ES2340197T3 - Particulas de latex carboxiladas. - Google Patents
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Abstract
Proceso para preparar partículas de látex carboxiladas, basado en la copolimerización de un monómero monoalquenil-aromático (A) y un ácido carboxílico alifático insaturado (B) que tiene lugar a un pH especificado y constante, comprendido entre > 1,5 y < 4,5, el cual se controla durante la reacción y se mantiene constante por valoración compensatoria, y como máximo se desvía 0,3 unidades del pH especificado para la mezcla de copolimerización.
Description
Partículas de látex carboxiladas.
La presente invención se refiere a procesos para
preparar partículas de látex carboxiladas, basados en la
copolimerización de un monómero
monoalquenil-aromático (A) con un ácido carboxílico
alifático insaturado (B), la cual tiene lugar a un pH comprendido
entre 1,5 y 4,5. El pH se controla durante el proceso de
copolimerización y se regula mediante una valoración compensatoria
adecuada. La presente invención también se refiere a partículas de
látex carboxiladas obtenibles por uno de los procesos según la
presente invención y al uso de estas partículas en un método de
ensayo inmunológico.
Los látex modificados superficialmente se han
usado durante más de 40 años en muchas áreas de aplicación
biomédica, por ejemplo en pruebas diagnósticas como material de
soporte, entre otros, para la inmovilización de enzimas. Singer,
J.M. y Plotz, C.M. (American Journal of Medicine 21 (1956)
888-896) emplearon partículas de látex, hace tanto
tiempo como en 1956, para desarrollar inmunoensayos homogéneos.
Además de las partículas de látex aminadas, los
látex principalmente usados como material de partida para
aplicaciones biomédicas han sido funcionalizados en la superficie,
por ejemplo mediante grupos carboxilo, epóxido o hidroxilo.
Biopolímeros como, por ejemplo, los anticuerpos específicos se unen
a estas partículas de látex por recubrimiento pasivo (adsorción) o
por enlace covalente, bien directamente o con la ayuda de reactivos
activadores tales como, por ejemplo, el
N-hidroxibenzotriazol.
En el estado técnico se conocen muchos procesos
para preparar partículas de látex.
Por ejemplo, Roncari, G. (US 4,226,747) describe
un proceso para preparar látex formados predominantemente a partir
de estireno y butadieno, los cuales se distinguen por llevar grupos
anilil-sulfo en la superficie del látex. Como
comonómeros se usan metalilsulfonato sódico, ácido acrílico y ácido
itacónico. El látex resultante se hace reaccionar con dihexil
sulfosuccinato sódico en agua, cloruro de
\alpha,\alpha'-azobisisobuti-ramidinio
en agua y p,p'-ditiobisanilina en estireno.
La solicitud de patente de Yaacoub, E.J. (DE 102
04 234) se refiere a un látex polimérico preparado con el uso de al
menos un carbohidrato, o derivado de carbohidrato, que está
sustituido con un grupo capaz de polimerizar por radicales libres y
que tiene propiedades tensioactivas. El látex polimérico preparado
mediante este proceso lleva preferentemente estireno y metacrilato
de metilo como comonómeros. Estas partículas de látex pueden usarse
en aplicaciones cosméticas, clínicas o diagnósticas.
Bowell, S.T. y otros (US 2,734,883) evitaron el
descenso de pH durante la copolimerización en emulsión de estireno
y butadieno, a pesar del ácido producido por la descomposición del
iniciador peroxídico, añadiendo continua o intermitentemente
álcali, con el fin de mantener el pH a un valor igual o superior a
9,7.
En Gasche, H.E. y otros, (US 2 0 03/0153678), el
pH se ajusta a un valor de 9-11 antes de añadir el
iniciador en la polimerización discontinua de un látex, y durante
la reacción se controla de manera que no varíe más de un \pm
0,5.
En el proceso de polimerización de un látex de
polibutadieno registrado por Sturt, A.G. y Feast, A.A.J. (DE 2 103
610) el pH se controla hasta un grado de conversión del 15%, con el
fin de que la emulsión se halle en unas condiciones estables.
Para preparar un polímero nitrílico resistente
al choque en un proceso de varias etapas, según Takahashi, A. y
otros (JP 61166813), el pH se ajusta por debajo de 5 en la primera
copolimerización, realizada en discontinuo, y se reduce hasta 3
antes de la segunda etapa, semicontinua.
Sun-Lin, C. y otros describieron
otro proceso para preparar un látex estable (EP 0 476 528). La
polimerización del látex se lleva a cabo inicialmente en presencia
de un éster de fosfato tensioactivo a un pH por debajo de 3,5.
Después las partículas de látex se ajustan a un pH entre 7 y 10,5,
añadiendo solución amoniacal.
Según la solicitud de patente de Meiners, C. y
otros (DE 102 36 395), se obtiene una dispersión acuosa de polímero
por polimerización discontinua en emulsión, que se usa
preferentemente como pintura anticorrosiva. En este caso la
emulsión se ajusta a un pH mayor o igual a 4,5, preferiblemente
5-7, con solución acuosa de hidróxido amónico.
Brewer, J.F. (US 3,032,524) desarrolló un
proceso para ajustar exactamente el pH de un látex. En este caso el
pH se ajusta de manera precisa al valor deseado - con un margen de
tolerancia de \pm 0,1 unidades de pH - mediante dióxido de
carbono durante el proceso de preparación. Para ello el dióxido de
carbono se introduce en el reactor y se distribuye finamente
mediante un agitador de hélice.
En principio el uso de partículas de látex,
incluyendo las partículas de látex carboxiladas, para fines
diagnósticos es conocido. Así, Fisk, R.T. (US 3,088,875) describió
en 1959 un ensayo inmunológico pensado para diagnosticar antígenos
o anticuerpos en fluidos corporales. Como materiales soporte se
usaron látex de poliestireno puro. Se trataba de látex conocidos
fabricados por Monsanto Chemical Company o Koppers Company Inc., con
tamaños de partícula de 150-200 nm. Las partículas
de látex se recubrieron con 7-S
\gamma-G globulina (ahora denominada
inmunoglobulina clase G) para detectar el llamado factor reumatoide
(FR), una proteína 19-S \gamma-M
(ahora denominada inmunoglobulina clase M), en suero humano por
agregación de las partículas de látex. El FR se fija al
recubrimiento de inmunoglobulina G y provoca la agregación de las
partículas de látex.
Batz, H.G. y otros (EP 0 054 685) prepararon un
látex funcionalizado en la superficie con grupos epoxi. Este látex
se usa como material soporte, al cual se unen covalentemente
sustancias con actividad biológica y/o inmunológica, de modo
directo o mediante un agente de acoplamiento. Como monómero con
grupos epoxi se usa uno o más entre metacrilato de glicidilo,
acrilato de glicidilo, glicidil-viniléter, ftalato
de glicidil-vinilo y
3,4-epoxibut(1)eno. Éste o éstos se
copolimerizan, por ejemplo, con estireno, dienos, acrilamida,
metacrilamida, acrilato o metacrilato de alquilo, hidroxialquilo o
aminoalquilo, éter o éster vinílico, o
N-vinilpirrolidona.
Una solicitud de patente de la Seksui Chemical
Co. Ltd. (JP 59179609) se refiere a la preparación de un látex para
el diagnóstico de antígenos y anticuerpos, variando el pH durante la
polimerización. En este caso se mezcla estireno y sulfonato de
estireno en agua con un emulsionante y un iniciador de persulfato, y
primero se polimeriza en condiciones básicas y luego en condiciones
ácidas o neutras.
En la publicación de
Miraballes-Martinez, I. y otros (J. Biomater. Sci.
Polymer Edn. 8 (1997) 765-777) se describe la
preparación de un látex que se funcionaliza con grupos clorometilo
en superficie y que es apropiado para el acoplamiento de
inmunoglobulina G (IgG). En este caso el látex de
clorometil-estireno se preparó mediante un proceso
de dos etapas en un reactor discontinuo. Los ensayos realizados en
esta publicación demostraron que el látex-IgG
obtenido de esta forma se puede emplear en pruebas de diagnóstico
inmunológico.
En el proceso patentado por Hager, H. (US
3,857,931) se utilizan látex funcionalizados, sobre todo
carboxilados.
En la patente DE 27 12 044, Beskid, G. y Savard,
E.V. describen el acoplamiento de anticuerpos, sustancias antígenas
u otros materiales biológicos a partículas de látex, para ensayos
serológicos. El antígeno A del grupo de los estreptococos se
conjuga mediante el uso de carbodiimidas solubles en agua a las
partículas de látex purificadas en este proceso.
Focella, A. y otros (DE 27 23 449) describen un
ensayo de aglutinación basado en látex carboxilados, que es capaz
de detectar barbituratos.
Fischer, E.A. (DE 28 40 767) se refiere a los
tipos de partículas soporte de látex carboxilados a las que se
pueden acoplar materiales inmunológicamente activos como, por
ejemplo, aminas primarias, aminoácidos, péptidos, proteínas, lipo y
glicoproteínas, esteroles, esteroides, lipoides, ácidos nucleicos,
enzimas, hormonas, vitaminas, polisacáridos y alcaloides. Conforme
a ello son adecuados los látex de estireno-butadieno
carboxilados, de poliestireno carboxilado, de polímeros de ácido
acrílico y ácido metacrílico, de polímeros de acrilonitrilo, de
acrilonitrilo-butadieno-estireno, de
poli-(acetato de vinilo-acrilatos), de
polivinilpiridinas, de cloruro de vinilo-acrilatos
y similares.
Otra patente de Fischer, E.A. (US 4,264,766)
describe el desarrollo de un ensayo inmunológico, en el cual un
látex de estireno-butadieno carboxilado (Dow CL 241)
es activado con
1-amino-2-hidroxipropil-dextrano
y luego se sigue procesando para el ensayo.
Gallati, H. (DE 27 49 956) empleó un látex de
estireno-butadieno carboxilado al que se une un
reactivo inmunológico, p.ej. GHC (gonadotropina coriónica
humana).
Como se ha explicado arriba, las partículas de
látex se pueden usar en principio en métodos de pruebas
diagnósticas. No obstante, las características de los látex para su
uso en diagnosis deben cumplir grandes requisitos. En concreto,
para métodos sensibles de diagnosis inmunológica es muy importante
que las partículas de látex utilizadas estén bien caracterizadas en
cuanto a tamaño y/o propiedades superficiales, sobre todo por lo
respecta a la distribución y densidad de carga, y que se puedan
preparar de manera reproducible.
La preparación definida y reproducible de
partículas de látex carboxiladas, y por tanto también su
disponibilidad con una distribución determinada de la carga sobre
la superficie, es difícil con los procesos del estado técnico
previo.
Por consiguiente, un objeto de la presente
invención era establecer procesos que ayudaran a eliminar los
inconvenientes del estado técnico previo y proporcionaran
partículas de látex carboxiladas que pudiesen emplearse
ventajosamente, por ejemplo, en métodos de ensayos
inmunológicos.
Sorprendentemente se ha encontrado un proceso
para preparar partículas de látex carboxiladas, basado en la
copolimerización de un monómero
monoalquenil-aromático (A) con un ácido carboxílico
alifático insaturado (B), realizando la copolimerización a un pH
constante, especificado entre > 1,5 y < 4,5, el cual se
controla durante el proceso de copolimerización y se regula
mediante una valoración compensatoria adecuada. En este proceso se
pueden preparar de modo muy reproducible partículas de látex
carboxiladas con el tamaño y densidad de carga deseados, y las
partículas de látex obtenidas por este proceso tienen ventajas y
propiedades particulares.
La presente solicitud de patente se refiere a un
proceso para preparar partículas de látex carboxiladas, basado en
la copolimerización de un monómero
monoalquenil-aromático (A) y un ácido carboxílico
alifático insaturado (B), realizando la copolimerización a un pH
constante, especificado entre > 1,5 y < 4,5. El pH se controla
durante el proceso de copolimerización y se regula mediante una
valoración compensatoria adecuada. Es preferible que el control del
pH en la mezcla de copolimerización y la valoración compensatoria se
efectúe de manera continua. Además se prefiere que la regulación
del pH sea continua y automática. El proceso conforme a la presente
invención permite controlar de modo reproducible y específico la
densidad de carga de los grupos carboxilo sobre las partículas de
látex en las condiciones de pH fuertemente ácido de dicho
proceso.
En una forma de ejecución preferida la
copolimerización tiene lugar a un pH superior o igual a 2,0 e
inferior a 4,0.
En una "copolimerización" se polimerizan
conjuntamente dos o más monómeros y el copolímero resultante está
compuesto por los monómeros de partida. Las propiedades de los
copolímeros dependen de la combinación, reactividad y proporciones
de los monómeros y del control de la reacción. En principio las
copolimerizaciones se pueden efectuar en sistemas heterogéneos y
homogéneos, en reactores continuos, semicontinuos y discontinuos.
Por lo tanto se pueden producir copolímeros con una amplia variedad
de propiedades. Aunque existen copolímeros compuestos de tres o más
monómeros distintos (copolímeros ternarios o cuaternarios, etc.),
preferiblemente no se usan más de tres monómeros polimerizables
diferentes.
La polimerización por siembra es un proceso
especial de polimerización en emulsión que emplea concretamente
para preparar látex con una distribución muy estrecha del tamaño de
partícula y látex compuestos por más de un tipo de monómero, con
una microestructura definida dentro de cada partícula de látex. Se
realiza añadiendo el monómero a polimerizar a una dispersión de
partículas de látex con distribución uniforme de tamaño de
partícula, llamada látex de siembra. El monómero se difunde
uniformemente en las partículas de látex y polimeriza en su
interior. En el caso concreto de la polimerización por siembra la
concentración de emulsionante presente en la emulsión se mantiene
dentro del valor micelar crítico (CMC). Si no, las partículas de
látex recién producidas, mucho más pequeñas, darían lugar a una
distribución de tamaño de partícula muy amplia. Según el modelo de
Smith, W.V. y Ewart, R.H. (Journal of Chemical Physics 16 (1948)
592-599) la polimerización por siembra corresponde
a las fases II y III de una polimerización en emulsión. La fase (I)
de formación de partícula de una polimerización en emulsión es
superflua debido a la presencia de partículas de látex
sembradas.
Desde 1950 han aparecido numerosas publicaciones
sobre la teoría del crecimiento de partícula en la polimerización
por siembra (entre otras Poehlein, G.W. y Vanderhoff, J.W., J.
Polymer Sci. 11 (1973) 447-452; Feeney, P.J.,
Napper, D.H., Gilbert, R.G., J. Colloid Interface Sci. 118 (1987)
493-505). Las descripciones teóricas de la
preparación de látex basadas en la teoría
Smith-Ewart tratan de la influencia de varios
factores en la distribución del tamaño de partícula. Poehlein y
Vanderhoff describen al respecto, por ejemplo, un "crecimiento
competitivo", que conduce a una distribución más estrecha del
tamaño de partícula. En tal sentido suponen que, debido a
diferencias de área específica, las partículas más pequeñas del
látex sembrado crecen con mayor rapidez que las más grandes, ya que
los monómeros se difunden con mayor probabilidad en las partículas
de menor tamaño.
Los látex monodispersos con mayores diámetros de
partícula suelen prepararse mediante polimerizaciones por etapas.
Esto implica inicialmente un primer látex de siembra que se prepara
mediante una polimerización apropiada. Luego estas partículas de
látex sembradas sirven de material de partida para la subsiguiente
polimerización (por siembra). Así pueden prepararse látex con una
distribución muy estrecha del tamaño de partícula. Estas
polimerizaciones se realizan frecuentemente en discontinuo y la
velocidad a la cual los monómeros penetran en las partículas
sembradas, el número promedio de radicales libres en la partícula de
látex y la tasa de crecimiento volumétrico influyen decisivamente
en la distribución del tamaño de partícula. En la preparación
industrial de los látex con distribuciones especiales del tamaño de
partícula, por ejemplo en el caucho
estireno-butadieno, se usan a menudo
polimerizaciones por siembra con control semicontinuo de la
reacción.
La polimerización semicontinua en emulsión se
usa preferentemente a escala industrial cuando la finalidad es
obtener dispersiones acuosas. Para ello se emplean dos métodos,
denominados de alimentación, distintos, la alimentación de
monómeros y la alimentación de emulsión.
En la alimentación de monómeros la carga inicial
lleva agua, emulsionante e iniciador y habitualmente una pequeña
proporción del monómero, y durante la polimerización se añade el
monómero restante y posiblemente también iniciador.
En la alimentación de emulsión la carga inicial
lleva, por ejemplo, una parte de la emulsión y una vez iniciada la
reacción se dosifica al reactor la emulsión de monómeros restante,
cuya composición puede diferir de la emulsión cargada al
comienzo.
La ventaja del control semicontinuo de la
reacción es que permite regular la velocidad y el calor de
polimerización a través del caudal de alimentación, permite
mantener baja la concentración de monómero no reaccionado y la
mezcla reactiva se puede enfriar con la alimentación fría. Para
producir un polímero uniforme al copolimerizar dos monómeros de
distinta reactividad cabe la posibilidad de hacer una carga inicial
que contenga un exceso del monómero que polimeriza más lentamente y
dosificar luego el monómero más reactivo, o ajustar la composición
de monómeros durante la alimentación (Chujo, K., y otros, J. Polymer
Sci. 27 (1969) 321-332; Snuparek, J. y
Kr\check{s}ka, F., J. of Applied Polymer Science 20 (1976)
1753-1764). Para controlar la composición del
copolímero se han desarrollado y cuantificado varias estrategias de
alimentación, a fin de establecer las proporciones de dosificación
necesarias en función del tiempo (Hamielec, A.E., y otros, Compr.
Polym. Sci 3 (1989) 17-31). Por tanto en
condiciones de alimentación idóneas se puede variar el grado de
polimerización, el tamaño de partícula y su distribución, sin
alterar la composición global del látex. Si el caudal de
alimentación no es demasiado alto, según Krackeler, J.J. y Naidus,
H., J. Polymer Sci. 27 (1969) 207-235, se establece
un estado casi estacionario con monómeros que cumplen el mecanismo
de Smith-Ewart, es decir, no se forman partículas
nuevas durante la dosificación de los monómeros, la velocidad neta
de reacción R y la velocidad de alimentación F son aproximadamente
idénticas y R depende solamente de la velocidad de alimentación
(Wessling, R.A., J. of Applied Polymer Science 12 (1968)
309-319). En este caso la concentración de monómero
[M] toma un valor inferior al de saturación y durante el periodo de
alimentación solo cambia ligeramente.
En este caso la velocidad de reacción R [mol/s]
y la velocidad de dosificación F [mol/s] pueden describirse
mediante la siguiente ecuación de la fórmula I.
En esta fórmula la constante G depende del
número promedio de radicales libres por partícula, del número de
partículas, de las constantes de velocidad de crecimiento, de los
coeficientes de reactividad y de los coeficientes de partición de
los monómeros entre el látex y la fase acuosa.
La representación gráfica
tiempo-conversión para polimerizaciones
semicontinuas es lineal dentro de un amplio intervalo y la
distribución de la masa molar o la composición del polímero resulta
homogénea, porque durante el tiempo de reacción se mantiene una
velocidad de polimerización básicamente constante (Snuparek, J. y
Kr\check{s}ka, F., J. of Applied Polymer Science 20 (1976)
1753-1764).
Para la copolimerización es importante y
preferible proceder de manera controlada, en las llamadas
"condiciones de agotamiento".
Ha resultado especialmente ventajoso formar las
partículas de látex carboxiladas conforme a la presente invención
según el principio núcleo-envoltura. En este proceso
la carga inicial contiene un núcleo o látex de siembra, y la
envoltura con las propiedades deseadas se prepara por
copolimerización sobre este látex de siembra. Para la siembra son
adecuadas en principio todas las partículas de látex. Se prefiere
que el látex de siembra pueda establecer enlaces covalentes con los
reactivos utilizados para construir la envoltura carboxilada. El
látex de siembra preferiblemente empleado es un látex de
poliestireno mixto o puro. La persona experimentada es capaz de
escoger látex de siembra idóneos, sin una etapa inventiva, y de
calcular a partir del tamaño y de la concentración de las
partículas de látex de siembra las cantidades de monómero
monoalquenil-aromático necesarias para formar la
envoltura deseada. La cantidad de ácido carboxílico alifáticamente
insaturado puede ignorarse en el cálculo y ajuste del tamaño de
partícula, pues su proporción es negligible en este contexto.
El tamaño final o especificado de las partículas
depende básicamente del número y tamaño de las partículas de látex
de siembra y de la cantidad de monómero
monoalquenil-aromático presente. La relación entre
el tamaño de partícula, molécula diana, peso de látex diana y peso
de látex de siembra está representada por la fórmula II:
donde:
*DT = diámetro promedio del látex diana
*DS = diámetro promedio del látex de siembra
*ptot = psiembra + pmonómero, en g
*psiembra = peso del látex de siembra empleado,
en g
*monómero = peso de monómero empleado, en g
Por tanto el número (cantidad) y tamaño de las
partículas sembradas define la cantidad de monómeros necesaria para
un tamaño concreto de partícula diana del producto final.
La mezcla prevista para la polimerización por
etapas se elige normalmente de modo que el látex diana resulte como
una suspensión de 3 hasta 30%, aproximadamente, de concentración.
Las condiciones se seleccionan preferiblemente de manera que el
látex diana quede en forma de una suspensión del 5 al 20% de
concentración.
El monómero
monoalquenil-aromático (A) será normalmente
estireno, alfa-metilestireno o viniltolueno. Como
monómeros monoalquenil-aromáticos se prefieren el
estireno y el alfa-metilestireno. Si es preciso
también se puede usar una mezcla de dos o más monómeros
monoalquenil-aromáticos en el proceso según la
presente invención. Sin embargo, preferiblemente, no se mezclan más
de dos de estos monómeros. Como monómero
mono-alquenil-aromático se usa
preferentemente el estireno.
El ácido carboxílico alifáticamente insaturado
(B) será preferiblemente ácido acrílico, ácido metacrílico, ácido
fumárico, ácido itacónico, ácido maleico o anhídrido maleico. Si es
preciso también se puede usar una mezcla de dos o más ácidos
carboxílicos alifáticamente insaturados en el proceso según la
presente invención. Sin embargo, preferiblemente, no se usarán más
de dos de estos ácidos carboxílicos alifáticamente insaturados.
Asimismo se prefiere escoger el ácido carboxílico alifáticamente
insaturado del grupo constituido por ácido acrílico, ácido
metacrílico, ácido fumárico y ácido itacónico. Como ácido
carboxílico alifáticamente insaturado se prefiere el ácido
acrílico.
En muchos procesos de preparación de partículas
de látex hay que añadir separadamente a la mezcla reactiva los
diversos monómeros empleados en la copolimerización. Otra ventaja
del proceso según la presente invención es que el monómero
monoalquenil-aromático (A) y el ácido carboxílico
alifáticamente insaturado (B) se pueden combinar de manera que (B)
se disuelva en (A). Por lo tanto el ácido carboxílico alifáticamente
insaturado (B) se disuelve preferiblemente en el monómero
monoalquenilaromático (A) y en el proceso de la presente invención
se alimenta al reactor la mezcla de (A) y (B).
Como se ha mencionado, es especialmente
ventajoso que el proceso para preparar partículas de látex
carboxiladas según la presente invención se desarrolle a un pH
fuertemente ácido y que este pH se mida continuamente y se mantenga
constante durante la reacción. El pH deseado para las condiciones de
la reacción también se denomina pH diana. En el contexto de la
presente invención aquí descrita un pH escogido para las condiciones
de la reacción se considera constante cuando la desviación de pH en
la mezcla de copolimerización respecto al pH diana deseado es igual
o inferior a 0,3. En el proceso según la presente invención el pH de
la mezcla de copolimerización no se desvía más de 0,3 unidades del
pH diana. Por tanto el proceso según la presente invención está
caracterizado porque el pH de la mezcla de copolimerización
se desvía como máximo 0,3 unidades del pH diana. El proceso según
la presente invención está preferiblemente caracterizado
porque el pH de la mezcla de copolimerización se desvía como
máximo 0,2 unidades o también preferiblemente 0,1 unidades del pH
diana.
En principio es posible usar cualquier solución
alcalina para ajustar el pH. Como reactivo regulador de pH se usa
preferiblemente una solución acuosa de un carbonato, bicarbonato o
hidróxido de metal alcalino.
Como se advierte en el estado técnico previo,
hay varias posibilidades de tratar el problema de la poca
solubilidad de las partículas de látex (en formación). En el
proceso según la presente invención se ha demostrado que es
adecuado llevar a cabo la copolimerización en emulsión acuosa. Por
lo tanto, en otra forma de ejecución preferida el proceso según la
presente invención se caracteriza porque la copolimerización
se realiza en emulsión acuosa. Asimismo esta copolimerización se
puede efectuar preferiblemente en ausencia de emulsionantes.
Como es propio de la producción de partículas de
látex, la reacción de (co)polimerización se puede iniciar
con varios agentes. Del estado técnico se conocen en concreto los
rayos gamma y los reactivos que generan radicales libres. El uso de
reactivos formadores de radicales libres en condiciones apropiadas
es preferido según la presente invención. Normalmente se utilizan
peróxidos como productos generadores de radicales libres. Se
prefieren los peróxidos hidrosolubles, sobre todo persulfatos y
peróxidos como, por ejemplo, persulfato sódico o amónico y peróxido
de hidrógeno.
Las partículas de látex carboxiladas que se
pueden preparar por el proceso según la presente invención se
distinguen especialmente por el hecho de que la densidad de carga
sobre la superficie de estas partículas puede predeterminarse y
reproducirse de manera específica. La densidad de carga se averigua
por microscopia de fuerza atómica (AFM) (Tan, S., y otros, Langmuir
21 (2005) 43-49). La llamada área de parking se
establece como medición de la densidad de carga e indica -por
ejemplo para las partículas de látex carboxiladas según la presente
invención- el área media ocupada por un grupo carboxilo sobre la
superficie de látex.
En el proceso según la presente invención, como
se muestra en el ejemplo 3, es posible ajustar una densidad de
carga deseada, concreta, eligiendo correctamente los parámetros de
la reacción. Las partículas de látex carboxiladas preparadas
preferiblemente por el proceso según la presente invención tienen un
área de parking de 10 a 160 (10^{-10} m)^{2},
también preferiblemente de 20 a 130 (10^{-10} m)^{2} o de 30 a 120 (10^{-10} m)^{2}.
también preferiblemente de 20 a 130 (10^{-10} m)^{2} o de 30 a 120 (10^{-10} m)^{2}.
El área de parking no solamente puede ajustarse
de modo empírico, también se puede calcular de antemano mediante la
fórmula III.
El eje y de la función representa el área de
parking en (10^{-10} m)^{2} y el eje x la concentración
de ácido acrílico en la formulación, expresada en 10^{-1} mol/l.
Este valor corresponde a la concentración total de ácido acrílico en
la emulsión, alcanzada durante la dosificación.
Cuando el pH = 2: y = 15, 99x^{-0,9805}
Cuando el pH = 3: y = 41 , 0 65x^{-0,4706}
Cuando el pH = 4: y = 51 , 0 61x^{-0,4722}
Los valores de a y b en la fórmula III se pueden
hallar empíricamente para cada mezcla de polimerización y cada pH.
La densidad de carga se fija preferiblemente en el proceso de la
presente invención, siguiendo la fórmula III.
Como las partículas de látex carboxiladas
conforme a la presente invención tienen una densidad de carga
exactamente definida, son muy especialmente adecuadas para ser
utilizadas en métodos diagnósticos. La densidad de carga definida
tiene el efecto de dotar a las partículas de látex carboxiladas de
un comportamiento uniforme y reproducible.
Por lo tanto -en una forma de ejecución
preferida- la presente invención también incluye las partículas de
látex carboxiladas preparadas según la misma.
Las partículas de látex carboxiladas preparadas
según el proceso de la presente invención son excelentes para la
unión covalente de moléculas bioquímicas.
Los látex carboxilados se activan, por ejemplo,
usando carbodiimidas como agentes de acoplamiento. Las biomoléculas
pueden unirse directamente al látex a través de grupos amida o
mediante un éster activo. En este contexto los reactivos de
acoplamiento son preferentemente carbodiimidas hidrosolubles (WSC).
Las siguientes carbodiimidas hidrosolubles, comercialmente
disponibles, son especialmente aptas para la activación y el
acoplamiento de biomoléculas a partículas de látex carboxiladas:
1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil)carbodiimida
meto-p-toluensulfonato y
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida
hidrocloruro. Estos agentes de acoplamiento se pueden usar para la
unión directa de biomoléculas a través de grupos amida. Sin embargo
también es posible convertir inicialmente los grupos carboxilo
libres en un éster activo, con el fin de efectuar el acoplamiento
mediante este éster activo (p.ej. un intermedio de
O-acilurea). Ambos procedimientos están
representados esquemáticamente abajo.
a) Reacción de acoplamiento directo a látex
carboxilado
b) Activación de látex carboxilados
a través de un éster
activo
Una ventaja del acoplamiento a través de un
éster activo es que las carbodiimidas se pueden eliminar antes de
que el antígeno o anticuerpo se acople al látex, para que no puedan
influir en el ensayo inmunológico.
Como biomoléculas son adecuadas todas las
moléculas utilizadas en los métodos convencionales de ensayo
diagnóstico. Incluyen con especial preferencia ácidos nucleicos,
péptidos y proteínas. No obstante también pueden emplearse
ventajosamente otras biomoléculas, como por ejemplo haptenos,
lípidos o polisacáridos.
Las biomoléculas preferidas pertenecen al grupo
de las proteínas, especialmente de aquellas que son buenos
componentes de fijación para otras biomoléculas, con especial
preferencia a este respecto para lectinas, avidina, estreptavidina
y anticuerpos.
El término "anticuerpo", aparte de las
inmunoglobulinas intactas, también se refiere a todos los fragmentos
de anticuerpo, incluyendo, por ejemplo, los fragmentos Fab, Fab' o
F(ab')_{2}. El término anticuerpo, sin añadir monoclonal o
policlonal, siempre comprende ambos tipos de anticuerpos, además de
construcciones quiméricas y todos los fragmentos arriba
citados.
Tras la unión de las biomoléculas a las
partículas de látex carboxiladas según la presente invención, la
persona experta se refiere a conjugados
biomolécula-látex o a conjugados de látex para
abreviar. Los conjugados de látex basados en las partículas de
látex carboxiladas según la presente invención constituyen también
una forma de ejecución preferida de la misma.
Los conjugados de látex basados en las
partículas de látex carboxiladas según la presente invención se
emplean de manera especialmente ventajosa en métodos de ensayos
inmunodiagnósticos. El diseño y procedimiento de tales métodos de
ensayo es conocido de persona experimentada.
Los siguientes ejemplos ilustran más ampliamente
la presente invención, definida en las reivindicaciones
adjuntas.
Se prepara por polimerización en emulsión un
látex de siembra formado por partículas de látex completamente
polimerizadas y estabilizadas con emulsionante. El procedimiento
sigue, por ejemplo, el método experimental de van den Brink (M.
v.d. Brink: "On-line monitoring of polymerization
reactions by Raman spectroscopy, application to control of emulsion
copolymerizations and copolymerization kinetics" [Control en
línea de reacciones de polimerización por espectroscopia Raman,
aplicación al control de copolimerizaciones en emulsión y su
cinética], Technische Universiteit Eindhoven, 2000).
Las cantidades indicadas de dodecilsulfato
sódico (SDS) y de NaHCO_{3} se pesan en un vaso de precipitados
de vidrio de 1000 ml y se disuelven, agitando, en la cantidad
indicada de agua. La solución se barre cuidadosamente con nitrógeno
y se transfiere junto con el estireno a un reactor de laboratorio de
1150 ml provisto de camisa y agitador de ancla. Cuando la mezcla
reactiva alcanza una temperatura constante se agrega la solución de
iniciador preparada.
La siembra se prepara a una temperatura de
reacción de 80ºC, con una velocidad de agitación de 300 rpm.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Para la copolimerización en emulsión, en cada
caso, una parte del monómero monoalquenil-aromático
(p.ej. estireno) se reemplaza por el látex polimérico de siembra
del ejemplo 1. La cantidad de monómero necesaria para conseguir un
tamaño de partícula diana concreto puede determinarse por la fórmula
I, con la ayuda de la concentración y del tamaño de las partículas
presentes en la siembra.
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La ventaja de este método es que la carga
superficial se puede adaptar a los requerimientos particulares,
ajustando el pH al valor especificado y eligiendo adecuadamente la
concentración de ácido acrílico.
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El estireno empleado se desestabiliza por
destilación antes de utilizarlo y el agua desmineralizada se
desgasifica con una corriente de nitrógeno. En los ejemplos
detallados específicamente más adelante el estireno se dividió en 2
porciones y las cantidades enumeradas en la tabla (a) se agregaron
al látex de siembra (alimentación de monómeros) o (b) se
dosificaron continuamente a la mezcla reactiva (alimentación de
emulsión). Los demás componentes se emplearon directamente sin
procesar.
La cantidad indicada de NaHCO_{3} se pesa en
un vaso de precipitados de vidrio de 1000 ml y se disuelve,
agitando, en la cantidad indicada de agua. La solución se barre
cuidadosamente con nitrógeno y se transfiere con la emulsión de
siembra y con la cantidad pesada de estireno (a) a un reactor de
laboratorio de 1150 ml. Cuando la mezcla reactiva alcanza una
temperatura constante de 72ºC se añade la solución de iniciador
preparada. El estireno (b) y el ácido acrílico se agregan mediante
bombas dosificadoras (bomba de pistón y diafragma, tipo Prominent
Gamma 4). La solución de bicarbonato sódico empleada para ajustar el
pH se introduce con un perfusor o también con una bomba
dosificadora.
La cantidad indicada de estireno (b) se dosifica
junto con el ácido acrílico que lleva disuelto, durante un periodo
de 240 min. Se produce un látex con un núcleo de poliestireno y una
envoltura de copolímero estireno-ácido acrílico con un tamaño de
partícula medio de unos 125-135 nm de diámetro.
El látex se preparó a una temperatura de
reacción de 72ºC, con una velocidad de agitación de 180 rpm.
\newpage
En las copolimerizaciones efectuadas se añadió
una solución de bicarbonato sódico mediante una segunda línea
dosificadora, para ajustar y regular los valores de pH indicados. La
tabla 2 muestra los pesos iniciales en los ejemplos de formulación
para la copolimerización con pH controlado de los látex
carboxilados:
En las reacciones semicontinuas incluidas en la
tabla 3 el pH se mantuvo constante durante el tiempo de dosificación
a los valores de pH indicados, pH = 2, pH = 3 y pH = 4
respectivamente, y se estudió la influencia del pH durante la
reacción en el área de parking.
El pH se ajustó con una solución de bicarbonato
sódico que se introdujo continuamente mediante un percusor, durante
el tiempo de dosificación de los monómeros. La concentración de la
disolución de NaHCO_{3} depende de la cantidad de ácido acrílico
que debe dosificarse y está comprendida entre 0,25 y 1,15 mol/l, y
la cantidad total de bicarbonato sódico dosificado en las
condiciones experimentales descritas es de 2,9-13,5
mmoles, dependiendo de la cantidad de ácido acrílico y del pH.
A pH 2 se dosificó adicionalmente
peroxodisulfato sódico durante un periodo de 240 min., porque debe
tenerse en cuenta que a este pH el iniciador se hidroliza por
catálisis ácida.
Los pesos iniciales de siembra de poliestireno,
de carga inicial de estireno, de estireno dosificado, de fase
continua (agua desmineralizada) y del iniciador empleado están
indicados en la tabla 2. La siguiente tabla 3, junto a la cantidad
exacta de ácido acrílico utilizada y desglosada en cada serie
concreta de pH, también indica el área de parking resultante en las
partículas de látex. Se encontró que el tamaño de las partículas de
látex era de 125 - 135 nm.
Al caer la cantidad de ácido acrílico hay un
incremento exponencial de área de parking, mientras que la masa de
ácido acrílico dosificado disminuye linealmente en relación con el
estireno. En los ensayos en que el pH se mantuvo constante a un
valor de 4 se incorporó menos ácido acrílico en la superficie del
látex, en contraste con un pH constante de 3. En el intervalo ácido
hay más ácido acrílico presente en forma protonada; por tanto es
más hidrófobo y copolimeriza más fácilmente con el estireno. En este
caso se incorpora a la copolimerización más ácido acrílico, el cual
se disuelve en el estireno.
Como puede verse en la tabla 3, con el proceso
de la presente invención pueden producirse de manera muy controlada
partículas de látex carboxiladas con una densidad de carga deseada y
predeterminada.
En este ensayo se intentó reproducir las
partículas del lote 2 del ejemplo 3.
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Como puede verse en la tabla 4, la reproducción
virtualmente idéntica del lote 2 pudo lograrse en el nuevo lote 16.
Por consiguiente, el método de copolimerización en emulsión, con
control del pH para preparar partículas de látex carboxiladas
también se distingue por una capacidad de reproducción óptima.
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Se activaron 15 mg de látex en 0,75 ml de tampón
de MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico)
20 mM, de pH 6,1, en presencia de sulfo-NHS
(N-hidroxisuccinimida) 4 mM y de EDC (hidrocloruro
de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida)
4 mM, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h en un
incubador de rodillos. Luego se añadieron 705 \mul de una
solución de MAb<CRP> (C = 0,96 mg de MAb/ml) (Mab<CRP> =
anticuerpo monoclonal contra proteína C-reactiva
(CRP)) en tampón MES de pH 6,1 y se siguió incubando durante 20 min.
Después se agregaron 45 \mul de una solución de Synperonic al 2%
en MES de pH 6,1. Esta mezcla reactiva se incubó durante 100 min.
más y la reacción se paró añadiendo 30 \mul de una disolución de
glicina-HCl 2 M (pH 11). La mezcla del conjugado se
centrifugó y el sobrenadante se separó y se dispersó en tampón
(glicina-HCl 50 mM, pH 8,0, con 0,03% de Synperonic
y 0,05% de azida sódica).
Los conjugados preparados se evaluaron empleando
el sistema Cobas Mira, de Roche Diagnostics. El comportamiento de
los conjugados basados en los látex preparados según la presente
invención cumplieron los requerimientos para su uso en un
inmunoensayo homogéneo de detección de CRP.
Claims (9)
1. Proceso para preparar partículas de látex
carboxiladas, basado en la copolimerización de un monómero
monoalquenil-aromático (A) y un ácido carboxílico
alifático insaturado (B) que tiene lugar a un pH especificado y
constante, comprendido entre > 1,5 y < 4,5, el cual se
controla durante la reacción y se mantiene constante por valoración
compensatoria, y como máximo se desvía 0,3 unidades del pH
especificado para la mezcla de copolimerización.
2. Proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el monómero
monoalquenil-aromático (A) es estireno o
alfa-metil-estireno.
3. Proceso según la reivindicación 1 o 2,
caracterizado porque el ácido carboxílico alifáticamente
insaturado (B) es ácido acrílico, ácido metacrílico, ácido fumárico
o ácido itacónico.
4. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la
copolimerización tiene lugar en emulsión acuosa.
5. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la
copolimerización es iniciada mediante radicales libres.
6. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque antes de la
copolimerización se añade un látex de siembra adecuado.
7. Proceso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el monómero (B)
se disuelve en el monómero (A).
8. Proceso según la reivindicación 7,
caracterizado porque como reactivo regulador del pH se
utiliza una solución acuosa de carbonato, bicarbonato o hidróxido
de metal alcalino.
9. Uso de partículas de látex carboxiladas,
obtenibles por un proceso según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 8, en un método de ensayo inmunológico.
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