ES2338221T3 - Formulacion de sensor para la deteccion de una composicion gaseosa y metodo para detectar la presencia de organismos que respiran. - Google Patents
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Abstract
Una formulación de sensor para monitorizar simultáneamente al menos dos componentes de una composición de gases, que comprende: pentahidrato de dicloruro de tris(4,7-difenil-1,10-fenantrolina)rutenio como primer fluoróforo y el colorante yoduro de 1,1'',3,3,3'',3''-hexametilindoldicarbocianina como segundo fluoróforo; un colorante cromóforo indicador ácido-base seleccionado de rojo cresol y azul brometilol; y una matriz de polímero, en donde dicho colorante cromóforo y dichos al menos dos fluoróforos se mezclan dentro de dicha matriz de polímero antes de la polimerización de dicha matriz, comprendiendo además dicha formulación de sensor dos polvos de sílice diferentes, siendo dichos dos polvos de sílice un primer polvo de sílice y un segundo polvo de sílice: teniendo dicho primer polvo de sílice una mayor densidad en comparación con el segundo polvo de sílice de menor densidad, estando dicho fluoróforo revestido sobre gránulos de dicho primer polvo de sílice y estando dicho segundo fluoróforo revestido sobre dicho segundo polvo de sílice.
Description
Formulación de sensor para la detección de una
composición gaseosa y método para detectar la presencia de
organismos que respiran.
Los microorganismos ocupan nuestro ambiente
afectando a nuestras vidas tanto de un modo beneficioso como
perjudicial. Por esta razón ha habido una necesidad siempre
creciente de proporcionar un mecanismo rápido, eficaz y sensible
para la detección, identificación y estudio de la presencia y
actividad metabólica de los microorganismos.
En los últimos años la ciencia de la
microbiología ha experimentado avances considerables. Esto es
particularmente cierto para el campo de los sensores usados en la
detección, identificación y análisis del comportamiento de los
microorganismos. Aunque se han logrados progresos en el campo de la
monitorización de los microorganismos, aún persisten ineficacias en
los métodos de monitorización usados comúnmente. Por ejemplo, un
método lento pero eficaz para analizar la susceptibilidad
antimicrobiana, el método del disco de Bauer-Kirby,
todavía se usa en los ambientes hospitalarios. Este método emplea
la presencia o ausencia de crecimiento visible de los
microorganismos para indicar la eficacia de un compuesto
antimicrobiano, y generalmente requiere un período de incubación de
18 a 24 horas para permitir el crecimiento del microorganismo antes
de que pueda obtenerse un resultado.
Otro método popular para analizar la
susceptibilidad antimicrobiana es el método de microdilución de
caldo, tal como el sistema Sceptor RTM para analizar la
identificación y susceptibilidad antimicrobiana de organismos
(Becton Dickinson Diagnostic Instrumentation Systems, Sparks, Md.).
Dicho sistema usa un panel de plástico desechable que tiene una
pluralidad de cavidades (de aproximadamente 0,4 ml por cavidad cada
una de las cuales contiene un compuesto de ensayo diferente o una
concentración diferente de un compuesto de ensayo secado sobre la
superficie de la cavidad. El organismo que ha de ser analizado se
suspende en el medio de ensayo deseado, y se suministran partes
alícuotas a las cavidades individuales del panel de ensayo. El
reactivo secado en el panel se disuelve en la muestra, y el sistema
se incuba durante una noche (18 a 24 horas) para permitir un tiempo
suficiente para que los organismos interactúen con el reactivo y
para que aparezca un crecimiento visible. El panel se examina luego
visualmente en cuanto a la presencia o ausencia de crecimiento,
obteniéndose con ello información sobre la susceptibilidad del
organismo que se analiza. Pocillos adicionales ayudan a identificar
el organismo. Sin embargo, este método de ensayo, al igual que el
método del disco de Bauer-Kirby, adolece del
inconveniente de que también requieren un largo periodo de
incubación.
En los últimos años se han hechos esfuerzos para
evitar los largos tiempos de incubación requeridos por los métodos
de monitorización antes comentados. Estas innovaciones se han
enfocado en la monitorización de la actividad metabólica de los
microorganismos en lugar de la monitorización del crecimiento de las
colonias. Se han descrito muchos métodos para monitorizar la
actividad metabólica de los microorganismos en un intento de
monitorizar rápida y precisamente dicha actividad metabólica.
Una innovación en el campo de la monitorización
de microorganismos es un aparato, que usa medios ópticos del
dispersión de la luz para determinar la susceptibilidad sondando el
cambio de tamaño o número de microorganismos en presencia de
diversos compuestos antimicrobianos. Un ejemplo de un instrumento
comercial, que emplea esta metodología es el constituido por el
sistema Vitech (BioMerieux Corp.). En el mejor de los casos este
sistema proporcionará información sobre la susceptibilidad
antimicrobiana de microorganismos dentro de un periodo de 6 horas
para muchos organismos y combinaciones de fármacos. Otras
combinaciones pueden requerir tanto como 18 horas antes de que
pueda determinarse la susceptibilidad antimicrobiana del organismo
por el método del sistema Vitech.
En un esfuerzo por mejorar el método de
Bauer-Kirby, se han desarrollado modificaciones que
permiten que ciertas muestras sean leídas en cuatro a seis horas.
Sin embargo, este sistema modificado es de naturaleza destructiva,
requiriendo la pulverización de una solución de revelado de un
colorante formador de color sobre la placa de ensayo. El efecto
destructivo de la solución de revelado prohíbe la
re-incubación y la lectura en un momento posterior
si falla la técnica rápida inicial. Por tanto, el experimento no
puede ser continuado para una evaluación estándar en un momento
posterior.
Otros métodos han implicado monitorizar el
consume de oxígeno microbiano por medidas del pH y/o cambio de
color de la hemoglobina, o por el uso de colorantes, tales como
cloruro de trifenil-5-tetrazolio y
resazurina, que cambian el color en respuesta al potencial redox
total del medio de ensayo líquido.
La monitorización del consumo de oxígeno
disuelto por los microorganismos, como un marcador de su
metabolismo, se ha estudiado desde hace muchos años. Por ejemplo,
C. E. Clifton en 1937 monitorizó el consumo de oxígeno por
microorganismos durante un período de siete días usando un matraz
Warburg. Este método midió el cambio en la concentración de oxígeno
de una manera lenta y engorrosa.
El electrodo de "Clark", un dispositivo
electroquímico, también se usa comúnmente para medir el oxígeno
disuelto. Desafortunadamente, el electrodo de Clark consume oxígeno
durante su uso (reduciendo con ello el oxígeno disponible para los
microorganismos) y el electrodo de tamaño "estándar" se usa
típicamente sólo para medir volúmenes de 100 ml o mayores para
impedir que el electrodo interfiera con las medidas.
Se ha descrito un electrodo de Clark en
"miniatura", pero este electrodo es una pieza
multi-componente complicada, que al igual que los
electrodos más grandes, debe estar en contacto con la solución que
se mide. Aunque puede usarse una membrana permeable al oxígeno para
impedir que los componentes del electrodo del dispositivo
interactúen con los constituyentes de la solución de ensayo, el
oxígeno debe todavía equilibrarse entre la solución de ensayo y el
sistema de medida y se consume una vez que pasa por la membrana.
Se han desarrollado sistemas ópticos que pueden
proporcionar datos de la concentración de oxígeno para superar los
inconvenientes de los sistemas de electrodos de Clark. La principal
ventaja de dichos métodos ópticos es que la instrumentación
requerida para determinar valores cuantitativos no entra en contacto
físico con la solución de ensayo. Se conocen técnicas ópticas que
permiten análisis tanto colorimétricos como fluorométricos para
oxígeno que se llevan a cabo tanto rápida como reproduciblemente, y
frecuentemente los costes de dichos análisis son bastante bajos.
Por ejemplo se han descrito varias técnicas luminiscentes para la
determinación de oxígeno que se basan en la capacidad del oxígeno
para extinguir las emisiones fluorescentes o fosforescentes de una
variedad de compuestos. Sin embargo, dichos métodos no se han
adaptado fácilmente a la monitorización microbiana. Además, dichos
sistemas, como el sistema del electrodo de Clark están limitados a
monitorizar solamente el consumo de oxígeno disuelto por
microorganismos.
La patente
US-A-5.747.349 describe una
formulación de sensor para detectar simultáneamente componentes
gaseosos que comprende perlas de información múltiple revestidas
con colorantes indicadores fluorescentes o un indicador de pH
cromógeno.
La patente
US-A-5.019.350 describe una
formulación relacionada con dos o más colorantes fluorescentes
embebidos en un polímero.
La patente
US-A-4.795.814 describe también un
sistema relacionado con dos colorantes fluorescentes embebidos en
un polímero transparente para detectar simultáneamente O_{2} y
CO_{2}.
Se han descrito otros sistemas que proporcionan
información sobre la presencia, identidad y susceptibilidad
antimicrobiana de microorganismos en un periodo de ocho horas o
menos. Wilkins y Stones en la patente
US-A-4.200.493 describen un sistema
que usa electrodos y un potenciómetro de alta impedancia para
determinar la presencia de microorganismos. En la patente
US-A-3.907.646 Wilkins et
al., describen un método analítico que utiliza los cambios de
presión en el espacio de cabeza de un matraz asociado con el
crecimiento microbiano para la detección y vigilancia de los
organismos. La patente
US-A-4.220.715 de Ahnell, describe
un sistema en donde el gas del espacio de cabeza por encima de una
muestra de ensayo se hace pasar a través de un detector de oxígeno
externo para la determinación de la presencia de microorganismos.
Ahnell, en la patente US.-A-4.152.213, describe un
sistema para el análisis por monitorización del vacío producido por
organismos en crecimiento en un espacio de cabeza cerrado por
encima de un muestra de ensayo. La patente
US-A-4.116.775 de Charles et
al., es un ejemplo del uso de medios ópticos basados en el
aumento de la turbidez o la densidad óptica de un cultivo
microbiano en crecimiento para la detección y monitorización de
crecimiento bacteriano. Al igual que con los sistemas de electrodos
de Clarke, estos sistemas están diseñados para proporcionar datos
limitados al consumo de oxígeno.
La patente
US-A-5.629.533 expedida a Ackley
et al., es ilustrativa de sensores ópticos que han sido
desarrollados para monitorizar los niveles de dióxido de carbono
sobre una base continua. Dichos sensores implican el uso de ópticas
de fibra de vidrio en combinación con un elemento sensor
sol-gel sensor, que contiene un indicador químico
sensible a la presencia de dióxido de carbono. Este sistema abarca
un sustrato ranurado con un material sol-gel que
tiene un indicador químico adherido den ro de las ranuras. Cables de
fibra óptica están acoplados a las ranuras y a medida que la luz
pasa a través de los cables de fibra óptica, la transmisión es
afectada por el elemento sensor sol-gel.
Aunque los métodos de ensayo como los ilustrados
como ejemplos anteriormente han mejorado en los últimos años para
proporcionar medios más rápidos y más precisos de detectar el
crecimiento y la actividad metabólica de microorganismos, es un
inconveniente común de tales métodos de ensayo que ninguna de las
innovaciones han proporcionado un sensor biológico que sea capaz de
simultáneamente detectar el crecimiento de microorganismos aerobios
y anaerobios en una muestra. Esta limitación en los sistemas de
monitorización comúnmente usados existe porque dichos sistemas
típicamente permiten que solamente sea detectado un componente
gaseoso en una unidad de
sensor.
sensor.
Los sistemas de monitorización de composición de
gases, que se pueden usar para detectar la actividad metabólica de
microorganismos están limitados a la monitorización de oxígeno o
dióxido de carbono. Los sensores para dióxido de carbono pueden
usar un cromóforo indicador ácido-base para modular
la producción de señal de un fluoróforo. En dicho sistema el
espectro de absorbancia de un cromóforo cambia cuando cambia el
valor del pH de una muestra medida. El sistema es capaz de
determinar el nivel de dióxido de carbono porque el valor del pH de
una muestra medida depende del nivel de dióxido de carbono del
ambiente de la muestra. Un sistema de monitorización que determina
la actividad metabólica de microorganismos empleando un sensor de
oxígeno, puede emplear un fluoróforo sensible al oxígeno para
detectar cambios en el nivel de oxígeno en un ambiente de la
muestra. Antes de la presente invención, la combinación de la
capacidad de monitorizar simultáneamente ambos niveles de dióxido
de carbono y oxígeno en una composición de gases estuvo frustrada
por el problema irresoluble de la interacción cruzada
(cross-talk) entre los sensores del
sistema.
La presente invención resuelve este problema
proporcionando una formulación y sistema de sensor que puede
responder independiente y simultáneamente al oxígeno y al dióxido de
carbono.
Por consiguiente es un objeto de esta invención
proporcionar un sistema de monitorización mejorado para detectar la
presencia de microorganismos anaerobios o aerobios presentes en
medios líquidos o semi-sólidos, y para evaluar su
actividad metabólica. Es otro objeto de esta invención proporcionar
un sistema de monitorización microbiano que monitoriza
independiente y simultáneamente los niveles de oxígeno y dióxido de
carbono en una composición de gases. Es otro objeto de la presente
invención proporcionar un sistema mejorado que puede detectar y/o
monitorizar la actividad de enzimas o sistemas enzimáticos
consumidores de oxígeno, así como el efecto de compuestos
inhibidores del crecimiento, tales como antibióticos sobre
microorganismos. Es otro objeto de la invención proporcionar una
formulación para uso en monitorizar la actividad metabólica de un
organismo. Es otro objeto de la invención proporcionar medios para
minimizar la interacción cruzada entre sensores de componentes
gaseosos distintos, los cuales están monitorizando simultáneamente
diferentes componentes de una composición de gases. Es otro objeto
de la presente invención proporcionar un método de preparar una
formulación mejorada, que se puede usar para monitorizar la
actividad metabólica de un microorganismo detectando individual y
simultáneamente niveles de oxígeno y dióxido de carbono en una
composición de gases.
Adicionalmente, es un objeto de la presente
invención proporcionar un método para monitorizar la actividad
metabólica de un microorganismo, abarcando el método el uso del
sistema de monitorización de la presente invención.
Los objetos anteriores y otros relacionados se
alcanzan mediante la presente invención.
En particular, la presente invención se refiere
a una formulación de sensor para monitorizar simultáneamente al
menos dos componentes de una composición de gases, que
comprende:
- \quad
- pentahidrato de dicloruro de tris(4,7-difenil-1,10-fenantrolina)rutenio (fluoróforo de hidrato de dicloruro de rutenio (II)) como primer fluoróforo y el colorante yoduro de 1,1',3,3,3',3'-hexametilindoldicarbocianina como el segundo fluoróforo; un colorante cromóforo indicador ácido-base seleccionado de rojo cresol y azul brometilol; y
- \quad
- una matriz de polímero,
en donde dicho colorante cromóforo y dichos al
menos dos fluoróforos se mezclan dentro de dicha matriz polímera
antes de la polimerización de dicha matriz.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere además a un
método para detectar la presencia de microorganismos que respiran,
que comprende:
proporcionar una formulación de sensor,
comprendiendo dicha formulación:
- \quad
- pentahidrato de dicloruro de tris(4,7-difenil-1,10-fenantrolina)rutenio como primer fluoróforo, siendo dicho fluoróforo sensible a cambios en la concentración de oxígeno en una composición de gases;
- \quad
- un primer polvo de sílice que tiene gránulos individuales, revistiendo dicho fluoróforo dichos gránulos de dicho primer polvo de sílice para proporcionar un primera sílice revestida con fluoróforo,
- \quad
- un colorante cromóforo indicador ácido-base seleccionado de rojo cresol y azul brometilol, siendo dicho colorante indicador ácido-base sensible a cambios en la concentración de dióxido de carbono en una composición de gases;
- \quad
- el colorante yoduro de 1,1',3,3,3',3'-hexametilindoldicarbocianina como segundo fluoróforo, estando la producción de la señal de dicho fluoróforo modulada por dicho colorante cromóforo indicador ácido-base;
- \quad
- un segundo polvo de sílice que tiene gránulos individuales, revistiendo dicho segundo fluoróforo dichos gránulos de dicho segundo polvo de sílice para proporcionar sílice revestida con dicho segundo fluoróforo; siendo dicho segundo polvo de sílice de menor densidad que dicho primer polvo de sílice;
- \quad
- una matriz polímera en donde en donde dicho cromóforo indicador ácido-base está uniformemente distribuido y dichas sílices revestidas con fluoróforos están segregadas una de la otra dentro de dicha matriz polímera debido a las diferentes densidades de dicho primer polvo de sílice y dicho segundo polvo de sílice;
proporcionar un dispositivo de lectura de
fluorescencia que tiene al menos un primer elemento sensor y un
segundo elemento sensor; estando dicho primer elemento sensor
sintonizado a la misma longitud de onda de dicho primer fluoróforo
y estando dicho segundo elemento sensor sintonizado a la misma
longitud de onda de dicho segundo fluoróforo;
proporcionar un microorganismo para
monitorizar;
exponer dicho microorganismo a dicha formulación
de sensor en presencia de dicho dispositivo de lectura de
fluorescencia; y
registrar la respuesta de dicho primer elemento
sensor y dicho segundo elemento sensor a dicho microorganismo.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también se refiere a un
método para monitorizar los efectos de una composición sobre el
metabolismo de un microorganismo que comprende:
proporcionar una formulación de sensor,
comprendiendo dicha formulación:
- \quad
- pentahidrato de dicloruro de tris(4,7-difenil-1,10-fenantrolina)rutenio como primer fluoróforo, siendo dicho fluoróforo sensible a cambios en la concentración de oxígeno en una composición de gases;
- \quad
- un primer polvo de sílice que tiene gránulos individuales, revistiendo dicho fluoróforo dichos gránulos de dicho primer polvo de sílice para proporcionar un primera sílice revestida con fluoróforo,
- \quad
- un colorante cromóforo indicador ácido-base seleccionado de rojo cresol y azul brometilol, siendo dicho indicador ácido-base sensible a cambios en la concentración de dióxido de carbono en una composición de gases;
- \quad
- el colorante yoduro de 1,1',3,3,3',3'-hexametilindoldicarbocianina como segundo fluoróforo, teniendo dicho segundo fluoróforo la producción de la señal modulada por dicho colorante cromóforo indicador ácido-base;
- \quad
- un segundo polvo de sílice que tiene gránulos individuales, revistiendo dicho segundo fluoróforo dichos gránulos de dicho segundo polvo de sílice para proporcionar sílice revestida con dicho segundo polvo de sílice; siendo dicho segundo polvo de sílice de menor densidad que dicho primer polvo de sílice;
- \quad
- una matriz polímera en donde en donde dicho cromóforo indicador ácido-base está uniformemente distribuido y dichas sílices revestidas de fluoróforo están segregadas una de la otra dentro de dicha matriz polímera debido a las diferentes densidades de dicho primer polvo de sílice y dicho segundo polvo de sílice;
proporcionar un dispositivo de lectura de
fluorescencia que tiene al menos un primer elemento sensor y un
segundo elemento sensor; estando dicho primer elemento sensor
sintonizado a la misma longitud de onda de dicho primer fluoróforo
y estando dicho segundo elemento sensor sintonizado a la misma
longitud de onda de dicho segundo fluoróforo;
proporcionar un microorganismo para
monitorizar;
exponer dicho microorganismo a dicha formulación
de sensor en presencia de dicho dispositivo de lectura de
fluorescencia; y
registrar la respuesta de dicho primer elemento
sensor y dicho segundo elemento sensor a dicho microorganismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Las realizaciones preferidas serán evidentes de
las reivindicaciones subordinadas.
La presente invención incluye el uso de un
sistema de detección de fluorescencia en donde se emplean compuestos
sensores fluorescentes para responder individual y simultáneamente
al nivel de oxígeno de oxígeno y al nivel de dióxido de carbono
asociado con la actividad metabólica de un microorganismo con mínima
o ninguna interacción cruzada entre los diferentes compuestos
sensores.
El sistema de fluorescencia de la presente
invención se puede emplear con un dispositivo de lectura de
fluorescencia comercialmente disponible modificado, tal como, pero
sin limitación a un panel de prueba configurado a partir de un
instrumento BD 9050. El dispositivo de lectura de fluorescencia
modificado puede estar modificado de modo que tenga al menos dos
sensores, estando cada sensor ajustado separadamente a la longitud
de onda de un colorante fluoróforo correspondiente. Un ejemplo de
dicho instrumento de lectura de fluorescencia modificado puede ser
el dispositivo BD 9050 comercialmente disponible que ha sido
modificado para tener dos sensores ajustados a las respectivas
longitudes de onda (sensibilidad) de dos colorantes fluoróforos
correspondientes; estando uno de los colorantes fluoróforos
incluido en la formulación de la presente invención con el fin de
reaccionar a los niveles de oxígeno de la muestra que se estudia
estando el segundo colorante fluoróforo incluido en la formulación
con el fin de reaccionar a los niveles de dióxido de carbono de de
la muestra analizada. Está dentro del concepto o alcance de la
presente invención que, si se desea medir gases adicionales en una
composición de gases, puedan emplearse colorantes fluoróforos
distintos adicionales correspondientes a sensores adicionales para
los otros gases que han de ser monitorizados. Los sensores
adicionales pueden ser ajustados separada y distintamente a las
respectivas longitudes de onda de los colorantes fluoróforos
correspondientes adicionales según sea necesario.
La formulación de sensor de la presente
invención puede ser puesta en contacto con la muestra de ensayo
(bien sea directamente o por separado mediante una membrana
permeable al oxígeno) y el nivel de fluorescencia para cada uno de
los colorantes fluoróforos de la composición puede ser medido usando
un equipo de lectura de fluorescencia como se ha descrito
anteriormente. Un aumento de la fluorescencia es indicativo de
microorganismos aerobios que respiran, que utilizan (y por tanto
reducen) el oxígeno de la muestra.
Por tanto el sistema se puede usar para detectar
una variedad de microorganismos que respiran, tanto aerobios como
anaerobios. Se anticipa además que este sistema se puede usar para
detectar la eficacia de compuestos tales como antibióticos sobre la
actividad metabólica de microorganismos.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig 1 muestra los espectros de la formulación
del sensor del Ejemplo 4 a 570 nm. Se representan gráficamente las
respuestas del sensor bajo N_{2} y CO_{2}, CO_{2} y aire, aire
solo, y N_{2} solo.
La Fig 2 muestra los espectros la formulación
del sensor del Ejemplo 4 a 470 nm. Se representan gráficamente las
respuestas del sensor bajo N_{2} y CO_{2}, CO_{2} y aire, aire
solo, y N_{2} solo.
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema de sensor biológico de la presente
invención proporciona una formulación de sensor que cuando se
emplea en el sistema de sensor es capaz de detectar el crecimiento
de microorganismos tanto anaerobios como aerobios en una muestra.
El resultado inesperado de detectar simultáneamente cambios en los
niveles de oxígeno y dióxido de carbono en una composición de gases
con mínima o ninguna interacción cruzada entre distintos sensores
para los dos gases se consigue debido a la formulación de sensor. La
formulación de sensor está compuesta de una mezcla de de cromóforo,
fluoróforos, y materiales de soporte inertes de tal modo que cada
colorante fluoróforo activo puede responder a una composición de
gases específica de una manera distinta sin interacción cruzada con
los cambios simultáneos de la composición detectados por otro
colorante fluoróforo en la misma matriz de sensor. El sistema de
sensor de la presente invención consigue esta minimización de la
interacción cruzada entre sensores mediante el empleo de la
composición del sensor.
Por lo tanto la presente invención proporciona
una formulación de composición para un
"combi-sensor" para la detección de CO_{2} y
O_{2}en un elemento sensor; el método de fabricar el sensor; y el
uso del sensor para detectar el crecimiento (o la inhibición del
crecimiento como puede ser el caso de fármacos antibióticos) de una
gran variedad de microorganismos causantes de enfermedades, mediante
tanto la producción de CO_{2} como el consumo de O_{2}. También
es posible usar este sensor para detectar el crecimiento (o la
inhibición del crecimiento) en células eucariotas, tales como las
que crecen en cultivo de tejidos y se usan para el escrutinio de
fármacos.
La formulación de la presente invención permite
que tanto la producción de CO_{2} producción como el consumo de
O_{2} sean monitorizados sin la esperada interacción cruzada entre
los sensores. Por tanto, a medida que cambia el nivel de CO_{2}
de la muestra cambia el espectro de absorbancia del cromóforo. Como
modulador el sensor de CO_{2} emplea un cromóforo indicador
ácido-base para modular la producción de señal de un
colorante fluoróforo. A medida que cambia el nivel de CO_{2} del
ambiente de la muestra, cambia correspondientemente el valor del
pH. El espectro de absorbancia del cromóforo cambia en relación con
el cambio en el valor del pH. El sensor de O_{2} emplea un
colorante fluoróforo sensible al oxígeno que cambia
correspondientemente con un cambio en los niveles de O_{2} en el
ambiente de la muestra. Los sensores en un dispositivo de lectura
de fluorescencia pueden ser ajustados a la longitud de onda de los
distintos colorantes para cada uno de los gases separados que han
de ser monitorizados; sin embargo, la interacción cruzada entre los
diferentes sensores puede ser tan intensa que anule cualquier
esfuerzo para monitoriza la composición de gases.
La presente invención resuelve este problema de
interacción cruzada entre los sensores y proporciona distintos
sensores que dan elevados resultados para cada uno de los gases
monitorizados por el uso de la formulación de sensores. Como
ejemplo de la presente invención, cualquier colorante fluoróforo
sensible al O_{2} puede ser revestido sobre un polvo de sílice de
mayor densidad. El polvo de sílice denso causa que la sílice
revestida con fluoróforo se sedimente en el fondo de la matriz del
sensor a medida que se forma. El colorante fluoróforo que se usa
para la detección de CO_{2} se reviste sobre una sílice de menor
densidad, lo que da como resultado que el fluoróforo asociado al
CO_{2} flote en toda la matriz del sensor. El cromóforo indicador
ácido-base se transforma en una emulsión en la
matriz del sensor y por tanto se dispersa en toda de dicha matriz
del sensor. Mediante una selección cuidadosa de los componentes de
la formulación, el perfil de los espectros del fluoróforo sensible
al O_{2} y el fluoróforo sensible al CO_{2} tienen un mínimo o
nulo solapamiento. La señal de O_{2} opera casi
independientemente de las variaciones de CO_{2} debido a la
configuración segregada de los diferentes sensores, lo que resulta
de las distintas densidades de las sílices seleccionadas durante la
formación de la matriz. Similarmente, la modulación del CO_{2}
opera casi independientemente del sensor del nivel de oxígeno
debido a la configuración segregada de la formulación descrita
anteriormente.
La formulación de sensor puede estar constituida
por una mezcla de cromóforo, fluoróforos, y materiales inertes de
soporte. Un ejemplo no limitativo de una formulación de sensor de la
presente invención puede incluir: (a) pentahidrato de dicloruro de
tris(4,7-difenil-1,10-fenantrolina)rutenio;
(b) yoduro de
1,1',3,3,3',3'-hexametilindodicarbocianina; (c) un
colorante indicador ácido-base; (d) un polímero de
silicio; (e) un compuesto de hidrógeno-silicio; (f)
un catalizador; y opcionalmente (g) un inhibidor y un método para
preparar la nueva composición. Importantemente, la selección de
componentes de la formulación permite a un experto ordinario en la
técnica construir el sistema sensor para proporcionar una
determinación neta de una composición de gases para cada muestra que
se analiza. También es importante entender que aunque los ejemplos
proporcionados están dirigidos a una formulación y sistema de
sensor, que puede detectar simultáneamente los niveles de O_{2} y
CO_{2} en una composición de gases, la formulación y, si se
desea, el sistema pueden ser expandidos, para incluir sensores
adicionales y colorantes fluoróforos correspondientes adicionales
que pueden facilitar la monitorización simultánea de gases
adicionales. El sistema sensor tiene por lo tanto un intervalo muy
amplio de capacidades y no está limitado a los ejemplos descritos
en la presente
memoria.
memoria.
En la Tabla 1 se proporcionan formulaciones para
algunos ejemplos no limitativos de la composición de sensor de la
presente invención. Los componentes específicos mostrados para cada
uno de los ejemplos de la Tabla 1 son representativos de los
componentes que pueden ser seleccionados para conseguir la presente
invención. La formulación de la presente invención puede incluir
cualquier mezcla de cromóforo, fluoróforos, y materiales inertes de
soporte que en combinación dan como resultado una alta devolución de
señal fluorescente para los colorantes fluoróforos distintos
fluoróforo con mínima o nula interacción cruzada entre los sensores
correspondientes.
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- ^{1} La solución madre de MCP es 0,19 g de púrpura de cresol + 434 g de CAPS + 0,086 g de timolftaleína + 22,14 g de NaOH 1N + 78,5 g de de H_{2}O desionizada.
- \quad
- ^{2} HFCS es sílice revestida con el fluróforo HIDC.
- \quad
- ^{3} La solución de rojo de cresol es 0,345 g de rojo de cresol + 0,54 g de tricina + 4,95 g de NaOH 1N + 0,19 g de KCI + 25,2 g de H_{2}O desionizada.
- \quad
- ^{4} El colorante BTB es 2,0 g de BTB + 28,0 g de CAPS + 0,53 g de timolftaleína + 16,0 g de NaOH 1N + 0,65 g de KCI + 100 g de H_{2}O desionizada.
- \quad
- ^{5} La parte A de polímero es un polidimetilsiloxano; preferiblemente un polidimetilsiloxano terminado en vinil-dimetilo.
- \quad
- ^{6} La parte B de polímeroes una mezcla de un copolímero de polimetilhidrodimetilsiloxano y un copolímero de siloxano.
- \quad
- ^{7} RFCS es la abreviatura en inglés de sílice revestida con fluoróforo de rutenio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporcionó un dispositivo de lectura de
fluorescencia BD 9050 con las configuraciones de canales que se
muestra en la Tabla 2. Se pueden proporcionar similares
configuraciones de canales para cualquier dispositivo de lectura de
fluorescencia que un experto ordinario en la técnica usaría para
monitorizar el metabolismo de un microorganismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Para preparar sílice revestida con yoduro de
1',1',3,3,3',3'-hexametilindoldicarbocyanina (en lo
sucesivo citado por sus iniciales en inglés "HIDC") se preparó
una solución de 0,0715 g de HIDC en 40 g de etanol al 95%. La
solución se mezcló luego con 54 g de sílice Aerosil® R812 de Degussa
(en lo sucesivo denominada "R812"). La mezcla se secó al aire
y se trituró el sólido resultante.
Se preparó una solución madre de solución de
rojo cresol (en lo sucesivo citado por la abreviatura inglesa
"CR") disolviendo 0,345 g de rojo cresol (CAS Nº
1733-12-6), 0,54 g de tricina (CAS
Nº 5704-04-1) y 0,19 g de KCl en
4,95 g de NaOH 1N y 25,2 g de agua desionizada.
De acuerdo con el método descrito en la patente
US-A- 5.567.598 se preparó sílice revestida de
pentahidrato de dicloruro de
tris(4,7-difenil-1,10
fenantrolina)rutenio II (citada en lo sucesivo por las
iniciales inglesas "RFCS").
Se preparó un polímero a base de silicio curable
por calor mezclando un polidimetilsiloxano terminado en vinilo con
diversas cantidades de catalizador e inhibidor y un agente
reticulante, que es un copolímero de polimetilhidrodimetilsiloxano
o una mezcla de un polidimetilsiloxano terminado en vinilo y un
copolímero de polimetilhidrodimetilsiloxano. El catalizador puede
ser incluido en la formulación desde 1 ppm a 5% y el inhibidor puede
ser incluido desde 1 ppm a 10%. Ejemplos no limitativos de
catalizadores e inhibidores satisfactorios son catalizadores de
platino e inhibidor de vinilmetil-dimetilsiloxano
cíclico como reflectores de la luz.
La formulación de sensor puede consistir en 0,36
g de CR, 0,2 g de sílice revestida con HIDC, 0,03 g de dióxido de
titanio puro de DuPont, y 21 g de polímero. La mezcla resultante
puede mezclarse mecánicamente. La RFCS (0,25 g) se puede añadir la
mezcla anterior y mezclarse de nuevo. Después de la segunda
mezcladura de la formulación, pueden añadirse 3,5 g de un agente
reticulante y mezclarse por tercera vez. Puede emplearse cualquier
agente reticulante adecuado dependiendo del grado de reticulación
deseado. Dos gramos de la mezcla detectora resultante se cargaron
en un frasco de vidrio Bactec 9000. El frasco del sensor se dejó
reposar a la temperatura ambiente durante tres horas seguido por un
curado térmico a 75º durante 3,5 horas. Se pueden hacer variaciones
a este método sin apartarse del alcance la invención.
Las señales del sensor de combinación se miden
mediante dos detectores separados a dos longitudes de onda
diferentes de una misma unidad instrumental en un mismo dispositivo
sensor. El panel de prueba usado para monitorizar la función del
sensor en los ejemplos se hizo a partir de un instrumento BD 9050
modificado. El instrumento se modificó de modo que ajustara las
distintas longitudes de onda de lo colorantes/fluoróforos en la
composición del sensor a las del instrumento. Se proporcionaron dos
canales del detector en el instrumento modificado. El primero se
proporcionó para las señales de variación del O_{2} y el segundo
para las señales de variación del CO_{2}. El control de la
longitud de onda de cualquier detector se puede conseguir por
diodos emisores de luz (DEL) apropiados o filtros o la combinación
de los dos. La simplicidad de las modificaciones de cualquier
instrumento capaz de lectura de fluorescencia está dentro de la
experiencia ordinaria de un experto familiarizado con dichos
instrumentos.
Se añadieron aproximadamente 30 ml de agua
desionizada a la formulación de sensor y el recipiente se cerró
herméticamente con un tapón de caucho de butilo. La señal inicial de
de la formulación de sensor se midió en el dispositivo de lectura
de fluorescencia modificado como señales de la categoría
"Aire". Luego se barrió con nitrógeno para obtener la medida
de la señal bajo un ambiente de "N_{2}" o exento de oxígeno.
El mismo sensor se barrió luego con nitrógeno que contenía 30% de
CO_{2} para señales 30% de CO_{2}/N_{2}. Finalmente el mismo
sensor se barrio con 30% de CO_{2} equilibrado con aire y se
midieron las señales correspondientes. La Figuras 1 y 2
proporcionan una presentación gráfica de la monitorización de
CO_{2} de una muestra de ensayo, ejemplo 4. mostrado en los
espectros de la formulación sensor del ejemplo 4 a 570 nm y 470 nm
respectivamente. Se representan gráficamente las respuestas del
sensor bajo N_{2} y CO_{2}, CO_{2} y aire, aire solo, y
N_{2} solo. La Tabla 2 proporciona los resultados de
monitorización de los ejemplos 1-4 usando la técnica
descrita anteriormente. Puede verse como un experto ordinario en la
técnica controlará los resultados de monitorizar muestras variando
la composición de la formulación del sensor.
Las medidas de señal con un dispositivo BD9050
bajo varias composiciones de gases se resumen a continuación con
ejemplos que incluyen una realización preferida, el ejemplo 4.
\newpage
El mejor resultado se obtuvo con el ejemplo 4
que representa un intervalo dinámico alto y con baja interacción
cruzada tanto en los canales de oxígeno como de dióxido de carbono.
El intervalo dinámico mide el cambio de señal por los cambios de la
composición de gases. La interacción cruzada indica la independencia
de un cambio de composición de gases de la otra.
Para mejorar la consistencia en evaluar las
formulaciones de la presente invención, el material de ensayo
empleado para todos los ejemplos de formulación se preparó
artificialmente una composición de gases. La composición de gases
preparada incluye 30% de CO_{2} y es una composición de gases
generalmente aceptada que mimetiza los perfiles de crecimiento
microbiológico reales. El frasco del sensor de vidrio que contiene
la composición artificial de gases está tapado con un tapón de
caucho. Se le inserta un dispositivo de doble aguja con una aguja
conectada a una fuente de gas y la otra abierta al aire. La fuente
de gases es una botella de gas con una composición de gas
específica, tal como nitrógeno puro, 30% de CO_{2} equilibrado con
nitrógeno y así sucesivamente. Estas botellas de gas pueden
comprarse directamente a distribuidores comerciales o suscribirse a
través de vendedores. El gas especificado se hace circular como
barrido a través del frasco del sensor durante un periodo no
definido (normalmente cinco minutos) para reemplazar el aire con el
gas deseado. Aunque la botella de gas aún permita que circule gas
en frasco del sensor, se retira el dispositivo de agujas para
completar el proceso.
Claims (8)
1. Una formulación de sensor para monitorizar
simultáneamente al menos dos componentes de una composición de
gases, que comprende:
- \quad
- pentahidrato de dicloruro de tris(4,7-difenil-1,10-fenantrolina)rutenio como primer fluoróforo y el colorante yoduro de 1,1',3,3,3',3'-hexametilindoldicarbocianina como segundo fluoróforo; un colorante cromóforo indicador ácido-base seleccionado de rojo cresol y azul brometilol; y
- \quad
- una matriz de polímero,
en donde dicho colorante cromóforo y dichos al
menos dos fluoróforos se mezclan dentro de dicha matriz de polímero
antes de la polimerización de dicha matriz, comprendiendo además
dicha formulación de sensor dos polvos de sílice diferentes, siendo
dichos dos polvos de sílice un primer polvo de sílice y un segundo
polvo de sílice: teniendo dicho primer polvo de sílice una mayor
densidad en comparación con el segundo polvo de sílice de menor
densidad, estando dicho fluoróforo revestido sobre gránulos de dicho
primer polvo de sílice y estando dicho segundo fluoróforo revestido
sobre dicho segundo polvo de sílice.
2. Una formulación de sensor de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde dicho colorante cromóforo está dispersado
uniformemente dentro de dicha matriz polímera.
3. Una formulación de sensor de acuerdo con la
reivindicación 2, en donde dicho primer fluoróforo está segregado
de dicho segundo fluoróforo dentro de dicha matriz polímera.
4. Una formulación de sensor de acuerdo con la
reivindicación 4, en donde dicha matriz polímera comprende al menos
dos ingredientes premezclados, un primer componente polímero y un
segundo componente reticulante y opcionalmente, en donde dicha
matriz polímera comprende además ingredientes premezclados de un
catalizador y un inhibidor; y opcionalmente en donde dicho
catalizador es un catalizador de platino.
5. Una formulación de sensor de acuerdo con la
reivindicación 2, en donde dicha matriz polímera comprende además
un inhibidor.
6. Un método para detectar la presencia de
microorganismos que respiran, que comprende:
proporcionar una formulación de sensor,
comprendiendo dicha formulación:
- \quad
- pentahidrato de dicloruro de tris(4,7-difenil-1,10-fenantrolina)rutenio como primer fluoróforo, siendo dicho fluoróforo sensible a cambios en la concentración de oxígeno en una composición de gases;
- \quad
- un primer polvo de sílice que tiene gránulos individuales, revistiendo dicho fluoróforo dichos gránulos de dicho primer polvo de sílice para proporcionar un primera sílice revestida con fluoróforo,
- \quad
- un colorante cromóforo indicador ácido-base seleccionado de rojo cresol y azul brometilol, siendo dicho indicador ácido-base sensible a cambios en la concentración de dióxido de carbono en una composición de gases;
- \quad
- el colorante yoduro de 1,1',3,3,3',3'-hexametilindoldicarbocianina como segundo fluoróforo, estando la producción de la señal de dicho fluoróforo modulada por dicho colorante cromóforo indicador ácido-base;
- \quad
- un segundo polvo de sílice que tiene gránulos individuales, revistiendo dicho segundo fluoróforo dichos gránulos de dicho segundo polvo de sílice para proporcionar sílice revestida con dicho segundo fluoróforo; siendo dicho segundo polvo de sílice de menor densidad que dicho primer polvo de sílice;
- \quad
- una matriz polímera en donde en donde dicho cromóforo indicador ácido-base está uniformemente distribuido y dichas sílices revestidas con fluoróforos están segregadas una de la otra dentro de dicha matriz polímera debido a las diferentes densidades de dicho primer polvo de sílice y dicho segundo polvo de sílice;
proporcionar un dispositivo de lectura de
fluorescencia que tiene al menos un primer elemento sensor y un
segundo elemento sensor; estando dicho primer elemento sensor
sintonizado a la misma longitud de onda de dicho primer fluoróforo
y estando dicho segundo elemento sensor sintonizado a la misma
longitud de onda de dicho segundo fluoróforo;
proporcionar un microorganismo para
monitorizar;
exponer dicho microorganismo a dicha formulación
de sensor en presencia de dicho dispositivo de lectura de
fluorescencia; y
registrar la respuesta de dicho primer elemento
sensor y dicho segundo elemento sensor a dicho microorganismo.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Un método para monitorizar los efectos de una
composición sobre el metabolismo de un microorganismo, que
comprende:
proporcionar una formulación de sensor,
comprendiendo dicha formulación:
- \quad
- pentahidrato de dicloruro de tris(4,7-difenil-1,10-fenantrolina)rutenio como primer fluoróforo, siendo dicho fluoróforo sensible a cambios en la concentración de oxígeno en una composición de gases;
- \quad
- un primer polvo de sílice que tiene gránulos individuales, revistiendo dicho fluoróforo dichos gránulos de dicho primer polvo de sílice para proporcionar un primera sílice revestida con fluoróforo,
- \quad
- un colorante cromóforo indicador ácido-base seleccionado de rojo cresol y azul brometilol, siendo dicho colorante indicador ácido-base sensible a cambios en la concentración de dióxido de carbono en una composición de gases;
- \quad
- el colorante yoduro de 1,1',3,3,3',3'-hexametilindoldicarbocianina como segundo fluoróforo, teniendo dicho segundo fluoróforo una producción de señal modulada por dicho colorante cromóforo indicador ácido-base;
- \quad
- un segundo polvo de sílice que tiene gránulos individuales, revistiendo dicho segundo fluoróforo dichos gránulos de dicho segundo polvo de sílice para proporcionar sílice revestida con dicho segundo polvo de sílice; siendo dicho segundo polvo de sílice de menor densidad que dicho primer polvo de sílice;
- \quad
- una matriz polímera en donde dicho cromóforo indicador ácido-base está uniformemente distribuido y dichas sílices revestidas de fluoróforo están segregadas una de la otra dentro de dicha matriz polímera debido a las diferentes densidades de dicho primer polvo de sílice y dicho segundo polvo de sílice;
proporcionar un dispositivo de lectura de
fluorescencia que tiene al menos un primer elemento sensor y un
segundo elemento sensor; estando dicho primer elemento sensor
sintonizado a la misma longitud de onda de dicho primer fluoróforo
y estando dicho segundo elemento sensor sintonizado a la misma
longitud de onda de dicho segundo fluoróforo;
proporcionar un microorganismo para
monitorizar;
exponer dicho microorganismo a dicha formulación
de sensor en presencia de dicho dispositivo de lectura de
fluorescencia; y
registrar la respuesta de dicho primer elemento
sensor y dicho segundo elemento sensor a dicho microorganismo.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Uso de una formulación, que comprende:
- \quad
- pentahidrato de dicloruro de tris(4,7-difenil-1,14-fenantrolina)rutenio como primer fluoróforo y el colorante yoduro de 1,1',3,3,3',3'-hexametilindoldicarbocianina como segundo fluoróforo; un colorante cromóforo indicador ácido-base seleccionado de rojo cresol y azul brometilol; y
- \quad
- una matriz de polímero,
en donde dicho colorante cromóforo y dichos al
menos dos fluoróforos se mezclan dentro de dicha matriz de polímero
antes de la polimerización de dicha matriz como un sensor para
monitorizar simultáneamente al menos dos componentes de una
composición de gases.
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