ES2336345T3 - Determinacion de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrofilos (ngal) como marcador de diagnostico para trastornos renales. - Google Patents

Abstract

Un método de diagnóstico, seguimiento o determinación de la probabilidad de un trastorno renal en un ser humano, en donde dicho método discrimina entre un trastorno renal y una afección que no afecta a los riñones, dicho método comprende los pasos de i) determinar la concentración de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) humana en una muestra de un fluido corporal del ser humano, ii) comparar dicha concentración con un valor de corte predeterminado, dicho valor de corte es de 250 ng/mL o un valor más alto, tal como un valor entre 250 ng/mL y 525 ng/mL, elegido para excluir concentraciones menores de NGAL asociadas con afecciones que no afectan a los riñones, en donde una concentración por encima del valor de corte es indicativa de un trastorno renal.

Description

Determinación de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) como marcador de diagnóstico para trastornos renales.

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a métodos para el diagnóstico y seguimiento de enfermedades humanas por medio de la medida en un fluido corporal de la lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) humana, la concentración anormal de la cual es indicativa de una enfermedad o grupo de enfermedades, en este caso trastornos del riñón que producen función renal disminuida, incluyendo los causados por lesión isquémica (debido a suministro sanguíneo deteriorado al riñón) o exposición a agentes nefrotóxicos o rechazo de un riñón trasplantado. Los métodos son particularmente útiles para la detección temprana de la respuesta renal a lesión isquémica, las consecuencias clínicas o patológicas de la cual típicamente son insuficiencia renal aguda (IRA), necrosis tubular aguda (NTA) o nefropatía tubulointersticial aguda (NTIA), y también se pueden usar para seguir el curso de trastornos renales incluyendo la respuesta a medidas terapéuticas.

Antecedentes de la invención

La detección de lesión isquémica renal que puede producir IRA, NTA ó NTIA ha dependido hasta ahora de los signos clínicos, tales como oliguria y retención de líquidos, combinado con los resultados de pruebas químicas en sangre y orina que muestran una baja excreción de sodio, niveles de creatinina y urea en sangre aumentados y crecientes y, si se mide, una baja depuración de creatinina. Estos signos son indicativos de la presencia de la afección establecida. También se han analizado varios marcadores urinarios de daño tubular renal. De éstos, alfa 1-microglobulina, beta 2-microglobulina (Penders y Delanghe, JR, 2004) y N-acetil-beta-D-glucosaminidasa (NAG) (Kotanko et al., 2000) están aumentados en casos de NTA establecida, pero pueden aparecer sólo 4 ó 5 días después de lesión isquémica o tóxica en animales experimentales. La molécula de lesión renal 1 (KIM-1) también está aumentada en la orina de pacientes con NTA, pero la evolución temporal, aunque probablemente temprana, no se ha establecido en pacientes humanos (Han et al., 2002). La proteína rica en cisteína 61 (CYR61) alcanza un máximo en orina de 6 a 9 horas después de la lesión isquémica en animales experimentales (Muramatsu et al., 2002). Sin embargo, los niveles en seres humanos son todavía desconocidos. Otros marcadores que se han estudiado incluyen clusterina (Aulitzky et al., 1992) y prostaglandina D-sintasa de tipo lipocalina (L-PGDS) (Tsuchida et al., 2004); su utilidad para el diagnóstico temprano o predicción de NTA aún no está clara. Como resultado de la evolución temporal en general lenta de la aparición de estas moléculas marcadoras en orina después de exponer el riñón a isquemia o agentes nefrotóxicos, no han entrado en el uso general para el diagnóstico temprano o trastornos renales inmediatos producidos por estas lesiones.

La lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) también se conoce como lipocalina de neutrófilos (NL; HNL en el caso de lipocalina de neutrófilos humana), lipocalina 2 (LCN2), proteína de 25 kDa relacionada con la alfa 2-microglobulina (en rata) o 24P3 (en ratón). En rata, también se ha denominado, lipocalina relacionada con neu (NRL), ya que su gen se sobreexpresa en tumores mamarios iniciados por el oncogén neu (HER2/c-erbB-2) (Stoesz y Gould, 1995). NGAL es una glicoproteína de 25 kDa aislada primero de los gránulos de leucocitos polimorfonucleares (Triebel et al., 1992; Kjeldsen et al., 1993). Contiene un puente disulfuro y forma una proporción de dímeros y una proporción de menor de trímeros. Está asociada con la colagenasa humana de tipo IV de neutrófilos de 92 kDa, también llamada metaloproteinasa de matriz 9 (MMP-9) o gelatinasa B, bien como monómero formando un complejo de aparentemente 115 kDa (Monier et al., 2000; Yan et al., 2001) o como dímero, formando un complejo de aparentemente 125 kDa (Yan et al., 2001). Se han identificado estos complejos en la orina de pacientes con varios cánceres, incluyendo cánceres de la próstata, vejiga, riñón y mama.

WO2004/088276 A2 describe la determinación de la probabilidad de desarrollar un trastorno renal en un ser humano, en donde se determina la concentración relativa de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) humana en asociación con creatinina y por lo que un nivel elevado que está por encima de un nivel de corte, que es "niveles detectables frente a niveles no detectables en orina", es indicativo de un trastorno renal.

NGAL se dio a conocer inicialmente como un marcador de activación de neutrófilos, que se libera a la sangre cuando los microorganismos invasores, en particular bacterias piógenas, causan la desgranulación de los neutrófilos y la exocitosis de las proteínas de los gránulos. Como tal, se cree que la medida de los niveles elevados de NGAL en una muestra de plasma o suero de un ser humano es indicativa de que el individuo padece una inflamación, especialmente una producida por una infección bacteriana (Venge, 2000; patente de EE. UU. 6136526; solicitud de PCT WO95/29404). A este respecto, pero en contradicción con su derivación específica de neutrófilos reivindicada, se identificó NGAL (24P3) como una proteína de fase aguda de tipo 1 en ratón, donde su expresión esta principalmente localizada en el hígado durante la respuesta de fase aguda (Liu y Nilsen-Hamilton, 1995).

La solicitud de patente de EE. UU. 2004/0219603 describe el uso de NGAL como un biomarcador en orina para detectar el inicio temprano de la lesión celular tubular renal. Sin embargo, no se describe si o cómo se puede discriminar la lesión celular tubular renal de la inflamación sistémica o infección bacteriana como la causa del nivel elevado de NGAL.

Compendio de la invención

Se ha encontrado ahora de forma sorprendente que los niveles de NGAL debidos a lesión renal en general son más altos que los niveles de NGAL producidos por afecciones inflamatorias, infecciosas o cancerosas que no afectan a la función renal. Esto ha permitido el establecimiento de métodos para el diagnóstico y/o seguimiento de un trastorno renal en un paciente que distingue trastornos renales de otros trastornos que no afectan al riñón. Mediante trastorno renal se quiere decir cualquier alteración de la función, incluyendo las correlaciones estructurales y ultraestructurales de esa alteración, bien del riñón como un todo o de una o más estructuras celulares de las que se compone, que va más allá de los mecanismos reguladores que mantienen el estado saludable normal. Ejemplos no exclusivos de tales trastornos incluyen afecciones asociadas con isquemia renal tales como necrosis tubular aguda (NTA) o nefropatía tubulointersticial aguda (NTIA), y también incluye insuficiencia renal agua (IRA) o insuficiencia renal crónica (IRC) de cualquier causa, glomerulonefritis agua y crónica de cualquier causa, nefropatía debida a obstrucción urinaria, nefropatía debida a hipertensión, nefropatía asociada con pre-eclampsia o toxemia de embarazo, rechazo o enfermedad recurrente de un riñón trasplantado, así como enfermedades congénitas y neoplásicas del riñón.

Según esto, la presente invención proporciona métodos para el diagnóstico y/o seguimiento de lesión renal en seres humanos, que comprende medir un nivel de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) humana en una muestra de fluido corporal, preferiblemente orina, obtenida del paciente. Los niveles elevados de NGAL son indicativos de lesión renal si son mayores que los niveles menos elevados especificados de NGAL producidos en otros trastornos que no afectan necesariamente a la función renal, tales como afecciones inflamatorias o infecciosas o cánceres. De esta manera, en un primer aspecto, la invención se refiere a un método de diagnóstico, seguimiento o determinación de la probabilidad de un trastorno renal en un ser humano, en donde dicho métodos discrimina entre un trastorno renal y otra afección que no afecta al riñón, dicho método comprende los pasos de

i)

determinar la concentración de NGAL humana en una muestra de un fluido corporal del ser humano,

ii)

comparar dicha concentración con un valor de corte predeterminado, dicho valor de corte es de 250 ng/ml o mayor, tal como un valor entre 250 ng/ml y 525 ng/ml, elegido para excluir las concentraciones menores de NGAL asociadas con afecciones que no afectan al riñón, en donde una concentración por encima del valor de corte es indicativa de un trastorno renal.

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Además, los métodos presentes permiten la discriminación entre diferentes grados de trastorno renal. De esta manera, por ejemplo, en una forma de realización, el método de la invención comprende un paso adicional de comparar dicha concentración con un segundo valor de corte, dicho segundo valor de corte se elige para excluir concentraciones menores de NGAL asociadas con un menor grado de trastornos renales que es improbable que requieran tratamiento mediante diálisis, en donde una concentración por encima del valor de corte es indicativa de un trastorno más grave que es probable que requiera tratamiento por diálisis.

El análisis de otras moléculas marcadoras para lesión renal que pueden producir IRA, NTA o NTIA no ha entrado en el uso clínico de rutina, ya que estos otros marcadores aparecen en la orina muy tarde en el curso del desarrollo del trastorno renal para ser útiles en alertar al médico del desarrollo del trastorno o guiar medidas preventivas o terapéuticas. Este problema se ha resuelto mediante la presente invención que usa el análisis de NGAL en muestras humanas tal como orina para detectar el desarrollo de trastornos renales según las reivindicaciones.

Los estudios animales sugieren que este es el marcador más temprano de lesión renal que aparece en orina, con niveles en orina que aumentan a las 2 ó 3 horas después del inicio de la lesión. El análisis de la NGAL en orina ofrece de esta manera un método de detectar lesión renal que puede producir IRA, NTA o NTIA, discriminándola de otros trastornos, y, si la velocidad de evolución lo permite, instituyendo las medidas apropiadas para invertir el proceso.

Los niveles de NGAL se determinan preferiblemente mediante un método inmunoquímico. Los ejemplos de tales métodos incluyen, pero no están limitados en ningún modo a ELISA sándwich (enzimoinmunoanálisis de adsorción), un método de flujo lateral, o una tira reactiva.

Descripción de las figuras

Figura 1

Curva de eficacia diagnóstica (ROC) para los valores máximos de NGAL en orina con respecto al diagnóstico de afección renal en 60 pacientes adultos ingresados en la unidad de cuidados intensivos de un hospital. Sólo se incluyeron los pacientes que se pudieron clasificar a partir de otros datos como que tenían o no tenían afección renal.

Figura 2

Curva de eficacia diagnóstica (ROC) para los valores máximos de NGAL en plasma con respecto al diagnóstico de afección renal en los mismos pacientes que en la figura 1.

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Figura 3

Curva de eficacia diagnóstica (ROC) para los valores máximos de NGAL en orina con respecto al diagnóstico de requerimiento de diálisis en 32 pacientes adultos ingresados en la unidad de cuidados intensivos de un hospital y diagnosticados clínicamente como que tienen afección renal.

Figura 4

Evolución temporal de los valores de NGAL en orina y creatinina en plasma en un paciente anciano hombre operado de gravedad para la rotura de un aneurisma aórtico abdominal.

Figura 5

Evolución temporal de los valores de NGAL en orina y creatinina en plasma en una paciente mujer que desarrolló septicemia que no afectó a la función renal. Se muestran el nivel de corte de NGAL en orina (329 ng/ml) para el diagnóstico de afección renal y el límite superior de normal para creatinina en plasma en mujeres (0,088 mmol/L).

Descripción detallada de la invención

Se ha encontrado que las concentraciones de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) humana en muestras de orina humana sólo están moderadamente influidas por los estados infecciosos o inflamatorios. Sin embargo, los niveles de NGAL están marcadamente elevados en trastornos renales atribuidos a lesión isquémica y el aumento de NGAL es particularmente alto en NTA. Además, se ha encontrado ahora que los niveles en suero o plasma de NGAL no reflejan necesariamente estados infecciosos o inflamatorios, y pueden aumentar incluso cuando el recuento de neutrófilos en sangre es extremadamente bajo, como puede suceder en leucemias o como consecuencia del tratamiento de la leucemia. De hecho existe una estrecha correlación entre la concentración de NGAL en suero o plasma humano y la concentración de NGAL en orina cuando se analizan en muestras puntuales de sangre y orina de pacientes críticamente enfermos seleccionados al azar, mientras que hay correlaciones muy malas de estos niveles con el recuento de neutrófilos en sangre periférica o la concentración de proteína C reactiva, una proteína de fase aguda que se usa normalmente como marcador de inflamación. De esta manera, sin estar unidos por una teoría particular, se puede hipotetizar que los riñones producen NGAL en respuesta a isquemia y otras influencias capaces de estimular la expresión renal de NGAL, y no sólo se libera en grandes cantidades en la orina, sino también en la sangre, confundiendo de esta manera el uso de las determinaciones de NGAL en suero o plasma como un marcador de inflamación o de infección bacteriana como se explica en la patente de EE. UU. 6136526.

Según esto, la presente invención se refiere a medidas de NGAL en una muestra de fluido corporal, preferiblemente orina humana de la que se han eliminado los neutrófilos, como un marcador de trastornos renales, especialmente los debidos a isquemia renal o agentes nefrotóxicos. En la presente invención, para que la concentración de NGAL sea específicamente indicativa de trastorno renal, debe exceder un valor de corte ajustado para excluir esas concentraciones más bajas de NGAL que pueden resultar de estados infecciosos o inflamatorios o carcinomas que no dan lugar a lesión renal.

El método de la presente invención en una forma de realización comprende los pasos de medir la concentración de NGAL humana en una muestra de orina, preferiblemente centrifugada para eliminar los neutrófilos, del individuo a ser diagnosticado, y comparar la concentración medida con un valor de corte seleccionado determinado para que supere esas concentraciones en orina encontradas en seres humanos que no tienen trastorno renal, pero que pueden estar aparentemente sanos o tener otros trastornos incluyendo afecciones inflamatorias, infecciones bacterianas o carcinomas. Si la concentración de NGAL medida supera el nivel de corte, esto es una indicación de que el ser humano ha sufrido lesión renal y puede desarrollar o ha desarrollado IRA, NTA o NTIA.

El nivel de corte por debajo del cual el nivel de NGAL en orina no puede ser diagnóstico de lesión renal con un grado aceptable de especificidad porque tal nivel se puede encontrar en individuos sanos o en los que padecen afecciones inflamatorias, infecciosas o cancerosas es preferiblemente un nivel de 250 ng/mL o más, tal como un valor entre 250 ng/mL y 525 ng/mL, tal como 275 ng/mL, o 300 ng/mL, o 325 ng/mL, o 350 ng/mL, o 375 ng/mL, o 400 ng/mL, o 425 ng/mL, o 450 ng/mL, o 475 ng/mL o 500 ng/mL. En otro ejemplo, el valor de corte usado es un valor de 1 \mug/mL o un valor mayor. Preferiblemente, el valor predictivo positivo para el valor de corte en orina es el 80% o más, tal como el 85% o más, por ejemplo, el 90% o más. De forma alternativa, o además, el valor predictivo negativo para el valor de corte en orina es preferiblemente del 80% o más, tal como del 85% o más, por ejemplo del 90% o más.

En otra forma de realización, la presente invención comprende los pasos de medir la concentración de NGAL humana en una muestra de plasma o suero del individuo a ser diagnosticado, y comparar la concentración medida con un valor de corte seleccionado determinado para que supere esas concentraciones de plasma o suero encontradas en seres humanos que no tienen trastorno renal, pero que pueden estar aparentemente sanos o tener otros trastornos incluyendo afecciones inflamatorias, infecciones bacterianas o carcinomas. Si la concentración de NGAL medida supera el nivel de corte, esto es una indicación de que el ser humano ha sufrido lesión renal y puede desarrollar o ha desarrollado IRA, NTA o NTIA.

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El nivel de corte para la concentración de NGAL en plasma o suero es similar a aquel para orina y es preferiblemente un nivel de 250 ng/mL o más, por ejemplo 300 ng/mL o un valor mayor, o un valor entre 250 ng/mL y 525 ng/mL, tal como 275 ng/mL, o 300 ng/mL, o 325 ng/mL, o 350 ng/mL, o 375 ng/mL, o 400 ng/mL, o 425 ng/mL, o 450 ng/mL, o 475 ng/mL o 500 ng/mL. Preferiblemente, el valor predictivo positivo para el valor de corte en plasma es el 80% o más, tal como el 85% o más, por ejemplo, el 90% o más. De forma alternativa, o además, el valor predictivo negativo para el valor de corte en plasma es preferiblemente del 80% o más, tal como del 85% o más, por ejemplo del 90% o más.

El método se puede usar para distinguir lesiones renales graves que probablemente requieran alguna forma de diálisis, que típicamente dan lugar a niveles muy altos en orina de NGAL, de lesiones renales menos graves que pueden requerir sólo ocasionalmente diálisis, que típicamente dan lugar a aumentos menores de NGAL en orina.

De esta manera, un segundo nivel de corte, más alto, por debajo del cual el nivel en orina de NGAL no es predictivo de requerimiento de diálisis pero es diagnóstico para un grado menor de lesión renal, es preferiblemente un nivel entre 1000 ng/mL y 3000 ng/mL, tal como 1250 ng/mL, o 1500 ng/mL, o 1750 ng/mL, o 2000 ng/mL, o 2250 ng/mL, o 2500 ng/mL, o 2750 ng/mL. Preferiblemente, el valor predictivo positivo para el valor de corte mayor es del 80% o más, tal como del 85% o más, por ejemplo, del 90% o más. De forma alternativa, o además, el valor predictivo negativo para el valor de corte mayor es preferiblemente del 70% o más.

Un aspecto adicional es que el método se puede usar para detectar el inicio de la afección renal en un paciente que está en observación y/o tratamiento para otra enfermedad que puede o no ella misma estar asociada con un aumento de niveles de NGAL en líquidos corporales, y en el que la afección renal es una posible complicación. En esta situación las concentraciones de NGAL en orina o plasma o suero que se asocian con la afección subyacente del paciente se pueden seguir a diario o a intervalos más cortos, y el inicio de la afección renal estará indicado por un aumento en la concentración de NGAL en orina o plasma o suero sobre los niveles anteriores. En estas circunstancias, la magnitud del aumento en las concentraciones de NGAL indicativas del inicio de la afección renal es preferiblemente de 50 ng/mL o más, tal como 100 ng/mL o más, por ejemplo, 150 ng/mL o más, tal como 200 ng/mL o más, por ejemplo, 300 ng/mL o más, tal como 400 ng/mL o más, por ejemplo 500 ng/mL o más.

Un aspecto adicional es que el método se puede usar para seguir el curso de afecciones renales que dan lugar a niveles de NGAL aumentados, tanto en su evolución natural como en respuesta a medidas terapéuticas. En estas circunstancias, el cambio en los niveles de NGAL reflejará el estado de la lesión o regeneración renal, siempre que cualquier afección inflamatoria, infecciosa o cancerosa simultánea permanezca relativamente estable durante el periodo de seguimiento. Los intervalos a los que se toman los líquidos corporales para el seguimiento pueden ser cortos, proporcionando de esta manera la indicación más temprana posible de lesión renal y permitiendo así la institución temprana de medidas terapéuticas. El seguimiento de los niveles de NGAL en líquidos corporales para detectar afección renal preferiblemente se lleva a cabo a intervalos de no más de 24 horas, y más preferiblemente a intervalos más cortos hasta un periodo sugerido de no más de 3 horas, o incluso más corto por ejemplo si se sabe que se ha producido una lesión, por ejemplo durante un procedimiento quirúrgico.

La medida de NGAL humana en una muestra de fluido corporal, tal como una muestra de orina, se puede realizar por cualquier método que proporcione especificidad, sensibilidad y precisión analíticas satisfactorias. Los métodos preferidos son ensayos de unión usando una o más moléculas de unión específicas para NGAL humana. Tales moléculas de unión incluyen, pero no están limitadas a, anticuerpos policlonales o monoclonales contra NGAL o moléculas especificas de unión a NGAL generadas por otros medios.

En un método preferido, se usan anticuerpos monoclonales generados contra NGAL recombinante humana. Se une un anticuerpo a un soporte sólido para capturar NGAL de una muestra, tal como una muestra de orina, mientras que el otro se une a un marcador tal como un complejo colorante o biotina o una enzima que se puede detectar mediante cualquiera de muchos métodos que conocen los expertos en la materia. El soporte sólido puede ser, por ejemplo una superficie de poliestireno o cloruro de polivinilo para enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), o partículas de látex (poliestireno), o un filtro sinterizado compuesto de partículas de polietileno comprimidas, o una matriz de nitrocelulosa porosa o de hecho cualquier soporte adecuado usado en análisis inmunoquímicos.

Un medio preferido para medir NGAL en una muestra de orina humana comprende una prueba de tira reactiva, de flujo lateral o de minicolumna, que permite el análisis rápido, cerca del paciente de una muestra. Como entenderá el experto en la materia al leer esta divulgación, sin embargo, se pueden usar otros medios para medir NGAL.

El método de la invención no comprende un paso quirúrgico, terapéutico o diagnóstico practicado en el cuerpo humano o del animal.

Se proporcionan los siguientes ejemplos no limitantes apara ilustrar adicionalmente la presente invención.

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Ejemplos Ejemplo 1 Prueba de tira reactiva para NGAL

Se recubre el área analítica de una tira reactiva comprendida de una superficie de poliestireno con un anticuerpo de captura contra NGAL humana. Se añade una alícuota de la muestra centrifugada y diluida a una solución de anticuerpo de detección marcado con enzima contra NGAL en el primer tubo, en el que se sumerge la tira reactiva. Los complejos de anticuerpo de detección marcado con enzima con NGAL se unen a la tira reactiva, que se lava luego con agua del grifo y se coloca en una solución de sustrato cromogénico en un segundo tubo. El color desarrollado en la solución de sustrato en un tiempo determinado se lee a ojo y se compara con una escala de intensidades de colores que indica la concentración de NGAL en la muestra de orina, o en un colorímetro sencillo que se puede, por ejemplo, programar para que indique la concentración de NGAL directamente.

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Ejemplo 2 Dispositivo de flujo lateral para NGAL

Se recubre un dispositivo de flujo lateral compuesto de una tira de nitrocelulosa porosa cerca de su extremo distal con un anticuerpo de captura contra NGAL aplicado como una banda transversal. Se coloca una banda transversal adicional de anticuerpo contra los anticuerpos de la especie de la que deriva el anticuerpo de detección de forma distal a la banda de anticuerpo de captura y sirve como un control de la función de la tira. El extremo proximal de la tira contiene el anticuerpo de detección contra NGAL adsorbido o unido a partículas de poliestireno marcadas o partículas de complejo colorante. Cuando se aplica una alícuota de la muestra de orina centrifugada al extremo proximal de la tira, las partículas marcadas unidas al anticuerpo de detección viajan a lo largo de la tira por atracción capilar. Cuando alcanzan la banda de anticuerpo de captura, sólo se retendrán aquellas partículas que hayan unido NGAL, dando lugar a una banda detectable. Las partículas que alcanzan la banda control de anticuerpo contra el anticuerpo de detección producirán una banda detectable hayan unido NGAL o no. La intensidad de las bandas marcadas se puede leer a ojo en el caso de partículas coloreadas o por medio del dispositivo de detección apropiado para el marcador usado. Un resultado positivo está indicado por el desarrollo de color o la acumulación de marcador en ambas bandas, mientras que un resultado negativo está indicado por el desarrollo de color u otro marcador sólo en la banda control. La falta del desarrollo de color u otro marcador en la banda control indica una función inadecuada de la tira. La sensibilidad de la prueba se puede regular mediante la dilución de la muestra aplicada, que se ajusta de modo que sólo las concentraciones de NGAL por encima de los valores de corte determinados den lugar a un resultado positivo. La sensibilidad de la prueba también se puede ajustar uniendo el anticuerpo de detección a una mezcla de partículas marcadas y sin marcar. Se pueden precalibrar lotes de tiras y equipar con un código de calibración que pueda leer el dispositivo de detección, de modo que se pueda leer del dispositivo un resultado cuantitativo o semicuantitativo. Son posibles muchas variaciones de los aspectos individuales de esta tecnología de flujo lateral, como saben los expertos en la materia.

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Ejemplo 3 Prueba en minicolumna de NGAL

Una minicolumna contiene una frita hecha de partículas de polietileno comprimidas que permiten el paso de líquido y células. La frita se recubre con anticuerpo de captura contra NGAL humana. La minicolumna se incorpora en un dispositivo, que por medio de manejo automatizado de líquido permite que se aplique la muestra diluida a una velocidad de flujo y volumen fijados, seguido por detección del anticuerpo en complejo con colorante. Después de pasar solución de lavado, se lee la intensidad de color de la frita por fotometría de difusión de luz. Los lotes de fritas se precalibran y las minicolumnas se equipan con un código de calibración que puede leer el dispositivo, de modo que el instrumento puede mostrar un resultado cuantitativo sin necesidad de calibración anterior con patrones.

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Ejemplo 4 ELISA sándwich de NGAL

Se preparó NGAL recombinante humana purificada para su uso como estándar y como material calibrador como describen Kjeldsen et al., (1996). Los anticuerpos contra NGAL fueron los descritos por Kjeldsen et al., (1993; 1996). Se recubrieron placas de poliestireno de ELISA durante la noche a 4ºC con anticuerpo 211-1 a una concentración de 2 \mug/mL en tampón carbonato de sodio 0,05 M, pH 9,4, aplicado a 100 \muL/pocillo. Los pocillos se vaciaron, se lavaron 3 veces con tampón de lavado de solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, que contenía Tween 20 al 0,05%, y se transfirieron. Se aplicaron a los pocillos diluciones del calibrador y muestras en tampón de dilución (tampón de lavado que contenía albúmina bovina a 0,1 mg/mL) en volúmenes de 100 \muL y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en un mesa con agitación. Los pocillos se vaciaron después, se lavaron y se transfirieron como antes. Se añadió anticuerpo 211-2 biotinilado a 0,25 \mug/mL en tampón de dilución a cada pocillo a 100 \muL/pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en una mesa con agitación. Los pocillos se vaciaron después, se lavaron y se transfirieron como antes. Se añadió un complejo de peroxidasa de rábano y estreptavidina (Zymed, CA) a una dilución de 1/2000 en tampón de dilución a cada pocillo a 100 \muL/pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en una mesa con agitación. Los pocillos se vaciaron después, se lavaron y se transfirieron como antes. Se aplicó luego una solución sustrato que contenía tetrametilbencidina y peróxido (TMB-ONE, Kem-En-Tech, Dinamarca) a cada pocillo a 100 \muL/pocillo y se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad durante exactamente 8 minutos, después de lo cual se paró la reacción de color añadiendo 50 \muL de ácido sulfúrico 1 M a cada pocillo. Se midieron después las absorbancias de luz de los pocillos a una longitud de onda de 450 nm en un lector de placas de ELISA, restando las absorbancias de luz a 650 nm. Se calcularon las concentraciones de NGAL en las muestras a partir de la curva patrón generada de las lecturas de la absorbancia de luz de los calibradores de concentración conocida.

El ensayo tenía un intervalo de 0,02 ng/mL a 1 ng/mL, con un límite de detección (límite de confianza de diferencia de cero del 95%) de 2,4 pg/mL, y mostró paralelismo entre diluciones de calibrador purificado y muestras. La concentración de NGAL fue de 90 ng/mL en una mezcla de suero humano normal y de 5,4 ng/mL en una mezcla de orina humana normal.

Los ejemplos adicionales muestran las correlaciones clínicas y paraclínicas, junto con una estimación del valor diagnóstico con respecto a trastorno renales, de la determinación de NGAL en suero o plasma y en orina de pacientes adultos sin seleccionar ingresados en la unidad de cuidados intensivos de un hospital. Se determinó NGAL mediante un ELISA sándwich similar en todos los detalles esenciales al descrito en el ejemplo 4 anteriormente.

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Ejemplo 5 Correlaciones clínicas y paraclínicas iniciales

Se muestran las concentraciones de NGAL en muestras puntuales únicas de orina y suero de 11 pacientes adultos no seleccionados ingresados en la unidad de cuidados intensivos de un hospital en la tabla 1, donde se comparan con datos clínicos y paraclínicos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Concentraciones de NGAL en orina y suero de 11 pacientes: correlaciones con datos clínicos y paraclínicos

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Todos los pacientes tenían concentraciones elevadas en orina de NGAL. Había una correlación muy estrecha entre los niveles de NGAL en suero y en orina, pero sólo una correlación moderada entre NGAL en orina y creatinina en plasma. El caso que se diagnosticó clínicamente como NTA se caracterizó por NGAL en orina extraordinariamente alta a un tiempo donde no hubo aumento significativo de creatinina en plasma. La mala correlación entre NGAL en suero y el recuento de neutrófilos muestra que NGAL en suero no es un reflejo de la neutrofilia. En particular, NGAL tanto en orina como en suero aumentaron en el paciente no. 3, con un recuento de neutrófilos de sólo 2,0 x 10^{9}/mL debido a la leucemia linfática aguda, y en el paciente no. 6, con un número de neutrófilos incontablemente bajo debido a la leucemia mieloide aguda. Además, la falta de correlación con CRP muestra que NGAL-s no es sólo una proteína de fase aguda. Los análisis repetidos de muestras almacenadas mostraron que NGAL puede tener una estabilidad limitada en muestras de orina, mientras que es más estable en muestras de suero. Los resultados sugieren que NGAL se produce en daño de órganos, particularmente, pero no sólo, por los riñones. Se vierte a la sangre y se excreta en la orina. Sin embargo, la NGAL renal en NTA también pasa directamente a la orina para producir una concentración de NGAL en orina muy alta.

Los pacientes nos. 3 y 4, que en el momento del muestreo no tenían diagnóstico clínico de trastorno renal y cuya creatinina-p estaba a ese tiempo en el intervalo normal, tenían niveles de NGAL en orina que eran mayores que los del paciente no. 2, que estaba recibiendo hemodiálisis para la anuria después de la ruptura de un aneurisma aórtico. Los dos pacientes (nos. 3 y 4) podían haber desarrollado lesión isquémica renal debido a sus infecciones graves, precediendo el aumento en NGAL en orina a cualquier aumento en creatinina-p, como también se observó en el paciente no. 5, que se diagnosticó clínicamente como que tenía NTA.

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Ejemplo 6 Poder de diagnóstico con respecto a trastornos renales de las determinaciones de NGAL en orina y plasma en pacientes adultos no seleccionados ingresados en cuidados intensivos

Se determinó NGAL en muestras de orina y plasma recogidas cada mañana de 109 pacientes consecutivos ingresados en la unidad de cuidados intensivos de un hospital. En base a los informes de alta y los resultados de análisis de sangre rutinarios, fue posible clasificar (sin conocimiento previo respecto a los datos de NGAL) 60 de estos pacientes en aquellos con y sin una afección renal durante su ingreso. Los datos incompletos hicieron imposible clasificar los 49 pacientes restantes con suficiente seguridad, y estos pacientes se excluyeron del análisis. Las concentraciones máximas de NGAL en orina y plasma de los 60 pacientes clínicamente clasificables se dan en la tabla 2. El poder de diagnóstico con respecto a afección renal de la concentración máxima de NGAL alcanzada en orina y plasma de cada paciente clasificado de determinó después representando curvas de eficacia diagnóstica (ROC) para los valores en orina y plasma. También se representaron los valores de NGAL en orina y plasma de las evoluciones diarias para cada paciente y se compararon con datos paraclínicos tales como los valores de creatinina en plasma.

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TABLA 2 Concentraciones máximas de NGAL en plasma y orina de 60 pacientes ingresados en cuidados intensivos que fueron clínicamente clasificables como con o sin afección renal

2

3

La figura 1 muestra la curva ROC para los valores máximos de NGAL en orina con respecto al diagnóstico de afección renal. El área bajo la curva fue de 0,930 y se determinó que el valor de corte por debajo del cual la concentración de NGAL en orina no es diagnóstica de trastorno renal estaba entre 370 ng/mL y 329 ng/mL. Con un valor de corte en este intervalo la sensibilidad del diagnóstico fue del 96,9%, la especificidad del diagnóstico fue del 89,3%, el valor predictivo positivo fue del 91,2% y el valor predictivo negativo fue del 96,2%.

La figura 2 muestra la curva ROC para los valores máximos de NGAL en plasma con respecto al diagnóstico de afección renal. El área bajo la curva fue de 0,914 y se determinó que el valor de corte por debajo del cual la concentración de NGAL en plasma no es diagnóstica de trastorno renal estaba entre 436 ng/mL y 355 ng/mL. Con un valor de corte en este intervalo la sensibilidad del diagnóstico fue del 84,8%, la especificidad del diagnóstico fue del 96,3%, el valor predictivo positivo fue del 93,1% y el valor predictivo negativo fue del 83,9%.

Diagnóstico del requerimiento de diálisis

Los pacientes con afección renal se dividieron en dos grupos con respecto a los valores máximos de NGAL en orina observados. El primer grupo (11 pacientes) se caracterizaba por valores de NGAL en orina de 1337 ng/mL o menos, y contenía pacientes con grados menores de afección renal juzgados por otros datos clínicos y paraclínicos. En este grupo 3 pacientes recibieron alguna forma de hemodiálisis. El segundo grupo (21 pacientes) estaba caracterizado por valores de NGAL en orina de 2672 ng/mL o más y contenía 17 pacientes diagnosticados clínicamente como que tenían NTA o NTIA. En este grupo 20 pacientes requirieron alguna forma de hemodiálisis. El valor de corte por debajo del cual la concentración de NGAL en orina no es predictiva de necesidad de diálisis pero puede ser diagnóstica de un grado menor de trastorno renal está por lo tanto entre 1338 y 2672 ng/mL.

La figura 3 muestra la curva ROC para los valores máximos de NGAL en orina con respecto al diagnóstico de afección renal que requiere diálisis. El área bajo la curva fue de 0,807 y se confirmó que el valor de corte por debajo del cual la concentración de NGAL en orina no es diagnóstica de requerimiento de diálisis estaba entre 1338 ng/mL y 2672 ng/mL. Con un valor de corte en este intervalo la sensibilidad del diagnóstico fue del 87,0%, la especificidad del diagnóstico fue del 88,9%, el valor predictivo positivo fue del 95,2% y el valor predictivo negativo fue del 72,7%.

Evolución temporal de valores de NGAL

Cuando se representó la evolución temporal de los valores diarios de NGAL en orina y plasma y se comparó con los datos clínicos y paraclínicos en pacientes individuales clasificados, se observó que aumentos de 86 ng/mL, 125 ng/mL y 200 ng/mL en NGAL en orina sobre el nivel anterior estaban asociados con un deterioro de la función renal como se registra en el informe de alta o se muestra por un aumento en el nivel de creatinina en plasma. Aumentos de NGAL en orina de más de 200 ng/mL sobre el nivel anterior también se asociaron con debilitamiento de la función renal cuando estos aumentos llevan el nivel de NGAL en orina por encima del nivel de corte de 329 ng/mL. El número de pacientes que claramente mostraba este tipo de aumento intercurrente en NGAL en orina no fue lo suficientemente grande para permitir un análisis significativo del valor diagnóstico con respecto a la insuficiencia renal aguda en relación a la magnitud del aumento.

En algunos casos hubo un paralelismo entre el aumento en NGAL en orina y el aumento en la creatinina en plasma atribuido al debilitamiento de la función renal. La figura 4 muestra tal aumento paralelo en NGAL en orina y creatinina en plasma en un paciente varón anciano operado de gravedad para la ruptura de un aneurisma aórtico abdominal. Aquí la lesión isquémica a los riñones debido a la hemorragia y el pinzamiento aórtico tuvo lugar el día anterior a las primeras muestras de plasma y orina, de modo que los niveles iniciales de NGAL en orina y creatinina en plasma eran ambos indicativos de un grado de insuficiencia renal.

Un aumento en la NGAL en orina de 200 ng/mL o más sobre el valor anterior, pero hasta un valor que permanece por debajo del nivel de corte de 329 ng/mL, no es diagnóstico de insuficiencia renal aguda, ya que puede ser debido a otra afección, tal como septicemia, que no afecta necesariamente a los riñones. La figura 5 muestra tal aumento en NGAL en orina que se asoció con el desarrollo de una septicemia que no afectó a la función renal, apoyado por el hecho de que el nivel de creatinina en plasma se mantuvo bien dentro intervalo normal a lo largo del curso clínico en la unidad de cuidados intensivos.

Referencias

Aulitzky WK, Schlegel PN, Wu DF, Cheng CY, Chen CL, Li PS, Goldstein M, Reidenberg M, Bardin CW (1992) Measurement of urinary clusterin as an index of nephrotoxicity. Proc Soc Exp Biol Med 199:93-96.

Han WK, Bailly V, Abichandani R, Thadhani R, Bonventre JV (2002) Kidney Injury Molecule-1 (KIM-1): a novel biomarker for human renal proximal tubule injury. Kidney Int 62:237-244.

Kjeldsen L, Johnsen AH, Sengelov H, Borregaard N (1993) Isolation and primary structure of NGAL, a novel protein associated with human neutrophil gelatinase. J Biol Chem 268:10425-10432.

Kjeldsen L, Koch C, Arnljots K, Borregaard N (1996) Characterization of two ELISAs for NGAL, a newly described lipocalin in human neutrophils. J Immunol Methods 198:155-164.

Kotanko P, Margreiter R, Pfaller W (2000) Urinary N-acetyl-beta-D-glucosaminidase and neopterin aid in the diagnosis of rejection and acute tubular necrosis in initially nonfunctioning kidney grafts. Nephron 84:228-235.

Liu Q, Nilsen-Hamilton M (1995) Identification of a new acute phase protein. J Biol Chem 270:22565-22570.

Monier F, Surla A, Guillot M, Morel F (2000) Gelatinase isoforms in urine from bladder cancer patients. Clin Chim Acta 299:11-23.

Muramatsu Y, Tsujie M, Kohda Y, Pham B, Perantoni AO, Zhao H, Jo SK, Yuen PS, Craig L, Hu X, Star RA (2002) Early detection of cysteine rich protein 61 (CYR61, CCN1) in urine following renal ischemic reperfusion injury. Kidney Int 62:1601-1610.

Penders J, Delanghe JR (2004) Alpha 1-microglobulin: clinical laboratory aspects and applications. Clin Chim Acta 346:107-118.

Stoesz SP, Gould MN (1995) Overexpression of neu-related lipocalin (NRL) in neu-initiated but not ras or chemically initiated rat mammary carcinomas. Oncogene 11:2233-2241.

Triebel S, Blaser J, Reinke H, Tschesche H (1992) A 25 kDa alpha 2-microglobulin-related protein is a component of the 125 kDa form of human gelatinase. FEBS Lett 314:386-388.

Tsuchida T, Eguchi N, Eguchi Y, Numabe A, Nakajima H, Oda H, Seiki K, Hakamada-Taguchi R, Urade Y, Uehara Y (2004) Lipocalin-type prostaglandin D synthase in urine in adriamycin-induced nephropathy of mice. Nephron Physiol 96:42-51.

Yan L, Borregaard N, Kjeldsen L, Moses MA (2001) The high molecular weight urinary matrix metalloproteinase (MMP) activity is a complex of gelatinase B/MMP-9 and neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL). Modulation of MMP-9 activity by NGAL. J Biol Chem 276:37258-37265.

Claims (17)

1. Un método de diagnóstico, seguimiento o determinación de la probabilidad de un trastorno renal en un ser humano, en donde dicho método discrimina entre un trastorno renal y una afección que no afecta a los riñones, dicho método comprende los pasos de

i)

determinar la concentración de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) humana en una muestra de un fluido corporal del ser humano,

ii)

comparar dicha concentración con un valor de corte predeterminado, dicho valor de corte es de 250 ng/mL o un valor más alto, tal como un valor entre 250 ng/mL y 525 ng/mL, elegido para excluir concentraciones menores de NGAL asociadas con afecciones que no afectan a los riñones, en donde una concentración por encima del valor de corte es indicativa de un trastorno renal.

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2. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra es una muestra de orina.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra es una muestra de plasma o suero.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la otra afección es un trastorno inflamatorio y el valor de corte se elige para excluir concentraciones menores de NGAL asociadas con trastornos inflamatorios.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método además discrimina entre un trastorno renal y un trastorno infeccioso y el valor de corte se elige para excluir las concentraciones menores de NGAL asociadas con trastornos infecciosos.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método además discrimina entre un trastorno renal y un trastorno canceroso y el valor de corte se elige para excluir las concentraciones menores de NGAL asociadas con trastornos cancerosos.

7. El método de seguimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende el paso adicional de repetir los pasos i) y ii) una o más veces.

8. El método de seguimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende el paso adicional de repetir los pasos i) y ii) a las 24 horas, por ejemplo a las 12 horas, tal como a las 6 horas, por ejemplo a las 3 horas.

9. El método de seguimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende el paso adicional de repetir los pasos i) y ii) después de que se haya iniciado o completado un tratamiento del trastorno renal.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el trastorno renal es una lesión renal posisquémica.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el trastorno renal es un trastorno que puede producir insuficiencia renal aguda, necrosis tubular aguda o nefropatía tubulointersticial aguda.

12. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el trastorno renal está producido por un agente nefrotóxico.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende el paso adicional de comparar dicha concentración con un segundo valor de corte, dicho segundo valor de corte se elige para excluir concentraciones menores de NGAL no asociadas con un grado de trastorno renal que requiere tratamiento del paciente por diálisis, en donde una concentración por encima del valor de corte es indicativo de un trastorno renal que requiere tratamiento por diálisis.

14. El método de la reivindicación 13, en donde dicho segundo valor de corte está entre 1000 ng/mL y 3000 ng/mL, tal como 1250 ng/mL, o 1500 ng/mL, o 1750 ng/mL, o 2000 ng/mL, o 2250 ng/mL, o 2750 ng/mL.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde NGAL se mide por medio de una molécula que se une específicamente a NGAL.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el fluido corporal es orina.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el fluido corporal es sangre o plasma o suero.