los tamaños (en kpb) de las bandas
obtenidas.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
8
Gráficas representativas que muestran \mumoles
de TMAO por Kg de peso fresco de plantas de Col de tres semanas
crecidas a 20ºC y expuestas a 4ºC durante diferentes tiempos (0, 6,
12, 24, 48 y 72 horas) (a) o expuestas a diferentes concentraciones
de NaCl (50, 100, 150, 200, 250 y 300 mM) durante 1 día (b).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
9
Gráficas representativas que muestran \mumoles
de TMAO por Kg de peso fresco de plantas de Col de tres semanas
crecidas a 20ºC y tratadas con diferentes concentraciones de TMAO
durante 1 día (0, 10, 50, 100 y 200 \muM) (a) o tratadas con 100
\muM TMAO durante diferentes tiempos (0, 6, 12, 24, 48, y 76
horas).
\vskip1.000000\baselineskip
RCI5 (At1g12140) fue aislado mediante el
rastreo de una biblioteca de cDNAs preparada a partir de plántulas
etioladas de Arabidopsis aclimatadas a frío (4ºC, durante 3 días)
con una sonda substractiva enriquecida en transcritos inducidos por
frío. La comparación de este cDNA (SEQ ID NO: 1), denominado
RCI5, con otras secuencias genómicas reveló que el gen RCI5
contiene 5 exones y 4 intrones (SEQ ID NO: 3). El análisis de la
expresión de este gen en plántulas etioladas de Arabidopsis mediante
hibridaciones de tipo Northern con una sonda especifica confirmó
que, de hecho, su expresión se induce en respuesta a temperaturas
bajas (Fig. 1a). Los transcritos de RCI5 se acumulan de
manera transitoria durante la exposición a 4ºC, alcanzando el nivel
máximo a las 12 h del comienzo del tratamiento. En plántulas
crecidas en condiciones control, los niveles de transcritos de
RCI5 son muy bajos (Fig. 1a). La especificidad de la sonda
fue determinada por hibridaciones de tipo Southern (Fig. 7b). Cuando
se estudió la expresión de RCI5 en plantas adultas (Fig. 1b),
la inducción por frío se detectó principalmente en hojas aunque se
observó una pequeña inducción en flores. La acumulación de
mensajeros RCI5 no experimentaba cambios aparentes ni en
raíces, ni en tallos ni en silicuas expuestas a frío (Fig. 1b). En
condiciones no estresantes, se detectaron niveles muy bajos de
transcritos RCI5 en todos los órganos, excepto en silicuas
(Fig. 1b). La inducción de RCI5 en respuesta a las
temperaturas bajas no se veía afectada en aba1-1, un
mutante deficiente en ABA (Koornneef et al., 1982),
cbf2-1, un mutante nulo para el gen
CBF2 (Novillo et al. 2004), y
CBF1-AS3, una línea transgénica de
Arabidopsis que no presenta inducción por frío de CBF1 o
CBF3 (Novillo et al., 2007) (Fig. 1c), sugiriendo
fuertemente que RCI5 es regulado por las temperaturas bajas a
través de una vía de señalizaron independiente de ABA y de los
CBFs.
Ya que, como se ha mencionado anteriormente,
muchos genes inducibles por frío responden también a otros estreses
abióticos, se examinó el efecto de la deshidratación y del estrés
salino en la expresión de RCI5. Únicamente se observó
acumulación de mRNAs de RCI5 después del tratamiento con NaCl
(Fig. 1d). Para determinar si esta acumulación era causada por el
componente iónico u osmótico del tratamiento con NaCl, se estudió la
expresión de RCI5 en plantas de Arabidopsis expuestas a LiCl,
ya que Li^{+} es un catión tóxico muy relacionado con el ión
Na^{+}, y manitol, que mimetiza el estrés osmótico sin la
toxicidad del estrés iónico. Los resultados obtenidos revelaron que
RCI5 se inducía por LiCl pero no por manitol (Fig. 1d),
indicando que el componente iónico era el responsable de la
acumulación de transcritos de RCI5 en respuesta a estrés
salino. Como en el caso de las temperaturas bajas, la inducción de
RCI5 en respuesta a NaCl parece estar mediada a través de una
vía independiente de ABA (Fig. 1c). KIN1 fue usado como
control positivo de todos los experimentos.
La expresión de RCI5 a nivel tisular
durante el desarrollo de la planta y en respuesta a diferentes
tratamientos fue estudiada mediante el análisis de plantas de
Arabidopsis que contienen una fusión de un fragmento de 782 pb del
promotor de RCI5 (de -770 a +12 desde el ATG) al gen
reportador uidA (GUS). Se examinaron cinco líneas
transgénicas independientes que contenían una única copia en
homocigosis del transgén. En todos los casos, la acumulación de
mRNAs de GUS en hojas expuestas a 4ºC o NaCl presentaban un
patrón muy similar al observado para los transcritos endógenos de
RCI5 (Fig. 1e). Estos resultados sugieren que el fragmento de
promotor aislado contenía los elementos de regulación en cis
implicados en la inducción de RCI5 en respuesta a las
temperaturas bajas y a estrés salino, y que esta inducción está
regulada a nivel transcripcional. El análisis histoquímico de la
actividad GUS no mostró tinción en las semillas transgénicas (Fig.
1f). Bajo condiciones no estresantes sólo se pudieron detector
niveles muy bajos de tinción GUS durante la germinación y en los
primeros estadios del desarrollo en los haces vasculares de raíces,
hipocotilos, cotiledones y hojas (Fig. 1f). En plantas desarrolladas
completamente, la tinción GUS fue ligeramente apreciable en las
venas de las hojas (Fig. 1f). Cuando se expusieron plantas
transgénicas en germinación a temperaturas bajas o NaCl, la tinción
GUS fue como en plantas no estresadas pero significativamente más
fuerte (Fig. 1f). Las plantas transgénicas adultas únicamente
mostraban niveles altos de actividad GUS en el tejido vascular,
aunque se podía observar una ligera tinción en las flores (base y
venas de los sépalos) y en las silicuas (zona de abscisión) (Fig.
1f). En las líneas transgénicas sometidas a deshidratación, el
patrón de actividad GUS era, en todos los casos, como el obtenido en
condiciones control (Fig. 1f). En conjunto, todos estos datos
demuestran que la expresión de RCI5 se encuentra regulada
durante el desarrollo de Arabidopsis y se induce en respuesta a frío
y estrés salino, principalmente en el tejido vascular de las
hojas.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia del cDNA RCI5 (SEQ ID NO: 1)
codifica para un polipéptido de 459 aminoácidos (SEQ ID NO: 2), con
un peso molecular estimado de 52 kDa y un pl de 6.1. Búsquedas en
bases de datos reveló que dicho polipéptido o proteína RCI5 contiene
los típicos motivos de una enzima flavina monooxigenasa (FMO)
(Cashman, 1994). De hecho, RCI5 posee un sitio altamente conservado
de unión a FAD, un domino de identificación de FMO y un dominio de
unión a NADPH que son característicos de las enzimas FMO.
Esta proteína RCI5 es una enzima con actividad
FMO que fue analizada en primer lugar investigando su capacidad para
oxidar NADPH, tras haber sido expresada y purificada en
Escherechia coli (Fig. 2a). Los resultados mostraron que, de
hecho, RCI5 tiene actividad monooxigenasa. La proteína de fusión
GST::RCI5 purificada y, sobre todo, la misma proteína RCI5 exhibió
una mayor capacidad para oxidar NADPH (2 y 8 veces, respectivamente)
que los extractos de E. coli conteniendo el plásmido vacío o
con el cDNA de RCI5 (fig. 2b). Posteriormente, se analizó la
actividad monooxigenasa de RCI5 in vivo utilizando plantas
transgénicas de Arabidopsis que sobreexpresan de forma constitutiva
la proteína RCI5 (plantas transgénicas
RCI5-OE). Para determinar la actividad
monooxigenasa se seleccionaron cuatro líneas independientes,
homocigotas para una copia única del transgén y que mostraban
niveles altos de expresión de RCI5 en condiciones control
(Fig. 2c). Las plantas sobreexpresoras de RCI5 crecieron y se
desarrollaron de manera idéntica a las plantas silvestres en
condiciones normales de crecimiento. En todos los casos, extractos
de estas líneas transgénicas RCI5-OE
presentaron una capacidad para oxidar NADPH significativamente mayor
que los extractos de plantas silvestres (Fig. 2d). Así, se concluye
que la proteína RCI5 es una enzima con actividad FMO.
\vskip1.000000\baselineskip
La tolerancia a la congelación de plantas
transgénicas RCI5-OE y silvestres de dos
semanas, antes y después de aclimatarlas al frío (4ºC, 7d), fue
cuantificada como el porcentaje de plantas supervivientes después de
haber sido expuestas 6 h a diferentes temperaturas de congelación.
La deshidratación fue inducida manteniendo plántulas transgénicas y
silvestres de 10 días en un papel de filtro durante 2 días. La
tolerancia a este estrés fue cuantificada como el porcentaje de peso
freso inicial (FW) remanente tras el tratamiento. Por último, la
tolerancia al estrés salino fue estimada determinando el peso fresco
y el número de hojas de plantas transgénicas
RCI5-OE y silvestres de 10 días cultivadas
durante 8 días en medios con concentraciones crecientes de NaCl (de
50 a 200 mM). La sobreexpresión de RCI5 incrementó
significativamente la tolerancia de Arabidopsis a la congelación
tanto de plantas no aclimatadas como aclimatadas 7 días a 4ºC,
siendo este incremento muy similar en ambos casos. Como todas las
líneas transgénicas RCI5-OE mostraron
fenotipos de tolerancia similares, únicamente se presentan los
resultados de la línea 1T (Figs. 3a, b). Los valores de LT_{50}
(temperatura que causa un 50% de mortalidad) de plantas no
aclimatadas silvestres y transgénicas RCI5-OE
estimados fueron -5,4 y -6,5ºC, respectivamente (Fig. 3a). Los
valores de LT50 de plantas silvestres y
RCI5-OE aclimatadas a frío fueron -7,5 y
-8,7ºC, respectivamente (Fig. 3b). El incremento en la tolerancia de
las líneas RCI5-OE, antes y después de la
aclimatación, era muy evidente a nivel fenotípico (Figs. 3c, d). No
se observó ninguna diferencia entre las plantas silvestres y
RCI5-OE cuando se analizó la tolerancia a la
deshidratación (datos no mostrados). Sin embargo, todas las líneas
sobreexpresoras de RCI5 presentaron una mayor tolerancia al
estrés salino que las plantas silvestres. Los fenotipos de
tolerancia mostrados por las diferentes líneas
RCI5-OE eran casi indistinguibles por lo que
solamente se presentan los resultados correspondientes a la línea 1T
(Fig. 3e). Las plantas transgénicas RCI5-OE
expuestas a estrés salino tenían mayor numero de hojas verdes y de
FW que las plantas silvestres no estresadas (p.e., alrededor de 120%
en ambos casos; Fig. 3e), indicando que la sobreexpresión del gen
RCI5 es suficiente para superar el estrés producido por el
tratamiento de NaCl. Además, las plantas silvestres sólo tuvieron un
80 y 70% de hojas verdes y peso fresco del que presentan en
condiciones control (Fig. 3e). Los mismos resultados se obtuvieron
cuando se expusieron plantas silvestres y transgénicas
RCI5-OE a concentraciones crecientes de LiCl
(5 mM-20 mM; Fig 3e). Por el contrario, plantas
silvestres y transgénicas RCI5-OE expuestas a
concentraciones crecientes de manitol (100 mM-400
mM) mostraron valores de número de hojas verdes y FW muy similares
(Fig 3e). Las diferencias encontradas entre la tolerancia de las
plantas transgénicas RCI5-OE y de las plantas
silvestres a los tratamientos con NaCl y LiCl fueron muy claras a
nivel fenotípico (Fig. 3f). En conjunto, estos resultados demuestran
que la sobreexpresión constitutiva del gen RCI5 incrementa la
tolerancia de Arabidopsis a la congelación y al estrés salino,
debido a su componente iónico, sugiriendo que la proteína RCI5 actúa
como un regulador positivo de la respuesta de Arabidopsis a frío y
estrés salino.
\vskip1.000000\baselineskip
La pregunta resultante era como la proteína RCI5
podría regular en Arabidopsis las respuestas al estrés por frío o
salino. Numerosos estudios indican que una de las funciones
fisiológicas de las FMO podría ser la osmoregulación, ya que en
animales se ha demostrado que estas encimas oxidan el metabolito
endógeno trimetilamina (TMA) a TMAO (Ziegler, 1993; Larsen y
Schelenk, 2001), un potente osmolito que facilita la adaptación de
diferentes organismos marinos a entornos salinos y con temperaturas
de congelación (Yancey et al., 1982; Larsen y Schelenk, 2001;
Seibel y Walsh, 2002; Treberg et al., 2005; Strambini y
Gonnelli, 2008). Por lo tanto, se decidió investigar si la proteína
RCI5 estaba implicada en la biosíntesis de TMAO. Así, se trató de
detectar TMAO en plantas de Arabidopsis creciendo en condiciones
controladas. Los resultados revelaron que, de hecho, plantas de
Arabidopsis no estresadas tienen niveles muy bajos, pero detectables
(\sim5 \mumol Kg^{-1} FW) de TMAO (Fig. 4a). Es destacable,
sin embargo, que cuando las plantas fueron expuestas a temperaturas
bajas o estrés salino, los dos tratamientos que inducen la expresión
del gen RCI5 (Fig. 1d), el contenido de TMAO se incrementa
significativamente. Así pues, la exposición a 4ºC ó 250 mM durante
24 h produce una acumulación de TMAO hasta valores cercanos a 25 y
35 \mumol Kg^{-1} FW, respectivamente (Fig. 4a), que son los
niveles máximos de TMAO endógeno que se detectaron en las
condiciones de estrés (Fig. 8). La deshidratación como estrés, que
no tiene ningún efecto en la expresión de RCI5 (Fig. 1d), tampoco
afecta los niveles de TMAO (Fig. 4a).
La identificación de TMAO endógeno en
Arabidopsis y la existencia de una correlación entre la expresión de
la proteína RCI5 y el contenido en TMAO llevó a analizar el
contenido de esta molécula en las líneas transgénicas
RCI5-OE. De forma clara, todas las plantas
que sobreexpresaban el gen RCI5
(RCI5-OE) manifestaron niveles
significativamente más elevados de TMAO (\sim2 veces) que las
plantas silvestres originales (Figura 4b), indicando que la proteína
RCI5 está involucrada en la biosíntesis de TMAO. Estos niveles, sin
embargo, eran menores (3-4 veces) que los
determinados en plantas silvestres expuestas a frío o a el
tratamiento con sal (Figura 4a), lo que sugiere fuertemente que
otras enzimas FMO, además de RCI5, tienen que estar implicadas en la
biosíntesis de TMAO en respuesta a estos estreses. De igual forma,
las plantas transgénicas RCI5-OE sometidas a
4ºC ó a 250 mM de NaCl durante 24 horas exhibieron mayores (\sim2
veces) cantidades de TMAO que las plantas silvestres expuestas al
mismo tratamiento (Figura 4c).
Una evidencia completa y definitiva de la
implicación de la proteína RCI5 en la biosíntesis de TMAO se obtuvo
mediante ensayos in vitro donde se analizó la capacidad de
RCI5 para oxidar TMA a TMAO. Los resultados confirmaron que la
proteína RCI5 de la invención purificada de E. coli fue capaz
de oxidar TMA de una manera dosis dependiente, generando cantidades
sustanciales de TMAO (Figura 4d). Estos datos demuestran que las
plantas Arabidopsis contienen niveles constitutivos de TMAO, que
dichos niveles se incrementan significativamente en respuesta a
estrés por bajas temperaturas y salino, y que dicho incremento se
debe en parte, por la inducción de la expresión de RCI5.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados descritos hasta ahora sugieren
una función de la proteína RCI5 en la osmoregulación a través de la
biosíntesis de TMAO. Sin embargo, la mayor acumulación de TMAO en
plantas de Arabidopsis sujetas a estrés por frío o sal
(25-35 \mumol Kg^{-1} FW) parece ser baja para
mediar un reajuste osmótico en estas condiciones. De hecho, esta
concentración es del orden de tres veces de magnitud menor que la
descrita para el TMAO en animales (Larsen y Schlenk, 2001; Seibel y
Walsh, 2002) y para diferentes osmolitos, como la prolina y la
glicinabetaina, en plantas (Wood et al., 1996; Russell et
al., 1998; Sakamoto y Murata, 2000). Se ha propuesto que, en
bajas concentraciones, algunos osmolitos pueden ejercer su papel
protector frente a estrés abiótico por medio de mecanismos
diferentes a la osmoprotección (Chen y Murata, 2002). Por ejemplo,
se ha sugerido que la prolina y la glicina botaina podrían regular
la expresión génica (Rajendrakumar et al., 1997; Iyer y
Caplan, 1998; Kavi Kishor et al., 2005; Mattioli et
al., 2008). Por tanto, se examinó la posibilidad de que el TMAO
pudiese actuar como una molécula señalizadora mediando la inducción
de la expresión génica en respuesta a estrés.
Ya que la proteína RCI5 esta implicado en la
síntesis de TMAO (ver mas arriba), primero se estudiaron los niveles
de transcritos de diferentes genes cuya expresión se induce por
estrés en las líneas transgénicas RCI5-OE
crecidas en condiciones control o expuestas a temperaturas bajas o
estrés salino. Entre los genes estudiados se incluyeron KIN1,
LTI78, COR15A y COR47, que son inducidos en respuesta a
diferentes estreses abióticos a través de las rutas dependientes e
independientes de los CBFs (Gilmour et al., 2004; Maruyama
et al., 2004), RAB18 y RCI1A, que son regulados
positivamente por frío por una vía independiente de los CFBs (Lang y
Palva, 1992; Jarillo et al., 1994; Gilmour et al.,
2004; Maruyama et al., 2004; López-Cobollo y
Salinas, unpublished results), y CAT2 y SOD2, dos
genes cuya expresión aumenta en respuesta a diferentes estreses y
codifican proteínas implicadas en la detoxificacion de ROS (Refs;
Kliebestein et al., 1998; Chevalier et al., 1992).
Además, se estudiaron los niveles de los genes CBFs
(CBF1-3), cuya expresión es promovida
específicamente por las temperaturas bajas (Gilmour et al.,
1998; Liu et al., 1998; Medina et al., 1999). Como los
patrones de expresión de todas las líneas transgénicas
RCI5-OE analizadas fueron muy similares solo
se muestran los resultados obtenidos con la línea 1T (Figs. 5a, b).
En condiciones control, la acumulación de transcritos
correspondientes a KIN1, COR15A, COR47, y principalmente los
de CAT2 y SOD2 fueron considerablemente superiores en
las plantas sobreexpresoras de RCI5 que en las silvestres
(Fig. 5a). La expresión de los otros genes analizados no se vio
afectada en la líneas transgénicas RCI5-OE
(Figs. 5a, b). La inducción de todos los genes, excepto RAB18
y RCI1A, en respuesta a frío era mayor en las plantas que
sobreexpresaban RCI5 (Fig. 5a, b). En condiciones de estrés
salino, todos los genes que responden a NaCl (p.e., KIN1, LTI78,
COR15A, COR47, CAT2 y SOD2, ver estos genes en la Fig 5a)
mostraban una mayor inducción en las plantas
RCI5-OE (Fig. 5a, b). Estos patrones de
expresión justifican completamente el incremento de la tolerancia a
la congelación, antes y después de la aclimatación a frío y a estrés
salino de las líneas RCI5-OE (Fig. 3). Por
tanto, se concluye que la proteína RCI5 regula positivamente la
respuesta de la expresión génica a estrés, lo cual sugiere que el
TMAO podría, de hecho, mediar la inducción por estrés de la
expresión génica y, por tanto, la tolerancia de Arabidopsis a la
congelación y al estrés salino.
\vskip1.000000\baselineskip
Si el TMAO actúa como una molécula señalizadora
y media la inducción de la expresión génica por estrés, su
aplicación exógena a plantas de Arabidopsis en condiciones control
debería inducir la expresión génica regulada por estrés. Esta
hipótesis se verificó examinando la acumulación de los transcritos
correspondientes a los genes analizados anteriormente in plantas
silvestres de Arabidopsis pulverizadas con 100 \muM TMAO, una
concentración que, tras 24 h de tratamiento, provoca una acumulación
de TMAO endógeno en el mismo rango detectado en plantas expuestas a
temperaturas bajas o estrés salino (30-35 \mumol
Kg^{-1} FW; Fig. 9). Excepto en el caso de RAB18 y
RCI1A, el TMAO exógeno activó la expresión de todos los genes
hasta niveles similares a los alcanzados tras la exposición a 4ºC y
NaCl (Figs. 5c, d), confirmando que el TMAO media la inducción de la
expresión génica por estrés. También se estudió La acumulación de
mRNA de RCI5 en respuesta a TMAO. Los resultados obtenidos
indican que la inducción por frío y sal del gen RCI5 no está
mediada por TMAO (Fig. 5c).
Por último, se estudió si el TMAO también
mediaba la tolerancia de Arabidopsis a la congelación y al estrés
salino. Para ello, plantas silvestres de Arabidopsis fueron
pulverizadas con 100 \muM TMAO y se determinó su tolerancia a la
congelación, antes y después de la aclimatación a frío, así como su
tolerancia a deshidratación y estrés salino. De manera consistente
con lo descrito anteriormente, la aplicación exógena de TMAO aumentó
de manera significativa la tolerancia de Arabidopsis a la
congelación, tanto de plantas aclimatadas como no aclimatadas, y a
estrés salino (Figs. 6a, b), pero no tuvo ningún efecto en la
capacidad de Arabidopsis para tolerar la deshidratación. También de
estudió la tolerancia a LiCl y manitol de plantas de Arabidopsis
tratadas con TMAO. El TMAO incrementó la tolerancia de Arabidopsis a
LiCl pero no a manitol (Fig. 6b), indicando que, como la proteína
RCI5, está implicado de manera específica en la tolerancia al
componente iónico del estrés salino. Las diferencias fenotípicas de
las plantas tratadas con TMAO y las no tratadas son muy evidentes
(Figs. 6c, d). En conjunto, todos estos resultados indican que el
TMAO actúa como una molécula señalizadota mediando la tolerancia de
Arabidopsis a la congelación y al estrés salino regulando
positivamente la inducción de la expresión génica.
\vskip1.000000\baselineskip
En este estudio se utilizó como material vegetal
Arabidopsis thaliana (L.) ecotipos Columbia (Col) y Landsberg
erecta (Ler), los mutantes aba1-1
(ref) y cbf2-1 (Novillo et al., 2004),
así como CBF1-AS3, una línea transgénica de
Arabidopsis en la cual CBF1 y CBF3 no son inducidos
por frío (Novillo et al., 2007). Para la obtención de
plántulas, las semillas eran sembradas en condiciones estériles en
cajas Petri con medio MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con
250 mg/l MES, solidificado con agar al 0,8% (w/v). Las plantas eran
cultivadas en macetas que contenían una mezcla de sustrato orgánico
con vermiculita (3:1, v/v), y se regaban con agua y una solución
mineral (Haughn y Sommerville, 1986). Ambas, plántulas y plantas, se
crecían a 21\pm1ºC en condiciones de día largo (16 horas de luz
blanca fluorescente, flujo de fotones de de 70-90
\mumol m^{-2} sec^{-1}).
Los análisis de expresión se realizaron con
plantas de tres semanas, excepto en el análisis en diferentes
órganos donde se utilizaron plantas de 8 semanas. El tratamiento de
bajas temperaturas se realizó transfiriendo las plantas a una cámara
de crecimiento a 4\pm1ºC durante diferentes periodos bajo las
condiciones de luz y fotoperiodo descritas a anteriormente. Para los
tratamientos con NaCl, LiCl y manitol las plantas fueron regadas con
250 mM NaCl, 20 mM LiCl y 500 mM manitol respectivamente, y
recolectadas un día mas tarde. La deshidratación fue inducida
dejando las plantas, previamente separadas de su sistema radicular,
perder un 50% de su FW. Para los tratamientos de TMAO, las plantas
fueron pulverizadas con 100 \muM TMAO y recolectadas un día mas
tarde. El control del tratamiento de TMAO se obtuvo pulverizando
plantas con agua. En todos los casos, las plantas fueron congeladas
inmediatamente con N_{2} después de los tratamientos y guardadas a
-80ºC hasta su uso.
El TMAO endógeno se midió siempre en plantas de
3 semanas. Se utilizaron plantas pulverizadas con 100 \muM TMAO y
recogidas tras diferentes tiempos de tratamiento, o pulverizadas con
diferentes concentraciones (10, 50, 100 y 200 \muM) de TMAO y
recogidas un día después. También se regaron plantas con diferentes
concentraciones (50, 100, 150, 200, 250 y 300 mM) de NaCl y se
recogieron un día después. El efecto de las temperaturas bajas en el
contenido de TMAO endógeno se estudio exponiendo plantas a 4ºC
durante diferentes tiempos. Después de recogerlas, las plantas
siempre fueron congeladas en N_{2} y usadas inmediatamente.
Los experimentos de congelación se llevaron a
cabo con plantas de 2 semanas como se ha descrito previamente
(Novillo et al., 2004). La tolerancia fue establecía como la
capacidad de las plantas de crecer tras 14 días de recuperación en
condiciones control. La tolerancia a sal se analizo transfiriendo
plántulas de 1º días a placas nuevas medio suplementado con
concentraciones crecientes de NaCl (50, 100, 150 y 200 mM) o LiCl
(5, 10, 15 y 20 mM). El estrés osmótico se impuso transfiriendo
plántulas de 10 días a placas con medios suplementados con
concentraciones crecientes de manitol (100, 200, 300 y 400 mM). En
todos los casos, las plantas se mantuvieron 2 días a cada
concentración. La tolerancia a estos tratamientos se evaluó
determinando el peso fresco y el número de hojas verdes al final del
tratamiento. La deshidratación fue inducida retirando las plántulas
de 10 días del medio de crecimiento, situándolas en un papel de
filtro húmedo, y se dejaron que crecieran durante 2 días sin agua.
La deshidratación se estimo como el porcentaje de FW inicial después
del tratamiento. Para analizar el efecto del TMAO en la tolerancia a
la congelación, se pulverizaron plantas de 2 semanas con 100 \muM
TMAO 1 h antes de ser congeladas o aclimatadas a frío como se ha
descrito previamente. El efecto del TMAO en la tolerancia de
Arabidopsis a NaCl, LiCl, manitol y deshidratación se estudió
germinando semillas en placas con medio suplementado con 100 \muM
TMAO. A continuación, las plántulas de 10 días se procesaron como se
ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
RCI5 se aisló rastreando una biblioteca
de cDNA, preparada a partir de plántulas etioladas de Arabidopsis
aclimatadas a frío, con una sonda substractiva enriquecida en
transcritos inducibles por frío siguiendo protocolos descritos
previamente (Jarillo et al. 1994). Para los análisis de
similitud de secuencia se usó el programa Basic Local Alignment
Search Tool (BLAST) del National Centre for Biotechnology
Information (Altschul et al., 1997). Las digestiones con
encimas de restricción, los clonajes, la extracción de proteínas
totales de plantas, y las hibridaciones de DNA y RNA se realizaron
de acuerdo a procedimientos estándar (Sambrook et al., 1989).
El RNA total se aisló como se ha sido reportado previamente
(Logemann et al., 1987).
El cDNA completo de RCI5 fue obtenido por
RT-PCR de RNA total de plantas de Arabidopsis
ecotipo Col expuestas a 4ºC durante 24 h, usando los cebadores SEQ
ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5. El fragmento resultante se rellenó con
Klenow y se ligó en el sito SmaI del plásmido pBluescript
SK(+) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, USA) para obtener
el plásmido pBSRCI5. Para obtener la fusión GST::RCI5,
el plásmido pBSRCI5 fue digerido con BamHI y
SalI. Entonces, el fragmento conteniendo el cDNA de
RCI5 se rellenó con Klenow y se ligó en el sitio SmaI del
vector pGEX-4T1 (GE Healthcare,
Bio-Sciences, Piscataway, NJ).
Para expresar RCI5 en E. coli, se
transformó la cepa BL21(DE3) pLysS (Invitrogen, Carlsbad, CA,
USA) con el vector pGEX-4T1 que contiene la
fusión GST::RCI5. La purificación de RCI5 de E. coli
se realizó de acuerdo al protocolo de la casa comercial, induciendo
la expresión en el cultivo durante 4 horas a 28ºC con 0.1 mM IPTG.
El vector pGEX-4T1 se usó como control.
La sonda específica para RCI5 se generó mediante
PCR sobre cDNA de Arabidopsis ecotipo Col usando los cebadores SEQ
ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7. Las sondas específicas para KIN1, LTI78,
COR47, COR15A, RCI1A, RAB18, CBF1, CBF2, CBF3, GUS y SOD2
fueron obtenidas como se ha sido descrito previamente (Kliebenstein
et al., 1998; Novillo et al., 2007;). La sonda
específica para CAT2 se obtuvo mediante PCR sobre DNA
genómico de Arabidopsis con los cebadores SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO:
9. Como control de carga se usó un fragmento EcoRI del 18S
rRNA (Tremousaygue et al., 1992). Las muestras de RNA
de cada experimento se analizaron en al menos dos membranas
independientes, y cada experimento se repitió al menos 3 veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante PCR se amplifico un fragmento de 0.77
kb inmediatamente anterior al ATG de la región codificante de RCI5,
usando como molde DNA genómico de Arabidopsis ecotipo Col y los
cebadores SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11. El fragmento de promotor se
clonó en el sitio SmaI del vector pBluescript SK{+).
Posteriormente, el plásmido fue digerido con SalI y
BamHI, y el fragmento obtenido se ligó en los
correspondientes sitios de restricción del plásmido pBI101
(Clontech, Palo Alto, CA, USA) para obtener la fusión
RCI5::GUS. El plásmido pBSRCI5 (ver anterior) fue
digerido con SmaI y el cDNA de RCI5 resultante se ligó
en el sitio SmaI del vector pROK2 bajo el control del
promotor CaMv35S (Baulcombe et al., 1986), para obtener la
construcción 35S::RCI5.
Los plásmidos recombinantes, una vez verificada
la construcción mediante secuenciación, se introdujeron en la cepa
de Agrobacterium tumefaciens C58C1 (Deblaere et al.,
1985). Para transformar las plantas de Arabidopsis ecotipo Col se
siguió el método de inmersión floral (Clough y Bent, 1998).
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis histoquímico de la actividad GUS en
las plantas transgénicas de Arabidopsis que contienen la fusión
RCI5::GUS se realizó siguiendo protocolos descritos
anteriormente (Medina et al., 2001).
\vskip1.000000\baselineskip
La cuantificación de la actividad monooxigenasa
se realizó siguiendo esencialmente protocolos publicados previamente
con modificaciones (Agustsson y Strom, 1981); (Lang et al.,
1998). Resumidamente, 100 \mul de tampón PBS (pH 7.4) conteniendo
100 \mug de proteínas procedentes de extractos bacterianos, 100
\mug de proteínas purificadas de E. coli, o 100 \mug de
proteínas totales de plantas de 3 semanas se añadieron a 2 ml de una
mezcla de reacción estándar consistente en 2.5 nmol FAD, 600 nmol
NADPH, 6 \mumol MgCl_{2} y 40 \mumol de pirofosfato potásico
(pH 8.2). La reacción se inició con 300 nmol TMA. Después de 20 min
a 24ºC, la reacción se paró añadiendo HClO_{4} a una concentración
final del 1%. La actividad monooxigenasa se cuantificó como la
cantidad de NADPH consumido por hora a 24ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El contenido de TMAO fue cuantificado reduciendo
el TMAO a TMA con TiCl_{3}, siguiendo el protocolo descrito
previamente (Bystedt et al., 1959) con algunas
modificaciones. Diez gramos de tejido verde congelado se homogeneizó
con 7,5%. TCA. Después de 2 h de incubación a temperatura ambiente,
las muestras se centrifugaron 15 min a 20ºC y el sobrenadante se
filtró a través de papel Whatman nº 1. El contenido en TMA se estimó
añadiendo 1 ml de formaldehído al 20%, 3 ml de KOH al 30% y 10 ml de
tolueno a 1 ml de sobrenadante filtrado. Esta mezcla se agitó
vigorosamente durante 15 s y se dejó reposar 5 min, la fase de
tolueno que contenía el TMA se recuperó y se transfirió a un tubo
nuevo que contenía 1 mg de Na_{2}SO_{4}. Mediante agitación
suave se obtuvo una fase acuosa libre de tolueno que se usó en el
análisis espectrofotométrico. Cinco ml del extracto con tolueno se
incubó con 5 ml de ácido pícrico 0,02% durante 30 s a temperatura
ambiente. Tras esta incubación, en presencia de TMA se desarrollo un
color amarillo cuya concentración era proporcional a la
concentración de TMA, y que era directamente proporcional a la
absorbancia a 410 nm. El TMAO se redujo añadiendo 132 \mul de 15%
TiCl_{3} a 4 ml del sobrenadante filtrado. La mezcla se incubó a
80ºC durante 90 s y se enfrió inmediatamente. El contenido en TMA en
la mezcla, después de la reducción del TMAO, se determinó como en
las muestras de TMA. Los valores obtenidos se refirieron a una curva
de calibración generada con varias soluciones con distintas
concentraciones de TMA comercial (Sigma, St. Louis, MO). El
contenido en TMAO se calculó como la diferencia de TMA antes y
después de la reducción.
Para evaluar la capacidad de RCI5 para generar
TMAO, se cuantificó la actividad monooxigenasa, usando 0, 50, 100 y
200 \mug de proteína purificada de E. coli, como se ha
descrito anteriormente (Cuantificación de la Actividad
Monooxigenasa). A continuación, la determinación de TMAO se realizó
como se ha descrito anteriormente cogiendo 1 ml de reacción final
para medir el TMA y 1 ml para reducir el TMAO a TMA.
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<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
\hskip1cmInstituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PLANTA TRANSGÉNICA RCI5 RESISTENTE
AL FRIO Y ESTRES SALINO PRODUCTORA DE TMAO, ELEMENTOS NECESARIOS
PARA SU OBTENCIÓN Y USO DE COMPOSICIONES QUE CONTIENEN TMAO PARA
INDUCIR TOLERANCIA AL FRIO Y ESTRÉS SALINO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> RCI5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2146
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(1397)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos codificante
del cDNA del gen RCI5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 459
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3227
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatcca cagagcatca tcatcatcac
\hfill30
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> DNA
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<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccccgggc aacacacaga caggtc
\hfill26
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<210> 6
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<211> 17
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaagtgggt ggctgca
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacacacag acaggtc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggtcttgg tcacatcgag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtcaagtt ctacaccag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggaacaat gtggttgctc g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctggtgcg atcttttttg tgtg
\hfill24
Claims (17)
1. Planta transgénica tolerante al frío y al
estrés salino caracterizada porque comprende una secuencia de
nucleótidos que permite la expresión de una proteína con actividad
monooxigenasa (FMO), seleccionada del siguiente grupo:
i.- la secuencia de nucleótidos del gen RCI5 de
SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; y
ii.- una secuencia de nucleótidos análoga a la
secuencia definida en a).
\vskip1.000000\baselineskip
2. Planta transgénica según la reivindicación 1
caracterizada porque la secuencia de nucleótidos es la SEQ ID
NO: 1.
3. Planta transgénica según la reivindicación 1
caracterizada porque la planta es Arabidopsis,
preferentemente la planta transgénica
RCI5-OE, que contiene la SEQ ID NO: 1.
4. Procedimiento de obtención de la planta
transgénica según las reivindicaciones 1 a la 3 caracterizado
porque consiste en la introducción en una planta de una secuencia de
nucleótidos constituida por:
i.- una secuencia de nucleótidos codificante de
proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del
siguiente grupo:
- la secuencia de nucleótidos del gen
RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; o una
secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a),
y
ii.- una secuencia de nucleótidos promotora que
permite y regula la expresión de la secuencia de i.- y la aparición
de una proteína con actividad monooxigenasa en el interior de la
célula.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Procedimiento según la reivindicación 4
caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
a) obtención de un vector de expresión que
contiene una secuencia de nucleótidos del gen RCI5 SEQ ID NO:
1,
b) obtención de microorganismos portadores del
vector a), y
c) transformación de las plantas con el vector
de a) o con el microorganismo de b).
\vskip1.000000\baselineskip
6. Una secuencia de nucleótidos codificante de
una proteína con actividad monooxigenasa (FMO), seleccionada del
siguiente grupo:
a) la secuencia de nucleótidos del gen
RCI5 de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma; o una
secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia definida en a), con
o sin
b) una secuencia de nucleótidos promotora que
permite y regula la expresión de la secuencia de a) y la aparición
de una proteína con actividad monooxigenasa en el interior de la
célula.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 6 caracterizado porque la secuencia de
nucleótidos de a) está constituida por la secuencia de nucleótidos
RCI5 de SEQ ID NO: 1.
8. Vector de expresión génica
caracterizado porque comprende la secuencia de nucleótidos
según las reivindicaciones 6 y 7 y que permite la transformación o
transfección de microorganismos y células y la posterior obtención
de las plantas transgénicas de la invención.
9. Vector de expresión según la reivindicación 8
caracterizado porque es el vector 35S::RCI5.
10. Microorganismo o célula caracterizado
porque contiene la secuencia de nucleótidos según las
reivindicaciones 6 y 7 o el vector de expresión según las
reivindicaciones 8 y 9.
11. Semilla de una planta caracterizada
porque contiene la secuencia de nucleótidos según las
reivindicaciones 6 y 7 o el vector de expresión según las
reivindicaciones 8 y 9.
12. Uso de una composición acuosa que comprende
el compuesto óxido de trimetilamina (TMAO) o un derivado del mismo
para inducir tolerancia al estrés salino y al frío en las plantas
y/o semillas.
13. Uso de una composición según la
reivindicación 12 caracterizado porque la composición acuosa
comprende el compuesto TMAO en una concentración comprendida entre 1
\muM y 100 mM, preferentemente entre 50 \muM y 1 mM, y más
preferentemente a 100 \muM.
14. Uso de una composición según la
reivindicación 12 caracterizado porque la composición acuosa
de TMAO es de 100 \muM.
15. Uso de una composición según las
reivindicaciones 12 a la 14 caracterizado porque la
composición acuosa se aplica mediante pulverización a la parte
aérea.
16. Uso de una composición según las
reivindicaciones 12 a la 14 caracterizado porque la
composición acuosa se aplica al tallo por inyección.
17. Uso de una composición según las
reivindicaciones 12 a la 14 caracterizado porque la
composición acuosa se aplica al suelo u otro sustrato de cultivo, al
agua de riego (o solución de cultivo) o por inmersión del sistema
radicular de las plantas y/o de semillas.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200802652A ES2347399B1 (es) | 2008-09-18 | 2008-09-18 | Planta transgenica rc15 resistente al frio y estres salino productorade tmao, elementos necesarios para su obtencion y uso de composiciones que contienen tmao para inducir tolerancia al frio y estres salino. |
| PCT/ES2009/070383 WO2010034862A1 (es) | 2008-09-18 | 2009-09-16 | Planta transgenica rci5 resistente al frio y estrés salino productora de tmao, elementos necesarios para su obtención y uso de composiciones que contienen tmao para inducir tolerancia al frio y estrés salino |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200802652A ES2347399B1 (es) | 2008-09-18 | 2008-09-18 | Planta transgenica rc15 resistente al frio y estres salino productorade tmao, elementos necesarios para su obtencion y uso de composiciones que contienen tmao para inducir tolerancia al frio y estres salino. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| ES2347399A1 ES2347399A1 (es) | 2010-10-28 |
| ES2347399B1 true ES2347399B1 (es) | 2011-09-15 |
Family
ID=42059296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200802652A Active ES2347399B1 (es) | 2008-09-18 | 2008-09-18 | Planta transgenica rc15 resistente al frio y estres salino productorade tmao, elementos necesarios para su obtencion y uso de composiciones que contienen tmao para inducir tolerancia al frio y estres salino. |
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| WO (1) | WO2010034862A1 (es) |
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| US9085776B2 (en) | 2013-08-13 | 2015-07-21 | Plant Response Biotech S.L. | Method for enhancing drought tolerance in plants |
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|---|---|---|---|---|
| AU2007287343A1 (en) * | 2006-08-22 | 2008-02-28 | University Of Copenhagen | Flavin monooxygenases and transcription factors involved in glucosinolate biosynthesis |
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2008
- 2008-09-18 ES ES200802652A patent/ES2347399B1/es active Active
-
2009
- 2009-09-16 WO PCT/ES2009/070383 patent/WO2010034862A1/es active Application Filing
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010034862A1 (es) | 2010-04-01 |
| ES2347399A1 (es) | 2010-10-28 |
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|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
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