ES2335588T3 - Plantas que tienen caracteristicas de crecimiento mejoradas y metodo para la elaboracion de las mismas. - Google Patents

Abstract

Un método para mejorar las características de crecimiento de una planta seleccionadas de una o más entre: un incremento en el área, un incremento del número de panículas, un incremento en altura, un incremento en el número de semillas, un incremento en el número de semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el índice de cosecha, dicho método comprendiendo un incremento en la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica a una proteína CDK de tipo B por medio de la introducción y expresión en una planta de una construcción genética que comprende un ácido nucleico para CDK de tipo B que codifica una proteína CDK de tipo B que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T.

Description

Plantas que tienen características de crecimiento mejoradas y método para la elaboración de las mismas.

La presente invención se relaciona generalmente con el campo de la biología molecular y se relaciona con un método para mejorar las características de crecimiento de las plantas. Más específicamente, la presente invención se relaciona con un método para mejorar las características de crecimiento de una planta incrementando la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica una proteína CDK (quinasa dependiente de la ciclina) tipo B por medio de la introducción y expresión en una planta de una construcción genética que contiene un ácido nucleico para CDK tipo B que codifica una proteína CDK tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de activación del bucle T. La presente invención también se relaciona con plantas obtenidas por medio de los métodos de la invención, cuyas plantas han mejorado las características de crecimiento con relación a las plantas correspondientes de tipo silvestre.

La población mundial siempre en crecimiento y la disminución de la oferta de tierras cultivables y disponibles para la agricultura estimulan la investigación agrícola con miras a mejorar la eficiencia de la agricultura. El medio convencional para realizar mejoras hortícolas y en los cultivos utiliza técnicas selectivas de reproducción para identificar plantas que tengan características deseables. Sin embargo, tales técnicas selectivas de reproducción tienen varios inconvenientes, especialmente que esas técnicas son típicamente de mano de obra intensiva y resultan en plantas que a menudo contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre terminan en el paso del rasgo deseado a partir de las plantas madre. Los avances en biología molecular le han permitido a la humanidad modificar el germoplasma de plantas y animales. La modificación por ingeniería genética de plantas implica el aislamiento y la manipulación de material genético (típicamente en la forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de ese material genético en una planta. Tal tecnología tiene la capacidad de suministrar cultivos o plantas que tienen diferentes rasgos hortícolas, agronómicos o económicos mejorados. Una característica de interés económico particular es la productividad. Normalmente se defina la productividad como la producción medible de valor económico de un cultivo. Esto se puede definir en términos de cantidad y/o de calidad. La productividad depende directamente de varios factores, por ejemplo del número y tamaño de los órganos, de la arquitectura de la planta (por ejemplo, del número de ramificaciones), de la producción de semilla y más. El desarrollo de raíces, la ingesta de nutrientes y la tolerancia al estrés son también factores importantes en la determinación de la productividad. Los tipos de estrés típicos a los cuales están sometidos las plantas incluyen estrés ambiental (abiótico) (tal como el estrés por temperatura causado por temperaturas atípicas altas o bajas; estrés causado por deficiencia e nutrientes; estrés causado por deficiencia de agua (sequía) y estrés biótico (que puede ser impuesto a las plantas por otras plantas (malas hierbas), plagas de animales y patógenos). Se puede incrementar la productividad de un cultivo no solamente por medio de la optimización de uno de los factores anteriormente mencionados, sino también por medio de la modificación de los mecanismos inherentes al crecimiento de una planta.

El mecanismo inherente de crecimiento de una planta reside en una secuencia altamente ordenada de eventos colectivamente conocidos como el "ciclo celular". La progresión a través del ciclo celular es fundamental para el crecimiento y desarrollo de todos los organismos multicelulares y es crucial para la proliferación celular. Los componentes principales del ciclo celular son altamente conservados en levaduras, mamíferos y plantas. El ciclo celular típicamente se divide en las siguientes fases secuenciales: G0 - G1 - S - G2 - M. La replicación o síntesis del ADN generalmente tiene lugar durante la fase S ("S" es para síntesis de ADN) y la segregación mitótica de los cromosomas ocurre durante la fase M (la "M" es para mitosis), con fases de intervención vacías, G1 (durante las cuales crecen las células antes de la replicación del ADN) y G2 (un período después de la replicación del ADN durante el cual se prepara la célula para la división). La división celular se completa después de la citoquinesis, la última etapa de la fase M. Las células que han salido el ciclo celular y que se han vuelto inactivas se dice que están en la fase G0. Las células en esta fase pueden ser estimuladas para entrar nuevamente al ciclo celular en la fase G1. La "G" en G1, G2 y G0 significa "vacío". La finalización del proceso del ciclo celular permite que cada célula hija reciba durante la división celular una copia completa del genoma de los
progenitores.

La división celular está controlada por dos eventos principales del ciclo celular, a saber, la iniciación de la síntesis del ADN y la iniciación de la mitosis. Cada transición a cada uno de estos eventos claves está controlada por un puesto de control representado por complejos específicos de proteína (involucrados en la replicación y en la división del ADN). La expresión de los genes, necesaria para la síntesis del ADN en el límite entre G1/S está regulada por la familia E2F de factores de transcripción en células de plantas y de mamíferos (La Thangue, 1994 (Curr. Opin. Cell Biol. 6 (3), 443 - 450); Muller y colaboradores, 2001 (Genes Dev. 15 (3), 267 - 285); De Veylder y colaboradores, 2002 (EMBO J. 21 (6), 1360 - 1368)). La entrada en el ciclo celular es regulada/activada por un complejo E2F/Rb que integra señales y permite la activación de la transcripción de los genes del ciclo celular. La transición entre las diferentes fases del ciclo celular, y por lo tanto el progreso a través del ciclo celular, está conducido por la formación y la activación de diferentes proteínas quinasas heterodiméricas de serina/treonina, generalmente denominadas como quinasas dependientes de la ciclina (CDK). Un prerrequisito para la actividad de estas quinasas es la asociación física con una ciclina específica, siendo muy dependiente el momento de la activación de la expresión de la ciclina. El enlazamiento de la ciclina induce cambios en la conformación en el lóbulo N-terminal de la CDK de asociación y contribuye a la localización y especificidad del sustrato del complejo. Las CDK monoméricas se activan cuando están asociadas con ciclinas y así tienen actividad de quinasa. Los niveles de proteína ciclina fluctúan en el ciclo celular y representan por lo tanto un factor principal en la determinación del momento de la activación de la CDK. La activación periódica de estos complejos que contienen ciclinas y CDK durante el ciclo celular media la regulación temporal de las transiciones del ciclo celular (puestos de control). Otros factores que regulan la actividad de la CDK incluyen inhibidores de CDK (los CKl o ICK, KIP, CIP, INKS), quinasas que activan CDK (las CAK), una CDK fosfatasa (Cdc25) y una subunidad CDK (CKS) (Mironov y colaboradores, 1999 (Plant Cell 11 (4), 509 - 522); Reed 1996 (Progressin Cell cycle Research 2, 15 - 27)).

En plantas, se han estudiado hasta ahora dos clases principales de CDK, conocidas como CDK de tipo A y de tipo B. Las CDK de tipo A regulan tanto las transiciones de G1 a S como de G2 a M, mientras que las CDK de tipo B parecen controlar únicamente el puesto de control de G2 a M (Hemerly y colaboradores, 1995 (EMBO J. 14 (16), 3925 - 3936); Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235); Porceddu y colaboradores, 2001 (J. Biol. Chem. 276 (39) 36354 - 36360)). Además, se ha reportado la presencia de las CDK de tipo C y de las quinasas que activan CDK (las CAK) (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235); Umeda y colaboradores, 1998 (Proc Natl Acad Sci USA. 95 (9), 5021 - 5026.; Joubes y colaboradores, 2001 (Plant Physiol. 126 (4), 1403 - 1415)), al igual que la presencia de las CDK de tipo D, tipo E y tipo F (Vandepoele y colaboradores, 2002 (Plant Cell 14 (4), 903 - 916)).

La habilidad para influir sobre el ciclo celular en una planta, y para modificar por lo tanto diferentes características de crecimiento de una planta, tendrían muchas aplicaciones en áreas tales como mejoramiento de cultivos, reproducción de plantas, producción de plantas ornamentales, arboricultura, horticultura, silvicultura, la producción de algas o plantas (por ejemplo para uso como biorreactores, para la producción de sustancias tales como compuestos farmacéuticos, anticuerpos, o vacunas, o para la bioconversión de desechos orgánicos o para uso como combustible en el caso de algas y plantas de alta productividad).

Se ha encontrado recientemente que el incremento de la expresión en una planta de un ácido nucleico para CDK de tipo B que codifica a una proteína CDK de tipo B incluye: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T, les proporciona a las plantas características mejoradas de crecimiento. Por lo tanto, de acuerdo a una primera modalidad de la presente invención, se proporciona un método para (mejorar) las características de crecimiento de una planta, que comprende el incremento de la expresión en una planta de un ácido nucleico para CDK de tipo B, que codifica a una proteína CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T en donde las características mejoradas de crecimiento se seleccionan entre uno o más de: un incremento en el área, un incremento del número de panículas, un incremento en altura, un incremento en el número de semillas, un incremento en el número de semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el índice de cosecha. Una mayor expresión de un ácido nucleico para CDK de tipo B es el mejoramiento o la mayor expresión de un ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B. La mayor expresión, es mayor comparada con la expresión de una CDK de tipo B en plantas correspondientes de tipo silvestre. Los métodos para obtener una mayor o mejor expresión de los genes o de los productos génicos están bien documentados en el arte e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión dirigida por un promotor fuerte, el uso de reforzadores de transcripción o de reforzadores de traducción.

El método para mejorar las características de crecimiento de las plantas comprende la introducción y expresión en una planta de un ácido nucleico para CDK de tipo B, que codifica una proteína CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T. Se puede introducir el ácido nucleico en una planta, por ejemplo, por medio de transformación. Por lo tanto, de acuerdo a un aspecto preferido de la presente invención, se proporciona un método para mejorar las características de crecimiento de una planta que comprende la introducción en una planta, en un formato expresable, de un ácido nucleico para CDK de tipo B, que codifica una proteína CDK de tipo B que incluye: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T, en donde las características mejoradas de crecimiento se seleccionan entre uno o más de: un incremento en el área, un incremento del número de panículas, un incremento en altura, un incremento en el número de semillas, un incremento en el número de semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el índice de cosecha, cada uno con relación a las correspondientes plantas de tipo
silvestre.

Un "ácido nucleico para CDK de tipo B" como se lo define aquí es un ácido nucleico/gen que codifica una proteína que tiene (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)).

Los motivos y los dominios identificados en (i) hasta (iii) anteriores pueden ser fácilmente identificados por las personas capacitadas en el arte utilizando técnicas de rutina. Un ensayo de quinasa puede, por ejemplo, ser realizado como se describe en Cockcroft y colaboradores, 2000 (Nature, 405 (6786), 575 - 579). El ensayo involucra la molienda de material de la planta en nitrógeno líquido y resuspender en un material apropiado (tal como 1 ml de Tris-HCl 50 mM de pH 7,5, NaCl 75 mM, EGTA 15 mM, MgCl_{2} 15 mM, ditiotreitol 1 mM, Tween 20 al 0,1%, inhibidor completo de proteasa Tm 1X, NaF 1 mM, NaV 0,2 mM, pirofosfato de Na 2 mM, beta-glicerofosfato 60 mM). Se homogeniza luego la suspensión 4 x 30 s con 30 s sobre hielo entre homogenizaciones. Se incuba luego el sobrenadante con 20 microlitros de proteína A - Sefarosa (suspensión al 50%) durante 30 min a 4ºC. Se incuba el sobrenadante con 1 microlitro de antisuero (dirigido contra el péptido del terminal carboxilo de una proteína CDC2b, como se describe en Setiady y colaboradores, 1996 (Plant Cell Physiology 37 (3), 369 - 376) durante 2 h sobre hielo, luego se añaden 20 microlitros de proteína A - Sefarosa y se agita la muestra por rotación a 4ºC durante una hora. Se lavan las muestras 2 veces con amortiguador de quinasa (Tris-HCl 50 mM de pH 7,5, NaCl 100 mM, EGTA 5 mM, DTT 1 mM), se resuspenden en 15 microlitros de amortiguador del ensayo (Tris-HCl 50 mM de pH 7,5, NaCl 100 mM, EGTA 5 mM, MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM, NaF 1 mM, vanadato de Na 0,2 mM, pirofosfato de Na 2 mM, beta-glicerofosfato 25 mM, histona H1 0,5 mM como sustrato, PMSF 0,5 mM, y 74 kBq [ATP gamma con ^{32}P (>185 TBq mmol^{-1}) por 15 microlitros de reacción) y se incuba a temperatura ambiente durante 30 min. Se puede detener la reacción por medio de la adición de amortiguador de carga del gel y se pueden analizar las muestras utilizando SDS-PAGE y cuantificar utilizando un fosfoimager (Molecular
Dynamics).

El término "aminoácido para CDK de tipo B" como se define aquí abarca cualquier secuencia de aminoácidos que cuando se la utiliza en la construcción de un árbol filogenético de CDK, tal como el descrito en la Fig. 1, tiende a agruparse alrededor de las CDK de tipo B en vez de cualquiera de los otros grupos de CDK. Una persona capacitada en el arte podría determinar fácilmente si cualquier secuencia de aminoácidos en cuestión cae dentro de la definición de un "aminoácido para CDK de tipo B" utilizando técnicas conocidas y software para la elaboración de tal árbol filogenético, tal como un paquete de programas GCG, EBI o CLUSTAL, utilizando parámetros por defecto. Por medio de la construcción de tal árbol filogenético, las secuencias que se agrupan en el grupo de CDK de tipo B se considera que caen dentro de la definición de una "CDK de tipo B" y por lo tanto será útil para llevar a cabo los métodos de la invención. Adicionalmente, un "aminoácido para CDK de tipo B" como se define aquí es uno que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)).

La tabla 1 a continuación, muestra las CDK representativas de tipo B y el motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencias en la posición 2 y/o 4 de izquierda a derecha.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

El ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B puede ser aislado o derivado de cualquier planta o alga o fuente de hongos. Este ácido nucleico puede ser sustancialmente modificado a partir de su forma nativa en composición y/o en el ambiente genómico a través de manipulación humana deliberada. El ácido nucleico para CDK de tipo B puede ser aislado de una especie monocotiledónea o dicotiledónea, preferiblemente de la familia Brassicaceae, preferiblemente adicionalmente de Arabidopsis thaliana. El ácido nucleico es preferiblemente para una CDK de tipo B clase 1, tal como una CDK de tipo B clase 1 seleccionada de los ejemplos de las CDK de clase 1 mostradas en la Fig. 1, a saber, CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana, CDK B1;2 de Arabidopsis thaliana, CDKB1;1 de Lycopersicon esculentum (tomate), CDK B1;1 de Antirrhinum majus, CDK B1;1de Medicago sativa (alfalfa) y CDK B1 de Dunaliella tertiolecta, preferiblemente adicionalmente CDK de tipo B clase 1 es una CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana o una CDK B1;2 de Arabidopsis thaliana. Alternativamente, el ácido nucleico es preferiblemente una CDK de tipo B clase 2, tal como una CDK de tipo B clase 2 seleccionada de los ejemplos mostrados en la Fig.1, a saber, una CDK B2;1 de Arabidopsis thaliana, una CDK B2;2 de Arabidopsis thaliana, una CDK B2;1 de Antirrhinum majus, una CDK B2;1 de Mesembryanthemum crassifolium, una CDK B2;1 1 de Medicago sativa, una CDK B2;1 de Lycopersicon esculentum y una CDK B 1 de Oryza sativa, preferiblemente adicionalmente la CDK de tipo B clase 2 es una CDK B2;2 de Arabidopsis thaliana.

Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B1;1 es como el representado por la SEQ ID NO: 1 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde la proteína CDK B1;1 es como la representada por la SEQ ID NO: 2, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B1;2 es como el representado por la SEQ ID NO: 3 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde la proteína CDK B1;2 es como la representada por la SEQ ID NO: 4, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B2;2 es como el representado por la SEQ ID NO: 5 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde la proteína CDK B2;2 es como la representada por la SEQ ID NO: 6, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Cada uno de los ácidos nucleicos/proteínas CDK B1;1, CDK B1;2 y CDK B2;2 también abarca las variantes de ácido nucleico y los aminoácidos como se describe aquí más adelante.

Aunque la invención ha sido ejemplificada con una CDK de tipo B de acuerdo a las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, y los aminoácidos correspondientes de acuerdo a las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6, respectivamente, será claro para una persona capacitada en el arte que los métodos de acuerdo a la invención pueden ser practicados también utilizando variantes de ácidos nucleicos y variantes de aminoácidos, tal como aquellos definidos aquí más adelante. Por lo tanto, tomado en un contexto amplio, el término proteína/ácido nucleico "CDK de tipo B" también abarca variantes de ácidos nucleicos y variantes de aminoácidos adecuados para la práctica de los métodos de acuerdo a la invención. Las variantes de ácidos nucleicos y las variantes de aminoácidos adecuados para la práctica de los métodos de acuerdo a la invención incluyen a aquellas que caen dentro de la definición de una "CDK de tipo B", lo cual significa que para la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel descrito en la Fig. 1, las variantes de las secuencias de interés tenderían a agruparse alrededor de las CDK de tipo B y/o cuyas variantes codifican (en el caso de una variantes de ácido nucleico) y es (en el caso de una variante de aminoácido) una proteína I que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)).

Las variantes adecuadas de ácido nucleico y de secuencias de aminoácidos útiles en la practica de los métodos de acuerdo a la invención, incluyen:

(i)

Porciones funcionales de un ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B;

(ii)

Secuencias capaces de hibridar con un ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B;

(iii)

Variantes alternativas de empalme de un ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B;

(iv)

Variantes alélicas de un ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B;

(v)

Homólogos, derivados y fragmentos activos de una proteína CDK de tipo B;

(vi)

Las CDK mutantes de tipo B.

Un ejemplo de una variante de un ácido nucleico/gen de tipo B; es una porción funcional de un ácido nucleico/gen de tipo B. Será claro para una persona capacitada en el arte que la secuencia de ADN de longitud completa no es un prerrequisito para llevar a cabo los métodos de acuerdo con la invención. Los métodos de acuerdo con la invención pueden ser practicados convenientemente utilizando porciones funcionales de una CDK de tipo B. Una porción funcional se refiere a una pieza de ADN derivada o preparada a partir de una molécula original (más larga) de ADN que codifica para CDK de tipo B, cuya porción de ADN, cuando se la introduce y expresa en una planta, produce plantas que tienen características modificadas de crecimiento, cuya porción codifica una proteína que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)). La porción puede incluir muchos genes con o sin elementos adicionales de control o puede contener secuencias espaciadoras. La porción se puede elaborar haciendo una o más supresiones y/o truncamientos a la secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5. Las técnicas para introducción de truncamientos y de supresiones dentro de un ácido nucleico son bien conocidas en el arte.

Un ejemplo de una variante adicional de ácido nucleico que codifica para CDK de tipo B es una secuencia que es capaz de hibridar con una CDK de tipo B. Convenientemente, se pueden practicar también los métodos de acuerdo con la presente invención utilizando secuencias capaces de hibridar con una CDK de tipo B, particularmente una CDK de tipo B como la representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, cuyas secuencias de hibridación son aquellas que caen dentro de la definición de una "CDK de tipo B", lo cual significa que para la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel descrito en la Fig. 1, la secuencia de hibridación sería aquella que tiende a agruparse alrededor de las CDK de tipo B en vez de cualquiera de los otros grupos de CDK y/o cuya secuencia de hibridación codifica a una proteína que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)).

El término "hibridación" como se define aquí es un proceso en donde las secuencias complementarias de nucleótidos sustancialmente homólogas se aparen entre sí. El proceso de hibridación puede ocurrir enteramente en solución, es decir, ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. Las herramientas en biología molecular que confían en tal proceso incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; y todos los métodos basados en la misma), hibridación sustractiva, extensión aleatoria del iniciador, mapeo de la nucleasa S1, extensión del iniciador, transcripción inversa, síntesis de ADNc, despliegue diferencial de los ARN, y determinación de la secuencia de ADN. El proceso de hibridación puede ocurrir también con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmobilizados a una matriz tal como cuentas magnéticas, cuentas de Sefarosa o cualquier otra resina. Las herramientas en biología molecular que cuentan con tal proceso incluyen el aislamiento de ARNm poli (A+). El proceso de hibridación puede ocurrir además con uno de los ácido nucleicos complementarios inmobilizados a un soporte sólido tal como una membrana de nylon o nitrocelulosa o inmobilizados por ejemplo por fotolitografía por ejemplo a un soporte de vidrio siliceo (este último conocido como arreglos de ácido nucleico o microarreglos o como chips de ácido nucleico). Las herramientas en biología molecular que cuentan con tal proceso incluyen análisis de transferencias en gel de ARN y ADN, hibridación de colonias, hibridación de placas, hibridación in situ e hibridación de microarreglos. Con el propósito de permitir que ocurra la hibridación, se desnaturalizan generalmente térmica o químicamente las moléculas de ácido nucleico para fundir la cadena doble en dos cadenas sencillas y/o para remover las horquillas u otras estructuras secundarias de ácidos nucleicos monocatenarios. La rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones tales como la temperatura, la concentración de sal y la composición del amortiguador de hibridación. Las condiciones de alta rigurosidad para la hibridación incluyen alta temperatura y/o baja concentración de sal (las sales incluyen NaCl y citrato de Na_{3}) y/o la inclusión de formamida en el amortiguador de hibridación y/o la disminución de la concentración de compuestos tales como SDS (detergente) en el amortiguador de hibridación y/o exclusión de compuestos tales como sulfato de dextrano o polietilén glicol (promoviendo el amontonamiento molecular) del amortiguador de hibridación. Las condiciones convencionales de hibridación están descritas, por ejemplo, en Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York, pero la persona capacitada se dará cuenta que se pueden diseñar numerosas condiciones diferentes de hibridación en función de la homología conocida o esperada y/o de la longitud de la secuencia de ácido nucleico. Se prefieren particularmente condiciones de hibridación con una rigurosidad suficientemente baja (al menos en el primer caso) para aislar ácido nucleicos heterólogos con las secuencias de ADN de la invención definida más arriba. Un ejemplo de condiciones de baja rigurosidad es 4-6x SSC/0,1-0,5% p/v SDS a 37-45ºC durante 2 - 3 horas. Dependiendo de la fuente y de la concentración del ácido nucleico involucrado en la hibridación, se pueden emplear condiciones alternativas de rigurosidad, tales como condiciones medias de rigurosidad. Los ejemplos de condiciones de rigurosidad media incluyen 1 - 4x SSC/0,25% p/v SDS \geq 45ºC durante 2 - 3 horas. Un ejemplo de condiciones de alta rigurosidad incluye 0,1 - 1x SSC/0,1% p/v SDS a 60ºC durante 1-3 horas. La persona capacitada será consiente de diferentes parámetros que pueden ser alterados durante la hibridación y lavado y que o bien mantendrán o cambiarán las condiciones de rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad pueden empezar bajas y ser incrementadas progresivamente hasta que proporcionen una hibridación de ácido nucleico para CDK de tipo B, como se define aquí más arriba. Los elementos que contribuyen a la heterología incluyen alelismo, degeneración del código genético y diferencias en el uso preferido del codón.

Otro ejemplo de una variante de CDK de tipo B es una variante alternativa de empalme de una CDK de tipo B. Los métodos de acuerdo con la presente invención pueden ser practicados también utilizando una variante alternativa de empalme de un ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo 3. El término "variante alternativa de empalme" que fue utilizado aquí, abarca variantes de un ácido nucleico en el cual los intrones y/o los exones seleccionados han sido cortados, reemplazados o añadidos. Tales variantes de empalme s e pueden encontrar en la naturaleza o pueden ser hechas por el hombre utilizando técnicas conocidas en el arte. Las variantes de empalme útiles en los métodos de acuerdo con la invención son las "CDK de tipo B" lo cual significa que para la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel descrito en la Fig. 1, la variante de empalme de interés sería una que tiende a agruparse alrededor de las CDK de tipo B en vez de alrededor de cualquiera de los otros grupos de CDK y/o cuya variante de empalme I codifica a una proteína que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)). Preferiblemente la variante de empalme es una variante de empalme de la secuencia representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5.

Otro ejemplo de una variante de CDK de tipo B es una variante alélica. Convenientemente, los métodos de acuerdo con la presente invención pueden ser practicados también utilizando variantes alélicas de un ácido nucleico para CDK de tipo B, preferiblemente una variante alélica de una secuencia representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5. Existen variantes alélicas en la naturaleza y dentro de los métodos de la presente invención, está abarcado el uso de estos alelos naturales aislados en los métos de acuerdo con la invención. Las variantes alélicas útiles en los métodos de acuerdo con la invención son las "CDK de tipo B" lo cual significa que para la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel descrito en la Fig. 1, la variante alélica de interés tendería a agruparse alrededor de las CDK de tipo B y cuya variante alélica codifica a una proteína que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)).

Los ejemplos de variantes de aminoácidos de tipo B incluyen homólogos, derivados y fragmentos activos de una proteína CDK de tipo B. Convenientemente, los métodos de acuerdo con la presente invención pueden ser practicados también utilizando homólogos, derivados o fragmentos activos de una CDK de tipo B, utilizando preferiblemente ácido nucleicos que codifican homólogos, derivados o fragmentos activos de una CDK de tipo B como la representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6.

Los "homólogos" de una proteína CDK de tipo B abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos con relación a la proteína no modificada en cuestión que tienen actividad biológica y funcional similar a la proteína no modificada de la cual se derivan. Para producir tales homólogos, se pueden reemplazar aminoácidos de la proteína por otros aminoácidos que tengan propiedades similares (tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, y propensión similares para formar o romper estructuras de hélice \alpha o estructuras de lámina \beta). Las tablas de sustituciones conservadoras son conocidas en el arte (ver por ejemplo Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company). Los homólogos útiles en los métodos de acuerdo con la invención son preferiblemente las CDK de tipo B, lo cual significa que para la construcción de un árbol filogenético, tal como aquel descrito en la Fig. 1, cualquiera de las secuencias homólogas de interés tendería a agruparse alrededor de las CDK de tipo B en vez de cualquier otro tipo de CDK. Tales CDK de tipo B tienen un orden creciente de preferencia de al menos 60% ó 65% ó 70% ó 75% u 80% u 85% ó 90% ó 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, de identidad de secuencia o similitud con aquella de la CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 2) y cuyo homólogo contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)).

Se puede establecer fácilmente por medio de alineación de secuencias si un polipéptido tienen al menos 60% de identidad con la CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana. Los métodos para la alineación de secuencias para comparación son conocidos en el arte; tales métodos incluyen GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch, 1970 (J. Mol. Biol. 48 (3), 443 - 453) para hallar la alineación de dos secuencias completas que maximicen el número de coincidencias y minimice el número de huecos. El algoritmo de BLAST calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para llevar a cabo el análisis por BLAST está públicamente disponible a través del National Centre for Biotechnology Information. Una proteína que tenga al menos 60% de identidad con la CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana puede ser fácilmente identificada por medio de la alineación de una secuencia problema con secuencias conocidas de CDK de tipo B (ver, por ejemplo la Fig. 1) utilizando, por ejemplo, el programa de alineación múltiple VNTI AlignX, con base en un algoritmo modificado de clustal W ((InforMax, Bethesda, MD, http://www.informaxinc.com), con configuraciones por defecto para penalización de abertura de huecos de 10 y una extensión del hueco de 0,05.

Dos formas especiales de homología: ortólogos y parálogos, son conceptos evolucionarios utilizados para describir la relación ancestral de los genes. El término "parálogos" se relaciona con duplicaciones de genes dentro del genoma de una especie que conduce a genes parálogos. El término "ortólogos" se relaciona con genes homólogos en diferentes organismos debido a una relación ancestral. El término "homólogos" como se lo utiliza aquí también abarca parálogos y ortólogos de las proteínas útiles en los métodos de acuerdo con la invención.

Ortólogos, por ejemplo, en especies de plantas monocotiledóneas pueden ser fácilmente encontrados llevando a cabo la así llamada búsqueda recíproca por medio de blast. Esto puede hacerse por medio de una primera búsqueda por blast que implica la comparación de la secuencia en cuestión a través de blast (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2) contra cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos públicamente disponible NCBI que puede encontrarse en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Si se buscaran ortólogos en el arroz, la secuencia en cuestión sería comparada, por ejemplo, contra, los 28.469 clones de ADNc de longitud completa de Oryza sativa Nippombare disponible en NCBI. Se pueden utilizar BLASTn o tBLASTX cuando se parte de nucleótidos o BLASTP o TBLASTN cuando se parte de la proteína, con valores estándar por defecto. Se pueden filtrar los resultados de la comparación. Las secuencias de longitud completa ya sea de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados son luego nuevamente comparados (segunda comparación) contra las secuencias de los organismos a partir de los cuales se derivan las secuencias en cuestión. Los resultados de la primera y de la segunda comparación son luego comparados. Se encuentra un ortólogo cuando los resultados de la segunda comparación dados como aciertos con la similitud más alta, un ácido nucleico o proteína CDK de tipo B, por ejemplo, si uno de los organismos es Arabidopsis entonces se encuentra un parálogo. En el caso de grandes familias, se puede utilizar ClustalW, seguido por una árbol vecino de unión, para ayudar a visualizar el agrupamiento.

Las "variantes de sustitución" de una proteína son aquellas en las cuales se ha removido al menos un residuo en una secuencia de aminoácidos e insertado un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales, pero pueden estar agrupados dependiendo de las restricciones funcionales generadas por el polipéptido; las inserciones serán usualmente aproximadamente del orden de 1 a 10 residuos de aminoácidos y las supresiones estarán en el rango aproximadamente entre 1 y 20 residuos. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos incluyen sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las variantes de sustitución útiles en los métodos de la invención serán aquellas que incluyen: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)).

Las "variantes de inserción" de una proteína son aquellas en las cuales se introducen uno o más residuos de aminoácidos en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden incluir fusiones aminoterminales y/o carboxiterminales así como inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos individuales o de múltiples aminoácidos. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones amino o carboxiterminales, aproximadamente del orden de 1 a 10 residuos. Los ejemplos de proteínas o de péptidos de fusión amino o carboxiterminales incluyen al dominio de enlazamiento o al dominio de activación de un activador transcripcional como el utilizado en el sistema híbrido doble de levadura, las proteínas de recubrimiento del fago, etiqueta de 6 (histidinas), etiqueta de S transferasa de glutationa, proteína A, proteína de enlazamiento de maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo Tag.100, epítopo c-myc, epítopo FLAG®, lacZ, CMP (péptido de enlazamiento de calmodulina), epítopo HA, epítopo de proteína C y epítodo VSV. Las variantes de inserción útiles en los métodos de la invención serán aquellos que contienen: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223-235)).

Las "variantes de supresión" de una proteína se caracterizan por la remoción de uno o más aminoácidos de la proteína. Las variantes de aminoácidos de una proteína pueden hacerse fácilmente utilizando técnicas de síntesis de péptidos conocidas en el arte, tales como la síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por medio de manipulaciones de ADN recombinante. Los métodos para la recombinación de secuencias de ADN para producir variantes de sustitución, de inserción o de supresión de una proteína son conocidos en el arte. Por ejemplo, las técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN son conocidos por aquellos capacitados en el arte e incluyen mutagénesis M13, mutagénesis in vitro de T7-Gen (USB, Cleveland, OH), QuickChange Site Directed mutagenesis (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio. Las variantes de supresión útiles en los métodos de la invención serán aquellas que incluyen: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223-235)).

Los métodos para la búsqueda e identificación de homólogos de CDK de tipo B estarían también en el ámbito de una persona capacitada en el arte. Los métodos para la alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en el arte. Tales métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch 1970 (J. Mol. Biol. 48 (3), 443-453) para hallar la alineación de dos secuencias completas que maximice el número de coincidencias y minimice el número de huecos. El algoritmo de BLAST calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para llevar a cabo el análisis por BLAST está públicamente disponible a través del National Ceentre for Biotechnology Information.

El término "derivados" se refiere a péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden contener sustituciones, supresiones o adiciones de residuos de aminoácidos de ocurrencia natural y no natural comparados con la secuencia de aminoácidos de una forma de ocurrencia natural de la proteína, por ejemplo, como la representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6. Los "derivados" de una proteína CDK de tipo B abarcan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden incluir residuos de aminoácidos alterados, glicosilados, acilados de ocurrencia natural o de ocurrencia no natural comparados con la secuencia de aminoácidos de una forma de ocurrencia natural del polipéptido. Un derivado puede incluir también uno o más sustituyentes que no son aminoácidos comparado con la secuencia de aminoácidos de la cual se deriva, por ejemplo una molécula reportera u otro ligando, enlazado en forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos tal como, por ejemplo, una molécula reportera que está enlazada para facilitar su detección, y residuos de aminoácidos de ocurrencia no natural con relación a la secuencia de aminoácidos de una proteína de ocurrencia natural. Los derivados útiles en los métodos de la invención serán aquellos que incluyen: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223-235)).

Los "fragmentos activos" de una proteína CDK de tipo B incluyen: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223-235)).

Más convenientemente aún, los métodos de acuerdo con las presente invención pueden ser practicados también utilizando las CDK mutantes de una planta, cuyas CDK mutantes tienen al menos una actividad biológica sustancialmente similar, preferiblemente mejorada, comparadas con las correspondientes proteínas CDK de tipo silvestre.

De acuerdo con una quinta modalidad de la presente invención, se proporcionan construcciones genéticas y vectores para facilitar la introducción y/o la expresión de las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de acuerdo con la invención. Por lo tanto, de acuerdo a una quinta modalidad de la presente invención, se proporciona una construcción genética que contiene:

(i)

un ácido nucleico/gen para CDK de tipo B que codifica una proteína CDK de tipo B que incluye: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de quinasa para activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223-235)); o

(ii)

una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión del ácido nucleico de (i), dicha secuencia de control incluyendo un promotor constitutivo GOS2 o un promotor de beta-expansina, y opcionalmente

(iii)

una secuencia de terminación de la transcripción.

Las construcciones útiles en los métodos de acuerdo con la presente invención pueden ser construidas utilizando tecnología de ADN recombinante bien conocida por las personas capacitadas en el arte. Las construcciones génicas se pueden insertar en vectores, que pueden estar comercialmente disponibles, adecuados para la trasformación en plantas y adecuados para la expresión del gen de interés en las células transformadas.

El ácido nucleico que codifica a un mutante de CDK puede ser cualquiera de los ácido nucleicos que codifican al mutante descritos aquí anteriormente.

El ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B puede ser aislado de una especie monocotiledónea o dicotiledónea, preferiblemente de la familia Brassicaceae, preferiblemente adicionalmente de Arabidopsis thaliana. El ácido nucleico es preferiblemente para una CDK de tipo B clase 1, tal como una CDK de tipo B clase 1 seleccionada de los ejemplos de las CDK de clase 1 mostradas en la Fig. 1, a saber, CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana, CDK B1;2 de Arabidopsis thaliana, CDKB1;1 de Lycopersicon esculentum (tomate), CDK B1;1 de Antirrhinum majus, CDK B1;1 de Medicago sativa (alfalfa) y CDK B1 de Dunaliella tertiolecta, preferiblemente adicionalmente la CDK de tipo B clase 1 es una CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana o una CDK B1;2 de Arabidopsis thaliana. Alternativamente, el ácido nucleico es preferiblemente una CDK de tipo B clase 2, tal como una CDK de tipo B clase 2 seleccionada de los ejemplos mostrados en la Fig.1, a saber, una CDK B2;1 de Arabidopsis thaliana, una CDK B2;2 de Arabidopsis thaliana, una CDK B2;1 de Antirrhinum majus, una CDK B2;1 de Mesembryanthemum crassifolium, una CDK B2;1 1 de Medicago sativa, una CDK B2;1 de Lycopersicon esculentum y una CDK B 1 de Oryza sativa, preferiblemente adicionalmente la CDK de tipo B clase 2 es una CDK B2;2 de Arabidopsis thaliana.

Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B1;1 es como el representado por la SEQ ID NO: 1 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde la proteína CDK B1;1 es como la representada por la SEQ ID NO: 2, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B1;2 es como el representado por la SEQ ID NO: 3 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde la proteína CDK B1;2 es como la representada por la SEQ ID NO: 4, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B2;2 es como el representado por la SEQ ID NO: 5 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde la proteína CDK B2;2 es como la representada por la SEQ ID NO: 6, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Cada uno de los ácidos nucleicos/proteínas CDK B1;1, CDK B1;2 y CDK B2;2 también abarca las variantes de ácido nucleico y los aminoácidos como se describió aquí anteriormente.

Las plantas son transformadas luego con una construcción o vector que incluye a la secuencia de interés (es decir, un ácido nucleico para CDK de tipo B que codifica a una proteína CDK de tipo B o a un ácido nucleico que codifica a un mutante de CDK), cuya secuencia está operativamente enlazada a una o más secuencias de control (al menos un promotor).

Los términos "elemento regulador", "secuencia de control" y "promotor" son todos utilizados aquí en forma intercambiable y se los utiliza para referirse a secuencias reguladoras de ácido nucleico capaces de efectuar la expresión de una secuencia con la cual están ligados. Abarcadas por los términos anteriormente mencionados están las secuencias reguladoras de la transcripción derivadas de un gen genómico eucariota clásico (incluida la caja TATA que es requerida para la iniciación precisa de la transcripción, con o sin una secuencia de caja CCAAT) y elementos regulador adicionales (es decir, secuencias activadoras secuencia arriba, reforzadoras y silenciadoras) que alteran la expresión del gen en respuesta a estímulos externos y/o de desarrollo, o en una forma específica para el tejido. También esta incluida dentro del término una secuencia reguladora de la transcripción de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja de -35 y/o secuencias reguladoras de la transcripción de caja -10. El término "elemento regulador" también abarca una molécula sintética de fusión o derivada que confiere, activa o refuerza la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. Los términos "secuencia de control", "secuencia reguladora", "elemento regulador" y "promotor" son utilizados aquí en forma intercambiable. El término "operativamente enlazado" como se lo utiliza aquí se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la secuencia promotora sea capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.

Convenientemente, el ácido nucleico para CDK de tipo B puede estar operativamente enlazado con cualquier promotor. Preferiblemente, en el caso de una CDK B1;1, la expresión está dirigida por un promotor activo en tejido joven en expansión, tal como en hojas, flores, tallos y raíces jóvenes. Tal como un "promotor preferido para tejido joven en expansión" como se define aquí, se refiere a un promotor que se expresa predominantemente en tejido joven en expansión, pero no necesariamente exclusivamente en tal tejido. Preferiblemente, el "promotor preferido para tejido joven en expansión" es el promotor EXPB8 de beta-expansina del arroz. Otros promotores adecuados incluyen cualquier promotor de expansina, pLEAFY y otros. Preferiblemente en el caso de una CDK B1;2 y CDK B2;2, la expresión es conducida en una forma constitutiva, más preferiblemente en donde el promotor constitutivo es un promotor GOS2. Un promotor constitutivo es transcripcionalmente activo durante la mayoría, pero no necesariamente todas, las fases de su crecimiento y desarrollo. Los ejemplos de promotores constitutivos de la planta a parecen en la Tabla C como se muestra a continuación. Los promotores mostrados en la Tabla C a continuación, pueden ser convenientemente utilizados para llevar a cabo los métodos de acuerdo con la invención.

TABLA C Ejemplos de promotores constitutivos

2

Los promotores inducibles son promotores que han inducido o incrementado la iniciación de la transcripción en respuesta a un estímulo de desarrollo, químico, ambiental o físico. Por ejemplo, los promotores inducibles por estrés son activados cuando se expone una planta a diferentes condiciones de estrés. Los ejemplos de promotores inducibles por estrés, que son también adecuados para llevar a cabo los métodos de acuerdo con la invención, están expuestos en la Tabla D como se muestra a continuación. Tales promotores pueden ser útiles también en la realización de los métodos de la invención ya que el crecimiento modificado (tal como un mayor crecimiento) inducido en tiempos de estrés puede tener muchas ventajas.

TABLA D Ejemplos de Promotores inducibles por estrés

3

4

Los promotores enlistados en las Tablas C y D son suministrados únicamente como ejemplo y la presente invención no está limitada por la lista suministrada en dichas tablas. Aquellos capacitados en el arte serán capaces fácilmente de suministrar promotores adicionales que sean útiles para la realización de la presente invención. Los promotores enlistados pueden ser modificados también para proporcionar especificidad de expresión según se requiera.

Opcionalmente, se pueden utilizar también una o más secuencias terminadoras en la construcción introducida en una planta. El término "terminadora" abarca una secuencia de control que es una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional que señala el procesamiento 3' y la poliadenilación de un transcripto primario y la terminación de la transcripción. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir reforzadores transcripcionales así como de la traducción. Aquellos capacitados en el arte se darán cuenta de secuencias terminadoras y reforzadoras que pueden ser adecuadas para ser usadas en la realización de la invención. Tales secuencias serían conocidas o pueden ser obtenidas fácilmente por una persona capacitada en el arte.

Las construcciones genéticas de la invención pueden incluir adicionalmente un origen de secuencia de replicación que es requerido para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo específico de célula. Un ejemplo es cuando se requiere mantener una construcción genética en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (por ejemplo una molécula de plásmido o de cósmido). Los orígenes preferidos de replicación incluyen, pero no se limitan a, el f1-ori y coIE1.

La construcción genética puede incluir opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como se lo utiliza aquí, el término "gen marcador seleccionable" incluye cualquier gen que confiera un fenotipo sobre una célula en la cual se exprese para facilitar la identificación y/o la selección de célula que sean transfectadas o transformadas con una construcción de ácido nucleico de la invención. Los marcadores adecuados se pueden seleccionar entre marcadores que confieran resistencia a los antibióticos o a herbicidas. Las células que contienen al ADN recombinante serán capaces por lo tanto de sobrevivir en presencia de concentraciones de antibiótico o de herbicida que matarían a células no transformadas. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen al gen bar que proporciona resistencia al herbicida Basta; el gen npt que confiere resistencia al antibiótico kanamicina; el gen hpt que confiere resistencia a la higromicina. Se pueden utilizar también marcadores visuales, tales como la Proteína Fluorescente Verde (GFP, Haseloff y colaboradores, 1997 (Proc Natl Acad Sci USA. 94 (6), 2122 - 2127), \beta-glucuronidasa (GUS) o luciferasa, como marcadores seleccionables. Otros ejemplos de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen al gen de resistencia a la ampicilina (Ampr), gen de resistencia a la tetraciclina (Tcr), gen de resistencia a la kanamicina bacteriana (Kanr), gen de resistencia a la fosfinotricina, gen de neomicina fosfotransferasa (nptII) gen de resistencia a la higromicina, y el gen del cloramfenicol acetiltransferasa (CAT), entre otros.

La presente invención también incluye a las plantas obtenidas por medio de los métodos de acuerdo con la presente invención. La presente invención proporciona por lo tanto plantas obtenidas por medio de los métodos de acuerdo con la presente invención, cuyas plantas tienen características de crecimiento mejoradas seleccionadas entre una o más de: un incremento en el área, un incremento del número de panículas, un incremento en altura, un incremento en el número de semillas, un incremento en el número de semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el índice de cosecha, y cuyas plantas tienen una mayor expresión de una CDK de tipo B, que codifica a una proteína CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T.

La presente invención también proporciona plantas que tienen características mejoradas de crecimiento seleccionadas entre uno o más de: un incremento en el área, un incremento del número de panículas, un incremento en altura, un incremento en el número de semillas, un incremento en el número de semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el índice de cosecha, y cuyas plantas tienen una mayor expresión de una CDK de tipo B, que codifica a una proteína CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T.

De acuerdo a una sexta modalidad de la presente invención, se proporciona un método para producción de plantas transgénicas que tienen características mejoradas de crecimiento seleccionadas entre una o más de: un incremento en el área, un incremento del número de panículas, un incremento en altura, un incremento en el número de semillas, un incremento en el número de semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el índice de cosecha, que comprende la introducción y la expresión en una planta de una molécula de ácido nucleico de la invención.

Más específicamente, la presente invención proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tiene características mejoradas de crecimiento, cuyo método comprende:

(i)

la introducción y expresión en una planta o en una célula de una planta de un ácido nucleico/gen para CDK de tipo B que codifica a una proteína CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T;

(ii)

el cultivo de la células de la planta bajo condiciones que promuevan la regeneración y el crecimiento de una planta madura.

Se puede introducir al propio ácido nucleico directamente en una célula de una planta o dentro de la misma planta (incluida la introducción en un tejido, órgano o en cualquier otra parte de la planta). De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, se introduce preferiblemente el ácido nucleico dentro de una planta por medio de transformación.

El gen/ácido nucleico que codifica para CDK de tipo Bnes preferiblemente una CDK de tipo B clase 1, tal como una CDK de tipo B clase 1 seleccionada de los ejemplos de las CDK de clase 1 mostradas en la Fig. 1, a saber, CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana, CDK B1;2 de Arabidopsis thaliana, CDK B1;1 de Lycopersicon esculentum (tomate), CDK B1;1 de Antirrhinum majus, CDK B1;1 de Medicago sativa (alfalfa) y CDK B1 de Dunaliella tertiolecta, preferiblemente adicionalmente CDK de tipo B clase 1 es una CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana o una CDK B1;2 de Arabidopsis thaliana. Alternativamente, el ácido nucleico es preferiblemente una CDK de tipo B clase 2, tal como una CDK de tipo B clase 2 seleccionada de los ejemplos mostrados en la Fig.1, a saber, una CDK B2;1 de Arabidopsis thaliana, una CDK B2;2 de Arabidopsis thaliana, una CDK B2;1 de Antirrhinum majus, una CDK B2;1 de Mesembryanthemum crassifolium, una CDK B2;1 1 de Medicago sativa, una CDK B2;1 de Lycopersicon esculentum y una CDK B 1 de Oryza sativa, preferiblemente adicionalmente la CDK de tipo B clase 2 es una CDK B2;2 de Arabidopsis thaliana.

Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B1;1 es como el representado por la SEQ ID NO: 1 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde la proteína CDK B1;1 es como la representada por la SEQ ID NO: 2, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B1;2 es como el representado por la SEQ ID NO: 3 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde la proteína CDK B1;2 es como la representada por la SEQ ID NO: 4, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B2;2 es como el representado por la SEQ ID NO: 5 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde la proteína CDK B2;2 es como la representada por la SEQ ID NO: 6, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Cada uno de los ácidos nucleicos/proteínas CDK B1;1, CDK B1;2 y CDK B2;2 también abarca las variantes de ácido nucleico y los aminoácidos como se describió aquí anteriormente.

El término "transformación" como se lo menciona aquí abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno dentro de una célula huésped, independientemente del método utilizado para la trasferencia. El tejido de la planta capaz de una propagación clonal posterior, ya sea por medio de organogénesis o de embriogénesis, puede ser transformado con una construcción genética de la presente invención y regenerar una planta completa a partir de allí. El tejido particular escogido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles, y más adecuados para la especie particular que está siendo transformada. Los ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocotiledondes, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, brotes axilares, y meristemas de la raíz), y tejido inducido de meristema (por ejemplo, meristema de cotiledon y meristema de hipocotiledon). Se puede introducir en forma transitoria o estable al polinucleótido en una célula huésped y mantenerlo en forma no integrada, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, se lo puede integrar en el genoma huésped. La célula de la planta transformada resultante puede ser utilizada luego para regenerar una planta transformada en una forma conocida por las personas capacitadas en el arte.

La transformación de una especie de una planta es hoy en día una técnica bastante rutinaria. Convenientemente, se pueden utilizar cualquiera entre muchos métodos de transformación para introducir al gen de interés dentro de un ancestro adecuado de una célula. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, compuestos químicos que incrementan la asimilación de ADN libre, inyección del ADN directamente dentro de la planta, bombardeo con una pistola de partículas, transformación utilizando virus o polen y microinyección. Se pueden seleccionar los métodos a partir del método de calcio/polietilén glicol para protoplastos (Krens, F. A. y colaboradores, 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. y colaboradores, June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R. D. y colaboradores, 1985 Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección dentro de un material de la planta (Crossway A. y colaboradores, 1986, Mol. Gen Genet 202, 179 - 185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein T. M. y colaboradores, 1987, Nature 327, 70) infección con virus (no integradores) y similares. Se producen preferiblemente plantas transgénicas de arroz que expresan un gen que codifica para CDK de tipo B a través de una transformación mediada por Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos conocidos para transformación del arroz, tal como los descritos en cualquiera de las siguientes publicaciones: solicitud europea de patente publicada EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta, 199, 612-617, 1996); Chan y colaboradores, (Plant Mol. Biol. 22 (3) 491-506, 1993), Hiei y colaboradores, (Plant J. 6 (2) 271 - 282, 1994), cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia como si estuvieran expuestas en su totalidad. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como el descrito ya sea en Ishida y colaboradores, (Nat. Biotechnol. 1996 Jun; 14(6): 745-50) o en Frame y colaboradores, (Plant Physiol. 2002 May; 129(1): 13-22), cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia como si estuvieran expuestas en su totalidad.

Generalmente después de la transformación, se seleccionan células de la planta o agrupaciones celulares por la presencia de uno o más marcadores que son codificados por genes expresables en la planta cotransfectados con el gen de interés, después de lo cual se regenera el material transformado en una planta completa.

Después de la transferencia del ADN y la regeneración, se pueden evaluar las plantas putativamente transformadas, por ejemplo utilizando análisis tipo Southern, por la presencia del gen de interés, número de copia y/o organización genómica. Alternativa o adicionalmente, se pueden hacer seguimiento a los niveles de expresión del ADN recientemente introducido utilizando análisis de tipo Northern y/o Western, siendo ambas técnicas conocidas por las personas ordinariamente calificadas en la técnica.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar por medio de una variedad de medios, tales como las técnicas de propagación clonal o de reproducción clásica. Por ejemplo, se puede autofecundar una primera generación de plantas transformadas (o T1) para producir transformantes homocigotos de segunda generación (o T2), y se pueden propagar luego las plantas T2 a través de técnicas clásicas de reproducción.

Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y de células no transformadas; transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener al casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un rizoma transformado injertado a un retoño no transformado).

La presente invención se extiende claramente a cualquier célula de planta o planta producida por medio de cualquiera de los métodos descritos aquí, y a todas las partes de la planta y propágulos de las mismas. La presente invención se extiende además para abarcar a la progenie de una célula primaria transformada o transfectada, tejido, órgano o planta completa que ha sido producida por medio de cualquiera de los método anteriormente mencionados, siendo el único requisito que la progenie exhiba la(s) misma(s) característica(s) genotípica(s) y/o fenotípica(s) como aquellas producidas en los progenitores por medio de los métodos de acuerdo con la invención. La invención también incluye células huésped que contienen una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una proteína capaz de modular una proteína CDK de tipo B, preferiblemente en donde la proteína es una proteína CDK de tipo B. Las células huésped preferidas de acuerdo con la invención son células de plantas. La invención se extiende también a las partes cosechables de una planta, tales como, pero sin limitarse a, cultivos de semillas, hojas, frutos, flores, tallos, rizomas, tubérculos y bulbos.

El término "planta" como se lo utiliza aquí abarca plantas enteras, ancestros y progenie de las plantas y partes de las plantas, incluidas semillas, brotes, tallos, raíces (incluidos los tubérculos), y células de plantas, tejidos y órganos. El término "planta" también abarca por lo tanto cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen algas, helechos, y todas las plantas que perteneces a la súper familia de Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneasts, incluyendo forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos de alimentos, árboles, o arbustos seleccionados de la lista que comprende Abelmoschus spp., Acer spp., Actinidia spp., Agropyron spp., Allium spp., Amaranthus spp., Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arabidopsis thaliana, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena sativa, Averrhoa carambola, Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp., Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carthamus tinctorius, Carya spp., Castanea spp., Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Cold spp., Colocasia esculenta, Corylus spp., Crataegus spp., Cucumis spp., Cucurbita spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Eleusine coracana, Eriobotrya japonica, Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp., Gossypium hirsutum, Helianthus spp., Hibiscus spp., Hordeum spp., Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lemna spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Macrotyloma spp., Malpighia emarginata, Malus spp., Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Omithopus spp., Oryza spp., Panicum miliaceum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Persea spp., Petroselinum crispum, Phaseolus spp., Phoenix spp., Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Rubus spp., Saccharum spp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Solanum spp., Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Triticosecale rimpaui, Triticum spp., Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otros.

De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo, tal como soja, girasol, canola, alfalfa, colza o algodón. Más preferiblemente, la planta de acuerdo con la presente invención es una planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar. Lo más preferible, la planta es un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, sorgo, mijo o cebada.

Convenientemente, la realización de los métodos de acuerdo con la presente invención resultan en plantas que tienen características mejoradas de crecimiento, seleccionadas entre una o más de: un incremento en el área, un incremento del número de panículas, un incremento en altura, un incremento en el número de semillas, un incremento en el número de semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el índice de cosecha, cada uno con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre.

El término "mayor rendimiento" como se define aquí abarca un incremento en biomasa (peso) en una o más partes de una planta, particularmente las partes que están por encima del suelo (cosechables), mayor biomasa de raíces o mayor biomasa de cualquier otra parte cosechable, con relación a la biomasa de las partes correspondientes de las correspondientes plantas de tipo silvestre. El término también abarca un incremento en el rendimiento de semillas. Que incluye un incremento en la biomasa de la semilla (peso de la semilla) y que se puede ser un incremento en el peso de las semillas por planta o con base en una semilla individual, y/o un incremento en el número de semillas (llenas) y/o en el tamaño de las semillas y/o un incremento en el volumen de las semillas, cada uno con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre. Un incremento en el tamaño y/o el volumen de las semillas puede influir también sobre la composición de las semillas. Un incremento en el rendimiento de las semillas podría ser debido aun incremento en el número y/o el tamaño de las flores. Un incremento en rendimiento podría incrementar también el índice de cosecha, que se expresa como la proporción de la biomasa total sobre el rendimiento de las partes cosechables, tal como las semillas. Un incremento en el rendimiento puede incrementar también el peso de mil granos (TKW) que se extrapola a partir del peso total del número de semillas llenas. Un incremento en TKW puede ser el resultado de un incremento en el tamaño de las semillas y/o en el peso de las semillas.

Tomando al maíz como ejemplo, un incremento en el rendimiento se puede manifestar como uno o más entre lo siguiente: un incremento en el número de plantas por hectárea o acre, un incremento en el número de espigas por planta, un incremento en el número de hileras, el número de granos por hilera, el peso del grano, el peso de mil granos, la longitud/diámetro de las espigas, entre otros. Tomando al arroz como ejemplo, un incremento en el rendimiento se puede manifestar por medio de un incremento en uno o más entre lo siguiente: el número de plantas por hectárea o acre, el número de panículas por planta, el número de espiguillas por panícula, el número de flores por panícula, un incremento en la proporción de semillas llenas, un incremento en el peso de mil granos, entre otros. Un incremento en rendimiento puede resultar también en una arquitectura modificada, o puede presentarse como resultado de una arquitectura modificada.

Ya que las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención tienen mayor rendimiento, es claro que estas plantas exhiben una mayor tasa de crecimiento (al menos durante parte de su ciclo de vida), con relación a la tasa de crecimiento de las correspondientes plantas de tipo silvestre. La mayor tasa de crecimiento puede ser específica para una o más partes de una planta (incluidas las semillas), o para toda la planta en conjunto. Una planta que tiene una mayor tasa de crecimiento puede exhibir incluso una floración temprana. El incremento en la tasa de crecimiento puede tener lugar en una o más etapas en el ciclo de vida de una planta o sustancialmente durante el ciclo de vida completo de la planta. Una mayor tasa de crecimiento durante las etapas tempranas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar un mayor vigor. El incremento en la tasa de crecimiento puede alterar el tiempo de la cosecha de una planta permitiendo que las plantas sean cosechadas más pronto de lo esperado. Si la tasa de crecimiento se incrementa lo suficiente, puede permitir la siembra de más semillas de la misma especie de planta (por ejemplo sembrando y cosechando plantas de arroz seguido por la siembra y cosecha de más plantas de arroz, todo dentro de un período convencional de crecimiento) o de diferentes especies de plantas (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de arroz seguida por, por ejemplo la siembra y cosecha opcional de soja, patatas o cualquier otra planta adecuada), incrementando así la producción anual de biomasa por acre (debido a un incremento en el número de veces (digamos en un año) que cualquier plantas particular puede crecer y cosecharse). Un incremento en la tasa de crecimiento puede permitir también el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más amplia que sus contrapartes de tipo silvestre, ya que las limitaciones territoriales para el desarrollo de un cultivo son a menudo determinada por condiciones ambientales adversas ya sea al momento de la siembra (principios de la temporada) o al momento de la cosecha (finales de la temporada). Tales condiciones adversas se pueden evitar si se acorta el ciclo de cosecha. La mayor velocidad de crecimiento se puede determinar derivando diferentes parámetros de las curvas de crecimiento derivadas de los experimentos de cultivo, pudiendo ser tales parámetros: T-Mid (el tiempo que se toman las plantas para alcanzar 50% de su tamaño máximo) y T-90 (tiempo que les toman las plantas alcanzar 90% de su tamaño máximo).

De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, la realización de los métodos de la invención resulta en plantas que tienen una tasa de crecimiento modificada. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar la tasa de crecimiento de las plantas, cuyo método comprende incrementar la expresión en una planta de un ácido nucleico/gen para CDK de tipo B que codifica a una proteína CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T. En los ejemplo se demuestra un incremento en la tasa de crecimiento por medio del menor tiempo que les toma a las plantas transgénicas para alcanzar la madures que a las plantas de control.

Un incremento en el rendimiento también abarca un mejor desempeño de las plantas bajo condiciones sin estrés así como bajo condiciones de estrés comparado con las plantas de tipo silvestre. Las plantas responden típicamente a la exposición al estrés creciendo más lentamente. Sin embargo, ya que las plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención tienen mayor rendimiento y mayor tasa de crecimiento, es claro que las plantas transgénicas crecerán también más rápidamente durante condiciones de estrés que las correspondientes plantas de tipo silvestre expuestas también a las mismas condiciones de estrés. Las condiciones de estrés serán típicamente los estreses bióticos y/o abióticos (ambientales) diarios a los cuales puede estar expuesta una planta. Los estreses abióticos o ambientales típicos incluyen estreses por temperatura causados por calor atípico o por temperaturas frías/de congelación; el estrés por salinidad; el estrés por agua (sequía o exceso de agua). Los estreses abióticos pueden ser causados también por compuestos químicos. Los estreses bióticos son aquellos estreses típicamente causados por patógenos, tales como bacterias, virus, hongos e insectos.

"Arquitectura modificada" como se la define aquí incluye cualquier cambio en la apariencia de uno o más entre hojas, brotes, tallos, vástagos, inflorescencia (para plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), panículas, polen, óvulos, semilla, embriones, endospermo, recubrimiento de semilla y aleuronas.

De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, la realización de los métodos de acuerdo con la presente invención resulta en plantas que tienen arquitectura modificada. La arquitectura modificada se manifiesta por al menos por medio de uno entre: un incremento en el área por encima del suelo, un incremento en el número de panículas y un incremento en la altura. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para modificar la arquitectura de las plantas, que comprende el incremento de la expresión en una planta de un ácido nucleico/gen para CDK de tipo B que codifica a una proteína CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T.

Los métodos de acuerdo con la presente invención resultan en plantas que tienen características mejoradas de crecimiento, como se describió aquí anteriormente. Estas características ventajosas de crecimiento se pueden combinar con otros rasgos económicamente convenientes, tales como rasgos adicionales de mejoramiento del rendimiento, tolerancia a diferentes estreses, rasgos que modifican diferentes características de arquitectura y/o características bioquímicas y/o fisiológicas.

De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, se proporciona el uso de un ácido nucleico/gen para CDK de tipo B que codifica a una proteína CDK de tipo B que comprende, (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T. Por ejemplo, se pueden utilizar las CDK de tipo B en programas de reproducción. La secuencia de ácido nucleico puede estar sobre un cromosoma, o una parte del mismo, incluyendo al menos la secuencia de ácido nucleico que codifica a la proteína CDK de tipo B y preferiblemente también uno o más miembros de una familia relacionada. En un ejemplo de tal programa de reproducción, se identifica un marcador de ADN que puede estar genéticamente enlazado a un gen capaz de modular la expresión de un ácido nucleico que codifica a una proteína CDK de tipo B en una planta, cuyo gen puede ser un gen que codifica a la misma proteína CDK de tipo B o cualquier otro gen capaz de influenciar directa o indirectamente la expresión de un gen que codifica para CDK de tipo B y/o la actividad y/o los niveles de una proteína CDK de tipo B. Este marcador de ADN puede ser utilizado luego en programas de reproducción para seleccionar plantas que tiene características de crecimiento alteradas.

Las variantes alélicas de las CDK de tipo B pueden ser utilizadas programas particulares de reproducción convencional, tales como en reproducción asistida por marcadores. Tales programas de reproducción requieren algunas veces de la introducción de variantes alélicas en las plantas por medio de tratamiento mutagénico de una planta. Un método mutagénico adecuado es la mutagénesis EMS. Tiene lugar entonces la identificación de variantes alélicas, por ejemplo, por medio de PCR. Esto es seguido por una etapa de selección para la seleccionar variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión que dan lugar a características alteradas de crecimiento de una planta. La selección se lleva a cabo típicamente por el seguimiento de los resultados de crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión, por ejemplo, diferentes variantes alélicas de la SEQ ID NO: 1. Se puede hacer el seguimiento del resultado del crecimiento en un invernadero o en el campo. Etapas opcionales adicionales incluyen cruzamiento de plantas, en las cuales se identificó la variante alélica superior, con otra planta. Esto se podría utilizar, por ejemplo, para hacer una combinación de características fenotípicas de interés. Las variantes alélicas también abarcan Polimorfismos de Nucleótidos Individuales (SNP), así como Polimorfismos Pequeños de Inserción/Supresión (INDEL). El tamaño de los INDEL es usualmente menor a 100 pb). Los SNP y los INDEL forman el conjunto más grande de variantes de secuencia en cadenas polimórficas de ocurrencia natural de la mayoría de los organismos.

La presente invención también se relaciona con el uso de un gen/ácido nucleico para CDK de tipo B que codifica una proteína CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T mejorando las características de crecimiento de las plantas, seleccionadas entre uno o más de: un incremento en el área, un incremento del número de panículas, un incremento en altura, un incremento en el número de semillas, un incremento en el número de semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el índice de cosecha.

El ácido nucleico para CDK de tipo B puede ser aislado de una especie monocotiledónea o dicotiledónea, preferiblemente de la familia Brassicaceae, preferiblemente adicionalmente de Arabidopsis thaliana. El ácido nucleico es preferiblemente para una CDK de tipo B clase 1, tal como una CDK de tipo B clase 1 seleccionada de los ejemplos de las CDK de clase 1 mostradas en la Fig. 1, a saber, CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana, CDK B1;2 de Arabidopsis thaliana, CDKB1;1 de Lycopersicon esculentum (tomate), CDK B1;1 de Antirrhinum majus, CDK B1;1 de Medicago sativa (alfalfa) y CDK B1 de Dunaliella tertiolecta, preferiblemente adicionalmente CDK de tipo B clase 1 es una CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana o una CDK B1;2 de Arabidopsis thaliana. Alternativamente, el ácido nucleico es preferiblemente una CDK de tipo B clase 2, tal como una CDK de tipo B clase 2 seleccionada de los ejemplos mostrados en la Fig.1, a saber, una CDK B2;1 de Arabidopsis thaliana, una CDK B2;2 de Arabidopsis thaliana, una CDK B2;1 de Antirrhinum majus, una CDK B2;1 de Mesembryanthemum crassifolium, una CDK B2;1 1 de Medicago sativa, una CDK B2;1 de Lycopersicon esculentum y una CDK B 1 de Oryza sativa, preferiblemente adicionalmente la CDK de tipo B clase 2 es una CDK B2;2 de Arabidopsis thaliana.

Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B1;1 es como el representado por la SEQ ID NO: 1 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde la proteína CDK B1;1 es como la representada por la SEQ ID NO: 2, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B1;2 es como el representado por la SEQ ID NO: 3 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde la proteína CDK B1;2 es como la representada por la SEQ ID NO: 4, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Más preferiblemente el ácido nucleico para CDK B2;2 es como el representado por la SEQ ID NO: 5 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, y en donde la proteína CDK B2;2 es como la representada por la SEQ ID NO: 6, o un homólogo, derivado o fragmento activo de la misma. Cada uno de los ácidos nucleicos/proteínas CDK B1;1, CDK B1;2 y CDK B2;2 también abarca las variantes de ácido nucleico y los aminoácidos como se describió aquí anteriormente.

La presente invención también se relaciona con el uso de un gen/ácido nucleico que codifica para CDK de tipo B y/o con el uso de una proteína CDK de tipo B como reguladores de crecimiento. Las secuencias de ácido nucleico para CDK de tipo B descritas aquí anteriormente y las secuencias de aminoácidos de la CDK de tipo B descritas aquí anteriormente son claramente útiles en la modificación de las características de crecimiento de las plantas. La presente invención también proporciona una composición que contiene una proteína CDK de tipo B como se describió aquí anteriormente para uso como un regulador de crecimiento.

Por el contrario, las secuencias de acuerdo a la presente invención pueden ser también objetivos interesantes para compuestos agroquímicos, tales como herbicidas. Por lo tanto, la presente invención abarca el uso de los ácidos nucleicos para CDK de tipo B anteriormente mencionados como objetivos para compuestos agroquímicos, tales como herbicidas.

Descripción de las figuras

La Fig. 1 es un árbol filogenético que muestra la relación de las CDK de diferentes plantas.

La Fig. 2 es una vista ampliada de la rama A de CDK del árbol filogenético de la Fig. 1.

La Fig. 3 es un mapa del vector binario para la expresión en Oryza sativa de un gen CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana bajo el control de un promotor putativo de beta-expansina, EXPB8 (SEQ ID NO: 14).

La Fig. 4 es un mapa del vector binario para la expresión en Oryza sativa de un gen CDK B1;2 de Arabidopsis thaliana bajo el control de un promotor GOS2 (SEQ ID NO: 15).

La Fig. 5 es un mapa del vector binario para la expresión en Oryza sativa de un gen CDK B2;2 de Arabidopsis thaliana bajo el control de un promotor GOS2 (SEQ ID NO: 15).

La Fig. 6 detalla ejemplos de secuencias útiles en la realización de los métodos de acuerdo con la presente invención.

La Fig. 7 es una alineación de secuencias múltiples CLUSTAL W (1.82) para algunas secuencias representativas tipo B de CDK. En negrilla se encuentra un motivo en las CDK de tipo B; subrayado está un dominio catalítico de quinasa y en itálicas se muestra un dominio de quinasa para la activación del bucle T (Magyar y colaboradores, 1997 (Plant Cell 9 (2), 223 - 235)).

Ejemplos

Se describirá ahora la presente invención con referencia a los siguientes ejemplos, que son únicamente a manera de ilustración.

Manipulación del ADN: a menos que se establezca otra cosa, se llevan a cabo las técnicas de ADN recombinante de acuerdo con los protocolos estándar descritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel y colaboradores, (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales y métodos estándar para el trabajo molecular con plantas están descritos en Plant Molecular Biology Labfase (1993) por R. D. D. Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU).

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Ejemplo 1

Clonación del Gen CDK B1;1

Se amplifico la CDK B1;1 de Arabidopsis por medio de PCR utilizando como molde una genoteca de ADNc de plántulas de Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, RU). Después de transcripción inversa del ARN extraído de las plántulas, se clonaron los ADNc dentro del pCMV Sport 6.0. El tamaño promedio del inserto del banco era de 1,5 kb y el número original de clones era de 1,59x10^{7} cfu. Se determinó que el título original era de 9,6x10^{5} cfu/ml y, después de la primera amplificación, de 6x10^{11} cfu/ml. Después de la extracción del plásmido, se utilizaron 200 ng del molde en una mezcla de PCR de 50 \mul. Se utilizaron iniciadores prm0350 (codón de inicio sentido, en negrillas, sitio AttB1 en itálicas: 5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACA ATGGAGAAGTACGAGAAGCTAGA3') y prm0351 (codón de detención inverso, complementario, en negrillas, sitio AttB2 en itálicas: 5' GGGGACCACTTTG TACAAGAAAGCTGGGT TCAGAACTGAGACTTGTCAAGG3'), que incluyen los sitios AttB para recombinación Gateway, para amplificación por PCR. Se llevo a cabo la PCR utilizando Hifi Taq ADN polimerasa en condiciones estándar. Se amplificó un fragmento de PCR de 930 pb y se lo purificó utilizando también métodos estándar. Se realizó luego la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual se recombinó el fragmento de PCR in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada", p0438. Se adquirió el plásmido pDONR201 a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

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Ejemplo 2

Vector de Construcción - CDK B1;1

Se utilizó posteriormente el clon de entrada p0438 en una reacción LR con p3169, un vector de destinación utilizado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los bordes del T-ADN: un marcador seleccionable de una planta, un marcador de muestreo de una planta y un casete Gateway destinado a recombinación in vivo LR con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Un promotor putativo de beta-expansina para expresión en tejido de expansión joven está localizado secuencia arriba de este casete Gateway.

Después de la etapa de recombinación LR, se transformó el vector de expresión resultante como se muestra en la Fig. 3 (CDK B1;1: sobreexpresión de beta-expansina) en plantas de Agrobacterium y posteriormente de Oryza sativa. A las plantas de arroz transformadas se las permitió crecer y luego fueron examinadas en relación con diferentes parámetros como se describe en el Ejemplo 7.

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Ejemplo 3

Clonación del Gen - CDK B1;2

Se amplifico la CDK B1;2 de Arabidopsis por medio de PCR utilizando como molde una genoteca de ADNc de plántulas de Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, RU). Después de transcripción inversa del ARN extraído de las plántulas, se clonaron los ADNc dentro del pCMV Sport 6.0. El tamaño promedio del inserto del banco era de 1,5 kb y el número original de clones era de 1,59x10^{7} cfu. Se determinó que el título original era de 9,6x10^{5} cfu/ml y, después de la primera amplificación, de 6x10^{11} cfu/ml. Después de la extracción del plásmido, se utilizaron 200 ng del molde en una mezcla de PCR de 50 \mul. Se utilizaron iniciadores prm439 (codón de inicio sentido, en negrillas, sitio AttB1 en itálicas: 5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACA ATGGAGAAATACGAGAAGCTC 3') y prm4401 (codón de detención inverso, complementario, en negrillas, sitio AttB2 en itálicas: 5' GGGGAC CACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGG TCAGAACTGAGATTTGTC 3') que incluyen los sitios AttB para recombinación Gateway, para amplificación por PCR. Se llevo a cabo la PCR utilizando Hifi Taq ADN polimerasa en condiciones estándar. Se amplificó un fragmento de PCR de 936 pb y se lo purificó utilizando también métodos estándar. Se realizó luego la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual se recombinó el fragmento de PCR in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada", p538. Se adquirió el plásmido pDONR201 a Invitrogen, como parte de la tecnología
Gateway®.

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Ejemplo 4

Vector Construction CDK B1;2

Se utilizó posteriormente el clon de entrada p538 en una reacción LR con p640, un vector de destinación utilizado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los bordes del T-ADN: un marcador seleccionable de una planta, un marcador de muestreo de una planta y un casete Gateway destinado a recombinación in vivo LR con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Se ubicó un promotor GOS2 para sobrerregulación secuencia arriba de este casete Gateway.

Después de la etapa de recombinación LR, se transformó el vector de expresión resultante como se muestra en la Fig. 4 (CDK B1;2: sobreexpresión de GOS2) en plantas de Agrobacterium y posteriormente de Oryza sativa. A las plantas de arroz transformadas se las permitió crecer y luego fueron examinadas en relación con diferentes parámetros como se describe en el Ejemplo 7.

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Ejemplo 5

Gene Cloning - CDK B2;2

Se amplifico la CDK B2;2 de Arabidopsis por medio de PCR utilizando como molde una genoteca de ADNc de plántulas de Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, RU). Después de transcripción inversa del ARN extraído de las plántulas, se clonaron los ADNc dentro del pCMV Sport 6.0. El tamaño promedio del inserto del banco era de 1,5 kb y el número original de clones era de 1,59x10^{7} cfu. Se determinó que el título original era de 9,6x10^{5} cfu/ml, después de la primera amplificación, de 6x10^{11} cfu/ml. Después de la extracción del plásmido, se utilizaron 200 ng del molde en una mezcla de PCR de 50 \mul. Se utilizaron iniciadores prm2213 (codón de inicio sentido, en negrillas, sitio AttB1 en itálicas: 5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACA ATGGACAACAATGGAGTTAA 3') y prm2214 (codón de detención inverso, complementario, en negrillas, sitio AttB2 en itálicas: 5' GGGGACCACTTTGTACAA GAAAGCTGGGT TCAGAGAGAGGACTTGTCAG 3'), que incluyen los sitios AttB para recombinación Gateway, para amplificación por PCR. Se llevo a cabo la PCR utilizando Hifi Taq ADN polimerasa en condiciones estándar. Se amplificó un fragmento de PCR de 948 pb y se lo purificó utilizando también métodos estándar. Se realizó luego la primera etapa del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante la cual se recombinó el fragmento de PCR in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada", p2660. Se adquirió el plásmido pDONR201 a Invitrogen, como parte de la tecnología Gateway®.

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Ejemplo 6

Vector Construction - CDK B2;2

Se utilizó posteriormente el clon de entrada p2660 en una reacción LR con p640, un vector de destinación utilizado para la transformación de Oryza sativa. Este vector contiene como elementos funcionales dentro de los bordes del T-ADN: un marcador seleccionable de una planta, un marcador de muestreo de una planta y un casete Gateway destinado a recombinación in vivo LR con la secuencia de interés ya clonada en el clon de entrada. Se ubicó un promotor pGOS2 para sobreexpresión secuencia arriba de este casete Gateway.

Después de la etapa de recombinación LR, se transformó el vector de expresión resultante como se muestra en la Fig. 5 (CDK B2;2: sobreexpresión de GOS2) en plantas de Agrobacterium y posteriormente de Oryza sativa. A las plantas de arroz transformadas se las permitió crecer y luego fueron examinadas en relación con diferentes parámetros como se describe en el Ejemplo 7.

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Ejemplo 7

Evaluación y Resultados

Se generaron aproximadamente 15 a 20 transformantes independientes de arroz T0. Se transfirieron los transformantes primarios de las cámaras de cultivo de tejido a un invernadero para crecimiento y cosecha de semilla T1. Se retuvieron 5 eventos, de los cuales la progenie T1 segregó 3:1 para la presencia/ausencia del transgén. Para cada uno de estos eventos, se seleccionaron aproximadamente 10 plántulas T1 que contenían al transgén (hetero y homocigotos) y aproximadamente 10 plántulas T1 que carecían del transgén (nulicigotos), haciendo seguimiento visual de la expresión del marcador.

Análisis estadístico: prueba t y prueba F

Se utilizó un ANOVA de dos factores (análisis de variantes) como modelo estadístico para la evaluación completa de las características fenotípicas de la planta. Se llevó a cabo una prueba F sobre todos los parámetros medidos, para todas las plantas de todos los eventos transformados con el gen de interés. Se llevó a cabo la prueba F para revisar el efecto del gen sobre todos los eventos de transformación y para determinar el efecto total del gen o "el efecto global del gen". Los datos significativos, como se determinaron por medio del valor de la prueba F, indican un efecto del "gen", lo cual significa que el fenotipo observado es provocado por causas más allá de la simple presencia o la posición del gen. En el caso de la prueba F, el umbral de significación para un efecto global del gen está establecido en un nivel de probabilidad del 5%.

Para revisar el efecto de los genes en un evento, es decir, para un efecto específico en línea, se llevó a cabo una prueba t dentro de cada evento utilizando conjuntos de datos de las plantas transgénicas y las correspondientes plantas nulas. "Plantas nulas" o "Segregantes nulos" son las plantas tratadas en la misma forma que las plantas transgénicas, pero de las cuales se ha segregado el transgén. Las plantas nulas pueden ser descritas también como los transformantes homocigotos negativos. El umbral de significación para la prueba t está establecido en un nivel de probabilidad del 10%. Dentro de una población de eventos de transformación, algunos eventos pueden estar por debajo o por encima de este umbral de la prueba t. Esto se basa en la hipótesis de que un gen podría tener únicamente un efecto en ciertas posiciones en el genoma, y que la ocurrencia de este efecto que depende de la posición no es raro. Esta clase de efecto del gen puede ser denominada también como un "efecto de línea de un gen". El valor p se obtiene por comparación del valor t con la distribución t o alternativamente, por comparación F con la distribución F. El valor p significa la probabilidad de que la hipótesis nula (siendo la hipótesis nula que "no existe efecto del transgén") sea
correcta.

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7.1 Mediciones del crecimiento vegetativo

Se transfirieron las plantas T1 seleccionadas (aproximadamente 10 con el transgén y aproximadamente 10 sin el transgén) a un invernadero. Cada planta recibió una etiqueta con un código de barras único para relacionar sin ambigüedades los datos del fenotipo con la planta correspondiente. Se cultivaron las plantas T1 seleccionadas sobre tierra en macetas de 10 cm de diámetro bajo las siguientes características ambientales: período de luz = 11,5 h, intensidad de la luz = 30.000 lux o más, temperatura durante el día = 28ºC o superior, temperatura durante la noche = 22ºC, humedad relativa = 60 - 70%. Se cultivaron las plantas transgénicas y los correspondientes nulicigotos uno al lado del otro en posiciones aleatorias. A partir de la etapa de cultivo hasta la etapa de maduración, se transfirieron varias veces las plantas a través de una cámara digital para toma de imágenes y se las fotografió. Se tomaron cada vez imágenes digitales puntuales (2048 x 1536 píxeles, 16 millones de colores) de cada planta al menos a partir de seis ángulos diferentes. Se derivaron los parámetros descritos más abajo en una forma automatizada a partir de todas las imágenes digitales de todas las plantas, utilizando un software para análisis de
imágenes.

En las tablas de resultados que se muestran a continuación, cada fila corresponde a un evento. Se reportan las diferencias numéricas entre las plantas positivas y las plantas negativas (dif) así como la diferencia en porcentaje entre estas plantas (dif en %). El valor p significa la probabilidad producida por la prueba t para cada línea de planta. La última fila muestra los números promedio para todos los eventos. En esta fila, el valor p es el valor p de la prueba
F.

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(a) Área de la planta por encima del suelo

Se determinó el área de la planta por encima del suelo haciendo un recuento del número total de píxeles de las partes de la planta por encima del suelo discriminadas de las que están por debajo del suelo. Se promedió este valor para las fotografías tomadas al mismo tiempo desde los diferentes ángulos y se los convirtió a un valor físico de superficie expresado en mm cuadrados por calibración. Los experimentos muestran que el área de la planta por encima del suelo medida de esta manera se correlaciona con la biomasa de las partes de la planta por encima del
suelo.

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TABLA 2 T1: Área de la planta por encima del suelo - CDK B1;1

5

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Como se muestra en la Tabla 1, la línea 3 produjo un incremento significativo en el área por encima del suelo para plantas transgénicas con relación a las plantas de control, con un valor p a partir de la prueba t de 0,0011. Las líneas 2 y 4 también mostraron un incremento en el área de la planta por encima del suelo con relación a aquellas de las plantas de control. Se observó un incremento total del 10% en el área por encima del suelo de las plantas transgénicas comparada con las plantas de control.

TABLA 3 T1: Área de la planta por encima del suelo - CDK B1;2

6

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Como se muestra en la Tabla 2, las líneas 11 y 12 produjeron un incremento significativo en el área de la planta por encima del suelo con respecto a los valores p de la prueba t de 0,0002 y 0,0573. Fue claro también un efecto total del gen de un valor p de 0,0178 a partir de la prueba F. Se observó un incremento total del 11% en el área por encima del suelo de las plantas transgénicas comparada con las plantas de control. La línea 11 fue confirmada también en la generación T2 (ver Tabla 4 a continuación) con un incremento del 30% comparado con los correspondientes nulicigotos y con un valor p a partir de la prueba t de 0,0002.

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TABLA 4 T2: Área de la planta por encima del suelo - CDK B1;2

7

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(b) Altura de la planta

Se determinó la altura de la planta por medio de la distancia entre las líneas horizontales que pasan a través del borde superior de la maceta y el píxel más elevado correspondiente a una parte de la planta por encima del suelo. Este valor fue promediado para las fotografías tomadas en el mismo momento a partir de diferentes ángulos, y convertido, por calibración, a una distancia física expresada en mm. Los experimentos mostraron que la altura de la planta medida de esta manera se correlaciona con la altura de la planta medida manualmente con una regla.

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TABLA 5 T1: Altura - CDK B1;1

8

En la Tabla 5 se muestran los resultados. Como se observa, la línea 3 mostró un incremento significativo en la altura de la planta con relación a las correspondientes plantas de control (con un valor p a partir de la prueba t de 0,0045).

TABLA 6 T1: Altura - CDK B1; 2

9

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TABLA 7 T2: Altura - CDK B1;2

10

La Tabla 6 muestra un incremento en altura en la generación T1 para las líneas 11 y 12. Como se muestra en la Tabla 7, la línea 11 mostró un incremento significativo en altura en las plantas de la generación T2 con relación a las plantas de control y produjo un valor p a partir de la prueba t de 0,019.

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7.2 Mediciones de parámetros relacionados las semillas

Se cosecharon, las panículas primarias maduras, se las empacó en bolsas, marcadas con un código de barras y luego secadas durante tres días en el horno a 37ºC. Se trillaron luego las panículas y se recolectaron y contaron todas las semillas. Se separaron las cáscaras llenas de las cáscaras vacías utilizando un dispositivo de soplado de aire. Se descartaron las cáscaras vacías y se contó nuevamente la fracción restante. Se pesaron las cáscaras llenas sobre una balanza analítica. Este procedimiento produjo el conjunto de parámetros relacionados con las semillas descritos a continuación.

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(c) Número total de semillas por planta

Este fue medido contando el número de cascaras cosechadas de una planta.

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TABLA 8 T1: Número total de semillas - CDK B1;1

11

Los resultados se muestran en la Tabla 8 anterior. Como se observa, la línea 3 produjo un incremento significativo en el número total de semillas producidas por las plantas transgénicas con relación al número total de semillas producidas por las plantas de control (con un valor p a partir de la prueba t de 0,0002).

TABLA 9 T2: Número total de semillas - CDK B1;2

12

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Como se observa en la Tabla 9, la línea 11 mostró un incremento significativo (con un valor p a partir de la prueba t de 0,0047) en el número total de semillas de las plantas transgénicas con relación al número total de semillas de las plantas de control.

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(d) Número de semillas llenas

Se determinó el número de semillas llenas contando el número se cáscaras llenas que quedaron después de la etapa de separación.

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TABLA 10 T1: Número de semillas llenas - CDK B1;1

13

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Los resultados se muestran en la Tabla 10 anterior. Como se observa, la línea 3 produjo un incremento significativo en el número de semillas llenas con relación a aquel de las plantas de control (con un valor p a partir de la prueba t de 0,0072).

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TABLA 11 T1: Número de semillas llenas - CDK B1;2

14

TABLA 12 T2 Número de semillas llenas - CDK B1;2

16

Como se observa en la Tabla 11, la línea 11 mostró un incremento en el número de semillas llenas con relación a las plantas de control con un valor p a partir de la prueba t de 0,0091. Se observó una diferencia total de 14% para el número de semillas llenas de plantas transgénicas con relación al número de semillas llenas para las correspondientes plantas de control. Los resultados de la generación T2 se observan en la Tabla 12, con la línea 11 desempeñándose particularmente bien.

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(e) Rendimiento total de semillas por planta

Se midió el rendimiento total de semillas pesando todas las cáscaras llenas cosechadas de una planta.

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TABLA 13 T1: Peso total de las semillas - CDK B1;1

17

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Los resultados se muestran en la Tabla 13 anterior. Como se observa, la línea 13 mostró un incremento significativo (con un valor p a partir de la prueba t de 0,005) en el peso total de las semillas de las plantas transgénicas con relación al peso total de las semillas de las correspondientes plantas no transgénicas. Se observó un incremento total del 16% para el peso total de las semillas de las plantas transgénicas versus el peso total de las semillas de las plantas de control.

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TABLA 14 T1: Peso total de las semillas - CDK B1;2

18

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Como se observa en la Tabla 14, la línea 11 mostró un incremento significativo en el peso total de las semillas de las plantas transgénicas con relación al peso total de las semillas de las plantas de control con un valor p a partir de la prueba t de 0,0139. Los resultados de la generación T2 se observan en la Tabla 15 a continuación, con la línea 11 desempeñándose particularmente bien.

TABLA 15 T2: Peso total de semillas - CDK B1;2

19

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(f) Indice de cosecha de las plantas

El índice de cosecha en la presente invención se define como la relación entre el rendimiento total de semillas y el área por encima del suelo (mm^{2}), multiplicado por un factor 106.

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TABLA 16 T1: Índice de cosecha - CDK B1;1

21

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Los resultados se muestran en la Tabla 16 anterior. Como se observa, la línea 3 mostró un mayor índice de cosecha para las plantas transgénicas con relación al índice de cosecha de las plantas de control (con un valor p a partir de la prueba t de 0,0201).

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(g) Peso de Mil Granos

Peso de Mil Granos (TKW): este parámetro se extrapola del número de semillas llenas contadas y su peso total.

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TABLA 18 T1: Peso de Mil Granos (TKW) - CDK B1;2

22

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TABLA 19 T2: Peso de mil granos (TKW) - CDK B1;2

23

Los resultados de las generación T1 se muestran en la Tabla 18. La Tabla 19 muestra los resultados de la generación T2. Como se observa, la línea 11 muestra un incremento significativo en el TKW de las plantas transgénicas con relación al TKW de las plantas de control con un valor p a partir de la prueba t de 0,0347.

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(h) Duración del ciclo - CDK B2;2

Se modelaron las mediciones semanales del área de la planta para obtener una curva de crecimiento para cada planta. Se graficó el área de la planta (en mm^{2}) contra el tiempo (en días) y a partir de la curva de crecimiento resultante se calcularon los siguientes parámetros.

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TABLA 20 T1: Tasa de crecimiento - CDK B2;2

24

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Los resultados se muestran en la Tabla 13 anterior. Como se observa, las líneas 21 y 27 muestran incrementos significativos en la tasa de crecimiento de las plantas transgénicas con relación a la tasa de crecimiento de las plantas de control, con incrementos de 4 días observados en ambos casos.

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Ejemplo 8

Maíz Transgénico que Expresa una CDK de Tipo B

Se clona una CDK de tipo B bajo el control de un promotor constitutivo o de un promot preferido del tejido joven en expansión en un vector de transformación de la planta adecuado para la transformación del maíz mediada por Agrobacterium. Los vectores y métodos para la transformación del maíz se seleccionan de aquellos descritos en cualquiera de los documentos: EP0604662, EP0672752, EP0971578, EP0955371, EP0558676, Ishida y colaboradores, (Nat. Biotechnol. 1996 Jun; 14(6): 745-50); y Frame y colaboradores, (Plant Physiol. 2002 May; 129(1):
13-22).

Las plantas transgénicas elaboradas por estos métodos se cultivan en el invernadero para la producción de semillas T1. Se revisa la heredabilidad y el número de copias del transgén por medio de PCR cuantitativo en tiempo real y análisis de transferencias tipo Southern. Los niveles de expresión del transgén se determinan por medio de PCR inversa y análisis tipo Northern. Se seleccionan las líneas transgénicas con inserciones de copias individuales del transgén y con niveles variables de expresión del transgén para la producción de semillas T2.

Se germinaron las semillas de la progenie y crecieron en un invernadero en condiciones adaptadas para el maíz (período de luz 16:8, temperatura durante el día 26 - 28ºC y temperatura durante la noche de 22 - 24ºC) así como condiciones de bajo contenido de agua, bajo contenido de nitrógeno, y exceso de NaCl. En el caso de autofecundación, se utilizan como controles segregantes nulos de la misma línea parental, así como de plantas de tipo silvestre del mismo cultivo. Se evalúan las plantas de la progenie resultantes de la autofecundación o de los cruzamientos para los diferentes parámetros de biomasa y de crecimiento, incluidos la altura de la planta, el espesor del tallo, el número de hojas, el área total por encima del suelo, el verdor de las hojas, el tiempo de maduración, el tiempo de floración, el número de espigas, el tiempo de cosecha. Se evalúan también las semillas de estas líneas para los cambios en diferentes parámetros, tales como el tamaño del grano, el rendimiento total de granos por planta, y la calidad del grano (contenido de almidón, contenido de proteína y contenido de aceite).

Se seleccionan las líneas que se mejoran en forma más significativa comparadas con las correspondientes líneas de control para un análisis de campo posterior y reproducción asistida por marcadores, con el objetivo de transferir los rasgos transgénicos validados en el terreno en germoplasma comercial. El análisis del maíz para los parámetros relacionados con el crecimiento y la productividad en el campo, se lleva a cabo utilizando protocolos bien establecidos. En forma similar, la introgresión de loci específicos (tal como los transgenes que contienen loci) de un germoplasma en otro se lleva a cabo también utilizando protocolos bien establecidos.

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

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\bullet R. D. D. Croy. Plant Molecular Biology Labfase. BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications (UK), 1993 [0081]

<110> CropDesign N. V.

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<120> Plantas que tienen características modificadas de crecimiento y el método para la elaboración de las mismas

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<130> CD-103-PCT

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<150> EP 03077811.2

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<151> 2003-09-05

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<160> 21

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<170> PatentIn versión 3.3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 930

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

26

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 309

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

27

\hskip0,8cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 936

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

29

\hskip0,8cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 311

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

31

\hskip0,8cm

310

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 948

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 315

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

33

\hskip0,8cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1115

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

35

\hskip0,8cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

37

\hskip0,8cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

380

\hskip0,8cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

40

\hskip0,8cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

42

\hskip0,8cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

44

\hskip0,8cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

46

\hskip0,8cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1243

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

48

\hskip0,8cm

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2191

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Oryza sativa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip0,8cm

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador sentido: prm0350

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggag aagtacgaga agctaga

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador antisentido: prm0351

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cagaactgag acttgtcaag g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador sentido: prm439

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggag aaatacgaga agctc

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador antisentido: prm440

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg gtcagaactg agatttgtc

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador sentido: prm2213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggac aacaatggag ttaa

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador antisentido: prm2214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cagagagagg acttgtcag

\hfill

49

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Claims (18)

1. Un método para mejorar las características de crecimiento de una planta seleccionadas de una o más entre: un incremento en el área, un incremento del número de panículas, un incremento en altura, un incremento en el número de semillas, un incremento en el número de semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el índice de cosecha, dicho método comprendiendo un incremento en la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica a una proteína CDK de tipo B por medio de la introducción y expresión en una planta de una construcción genética que comprende un ácido nucleico para CDK de tipo B que codifica una proteína CDK de tipo B que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T.

2. Un método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde dicha CDK de tipo B se deriva de una fuente de una planta, alga u hongo.

3. Un método de acuerdo a la reivindicación 2, donde dicha CDK de tipo B derivada de una planta es preferiblemente de una planta dicotiledónea, preferiblemente adicionalmente de la familia Brassicaceae, preferiblemente la secuencia de ácido nucleico es de Arabidopsis thaliana.

4. Un método de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha CDK de tipo B es una CDK de tipo B clase 1, preferiblemente una CDK B1;1 de Arabidopsis thaliana o una CDK B1;2 de Arabidopsis thaliana.

5. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones, en donde dicha CDK de tipo B es una CDK de tipo B clase 2, preferiblemente una CDK B2;2 de Arabidopsis thaliana.

6. Un método de acuerdo a la reivindicación 4, en donde dicho ácido nucleico para CDK B1;1 es como el representado por la SEQ ID NO: 1 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con él, en donde dicha porción o secuencia de hibridación codifica una proteína CDK de tipo B que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T.

7. Un método de acuerdo a la reivindicación 4, en donde dicho ácido nucleico para CDK B1;2 es como el representado por la SEQ ID NO: 3 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con él, en donde dicha porción o secuencia de hibridación codifica una proteína CDK de tipo B que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T.

8. Un método de acuerdo a la reivindicación 5, en donde dicho ácido nucleico para CDK B2;2 es como el representado por la SEQ ID NO: 5 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico que hibrida con él, en donde dicha porción o secuencia de hibridación codifica una proteína CDK de tipo B que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T.

9. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha CDK de tipo B se selecciona entre

(a)

Variantes alternativas de empalme de un ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B;

(b)

Variantes alélicas de un ácido nucleico/gen que codifica para CDK de tipo B;

(c)

Homólogos, derivados y fragmentos activos de una proteína CDK de tipo B;

(d)

Las CDK mutantes de tipo B.

en donde dicha CDK de tipo B de (a), (b), (c), y (d) contienen cada una: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T.

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10. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 4, 6, 9, en donde la expresión de dicho ácido nucleico para CDK B1;1 está dirigida por un promotor preferido del tejido joven de expansión, preferiblemente donde dicho promotor es un promotor de beta expansina.

11. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 4, 7, 9, en donde la expresión de dicho ácido nucleico para CDK B1;2 y en donde de dicho ácido nucleico para CDK B2;2 está dirigida por un promotor constitutivo, preferiblemente donde dicho promotor es un promotor GOS2.

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12. Las plantas obtenidas por un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dichas plantas contienen una construcción genética que comprende:

I.

Un ácido nucleico para CDK de tipo B que codifica una proteína CDK de tipo B que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T; y

II.

una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión del ácido nucleico de I, comprendiendo dicha secuencia de control un promotor constitutivo GOS2 o un promotor de beta expansina.

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13. Una construcción que comprende:

(a)

Un ácido nucleico/gen para CDK de tipo B que codifica una proteína CDK de tipo B que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T;

(b)

Una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión del ácido nucleico de (a), dicha secuencia de control que contiene un promotor constitutivo GOS2, un promotor de beta expansina; y opcionalmente

(c)

una secuencia de terminación de la transcripción.

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14. Una construcción de acuerdo a la reivindicación 13, en donde dicho ácido nucleico de (a) es un ácido nucleico para CDK B1;2 como el representado por la SEQ ID NO: 3 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, cuyo pacido nucleico codifica una proteína CDK B1;2 como la representada por la SEQ ID NO: 4, o un homólogo, derivado o fragmento activo del mismo, donde dicha porción o secuencia de hibridación codifica una proteína CDK de tipo B que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T, y en donde dicho homólogo, derivado o fragmento activo comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T.

15. Una construcción de acuerdo a la reivindicación 13, en donde dicho ácido nucleico de (a) es un ácido nucleico para CDK B2;2 como el representado por la SEQ ID NO: 5 o por una porción del mismo, o por una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar con él, cuyo pacido nucleico codifica una proteína CDK B2;2 como la representada por la SEQ ID NO: 6, o un homólogo, derivado o fragmento activo del mismo, donde dicha porción o secuencia de hibridación codifica una proteína CDK de tipo B que contiene: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T, y en donde dicho homólogo, derivado o fragmento activo comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T.

16. Un método para la producción de una planta transgénica que tiene características mejoradas de crecimiento seleccionadas entre una cualquiera o más de: un incremento en el área, un incremento del número de panículas, un incremento en altura, un incremento en el número de semillas, un incremento en el número de semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el índice de cosecha, dicho método comprendiendo las etapas de:

(a)

la introducción en una planta o en una célula de una planta por medio de la transformación de una planta de una construcción genética que comprende un ácido nucleico/gen para CDK de tipo B que codifica a una proteína CDK de tipo B que comprende: (i) un motivo PPTALRE sin falta de coincidencias o con una falta de coincidencia en la posición 2 y/o en la 4 de izquierda a derecha; (ii) un dominio catalítico de quinasa; y (iii) un dominio de la quinasa para activación del bucle T;

(b)

el cultivo de la células de la planta bajo condiciones que promuevan la regeneración y el crecimiento de una planta madura.

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17. Una planta transgénica que tiene características mejoradas de crecimiento seleccionadas entre una cualquiera o más de: un incremento en el área, un incremento del número de panículas, un incremento en altura, un incremento en el número de semillas, un incremento en el número de semillas llenas, un incremento en el peso total de las semillas, un incremento en el peso de mil granos (TKW) y un incremento en el índice de cosecha, teniendo dicha planta una mayor expresión de un ácido nucleico para CDK de tipo B que codifica una proteína CDK de tipo B con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre y cuya planta incluye una construcción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15.

18. Una planta trangénica de acuerdo a la reivindicación 17, en donde dicha planta es una planta monocotiledónea.