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ES2332774T3 - 15603, un miembro de la familia de canales ionicos humanos. - Google Patents

15603, un miembro de la familia de canales ionicos humanos. Download PDF

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ES2332774T3
ES2332774T3 ES02794118T ES02794118T ES2332774T3 ES 2332774 T3 ES2332774 T3 ES 2332774T3 ES 02794118 T ES02794118 T ES 02794118T ES 02794118 T ES02794118 T ES 02794118T ES 2332774 T3 ES2332774 T3 ES 2332774T3
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ES
Spain
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protein
seq
amino acid
nucleic acid
sequence
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ES02794118T
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Katherine M. Galvin
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Millennium Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Millennium Pharmaceuticals Inc
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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Abstract

Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico, que comprende: i) poner en contacto un compuesto candidato con la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1; y ii) ensayar la capacidad del compuesto de inhibir la expresión de la molécula de ácido nucleico, identificando de esta manera un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico.

Description

15603, un miembro de la familia de canales iónicos humanos.
Muchos acontecimientos intercelulares e intracelulares dependen de la regulación de la concentración de ciertos iones tales como calcio, sodio, potasio y cloro dentro de la célula. Se han descubierto canales iónicos que regulan el flujo de aniones o cationes a través de una membrana basándose en el voltaje, pH, fosforilación y unión a ligandos. Típicamente, un canal iónico consiste en múltiples dominios transmembrana que forman un canal a través del cual los iones pasan desde un lado de la membrana al otro. Estos canales iónicos pueden jugar papeles importantes en cómo una célula responde a hormonas o neurotransmisores con un aumento de la actividad de enzimas tales como la fosfolipasa C y una elevación posterior en la concentración de calcio libre intracelular (Ca^{+2}). El aumento en la concentración de calcio intracelular puede producirse como resultado de la liberación del calcio desde reservas intracelulares así como por una entrada de calcio a través de la membrana plasmática.
Se cree que las proteínas de potencial receptor transitorio (TRP) de Drosophila y algunos homólogos de mamíferos (proteínas TRPC) median la entrada capacitiva de Ca^{+2} (Hofmann et al., Nature 397:259-263 (1999)). Se han clonado y caracterizado siete genes homólogos de mamífero (TRPC 1 a TRPC 7). TRPC6, junto con TRPC 3 se han identificado como los primeros miembros de una nueva familia funcional de canales catiónicos que funcionan con segundo mensajero, que se activan por diacilglicerol independientemente de la proteína quinasa C (Hofmann et al., supra). Recientemente se ha demostrado que, probablemente, TRPC6 es el componente esencial del canal catiónico no selectivo activado por el adrenoceptor \alpha1 (\alpha1-AR-NSCC), que puede servir como ruta de entrada de Ca^{2+} independiente de agotamiento de reservas durante el aumento de la actividad simpática. El receptor de andrógenos \alpha1 (\alpha1-AR) se expresa de forma generalizada en el sistema vascular. La estimulación de \alpha1-AR conduce a la activación de la fosfolipasa C\beta acoplada a la proteína G, que cataliza la formación a partir del fosfoinosítido de 1, 4, 5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol, que conduce a la liberación del Ca^{2+} almacenado y a la entrada sostenida de Ca^{2+}. La presente invención se refiere a una proteína TRP6 humana, 15603.
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de un nuevo miembro de la familia de los canales iónicos, denominado en la presente memoria "15603". La secuencia de nucleótidos que codifica 15603 se muestra en la SEC ID Nº: 1, y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido 15603 se muestra en la SEC ID Nº: 2. Además, la secuencia de nucleótidos de la región codificante se representa en la SEC ID Nº: 3.
La invención proporciona métodos para explorar compuestos que modulan la expresión o actividad de los polipéptidos o ácidos nucleicos de 15603.
En un aspecto, la invención proporciona un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico, que comprende: i) poner en contacto un compuesto candidato con la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1; y ii) ensayar la capacidad del compuesto de inhibir la expresión de la molécula de ácido nucleico, identificando de esta manera un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico.
En un aspecto alternativo, la invención proporciona un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico, que comprende: i) poner en contacto un compuesto candidato con un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1 o una célula que expresa el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1; y ii) ensayar la capacidad del compuesto de inhibir la actividad de canal iónico del polipéptido, identificando de esta manera un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico. En una realización, dicho ensayo es un ensayo basado en células y dicho compuesto candidato se pone en contacto con una célula que expresa dicha polipéptido. En realizaciones alternativas, dicho ensayo es un ensayo sin células. En una realización, dicho polipéptido se proporciona como un canal iónico en una membrana plasmática. En una realización, dicho ensayo de la capacidad del compuesto de inhibir la actividad del polipéptido comprende medir el flujo de iones a través de dicho canal iónico. En otra realización, el flujo de iones a través de dicho canal iónico se mide por registro de pinzamiento zonal.
En una realización, los métodos mencionados anteriormente para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico comprenden confirmar la capacidad de un compuesto de ensayo de inhibir la expresión de la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1 o de inhibir el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1 en un modelo animal.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa una secuencia de ADNc (SEC ID Nº: 1) y la secuencia de aminoácidos prevista (SEC ID Nº: 2) de la proteína 15603 humana. También se muestra la fase de lectura abierta iniciada por metionina de la proteína 15603 humana (sin las regiones no traducidas 5' y 3' de la SEC ID Nº: 1) como secuencia codificante, SEC ID
Nº: 3.
\newpage
La Figura 2 representa un gráfico de hidropatía de la proteína 15603 humana. Los restos relativamente hidrófobos se muestran encima de la línea horizontal de trazos, y los restos relativamente hidrófilos están debajo de la línea horizontal de trazos. Los restos de cisteína (cys) se indican por líneas cortas verticales justo por debajo del gráfico de hidropatía. Se indican los números correspondientes a la secuencia de aminoácidos de la proteína 15603 humana - Los polipéptidos de la invención incluyen fragmentos que incluyen: todo o parte de una secuencia hidrófoba, por ejemplo, una secuencia por encima de la línea de trazos, por ejemplo, la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 162 al 172, desde aproximadamente el aminoácido 215 al 225, desde aproximadamente el aminoácido 325 al 335, desde aproximadamente el aminoácido 401 al 431, desde aproximadamente el aminoácido 441 al 461, desde aproximadamente el aminoácido 486 al 506, desde aproximadamente el aminoácido 521 al 551, desde aproximadamente el aminoácido 591 al 616, desde aproximadamente el aminoácido 631 al 656, desde aproximadamente el aminoácido 665 al 675, desde aproximadamente el aminoácido 701 al 731, y desde aproximadamente el aminoácido 770 a 780 de la SEC ID Nº: 2; todo o parte de una secuencia hidrófila, por ejemplo, una secuencia por debajo de la línea de trazos, por ejemplo, la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 20 al 32, desde aproximadamente el aminoácido 55 al 85, desde aproximadamente el aminoácido 181 al 221, desde aproximadamente el aminoácido 241 al 281, desde aproximadamente el aminoácido 306 al 321, desde aproximadamente el aminoácido 331 al 340, desde aproximadamente el aminoácido 461 al 486, desde aproximadamente el aminoácido 780 al 805, desde aproximadamente el aminoácido 810 al 841, desde aproximadamente el aminoácido 841 al 851, desde aproximadamente el aminoácido 865 al 890, desde aproximadamente el aminoácido 895 al 905, y desde aproximadamente el aminoácido 915 a 931 de la SEC ID Nº: 2; y una secuencia que incluye una Cys, o un sitio de glicosilación.
La Figura 3 representa un alineamiento de la proteína de transporte iónico y dominios de repetición de ank de la proteína 15603 humana con una secuencia de aminoácidos consenso procedente de un modelo oculto de Markov (HMM) a partir de PFAM. La secuencia superior es la secuencia de aminoácidos consenso (SEC ID Nº: 4,5,6) para un dominio de repetición de ank, mientras que la secuencia de aminoácidos inferior corresponde a los aminoácidos 97 a 131, 132 a 163 y 218 a 250 de la SEC ID Nº: 2. También se muestra la secuencia de aminoácidos consenso (SEC ID Nº: 7) para un dominio de proteína de transporte iónico alineada con los aminoácidos 493 a 727 de la SEC ID Nº: 2.
La Figura 4 representa un alineamiento BLAST del dominio del canal iónico de la proteína 15603 humana con una secuencia de aminoácidos consenso de un dominio derivado de la base de datos ProDomain ("Channel Receptor Transient Repeat Calcium Potential Ion Ank Transport Transmembrane"; No. PD004194; ProDomain Release 2001.1; http://www.toulouse.inra.fr/prodom.html). La secuencia inferior son los restos aminoacídicos 52 a 278 de la secuencia consenso de PD004194 de 278 aminoácidos (SEC ID Nº: 8), mientras que la secuencia de aminoácidos superior corresponde al dominio de canal iónico de la proteína 15603 humana, restos aminoacídicos 123 a 347 de la SEC ID Nº: 2.
Descripción detallada de la invención
La secuencia de la proteína 15603 humana (Figura 1; SEC ID Nº: 1), que tiene una longitud de aproximadamente 2796 nucleótidos incluyendo regiones no traducidas, contiene una secuencia codificante iniciada por metionina prevista de aproximadamente 2796 nucleótidos, incluyendo el codón de terminación (nucleótidos indicados como "codificantes" de la SEC ID Nº: 1 en la Fig. 1; SEC ID Nº: 3). La secuencia codificante codifica una proteína de 931 aminoácidos (SEC ID Nº: 2). La proteína 15603 humana de la SEC ID Nº: 2 y la Figura 2 incluye una secuencia de aminoácidos hidrófoba amino-terminal, consistente con una secuencia señal de aproximadamente 26 aminoácidos (desde el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 26 de la SEC ID Nº: 2, PSORT, Nakai and Kanehisa (1992) Genomics 14:897-911), que después de la escisión proporciona una forma de proteína madura.)). Esta forma de proteína madura tiene una longitud de aproximadamente 905 restos aminoacídicos (desde aproximadamente el aminoácido 27 hasta el aminoácido 931 de la SEC ID Nº: 2).
La proteína 15603 humana contiene las siguientes regiones u otras características estructurales (para información general en relación con los identificadores de PFAM, los números de identificación de dominios de prefijo PS y prefijo PF, véase Sonnhammer et al. (1997) Protein 28: 405-420 y http://www.psc.edu/general/ software/packages/pfam/pfam.html:
un dominio de ank (Número de Acceso de PFAM PF0023) localizado aproximadamente en los aminoácidos 97 a 131 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio de ank (Número de Acceso de PFAM PF0023) localizado aproximadamente en los aminoácidos 132 a 163 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio de ank (Número de Acceso de PFAM PF0023) localizado aproximadamente en los aminoácidos 218 a 250 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio de proteína de transporte iónico (Número de Acceso de PFAM PF00520) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 493 a 727 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio iónico de entrada de calcio de variante de repetición de potencial transitorio de canal receptor (ProDom No. PD140156) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 1 a 39 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio iónico de entrada de calcio de variante de repetición de potencial transitorio de canal receptor (ProDom No. PD323618) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 40 a 71 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio de variante de repetición relacionado con Trp de entrada capacitiva de calcio de potencial transitorio de canal receptor (ProDom No. PD186301) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 93 a 133 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio de ank de potencial transitorio Trp Vision de repetición de canal iónico receptor (ProDom No.
PD140149) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 95 a 154 de la SEC ID Nº: 2;
un factor del tipo de la familia del receptor de ankirina con ORF del gen de canal de ankirina repetido (ProDom No. PD007334) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 102 a 166 se la SEC ID Nº: 2;
un dominio de tipo glicoproteína EGF alternativa relacionado con ankirina UNC-44, dominio quinasa de repetición de ankirina (ProDom No. PD000041) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 105 a 188 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio transmembrana de ank de transporte iónico de calcio de repetición de potencial transitorio de canal receptor (ProDom No. PD004194) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 123 a 347 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio NOMPC TRP2 Y71A12B.4 Y71A12B.E 2-Beta 2-Alfa de potencial transitorio del canal receptor (ProDom No. PD296552) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 299 a 509 de la SEC ID
Nº: 2;
un dominio MTR1 del Receptor Transmembrana Fis (ProDom No. PD039592) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 308 a 916 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio transmembrana de transporte iónico de calcio de potencial transitorio de repetición del canal receptor (ProDom No. PD328255) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 362 a 509 de la SEC ID
Nº: 2;
un dominio transmembrana de transporte iónico de vanilloide de repetición de potencial transitorio del canal receptor de calcio (ProDom No. PD003230) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 409 a 748 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio de Ank variante iónico transitorio de repetición de potencial de canal receptor de calcio (ProDom No. PD238062) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 510 a 597 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio de transporte iónico de entrada capacitiva de potencial transitorio de repetición del canal receptor de calcio (ProDom No. PD342728) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 744 a 895 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio transmembrana de ank de transporte iónico de calcio de potencial transitorio de repetición del canal receptor (ProDom No. PD004174) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 749 a 900 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio de repetición de ank de transporte iónico transitorio del receptor de entrada del canal receptor de calcio (ProDom No. PD266294) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 786 a 854 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio relacionado con Gelsolin (ProDom No. PD202783) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 792 a 931 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio de músculo de patrón séptuple de filamento de cadena pesada de repetición de miosina superenrollada (ProDom No. PD000002) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 796 a 928 de la SEC ID Nº: 2;
un ion de entrada de calcio variante de repetición de potencial transitorio de canal receptor (ProDom No. PD137340) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 901 a 931 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio transmembrana (previsto por MEMSAT, Jones et al. (1994) Biochemistry 33:3038-3049) aproximadamente en los restos aminoacídicos 407 a 426 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio transmembrana (previsto por MEMSAT, Jones et al. (1994) Biochemistry 33:3038-3049) aproximadamente en los restos aminoacídicos 443 a 459 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio transmembrana (previsto por MEMSAT, Jones et al. (1994) Biochemistry 33:3038-3049) aproximadamente en los restos aminoacídicos 490 a 507 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio transmembrana (previsto por MEMSAT, Jones et al. (1994) Biochemistry 33:3038-3049) aproximadamente en los restos aminoacídicos 598 a 614 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio transmembrana (previsto por MEMSAT, Jones et al. (1994) Biochemistry 33:3038-3049) aproximadamente en los restos aminoacídicos 637 a 653 de la SEC ID Nº: 2;
un dominio transmembrana (previsto por MEMSAT, Jones et al. (1994) Biochemistry 33:3038-3049) aproximadamente en los restos aminoacídicos 703 a 727 de la SEC ID Nº: 2;
una estructura superenrollada localizada aproximadamente en los restos aminoacídicos 296 a 907 (ALELSNELAV ... LEEKSQNTED) de la SEC ID Nº: 2;
un patrón de cremallera de leucina (Prosite PS00029) localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 766 a 787 (LVPSPKSLFYLLLKLKKWISEL) de la SEC ID Nº: 2;
nueve sitios de fosforilación de proteína quinasa C (Prosite PS00005) localizados aproximadamente en los restos aminoacídicos 14 a 16 (SPR), 89 a 91 (SDR), 563 a 565 (TLK), 630 a 632 (TVK), 674 a 676 (SFK), 769 a 771 (SPK), 836 a 838 (SIR), 893 a 895 (SLR) y 929 a 931 (TNR) de la SEC ID Nº: 2;
dieciséis sitios de fosforilación de caseína quinasa II (Prosite PS00006) localizados aproximadamente en los restos aminoacídicos 96 a 99 (SIEE), 197 a 200 (SQSE), 216 a 219 (SSHD), 289 a 292 (SSED), 296 a 299 (TALE), 475 a 478 (TSTD), 492 a 495 (SWME), 556 a 559 (SIID), 563 a 566 (TLKD), 571 a 574 (TLGD), 630 a 633 (TVKD), 669 a 672 (TTVE), 730 a 733 (SFQE), 752 a 755 (SYFE), 815 a 818 (SHED) y 839 a 842 (SSED) de la SEC ID Nº: 2;
dos sitios de fosforilación de proteína quinasa dependiente de AMPc/GMPc (Prosite PS00004) localizados aproximadamente en los restos aminoacídicos 67 a 70 (RRQT) y 319 a 322 (KKLS) de la SEC ID Nº: 2;
tres sitios de fosforilación de tirosina (Prosite PS00007) localizados aproximadamente en los restos aminoacídicos 24 a 31 (RRNESQDY), 101 a 108 (RFLDAAEY) y 698 a 705 (KFIENIGY) de la SEC ID Nº: 2;
dos sitios de amidación (Prosite PS00009) localizados aproximadamente en los restos aminoacídicos 75 a 78 (KGRR) y 188 a 191 (EGKR) de la SEC ID Nº: 2;
nueve sitios de N-glicosilación (Prosite PS00001) localizados aproximadamente en los restos aminoacídicos 26 a 29 (NESQ), 157 a 160 (NLSR), 362 a 365 (NLSR), 394 a 397 (NLSG), 473 a 476 (NETS), 561 a 564 (NDTL), 617 a 620 (NESF), 712 a 715 (NVTM) y 728 a 731 (NSSF) de la SEC ID Nº: 2; y
cinco sitios de N-miristoilación (Prosite PS00008) localizados aproximadamente en los restos aminoacídicos 17 a 22 (GAAGAA), 213 a 218 (GTRSSH), 504 a 509 (GMIWAE), 661 a 666 (GAKQNE) y 811 a 816 (GILGSH) de la SEC ID Nº: 2.
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La proteína 15603 contiene un número significativo de características estructurales en común con miembros de la familia de canales iónicos y la familia de repeticiones de ank. El término "familia", cuando hace referencia a las moléculas de proteína y de ácido nucleico de la invención, se refiere a dos o más proteínas o moléculas de ácido nucleico que tienen un dominio o motivo estructural común y que tienen una homología de secuencias de aminoácidos o de nucleótidos suficiente como se define en la presente memoria. Estos miembros de la familia pueden ser naturales o no naturales y pueden proceder de la misma especie o de especies diferentes. Por ejemplo, una familia puede contener una primera proteína de origen humano así como otras proteínas diferentes de origen humano o, como alternativa, puede contener homólogos de origen no humano, por ejemplo, proteínas de rata o de ratón. Los miembros de una familia también pueden tener características funcionales comunes.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "canal iónico" incluye una proteína o polipéptido que puede regular el flujo de iones tales como cationes de calcio a través de un canal. El canal puede regular el flujo de un catión o anión particular o puede ser menos discriminativo y permitir el flujo a su través de múltiples tipos de cationes o aniones. El flujo de iones puede regularse por la presencia o ausencia de un ligando unido o puede regularse por el estado de fosforilación del canal u otra proteína asociada con el canal. La proteína del canal iónico puede experimentar un cambio conformacional basado en la unión de un ligando, la fosforilación de un resto particular o la unión de otra proteína o biomolécula.
Los miembros de una familia de proteínas de canales iónicos se caracterizan por dominios transmembrana, dominios citoplásmicos, dominios extracelulares, y pueden ser homodímeros, homotrímeros, homomultímeros, heterodímeros etc. El poro de los canales iónicos típicamente se forma por múltiples proteínas transmembrana codificadas por el mismo gen o por genes diferentes. Típicamente, se forma un canal transmembrana hidrófilo que permite el paso de iones desde un lado de la membrana plasmática al otro. Grupos de aminoácidos cargados en la boca del canal pueden aumentar la selectividad por un tipo particular de ion, por ejemplo, grupos de restos aminoacídicos cargados negativamente en la boca del canal pueden excluir los iones negativos de los canales iónicos.
Todas las proteínas de la familia de canales iónicos forman poros rellenos de agua a través de las membranas. Las proteínas de los canales iónicos están localizadas en la membrana plasmática de células animales y vegetales y se caracterizan adicionalmente por pequeños poros de alta selectividad que participan en el transporte iónico. Típicamente, más de 10^{6} iones pueden pasar a través de dicho canal cada segundo. Muchos canales iónicos permiten la difusión de iones específicos tales como Na^{+}, K^{+}, Ca^{2+}, o Cl^{-}, por sus gradientes electroquímicos a través de la bicapa lipídica. Las proteínas de los canales iónicos muestran selectividad iónica, que permite que pasen algunos iones pero no otros. Otra característica de las proteínas de los canales iónicos es que no se abren de manera continua, a diferencia de los poros sencillos para el paso de agua. En su lugar tienen "aberturas" que se abren brevemente y después se cierran de nuevo. Esta apertura y cierre normalmente responde a una perturbación específica de la membrana, tal como un cambio en el voltaje a través de la membrana (canales de apertura por voltaje), estimulación mecánica (canales abiertos mecánicamente) o la unión de una molécula de señalización (canales de apertura por ligando). En el caso de los canales de apertura por ligando, el ligando de señalización puede ser un mediador extracelular, tal como un neurotransmisor (canales de apertura por neurotransmisor), un mediador intracelular, tal como un ion (canales de apertura por iones), un nucleótido (canales de apertura por nucleótido) o una proteína reguladora de unión a GTP (canales de apertura por proteína G).
Los canales iónicos son responsables de la excitabilidad eléctrica de las células nerviosas y musculares y median la mayoría de las formas de señalización eléctrica en el sistema nervioso. Una sola célula nerviosa típicamente contiene más de cinco tipos de canales iónicos. Sin embargo, estos canales iónicos no se restringen a células excitables eléctricamente. Los canales iónicos están presentes en todas las células animales y se encuentran en células vegetales y microorganismos. Por ejemplo, las proteínas de los canales iónicos propagan la respuesta de cierre de las hojas de la mimosa y permiten que el organismo unicelular conocido como paramecio invierta la dirección después de una colisión. La proteína 15603, también conocida como TRPC6, es un canal de cationes no selectivo que se activa por diacilglicerol de una manera delimitada a la membrana, independientemente de la proteína
quinasa C.
Un polipéptido 15603 puede incluir un "dominio de canal iónico" o regiones homólogas con un "dominio de canal iónico". Un polipéptido 15603 puede incluir además un "dominio de ank" o regiones homólogas a un "dominio de ank".
Como se usa en la presente memoria, la expresión "dominio de proteína de transporte iónico" incluye una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 200 a 250 restos aminoacídicos de longitud y que tiene un valor de bit score (puntuación en unidades de información (bits)) para el alineamiento de la secuencia con el dominio de la proteína de transporte iónico (HMM) de al menos 75. Preferiblemente, un dominio de transporte iónico regula el flujo de iones a través de una membrana. Preferiblemente, un dominio de proteína de transporte iónico incluye al menos de aproximadamente 200 a 300 aminoácidos, más preferiblemente de aproximadamente 200 a 250 restos aminoacídicos, o de aproximadamente 210 a 240 aminoácidos y tiene un valor de bit score para el alineamiento de la secuencia con el dominio de la proteína de transporte iónico (HMM) de al menos 50, 75, 80 o mayor. El dominio de transporte iónico puede incluir dominios transmembrana. Al dominio de proteína de transporte iónico (HMM) se le ha asignado el Número de Acceso de PFAM PF00520 (http;//genome.wustl.edu/Pfam/.html). En la Figura 3 se representa un alineamiento del dominio de proteína de transporte iónico (aminoácidos 493 a 727 de la SEC ID Nº: 2) del polipéptido 15603 humano con la secuencia de aminoácidos consenso de la proteína de transporte iónico de Pfam (SEC ID Nº: 7) obtenida con un modelo oculto de Markov.
Como se usa en este documento, la expresión "dominio de repetición de ank" incluye una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 30 a 35 restos aminoacídicos de longitud y que tiene un valor de bit score para el alineamiento de la secuencia con el dominio de repetición de ank (HMM) de al menos 15. Preferiblemente, un dominio de repetición de ank incluye al menos de aproximadamente 20 a 40 aminoácidos, más preferiblemente de aproximadamente 25 a 35 restos aminoacídicos, o de aproximadamente 30 a 35 aminoácidos y tiene un valor de bit score para el alineamiento de la secuencia con el dominio de repetición de ank (HMM) de al menos 10, 15, 20 o mayor. Al dominio de repetición de ank (HMM) se le ha asignado el Número de Acceso de PFAM PF0023 (http;//genome.wustl.edu/Pfam/.html). Además, al dominio de repetición de ank (HMM) se le ha asignado el identificador SMART ANK_2a (http://smart.embl-heidelberg.de/). En la Figura 3 se representa un alineamiento del dominio de repetición de ank (aminoácidos 97 a 131, 132 a 163 y 218 a 250 de la SEC ID Nº: 2) de la proteína 15603 humana con la secuencia de aminoácidos consenso del dominio de repetición de ank de Pfam (SEC ID Nº: 4,5,6) obtenida con un modelo oculto de Markov. En la Figura 3 se representa un alineamiento del dominio de repetición de ank (aminoácidos 97 a 126, 132 a 160 y 218 a 247 de la SEC ID Nº: 2) de la proteína 15603 humana con la secuencia de aminoácidos consenso del dominio SMART ANK_2a (SEC ID Nº: 4,5,6) obtenida con un modelo oculto de Markov.
Preferiblemente, un polipéptido o proteína 15603 tiene un "dominio de proteína de transporte iónico" o una región que incluye al menos de aproximadamente 200 a 300, más preferiblemente de aproximadamente 200 a 250 o de 210 a 240 restos aminoacídicos y tiene una homología de al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% con un "dominio de proteína de transporte iónico", por ejemplo, el dominio de proteína de transporte iónico de la proteína 15603 humana (por ejemplo, los restos 493 a 727 de la SEC ID Nº: 2).
Preferiblemente, un polipéptido o proteína 15603 tiene un "dominio de repetición de ank" o una región que incluye al menos de aproximadamente 25 a 40, más preferiblemente de aproximadamente 25 a 35 o de 30 a 35 restos aminoacídicos y tiene una homología de al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% con un "dominio de repetición de ank", por ejemplo, un dominio de repetición de ank de la proteína 15603 humana (por ejemplo, los restos 97 a 131, 132 a 163, o 218 a 250 de la SEC ID Nº: 2).
Para identificar la presencia de un dominio de "proteína de transporte iónico" o un dominio de "repetición de ank" en una secuencia de proteína 15603, y realizar la determinación de que un polipéptido o proteína de interés tiene un perfil particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína puede someterse a una búsqueda frente a la base de datos Pfam de HMM (por ejemplo, la base de datos Pfam, edición 2.1) usando los parámetros por defecto (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search). Por ejemplo, el programa hmmsf, que está disponible como parte del paquete de programas de búsqueda HMMER, es una familia de programas por defecto específicos para MILPAT0063 y una puntuación de 15 es la puntuación umbral por defecto para determinar un acierto (hit). Como alternativa, la puntuación umbral para determinar un acierto puede estar reducida, (por ejemplo, a 8 bits). Se puede encontrar una descripción de la base de datos Pfam en Sonhammer et al. (1997) Proteins 28:405-420 y puede encontrarse una descripción detallada de HMM, por ejemplo, en Gribskov et al. (1990) Meth. Enzymol 183:146-159; Gribskov et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4355-4358; Krogh et al. (1994) J. Mol. Biol. 235: 1501-1531; y Stultz et al. (1993) Protein Sci. 2:305-314. Se realizó una búsqueda frente a la base de datos HMM que dio como resultado la identificación de un "dominio de proteína de transporte iónico" en la secuencia de aminoácidos de la proteína 15603 humana aproximadamente en los restos 493 a 727 de la SEC ID Nº: 2 (véase la Figura 1). Se realizó una búsqueda frente a la base de datos HMM que dio como resultado la identificación de tres dominios de "repetición de ank" en la secuencia de aminoácidos de la proteína 15603 humana aproximadamente en los restos 97 a 131, 132 a 163 y 218 a 250 de la SEC ID Nº: 2 (véase la Figura 1).
Como método adicional para identificar la presencia de un dominio de "repetición de ank" en una secuencia de proteína 15603, y realizar la determinación de que un polipéptido o proteína de interés tiene un perfil particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína puede buscarse frente a una base de datos SMART (Simple Modular Architecture Research Tool, http://smart.embl-heidelberg.de/) de HMM como se describe en Schultz et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:5857 y Schultz et al. (2000) Nucl. Acids Res 28: 231. La base de datos contiene dominios identificados por perfilado con los modelos ocultos de Markov del programa de búsqueda HMMer^{2} (Durbin et al. (1998) Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids. Cambridge University Press.; http://hmmer.wustl.edu/). La base de datos también se anota y controla extensivamente por expertos para mejorar la exactitud. Se realizó una búsqueda frente a la base de datos HMM que dio como resultado la identificación de tres dominios de "ank 2a" en la secuencia de aminoácidos de la proteína 215603 humana aproximadamente en los restos 97 a 126, 132 a 160 y 218 a 247 de la SEC ID Nº: 2 (véase la Figura 1).
Para una identificación adicional de dominios en una secuencia de proteína 15603, y para realizar la determinación de que un polipéptido o proteína de interés tiene un perfil particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína puede buscarse frente a una base de datos de dominios, por ejemplo, la base de datos ProDom (Corpet et al. (1999), Nucl. Acids Res. 27:263-267). La base de datos de dominios de proteína ProDom consiste en una recopilación automática de dominios homólogos. Se están construyendo versiones actuales de ProDom usando búsquedas PSI-BLAST recursivas (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Gouzy et al. (1999) Computers and Chemistry 23:333-340) de las bases de datos de proteínas SWISS-PROT 38 y TREMBL. La base de datos genera automáticamente una secuencia consenso para cada dominio. Se realizó una búsqueda BLAST frente a la base de datos HMM que tuvo como resultado la identificación de un dominio "transmembrana de repetición de ank de transporte iónico de calcio de potencial transitorio de canal receptor" en la secuencia de aminoácidos de la proteína 15603 humana aproximadamente en los restos 123 a 347 de la SEC ID Nº: 2 (véase la Figura 1).
Una molécula de 15603 puede incluir además un dominio transmembrana o un dominio de repetición de ank.
Un polipéptido 15603 puede incluir al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o preferiblemente seis "dominios transmembrana" o regiones homólogas con "dominios transmembrana". Como se usa en este documento, la expresión "dominio transmembrana" incluye una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 10 a 40 restos aminoácidos de longitud y que abarca la membrana plasmática. Los dominios transmembrana son ricos en restos hidrófobos, por ejemplo, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de los aminoácidos de un dominio transmembrana son hidrófobos, por ejemplo, leucinas, isoleucinas, tirosinas o triptófanos. Los dominios transmembrana típicamente tienen estructuras en alfa hélice y se describen, por ejemplo, en Zagotta et al., (1996) Annual Rev. Neurosci. 19:235-263. Los dominios transmembrana de la proteína 15603 humana están localizados aproximadamente en los restos 407 a 426, 443 a 459,490 a 507, 598 a 614, 637 a 653 y 703 a 727 de la SEC ID Nº: 2.
En una realización preferida, un polipéptido o proteína 15603 tiene al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o preferiblemente seis "dominios transmembrana", o una región que incluye al menos de aproximadamente 12 a 35, más preferiblemente de aproximadamente 14 a 30 o de 15 a 25 restos aminoacídicos y tiene una homología de al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% con un "dominio transmembrana", por ejemplo, los dominios transmembrana de la proteína 15603 humana (por ejemplo, los restos 407 a 426, 443 a 459, 490 a 507, 598 a 614, 637 a 653, o 703 a 727 de la SEC ID Nº: 2). El dominio transmembrana de la proteína 15603 humana se visualiza en el gráfico de hidropatía (Figura 2) como regiones de aproximadamente 15 a 25 aminoácidos en las que el gráfico de hidropatía está principalmente por encima de la línea horizontal.
Para identificar la presencia de un dominio "transmembrana" en una secuencia de proteína 15603, y realizar la determinación de que un polipéptido o proteína de interés tiene un perfil particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína puede analizarse por un método de predicción transmembrana que predice la estructura secundaria y la topología de proteínas de membrana integrales basándose en el reconocimiento de modelos topológicos (MEMSAT, Jones et al., (1994) Biochemistry 33:3038-3049).
Un polipéptido 15603 puede incluir al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o preferiblemente siete "regiones no transmembrana". Como se usa en la presente memoria, la expresión "región no transmembrana" incluye una secuencia de aminoácidos no identificada como un dominio transmembrana. Las regiones no transmembrana en la proteína 15603 están localizadas aproximadamente en los restos aminoacídicos 1 a 406, 427 a 442, 460 a 489, 508 a 597, 615 a 636, 654 a 702 y 727 a 931 de la SEC ID Nº: 2. Los dominios no transmembrana pueden ser citoplásmicos o
extracelulares.
Las regiones no transmembrana de la proteína 15603 incluyen al menos uno, dos, tres o preferiblemente cuatro regiones citoplásmicas. Cuando se localiza en el extremo N, la región citoplásmica se denomina en la presente memoria "dominio citoplásmico N-terminal". Como se usa en la presente memoria, un "dominio citoplásmico N-terminal" incluye una secuencia de aminoácidos que tiene de aproximadamente 1 a 500, preferiblemente de aproximadamente 1 a 450, más preferiblemente de aproximadamente 1 a 425, o incluso más preferiblemente de aproximadamente 1 a 410 restos aminoacídicos de longitud, y está localizado en el interior de una célula o dentro del citoplasma de una célula. El resto aminoacídico C-terminal de un "dominio citoplásmico N-terminal" está adyacente a un resto aminoacídico N-terminal de un dominio transmembrana en una proteína 15603. Por ejemplo, un dominio citoplásmico N-terminal se localiza aproximadamente en los restos aminoacídicos 1 a 406 de la SEC ID Nº: 2.
En una realización preferida, un polipéptido o proteína 15603 tiene una región o dominio citoplásmico N-terminal que incluye de aproximadamente 1 a 450, preferiblemente de aproximadamente 1 a 425, y más preferiblemente de aproximadamente 1 a 410 restos aminoacídicos y tiene una homología de al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% con un "dominio citoplásmico N-terminal", por ejemplo, el dominio citoplásmico N-terminal de la proteína 15603 humana (por ejemplo, los restos 1 a 406 de la SEC ID Nº: 2).
En otra realización, una región citoplásmica de 15603 incluye al menos uno, y preferiblemente dos bucles citoplásmicos. Como se usa en la presente memoria, el término "bucle" incluye una secuencia de aminoácidos que no se incluye dentro de una membrana de fosfolípidos, que tiene una longitud de al menos aproximadamente 4, preferiblemente de aproximadamente 5 a 95, y más preferiblemente de aproximadamente 6 a 35 restos aminoacídicos, y tiene una secuencia de aminoácidos que conecta dos dominios transmembrana dentro de una proteína o polipéptido. Por consiguiente, el aminoácido N-terminal de un bucle está adyacente a un aminoácido C-terminal de un dominio transmembrana en una molécula 15603, y el aminoácido C-terminal de un bucle está adyacente a un aminoácido N-terminal de un dominio transmembrana en una molécula 15603. Como se usa en la presente memoria, un "bucle citoplásmico" incluye un bucle localizado en el interior de una célula o dentro del citoplasma de una célula. Por ejemplo, un "bucle citoplásmico" puede encontrarse aproximadamente en los restos aminoacídicos 460 a 489 y 615 a 636 de la SEC ID Nº: 2.
En una realización preferida, un polipéptido o proteína 15603 tiene un bucle citoplásmico o una región que incluye al menos aproximadamente 4, preferiblemente de aproximadamente 5 a 40, y más preferiblemente de aproximadamente 6 a 35 restos aminoacídicos y tiene una homología de al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% con un "bucle citoplásmico", por ejemplo, un bucle citoplásmico de la proteína 15603 humana (por ejemplo, los restos 460 a 489 y 615 a 636 de la SEC ID Nº: 2).
En otra realización, una región no transmembrana de 15603 incluye al menos uno, dos o preferiblemente tres bucles no citoplásmicos. Como se usa en la presente memoria, un "bucle no citoplásmico" incluye un bucle localizado fuera de una célula o dentro de un orgánulo intracelular. Los bucles no citoplásmicos incluyen dominios extracelulares (es decir, fuera de la célula) y dominios intracelulares (es decir, dentro de la célula). Cuando se hace referencia a proteínas unidas a la membrana encontradas en orgánulos intracelulares (por ejemplo, mitocondrias, retículo endoplásmico, peroxisomas, microsomas, vesículas, endosomas y lisosomas), los bucles no citoplásmicos incluyen los dominios de la proteína que residen en el lumen del orgánulo o la matriz o el espacio intermembrana. Por ejemplo, puede encontrarse un "bucle no citoplásmico" aproximadamente en los restos aminoacídicos 427 a 442, 508 a 597 y 654 a 702 de la SEC ID Nº: 2.
En una realización preferida, un polipéptido o proteína 15603 tiene al menos un bucle no citoplásmico o una región que incluye al menos aproximadamente 4, preferiblemente de aproximadamente 5 a 100, más preferiblemente de aproximadamente 6 a 90 restos aminoacídicos y tiene una homología de al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% con un "bucle no citoplásmico" por ejemplo, al menos un bucle no citoplásmico de la proteína 15603 humana (por ejemplo, los restos 427 a 442, 508 a 597 y 654 a 702 de la SEC ID Nº: 2).
En otra realización, una región citoplásmica de una proteína 15603 puede incluir el extremo C y puede ser un "dominio citoplásmico C-terminal" también conocido en este documento como "cola citoplásmica C-terminal." Como se usa en la presente memoria, un "dominio citoplásmico C-terminal" incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una longitud de al menos aproximadamente 200, preferiblemente de aproximadamente 150 a 250, más preferiblemente de aproximadamente 175 a 225 restos aminoacídicos, y está localizado en el interior de una célula o dentro del citoplasma de una célula. El resto aminoacídico N-terminal de un "dominio citoplásmico C-terminal" está adyacente a un resto aminoacídico C-terminal de un dominio transmembrana en una proteína 15603. Por ejemplo, un dominio citoplásmico C-terminal está localizado aproximadamente en los restos aminoacídicos 728 a 931 de la
SEC ID Nº: 2.
En una realización preferida, un polipéptido o proteína 15603 tiene un dominio citoplásmico C-terminal o una región que incluye al menos aproximadamente 200, preferiblemente de aproximadamente 150 a 250 y más preferiblemente de aproximadamente 175 a 225 restos aminoacídicos y tiene una homología de al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% con un "dominio citoplásmico C-terminal" por ejemplo, el dominio citoplásmico C-terminal de la proteína 15603 humana (por ejemplo, los restos 728 a 931 de la SEC ID Nº: 2).
Una proteína 15603 humana puede incluir además una cremallera de leucina o una estructura superenrollada. Preferiblemente, un dominio de cremallera de leucina tiene una homología de al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% con el dominio de cremallera de leucina de la proteína 15603 humana (por ejemplo, los restos 766 a 787 de la SEC ID Nº: 2). Preferiblemente, un dominio superenrollado tiene una homología de al menos aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% con el dominio superenrollado de la proteína 15603 humana (por ejemplo, los restos 296 a 907 de la SEC ID Nº: 2). Una proteína 15603 humana puede incluir además sitios de N-glicosilación, sitios de fosforilación de proteína quinasa dependiente de AMPc y GMPc, sitios de fosforilación de proteína quinasa C, sitios de fosforilación de caseína quinasa II, sitios de fosforilación de tirosina quinasa, sitios de N-miristoilación y sitios de amidación.
Un miembro de la familia de 15603 puede incluir al menos un dominio de proteína de canal iónico; y al menos uno, dos o preferiblemente tres dominios de repetición de ank o dominios transmembrana o no transmembrana. Un miembro de la familia de 15603 puede incluir al menos una estructura de cremallera de leucina o al menos una estructura superenrollada. Además, un miembro de la familia de 15603 puede incluir al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o preferiblemente nueve sitios de fosforilación de proteína quinasa C (Prosite PS00005); al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince y preferiblemente dieciséis sitios de fosforilación de caseína quinasa II (Prosite PS00006); al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho y preferiblemente nueve sitios de N-glicosilación (Prosite PS00001); al menos uno y preferiblemente dos sitios de fosforilación de proteína quinasa dependiente de AMPc/GMPc (Prosite PS00004); al menos uno y preferiblemente dos sitios de amidación (Prosite PS00009); y al menos uno, dos, tres, cuatro y preferiblemente cinco sitios de N-miristoilación (Prosite PS00008).
Como los polipéptidos 15603 de la invención pueden modular actividades mediadas por 15603, pueden ser útiles para el desarrollo de nuevos agentes de diagnóstico y terapéuticos para trastornos asociados con los canales iónicos u otros trastornos asociados con la proteína 15603, como se describe más adelante.
Como se usa en la presente memoria, una "actividad asociada a canales iónicos" incluye una actividad que implica la regulación del flujo de iones a través de una membrana. El flujo de iones puede controlarse por un segundo mensajero tal como diacilglicerol. Ciertos miembros de la familia pueden intervenir en enfermedades cardiovasculares tales como una angiogénesis anómala.
Como se usa en la presente memoria, una "actividad de 15603", "actividad biológica de 15603" o "actividad funcional de 15603" se refiere a una actividad ejercida por una molécula de proteína, polipéptido o ácido nucleico de 15603, por ejemplo, en una célula que responde a 15603 o en un sustrato de 15603, por ejemplo un sustrato proteico, como se determina in vivo o in vitro. En una realización, una actividad de 15603 es una actividad directa, tal como una asociación con una molécula diana de 15603. Una "molécula diana" o "compañero de unión" es una molécula con la cual se une o interacciona en la naturaleza una proteína 15603. En una realización ilustrativa, la proteína 15603 es un canal iónico, por ejemplo, un canal de cationes no selectivo que se activa por diacilglicerol, y por lo tanto interacciona en la naturaleza con una molécula tal como un segundo mensajero (por ejemplo, diacilglicerol) para regular el flujo de cationes a través de una membrana.
Una actividad de 15603 también puede ser una actividad indirecta, por ejemplo, una actividad de señalización celular mediada por la interacción de la proteína 15603 con un receptor de 15603. Basándose en las estructuras de secuencia descritas anteriormente y en las similitudes con moléculas de función conocida, las moléculas de 15603 de la presente invención pueden tener actividades biológicas similares a los miembros de la familia de canales iónicos. Por ejemplo, las proteínas 15603 de la presente invención pueden tener una o más de las siguientes actividades: (1) la capacidad de unirse a un segundo mensajero; (2) la capacidad de unirse a diacilglicerol; (3) la capacidad de regular el flujo de cationes a través de una membrana; (4) la capacidad de regular la angiogénesis; y (5) la capacidad de regular los niveles de calcio intracelulares.
Las moléculas de 15603 de la invención pueden modular las actividades de las células en tejidos en los que se expresan. Por ejemplo, el ARNm de 15603 se expresa en niveles de moderados a elevados en hemangiomas, megacariocitos, tumor de Wilm, células de músculo liso vascular, células endoteliales proliferativas, útero y corteza cerebral normal. Por consiguiente, las moléculas de 15603 de la invención pueden actuar como agentes terapéuticos o de diagnóstico para trastornos cardiovasculares, angiogénicos o neoproliferativos.
De esta manera, las moléculas de 15603 pueden actuar como nuevas dianas de diagnóstico y agentes terapéuticos para controlar uno o más trastornos cardiovasculares, angiogénicos, neoproliferativos u otros trastornos de canales iónicos. Como se usa en la presente memoria, los "trastornos de canales iónicos" son enfermedades o trastornos cuya patogénesis se produce por, está relacionada o está asociada con una función o expresión aberrante o deficiente de proteínas de canales iónicos.
Las moléculas de 15603 pueden usarse para tratar trastornos cardiovasculares, del sistema inmune o proliferativos en parte porque se encuentran miembros de la familia en los hemangiomas, vasos sanguíneos y megacariocitos.
Como se usa en la presente memoria, un "trastorno de células endoteliales" incluye un trastorno caracterizado por una actividad de las células endoteliales aberrante, no regulada o indeseada, por ejemplo, angiogénesis; o la expresión aberrante de moléculas de adhesión en la superficie celular o genes asociados con la angiogénesis, por ejemplo, TIE-2, FLT y FLK. Los trastornos de las células endoteliales incluyen tumorigénesis, metástasis tumoral, psoriasis, retinopatía diabética, endometriosis, enfermedad de Grave, enfermedad isquémica (por ejemplo, aterosclerosis) y enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, artritis reumatoide).
La proteína 15603, sus fragmentos y derivados y otras variantes de la secuencia en la SEC ID Nº: 2 se denominan colectivamente "proteínas o polipéptidos 15603". Las moléculas de ácido nucleico que codifican estos polipéptidos y proteínas se denominan colectivamente "ácidos nucleicos de 15603".
Como se usa en la presente memoria, la expresión "molécula de ácido nucleico" incluye moléculas de ADN (por ejemplo, un ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, un ARNm) y análogos del ADN o ARN generados, por ejemplo, mediante el uso de análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario.
La expresión "molécula de ácido nucleico aislada o purificada" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con respecto al ADN genómico, el término "aislado" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas del cromosoma con el cual está asociado naturalmente el ADN genómico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" carece de secuencias que flanquean de forma natural el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y/o 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que procede el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos 5' y/o 3' que flanquean de forma natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que procede el ácido nucleico. Además, una molécula del ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede carecer sustancialmente de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o carecer sustancialmente de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "hibrida en condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad media, alta rigurosidad o rigurosidad muy alta" describe condiciones de hibridación y lavado. Pueden encontrarse directrices para realizar reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology (1989) John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6. Esa referencia describe métodos acuosos y no acuosos y pueden usarse ambos. Las condiciones de hibridación específicas a las que se hace referencia en la presente memoria son las siguientes: 1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en cloruro sódico/citrato sódico (SSC) 6X a aproximadamente 45ºC, seguido de dos lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% al menos a 50ºC (la temperatura de los lavados puede aumentarse a 55ºC en las condiciones de baja rigurosidad); 2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en SSC 6X a aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 60ºC; 3) condiciones de hibridación de rigurosidad elevada en SSC 6X a aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 65ºC; y preferiblemente 4) son condiciones de hibridación de rigurosidad muy alta fosfato sódico 0,5 M, SDS al 7% a 65ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 1% a 65ºC. Las condiciones de rigurosidad muy alta (4) son las condiciones preferidas y las que deben usarse a menos que se especifique otra cosa.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, una molécula de ácido nucleico "que se produce de forma natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia nucleotídica que aparece en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural).
Como se usa en la presente memoria, las expresiones "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que incluyen una fase de lectura abierta que codifica una proteína 15603, preferiblemente una proteína 15603 de mamífero, y pueden incluir además secuencias reguladoras no codificantes e intrones.
Un polipéptido o proteína "aislada" o "purificada" carece sustancialmente de material celular u otra proteína contaminante de la fuente celular o tisular de la que procede la proteína, o carece sustancialmente de precursores químicos u otros agentes químicos cuando se sintetiza químicamente. En una realización, la expresión "carece sustancialmente" se refiere a la preparación de proteína 15603 que tiene menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% y más preferiblemente 5% (en peso seco), de proteína distinta de la proteína 15603 (también denominada en la presente memoria "proteína contaminante"), o de precursores químicos o agentes químicos que no son la proteína 15603. Cuando la proteína 15603 o la parte biológicamente activa de la misma se produce de forma recombinante, preferiblemente también carece sustancialmente de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10% y aún más preferiblemente menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de la proteína. La invención incluye preparaciones aisladas o purificadas de al menos 0,01, 0,1, 1,0 y 10 miligramos en peso seco.
Un resto aminoacídico "no esencial" es un resto que puede alterarse de la secuencia de tipo silvestre de 15603 (por ejemplo, la secuencia de la SEC ID Nº: 1 ó 3) sin anular o, más preferiblemente, sin alterar sustancialmente una actividad biológica, mientras que un restos aminoacídico "esencial" ocasiona dicho cambio. Por ejemplo, es previsible que los restos aminoacídicos que están conservados entre los polipéptidos de la presente invención, por ejemplo, los presentes en la proteína de canal iónico o en los dominios de repetición de ank, sean particularmente susceptibles de alteración.
Una "sustitución conservativa de aminoácido" es una en la que el resto aminoacídico se reemplaza por un resto aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triftófano), cadenas laterales ramificadas \beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De esta manera, un resto aminoacídico no esencial previsto en una proteína 15603 se reemplaza preferiblemente por otro resto aminoacídico de la misma familia de cadenas laterales. Como alternativa, en otra realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de 15603, tal como por mutagénesis de saturación, y en los mutantes resultantes puede explorarse la actividad biológica de 15603 para identificar mutantes que retienen la actividad. Después de la mutagénesis de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 3, la proteína codificada puede expresarse de forma recombinante y puede determinarse la actividad de la proteína.
Como se usa en la presente memoria, una "parte biológicamente activa" de una proteína 15603 incluye un fragmento de una proteína 15603 que participa en una interacción entre una molécula de 15603 y una molécula distinta de 15603. Las partes biológicamente activas de una proteína 15603 incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas o derivadas de la secuencia de aminoácidos de la proteína 15603, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2, que incluye menos aminoácidos que la proteína 15603 de longitud completa, y presenta al menos una actividad de una proteína 15603. Típicamente, las partes biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína 15603, por ejemplo, la capacidad de regular el flujo de cationes a través de una membrana. Una parte biológicamente activa de una proteína 15603 puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, una longitud de 10, 25, 50, 100, 200 o más aminoácidos. Las partes biológicamente activas de una proteína 15603 pueden usarse como dianas para desarrollar agentes que modulan una actividad mediada por 15603, por ejemplo, la capacidad de regular el flujo de cationes a través de la
membrana.
Los cálculos de homología o identidad de secuencia (los términos "homología" e "identidad" se usan indistintamente en la presente memoria) entre secuencias se realizan como se indica a continuación:
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de ácido nucleico, se alinean las secuencias para conseguir una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o tanto en la primera como en la segunda secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico para un alineamiento óptimo y pueden descartarse secuencias no homólogas con fines comparativos). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es de al menos el 30%, preferiblemente al menos el 40%, más preferiblemente al menos el 50%, incluso más preferiblemente al menos el 60%, e incluso más preferiblemente al menos el 70%, 80%, 90% o 100% de la longitud de la secuencia de referencia (por ejemplo, cuando se alinea una segunda secuencia con la secuencia de aminoácidos de 15603 de la SEC ID Nº: 2 que tiene 931 restos de aminoácidos, se alinean al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, incluso más preferiblemente al menos 60% e incluso más preferiblemente al menos 70%, 80% o 90% de restos aminoacídicos). Después se comparan los restos aminoacídicos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o en las posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición de la primera secuencia está ocupada por el mismo resto aminoacídico o nucleótido que la correspondiente posición en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en la presente memoria, "identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que necesitan introducirse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias.
La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 444-453 que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Una serie particularmente preferida de parámetros (y la que debe usarse si el especialista duda sobre qué parámetros debe aplicar para determinar si una molécula está dentro de una limitación de identidad u homología de secuencia de la invención) es la matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de hueco de 12, una penalización de extensión de hueco de 4 y una penalización de hueco de desplazamiento de fase de 5.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo de Meyers y Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de restos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.
Las secuencias de ácido nucleico y de proteína descritas en la presente memoria pueden usarse como "secuencia de búsqueda" para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas para identificar, por ejemplo, otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Se pueden realizar tales búsquedas utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a moléculas de ácido nucleico de 15603 de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a moléculas de proteína 15603 de la invención. Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Ciertos polipéptidos 15603 particulares tienen secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2. En el contexto de una secuencia de aminoácidos, la expresión "sustancialmente idéntica" se usa para hacer referencia a un primer aminoácido que contiene un número suficiente o mínimo de restos aminoacídicos que son i) idénticos a, o ii) sustituciones conservativas de restos aminoacídicos alineados en una segunda secuencia de aminoácidos de tal forma que la primera y la segunda secuencias de aminoácidos pueden tener un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común que tiene una identidad de al menos aproximadamente 60% o 65%, probablemente una identidad de 75%, más probablemente una identidad de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la SEC ID Nº: 2 se denominan sustancialmente idénticas.
En el contexto de una secuencia de nucleótidos, la expresión "sustancialmente idéntica" se usa en la presente memoria para hacer referencia a una primera secuencia de ácido nucleico que contiene un número suficiente o mínimo de nucleótidos que son idénticos a nucleótidos alineados en una segunda secuencia de ácido nucleico de tal forma que la primera y segunda secuencias de ácido nucleico codifican un polipéptido que tiene una actividad funcional común, o codifican un dominio de polipéptido estructural común o una actividad de polipéptido funcional común. Por ejemplo, las secuencias e nucleótidos que tienen una identidad de al menos aproximadamente 60% o 65%, probablemente una identidad de 75%, más probablemente una identidad de 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la SEC ID Nº: 1 ó 3 se denominan sustancialmente idénticas.
"Silvestre errónea o expresión aberrante", tal y como se emplea en esta memoria, se refiere a un patrón de la expresión génica del ARN o la proteína de tipo no silvestre. Incluye: expresión a niveles que no son de tipo silvestre, es decir, una expresión excesiva o insuficiente; un patrón de expresión que difiere del tipo silvestre en términos del momento o fase en la que se expresa el gen, por ejemplo, aumento o disminución de la expresión (en comparación con el tipo silvestre) en un periodo o fase del desarrollo predeterminado; un patrón de expresión que difiere del tipo silvestre en términos de disminución de la expresión (en comparación con el tipo silvestre) en un tipo de célula o tipo de tejido predeterminados; un patrón de expresión que difiere del tipo silvestre en términos de tamaño del ayuste, secuencia de aminoácidos, modificación postraduccional o actividad biológica del polipéptido expresado; un patrón de expresión que difiere del tipo silvestre en términos del efecto de un estímulo ambiental o estímulo extracelular sobre la expresión del gen, por ejemplo, un patrón de aumento o disminución de la expresión (en comparación con el tipo silvestre) en presencia de un aumento o disminución en la intensidad del estímulo.
"Sujeto", como se usa en la presente memoria, puede hacer referencia a un mamífero, por ejemplo, un ser humano, o a un modelo de enfermedad experimental o animal. El sujeto también puede ser un animal no humano, por ejemplo, un caballo, vaca, cabra u otro animal doméstico.
Una "preparación purificada de células", como se usa en la presente memoria, se refiere, en el caso de células animales o vegetales, a una preparación in vitro de células y no a la planta o animal entero. En el caso de células cultivadas o células microbianas, consiste en una preparación de al menos 10% y más preferiblemente 50% de las células del sujeto.
A continuación se describen con detalle diversos aspecto de la invención.
Moléculas de ácido nucleico aisladas
En el presente documento se describe una molécula de ácido nucleico aislada o purificada, que codifica un polipéptido 15603, por ejemplo una proteína 15603 de longitud completa o un fragmento de la misma, por ejemplo, una parte biológicamente activa de una proteína 15603. También se describe un fragmento de ácido nucleico adecuado para uso como sonda de hibridación que puede usarse, por ejemplo, para identificar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido 15603, ARNm de 15603 y fragmentos adecuados para uso como cebadores, por ejemplo, cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico.
Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico de 15603 aislada incluye la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1, o una parte cualquiera de esta secuencia de nucleótidos. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico incluye secuencias que codifican la proteína 15603 humana (es decir, "la región codificante" de la SEC ID Nº: 1, como se muestra en la SEC ID Nº: 3). Como alternativa, la molécula de ácido nucleico puede incluir sólo la región codificante de la SEC ID Nº: 1 (por ejemplo, la SEC ID Nº: 3) y, por ejemplo, ninguna secuencia flanqueante de las que normalmente acompañan a la secuencia objeto. Como alternativa, la molécula de ácido nucleico codifica una secuencia correspondiente a un fragmento de la proteína desde aproximadamente el aminoácido 493 al 727 o desde el 123 al 347 de la SEC ID Nº: 2.
Como alternativa, una molécula de ácido nucleico de 15603 aislada incluye una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 o en la SEC ID Nº: 3, o una parte de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos. Como alternativa, la molécula de ácido nucleico es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3 de tal forma que puede hibridar con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 ó 3, formando de esta manera un dúplex
estable.
Como alternativa, una molécula de ácido nucleico de 15603 aislada incluye una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor con la longitud entera de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC Nº:1 o SEC ID Nº: 3, o una parte, preferiblemente de la misma longitud, de cualquiera de esas secuencias de nucleótidos.
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Fragmentos de Ácido Nucleico de 15603
Una molécula de ácido nucleico de 15603 puede incluir sólo una parte de la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 1 ó 3. Por ejemplo, dicha molécula de ácido nucleico puede incluir un fragmento que puede usarse como sonda o cebador o un fragmento que codifica una parte de una proteína 15603, por ejemplo, una parte inmunogénica o biológicamente activa de una proteína 15603. Un fragmento puede comprender los nucleótidos de la SEC ID Nº: 1, que codifican un dominio de proteína de canal iónico de la proteína 15603 humana. La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen de 15603 permite la generación de sondas y cebadores diseñados para uso en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia de 15603, o fragmentos de los mismos, así como homólogos de la proteína 15603, o fragmentos de la misma, procedentes de otras especies.
Como alternativa, un ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que incluye parte, o toda la región codificante y se extiende hasta la región no codificante 5' o 3' (o ambas). Otras alternativas incluyen un fragmento que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de aminoácidos descrito en la presente memoria. Los fragmentos de ácido nucleico pueden codificar un dominio o sitio específico descrito en la presente memoria o fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos de los mismos con una longitud de al menos 100, 200 ó 300 aminoácidos. Los fragmentos también incluyen secuencias de ácido nucleico que corresponden a secuencias de aminoácidos específicas descritas anteriormente o fragmentos de las mismas. No debe considerarse que los fragmentos de ácido nucleico incluyen los fragmentos que pueden haberse descrito antes de la invención.
Un fragmento de ácido nucleico puede incluir una secuencia correspondiente a un dominio, región o sitio funcional descrito en la presente memoria. Un fragmento de ácido nucleico también puede incluir uno o más dominios, regiones o sitios funcionales descritos en la presente memoria. De esta manera, por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico de 15603 puede incluir una secuencia correspondiente a un dominio de proteína de canal iónico, como se describe en la presente memoria.
Se describen sondas y cebadores de 15603. Típicamente, una sonda/cebador es un oligonucleótido aislado o purificado. El oligonucleótido típicamente incluye una región de secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 7, 12 ó 15, preferiblemente aproximadamente 20 ó 25, más preferiblemente aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, ó 75 nucleótidos consecutivos de una secuencia con sentido o antisentido de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 3, o de una variante alélica natural o mutante de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 3.
En una realización preferida, el ácido nucleico es una sonda que tiene una longitud de al menos 5 ó 10, y menos de 200, más preferiblemente menos de 100 o menos de 50 pares de bases. Debe ser idéntica o diferir en una o menos de 5 ó 10 bases de una secuencia descrita en la presente memoria. Si se necesita un alineamiento para esta comparación, las secuencias deben alinearse para una homología máxima. Se consideran diferencias las secuencias de "bucles" de deleciones o inserciones, o desacoplamientos.
Una sonda o cebador puede proceder de la cadena con sentido o antisentido de un ácido nucleico que codifica: dominios transmembrana de 15603, que están localizados aproximadamente en los restos aminoacídicos 407 a 426, 443 a 459, 490 a 507, 598 a 614, 637 a 653 y 703 a 727 de la SEC ID Nº: 2 (previsto por MEMSAT, Jones et al. (1994) Biochemistry 33:3038-3049); o del dominio de repetición de Ank en los aminoácidos 97 a 131, 132 a 163 y 218 a 250 de la SEC ID Nº: 2.
También se describe una serie de cebadores, por ejemplo, cebadores adecuados para uso en una PCR, que pueden usarse para amplificar una región seleccionada de una secuencia de 15603, por ejemplo, un dominio, región, sitio u otra secuencia descrita en la presente memoria. Los cebadores deben tener una longitud de al menos 5, 10 ó 50 pares de bases y una longitud menor de 100 o menor de 200 pares de bases. Los cebadores deben ser idénticos o difieren en una base de una secuencia descrita en la presente memoria o de una variante natural.
Un fragmento de ácido nucleico puede codificar un epítopo que lleva una región de un polipéptido descrito en la presente memoria.
Un fragmento de ácido nucleico que codifica una "parte biológicamente activa de un polipéptido 15603" puede prepararse por aislamiento de una parte de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1 ó 3, que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica de 15603 (por ejemplo las actividades biológicas de las proteínas 15603 se describen en la presente memoria), expresión de la parte codificada de la proteína 15603 (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro) y evaluación de la actividad de la parte codificada de la proteína 15603. Por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico que codifica una parte biológicamente activa de 15603 incluye un dominio de canal iónico, por ejemplo, los restos aminoacídicos aproximadamente 493 a 727 de la SEC ID Nº: 2. Un fragmento de ácido nucleico que codifica una parte biológicamente activa de un polipéptido 15603, puede comprender una secuencia de nucleótidos con una longitud mayor de 200, 250, 300 o más nucleótidos.
Preferiblemente, un ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que tiene una longitud de aproximadamente 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700 o más nucleótidos e hibrida en condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 3.
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Variantes de Ácido Nucleico de 15603
También se describen moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 o en la SEC ID Nº: 3. Estas diferencias pueden deberse a la degeneración del código genético (y producir un ácido nucleico que codifica las mismas proteínas 15603 que se han codificado por la secuencia de nucleótidos descrita en la presente memoria). Como alternativa, una molécula de ácido nucleico de 15603 aislada tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere, al menos en 1, pero menos de 5, 10, 20, 50 ó 100 restos aminoacídicos que se muestran en la SEC ID Nº: 2. Si se necesita un alineamiento para esta comparación, las secuencias deben alinearse para una homología máxima. Se consideran diferencias las secuencias de "bucles" de deleciones o inserciones, o desacoplamientos.
Pueden elegirse ácidos nucleicos que tengan codones, que son preferidos o no preferidos, para un sistema de expresión particular. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser uno en el que al menos un codón, preferiblemente al menos 10% o 20% de los codones se han alterado de forma que la secuencia se optimiza con respecto a la expresión en E. coli, células de levadura, células humanas, células de insecto o células CHO.
Las variantes del ácido nucleico puede ser naturales, tales como variantes alélicas (mismo locus), homólogas (diferente locus) y ortólogas (diferente organismo) o pueden ser no naturales. Las variantes no naturales pueden obtenerse por técnicas de mutagénesis, incluyendo las aplicadas a polinucleótidos, células u organismos. Las variantes pueden contener sustituciones, deleciones, inversiones e inserciones de nucleótidos. Puede producirse una variación en cualquiera o tanto en la región codificante como en la región no codificante. Las variaciones pueden producir sustituciones de aminoácidos conservativas y no conservativas (en comparación con el producto codificado).
Preferiblemente, el ácido nucleico difiere del de la SEC ID Nº: 1 ó 3, por ejemplo, como se indica a continuación: al menos en uno pero en menos de 10, 20, 30 ó 40 nucleótidos; al menos en uno pero en menos de 1%, 5%, 10% o 20% de los nucleótidos en el ácido nucleico a analizar. Si es necesario para este análisis, las secuencias deben alinearse para conseguir una homología máxima. Se consideran diferencias las secuencias de "bucles" de deleciones o inserciones, o desacoplamientos.
Pueden identificarse ortólogos, homólogos y variantes alélicas usando métodos conocidos en la técnica. Estas variantes comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una identidad de 50%, al menos aproximadamente 55%, típicamente al menos aproximadamente 70-75%, más típicamente al menos aproximadamente 80-85% y aún más típicamente al menos aproximadamente 90-95% o mayor con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 2 o un fragmento de esta secuencia. Estas moléculas de ácido nucleico pueden identificarse fácilmente como moléculas capaces de hibridar en condiciones rigurosas, con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº: 2 o un fragmento de la secuencia. Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a ortólogos, homólogos y variantes alélicas de los ADNc de 15603 de la invención pueden aislarse adicionalmente por mapeo en el mismo cromosoma o locus que el gen de 15603.
Las variantes preferidas incluyen las que están correlacionadas con la capacidad de regular el flujo de cationes a través de una membrana por la presencia de un segundo mensajero tal como diacilglicerol.
Las variantes alélicas de 15603, por ejemplo 15603 humana, incluyen tanto proteínas funcionales como proteínas no funcionales. Las variantes alélicas funcionales son variantes de secuencias de aminoácidos naturales de la proteína 15603 dentro de una población que mantiene la capacidad de regular canales de cationes accionados por segundo mensajero activados por diacilglicerol. Las variantes alélicas funcionales típicamente contendrán sólo la sustitución conservativa de uno o más aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, o la sustitución, deleción o inserción de restos no críticos en regiones no críticas de la proteína. Las variantes alélicas no funcionales son variantes de secuencias de aminoácidos naturales de la proteína 15603, por ejemplo, la proteína 15603 humana, dentro de una población que no tienen la capacidad de regular canales catiónicos accionados por segundo mensajero activados por diacilglicerol. Las variantes alélicas no funcionales contendrán típicamente una sustitución, deleción, o inserción no conservativas, o el truncamiento prematuro de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, o una sustitución, inserción, o deleción en restos críticos o regiones críticas de la proteína.
Además, también se describen moléculas de ácido nucleico que codifican otros miembros de la familia de 15603 y, por lo tanto, que tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de las secuencias de 15603 de la SEC ID Nº: 1 o la SEC ID Nº: 3.
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Moléculas de Ácido Nucleico Antisentido, Ribozimas y Moléculas de Ácido Nucleico de 15603 Modificadas
También se describe en la presente memoria una molécula de ácido nucleico aislada que es antisentido con respecto a la proteína 15603. Un ácido nucleico "antisentido" puede incluir una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "con sentido" que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria a la cadena codificante de una molécula de ADNc bicatenaria o complementaria a una secuencia de ARNm. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena codificante de 15603 entera, o sólo a una parte de la misma (por ejemplo, la región codificante de 15603 humana correspondiente a la SEC ID Nº: 3). Como alternativa, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido con respecto a una "región no codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica 15603 (por ejemplo, las regiones no traducidas 5' y 3').
Un ácido nucleico antisentido puede diseñarse de tal forma que sea complementario a la región codificante entera del ARNm de 15603, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido con respecto a solamente una parte de la región codificante o no codificante del ARNm de 15603. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción del ARNm de 15603, por ejemplo, entre las regiones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del gen diana de interés. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 o más nucleótidos de longitud.
Un ácido nucleico antisentido puede construirse usando síntesis química y reacciones de ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) se puede sintetizar químicamente usando los nucleótidos que se producen de forma natural o nucleótidos modificados de muy distintas formas diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y con sentido; por ejemplo, se pueden utilizar derivados de fosforotioato y nucleótidos con sustituciones de acridina. El ácido nucleico antisentido también puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés, descrito adicionalmente en la siguiente subsección).
Las moléculas de ácido nucleico antisentido típicamente se administran a un sujeto (por ejemplo, por inyección directa en un sitio de un tejido), o se generan in situ de tal forma que hibriden o se unan al ARNm celular y/o ADN genómico que codifica una proteína 15603 para inhibir de esta manera la expresión de la proteína, por ejemplo, por medio de la inhibición de la transcripción y/o la traducción. Como alternativa, pueden modificarse moléculas de ácido nucleico antisentido para dirigirse a células seleccionadas y después administrarse sistémicamente. Para la administración sistémica, se pueden modificar las moléculas antisentido de tal forma que se unan específica o selectivamente a receptores o antígenos expresados en una superficie celular determinada, por ejemplo, uniendo las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores o antígenos de la superficie celular. Las moléculas de ácido nucleico antisentido también pueden administrarse a células usando los vectores descritos en la presente memoria. Para conseguir suficientes concentraciones intracelulares de las moléculas antisentido, se prefieren construcciones de vectores en las que la molécula de ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un promotor fuerte de pol II o pol III.
Como alternativa, la molécula de ácido nucleico antisentido es una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica. Una molécula \alpha-anomérica de ácido nucleico forma híbridos bicatenarios específicos con el ARN complementario en los que, a diferencia de las unidades \beta usuales, las cadenas circulan en paralelo (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2'-o-metilrribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215: 327-330).
Como alternativa, un ácido nucleico antisentido es una ribozima. Una ribozima que tiene especificidad por un ácido nucleico codificante de 15603 puede incluir una o más secuencias complementarias a la secuencia de nucleótidos de un ADNc de 15603 descrito en la presente memoria (es decir, la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 3), y una secuencia que tiene una secuencia catalítica conocida responsable de la escisión del ARNm (véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.093.246 o Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334: 585-591). Por ejemplo, puede construirse un derivado del ARN L-19 IVS de Tetrahymena en el que la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos a escindir en un ARNm codificante de 15603. Véase, por ejemplo, Cech et al. Patente de Estados Unidos Nº 4.987.071; y Cech et al. Patente de Estados Unidos Nº 5.116.742. Como alternativa, el ARNm de 15603 puede usarse para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad ribonucleasa específica de un grupo de moléculas de ARN. Véase, por ejemplo, Bartel y Szostak (1993) Science 261:1411-1418.
La expresión del gen de 15603 puede inhibirse por dirección a secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora de la proteína 15603 (por ejemplo, el promotor y/o potenciadores de 15603) para formar estructuras en triple hélice que impiden la transcripción del gen de 15603 en células diana. Véase, en general, Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6:569-84; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher (1992) Bioassays 14:807-15. Las secuencias potenciales que pueden fijarse como dianas para la formación de triples hélices pueden aumentarse creando una denominada molécula de ácido nucleico "cambiante" ("switchback"). Las moléculas switchback se sintetizan de una forma 5'-3', 3'-5' alterna, de tal manera que forman pares de bases primero con una cadena de un dúplex y después con la otra, eliminando la necesidad de que esté presente un tramo considerable de purinas o pirimidinas en una cadena de dúplex.
En la presente memoria también se describen moléculas de sonda y cebadores oligonucleotídicos marcados de manera detectable. Típicamente, estos marcadores son quimioluminiscentes, fluorescentes, radiactivos o colorimé-
tricos.
Una molécula de ácido nucleico de 15603 puede modificarse en el resto base, resto de azúcar o cadena principal de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, la cadena principal de desoxirribosa fosfato de las moléculas de ácido nucleico puede modificarse para generar ácidos nucleicos peptídicos (véase Hyrup et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4: 5-23). Como se usan en la presente memoria, los términos "ácido péptido nucleico" o "APN" se refieren a un mimético de ácido nucleico, por ejemplo un mimético de ADN, en el que la cadena principal de desoxirribosa fosfato se reemplaza por una cadena principal seudopeptídica y sólo se conservan las cuatro nucleobases naturales. La cadena principal neutra de un APN puede permitir la hibridación específica a ADN y ARN en condiciones de alta intensidad iónica. Se puede realizar la síntesis de oligómeros PNA utilizando protocolos estándar de síntesis de péptidos en fase sólida tal y como se describe en Hyrup, et al. (1996) supra; Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 14670-675.
Pueden usarse APN de moléculas de ácido nucleico de 15603 en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, se pueden utilizar APN como agentes antisentido o antígenos para la modulación específica de la secuencia de la expresión génica, por ejemplo, induciendo la parada de la transcripción o de la traducción o inhibiendo la replicación. También se pueden utilizar APN de las moléculas de ácido nucleico de 15603 en el análisis de mutaciones de un único par de bases en un gen, (por ejemplo, mediante pinzamiento por PCR dirigida por APN); como "enzimas de restricción artificiales" cuando se utilizan en combinación con otras enzimas (por ejemplo, nucleasas S1 [Hyrup, et al. (1996) supra]); o como sondas o cebadores para la secuenciación o hibridación del ADN (Hyrup, et al. (1996) supra; Perry-O'Keefe supra).
Como alternativa, el oligonucleótido puede incluir otros grupos colgantes tales como péptidos (por ejemplo, para fijar como objetivo receptores de células hospedadoras in vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; la publicación de PCT nº WO 88/09810) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, la publicación PCT nº WO 89/10134). Además, se pueden modificar oligonucleótidos con agentes de escisión que se desencadenan con la hibridación (véase, por ejemplo, Krol et al. (1988) Bio-Techniques 6:958-976) o agentes intercalantes. (véase, por ejemplo, Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549). Para este fin, el oligonucleótido puede conjugarse con otra molécula (por ejemplo, un péptido, agente de reticulación inducido por hibridación, agente de transporte o agente de escisión inducido por hibridación).
En la presente memoria también se describen moléculas oligonucleotídicas de cebador y sonda con balizas moleculares que tienen al menos una región que es complementaria a un ácido nucleico de 15603, dos regiones complementarias teniendo una un fluoróforo y teniendo la otra un inactivador de tal forma que la baliza molecular sea útil para cuantificar la presencia del ácido nucleico de 15603 de la invención en una muestra. Se describen ácidos nucleicos de balizas moleculares, por ejemplo, en Lizardi et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.854.033; Nazarenko et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.866.336 y Livak et al., Patente de Estados Unidos 5.876.930.
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Polipéptidos 15603 Aislados
En la presente memoria también se describe una proteína 15603 aislada, o un fragmento, por ejemplo, una parte biológicamente activa, para uso como inmunógenos o antígenos para inducir o ensayar (o más generalmente para unirse a) anticuerpos anti-15603. La proteína 15603 puede aislarse a partir de fuente celulares o tisulares usando técnicas de purificación de proteínas convencionales. La proteína 15603 o sus fragmentos pueden producirse por técnicas de ADN recombinantes o pueden sintetizarse químicamente.
Los polipéptidos descritos en la presente memoria incluyen los que se producen como resultado de la existencia de múltiples genes, acontecimientos alternativos de la transcripción, acontecimientos alternativos de corte y empalme de ARN y acontecimientos alternativos de traducción y postraduccionales. El polipéptido puede expresarse en sistemas, por ejemplo, células cultivadas que ocasionan sustancialmente las mismas modificaciones postraduccionales presentes cuando el polipéptido se expresa en una célula nativa, o en sistemas que ocasionan la alteración u omisión de modificaciones postraduccionales, por ejemplo glicosilación o escisión, presentes en una célula
nativa.
Preferiblemente, un polipéptido 15603 tiene una o más de las siguientes características:
tiene la capacidad de regular el flujo de cationes a través de una membrana, la capacidad de unirse a un segundo mensajero, la capacidad de unirse a diacilglicerol, la capacidad de regular los niveles de calcio intracelulares y la capacidad de regular la angiogénesis;
tiene un peso molecular, por ejemplo, un peso molecular deducido, preferiblemente ignorando cualquier contribución de modificaciones postraduccionales, composición de aminoácidos u otras características físicas de un polipéptido 15603, por ejemplo un polipéptido de la SEC ID Nº: 2;
tiene una similitud de secuencia global de al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80, 90 ó 95%, con un polipéptido de la SEC ID Nº: 2;
se expresa en al menos los siguientes tejidos y líneas celulares humanas: a altos niveles en nombres de tejidos de la lista y taqman: hemangioma, músculo liso vascular, megacariocitos, tumor de Wilm; a niveles medios en corteza cerebral normal, útero y células endoteliales proliferativas; y a niveles bajos en tejido adiposo, arteria mamaria interna humana normal, aorta humana enferma, arteria humana enferma, vena humana enferma y vena humana normal, corazón normal, corazón CHF, riñón normal, músculo esquelético, páncreas, osteoblastos primarios, hipotálamo cerebral, mama normal, ovario normal, próstata normal, tumor de próstata, glándulas salivares, colon normal, tumor de colon, pulmón normal, tumor de pulmón, COPD pulmonar, IBD de colon, bazo normal, amígdala normal, intestino delgado normal, úlcera de decúbito en la piel, sinovio, glioblastomas, glándula suprarrenal fetal, hígado fetal y corazón
fetal;
tiene un dominio de proteína de canal iónico que tiene una identidad preferiblemente de aproximadamente 70%, 80%, 90% o 95% a los restos aminoacídicos aproximadamente 493 a 727 de la SEC ID Nº: 2;
tiene un dominio de repetición de ank que tiene una identidad de preferiblemente aproximadamente 70%, 80%, 90% o 95% con los restos aminoacídicos aproximadamente 97 a 131, 132 a 163 y 218 a 250 de la SEC ID Nº: 2;
y
Preferiblemente, la proteína 15603, o su fragmento, difiere de la secuencia correspondiente de la SEC ID Nº: 2. En una realización difiere al menos en uno pero menos de 15, 10 ó 5 restos aminoacídicos. En otra difiere de la secuencia correspondiente de la SEC ID Nº: 2 en al menos un resto pero menos de 20%, 15%, 10% o 5% de los restos en ella difieren de la secuencia correspondiente de la SEC ID Nº: 2. (Si esta comparación requiere un alineamiento de las secuencias, deben alinearse para una homología máxima. Las secuencias de "bucles" debidas a deleciones o inserciones, o desacoplamientos, se consideran diferencias). Las diferencias son, preferiblemente, diferencias o cambios en un resto no esencial o una sustitución conservativa. Preferiblemente, las diferencias no están en el dominio de repetición de ank aproximadamente en los restos 97 a 131, 132 a 163 y 218 a 250 de la SEC ID Nº: 2. Como alternativa, una o mas diferencias están en el dominio de repetición de ank aproximadamente en los restos 97 a 131, 132 a 163 y 218 a 250 de la SEC ID Nº: 2.
Otras alternativas incluyen una proteína que contiene uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, un cambio en un resto aminoacídico que no es esencial para la actividad. Estas proteínas 15603 difieren en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, aunque retienen la actividad biológica.
Como alternativa, la proteína incluye una secuencia de aminoácidos con una homología de al menos aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o mayor con la SEC ID Nº: 2.
Se proporciona una proteína 15603 o un fragmento que varía de la secuencia de la SEC ID Nº: 2 en regiones definidas por aproximadamente los restos aminoacídicos 407 a 426, 443 a 459, 490 a 507, 598 a 614, 637 a 653, o 703 a 727 de la SEC ID Nº: 2 al menos en uno pero menos de 15, 10 ó 5 restos aminoacídicos de la proteína o fragmento. En algunas alternativas, la diferencia está en un resto no esencial o es una sustitución conservativa, mientras que en otras la diferencia está en un resto esencial o es una sustitución no conservativa.
Se proporciona una proteína 15603 o fragmento que varía de la secuencia de la SEC ID Nº: 2 en regiones definidas por los restos aminoacídicos aproximadamente 97 a 131, 132 a 163 y 218 a 250 de la SEC ID Nº: 2 en al menos uno pero menos de 15, 10 ó 5 restos aminoacídicos en la proteína o fragmento. En algunas alternativas, la diferencia está en un resto no esencial o es una sustitución conservativa, mientras que en otras la diferencia está en un resto esencial o es una sustitución no conservativa.
En una alternativa, una parte biológicamente activa de una proteína 15603 incluye al menos un dominio transmembrana. Además, pueden prepararse otras partes biológicamente activas en las que están delecionadas otras regiones de la proteína por técnicas recombinantes y evaluarse con respecto a una o más de las actividades funcionales de una proteína 15603 nativa.
Preferiblemente, la proteína 15603 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2. En otras realizaciones, la proteína 15603 es suficientemente o sustancialmente idéntica a la SEC ID Nº: 2. Como alternativa, la proteína 15603 es suficientemente o sustancialmente idéntica a la SEC ID Nº: 2 y conserva la actividad funcional de la proteína de la SEC ID Nº: 2, como se describe con detalle en las subsecciones anteriores.
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Proteínas 15603 Quiméricas o de Fusión
En la presente memoria también se describen proteínas quiméricas o de fusión de 15603. Como se usa en la presente memoria, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" de 15603 incluye un polipéptido 15603 unido a un polipéptido que no es 15603. Un "polipéptido que no es 15603" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la proteína 15603, por ejemplo, una proteína que es diferente de la proteína 15603 y que procede del mismo organismo o de un organismo diferente. El polipéptido 15603 de la proteína de fusión puede corresponder a todo o a una parte, por ejemplo, a un fragmento descrito en la presente memoria de una secuencia de aminoácidos de 15603. Preferiblemente, una proteína de fusión de 15603 incluye al menos una (o dos) partes biológicamente activas de una proteína 15603. El polipéptido que no es 15603 puede fusionarse al extremo N o al extremo C del polipéptido 15603.
La proteína de fusión puede incluir un resto que tiene alta afinidad por un ligando. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión GST-15603 en la que las secuencias de 15603 están fusionadas al extremo C de las secuencias de GST. Estas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de 15603 recombinante. Como alternativa, la proteína de fusión puede ser una proteína 15603 que contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo N. En ciertas células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras de mamífero), la expresión y/o secreción de 15603 puede aumentarse por medio del uso de una secuencia señal heteróloga.
Las proteínas de fusión pueden incluir todo o una parte de una proteína sérica, por ejemplo una parte de una inmunoglobulina (por ejemplo IgG, IgA, o IgE), por ejemplo una región Fc y/o las secuencias de bisagra C1 y C2 de una inmunoglobulina o albúmina de suero humano.
Las proteínas de fusión de 15603 pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas y administrarse a un sujeto in vivo. Las proteínas de fusión de 15603 pueden usarse para afectar a la biodisponibilidad de un sustrato de 15603. Las proteínas de fusión de 15603 pueden ser terapéuticamente útiles para el tratamiento trastornos producidos, por ejemplo, por i) la mutación o modificación aberrante de un gen que codifica una proteína 15603; ii) la regulación alterada del gen de 15603; y (iii) una modificación post-traduccional aberrante de una proteína 15603.
Además, las proteínas de fusión de 15603 pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos anti-15603 en un sujeto, para purificar ligandos de 15603 y en ensayos de selección para identificar moléculas que inhiben la interacción de 15603 con un sustrato de 15603.
Se dispone en el mercado de vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido de GST). Un ácido nucleico que codifica 15603 puede clonarse en dicho vector de expresión de tal forma que el resto de fusión se una en fase a la proteína 15603.
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Variantes de Proteínas 15603
En la presente memoria también se describe una variante de un polipéptido 15603, por ejemplo, que funciona como un agonista (mimético) o como un antagonista. Pueden generarse variantes de las proteínas 15603 por mutagénesis, por ejemplo por mutación puntual discreta, la inserción o deleción de secuencias o el truncamiento de una proteína 15603. un agonista de las proteínas 15603 puede retener sustancialmente las mismas, o una subserie de las actividades biológicas de la forma natural de una proteína 15603. Un antagonista de una proteína 15603 puede inhibir una o más de las actividades de la forma natural de la proteína 15603, por ejemplo, por modulación competitiva de una actividad mediada por 15603 de una proteína 15603. Por lo tanto, se pueden desencadenar efectos biológicos específicos mediante el tratamiento con una variante de función limitada. Preferiblemente, el tratamiento de un sujeto con una variante que tiene una subserie de las actividades biológicas de la forma natural de la proteína tiene menos efectos secundarios en un sujeto con respecto al tratamiento con la forma natural de la proteína 15603.
Pueden identificarse variantes de una proteína 15603 explorando en bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, de una proteína 15603 la actividad agonista o antagonista.
Pueden usarse bibliotecas de fragmentos, por ejemplo, fragmentos N terminales, C terminales, o internos, de una secuencia codificante de proteína 15603 para generar una población variada de fragmentos para la exploración y posterior selección de variantes de una proteína 15603.
Se prefieren particularmente variantes en las que se añade o se deleciona un resto de cisteína o en las que se añade o se deleciona un resto que está glicosilado.
En la técnica se conocen métodos para explorar productos génicos de bibliotecas combinatorias obtenidas por mutaciones puntuales o truncamiento, y para la exploración de bibliotecas de ADNc para seleccionar productos génicos que tengan una propiedad seleccionada. La mutagénesis recursiva en conjunto (REM por su nombre en inglés), una nueva técnica que mejora la frecuencia de mutantes funcionales en las genotecas, se puede utilizar en combinación con los análisis de detección para identificar variantes de la proteína 15603 (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6:327-331).
Pueden explotarse ensayos basados en células para analizar una biblioteca de 15603 variada. Por ejemplo, una biblioteca de vectores de expresión puede introducirse por transfección en una línea celular, por ejemplo, una línea celular que responde normalmente a 15603 de una manera dependiente del sustrato. Las células transfectadas después se ponen en contacto con 15603 y puede detectarse el efecto de la expresión del mutante sobre la señalización por el sustrato 15603, por ejemplo midiendo los potenciales de membrana o la unión a diacilglicerol. A continuación se puede recuperar el ADN plasmídico de las células que reflejan la inhibición o, alternativamente, la potenciación de la señalización por el sustrato de la proteína 15603, y caracterizar adicionalmente los distintos
clones.
En la presente memoria también se describe un método para obtener un polipéptido 15603, por ejemplo un péptido que tiene una actividad de tipo no silvestre, por ejemplo, un antagonista, agonista o superagonista de un polipéptido 15603 natural, por ejemplo un polipéptido 15603 natural. El método incluye alterar la secuencia de un polipéptido 15603, por ejemplo, alterar la secuencia, por ejemplo, por sustitución o deleción de uno o más restos de una región no conservada, un dominio o resto descrito en la presente memoria, y ensayar en el polipéptido alterado la actividad deseada.
En la presente memoria también se describe un método para obtener un fragmento o análogo de un polipéptido 15603 con una actividad biológica de un polipéptido 15603 natural. El método incluye alterar la secuencia, por ejemplo, por sustitución o deleción de uno o más restos de un polipéptido 15603 de, por ejemplo, alterando la secuencia de una región no conservada, o un dominio o resto descrito en la presente memoria, y ensayar en el polipéptido alterado la actividad deseada.
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Anticuerpos Anti-15603
En la presente memoria también se describe un anticuerpo anti-15603. El término "anticuerpo" como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula inmunoglobulina o a una parte inmunológicamente activa de la misma, es decir, una parte de unión a antígeno. Los ejemplos de partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos scFV y dcFV, y fragmentos Fab y F(ab')_{2} que pueden generarse por tratamiento del anticuerpo con una enzima tal como papaína o pepsina, respectivamente.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, monoclonal, recombinante, por ejemplo, quimérico o humanizado, completamente humano, no humano, por ejemplo, murino, o monocatenario. En una realización preferida tiene una función efectora y puede fijarse al complemento. El anticuerpo puede acoplarse a una toxina o a un agente formador de imágenes.
Una proteína 15603 de longitud completa o un fragmento peptídico antigénico de 15603 puede usarse como inmunógeno o puede usarse para identificar anticuerpos anti-15603 obtenidos con otros inmunógenos, por ejemplo, células, preparaciones de membrana y similares. El péptido antigénico de 15603 debe incluir al menos 8 restos aminoacídicos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2 e incluye un epítopo de 15603. Preferiblemente, el péptido antigénico incluye al menos 10 restos aminoacídicos, más preferiblemente al menos 15 restos aminoacídicos, incluso más preferiblemente al menos 20 restos aminoacídicos y aún más preferiblemente al menos 30 restos aminoacídicos.
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Vectores de Expresión Recombinantes, Células Hospedadoras y Células Obtenidas Por Ingeniería Genética
También se describen en la presente memoria vectores, preferiblemente vectores de expresión que contienen un ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito en la presente memoria. Como se usa en la presente memoria, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido y puede incluir un plásmido, cósmido o vector viral. El vector puede ser capaz de replicarse de forma autónoma o puede integrarse en el ADN de un hospedador. Los vectores virales incluyen, por ejemplo, retrovirus con defectos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados.
Un vector puede incluir un ácido nucleico de 15603 en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora. Preferiblemente, el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras unidas operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. El término "secuencia reguladora" incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo señales de poliadenilación). Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos, así como secuencias inducibles y/o reguladoras con especificidad de tejido. El diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado y similares. Los vectores de expresión pueden introducirse en células hospedadoras para producir de esta manera proteínas o polipéptidos, incluyendo proteínas o polipéptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como los descritos en la presente memoria (por ejemplo, proteínas 15603, formas mutantes de proteínas 15603, proteínas de fusión y similares).
Los vectores de expresión recombinantes pueden diseñarse para la expresión de proteínas 15603 en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, pueden expresarse polipéptidos de la invención en E. coli, células de insecto (por ejemplo usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Se describen células hospedadora adecuadas adicionalmente en Goeddel, (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 1885, Academic Press, San Diego, CA. Como alternativa, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras del promotor de T7 y polimerasa de T7.
La expresión de proteínas en procariotas se realiza la mayoría de las veces en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o proteínas que no son proteínas de fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a una proteína codificada en los mismos, normalmente en el extremo amino de la proteína recombinante. Estos vectores de fusión típicamente tiene tres fines: 1) aumentar la expresión de la proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en la purificación por afinidad. A menudo, se introduce un sitio de escisión proteolítico en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Estas enzimas y sus secuencias de reconocimiento afines incluyen el Factor Xa, trombina y enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.
Las proteínas de fusión purificadas pueden usarse en ensayos de actividad de 15603 (por ejemplo, ensayos directos o ensayos competitivos descritos con detalle más adelante), o para generar anticuerpos específicos o selectivos para proteínas 15603. Preferiblemente, una proteína de fusión expresada en un vector retroviral puede usarse para infectar células de médula ósea que posteriormente se trasplantan en receptores irradiados. Posteriormente, se examina la patología del receptor después de que haya transcurrido un tiempo suficiente (por ejemplo, seis semanas).
Para maximizar la expresión de proteínas recombinantes en E. coli, se expresa la proteína en una bacteria hospedadora con una capacidad deteriorada de escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico a insertar en un vector de expresión de forma que los codones individuales para cada aminoácido sean los utilizados preferentemente en E. coli (Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). Esta alteración de secuencias de ácido nucleico de la invención puede realizarse por técnicas de síntesis de ADN convencionales.
El vector de expresión de 15603 puede ser un vector de expresión de levadura, un vector para la expresión en células de insecto, por ejemplo, un vector de expresión de baculovirus o un vector adecuado para la expresión en células de mamífero.
Cuando se usa en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión a menudo se proporcionan por elementos reguladores víricos. Por ejemplo, los promotores usados comúnmente proceden de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40.
Como alternativa, el vector de expresión de mamífero recombinante puede dirigir la expresión del ácido nucleico preferiblemente en un tipo celular particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores con especificidad de tejido para expresar el ácido nucleico). Los ejemplos no limitantes de promotores con especificidad de tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina (con especificidad de hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 265-277), promotores con especificidad linfoide (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores específicos de las neuronas (e.g., el promotor del neurofilamento; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), promotores con especificidad de páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230: 912-916), y promotores con especificidad de glándula mamaria (por ejemplo, promotor de suero de leche; Patente de Estados Unidos Nº 4.873.316 y Publicación de Solicitud Europea Nº 264.166). También se incluyen promotores regulados en el desarrollo, por ejemplo, los promotores de hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249: 374-379) y el promotor de \alpha-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546).
También se describe un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Pueden elegirse secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores y/o potenciadores virales) unidos operativamente a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido que dirijan la expresión constitutiva, específica de tejido o específica de tipo celular del ARN antisentido en una diversidad de tipos celulares. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido recombinante, fagémico o virus atenuado. Como análisis de la regulación de la expresión génica usando genes antisentido, véase Weintraub et al., (1986) Reviews - Trends in Genetics 1:1.
También se describe en la presente memoria una célula hospedadora que incluye una molécula de ácido nucleico descrita en este documento, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de 15603 dentro de un vector de expresión recombinante o una molécula de ácido nucleico de 15603 que contiene secuencias que permiten que se recombine de manera homóloga en un sitio específico del genoma de la célula hospedadora. Las expresiones "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se usan indistintamente en la presente memoria. Estos términos se refieren no sólo a la célula objeto particular, sino a la descendencia o posible descendencia de dicha célula. Dado que se pueden producir determinadas modificaciones en las sucesivas generaciones debido a influencias de mutaciones o medioambientales, tal descendencia no puede, de hecho, ser idéntica a la célula original, pero se sigue incluyendo dentro del alcance de la terminología tal y como se utiliza en la presente memoria.
Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, una proteína 15603 puede expresarse en células bacterianas tales como células E. coli, células de insecto, células de levadura o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o el origen de CV-1 o células SV-40 (COS)). Los especialistas en la técnica conocen otras células hospedadoras adecuadas.
El ADN del vector puede introducirse en células hospedadoras por técnicas de transformación o transfección convencionales. Tal y como se emplea en la presente memoria, la terminología "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una serie de técnicas reconocidas en la técnica anterior para introducir un ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedadora, que incluyen la coprecipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, la transfección mediante DEAE-dextrano, la lipofección o la electroporación.
Una célula hospedadora puede usarse para producir (es decir, expresar) una proteína 15603. Por consiguiente, la invención proporciona además métodos para producir una proteína 15603 usando las células hospedadoras de la invención. Por ejemplo, el método incluye cultivar la célula hospedadora de la invención (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica una proteína 15603) en un medio adecuado de tal forma que se produce una proteína 15603. Como alternativa, el método incluye además aislar una proteína 15603 a partir del medio o la célula hospedadora.
También se describe una célula o preparación purificada de células que incluyen un transgén de 15603, o que expresan de forma errónea 15603 por otra razón. La preparación de células puede consistir en células humanas o no humanas, por ejemplo, células de roedor, por ejemplo, células de ratón o rata, células de conejo o células de cerdo. Preferiblemente, la célula o células incluyen un transgén de 15603, por ejemplo, una forma heteróloga de una proteína 15603, por ejemplo, un gen procedente de seres humanos (en el caso de una célula no humana). El transgén de 15603 puede expresarse de forma defectuosa, por ejemplo, tener una expresión excesiva o insuficiente. Preferiblemente, la célula o células incluyen un gen que expresa de forma errónea una proteína 15603 endógena, por ejemplo, un gen cuya expresión está alterada, por ejemplo, un gen knockout. Estas células pueden servir como modelo para estudiar trastornos que están relacionados con alelos de 15603 mutados o expresados de forma errónea o para uso en la selección de fármacos.
También se describe una célula humana, por ejemplo una célula madre hematopoyética, transformada con un ácido nucleico que codifica un polipéptido 15603 objeto.
También se describen células, preferiblemente células humanas, por ejemplo, células hematopoyéticas o fibroblastos humanos, en las que un gen de 15603 endógeno está bajo el control de una secuencia reguladora que normalmente no controla la expresión del gen de 15603 endógeno. Las características de expresión de un gen endógeno dentro de una célula, por ejemplo, una línea celular o microorganismo, pueden modificarse insertando un elemento regulador de ADN heterólogo en el genoma de la célula de tal forma que el elemento regulador insertado esté unido operativamente al gen de 15603 endógeno. Por ejemplo, un gen de 15603 endógeno que es "transcripcionalmente silencioso", por ejemplo, no se expresa normalmente o se expresa sólo a niveles muy bajos, puede activarse por la inserción de un elemento regulador que es capaz de promover la expresión de un producto génico expresado normalmente en esa célula. Pueden usarse técnicas tales como recombinaciones homólogas dirigidas para insertar el ADN heterólogo como se describe, por ejemplo, en Chappel, documento US 5.272.071; WO 91/06667, publicado el 16 de mayo de
1991.
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Usos
Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteína y anticuerpos descritos en la presente memoria pueden usarse en uno o más de los siguientes métodos: a) ensayos de exploración;
Las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas en la presente memoria pueden usarse, por ejemplo, para expresar una proteína 15603 (por ejemplo, a través de un vector de expresión recombinante en una célula hospedadora en aplicaciones de terapia génica), para detectar un ARNm de 15603 (por ejemplo, en una muestra biológica) o una alteración genética en un gen de 15603, y para modular la actividad de 15603, como se describe con más detalle más adelante. Las proteínas 15603 pueden usarse para tratar trastornos caracterizados por una producción insuficiente o excesiva de un sustrato de 15603 o la producción de inhibidores de 15603. Además, las proteínas 15603 pueden usarse para explorar sustratos de 15603 naturales, para seleccionar fármacos o compuestos que modulen la actividad de 15603, así como para tratar trastornos caracterizados por una producción excesiva o insuficiente de la proteína 15603 o la producción de formas de la proteína 15603 que tienen una actividad reducida, aberrante o indeseada en comparación con la proteína 15603 de tipo silvestre (por ejemplo, una función o expresión aberrante o deficiente del canal iónico). Además, los anticuerpos anti-15603 de la invención pueden usarse para detectar y aislar proteínas 15603, regular la biodisponibilidad de las proteínas 15603 y modular la actividad de 15603.
Se proporciona un método para evaluar en un compuesto la capacidad de interaccionar, por ejemplo, unirse a un polipéptido 15603 objeto. El método incluye: poner en contacto el compuesto con el polipéptido 15603 objeto; y evaluar la capacidad del compuesto de interaccionar con, por ejemplo, de unirse o formar un complejo con el polipéptido 15603 objeto. Este método puede realizarse in vitro, por ejemplo en un sistema sin células, o in vivo, por ejemplo, en un ensayo TRAP de interacción doble híbrido. Este método puede usarse para identificar moléculas naturales que interaccionan con el polipéptido 15603 objeto. También puede usarse para encontrar inhibidores naturales o sintéticos del polipéptido 15603 objeto. Más adelante se describen con más detalle métodos de exploración.
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Ensayos de exploración
La invención proporciona métodos (también denominados en la presente memoria "ensayos de exploración") para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos o de ensayo (por ejemplo, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, peptoides, moléculas pequeñas u otros fármacos) que tienen un efecto inhibidor sobre la expresión de 15603 o la actividad de 15603. Los compuestos identificados de esta manera pueden usarse para modular la actividad de productos génicos diana (por ejemplo genes de 15603) en un protocolo terapéutico, para elaborar la función biológica del producto génico diana, o para identificar compuestos que alteran las interacciones normales con el gen diana.
También se describen ensayos para explorar compuestos candidatos o de ensayo que son sustratos de una proteína o polipéptido 15603 o una parte biológicamente activa del mismo. También se describen ensayos para explorar compuestos candidatos o de ensayo que se unen o modulan la actividad de una proteína o polipéptido 15603 o una parte biológicamente activa de la misma.
Los compuestos de ensayo usados en la presente invención pueden obtenerse usando cualquiera de las numerosas estrategias en los métodos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moléculas que tienen las funcionalidades de péptidos, pero con un nuevo esqueleto no peptídico que son resistentes a la degradación enzimática pero que siguen siendo bioactivas; véase, por ejemplo, Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678-85); bibliotecas en fase de solución o en fase sólida paralelas dirigibles espacialmente; métodos de bibliotecas sintéticas que requieren desconvolución; el método de biblioteca "una perla-un compuesto"; y los métodos de bibliotecas sintéticas que usan la selección de cromatografía de afinidad. Las estrategias de biblioteca biológica y biblioteca de peptoides se limitan a bibliotecas de péptidos, mientras que las otras cuatro estrategias son aplicables a bibliotecas de péptidos, oligómeros no peptídicos o compuestos de molécula pequeña (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).
Pueden encontrarse ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares en la técnica, por ejemplo, en : DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-426; Zuckermann et al. 1994. J. Med. Chem. 37:2678-85; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; y en Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233-51.
Las bibliotecas de compuestos se pueden presentar en disolución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), o en perlas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (Ladner, patente de los Estados Unidos n.º 5.223.409), esporas (Ladner, patente de los Estados Unidos n.º '409), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865-1869) o en fagos (Scott y Smith (1990) Science 249: 386-390; Devlin (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-310; Ladner supra.).
En una realización, el ensayo es un ensayo basado en células en el que una célula que expresa una proteína 15603 o una parte biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de ensayo y se determina la capacidad del compuesto de ensayo de inhibir la actividad de 15603. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de 15603 puede realizarse monitorizando la función del canal iónico. La célula, por ejemplo, puede ser de mamífero, por ejemplo, humana.
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También puede evaluarse la capacidad del compuesto de ensayo de modular la unión de 15603 a un compuesto, por ejemplo, un sustrato de 15603, o de unirse a 15603. Esto puede conseguirse, por ejemplo, por acoplamiento del compuesto, por ejemplo el sustrato, con un marcador radioisotópico o enzimático de tal forma que la unión del compuesto, por ejemplo, el sustrato a 15603 pueda determinarse por medio de la detección del compuesto marcado, por ejemplo, el sustrato en un complejo. Como alternativa, 15603 podría acoplarse con un marcador radioisotópico o enzimático para controlar la capacidad de un compuesto de ensayo de modular la unión de 15603 a un sustrato de 15603 en un complejo. Por ejemplo, se pueden marcar los compuestos (por ejemplo, sustratos de 15603) con ^{121}I, ^{35}S, ^{14}C, o ^{3}H, directamente o indirectamente, y detectar el radioisótopo al contar directamente la radioemisión o al contar el centelleo. Como alternativa, los compuestos pueden marcarse enzimáticamente, por ejemplo, con peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, o luciferasa, y el marcador enzimático puede detectarse determinando la conversión de un sustrato apropiado en producto.
Puede evaluarse la capacidad de un compuesto (por ejemplo, un sustrato de 15603) de interaccionar con 15603 con o sin el marcaje de cualquiera de los agentes que interaccionan. Por ejemplo, puede usarse un microfisiómetro para detectar la interacción de un compuesto con 15603 sin el marcaje del compuesto o la proteína 15603. McConnell et al. (1992) Science 257: 1906-1912. Tal y como se utiliza en esta memoria, un "microfisiómetro" (por ejemplo, Cytosensor) es un instrumento analítico que mide con un sensor potenciométrico activado por luz (LAPS) la velocidad a la que una célula acidifica su entorno. Los cambios en esta velocidad de acidificación pueden usarse como indicador de la interacción entre un compuesto y 15603.
En otra realización más, se proporciona un ensayo sin células en el que una proteína 15603 se pone en contacto con un compuesto de ensayo y se evalúa la capacidad del compuesto de ensayo de inhibir la proteína 15603. Las partes biológicamente activas de las proteínas 15603 a usar en ensayos descritos en la presente memoria incluyen fragmentos que participan en interacciones con moléculas que no son 15603, por ejemplo, fragmentos con altas puntuaciones de probabilidad en superficie.
En los ensayos sin células de la invención pueden usarse formas solubles y/o unidas a la membrana de proteínas 15603. Cuando se usan formas unidas en la membrana de la proteína, puede ser deseable utilizar un agente de solubilización. Los ejemplos de estos agentes de solubilización incluyen detergentes no iónicos tales como n-octilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, isotridecipoli(etilenglicoléter)_{n}, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano sulfonato (CHAPS), 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propano sulfonato (CHAPSO) o N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propano sulfonato.
Los ensayos sin células implican preparar un canal iónico en una membrana plasmática y medir el flujo de iones a través del poro de la membrana, por ejemplo por pinzamiento zonal. Si se requiere la unión del canal iónico o la proteína o subunidad relacionada y un compuesto o proteína de ensayo para la activación del canal, esto puede conseguirse en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los dos componentes interaccionen y se unan, formándose de esta manera un complejo.
También puede detectarse la interacción entre dos moléculas, por ejemplo, usando transferencia de energía de fluorescencia (FET) (véase, por ejemplo, Lakowicz et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.631.169; Stavrianopoulos, et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.868.103). Se selecciona un marcador fluoróforo en la primera molécula "donadora" de tal forma que su energía fluorescente emitida se absorba por un marcador fluorescente en una segunda molécula "aceptora", que a su vez puede emitir fluorescencia debido a la energía absorbida. Como alternativa, la proteína "donadora" puede usar simplemente la energía fluorescente natural de restos de triptófano. Se eligen marcadores que emiten diferentes longitudes de onda de luz, de tal forma que el marcador de la molécula "aceptora" puede diferenciarse del de la "donadora". Como la eficacia de transferencia de energía entre los marcadores está relacionada con la distancia que separa las moléculas, puede evaluarse la relación espacial entre las moléculas. En una situación en la que se produce la unión entre las moléculas, la emisión fluorescente del marcador de la molécula "aceptora" en el ensayo debe ser máxima. Convenientemente puede medirse un acontecimiento de unión FET por medios de detección fluorométrica convencionales bien conocidos en la técnica (por ejemplo, usando un fluorímetro).
Como alternativa, la determinación de la capacidad de la proteína 15603 de unirse a una molécula diana puede realizarse usando el análisis de interacción biomolecular a tiempo real (BIA) (véase, por ejemplo, Sjolander and Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63: 2338-2345 y Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705). La "resonancia de plasmón superficial" o "BIA" detecta interacciones bioespecíficas a tiempo real, sin marcar ninguna de las moléculas que interaccionan (por ejemplo, BIAcore). Los cambios en la masa en la superficie de unión (que indica un acontecimiento de unión) producen alteraciones del índice de refracción de luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (SPR)), dando como resultado una señal detectable que puede usarse como indicación de reacciones a tiempo real entre moléculas biológicas.
Por ejemplo, el producto génico diana o la sustancia de ensayo se ancla en una fase sólida. Al final de la reacción pueden detectarse los complejos de producto génico diana/compuesto ensayo anclados en la fase sólida. Preferiblemente, el producto génico diana puede anclarse en una superficie sólida y el compuesto de ensayo (que no se ancla) puede marcarse, directamente o indirectamente, con marcadores detectables descritos en la presente memoria.
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Puede ser deseable inmovilizar 15603, o un anticuerpo anti-15603 o su molécula diana para facilitar la separación entre las formas complejadas y las formas no complejadas de una o las dos proteínas, así como para acomodar la automatización del ensayo. La unión de un compuesto de ensayo a una proteína 15603, o la interacción de una proteína 15603 con una molécula diana en presencia y ausencia de un compuesto candidato, pueden realizarse en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los ejemplos de estos recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. Por ejemplo, puede proporcionarse una proteína de fusión que añade un dominio que permite unir una o las dos proteínas a una matriz. Por ejemplo, pueden adsorberse proteínas de fusión glutatión-S-transferasa/15603 o proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa/diana en perlas de glutatión sepharose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación modificadas con glutatión, que después se combinan con el compuesto de ensayo o el compuesto de ensayo y la proteína diana no adsorbida o proteína 15603, y la mezcla puede incubarse en condiciones que conducen a la formación de complejos (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sales y pH). Después de la incubación, se lavan las perlas o los pocillos de la placa de microtitulación para retirar cualquier componente que no se haya unido, se inmoviliza la matriz en el caso de las perlas y se determinan los complejos directa o indirectamente, por ejemplo, como se descrito anteriormente. Como alternativa, los complejos pueden disociarse de la matriz y puede determinarse el nivel de unión o actividad de 15603 usando técnicas
convencionales.
Otras técnicas para inmovilizar una proteína 15603 o una molécula diana en matrices incluyen el uso de conjugación de biotina y estreptavidina. Puede prepararse moléculas diana o proteínas 15603 biotiniladas a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando técnicas conocidas en este campo (por ejemplo, un kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL), e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical).
Para realizar el ensayo, el componente no inmovilizado se añade a la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Después de completarse la reacción, se retiran los componentes que no han reaccionado (por ejemplo por lavado) en condiciones tales que los complejos formados permanezcan inmovilizados en la superficie sólida. La detección de complejos anclados en la superficie sólida puede realizarse de varias maneras. Cuando el componente no inmovilizado previamente está premarcado, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que se formaron complejos. Cuando el componente no inmovilizado previamente no está premarcado, puede usarse un marcador indirecto para detectar complejos anclados en la superficie; por ejemplo, usando un anticuerpo marcado específico o selectivo para el componente inmovilizado (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente o marcarse indirectamente con, por ejemplo, un anticuerpo anti-Ig marcado).
Por ejemplo, este ensayo se realiza utilizando anticuerpos reactivos con la proteína 15603 o moléculas diana pero que no interfiere con la unión de la proteína 15603 a su molécula diana. Estos anticuerpos pueden modificarse en los pocillos de la placa y la diana no unida o la proteína 15603 puede quedar atrapada en los pocillos por conjugación con el anticuerpo. Los métodos para detectar estos complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GST, incluyen inmunodetección de complejos usando anticuerpos reactivos con la proteína 15603 o molécula diana, así como ensayos ligados a enzimas que se basan en la detección de una actividad enzimática asociada con la proteína 15603 o molécula diana.
Como alternativa, los ensayos sin células se pueden realizar en una fase líquida. En dicho ensayo, los productos de reacción se separan de los componentes que no han reaccionado, por cualquiera de varias técnicas convencionales, incluyendo pero sin limitación: centrifugación diferencial (véase, por ejemplo, Rivas and Minton (1993) Trends Biochem Sci 18:284-7); cromatografía (cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico); electroforesis (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds. (1999) Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley, New York.); e inmunoprecipitación (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds. (1999) Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley, New York). Estas resinas y técnicas cromatográficas se conocen por un especialista en la técnica (véase, por ejemplo, Heegaard (1998) J Mol Recognit 11:141-8; Hage and Tweed (1997) J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 699:499-525). Además, también puede utilizarse convenientemente transferencia de energía de fluorescencia, como se describe en este documento, para detectar la unión sin purificación adicional del complejo de la
solución.
Preferiblemente, el ensayo incluye poner en contacto la proteína 15603 o una parte biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a 15603 para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo de interaccionar con una proteína 15603, donde la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo de interaccionar con una proteína 15603 incluye la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo de unirse preferentemente a 15603 o a una parte biológicamente activa de la misma o modular la actividad de una molécula diana en comparación con el compuesto conocido.
Los productos de los genes diana descritos en la presente memoria pueden interaccionar, in vivo, con una o más macromoléculas celulares o extracelulares, tales como proteínas. Para los fines de este análisis, estas macromoléculas celulares y extracelulares se denominan en este documento "compañeros de unión". Los compuestos que rompen dichas interacciones pueden ser útiles para regular la actividad del producto génico diana. Estos compuestos pueden incluir, pero sin limitación, moléculas tales como anticuerpos, péptidos y moléculas pequeñas. Los productos/genes diana preferidos son los genes de 15603 identificados en la presente memoria. En la presente memoria también se describen métodos para determinar la capacidad del compuesto de ensayo de modular la actividad de una proteína 15603 por medio de la modulación de la actividad de un efector aguas abajo de una molécula diana. Por ejemplo, puede determinarse la actividad de la molécula efectora en una diana apropiada o puede determinarse la unión del efector a una diana apropiada, como se ha descrito previamente.
Para identificar compuestos que interfieren con la interacción entre el producto génico diana y su compañero de unión celular o extracelular, se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto génico diana y el compañero de unión, en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que los dos productos formen un complejo. Para ensayar un agente inhibidor, la mezcla de reacción se proporciona en presencia y ausencia del compuesto de ensayo. El compuesto de ensayo puede incluirse inicialmente en la mezcla de reacción o puede añadirse en un periodo de tiempo posterior a la adición del gen diana y su compañero de unión celular o extracelular. Las mezclas de reacción de control se incuban sin el compuesto de ensayo o con un placebo. Después se detecta la formación de cualquier complejo entre el producto génico diana y el compañero de unión celular o extracelular. La formación de un complejo en la reacción de control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de ensayo, indica que el compuesto interfiere con la interacción del producto génico diana y el compañero de unión interactivo. Además, la formación de complejos dentro de mezclas de reacción que contienen el compuesto de ensayo y el producto génico diana normal también puede compararse con la formación de complejos dentro de mezclas de reacción que contienen el compuesto de ensayo y el producto génico diana mutante. Esta comparación puede ser importante en los casos en los que deseable identificar compuestos que alteran interacciones de mutantes pero no productos génicos diana
normales.
Estos ensayos pueden realizarse en un formato heterogéneo u homogéneo. Los ensayos heterogéneos implican el anclaje del producto génico diana o el compañero de unión en una fase sólida y la detección de complejos anclados en la fase sólida al final de la reacción. En los ensayos homogéneos, la reacción entera se realiza en una fase líquida. En cualquier estrategia, el orden de adición de los reactivos puede variarse para obtener diferente información sobre los compuestos que se están ensayando. Por ejemplo, pueden identificarse compuestos de ensayo que interfieren con la interacción entre los productos génicos diana y los compañeros de unión, por ejemplo, por competición realizando la reacción en presencia de la sustancia de ensayo. Como alternativa, pueden ensayarse compuestos de ensayo que rompen los complejos preformados, por ejemplo, compuestos con mayores constantes de unión que desplazan uno de los componentes del complejo, añadiendo el compuesto de ensayo a la mezcla de reacción después de que se hayan formado los complejos. Los diversos formatos se describen brevemente más adelante.
En un sistema de ensayo heterogéneo, el producto génico diana o el compañero de unión celular o extracelular interactivo, se ancla en una superficie sólida (por ejemplo, una placa de microtitulación), mientras que la especie no anclada se marca directa o indirectamente. Las especies ancladas pueden inmovilizarse por uniones covalentes o no covalentes. Como alternativa, puede usarse un anticuerpo inmovilizado específico o selectivo para la especie a anclar para anclar la especie a la superficie sólida.
Para realizar el ensayo, el compañero de la especie inmovilizada se expone a la superficie recubierta con o sin el compuesto de ensayo. Después de completarse la reacción, se retiran los componentes que no han reaccionado (por ejemplo por lavado) y cualquier complejo formado permanecerá inmovilizado en la superficie sólida. Cuando la especie no inmovilizada está pre-marcada, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que se formaron complejos. Cuando la especie no inmovilizada no está pre-marcada, puede usarse un marcador indirecto para detectar complejos anclados en la superficie; por ejemplo, usando un anticuerpo marcado específico o selectivo para la especie no inmovilizada inicialmente (el anticuerpo, a su vez, puede marcarse directamente o puede marcarse indirectamente con, por ejemplo, un anticuerpo anti-Ig marcado). Dependiendo del orden de adición de los componentes de reacción, pueden detectarse compuestos de ensayo que inhiben la formación de complejos o que rompen los complejos preformados.
Como alternativa, la reacción puede realizarse en una fase líquida en presencia o ausencia del compuesto de ensayo, los productos de reacción pueden separarse de los componentes que no han reaccionado y los complejos pueden detectarse; por ejemplo, usando un anticuerpo inmovilizado específico o selectivo para uno de los componentes de unión para anclar cualquier complejo formado en solución, y un anticuerpo marcado específico o selectivo para el otro compañero para detectar complejos anclados. De nuevo, dependiendo del orden de adición de los reactivos a la fase líquida, pueden identificarse compuestos de ensayo que inhiben complejos o que rompen complejos
preformados.
Como alternativa, puede usarse un ensayo homogéneo. Por ejemplo, se prepara un complejo preformado del producto génico diana y el producto del compañero de unión celular o extracelular interactivo en el que los productos génicos diana o sus compañeros de unión están marcados, pero la señal generada por el marcador se inactiva debido a la formación de complejos (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.109.496 que utiliza esta estrategia para inmunoensayos). La adición de una sustancia de ensayo que compite y desplaza una de las especies del complejo preformado dará como resultado la generación de una señal por encima del nivel de fondo. De esta manera, pueden identificarse sustancias de ensayo que alteran la interacción de producto génico diana-compañero de
unión.
En otro aspecto, las proteínas 15603 pueden usarse como "proteínas de cebo" en un ensayo doble híbrido o en un ensayo triple híbrido (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046-12054. Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1 693-1696; y Brent documento WO 94/10300), para identificar otras proteínas que se unen o interaccionan con 15603 ("proteínas de unión a 15603" o "15603-bp") y están implicadas en la actividad de 15603. Estas 15603-bp pueden ser activadores o inhibidores de señales por las proteínas 15603 o dianas de 15603 tales como, por ejemplo, elementos aguas abajo de una ruta de señalización mediada por 15603.
El sistema doble híbrido se basa en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que consisten en dominios de unión y activación de ADN separables. En resumen, el ensayo utiliza dos construcciones de ADN diferentes. En una construcción, el gen que codifica una proteína 15603 se fusiona a un gen que codifica el dominio de unión al ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En la otra construcción, una secuencia de ADN de una biblioteca de secuencias de ADN, que codifica una proteína no identificada ("presa" o "muestra") se fusiona a un gen que codifica el dominio de activación del factor de transcripción conocido. (Como alternativa: la proteína 15603 puede fusionarse al dominio activador.) Si las proteínas "cebo" y "presa" pueden interaccionar, in vivo, formando un complejo dependiente de 15603, los dominios de unión al ADN y de activación del factor de transcripción se acercan mucho. Esta proximidad permite la transcripción de un gen indicador (por ejemplo, LacZ) que se une operablemente a un sitio regulador de la transcripción que responde al factor de transcripción. La expresión del gen indicador puede detectarse y pueden aislarse colonias de células que contienen el factor de transcripción funcional y usarse para obtener el gen clonado que codifica la proteína que interacciona con la proteína 15603.
Como alternativa, se identifican moduladores de la expresión de 15603. Por ejemplo, una célula o una mezcla sin células se pone en contacto con un compuesto candidato y se evalúa la expresión del ARNm o la proteína 15603 con respecto a nivel de expresión del ARNm o proteína 15603 en ausencia del compuesto candidato. Cuando la expresión del ARNm o proteína 15603 es mayor en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador de la expresión de la proteína o ARNm de 15603. Como alternativa, cuando la expresión del ARNm o la proteína 15603 es menor (menor de una forma estadísticamente significativa) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, se identifica el compuesto candidato como un inhibidor de la expresión del ARNm o la proteína 15603. El nivel de expresión del ARNm o la proteína 15603 puede determinarse por métodos descritos en la presente memoria para detectar el ARNm o la proteína 15603.
También se describe en la presente memoria una combinación de dos o más de los ensayos descritos en este documento. Por ejemplo, un agente modulador puede identificarse usando un ensayo basado en células o un ensayo sin células, y la capacidad del agente para modular la actividad de una proteína 15603 puede confirmarse in vivo, por ejemplo, en un animal tal como un modelo animal para una función o expresión aberrante o deficiente de un canal iónico.
También se describen en la presente memoria nuevos agentes identificados por los ensayos de exploración descritos anteriormente. Un agente identificado como se describe en la presente memoria (por ejemplo, un agente modulador de 15603, una molécula de ácido nucleico de 15603 antisentido, un anticuerpo específico para 15603 o un compañero de unión de 15603) puede usarse en un modelo animal apropiado para determinar la eficacia, toxicidad, efectos secundarios o mecanismos de acción, de tratamiento con dicho agente. Además, pueden usarse nuevos agentes identificados por los ensayos de exploración descritos anteriormente para los tratamientos como se describe en la presente
memoria.
La invención se ilustra adicionalmente mediante el siguiente ejemplo, que no debe considerarse limitante.
Ejemplo Análisis de Expresión Génica
Se preparó ARN total a partir de diversos tejidos humanos por un método de extracción de una sola etapa usando ARN STAT-60 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (TelTest, Inc). Cada preparación de ARN se trató con DNasa I (Ambion) a 37ºC durante 1 hora. Se determinó que el tratamiento con DNAsa I se había completado si la muestra requería al menos 38 ciclos de amplificación por PCR para alcanzar un nivel umbral de fluorescencia usando \beta-2 microglobulina como referencia de amplicón interna. La integridad de las muestras de ARN después del tratamiento con DNasa I se confirmó por electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. Después de la extracción con fenol, se preparó ADNc a partir de la muestra usando el SUPERSCRIPT^{TM} Choice System siguiendo las instrucciones del fabricante (GibcoBRL). Para cada muestra de ARN se transcribió de forma simulada un control negativo de ARN sin transcriptasa inversa.
La expresión de la proteína 15603 humana se midió por PCR cuantitativa TaqMan® (Perkin Elmer Applied Biosystems) en el ADNc preparado a partir de una diversidad de líneas celulares y tejidos humanos normales y enfermos (por ejemplo, cancerosos).
Se diseñaron sondas por el software PrimerExpress (PE Biosystems) basándose en la secuencia del gen de la proteína 15603 humana. Cada sonda de gen de la proteína 15603 humana se marcó usando FAM (6-carboxifluoresceína), y la sonda de referencia de \beta2-microglobulina se marcó con un colorante fluorescente diferente, VIC. De esta manera, el marcaje diferencial del gen diana y el gen de referencia interna permitió la medición en el mismo pocillo. Se añadieron cebadores directos e inversos y las sondas tanto para la \beta2-microglobulina como para el gen diana a la mezcla maestra de PCR universal TaqMan® (PE Applied Biosystems). Aunque la concentración final de cebador y sonda podía variar, cada una fue internamente constante dentro de un experimento dado. Un experimento típico contenía una concentración 200 nM de cebadores directo e inverso más una concentración 100 nM de sonda para \beta-2 microglobulina y una concentración 600 nM de cebadores directo e inverso más una concentración 200 nM de sonda para el gen diana. Los experimentos de matriz TaqMan se realizaron en un sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7700 (PE Applied Biosystems). Las condiciones del aparato de ciclos térmicos fueron las siguientes: mantenimiento durante 2 min a 50ºC y 10 min a 95ºC, seguido de una PCR de dos etapas durante 40 ciclos de 95ºC durante 15 seg seguido de 60ºC durante 1 min.
El siguiente método se usó para calcular cuantitativamente la expresión del gen de la proteína 15603 humana en los diversos tejidos con respecto a la expresión de \beta-2 microglobulina en el mismo tejido. El valor del ciclo umbral (Ct) se define como el ciclo al que se detecta un aumento estadísticamente significativo en fluorescencia. Un valor menor de Ct es indicativo de una mayor concentración de ARNm. El valor de Ct del gen de la proteína 15603 humana se normaliza restando el valor de Ct del gen de la \beta-2 microglobulina para obtener un valor de _{\Delta}Ct usando la siguiente fórmula: \DeltaCt=Ct_{humano 59914 y 59921} - Ct _{\beta -2 microglobulina}. La expresión después se calibra frente a una muestra de ADNc mostrando un nivel comparativamente bajo de expresión del gen de la proteína 15603 humana. El valor de _{\Delta}Ct para la muestra del calibrador después se resta de _{\Delta}Ct para cada muestra de tejido de acuerdo con la siguiente fórmula: _{\Delta \Delta}Ct=_{\Delta}Ct-_{muestra} - _{\Delta}Ct-_{calibrador}\cdot Después se calcula la expresión relativa usando la fórmula aritmética dada por 2^{- \Delta \Delta Ct}. Posteriormente se representa gráficamente la expresión del gen de la proteína 15603 humana diana en cada uno de los tejidos ensayados como se describe con más detalle más adelante.
Los resultados indican una expresión significativa de 15603 en hemangioma, músculo liso vascular, megacariocitos, tumor de Wilm; a niveles medios en corteza cerebral normal, útero y célula endoteliales proliferativas; y a niveles bajos en tejido adiposo, arteria mamaria interna humana normal, aorta humana enferma, arteria humana enferma, vena humana enferma y vena humana normal, corazón normal, corazón CHF, riñón normal, músculo esquelético, páncreas, osteoblastos primarios, hipotálamo cerebral, mama normal, ovario normal, próstata normal, tumor de próstata, glándulas salivares, colon normal, tumor de colon, pulmón normal, tumor de pulmón, COPD pulmonar, IBD de colon, bazo normal, amígdala normal, intestino delgado normal, úlcera de decúbito en la piel, sinovio, glioblastomas, glándula suprarrenal fetal, hígado fetal y corazón fetal.
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TABLA 1 Fase 1.5.1 Expresión de 15603 con beta 2
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3 
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TABLA 2 15603 Expresión en Vasos Panel 2.1
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6 
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TABLA 3 Expresión de 1506
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8
9 
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TABLA 4 Expresión de 15603 con \beta2 en el Panel de Angiogénesis
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Claims (8)

1. Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico, que comprende:
i) poner en contacto un compuesto candidato con la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1; y
ii) ensayar la capacidad del compuesto de inhibir la expresión de la molécula de ácido nucleico,
identificando de esta manera un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico.
2. Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico, que comprende:
i) poner en contacto un compuesto candidato con un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1 o una célula que expresa el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1; y
ii) ensayar la capacidad del compuesto de inhibir la actividad de canal iónico del polipéptido,
identificando de esta manera un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho ensayo es un ensayo basado en células y dicho compuesto candidato se pone en contacto con una célula que expresa dicho polipéptido.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho ensayo es un ensayo sin células.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho polipéptido se proporciona como un canal iónico en una membrana plasmática.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho ensayo de la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de canal iónico del polipéptido comprende medir el flujo de iones a través de dicho canal iónico.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el flujo de iones de través de dicho canal iónico se mide por pinzamiento zonal.
8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además confirmar la capacidad de un compuesto de ensayo para inhibir la expresión de la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1 o inhibir el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1 en un modelo animal.
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