ES2330519T3 - Inducion de la transicion de permeabilidad mitocondrial. - Google Patents
Inducion de la transicion de permeabilidad mitocondrial. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2330519T3 ES2330519T3 ES03810339T ES03810339T ES2330519T3 ES 2330519 T3 ES2330519 T3 ES 2330519T3 ES 03810339 T ES03810339 T ES 03810339T ES 03810339 T ES03810339 T ES 03810339T ES 2330519 T3 ES2330519 T3 ES 2330519T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- group
- alkyl
- aryl
- hydrogen
- cycloalkyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/28—Compounds containing heavy metals
- A61K31/285—Arsenic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F5/00—Compounds containing elements of Groups 3 or 13 of the Periodic Table
- C07F5/06—Aluminium compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/66—Arsenic compounds
- C07F9/70—Organo-arsenic compounds
- C07F9/74—Aromatic compounds
- C07F9/78—Aromatic compounds containing amino groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/66—Arsenic compounds
- C07F9/70—Organo-arsenic compounds
- C07F9/80—Heterocyclic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/66—Arsenic compounds
- C07F9/70—Organo-arsenic compounds
- C07F9/80—Heterocyclic compounds
- C07F9/82—Arsenic compounds containing one or more pyridine rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
- G01N33/5079—Mitochondria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/475—Assays involving growth factors
- G01N2333/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
Abstract
Un proceso in vitro para identificar un compuesto que induzca selectivamente la transición de permeabilidad mitocondrial (MPT) en células en proliferación, donde dicho proceso comprende poner en contacto una célula o extracto celular con un compuesto, determinar si el compuesto se une al translocador de nucleótidos de adenina (ANT) y determinar si el compuesto induce selectivamente la MPT en células en proliferación.
Description
Inducción de la transición de permeabilidad
mitocondrial.
La presente invención se refiere a la
modificación de la permeabilidad de membrana mitocondrial en células
y, en particular, la identificación y uso de compuestos que induzcan
selectivamente la MPT en células en proliferación.
La mitocondria proporciona ATP para apoyar la
función celular normal y su alteración conduce a muerte celular
apoptótica y necrótica (Crompton, 1999). Un factor importante en la
apoptosis y necrosis es la transición de permeabilidad mitocondrial
(MPT) que se produce como resultado de una sobrecarga de calcio. La
causa de la MPT es la apertura de un poro inespecífico en la
membrana mitocondrial interna, conocido como el poro de transición
de permeabilidad mitocondrial (MPTP) (Crompton et al, 1987).
El estrés oxidativo, el agotamiento de nucleótidos de adenina y el
fosfato inorgánico elevado aumentan enormemente la sensibilidad del
poro a la concentración de calcio. La apertura del MPTP se acompaña
del equilibrado de todos los solutos pequeños (<1,5 kD) a través
de la membrana mitocondrial interna. La alta concentración de
proteína resultante en la matriz ejerce una presión osmótica
coloidal que es responsable de un hinchamiento importante de la
mitocondria y, en última instancia, apoptosis o
necrosis.
necrosis.
El translocador de nucleótidos de adenina (ANT)
es una proteína de 30 kD que atraviesa la membrana mitocondrial
interna y es fundamental para el MPTP (Crompton et al,
1988).
Existe la necesidad de inducir selectivamente la
MPT, particularmente en células en proliferación, como un medio
para inducir la apoptosis. J. Biol. Chem. (1996) 271, págs.
6746-6751 por Constantini et al es un
ejemplo de una publicación que describe un método para identificar
compuestos que inducen la MPT pero que no contiene ninguna
sugerencia de que dicho método debería usarse en células en
proliferación.
La presente invención se refiere a un proceso
para identificar compuestos que se unan a ANT en la mitocondria e
induzcan selectivamente la MPT en células en proliferación respecto
a células que no están en proliferación o de crecimiento en estado
quiescente.
De acuerdo con un primer aspecto de la invención
se proporciona un proceso in vitro para identificar un
compuesto que induzca selectivamente la transición de permeabilidad
mitocondrial (MPT) en células en proliferación, donde el proceso
comprende poner en contacto una célula o extracto celular con un
compuesto, determinar si el compuesto se une al translocador de
nucleótidos de adenina (ANT) y determinar si el compuesto induce
selectivamente la MPT en células en proliferación.
De acuerdo con un segundo aspecto de la
invención se proporciona un proceso in vitro para explorar
una pluralidad de compuestos para identificar un compuesto que
induzca selectivamente la MPT en células en proliferación, donde el
proceso comprende poner en contacto una célula o un extracto celular
con la pluralidad de compuestos, determinar si cualquiera de los
compuestos se une a ANT y si es así, determinar por separado para
cada uno de la pluralidad de compuestos si el compuesto induce
selectivamente la MPT en células en proliferación.
Con referencia al primer y segundo aspectos de
la invención, puede determinarse la selectividad para células en
proliferación, por ejemplo, comparando el efecto de compuestos que
se ha identificado que se unen a ANT sobre la MPT en células en
proliferación con el efecto sobre la MPT en células que no están en
proliferación o de crecimiento en estado quiescente.
También con referencia al primer y segundo
aspecto de la invención, en una realización, la determinación de la
inducción de la MPT puede implicar medir cambios en la liberación de
Citocromo C. En otra realización, la determinación de la inducción
puede implicar medir cambios en la concentración de superóxido
celular.
Con respecto a cualquiera del primero y segundo
aspectos de la invención, en una realización el compuesto puede ser
un compuesto reactivo de ditiol.
En otra realización, el compuesto puede tener un
resto arsenóxido (o equivalente de arsenóxido).
En una realización más, el compuesto arsenóxido
(o equivalente de arsenóxido) puede tener la fórmula (I):
(I)A-[(XBX')_{n}B'-Y]_{p}
\newpage
en la
que
A comprende al menos un grupo colgante
sustancialmente impermeable de membrana celular;
(XBX')_{n}B' comprende un grupo enlazador
adecuado, donde n es un número entero seleccionado entre 0, 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, 3, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20;
Y comprende al menos un arsenóxido O equivalente
de arsenóxido; y
p es un número entero seleccionado entre 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, el compuesto de fórmula (I)
puede tener más de 8 átomos de carbono.
Las siguientes características se refieren a la
Fórmula (I):
En una realización, A puede seleccionarse entre
el grupo que consiste en aminoácidos naturales, no naturales y
sintéticos, aminas hidrófilas, péptidos y polipéptidos, incluyendo
dipéptidos tripéptidos, tetrapéptidos, pentapéptidos, restos de
azúcar tales como monosacáridos, disacáridos y oligosacáridos
(incluyendo variantes sustituidas) y proteínas que contienen tiol,
o una combinación de los mismos. Por ejemplo, A puede seleccionarse
entre el grupo que consiste en glutatión, glucosamina,
cisteinilglicina, ácido cisteico, ácido aspártico, ácido glutámico,
lisina y arginina, donde el átomo de azufre de cada compuesto que
contiene azufre puede estar opcionalmente oxidado para formar un
sulfóxido o sulfona. En otras realizaciones, A puede comprender un
resto de azúcar, un resto disacárido u oligosacárido tal como, por
ejemplo, glucosa, fructosa, manosa, xilosa, lixosa, galactosa,
hexosa, sacarosa, sorbosa, galactosil-sucnosa,
sorbitol, manitol, xilitol, etc. En otras realizaciones, A puede
ser una amina hidrófila tal como una alquil- aril- o
aralquil-amina primaria, secundaria o terciaria, o
una amina heterocíclica tal como piridina, pirrol, imidazol,
etc.
Los aminoácidos son conocidos por los
especialistas en la técnica y se muestran, por ejemplo, en libros de
referencia convencionales, tales como King and Stansfield, A
Dictionary of Genetics, 4ª Edición, Oxford University Press, 1990,
cuyo contenido se incorpora en la presente memoria como referencia.
Por ejemplo, los aminoácidos pueden ser aminoácidos \alpha,
\beta o \gamma. La presente invención también incluye las formas
de aminoácidos L y D. Los ejemplos de aminoácidos incluyen glicina,
alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina,
fenilalanina, triptófano, serina, treonina, cisteína, tirosina,
asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina,
arginina e histidina.
En una realización, A puede seleccionarse entre
el grupo que consiste en ureas tri-ácidas y péptidos que incluyen
dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos y pentapéptidos. Por ejemplo,
glutatión, Cys-Glu-Gly,
Arg-Gly-Asp-Cys,
Val-Thr-Cys-Gly,
Gly-Gly-Cys,
Lys-Glu-Gly,
Arg-Gly-Asp-Lys,
Val-Thr-Lys-Gly,
Gly-Gly-Lys,
Ser-Glu-Gly,
Arg-Gly-Asp-Ser,
Val-Thr-Ser-Gly,
Gly-Gly-Ser,
Asp-Glu-Gly,
Arg-Gly-Asp-Asp,
Val-Tbr-Asp-Gly,
Gly-Gly-Asp,
Glu-Glu-Gly,
Arg-Gly-Asp-Glu,
Val-Thr-Glu-Gly,
Gly-Gly-Glu, etc, ácido preslonoico,
moléculas ácidas pequeñas tales como ácido
3-mercapto-1-propanosulfónico,
ácido mercaptopropiónico, ácido mercaptosuccínico; alcoholes
pequeños tales como
1-tio-beta-D-glucosa,
3-mercapto-1,2-propanodiol;
aminas pequeñas, incluyendo, por ejemplo, alquil-, aril- y
aralquil-aminas sustituidas primarias, secundarias
y terciarias; y compuestos heteroaromáticos tales como ácido
5-mercapto-1-tetrazolacético,
2-mercaptopiridina y
2-aminopiridina.
En una realización, A es un tripéptido. Por
ejemplo, A puede ser una glutatión y en una forma el compuesto puede
representarse por la Fórmula (II):
en la que (XBX')_{n}B' comprende
cualquier grupo enlazador adecuado, e Y comprende un arsenóxido o un
equivalente de
arsenóxido.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, p es un número entero
seleccionado de 1 a 5. Por ejemplo, p puede ser 1, 2, 3, 4 ó 5. En
una realización, p es 1 ó 2. En otra realización, p es 1.
En una realización, n es un número entero de 0 a
15. Por ejemplo, n puede ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14 ó 15, en una realización n es un número entero
seleccionado de 0 a 10. En otra realización n es un número entero
seleccionado de 0 a 5, por ejemplo, n puede ser 0, 1, 2, 3, 4 ó
5.
\newpage
En una realización, X se selecciona entre el
grupo que consiste en -NR, -S(O)-, -S(O)O-,
-S(O)_{2}-, -S(O)_{2}O-,
-C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-, C(S)O-, -C(S)S-, -P(O)(R_{1})- y -P(O)(R_{1})O-, o está ausente;
-C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-, C(S)O-, -C(S)S-, -P(O)(R_{1})- y -P(O)(R_{1})O-, o está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en
alquileno C_{1}-C_{10}, alquenileno
C_{2}-C_{10}, alquinileno
C_{2}-C_{10}, cicloalquileno
C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno
C_{6}-C_{10}, heterocicloalquileno
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenileno
C_{6}-C_{10}, arileno
C_{6}-C_{12}, heteroarileno y acilo
C_{2}-C_{10};
X' se selecciona entre el grupo que consiste en
-NR-, -O-, -S-, -Se-, -S-S-, S(O)-,
-OS(O)-, OS(O)O-, -OS(O)_{2}-
-OS(O)_{2}O, -S(O)O-,
-S(O)_{2}-, -S(O)_{2}O-,
-OP(O)(R_{1})-, -OP(O)(R_{1})O-,
-OP(O)(R_{1})OP(O)(R_{1})O-,
-C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-,
C(S)O-, -C(S)S-, -P(O)(R_{1})-,
P(O)(R_{1})O- y 2 , o está ausente;
donde E es O, S, Se, NR o N(R)_{2}^{+};
n es 0, 1 ó 2; y
B' se selecciona entre el grupo que consiste en
alquileno C_{1}-C_{10}, alquenileno
C_{2}-C_{10}, alquinileno
C_{2}-C_{10}, cicloalquileno
C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquileno
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenileno
C_{5}-C_{10}, arileno
C_{6}-C_{12} y heteroarileno o está ausente; y
donde
cada R se selecciona independientemente entre el
grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo, OR_{2} y acilo
C_{2}-C_{10};
R' es igual que R o dos R' pueden tomarse junto
con los átomos de nitrógeno a los que están unidos para formar un
anillo heterocíclico, saturado o insaturado, de 5 o 6 miembros;
cada R_{1} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo, halo, OR_{2} y
N(R)_{2};
cada R_{2} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo y
-C(O)R_{5};
cada R_{5} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo, alcoxi
C_{1}-C_{10}, alqueniloxi
C_{1}-C_{10}, alquiniloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, heteroariloxi, alquiltio
C_{1}-C_{10}, alqueniltio
C_{3}-C_{10}, alquiniltio
C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, heteroariltio, OH, SH y
N(R)_{2};
donde para cada caso en el que B y/o B' es
arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos arileno
respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de arsenóxido)
pueden estar en cualquier posición disponible, y, por ejemplo,
pueden estar en una relación para-, meta- u orto-; y
donde cada alquileno, alquenileno,
alquinileno, cicloalquileno, cicloalquenileno,
heterocicloalquileno, heterocicloalquenileno, arileno,
heteroarileno y acilo puede estar sustituido independientemente con
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo, ciano, cianato,
isocianato, OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido,
-S(O)R_{3}, -OS(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3}, -OS(O)_{2}R_{3},
-P(O)R_{4}R_{4},
-OP(O)R_{4}R_{4}, -N(R'')_{2},
-NRC(O)(CH_{2})_{m}Q,
-C(O)R_{5};
donde
R, R_{1} y R_{5} son como se han definido
anteriormente; y
R_{2a} se selecciona entre el grupo que
consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5},
alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{3}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3},
-P(O)(R_{4})_{2}, N(R)_{2} y
-C(O)R_{5};
cada R_{3} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo, alcoxi
C_{1}-C_{10}, alqueniloxi
C_{3}-C_{10}, alquiniloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, heteroariloxi, alquiltio
C_{1}-C_{10}, alqueniltio
C_{3}-C_{10}, alquiniltio
C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, heteroariltio y
N(R)_{2};
cada R_{4} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo, alcoxi
C_{1}-C_{10}, alqueniloxi
C_{3}-C_{10}, alquiniloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, heteroariloxi, alquiltio
C_{1}-C_{10}, alqueniltio
C_{3}-C_{10}, alquiniltio
C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{6}-C_{10}, heterocicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio
C_{6}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, heteroariltio, halo y
N(R)_{2};
R_{6} se selecciona entre el grupo que
consiste en alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo, alquiltio
C_{1}-C_{10}, alqueniltio
C_{3}-C_{10}, alquiniltio
C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, heteroariltio,
-S(O)R_{3}, SU(O)_{2}R_{3} y
-C(O)R_{5},
R'' es igual que R o dos R'' tomados junto con
el átomo de N al que están unidos pueden formar un sistema de anillo
heterocíclico saturado, insaturado o aromático;
Q se selecciona entre halógeno y
-OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se selecciona entre
alquilo C_{1}-C_{4}, perfluoroalquilo, fenilo,
p-metilfenilo; y
m es 1, 2, 3, 4 ó 5.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, X se selecciona entre el
grupo que consiste en una atmósfera de NH, -C(o)-,
-C(S)-, -C(O)O-, C(S)O- y
-C(S)S- o está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en
alquileno C_{1}-C_{5}, alquenileno
C_{2}-C_{5}, alquinileno
C_{2}-C_{5}, cicloalquileno
C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno
C_{5}-C_{10}, arileno
C_{6}-C_{12} y acilo
C_{2}-C_{5};
X' se selecciona entre el grupo que consiste en
-O-, -S-, -NR-, -S-S-, -S(O)-,
-S(O)_{2}-, -P(O)(R_{1})-,
-OP(O)(R_{1})-, OP(O)(R_{1})O-,
OP(O)(R_{1})OP(O)(R_{1})O-,
-C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-,
C(S)O-, -C(S)S-, -Se-,
n es 0,1 ó 2; y
B' se selecciona entre el grupo que consiste en
alquileno C_{1}-C_{5}, alquenileno
C_{2}-C_{5}, alquinileno
C_{2}-C_{5}, cicloalquileno
C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno
C_{5}-C_{10} y arileno
C_{6}-C_{12}, o está ausente; y donde
cada R se selecciona independientemente entre el
grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, OR_{2} y acilo
C_{2}-C_{10};
R' es el mismo que R;
cada R_{1} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, halo, OR_{2} y
N(R)_{2};
cada R_{2} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{6}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{6}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12} y -C(O)R_{5};
cada R_{5} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, alqueniloxi
C_{3}-C_{5}, alquiniloxi
C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi
C_{6}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{6}, alqueniltio
C_{3}-C_{5}, alquiniltio
C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12} , OH, SH y
N(R)_{2};
donde para cada caso en el que B y/o B' es
arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos de
arileno respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de
arsenóxido) pueden estar en cualquier posición, y, por ejemplo,
pueden estar en una relación para-, meta- u orto-, y
donde cada alquileno, alquenileno, alquinileno,
cicloalquileno, cicloalquenileno, arileno y acilo puede estar
sustituido independientemente con hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, ciano, halo, cianato, isocianato,
OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido, -S(O)R_{3},
-OS(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3},
-OS(O)_{2}R_{3},
-P(O)R_{4}R_{4},
-OP(O)R_{4}R_{4}, -N(R'')_{2},
NRC(O(CH_{2})_{m}Q,
-C(O)R_{6},
donde
R, R_{1} y R_{5} son como se han definido
anteriormente; y
R_{2a} se selecciona entre el grupo que
consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5},
alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3},
-P(O)(R_{4})_{2}, N(R)_{2} y
-C(O)R_{5};
cada R_{3} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, alqueniloxi
C_{3}-C_{5}, alquiniloxi
C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, alqueniltio
C_{3}-C_{5}, alquiniltio
C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12} y N(R)_{2};
cada R_{4} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, alqueniloxi
C_{3}-C_{5}, alquiniloxi
C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{5}, cicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, alqueniltio
C_{3}-C_{5}, alquiniltio
C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{5}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, halo y
N(R)_{2};
R_{6} se selecciona independientemente entre
el grupo que consiste en alquilo C_{1}-C_{5},
alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, alqueniltio
C_{3}-C_{5}, alquiniltio
C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3} y -C(O)R_{5},
R'' es el mismo que R;
Q se selecciona entre el grupo que consiste en
halógeno y -OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se
selecciona entre alquilo C_{1}-C_{4},
perfluoroalquilo C_{1}-C_{4}, fenilo,
p-metilfenilo; y
m es 1, 2, 3, 4 ó 5.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización, X está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en
alquileno C_{1}-C_{5}, arileno
C_{6}-C_{12} y acilo
C_{2}-C_{5};
X' se selecciona entre el grupo que consiste en
-O-, -S-, -NR-, -S-S-, -S(O)-,
-S(O)_{2}-, -P(O)(R_{1})-, -C(O)-,
-C(S)-, -C(O)O-, C(S)-, -Se- y
n es 0, 1 ó 2; y
B' es alquileno C_{1}-C_{5},
arileno C_{6}-C_{12} o está ausente; y donde
cada R se selecciona independientemente entre el
grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, OR_{2} y acilo
C_{2}-C_{5};
R' es el mismo que R;
cada R_{1} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, halo, OR_{2} y
N(R)_{2};
\newpage
cada R_{2} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12} y -C(O)R_{5};
cada R_{5} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, alqueniloxi
C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, alqueniltio
C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio
C_{1}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, OH, SH y
N(R)_{2};
donde para cada caso en el que B y/o B' es
arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos de
arileno respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de
arsenóxido) pueden estar en cualquier posición del anillo o anillos
respectivos y, por ejemplo, pueden estar en una relación para-,
meta- u orto-, y
donde cada alquileno, alquenileno, alquinileno,
cicloalquileno, cicloalquenileno, arileno y acilo puede estar
sustituido independientemente con hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, halo, ciano, cianato, isocianato,
OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido, -S(O)R_{3},
-OS(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3},
-OS(O)_{2}R_{3},
-P(O)R_{4}R_{4},
-OP(O)R_{4}R_{4}, -N(R'')_{2},
-NRC(O)(CH_{2})_{m}Q,
-C(O)R_{5},
donde
R, R_{1} y R_{5} son como se han definido
anteriormente; y
R_{2a} se selecciona entre el grupo que
consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5},
cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3}, -P(O)(R_{4})_{2}
y -C(O)R_{5};
cada R_{3} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12} y N(R)_{2};
cada R_{4} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, halo y
N(R)_{2};
R_{6} se selecciona entre el grupo que
consiste en alquilo C_{1}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{6}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3} y -C(O)R_{5},
R'' es el mismo que R;
Q se selecciona entre halógeno y
-OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se selecciona entre
alquilo C_{1}-C_{4}, perfluoroalquilo
C_{1}-C_{4}, fenilo, p-metilfenilo; y
m es 1, 2, 3, 4 ó 5.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización más, X está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en
alquileno C_{1}-C_{5}, arileno
C_{6}-C_{12} y acilo
C_{2}-C_{5};
X' se selecciona entre el grupo que consiste en
-O-, -S-, -NR-, -C(O)- y -C(O)O-, o está
ausente;
n es 1; y
B' es alquileno C_{1}-C_{5},
arileno C_{6}-C_{12} o está ausente; y
R se selecciona entre el grupo que consiste en
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12} y acilo
C_{2}-C_{5};
donde para cada caso en el que B y/o B' es
arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos de
arileno respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de
arsenóxido) pueden estar en cualquier posición disponible del anillo
o anillos respectivos y, por ejemplo, puede estar en una relación
para-, meta- u orto-, y
\newpage
donde cada alquileno, arileno y acilo puede
estar sustituido independientemente con hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{6}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, halo, ciano, cianato, isocianato,
OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3}, -P(O)R_{4}R_{4},
-N(R'')_{2}, -NRC(O)(CH_{2})_{m}Q,
-C(O)R_{5},
donde
cada R se selecciona independientemente entre el
grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12} y acilo
C_{2}-C_{5};
R_{2a} se selecciona entre el grupo que
consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5},
arilo C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3}, -P(O)(R_{4})_{2}
y -C(O)R_{5};
cada R_{3} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5} y ariltio
C_{6}-C_{12};
cada R_{4} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, ariltio
C_{6}-C_{12}, halo y
N(R)_{2};
cada R_{5} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, ariltio
C_{6}-C_{12}, OH, SH y
N(R)_{2};
R_{6} se selecciona entre el grupo que
consiste en alquilo C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{6}, ariltio
C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3} y -C(O)R_{5},
R'' es el mismo que el R anterior;
Q se selecciona entre halógeno y
-OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se selecciona entre
alquilo C_{1}-C_{4}, perfluoroalquilo
C_{1}-C_{4}, fenilo, p-metilfenilo; y
m es 1, 2, 3, 4 ó 5.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización más, X está ausente
B es acilo C_{2}-C_{5};
X' es NR;
n es 1;
B' es fenileno; y
R es H;
donde los sustituyentes unidos directamente al
anillo de fenileno pueden estar en cualquier posición disponible,
como se ilustra, por ejemplo, por la Fórmula (III);
en la que R_{7} a R_{10} se
seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12}, halógeno, hidroxi, amino, nitro,
carboxi, alcoxi C_{1}-C_{5},
-OS(O)_{2}R_{3} y -NHC(O)CH_{2}Q
donde Q es halógeno, -OS(O)_{2}CH_{3},
-OS(O)_{2}C_{6}H_{5} y
-OS(O)_{2}-p-tolilo; y donde, cuando uno
cualquiera de R_{7} a R_{10} es alquilo
C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, -OS(O)_{2}R_{3},
es capaz de formar un anillo condensado con el fenileno; y donde,
además, al menos uno de R_{7} a R_{10} es alquilo
C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5} o -OS(O)_{2}R_{3},
junto con al menos otro cualquiera de R_{7} a R_{10}, es capaz
de formar un anillo condensado con el
fenileno.
\vskip1.000000\baselineskip
Más típicamente, de R_{7} a R_{10} se
seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en
hidrógeno, halógeno, hidroxi, amino, nitro, ciano, carboxi, alcoxi
C_{1}-C_{5}, metilo, etilo, isopropilo,
terc-butilo, fenilo y -NHC(O)CH_{2}Q
donde Q es halógeno, -OS(O)_{2}CH_{3},
-OS(O)_{2}C_{5}H_{6} y
-OS(O)_{2}-p-tolilo.
Por ejemplo, cuando el grupo colgante A es
glutatión, el compuesto de fórmula (III) puede representarse
como
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Además, cuando B' es arileno, los sustituyentes
unidos al anillo de arileno pueden estar en cualquier posición
disponible del anillo de arileno. Por ejemplo, los sustituyentes
pueden estar en una relación meta- o para- con respecto al grupo
-As=O.
En otra realización, un compuesto de arsenóxido
identificado de acuerdo con la presente invención se selecciona
entre los siguientes compuestos:
\vskip1.000000\baselineskip
El compuesto "GSAO"
(4-(N-(S-glutationilacetil)amino)-fenilarsenóxido)
se ha descrito previamente en la solicitud de patente internacional
WO 01/21628.
Otros compuestos que pueden interactuar con ANT
incluyen compuestos de acuerdo con la fórmula (V) que se ilustra a
continuación:
en la que Q es cualquier
halógeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra forma de un compuesto de arsenóxido que
puede interactuar con ANT es un compuesto de acuerdo con la Fórmula
(VI):
en al que G se selecciona entre el
grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, hidroxi, amino, nitro,
ciano, carboxi, alcoxi C_{1}-C_{5}, alquilo
C_{1}-C_{5} y arilo
C_{6}-C_{12} y -NHC(O)CH_{2}Q,
donde Q es halógeno, -OS(O)_{2}CH_{3},
-OS(O)_{2}C_{6}H_{3} o
-OS(O)_{2}-p-tolilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Típicamente, G se selecciona entre el grupo que
consiste en hidrógeno, halógeno, hidroxi, amino, nitro, carboxi,
alcoxi C_{1}-C_{5}, metilo, etilo, isopropilo,
terc-butilo, fenilo y
-NHC(O)CH_{2}Q, donde Q es el grupo que consiste en
halógeno, -OS(O)_{2}CH_{3},
-OS(O)_{2}C_{6}H_{5} y
-OS(O)_{2}-p-tolilo.
En una realización, en un compuesto de Fórmula
VI, G es hidroxi, flúor, amino o nitro.
\newpage
En otra realización, el grupo G está en una
relación orto-, meta- o para- con el grupo arsenóxido. Por ejemplo,
en otra realización, G está en una relación orto- o para- con el
grupo arsenóxido.
Típicamente, la actividad del átomo de arsénico
puede modificarse por el grupo G, cuando G y el átomo de arsénico
están en una relación orto o para entre sí. Por ejemplo, cuando G es
un grupo donador de electrones tal como OH (ionizado en O^{-} a
pH fisiológico), el átomo de arsénico puede desactivarse hacia
ditioles y puede hacerse más selectivo, por ejemplo, únicamente
reaccionando con ditioles muy reactivos. Como alternativa, cuando G
es un grupo de extracción de electrones, tal como NO_{2}, la
densidad de electrones puede apartarse del átomo de arsénico,
haciendo que sea más reactivo a los ditioles. La inhibición
selectiva de algunas proteínas redox y no de otras puede conseguirse
por manipulación de G.
Típicamente, en los compuestos de arsenóxido
capaces de interactuar con ANT, el grupo arsenóxido (-As=O) puede
reemplazarse por un equivalente de arsenóxido
Un equivalente de arsenóxido se define en la
presente memoria como cualquier especie reactiva a ditiol que
muestra esencialmente la misma afinidad para ditioles que para
-As=O. Típicamente, el equivalente de arsenóxido incluye entidades
reactivas a ditiol, tales como especies As, Ge, Sn y Sb. Más
típicamente, un equivalente de arsenóxido puede representarse por
-D(Z_{1})(Z_{2}). Se espera que los equivalentes de
arsenóxido muestren una actividad idéntica o sustancialmente
idéntica a la del arsenóxido correspondiente.
Típicamente, para equivalentes de arsenóxido de
la forma -D(Z_{1})(Z_{2}), D será, por ejemplo, As, RSn,
Sb o RGe, y Z_{1} y Z_{2} serán grupos lábiles (es decir, grupos
desplazados fácilmente en condiciones fisiológicas). Z_{1} y
Z_{2} pueden ser iguales o diferentes, y pueden estar conectados o
ser independientes entre sí (unidos sólo al átomo de arsénico).
Los equivalentes de arsenóxido adecuados
incluyen los siguientes:
-D(Z_{1})(Z_{2}),
donde Z_{1} y Z_{2} se
seleccionan entre el grupo que consiste en OH, alcoxi
C_{1}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{10}, alquilseleno
C_{1}-C_{10}, arilseleno
C_{6}-C_{10}, F, Cl, Br e
I;
donde E_{1} = E_{2} = O,
E_{1} = O y E_{2} = S o E_{1} = E_{2} = S; M es R''' y R''''
se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, halógeno, alcoxi
C_{1}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{10}, hidroxi y carboxi; y n = 1 a
10.
\vskip1.000000\baselineskip
Para equivalentes de arsenóxido de la forma
D(Z_{1})(Z_{2}), cuando D es As y Z_{1} y Z_{2} son
OH, el equivalente de arsenóxido puede estar en equilibrio con
especies poliméricas, como se representa a continuación.
Con respecto al equilibrio representado
anteriormente, el arsénico es uno de muchos elementos cuyas especies
hidroxi existen en equilibrio con los anhídridos poliméricos
correspondientes (Doak & Freedman, 1970). Por lo tanto, los
compuestos de arsenóxido pueden existir en realidad como polímeros
de bajo o medio peso molecular (por ejemplo, n = 3 a 6). Sin
embargo, la reacción de deshidratación es reversible, y por lo tanto
se espera que los anhídridos poliméricos solubles se comporten como
equivalentes de arsenóxido, es decir, se espera que se unan a
ditioles muy espaciados sustancialmente de la misma manera que las
especies monoméricas -AS(OH)_{2}.
donde X_{3} = NH, Y_{1} = O;
X_{3} = Y_{1} = O o X_{3} = S, Y_{1} = O, y R' se selecciona
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12} y carboxi, o es una de las cadenas
laterales de veinte
aminoácidos:
donde X_{3} = Y_{1} = O;
X_{3} = NH, Y_{1} = O; X_{3} = S, Y_{1} = O; X_{3} =
Y_{1} = NH; o X_{3} = S, Y_{1} = NH; o X_{3} = S, Y_{1} =
NH y R_{11} a R_{14} se seleccionan entre el grupo que consiste
en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12} y
CO_{2}H;
donde X3 = Y_{1} = O o X_{3} =
NH, Y_{1} = O; y R_{11} a R_{14} se seleccionan entre el grupo
que consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{10},
arilo C_{6}-C_{12}, halógeno, alcoxi
C_{1}-C_{10} y CO_{2}H. Típicamente, (XBX')B'
es como se ha definido
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
En el contexto de esta memoria descriptiva, la
abreviatura MPT representa la Transición de Permeabilidad
Mitocondrial.
En el contexto de esta memoria descriptiva, la
abreviatura MPTP representa el Poro de Transición de Permeabilidad
Mitocondrial.
En el contexto de esta memoria descriptiva, la
abreviatura ANT representa el translocador de nucleótidos de
adenina.
En el contexto de esta memoria descriptiva, el
EGTA es ácido etilenglicol-bis
(beta-aminoetil
éter)-N,N,N',N'-tetraacético.
En el contexto de esta memoria descriptiva, PAO
representa arsenóxido de fenilo.
En el contexto de esta memoria descriptiva, el
término "arsenóxido" se refiere al grupo -As=O.
En el contexto de esta memoria descriptiva, los
grupos escritos como -As=O y -As(OH)_{2} deben
considerarse sinónimos.
En el contexto de esta memoria descriptiva, la
expresión "equivalente de arsenóxido" se refiere a cualquier
especie reactiva de ditiol que muestra esencialmente la misma
afinidad hacia ditioles que -As=O o As(OH)_{2}, y
la expresión incluye, por ejemplo, grupos que comprenden un elemento
de transición y cualquier arsenical trivalente que se hidrolice a
-As=O o -As(OH)_{2} cuando se disuelva en un medio
acuoso (tal como tampones de cultivo de células y los líquidos
contenidos en el organismo que se esté tratando).
En el contexto de esta memoria descriptiva, la
expresión "grupo sustancialmente impermeable de membrana
celular" se refiere a cualquier grupo que limite la velocidad a
la que pasa un compuesto a través de una membrana celular y hacia
el interior de la célula. Un grupo sustancialmente impermeable de
membrana celular puede limitar la velocidad de entrada de un
compuesto en una célula en virtud de una o más propiedades tales
como, por ejemplo, carga, tamaño (peso molecular), polaridad,
lipofilia, hidrofilia, etc.
El término "arsenical", como se usa en la
presente memoria, incluye cualquier compuesto que contenga
arsénico.
El término "acilo", como se usa en la
presente memoria, incluye restos alquilo, alquenilo, alquinilo,
cicloalquilo y cicloalquenilo monovalentes y divalentes que poseen
un sustituyente carbonilo terminal donde puede producirse la unión
en el resto hidrocarburo, el resto carbonilo o ambos.
El término "alquilo", como se usa en la
presente memoria incluye en su significado radicales hidrocarburo
monovalentes, saturados, de cadena lineal y ramificada.
El término "alquenilo", como se usa en la
presente memoria incluye en su significado radicales hidrocarburo
monovalentes, de cadena lineal y ramificada, que tienen al menos un
doble enlace.
El término "alquinilo", como se usa en la
presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo
monovalentes, de cadena lineal y ramificada, que tienen al menos un
triple enlace.
El término "alquileno", como se usa en la
presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo
divalentes, saturados, de cadena lineal.
El término "alquenileno", como se usa en la
presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo
divalentes, de cadena lineal, que tienen al menos un doble
enlace.
El término "alquinileno", como se usa en la
presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo
divalentes, de cadena lineal, que tienen al menos un triple
enlace.
El término "arilo" como se usa en la
presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo
aromáticos monovalentes, sencillos, polinucleares, conjugados y
condensados.
El término "arileno", como se usa en la
presente memoria, incluye en su significado radicales hidrocarburo
aromáticos divalentes, sencillos, polinucleares, conjugados y
condensados.
La expresión "ditioles estrechamente
separados", como se usa en la presente memoria, incluye en su
significado tioles que están químicamente próximos así como tioles
que se ponen en yuxtaposición espacial en virtud de su conformación
molecular.
El término "cicloalquilo", como se usa en
la presente memoria, incluye en su significado radicales
hidrocarburo monovalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos,
policiclícos o policíclicos condensados.
El término "cicloalquileno", como se usa en
la presente memoria, incluye en su significado radicales
hidrocarburo divalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos,
policíclicos o policíclicos condensados.
El término "cicloalquenilo", como se usa en
la presente memoria, incluye en su significado radicales
hidrocarburo monovalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos,
policíclicos o policíclicos condensados que tienen al menos un doble
enlace.
El término "cicloalquenileno", como se usa
en la presente memoria, incluye en su significado radicales
hidrocarburo divalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos,
policíclicos o policíclicos condensados que tienen al menos un doble
enlace.
El término "halo", como se usa en la
presente memoria, incluye flúor, cloro, bromo y yodo.
El término "heteroarilo", como se usa en la
presente memoria, incluye en su significado radicales aromáticos
monovalentes, sencillos, polinucleares, conjugados y condensados,
que tienen de 1 a 12 átomos, donde de 1 a 6 átomos son heteroátomos
seleccionados de O, N y S.
El término "heteroarileno", como se usa en
la presente memoria, incluye en su significado radicales aromáticos
conjugados y condensados divalentes, sencillos, polinucleares que
tienen de 1 a 12 átomos, donde de 1 a 6 átomos son heteroátomos
seleccionados de O, N y S.
El término "heterocicloalquilo", como se
usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales
monovalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o
condensados donde de 1 a 5 átomos son heteroátomos seleccionados de
O, N o S.
El término "heterocicloalquileno", como se
usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales
divalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o
policíclicos condensados donde de 1 a 5 átomos son heteroátomos
seleccionados de O, N o S.
El término "heterocicloalquenilo", como se
usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales
monovalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o
policíclicos condensados que tienen al menos 1 doble enlace y en el
que de 1 a 5 átomos son heteroátomos seleccionados de O, N o S.
El término "heterocicloalquenileno", como
se usa en la presente memoria, incluye en su significado radicales
divalentes, saturados, monocíclicos, bicíclicos, policíclicos o
policíclicos condensados que tienen al menos un doble enlace y en el
que de 1 a 5 átomos son heteroátomos seleccionados de O, N o S.
La expresión "ácido fenilarsénico", como se
usa en la presente memoria, debe considerarse sinónimo al "ácido
bencenarsénico".
Figura 1. El GSAO desencadenaba la apertura
del MTP por reacción con y alteración del ANT. A Estructura de
GSAO, GSAA y GSCA. B GSAO desencadenó el hinchamiento de la
mitocondria. El hinchamiento se midió por control de la disminución
asociada de la dispersión de luz a 520 nm a lo largo de 60 min. Las
señales son representativas de un mínimo de tres experimentos en al
menos dos preparaciones mitocondriales diferentes. En la parte i, se
incubaron mitocondrias con nada (\medbullet), GSAO 25
(\medcirc), 50 (\ding{115}), 100 (\Delta) o 200
(\blacksquare) \muM. El control positivo para la apertura de
poros era Ca^{2+} 150 \muM y Pi 6 mM (\boxempty). En la parte
ii, se incubaron mitocondrias con nada (\medbullet), GSCA 100
\muM (\Delta), GSAA 100 \muM (\ding{115}) o GSAO 100 \muM
(\blacksquare). El control positivo para la apertura de poros era
PAO 25 \muM (\medcirc). En la parte iii, se incubaron
mitocondrias con GSAO 100 \muM en ausencia (\blacksquare) o
presencia de Mg^{2+} 3 mM (\ding{116}), EGTA 100 \muM
(\Delta), BKA 10 \muM (\ding{115}), CsA 5 \muM (\nabla) o
ADP 8 mM (\medcirc). Se muestra sin tratamiento (\medbullet)
para una comparación. C El aumento de la concentración de Ca^{2+}
sensibiliza el MPTP a GSAO. Se incubaron mitocondrias con GSAO 50
(\medbullet), 75 (\medcirc), 100 (\blacksquare) o 200 \muM
(\boxempty) en ausencia o presencia de una concentración creciente
de Ca^{2+} y se midió el tiempo para un hinchamiento semimáximo. D
Marcaje de ANT con GSAO-B. Se marcaron mitocondrias
de rata aisladas con GSAO-B en ausencia (carril 1) o
presencia (carril 2) de un exceso molar de 4 veces de
2,3-dimercaptopropanol (DMP) y las proteínas
marcadas con biotina se recogieron en perlas de
estreptavidina-agarosa, se resolvieron en un
SDS-PAGE y se sometieron a una transferencia de
Western para ANT. E El GSAO competía por la alquilación de
Cys^{160} en ANT por eosina-maleimida. Se marcaron
partículas submitocondriales de rata con
eosina-5-maleimida en ausencia
(carril 1) o presencia (carril 2) de GSAO y el ANT marcado con
eosina se resolvió en un SDS-PAGE y se detectó por
transiluminación.
Figura 2. El GSAO se concentraba en
mitocondrias en células viables. Microscopía confocal de células
BAE incubadas con GSAO-F (i) y Mitotracker Red (II),
que muestra la colocalización de los compuestos en las mitocondrias
de una célula individual. El GSAO-F no teñía células
cuando se incubaban con DMP (iii y iv). El arsenical pentavalente,
GSAA-F, tampoco teñía las células (v y vi).
Figura 3. El GSAO desencadenaba la
despolarización mitocondrial y la apoptosis en células endoteliales
en proliferación pero no de crecimiento en estado quiescente. A
El GSAO reducía la viabilidad de células endoteliales en
proliferación, pero no de crecimiento en estado quiescente. Por el
contrario, el PAO era igualmente tóxico para ambos tipos de células.
Las células BAE se detuvieron durante 24 h en medio que contenía
suero a 0,25%, después se cultivaron durante 48 h adicionales en
medio que contenía suero a 0,25% o a 10% con GSAO (i) o PAO (ii). Se
midió el número de células unidas después de un tratamiento de 48 h.
Los resultados son la media \pm ET de tres experimentos. B El GSAO
desencadenaba la despolarización mitocondrial e inducía la apoptosis
en células BAE. Las células se cultivaron durante 48 h en medio que
contenía suero a 10% y GSAO y después se marcaron con
JC-1 o anexina V. El porcentaje de células positivas
para despolarización de membrana mitocondrial (fluorescencia
verde/roja de JC-1) y se midió la inducción de
apoptosis (unión a anexina V). Se observó el mismo resultado en dos
experimentos diferentes.
Figura 4. El GSAO inhibía la producción de
ATP y aumentaba los niveles de superóxido en células endoteliales en
proliferación pero no de crecimiento en estado quiescente. A Se
cultivaron células BAE durante 24 h en medio que contenía suero a
0,5% o a 10% y después 24 h adicionales en presencia de GSAO. En la
parte I, se midieron los niveles de ATP celular usando un ensayo de
luciferina/luciferasa. Los resultados son la media \pm ETM de
cuatro experimentos. En la parte II, se midió la masa mitocondrial a
partir de la captación de naranja de nonil acridina (NAO). Los
resultados son la media \pm intervalo de dos experimentos. B.
Nivel de superóxido medido con dihidroetidina en células BAE que se
habían cultivado durante 24 h en medio que contenía suero a 0,5% o
10% y después durante 24 h adicionales en presencia de GSAO. Los
resultados son la media \pm el intervalo de dos experimentos. C
Medición simultánea de O_{2} (eje y) en células BAE cultivadas en
medio que contiene suero a 10% y GSAO durante 24 h. El porcentaje de
células en cada cuadrante se muestra en la esquina más externa.
Figura 5. El GSAO inducía la liberación del
citocromo c desde la mitocondria. Se incubaron mitocondrias de
hígado de rata durante 0-60 min con GSAO 100 \muM
y se midió el citocromo c liberado hacia el medio por transferencia
de Western. Se muestra la transferencia de Western y la
cuantificación correspondiente. B se incubaron mitocondrias de
hígado de rata durante 30 min con nada, GSAO 100 \muM, GSAO 100
\muM y ciclosporina (CsA) 5 \muM, o Ca^{2+} 150 \muM y Pi 6
mM como control positivo. Se midió el citocromo c liberado hacia el
medio por transferencia de Western.
Figura 6. Comparación de la inducción de MPTP
por análogos de GSAO y GSAO.
Figura 7. Correlación de la inducción de MPTP y
peso molecular para GSAO y análogos relacionados.
Figura 8. Correlación de la inducción de MPTP y
Log P para GSAO y análogos relacionados.
Figura 9. Comparación de la actividad
antiproliferativa en células BAE e inducción de MPTP.
Figura 10. Inducción de la transición de
permeabilidad mitocondrial por GSAO o o-GSAO. Se
midió el hinchamiento por disminución de la dispersión de luz a 520
nm. Se incubaron mitocondrias aisladas con diferentes
concentraciones de GSAO (parte A) o o-GSAO (parte
B). El semi-tiempo para el hinchamiento en función
de la concentración de GSAO o o-GSAO en dos
experimentos diferentes se muestra en la parte C. El
semi-tiempo para el hinchamiento en función de la
concentración de GSAO o PAO se muestra en la parte D. El control
positivo en las partes A y B era Ca^{2+} 150 \muM y Pi 6 mM
(\blacksquare).
Figura 11. Dependencia de calcio del efecto de
GSAO o o-GSAO sobre la transición de permeabilidad
mitocondrial. Se incubaron mitocondrias con diferentes
concentraciones de GSAO (parte A) o o-GSAO (parte B)
a concentraciones crecientes de Ca^{2+} y se midió el tiempo para
un hinchamiento semimáximo.
Figura 12. Los ligandos de ANT bloquean la
inducción de la transición de permeabilidad mitocondrial por
o-GSAO. Se incubaron mitocondrias con
o-GSAO 200 \muM en ausencia o presencia de EGTA,
Mg^{2+}, CSA o ADP. El control positivo era Ca^{2+} 150 \muM y
Pi 6 mM (\blacksquare).
La presente invención se refiere a procesos
in vitro para identificar compuestos que se unen a ANT en
mitocondrias e inducen selectivamente la MPT en células en
proliferación respecto a células que no están en proliferación.
El ANT es una proteína de 30 kD que atraviesa la
membrana mitocondrial interna y es fundamental para el MPTP
(Crompton et al., 1988). Existen tres cisteínas no
emparejadas en el lado de la matriz de
ANT-Cys^{57}, Cys^{160} y Cys^{257}.
(Halestrap et al., 1997). La actividad de ANT está controlada
por la unión de Ca^{2+}, ciclofilina D y nucleótidos adenina. La
ciclofilina D (Crompton et al., 1988) y los nucleótidos de
adenina (Haworth y Hunter, 1979a, b; Haworth y Hunter, 2000) se
unen al lado de la matriz de ANT mientras que aún no se ha
determinado el sitio o sitios para la interacción del Ca^{2+}.
Existen varios reguladores conocidos del MPTP que parecen actuar
modulando la unión de estos tres compuestos. El desencadenamiento
primario para la apertura del MPTP es un aumento en la
concentración de Ca^{2+}. La quelación de Ca^{2+} con EGTA
bloquea la apertura de poros. La especificidad del sitio de
desencadenamiento (presumiblemente en ANT) para Ca^{2+} parece
ser absoluta, ya que otros iones de metales divalentes tales como
Mg^{2+} actúan como inhibidores (Haworth y Hunter, 1979a). La
unión de ciclofilina D a ANT es necesaria para la apertura de poros
a concentraciones de Ca^{2+} submilimolares (Halestrap et
al., 2002). La ciclosporina A (CsA) bloquea la apertura de poros
por unión a ciclofilina D y desplazamiento de la misma del ANT
(Crompton et al., 1988). El ADP de la matriz también es un
modulador importante de la apertura de poros que se une a ANT y
disminuye la sensibilidad del sitio de desencadenamiento a
Ca^{2+} (Haworth y Hunter, 1979a, b). El ácido bonkrékico (BKA)
también interacciona con ANT y disminuye la sensibilidad a Ca^{2+}
(Hunter y Haworth, 1979).
Generalmente, el proceso para identificar un
compuesto que induzca la MPT en células en proliferación de acuerdo
con la invención comprende poner en contacto una célula o extracto
celular con un compuesto candidato, determinar si el compuesto se
une a ANT y después determinar si el compuesto induce selectivamente
la MPT en células en proliferación. La evaluación de si un
compuesto induce selectivamente la MPT en las células en
proliferación puede determinarse por comparación del efecto de un
compuesto que se ha identificado que se une a ANT sobre la MPT en
células en proliferación con el efecto del compuesto sobre la MPT en
células que no están en proliferación o de crecimiento en estado
quiescente.
Puede realizarse el control de la inducción de
MPT usando técnicas convencionales conocidas por los especialistas
en la técnica. Por ejemplo, controlando espectrofotométricamente el
cambio en la dispersión de la luz a una longitud de onda dada para
diferentes concentraciones de compuesto. Una longitud de onda
adecuada es típicamente de
520 nm.
520 nm.
La detección de la captación de un compuesto
hacia la mitocondria de una célula puede realizarse usando técnicas
convencionales. Por ejemplo, pueden usarse compuestos marcados
fluorescentes o puede unirse un fluoróforo a un compuesto. Los
ejemplos de fluoróforos adecuados incluyen fluoresceína y
Cy^{TM}5.5. La localización subcelular de compuestos puede
detectarse por técnicas convencionales, incluyendo microscopía de
fluorescencia confocal. Como alternativa, los compuestos pueden
unirse a otros grupos detectables, por ejemplo, biotina, y
detectarse por tinción con estreptavidina, tal como
Estreptavidina-Alexa Fluor 488.
Puede evaluarse el potencial transmembrana
mitocondrial usando técnicas convencionales, incluyendo, por
ejemplo, colorantes tales como JC-1 y tinciones,
tales como anexina V-FITC. Mediante dichas técnicas
es posible determinar si las células han experimentado la MPT y
evaluar si se ha inducido la apoptosis.
Se generan especies de oxígeno reactivo tales
como anión superóxido (O_{2}) y peróxido de hidrógeno
(H_{2}O_{2}) como subproducto de la producción de ATP y
desempeñan un papel importante como intermedios de señalización en
la proliferación celular, pero a elevadas concentraciones detienen
la proliferación e inducen la apoptosis dañando los lípidos,
proteínas, ADN y ARN (Zanetti et al. 2001). El O_{2} se
convierte en la mitocondria en H_{2}O_{2} mediante la Mn
superóxido dismutasa (SOD) pero también puede liberarse de la
mitocondria a través de canales aniónicos, donde se dismuta en
H_{2}O_{2} mediante la Cu/Zn SOD citosólica (Vanden Hoek et
al., 1998).
La invención se ilustrará ahora con referencia a
los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó BRAA por una modificación del método
descrito en Donoghue et al (2000) y en el documento WO
01/21628. Se añadió en porciones ácido p-arsanílico (20,6 g,
95 mmol) a una solución de carbonato sódico (20 g, 189 mmol) en
agua (200 ml). Cuando se disolvieron todos los sólidos, se descubrió
que el pH de la solución era 10, y se enfrió a 4ºC durante 2 horas.
Se añadió en dos porciones bromuro de bromoacetilo (15 ml, 173
mmol) en diclorometano seco (35 ml), cada porción seguida de
agitación vigorosa durante 2 a 3 min. La mezcla se dejó en reposo
durante unos minutos, y la capa orgánica inferior se retiró por
drenaje. Se precipitó ácido
4-(N-(bromoacetil)amino)bencenoarsónico (BRAA)
por acidificación de la solución a aproximadamente pH
2-3 con la adición gota a gota de ácido sulfúrico
al 98%, se recogió por filtración al vacío y se secó, dando BRAA en
forma de un sólido de color blanco.
Se mezclaron juntos BRAA (3,38 g, 10 mmol),
glutatión reducido (3,23 g, 10,5 mmol) y bicarbonato sódico (3,15
g, 37,5 mmol) y la mezcla sólida se disolvió en porciones en tampón
bicarbonato 0,5 M (100 ml). Se descubrió que la solución
transparente tenía un valor de pH de 9, se mezcló minuciosamente y
se dejó durante una noche a temperatura ambiente. Al día siguiente,
la solución se acidificó hasta alcanzar pH neutral con la adición
gota a gota de ácido clorhídrico al 32% y el producto se precipitó
en etanol absoluto (1 l) mediante la adición gota a gota de la
solución acidificada al alcohol bien agitado. La mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante 1 hora y después se dejó durante 3
horas hasta que el precipitado se sedimentó. La solución etanólica
transparente se decantó hasta que quedaron \sim300 ml y después se
agitó vorticialmente y se centrifugó a 2000 g durante 5 min. El
producto ácido
4-(N-((S-glutationil)acetil)amino)-bencenoarsónico
(GSAA) se lavó por re-suspensión en etanol absoluto
reciente recién preparado y se centrifugó de nuevo. El lavado se
repitió dos veces más y la suspensión final se secó para dar un
sólido de color blanco, GSAA, por evaporación rotatoria. El GSAA se
caracterizó por ^{1}H RMN (D_{2}O 300 MHz) y ^{13}C RMN
(D_{2}O, 75 MHz) y tiene un peso molecular de 564.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis completo de GSAO se describe en la
solicitud de patente internacional WO 01/21628, cuyo contenido
entero se incorpora en la presente memoria como referencia cruzada.
Se preparó BRAA como se ha descrito anteriormente. Después, BRAA se
convirtió en ácido
4-(N-(bromoacetil)amino)-bencenoarsonoso
(BRAO) usando el método descrito en Donoghue et al. (2000).
El procedimiento para la conversión de BRAO en GSAO es una
modificación del descrito en Donoghue et al. (2000), como se
indica a continuación. Se disolvió glutatión reducido (16 g, 52
mmol) en agua desoxigenada (1 l) en una atmósfera de nitrógeno (se
preparó agua desoxigenada por ebullición seguido de refrigeración a
temperatura ambiente, todo el tiempo en una atmósfera de nitrógeno).
Se suspendió BRAO (25 g, 77 mmol) en la solución y se aplicó
agitación vigorosa de la mezcla hasta que el BRAO no disuelto había
perdido toda la tendencia a flotar, momento en el que se disminuyó
la velocidad de agitación. Se añadió trietilamina (16 ml, 11,6 g,
115 mmol) y la mezcla se agitó durante al menos 18 horas, todo el
tiempo en una atmósfera de nitrógeno. Se retiró algún sólido
incoloro por filtración rápida al vacío y el filtrado se concentró
para dar un gel viscoso en un evaporador rotatorio. El gel se
diluyó con etanol (250 ml), la velocidad de agitación se aumentó y
después se añadió acetona (250 ml), con formación de un sólido de
color blanco. Después de agitar durante 2 horas en una atmósfera de
nitrógeno, el sólido se recogió por filtración al vacío y se secó a
temperatura ambiente al vacío hasta alcanzar un peso constante. El
análisis del material por ^{1}H RMN permitió determinar la
cantidad de trietilamina. Se añadió una cantidad equivalente de
hidróxido sódico (es decir, 1 mmol de NaOH por mmol de
trietilamina) en forma de una solución acuosa 10 M a una solución
del material en la cantidad mínima de agua desoxigenada. La
solución se agitó en una atmósfera de nitrógeno durante 2 horas y se
obtuvo GSAO (en forma de la sal sódica) por retirada del disolvente
en un evaporador rotatorio. El GSAO se caracterizó por los
siguientes métodos: ^{1}H RMN (D_{2}O 400 MHz), ^{13}C RMN
(D_{2}O, 100 MHz), HPLC y espectroscopía de infrarrojos (nujol
mull). El análisis elemental era coherente con una composición de
GSAO\cdot2H_{2}O, y el espectro de masas dio el ión molecular
parental a 549,1 m.u. [GSAO+H]^{+}. La pureza de GSAO fue
>94% por HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó GSCA de una manera similar a GSAA,
usando ácido 4-aminobenzoico en lugar de ácido
p-arsanílico como se indica a continuación. Se preparó una
solución alcalina fría de ácido 4-aminobenzoico (13
g, 95 mmol) como se ha descrito anteriormente ara
p-arsanílico y se hizo reaccionar de una manera
idéntica con bromuro de bromoacetilo. La capa orgánica inferior se
retiró por drenaje y se precipitó ácido
4-(N-(bromoacetil)amino)-benzoico
(BRCA) directamente de la solución por sí mismo. Siguiendo el resto
del procedimiento para GSM de forma exacta usando BRCA (2,58 g, 10
mmol) en lugar de BRAA se dio GSCA en forma de un sólido de color
blanco después de la evaporación rotatoria. El GSCA se caracterizó
por ^{1}H RMN (D_{2}O, 300 MHz) y ^{13}C RMN (D_{2}O 75 MHz)
y la sal disódica tiene un peso molecular de 528.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjo GSAO-B como se
describe por Donoghue et al. (2000) y tiene un peso molecular
de 1001. Se añadió una solución de
fluorescein-5-EX succinimidil éster
(Molecular Probes, Eugene, OR) (2,4 mg, 4,1 \mumol) en DMSO (240
\mul) a GSAO o GSM (33,8 mM) en tampón Mes, pH 5,5 (5 mM, 473
\mul), la mezcla se diluyó con tampón bicarbonato, pH 9 (0,5 M,
3,287 ml) y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 80 min.
Después, la reacción se diluyó con glicina (100 mM) en PBS (4 ml) y
se dejó en reposo a temperatura ambiente durante una noche La
solución final contenía arsénico trivalente (2,0 mM) y glicina (50
mM). La proporción molar de fluorescein-5X a GSAO o
GSAA era \sim1,5:1. Los pesos moleculares de GSAO- y
GSAA-fluoresceína (GSAO-F y
GSAA-F) son 1024 y 1040, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió ácido o-arsanílico
(4,70 g, 21,7 mmol) en KOH 1,85 M (25 ml) y después se hizo
reaccionar con Na_{2}CO_{3} (6 g) y se diluyó con H_{2}O (25
ml). La solución se enfrió en hielo durante 30 min y después se
añadió a un embudo de decantación de 250 ml. Al embudo de
decantación se le añadió cuidadosamente una solución de bromuro de
bromoacetilo (4 ml, 46,0 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (20 ml) durante
aproximadamente 30 min con agitación frecuente y liberación de
CO_{2} (g). Después de que cesara el desprendimiento de CO_{2},
el CH_{2}Cl_{2} se separó y la capa acuosa se acidificó con
H_{2}SO_{4} conc. Se produjo como resultado un precipitado de
color blanco que se recogió por filtración
(6 g, 82% de rendimiento).
(6 g, 82% de rendimiento).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió ácido
2-(2-bromoacetilamino)bencenoarsónico (6 g,
17,8 mmol) en HBr/MeOH (1:1), se añadió NaI (80 mg) y la reacción
se purgó con N_{2} y se enfrió a 0ºC. Se burbujeó SO_{2} a su
través a aprox. 4 burbujas/segundo y después de 15 min comenzó a
formarse un precipitado de color blanco. Se burbujeó SO_{2} a su
través durante 2,5 h más según se calentaba la reacción a
temperatura ambiente. La reacción se purgó con N_{2} durante 10
min y el sólido se recogió por filtración lavando con H_{2}O (x 3)
y éter (x 2) para dar 1,35 g de ácido
2-(2-bromoacetilamino)bencenoarsonoso. Se
obtuvieron 0,25 g más a partir del filtrado inicial. Rendimiento
total (1,60 g, 28%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió ácido p-arsanílico (20 g, 92
mmol) en KOH 1,85 M (100 ml) y después se trató con Na_{2}CO_{3}
(30 g) y H_{2}O (100 ml). La solución se enfrió en hielo durante
30 min y después se añadió a un embudo de decantación de 500 ml. Al
embudo de decantación se le añadió cuidadosamente una solución de
bromuro de bromoacetilo (18 ml, 184 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (60
ml) con agitación frecuente y liberación de CO_{2} (g). La
adición duró aproximadamente 2 h. Después de que cesara el
desprendimiento de CO_{2} (g), el CH_{2}Cl_{2} se separó y la
capa acuosa se acidificó con H_{2}SO_{4} al 98%. Se produjo como
resultado un precipitado de color blanco que se recogió por
filtración y se secó durante 18 h en un desecador. Se obtuvieron 24
g (72 mmol, 78% de rendimiento).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió ácido
2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsónico
(15 g, 45 mmol) en 150 ml de HBr al 48% (ac.)/
MeOH (1:1). Se añadió NaI (200 mg, 13 mmol) y la reacción se purgó con N_{2} y se enfrió sobre hielo. Se burbujeó SO_{2} (g) a su través a aprox. 2 burbujas/segundo y después de 5 h comenzó a formarse un precipitado de color blanco. Se burbujeó SO_{2} (g) a su través durante 2 h más según se calentaba la reacción a 25ºC. La reacción se purgó con N_{2} durante 10 min y el sólido se recogió por filtración lavando con H_{2}O (x 3) y éter (x 2) para dar 1,35 g de ácido 2-(2-bromoacetilamino)bencenoarsonoso. Se obtuvieron 5,5 g (17 mmol, 38% de rendimiento).
MeOH (1:1). Se añadió NaI (200 mg, 13 mmol) y la reacción se purgó con N_{2} y se enfrió sobre hielo. Se burbujeó SO_{2} (g) a su través a aprox. 2 burbujas/segundo y después de 5 h comenzó a formarse un precipitado de color blanco. Se burbujeó SO_{2} (g) a su través durante 2 h más según se calentaba la reacción a 25ºC. La reacción se purgó con N_{2} durante 10 min y el sólido se recogió por filtración lavando con H_{2}O (x 3) y éter (x 2) para dar 1,35 g de ácido 2-(2-bromoacetilamino)bencenoarsonoso. Se obtuvieron 5,5 g (17 mmol, 38% de rendimiento).
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió ácido
2-(2-bromoacetilamino)bencenoarsonoso (288 m,
0,90 mmol) en H_{2}O desgasificada (5 ml). Se añadió Net_{3}
(250 \mul, 1,7 mmol) seguido de glutatión (160 mg, 0,521 mmol). Se
confirmó que el pH de la mezcla de reacción era pH \geq8. La
suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera
de N_{2} durante 20 h. La reacción se filtró a través de un filtro
vitrificado y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio.
El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml
de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color
blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,5 h. El
sobrenadante se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color
blanco, que se decantó y se secó adicionalmente al vacío. El
o-GSAO polvoriento seco se disolvió en
H_{2}O (4 ml) y se inyectó en la HPLC
semi-preparativa, columna C_{18} Vydac Protein
& Peptide. Tampón A: TFA al 0,1% en agua filtrada y
desgasificada, Tampón B: TFA al 0,1% en acetonitrilo filtrado y
desgasificado-agua filtrada y desgasificada (9:1).
Las fracciones se recogieron y se liofilizaron. La estructura de
o-GSAO se confirmó por LC-MS
(M^{+} 548,4) y por ^{1}H RMN. La pureza por HPLC fue de 96,9% a
98,8% para 4 extracciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió ácido
2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso
(80 mg, 0,25 mmol) en H_{2}O desgasificado (2 ml). Se añadió
Net_{3} (70 \mul, 0,5 mmol) seguido de
retro-HO-Cys-carbonil-Glu-OH
(50 mg, 0,17 mol). Se confirmó que el pH de la solución era pH
\geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en
una atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a
través de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se
concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un
tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando
como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se
almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se
decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de
nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó
por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por
RP-HPLC semi-preparativa. Las
fracciones se secaron en el
speed-vac.
speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió ácido
2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso
(80 mg, 0,25 mmol) en H_{2}O desgasificada (2 ml). Se añadió HEU
(70 \mul, 0,5 mmol) seguido de
retro-HO-Cys-carbonil-Glu-OH
(50 mg, 0,17 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH
\geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una
atmósfera de N_{2} durante 18 h. La reacción se filtró a través
de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un
evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico
y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un
precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC
durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un
sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en
MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por
RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por
RP-HPLC semi-preparativa. Las
fracciones se secaron en el
speed-vac.
speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió ácido
2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso
(80 mg, 0,25 mmol) en H_{2}O desgasificada (4 ml). Se añadió
Net_{3} (70 \mul, 0,5 mmol) seguido de
H-Arg-Gly-Asp-Cys-OH
(50 mg, 0,11 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH
\geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una
atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a través
de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un
evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico
y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un
precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC
durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un
sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en
MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por
RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por
RP-HPLC semi-preparativa. Las
fracciones se secaron en el
speed-vac.
speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió ácido
2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso
(288 mg, 0,90 mmol) en H_{2}O desgasificada (4 ml). Se añadió
Net_{3} (220 \mul, 1,6 mmol) seguido de
H-Gly-Gly-Cys-OH
(141,2 mg, 0,8 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH
\geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una
atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a través
de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un
evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico
y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un
precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC
durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un
sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en
MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por
RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por
RP-HPLC semi-preparativa. Las
fracciones se secaron en el
speed-vac.
speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió ácido
2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso
(80 mg, 0,25 mmol) en H_{2}O desgasificada (4 ml). Se añadió
Net_{3} (70 \mul, 0,5 mmol) seguido de
H-Val-Thr-Cys-Gly-OH
(50 mg, 0,13 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH
\geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una
atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a través
de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un
evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico
y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un
precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC
durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un
sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en
MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por
RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por
RP-HPLC semi-preparativa. Las
fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Reducción de ácido preslonoico: disolver el
péptido en 10 ml de bicarbonato sódico 0,1 M, solución de DTT (99
mg, 0,65 mmol) desgasificada con N_{2}. Se confirmó que el pH de
la solución era pH \geq8 y proteger la mezcla con N_{2}.
Después de 2 h, acidificar la solución con AcOH y liofilizar la
mezcla. Purificar por RP-HPLC
semi-preparativa después de disolver en una solución
acuosa al 0,1% de TFA. Liofilizar.
Se suspendió ácido
2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso
(26 mg, 0,081 mmol, 14 equiv.) en H_{2}O desgasificada (3 ml). Se
añadió Net_{3} (20 \mul, 0,14 mmol) seguido de ácido preslonoico
(22 mg, 0,028 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH
\geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una
atmósfera de N_{2} durante 18 h. La reacción se filtró a través
de un disco 0,45 \muM desechable y el nitrato se concentró en un
evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico
y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un
precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC
durante 1,0 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un
sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en
MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por
RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por
RP-HPLC semi-preparativa. Las
fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió ácido
2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso
(288 mg, 0,90 mmol) en H_{2}O desgasificada (4 ml). Se añadió
Net_{3} (220 \mul, 1,6 mmol) seguido de ácido
3-mercaptopropanosulfónico (108,9 mg, 0,6 mmol). Se
confirmó que el pH de la solución era pH \geq8. La suspensión de
color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera de N_{2}
durante 16 h. La reacción se filtró a través de un disco 0,45 \muM
desechable y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio.
El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se añadieron 2 ml
de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un precipitado de color
blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La
solución se centrifugó y se decantó, dejando un sólido de color
blanco, que se disolvió de nuevo en MeCN-Agua. La
muestra en bruto se analizó por RP-HPLC y LCMS. El
producto se purificó por RP-HPLC
semi-preparativa. Las fracciones se secaron en el
speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió ácido
2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso
(288 mg, 0,90 mmol) en H_{2}O desgasificada (4 ml). Se añadió
Net_{3} (210 \mul, 1,5 mmol) seguido de ácido mercaptopropiónico
(53 \mul, 0,6 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH
8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una
atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a través de
un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un
evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico
y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un
precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC
durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un
sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en
MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por
RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por
RP-HPLC semi-preparativa. Las
fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió ácido
2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso
(288 mg, 0,90 mmol) en H_{2}O desgasificada (4 ml). Se añadió
Net_{3} (210 \mul, 1,5 mmol) seguido de ácido mercaptosuccínico
(90 mg, 0,6 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH
\geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en
una atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a
través de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se
concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un
tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando
como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se
almacenó a 4ºC durante 15 h. La solución se centrifugó y se
decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de
nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó
por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por
RP-HPLC semi-preparativa. Las
fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió ácido
2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso
(288 mg, 0-90 mmol) en H_{2}O desgasificada (4
ml). Se añadió Net_{3} (210 \mul, 1,5 mmol) seguido de
1-tio-\beta-D-glucosa
(130,9 mg, 0,6 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH
\geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en
una atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a
través de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se
concentró en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un
tubo de plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando
como resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se
almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se
decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de
nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó
por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por
RP-HPLC semi-preparativa. Las
fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió ácido
2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso
(288 mg, 0,90 mmol) en H_{2}O desgasificada (4 ml). Se añadió
Net_{3} (210 \mul, 1,5 mmol) seguido de
3-mercapto-1,2-propanodiol
(65 \mul, 0,6 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH
\geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en
una atmósfera de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a
través de un disco 0,5 \muM desechable y el filtrado se concentró
en un evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de
plástico y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como
resultado un precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se
almacenó a 4ºC durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se
decantó, dejando un sólido de color blanco, que se disolvió de
nuevo en MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó
por RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por
RP-HPLC semi-preparativa. Las
fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió ácido
2-(2-bromoacetil-p-amino)bencenoarsonoso
(288 mg, 0,90 mmol) en H_{2}O desgasificada (5 ml). Se añadió
Net_{3} (210 \mul, 1,5 mmol) seguido de ácido
5-mercapto-tetrazolacético (110 mg,
0,6 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH \geq8. La
suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una atmósfera
de N_{2} durante 16 h. La reacción se filtró a través de un disco
0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un evaporador
rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico y se
añadieron 2 ml EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un
precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC
durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un
sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en
MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por
RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por
RP-HPLC semi-preparativa. Las
fracciones se secaron en el
speed-vac.
speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió ácido
2-(2-bromoacetil-o-amino)bencenoarsonoso
(180 mg, 0,5 mmol) en H_{2}O desgasificada (1 ml). Se añadió
Net_{3} (140 \mul, 1,0 mmol) seguido de
H-Gly-Gly-Cys-OH
(61 mg, 0,26 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH
\geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una
atmósfera de N_{2} durante 20 h. La reacción se filtró a través
de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un
evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico
y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un
precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC
durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un
sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en
MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por
RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por
RP-HPLC semi-preparativa. Las
fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió acido
2-(2-bromoacetil-o-amino)bencenoarsonoso
(80 mg, 0,25 mmol) en H_{2}O desgasificada (1 ml). Se añadió
Net_{3} (70 \mul, 0,50 mmol) seguido de
H-Val-Thr-Cys-Gly-OH
(50 mg, 0,13 mmol). Se confirmó que el pH de la solución era pH
\geq8. La suspensión de color blanco se agitó vigorosamente en una
atmósfera de N_{2} durante 20 h. La reacción se filtró a través
de un disco 0,45 \muM desechable y el filtrado se concentró en un
evaporador rotatorio. El residuo se transfirió a un tubo de plástico
y se añadieron 2 ml de EtOH/acetona (1:1), dando como resultado un
precipitado de color blanco. El tubo se tapó y se almacenó a 4ºC
durante 1,5 h. La solución se centrifugó y se decantó, dejando un
sólido de color blanco, que se disolvió de nuevo en
MeCN-Agua. La muestra en bruto se analizó por
RP-HPLC y LCMS. El producto se purificó por
RP-HPLC semi-preparativa. Las
fracciones se secaron en el speed-vac.
\vskip1.000000\baselineskip
Las concentraciones de GSAO,
GSAO-B y GSAO-F se midieron por
valoración con dimercaptopropanol y calculando los tioles libres
restantes con ácido
5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico)
(Sigma, St Louis, MO) (Donoghue et al., 2000). Los conjugados
se filtraron mientras permanecían estériles y se almacenaron a 4ºC
en la oscuridad hasta su uso. No hubo ninguna pérdida significativa
en la concentración activa de soluciones madre de los arsenicales
durante al menos una semana cuando se almacenaron en estas
condiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron mitocondrias de los hígado de ratas
Wistar macho de \sim250 g usando centrifugación diferencial como
se ha descrito anteriormente (Schnaitman y Greenawalt, 1968). El
sedimento mitocondrial final se resuspendió en tampón
HEPES-KOH 3 mM, pH 7,0 que contenía manitol 213 mM,
sacarosa 71 mM y succinato de sodio 10 mM a una concentración de 30
mg de proteína por ml. La inducción de MPT se evaluó
espectrofotométricamente suspendiendo las mitocondrias de hígado a
0,5 mg de proteína por ml a 25ºC en tampón HEPES-KOH
3 mM, pH 7,0, que contiene manitol 75 mM, sacarosa 250 mM,
succinato de sodio 10 mM y rotenona 2 \muM. Todos los componentes
de tampón eran de Sigma, St Louis, MO. Los derivados arsenicales y
el GSCA se disolvieron en solución salina tamponada con fosfato
(PBS) que contiene glicina 100 mM. Los compuestos de unión a ANT
empleados eran CsA, BKA y ADP (Sigma, St. Louis, MO). Las
concentraciones de reactivo se indican en las leyendas de la
figuras. Se midió el hinchamiento por control de la disminución
asociada de la dispersión de luz a 520 nm usando un lector de
microplacas Molecular Devices Thermomax Plus (Palo Alto, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendieron mitocondrias de hígado de rata a
1 mg de proteína por ml a 25ºC en tampón HEPES-KOH 3
mM, pH 7,0 que contenía manitol 213 mM, sacarosa 71 mM y succinato
de sodio 10 mM y se incubaron con GSAO-B 100 \muM
en ausencia o presencia de 2,3-dimercaptopropanol
400 \muM (Fluka, Buchs, SG, Suiza) a temperatura ambiente en una
rueda giratoria durante 1 h. Las mitocondrias marcadas se lavaron
tres veces con PBS y se sonicaron en 0,3 ml de tampón Tris 25 mM,
pH 7,4 enfriado en hielo que contenía NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM,
Triton X-100 a 0,5%, Tween-20 a
0,05%, leupeptina 10 \muM, aprotinina 10 \muM, fluoruro de 4,2-
(aminoetil)-benceno sulfonilo 50 \mug.ml^{-1} y
EDTA 5 mM. El lisado se aclaró por centrifugación a 18000 g durante
10 min a 4ºC y se incubó con 30 \mul de
estreptavidina-Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega)
durante 60 min a 4ºC en una rueda giratoria para aislar las
proteínas marcadas con biotina. Las perlas se lavaron 5 veces con
tampón de sonicación y las proteínas marcadas con biotina se
liberaron de las perlas por ebullición en 30 \mul de tampón
SDS-Laemmli durante 2 minutos. Las muestras se
resolvieron en iGels de gradiente de 8-16% en
condiciones reductoras y se transfirieron a una membrana de PVDF.
Las proteínas se detectaron mediante transferencia de Western
usando una dilución 1:500 de anticuerpo policlonal de cabra
anti-ANT humano (Santa Cruz Biotechnology, Santa
Cruz, CA) y una dilución 1:2000 de anticuerpos de conejo
anti-cabra conjugados con peroxidasa (Dako,
Carpinteria, California).
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon partículas submitocondriales de
hígado de rata por sonicación y centrifugación diferencial de
acuerdo con Majima et al. (1998). Las partículas se
suspendieron a 20 mg de proteína por ml en tampón Tris 10 mM pH 7,2
que contenía sacarosa 250 mM y EDTA 0,2 mM y se incubaron sin o con
GSAO 200 nmol por mg de proteína durante 10 min a 25ºC, seguido de
20 nmol de eosin-5-maleimida por mg
de proteína durante 1 min a 0ºC en la oscuridad. El marcaje se
terminó por adición de 10 \mumol de ditiotreitol por mg de
proteína. Las proteínas se resolvieron en iGels de gradiente de
4-20% y el ANT marcado con eosina se visualizó por
transiluminación UV usando un Fluor-S^{TM}
Multilmager (Bio-Rad, Hercules, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
El GSAO (Fig. 1A) desencadenaba el hinchamiento
de mitocondrias de hígado de rata aisladas (Fig. 1B). La velocidad
de hinchamiento aumentaba con el aumento de la concentración de GSAO
y del tiempo de incubación. El resto arsenical trivalente de GSAO
era responsable de su actividad ya que los compuestos arsenical
pentavalente (ácido
4-(N-((S-glutationil)acetil)amino)bencenarsénico,
GSAA) o de ácido carboxílico (ácido
4-(N-((S-glutationil)acetil)amino)benzoico,
GSCA) correspondientes (Fig. 1A) no tenían efecto (Fig. 1Bii). Los
controles positivos para apertura de poros eran iones Ca2+ y Pi
(Fig. 1Bi) y PAO (Fig. 1Bii).
La actividad de ANT se controla por la unión de
Ca2+, ciclofilina D y nucleótidos de adenina. La ciclofilina D
(Crompton et al., 1988) y los nucleótidos de adenina (Haworth
y Hunter, 1979a,b) se unen al lado de la matriz de ANT mientras que
aún no se ha determinado el sitio o sitios para la interacción de
Ca^{2+}. El desencadenamiento primario para la apertura del MPTP
es un aumento en la concentración de Ca^{2+} en la matriz. La
quelación de Ca^{2+} con EGTA bloquea la apertura del poro. La
especificidad del sitio de desencadenamiento para Ca^{2+} parece
ser absoluta ya que otros iones de metales divalentes tales como
Mg^{2+} actúan como inhibidores (Haworth y Hunter, 1979a). La
unión de ciclofilina D a ANT es necesaria para la apertura de poros
a concentraciones de Ca^{2+} submilimolares (Halestrap et
al., 2002). La ciclosporina A (CsA) bloquea la apertura de poros
por unión a ciclofilina D y desplazamiento de la misma del ANT
(Crompton et al., 1988). El ADP de la matriz también es un
modulador importante de la apertura de poros que se une a ANT y
disminuye la sensibilidad del sitio de desencadenamiento a
Ca^{2+} (Haworth y Hunter, 1979a,b). El ácido bonkrékico (BKA)
también interacciona con ANT y disminuye la sensibilidad a Ca^{2+}
(Hunter y Haworth, 1979).
El Mg^{2+}, EGTA, CsA, ADP y BKA bloquean
todos el efecto del GSAO sobre la apertura de poros (Fig. 1Biii).
Estas observaciones concuerdan con un efecto específico del GSAO
sobre la apertura de poros y confirman al ANT como su diana.
El semi-tiempo para el
hinchamiento de la mitocondria mediado por GSAO se redujo por
Ca^{2+} añadido (Fig. 1C). Este resultado concuerda con que el
GSAO entrecruza dos de los tres restos cisteína en el ANT que
sobresalen hacia la matriz mitocondrial.
La interacción directa del ANT con un GSAO
marcado con biotina (fenilarsenóxido de
4-(N-(S-(N-(6-((6-((bioti-
noil)amino)hexanoil)amino)hexanoil)-glutationil)acetil)amino), GSAO-B, se muestra en la Figura 1D. El marcaje de ANT con GSAO-B era específico ya que presentaba competición con un exceso molar de 4 veces del ditiol sintético pequeño, dimercaptopropanol. La eosina-maleimida alquila la Cys^{160} en el ANT (Majima et al., 1998) y bloquea la unión a ADP (Halestrap et al., 1997). El GSAO competía por la alquilación por eosina-maleimida de la Cys^{160} del ANT (Fig. 1E), que implicaba que el GSAO entrecruza Cys^{160} y Cys^{257}.
noil)amino)hexanoil)amino)hexanoil)-glutationil)acetil)amino), GSAO-B, se muestra en la Figura 1D. El marcaje de ANT con GSAO-B era específico ya que presentaba competición con un exceso molar de 4 veces del ditiol sintético pequeño, dimercaptopropanol. La eosina-maleimida alquila la Cys^{160} en el ANT (Majima et al., 1998) y bloquea la unión a ADP (Halestrap et al., 1997). El GSAO competía por la alquilación por eosina-maleimida de la Cys^{160} del ANT (Fig. 1E), que implicaba que el GSAO entrecruza Cys^{160} y Cys^{257}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células endoteliales aórticas
bovinas (BAE) (ATCC, Rockville, MD) en DMEM complementado con suero
fetal de ternera a 10% (FCS), L-glutamina 2 mM y
penicilina/estreptomicina 5 U.ml^{-1} (Gibco, Galthersburg, MD).
La línea celular endotelial microvascular humana,
HMEC-1 (Ades et al., 1992), se cultivó en
medio MCDB131 (Gibco) complementado con FCS al 10%,
L-glutamina 2 mM, penicilina/estreptomicina 5
U.ml^{-1}, factor de crecimiento epidérmico 10 ng.ml^{-1}
(Sigma, St. Louis, MO) e hidrocortisona 1 \mug.ml^{-1} (Sigma).
Se adquirió material de plástico de cultivo de células en Coming
Costar (Corning, NY). La solución de tripsina/EDTA era de Gibco.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembraron células BAE a una densidad de
10^{4} células por pocillo en portaobjetos de cámara de vidrio
Labtek de 8 pocillos (Nunc, Naperville, IL) y se dejó que se
adhirieran durante una noche. Las células se lavaron una vez y el
medio se sustituyó con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)
(Gibco). Las células se incubaron después durante 1 h con
GSAO-F 50 \muM, GSAO-F 50 \muM y
dimercaptopropanol 250 \muM o GSAA-F 50 \muM.
Todas las células se contratiñeron con Mitotracker^{TM} Red CMXRos
100 nM (Molecular Probes, Eugene, OR). Las células se lavaron
después tres veces con HBSS, se fijaron durante 10 min con acetona a
80% y metanol a 20% y se lavaron tres veces con HBSS. Los
portaobjetos se montaron en agente protector de fluorescencia
VectaShield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se sellaron con
laca de uñas. Las imágenes se capturaron usando un microscopio
invertido Leica DM IRB y un sistema confocal con el programa
informático confocal de Leica.
\vskip1.000000\baselineskip
Una característica sorprendente del GSAO era que
se localizaba rápidamente en mitocondrias en células endoteliales
microvasculares aórticas bovinas (BAE) (Figura 2) y dérmicas humanas
(HMEC-1) (no se muestran los datos). El GSAO se
conjugó con fluoresceína (GSAO-F) y se determinó su
localización subcelular por microscopía de fluorescencia confocal.
La tinción mitocondrial se confirmó por colocalización de
GSAO-F con la sonda Mitotracker roja fluorescente
que se acumula en la mitocondria de células con respiración activa
(Figuras 2ii, iv y vi). La acumulación mitocondrial de
GSAO-F era específica para la reactividad ditiol del
GSAO ya que se suprimía en presencia de un exceso molar de cinco
veces del ditiol sintético pequeño dimercaptopropanol (Figura 2iii)
y el arsenical pentavalente correspondiente, GSAA-F,
no teñía las células (Figura 2v). La localización mitocondrial
también se observó en células BAE incubadas con
GSAO-B seguido de tinción con
estreptavidina-Alexa Fluor 488 (no se muestran los
datos).
El ANT es abundante en la membrana mitocondrial
interna. El secuestro de GSAO en el lado de la matriz del ANT
dirigiría la importación entrópica del GSAO hacia la matriz. Este
mecanismo se confirma por el descubrimiento de que el GSAA, que
tiene de hecho la misma carga y tamaño que el GSAO, no reacciona con
el ANT ni se acumula en la mitocondria.
\vskip1.000000\baselineskip
Se detuvieron células BAE en placas de cultivo
de seis pocillos durante 24 h en suero a 0,5% o se dejaron en suero
a 10%, después se trataron durante 24 h con GSAO 0, 60 ó 150 \muM.
Las células se lavaron una vez, después se resuspendieron en PBS a
0,4 ml que contenía albúmina de suero bovino a 0,3%. Una muestra de
50 \mul de células se mezcló con 50 \mul de agua y 100 \mul
de agente liberador de ATP (Sigma) y se midió la concentración de
ATP usando una mezcla de ensayo de ATP con luciferina/luciferasa.
Las unidades de luz se convirtieron a concentraciones de ATP usando
un patrón de ATP en lugar de los 50 \mul de agua. Se realizó un
recuento del número de células usando un contador Beckman Coulter y
los moles de ATP se expresaron por millón de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembraron células BAE o
HMEC-1 a una densidad de 10^{4} células por célula
en placas de 96 pocillos y se dejó que se adhirieran durante una
noche y después se trataron como se indica. Para los experimentos
que implicaban la detención de la proliferación celular en suero a
0,25%, las células se sembraron en medio que contenía suero a 10%,
se dejó que se adhirieran durante una noche, después se lavaron con
PBS y se detuvieron durante 24 h en medio que contenía suero a
0,25%. Las células que permanecían unidas después de los
tratamientos se midieron usando azul de metileno (Oliver et
al., 1989).
\vskip1.000000\baselineskip
Para mediciones de niveles de superóxido con
dihidroetidina, potencial de membrana mitocondrial con
JC-1, masa mitocondrial con naranja de nonil
acridina y apoptosis con anexina V, se trataron células BAE en
proliferación o de crecimiento en estado quiescente durante 24 o 48
h con GSAO en placas de cultivo de seis pocillos, después se
despegaron con tripsina/EDTA, se lavaron una vez y se resuspendieron
a 2 x 10^{6} células por ml en medio sin suero. Después las
células se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente con
dihidroetidina (5 \muM, Molecular Probes) o 30 min a temperatura
ambiente con JC-1 (0,5 \mug.ml^{-1}, Molecular
Probes), anexina V-FITC (50 \mul.ml^{-1})
(Pharmingen, La Jolla, CA, Estados Unidos) o
10-nonil bromuro de naranja de acridina (5 \muM,
Molecular Probes). Después las células se lavaron una vez, se
resuspendieron en 0,5 ml de medio sin suero, se transfirieron a
hielo y se cuantificó la fluorescencia inmediatamente por citometría
de flujo.
\vskip1.000000\baselineskip
El GSAO se concentraba en mitocondrias en
células viables y alteraba la función mitocondrial y la viabilidad
celular. Teniendo las células en proliferación una mayor masa
mitocondrial y respiración que las células de crecimiento en estado
quiescente. Para ensayar si el GSAO podía tener efectos selectivos
sobre células en proliferación, se incubaron células BAE en
proliferación o de crecimiento en estado quiescente durante 48 h con
concentraciones crecientes de GSAO.
Las CI_{50} de GSAO para la reducción de la
viabilidad de células BAE en proliferación era de \sim75 \muM
(Figura 3Ai), mientras que el compuesto tenía escaso efecto sobre
células de crecimiento en estado quiescente. Los compuestos de
control, GSAA y GSCA, no tenían efectos significativos sobre la
viabilidad de células BAE en proliferación a concentraciones de
hasta 1,0 mM (no se muestran los datos). El efecto del GSAO sobre la
viabilidad células en proliferación dependía del tiempo. La
CI_{50} del GSAO disminuía de \sim75 \muM a \sim25 \muM
cuando el tiempo de incubación aumentaba de 48 a 72 h (no se
muestran los datos). El PAO, por el contrario, era igualmente
tóxico para células BAE tanto en proliferación como de crecimiento
en estado quiescente con una CI_{50} de \sim200 nM (Figura
3A(ii)). Los mismos resultados se observaron con células
HMEC-1 (no se muestran los datos). El efecto del
GSAO sobre la viabilidad de células endoteliales en proliferación
estaba estrechamente asociado con la pérdida de potencial
transmembrana mitocondrial y apoptosis (Figura 3B). Estos parámetros
se midieron usando el colorante JC-1 y anexina V
conjugada con FITC, respectivamente. La proporción de distribución
de JC-1 entre el citosol (fluorescencia verde) y la
mitocondria (fluorescencia roja) refleja el potencial transmembrana
mitocondrial (Smiley et al., 1991), mientras que la anexina V
se une a la fosfatidilserina expuesta en la superficie de células
apoptóticas.
La unión de GSAO a ANT en células endoteliales
en proliferación afectaba a la producción de ATP. El contenido de
ATP de células BAE en proliferación era aproximadamente el doble que
el de células de crecimiento en estado quiescente y la incubación
con GSAO 150 \muM durante 24 h reducía los niveles de ATP en
células en proliferación hasta el de células de crecimiento en
estado quiescente (Figura 4ai). Este resultado refleja los efectos
selectivos del GSAO sobre la viabilidad de células en proliferación
(Figura 4ai). Para confirmar que el ATP celular disminuido se debía
a un efecto del GSAO sobre la síntesis de ATP mitocondrial más que a
la biogénesis mitocondrial, se midió la masa mitocondrial usando
naranja de nonil acridina. El colorante se une a cardiolipina en la
membrana mitocondrial (Petit et al., 1992). La masa
mitocondrial de células en proliferación era aproximadamente el
doble que la de células de crecimiento en estado quiescente, que no
cambiaba por tratamiento con GSAO (Figura 4aii).
A altas concentraciones, las especies de oxígeno
reactivo tales como anión superóxido (O_{2}) pueden detener la
proliferación celular e inducir la apoptosis. Para ensayar el efecto
del GSAO sobre los niveles celulares de O_{2}, se trataron
células BAE durante 24 h con GSAO y se midieron los niveles
celulares de O_{2} y H_{2}O_{2} usando los colorantes
dihidroetidio y CM-H_{2}-DCFDA,
respectivamente. Los niveles celulares de O_{2-} aumentaban
linealmente con la concentración de GSAO en células BAE en
proliferación pero no en las de crecimiento en estado quiescente
(Figura 4b). Este efecto del GSAO no se debía a la inhibición de la
actividad de la SOD ya que solo había una pequeña disminución en los
niveles de H_{2}O_{2} (Figura 4c). Por ejemplo, el tratamiento
con GSAO 120 \muM durante 24 h dio como resultado una disminución
de 30% en H_{2}O_{2} pero un aumento de 100% en el nivel de
O_{2}. Este descubrimiento se confirmó usando un análisis
citométrico de flujo de dos canales de los niveles celulares de
O_{2} y H_{2}O_{2}. Los niveles de O_{2} se aumentaron en
la mayoría de las células sin una disminución correspondiente en el
H_{2}O_{2} (no se muestran los datos). Por el contrario, el
GSAA no tenía efecto sobre los niveles de O_{2} o H_{2}O_{2}.
El aumento lineal en los niveles de O_{2} con tratamiento con GSAO
concuerda con una alteración de la integridad mitocondrial.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendieron mitocondrias de hígado de rata a
1 mg de proteína por ml a 25ºC en tampón HEPES 3 mM, pH 7,0 que
contenía manitol 75 mM, sacarosa 250 mM, succinato de sodio 10 mM y
rotenona 2 \muM y se trataron con los compuestos de unión a ANT
durante de 0 a 60 min. Las concentraciones de reactivo se indican en
las leyendas de las figuras. Las mitocondrias en 0,25 ml de
reacción se sedimentaron por centrifugación a 8000 g durante 5 min
y los sobrenadantes se concentraron 10 veces por ultrafiltración a
través de una membrana Microcon YM-3 (Millipore,
Bedford, MA). Los sobrenadantes concentrados se resolvieron en iGels
de gradiente de 8-16% de Gradipore (Sydney,
Australia) en condiciones no reductoras y se transfirieron a una
membrana de PVDF. Las proteínas se detectaron mediante
transferencia de Western usando anticuerpos policlonales anti-
citocromo c humano (Producto 556433, BD Pharmingen) y anticuerpos
anti-conejo conjugados con peroxidasa (Dako,
Carpinteria, California). Se analizaron películas de
quimioluminiscencia usando un densitómetro de formación de imágenes
GS-700 y el programa informático
Multi-Analyst (Bio-Rad, Hercules,
California).
\vskip1.000000\baselineskip
La incubación de mitocondrias aisladas con GSAO
desencadenaba la liberación dependiente del tiempo de Citocromo C
hacia el medio (Figura 5A). El ligando de ANT, la ciclosporina A,
inhibía parcialmente esta liberación (Figura 5B).
\vskip1.000000\baselineskip
La exploración se realizó usando mitocondrias de
hígado de rata congeladas durante 1 ó 2 días a -80ºC después del
aislamiento. El hinchamiento de las mitocondrias se midió por
control de la disminución de la dispersión de luz a 520 nm usando un
lector de microplacas.
En todos los experimentos se determinó el tiempo
necesario para un hinchamiento semimáximo para cada compuesto.
Después, se calcularon las velocidades de hinchamiento y se
compararon con el GSAO. El aumento de la velocidad de hinchamiento
en comparación con el GSAO se calculó de la forma siguiente:
Factor de
aumento de hinchamiento = Velocidad de hinchamiento_{\text{(análogo
de GSAO)}} / Velocidad de
hinchamiento_{(GSAO)}
Los resultados se resumen en la Tabla 1 y se
presentan en la Figura 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los compuestos se ensayaron al menos 2
veces en preparaciones mitocondriales diferentes para determinar sus
propiedades de inducción de MPTP, excepto el compuesto 15 que se
ensayó solamente una vez.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los compuestos mostraban una actividad de
inducción similar o mejor que el GSAO. Los compuestos más activos
eran el 1, 4, 22 y 23, que mostraban una actividad aumentada
respecto al GSAO que variaba de 5,4 a 16,3 veces (Tabla 1; Figura
6). Para la inducción de MPTP, como para la actividad
antiproliferativa sobre células BAE, los compuestos de
orto-arsenóxido (1, 4, 22 y 23) tenían una actividad
aumentada respecto a los compuestos de
para-arsenóxido correspondientes (GSAO, 3, 7 y 8,
respectivamente).
Se presenta una comparación de la inducción de
MPTP frente al peso molecular de los compuestos en la Figura 7.
Se presenta una comparación de la inducción de
MPTP frente al Log P del compuesto ensayado en la Figura 8.
La actividad antiproliferativa del GSAO y
análogos relacionados se comparó con la capacidad de esos compuestos
para inducir la MPT. Los resultados se presentan en la Figura 9.
Los compuestos que mostraban una actividad aumentada respecto al
GSAO en ambos ensayos eran los compuestos de
orto-arsenóxido 1, 4, 22 y 23.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron mitocondrias a partir de los hígados
de ratas Wistar macho de \sim250 g usando centrifugación
diferencial como se ha descrito anteriormente (Don et al.,
2003). El sedimento mitocondrial final se resuspendió en tampón
HEPES-KOH 3 mM, pH 7,0 que contenía manitol 213 mM,
sacarosa 71 mM y succinato de sodio 10 mM a una concentración de 30
mg de proteína por ml. Se evaluó la inducción de transición de
permeabilidad mitocondrial espectrofotométricamente por suspensión
de las mitocondrias de hígado a 0,5 mg de proteína por ml a 25ºC en
tampón HEPES-KOH 3 mM pH 7,0 que contenía manitol
75 mM, sacarosa 250 mM, succinato de sodio 10 mM y rotenona 2 mM. El
hinchamiento se midió por control de la disminución asociada de la
dispersión de luz a 520 nm usando un lector de microplacas.
\vskip1.000000\baselineskip
El semi-tiempo para el
hinchamiento máximo de mitocondrias aisladas era 3-5
veces más rápido para una concentración dada de
o-GSAO en comparación con GSAO (Figura 10). De
hecho, el o-GSAO era casi tan eficaz como el PAO
lipófilo en la inducción de la transición de permeabilidad
mitocondrial (Figura 17D).
La formación de poros por el ANT está controlada
por la unión de Ca^{2+}, ciclofilina D y nucleótidos de adenina
en condiciones fisiológicas. El desencadenamiento primario para la
apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial es un
aumento en la concentración de Ca^{2+} en la matriz. La quelación
de Ca^{2+} con EGTA bloquea la apertura de poros, al igual que un
exceso de otros iones de metales divalentes tales como Mg^{2+}.
Tanto el EGTA como el Mg^{2+} bloquearon el hinchamiento
dependiente de GSAO (Figura 11). La unión de ciclofilina D a ANT es
necesaria para la apertura de poros a concentraciones de Ca^{2+}
submilimolares. La ciclosporina A (CsA) bloquea la apertura de poros
por unión a ciclofilina D y desplazamiento de la misma del ANT.
Además, el ADP inhibe la apertura de poros por unión a ANT y
disminución de la sensibilidad del sitio de desencadenamiento a
Ca^{2+}. El CsA y el ADP bloqueaban el efecto del
o-GSAO sobre la apertura de poros (Figura 12).
\vskip1.000000\baselineskip
Ades, E. W., Candal, F. J.,
Swerlick, R. A., George, V. G., Summers, S.
Bosse, D. C., y Lawley, T. J. HMEC-1:
Establishment of an immortalized human microvascular endothelial
cell line. J. Invest. Dermatol. 99, 683-890,
1992.
Carmeliet, P. y Jain, R. K.
Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 407,
249-257, 2000.
Crompton, M. The mitochondiial
permeability transition pore and its role in cell death. Biochem.
J. 341, 233-249, 1999.
Crompton, M.; Costi, A. y
Hayat, L Evidence for the presence of a reversible
Ca^{2+}-dependent pore activated by oxidative
stress in heart mitochondria. Biochem. J. 248,
915-918, 1987.
Crompton, M., Ellinger, H. y
Costi, A. inhibition by cyclosporin A of a Ca^{2+}
dependent pore in heart mitochondria activated by inorganic
phosphate and oxidative stress. Biochem. J. 255,
357-360, 1988.
Donoghue, N., Yam, P. T. W.,
Jiang, X., y Hogg, P. J. Presence of closely spaced
protein thiols on the surface of mammalian cells. Protein
Sci. 9, 2438-2445, 2000. Folkman, J.
Angiogenesis and its inhibitors. En Important Advances in Oncology,
DeVita, V. T., Hellman, S., y Rosenbeig, S., eds. (J. B. Lippincott
Company, PD) págs. 42-62, 1985.
Halestrap, A. P., McStay, G. P.,
Clarke, S. J. The permeability transition pore complex:
another view. Biochimie 84, 153-66,
2002.
Halestrap, A. P., Woodfield, K. Y.
y Connem, C. P. Oxidative stress, thiol reagents, and
membrane potential modulate the mitochondrial permeability
transition by affecting nucleotide binding to the adenine nucleotide
translocase. J. Biol. Chem, 272, 3346-3354,
1997.
Hanahan, D. y Folkman, J. Patterns
and emerging mechanisms of the angiogenic switch during
tumourigenesis. Cell 86, 353-364,
1996.
Haworth, R. A. y Hunter, D. R.
Control of the mitochondrial permeability transition pore by
high-affinity ADP binding at the ADP/ATP translocase
in permeabilized mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr. 32,
91-96, 2000.
\newpage
Haworth, R. A. y Hunter, D. R. The
Ca^{2+}-induced membrane transition in
mitochondria. II. Nature of the Ca^{2+} trigger site. Arch.
Biochem. Biophys. 195, 460-467, 1979.
Holmgren, L, O'Reilly, M.S., y
Folkman, J. Dormancy of micrometastases: balanced
proliferation and apoptosis in the presence of angiogenesis
suppression. Nature Med. 1,149-153,
1995.
Hunter, D. R, y Haworth, R. A. The
Ca^{2+}-induced membrane transition in
mitochondria. I. The protective mechanisms. Arch. Biochem.
Biophys. 195, 453-459, 1979.
Majima, E. Yamaguchi, N.,
Chuman, H., Shinohara, Y., Ishida, M.,
Goto, S. y Terada, H. Binding of the fluorescein
derivative eosin Y to the mitochondrial ADP/ATP carrier:
characterization of the adenine nucleotide binding site.
Biochemistry 37, 424-432, 1998.
Nguyen, M., Shing, Y., y
Folkman, J. Quantitation of angiogenesis and antiangiogenesis
in the chick embryo chorioallantoic membrane. Microvascular
Res. 47, 31-40, 1994.
Oliver, M. H., Harrison, N. K.,
Bishop, J. E, Cole, P. J., y Laurent, G. J. A
rapid and convenient assay for counting cells cultured in microwell
plates: application for assessment of growth factors. J. Cell
Sci. 92, 513-518, 1989.
O'Reilly, M.S., Boehm, T.,
Shing, Y., Fukai, N., Vaslos, G., Lane,
W. S., Flynn, E., Birkhead, J. R., Olsen, B.
R., y Folkman J. Endostatin: an endogenous inhibitor of
angiogenesis and tumour growth. Cell 88,
277-285, 1997.
Petit, J. M., Maftah, A.,
Ratinaud, M. H., y Julien, R.
10N-nonyl acridine orange interacts with cardiolipin
and allows the quantification of this phospholipid in isolated
mitochondria. Eur. J. Biochem. 209, 267-273,
1992.
Schnaitman, C. y Greenawalt, J. W.
Enzymatic properties of the inner and outer membranes of rat liver
mitochondria. J. Cell Biol. 38, 158-75,
1968.
Smiley, S. T., Reers, M.,
Mottola-Hartshom, C., Lin, M,
Chen, A., Smith, T. W., Steele, G. D., y
Chen, L. B. Intracellular heterogeneity in mitochondrial
membrane potentials revealed by a
J-aggregate-forming lipophilic
cation JC-1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,
3671-3675, 1991.
Vanden Hoek, T. L., Becker, L. B.,
Shao, Z., Li C., y Schumacker, P. T. Reactive
oxygen species released from mitochondria during brief hypoxia
induce preconditioning in cardiomyocytes. J. Biol. Chem. 29,
18092-18098, 1998.
Zanetti, M., Zwacka, R. M.,
Engelhardt, J. F., Katusic, Z. S., y O'Brien,
T. Superoxide anions and endothelial cell proliferation in
normoglycemia and hyperglycemia. Arterioscler. Thromb. Vasc.
Biol. 21, 195-200, 2001.
Claims (25)
1. Un proceso in vitro para identificar
un compuesto que induzca selectivamente la transición de
permeabilidad mitocondrial (MPT) en células en proliferación, donde
dicho proceso comprende poner en contacto una célula o extracto
celular con un compuesto, determinar si el compuesto se une al
translocador de nucleótidos de adenina (ANT) y determinar si el
compuesto induce selectivamente la MPT en células en
proliferación.
2. Un proceso in vitro de acuerdo con la
reivindicación 1 para explorar una pluralidad de compuestos para
identificar un compuesto que induzca selectivamente la MPT en
células en proliferación, donde dicho proceso comprende poner en
contacto una célula o un extracto celular con la pluralidad de
compuestos, determinar si cualquiera de los compuestos se une a ANT
y, si es así, determinar por separado para cada uno de la pluralidad
de compuestos si el compuesto induce selectivamente la MPT en
células en proliferación.
3. Un proceso in vitro de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en el que la selectividad por células en
proliferación se determina por comparación del efecto de compuestos
que se ha identificado que se unen a ANT sobre la MPT en células en
proliferación con el efecto sobre la MPT en células que no están en
proliferación o de crecimiento en estado quiescente.
4. Un proceso in vitro de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en el que dicha determinación de la inducción
de la MPT implica medir cambios en la liberación de Citocromo C.
5. Un proceso in vitro de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en el que dicha determinación de la inducción
de la MPT implica medir cambios en la concentración celular de
superóxido.
6. Un proceso in vitro de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que el compuesto es
un compuesto reactivo de ditiol.
7. Un proceso in vitro de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el compuesto
tiene un resto arsenóxido (o equivalente de arsenóxido).
8. Un proceso in vitro de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que el compuesto es de la fórmula (I):
(I)A-[(XBX')_{n}B'-Y]_{p}
en la
que
A comprende al menos un grupo colgante;
(XBX')_{n}B' comprende un grupo enlazador
adecuado, donde X se selecciona entre el grupo que consiste en
-NR,
-S(O)-, -S(O)O-, -S(O)_{2}-, -S(O)_{2}O-, -C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-, C(S)O-, -C(S)S-, -P(O)(R_{1})- y -P(O)(R_{1})O-, o está ausente;
-S(O)-, -S(O)O-, -S(O)_{2}-, -S(O)_{2}O-, -C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-, C(S)O-, -C(S)S-, -P(O)(R_{1})- y -P(O)(R_{1})O-, o está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en
alquileno C_{1}-C_{10}, alquenileno
C_{2}-C_{10}, alquinileno
C_{2}-C_{10}, cicloalquileno
C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquileno
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenileno
C_{5}-C_{10}, arileno
C_{6}-C_{12}, heteroarileno y acilo
C_{2}-C_{10};
X' se selecciona entre el grupo que consiste en
-NR-, -O-, -S-, -Se-, -S-S-, S(O)-,
-OS(O)-, OS(O)O-, OS(O)_{2},
-OS(O)_{2}O-, -S(O)O-,
-S(O)_{2}-, -S(O)_{2}O-,
-OP(O)(R_{1})-, -OP(O)(R_{1})O-,
-OP(O)(R_{1})OP(O)(R_{1})O-,
-C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-,
C(S)O-, -C(S)S-, -P(O)(R_{1})-,
-P(O)(R_{1})O-, y
B' se selecciona entre el grupo que consiste en
alquileno C_{1}-C_{10}, alquenileno
C_{2}-C_{10}, alquinileno
C_{2}-C_{10}, cicloalquileno
C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquileno
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenileno
C_{5}-C_{10}, arileno
C_{6}-C_{12} y heteroarileno o está ausente; y
donde
cada R se selecciona independientemente entre el
grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo, OR_{2} y acilo
C_{2}-C_{10};
R' es igual que R o dos R^{1} pueden tomarse
junto con los átomos de nitrógeno a los que están unidos para formar
un anillo heterocíclico saturado o insaturado de 5 ó 6 miembros;
\global\parskip0.900000\baselineskip
cada R_{1} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo, halo, OR_{2} y
N(R)_{2};
cada R_{2} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo y
-C(O)R_{5};
cada R_{5} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo, alcoxi
C_{1}-C_{10}, alqueniloxi
C_{3}-C_{10}, alquiniloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, heteroariloxi, alquiltio
C_{1}-C_{10}, alqueniltio
C_{3}-C_{10}, alquiniltio
C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, heteroariltio, OH, SH y
N(R)_{2};
donde para cada caso en el que B y/o B' es
arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos de
arileno respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de
arsenóxido) pueden estar en una relación para-, meta- u orto-; y
donde cada alquileno, alquenileno, alquinileno,
-cicloalquileno, cicloalquenileno, heterocicloalquileno,
heterocicloalquenileno, arileno, heteroarileno y acilo puede estar
sustituido independientemente con hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo, ciano, cianato,
isocianato, OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido,
-S(O)R_{3}, -OS(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3}, -OS(O)_{2}R_{3},
-P(O)R_{4}R_{4},
-OP(O)R_{4}R_{4}, -N(R'')_{2},
-NRC(O)(CH_{2})_{m}Q,
-C(O)R_{5};
donde
R, R_{1} y R_{5} son como se han definido
anteriormente; y
R_{2a} se selecciona entre el grupo que
consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5},
alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3},
-P(O)(R_{4})_{2}, N(R)_{2} y
-C(O)R_{5};
cada R_{3} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo, alcoxi
C_{1}-C_{10}, alqueniloxi
C_{3}-C_{10}, alquiniloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, heteroariloxi, alquiltio
C_{1}-C_{10}, alqueniltio
C_{3}-C_{10}, alquiniltio
C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, heteroariltio y
N(R)_{2};
cada R_{4} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo. alcoxi
C_{1}-C_{10}, alqueniloxi
C_{3}-C_{10}, alquiniloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, heteroariloxi, alquiltio
C_{1}-C_{10}, alqueniltio
C_{3}-C_{10}, alquiniltio
C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, heteroariltio, halo y
N(R)_{2};
R_{6} se selecciona entre el grupo que
consiste en alquilo C_{1}-C_{10}, alquenilo
C_{2}-C_{10}, alquinilo
C_{2}-C_{10}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, heterocicloalquilo
C_{3}-C_{10}, heterocicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, heteroarilo, alquiltio
C_{1}-C_{10}, alqueniltio
C_{3}-C_{10}, alquiniltio
C_{3}-C_{10}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, tetracicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, heterocicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, heteroariltio,
-S(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3} y
-C(O)R_{5};
R'' es igual que R o dos R'' tomados junto con
el átomo de N al que están unidos pueden formar un sistema de anillo
heterocíclico saturado, insaturado o aromático;
Q se selecciona entre halógeno y
-OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se selecciona entre
alquilo C_{1}-C_{4}, perfluoroalquilo
C_{1}-C_{4}, fenilo,
p-metilfenilo; y
m es de 1 a 5,
n es un número entero de 0 a 20
Y comprende al menos un arsenóxido o equivalente
de arsenóxido;
p es un número entero de 1 a 10, y donde el
compuesto de fórmula (I) tiene más de 6 átomos de carbono.
\global\parskip1.000000\baselineskip
9. Un proceso in vitro de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que A se selecciona entre
el grupo que consiste en aminoácidos naturales,
no naturales y sintéticos, aminas hidrófilas, péptidos,
polipéptidos, restos de azúcar, oligosacáridos, y proteínas que
contienen tiol, restos de ácidos pequeños, restos que contienen
hidroxilo, o una combinación de los mismos.
10. Un proceso in vitro de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que dicha amina hidrófila se selecciona
entre alquilaminas primarias, arilaminas primarias, aralquilaminas
primarias, alquilaminas secundarias, arilaminas secundarias,
aralquilaminas secundarias, terciarias alquilaminas, arilaminas
terciarias y aralquilaminas terciarias y aminas heterocíclicas.
11. Un proceso in vitro de acuerdo con la
reivindicación 9 ó 10, en el que A se selecciona entre el grupo que
consiste en dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos, pentapéptidos,
glutatión, glucosamina, sacáridos, disacáridos, oligosacáridos,
donde el átomo de azufre de cada resto que contiene azufre puede
estar opcionalmente oxidado para formar un sulfóxido o sulfona.
12. Un proceso in vitro de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que A se selecciona entre un péptido que
comprende uno o más de cisteinilglicina, ácido cisteico, ácido
aspártico, ácido glutámico, lisina y arginina; glucosa, fructosa,
manosa, xilosa, lixosa, galactosa, hexosa, sacarosa, sorbosa,
galactosil-sacarosa, sorbitol, manitol y
xilitol.
13. Un proceso in vitro de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que
X se selecciona entre el grupo que consiste en
-C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-,
C(S)O- y -C(S)S-, o está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en
alquileno C_{1}-C_{5}, alquenileno
C_{2}-C_{5}, alquinileno
C_{2}-C_{5}, cicloalquileno
C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno
C_{5}-C_{10}, arileno
C_{6}-C_{12} y a;
X' se selecciona entre el grupo que consiste
en-O-, -S-, -NR-, -S-S-,
-S(O)-, -S(O)_{2}-, -P(O)(R_{1})-,
-OP(O)(R_{1})-, OP(O)(R_{1})O-,
-OP(O)(R_{1})OP(O)(R_{1})O-,
-C(O)-, -C(S)-, -C(O)O-,
C(S)O-, -C(S)S-,
n es 0, 1 ó 2; y
B' se selecciona entre el grupo que consiste en
alquileno C_{1}-C_{5}, alquenileno
C_{2}-C_{5}, alquinileno
C_{2}-C_{5}, cicloalquileno
C_{3}-C_{10}, cicloalquenileno
C_{5}-C_{10} y arileno
C_{6}-C_{12}, o está ausente; y donde
cada R se selecciona independientemente entre el
grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, OR_{2} y acilo
C_{2}-C_{10};
R' es el mismo que R;
cada R_{1} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, halo, OR_{2} y
N(R)_{2};
cada R_{2} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12} y -C(O)R_{5};
cada R_{5} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, alqueniloxi
C_{3}-C_{5}, alquiniloxi
C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi
C_{1}-C_{10}, cicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, alqueniltio
C_{3}-C_{5}, alquiniltio
C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, OH, SH y
N(R)_{2};
donde para cada caso en el que B y/o B' es
arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos de
arileno respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de
arsenóxido) pueden estar en una relación para-, meta- u orto-, y
donde cada alquileno, alquenileno, alquinileno,
cicloalquileno, cicloalquenileno, arileno y acilo puede estar
sustituido independientemente con hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, ciano, halo, cianato, isocianato,
OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido, -S(O)R_{3},
-OS(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3},
-OS(O)_{2}R_{3},
-P(O)R_{4}R_{4},
-OP(O)R_{4}R_{4}, -N(R'')_{2},
NRC(O)(CH_{2})_{m}Q,
-C(O)R_{5},
donde
\global\parskip0.950000\baselineskip
R, R_{1} y R_{5} son como se han definido
anteriormente; y
R_{2a} se selecciona entre el grupo que
consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5},
alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3},
-P(O)(R_{4})_{2}, N(R)_{2} y
-C(O)R_{5};
cada R_{3} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, alqueniloxi
C_{3}-C_{5}, alquiniloxi
C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, alqueniltio
C_{3}-C_{5}, alquiniltio
C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12} y N(R)_{2};
cada R_{4} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno , alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, alqueniloxi
C_{3}-C_{5}, alquiniloxi
C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, alqueniltio
C_{3}-C_{5}, alquiniltio
C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{5}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, halo y
N(R)_{2};
R_{6} se selecciona independientemente entre
el grupo que consiste en alquilo C_{1}-C_{5},
alquenilo C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, alqueniltio
C_{3}-C_{5}, alquiniltio
C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3} y -C(O)R_{5},
R'' es el mismo que R;
Q se selecciona entre el grupo que consiste en
halógeno y -OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se
selecciona entre alquilo C_{1}-C_{4},
perfluoroalquilo C_{1}-C_{4}, fenilo,
p-metilfenilo;
m es de 1 a 5.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Un proceso in vitro de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 en el que
X está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en
alquileno C_{1}-C_{5}, arileno
C_{6}-C_{12} y acilo
C_{2}-C_{5};;
X' se selecciona entre el grupo que consiste en
-O-, -S-, -NR-, -S-S-, -S(O)-,
-S(O)_{2}-, -P(O)(R_{1})-, -C(O)-,
-C(S)-, -C(O)O-, C(S)O-, -Se-
y
n es 0, 1 ó 2; y
B' es alquileno C_{1}-C_{5},
arileno C_{6}-C_{12} o está ausente; y donde
cada R se selecciona independientemente entre el
grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, OR_{2} y acilo
C_{2}-C_{5};
R' es el mismo que R;
cada R_{1} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, halo, OR_{2} y
N(R)_{2};
cada R_{2} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12} y -C(O)R_{5};
cada R_{5} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, alqueniloxi
C_{3}-C_{5}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniloxi
C_{5}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, alqueniltio
C_{3}-C_{5}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, cicloalqueniltio
C_{5}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, OH, SH y
N(R)_{2};
\global\parskip1.000000\baselineskip
donde para cada caso en el que B y/o B' es
arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos de
arileno respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de
arsenóxido) pueden estar en una relación para-, meta- u orto-, y
donde cada alquileno, alquenileno, alquinileno,
cicloalquileno, cicloalquenileno, arileno y acilo puede estar
sustituido independientemente con hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, halo, ciano, cianato, isocianato,
OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido, -S(O)R_{3},
-OS(O)R_{3}, -S(O)_{2}R_{3},
-OS(O)_{2}R_{3},
-P(O)R_{4}R_{4},
-OP(O)R_{4}R_{4}, -N(R'')_{2},
-NRC(O)(CH_{2})_{m}Q_{1},
-C(O)R_{5},
donde
R, R_{1} y R_{5} son como se han definido
anteriormente; y
R_{2a} se selecciona entre el grupo que
consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{3},
cicloalquilo C_{3}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3}, -P(O)(R_{4})_{2}
y -C(O)R_{5};
cada R_{3} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12} y N(R)_{2};
cada R_{4} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{3}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, cicloalquiloxi
C_{3}-C_{10}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, halo y
N(R)_{2};
R_{6} se selecciona entre el grupo que
consiste en alquilo C_{1}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, cicloalquiltio
C_{3}-C_{10}, ariltio
C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3} y -C(O)R_{5},
R'' es el mismo que R;
Q se selecciona entre halógeno y
-OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se selecciona entre
alquilo C_{1}-C_{4}, perfluoroalquilo
C_{1}-C_{4}, fenilo, p-metilfenilo;
m es de 1 a 5.
\vskip1.000000\baselineskip
15. Un proceso in vitro de acuerdo con
las reivindicaciones 8 a 14 en el que
X está ausente;
B se selecciona entre el grupo que consiste en
alquileno C_{1}-C_{5}, arileno
C_{6}-C_{12} y acilo
C_{2}-C_{5};
X' se selecciona entre el grupo que consiste en
-O-, -S-, -NR-, -C(O)- y -C(O)O-, o está
ausente;
n es 1; y
B' es alquileno C_{1}-C_{5},
arileno C_{6}-C_{12} o está ausente; y
R se selecciona entre el grupo que consiste en
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12} y acilo
C_{2}-C_{5};
donde para cada caso en el que B y/o B' es
arileno, los sustituyentes unidos directamente a los anillos de
arileno respectivos (incluyendo arsenóxido o equivalente de
arsenóxido) pueden estar en una relación para-, meta- u orto-, y
donde cada alquileno, arileno y acilo puede
estar sustituido independientemente con hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, alquenilo
C_{2}-C_{5}, alquinilo
C_{2}-C_{5}, cicloalquilo
C_{3}-C_{10}, cicloalquenilo
C_{5}-C_{10}, arilo
C_{6}-C_{12}, halo, ciano, cianato, isocianato,
OR_{2a}, SR_{6}, nitro, arsenóxido, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3}, -P(O)R_{4}R_{4},
-N(R'')_{2}, -NRC(O)(CH_{2})_{m}Q,
-C(O)R_{5},
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
donde
cada R se selecciona independientemente entre el
grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12} y acilo
C_{2}-C_{5};
R_{2a} se selecciona entre el grupo que
consiste en hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5},
arilo C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3}, -P(O)(R_{4})_{2}
y -C(O)R_{5}:
cada R_{3} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, y ariltio
C_{6}-C_{12};
cada R_{4} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, ariltio
C_{6}-C_{12}, halo y
N(R)_{2};
cada R_{5} se selecciona independientemente
entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo
C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, ariloxi
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, ariltio
C_{6}-C_{12}, OH, SH y
N(R)_{2};
R_{6} se selecciona entre el grupo que
consiste en alquilo C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12}, alquiltio
C_{1}-C_{5}, ariltio
C_{6}-C_{12}, -S(O)R_{3},
-S(O)_{2}R_{3} y -C(O)R_{5},
R'' es el mismo que el R anterior;
Q se selecciona entre halógeno y
-OS(O)_{2}Q_{1}; donde Q_{1} se selecciona entre
alquilo C_{1}-C_{4}, perfluoroalquilo
C_{1}-C_{4}, fenilo, p-metilfenilo; y
m es 2, 3, 4 ó 5.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Un proceso in vitro de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, en el que
X está ausente
B es acilo C_{2}-C_{5};
X' es NR;
n es 1;
B' es fenileno; y
R es H;
donde los sustituyentes unidos directamente al
anillo de fenileno pueden estar en una relación para-, meta u
orto-.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Un proceso in vitro de acuerdo con la
reivindicación 16 en el que dicho compuesto es:
donde R_{7} a R_{10} se
seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en
hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12}, halógeno, hidroxi, amino, nitro,
carboxi, alcoxi C_{1}-C_{5},
-OS(O)_{2}R_{3} y -NHC(O)CH_{2}Q
donde Q es halógeno, -OS(O)_{2}CH_{3},
-OS(O)_{2}C_{6}H_{5} y
-OS(O)_{2}-p-tolilo; y donde, cuando uno
cualquiera de R_{7} a R_{10} es alquilo
C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5}, -OS(O)_{2}R_{3},
es capaz de formar un anillo condensado con el fenileno; y donde,
además, al menos uno de R_{7} a R_{10} es alquilo
C_{1}-C_{5}, arilo
C_{6}-C_{12}, alcoxi
C_{1}-C_{5} o -OS(O)_{2}R_{3},
junto con al menos otro cualquiera de R_{7} a R_{10}, es capaz
de formar un anillo condensado con el
fenileno.
18. Un proceso in vitro de acuerdo con la
reivindicación 17 en el que R_{7} a R_{10} se seleccionan
independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno,
halógeno, hidroxi, amino, nitro, ciano, carboxi, alcoxi
C_{1}-C_{5}, metilo, etilo, isopropilo,
terc-butilo, fenilo y -NHC(O)CH_{2}Q
donde Q es halógeno, -OS(O)_{2}CH_{3},
-OS(O)_{2}C_{6}H_{5} y
-OS(O)_{2}-p-tolilo.
\global\parskip1.000000\baselineskip
19. Un proceso in vitro de acuerdo con la
reivindicación 16 ó 17 en el que el grupo arsenóxido (-As=O) está en
la posición 4 del anillo de fenileno.
20. Un proceso in vitro de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en el que el compuesto
se selecciona entre el grupo que consiste en:
21. Un proceso in vitro de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en el que el compuesto
se representa por la Fórmula VII:
en el que G se selecciona entre el
grupo que consiste en; hidrógeno, halógeno, hidroxi, amino, nitro,
carboxi, alcoxi C_{1}-C_{5}, alquilo
C_{1}-C_{5} y arilo
C_{6}-C_{12} y -NHC(O)CH_{2}Q
donde Q es halógeno, OS(O)_{2}CH_{3}
-OS(O)_{2}C_{6}H_{5} o
-OS(O)_{2}-p-tolilo.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Un proceso in vitro de acuerdo con la
reivindicación 21 en el que G se selecciona entre hidrógeno,
halógeno, hidroxi, amino, nitro, carboxi, alcoxi
C_{1}-C_{5}, metilo, etilo,
iso-propilo, terc-butilo, fenilo y
-NHC(O)CH_{2}Q donde Q es halógeno,
-OS(O)_{2}CH_{3},
-OS(O)_{2}C_{6}H_{5} o
-OS(O)_{2}-p-tolilo.
23. Un proceso in vitro de acuerdo con la
reivindicación 21 ó 22, en el que G se selecciona entre hidroxi,
flúor, amino y nitro.
24. Un proceso in vitro de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que el grupo
arsenóxido (-As=O) se reemplaza por un equivalente de arsenóxido
como se define en la presente memoria.
25. Un proceso in vitro de acuerdo con la
reivindicación 24, en el que el equivalente de arsenóxido es
cualquier especie reactiva de ditiol que muestra esencialmente la
misma afinidad para ditioles que para -As=O.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AU2002952526 | 2002-11-07 | ||
| AU2002952526A AU2002952526A0 (en) | 2002-11-07 | 2002-11-07 | Induction of the mitochondrial permeability transition |
| AU2003906109A AU2003906109A0 (en) | 2003-11-05 | A Substantially Cell Membrane Impermeable Arsenoxide Compound and Use Thereof | |
| AU2003906109 | 2003-11-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2330519T3 true ES2330519T3 (es) | 2009-12-11 |
Family
ID=32313402
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03810339T Expired - Lifetime ES2330519T3 (es) | 2002-11-07 | 2003-11-07 | Inducion de la transicion de permeabilidad mitocondrial. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20060166208A1 (es) |
| EP (2) | EP1563099B1 (es) |
| JP (1) | JP4426456B2 (es) |
| CN (1) | CN101863958B (es) |
| AT (1) | ATE437239T1 (es) |
| CA (1) | CA2504935C (es) |
| DE (1) | DE60328513D1 (es) |
| ES (1) | ES2330519T3 (es) |
| HK (2) | HK1073868A1 (es) |
| WO (1) | WO2004042079A1 (es) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPR874601A0 (en) * | 2001-11-08 | 2001-11-29 | Unisearch Limited | Selective targeting of apoptotic cells |
| WO2003057012A2 (en) | 2002-01-07 | 2003-07-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | S-dimethylarsino-thiosuccinic acid s-dimethylarsino-2-thiobenzoic acid s-(dimethylarsino) glutathione as treatments for cancer |
| DE60328513D1 (de) | 2002-11-07 | 2009-09-03 | Newsouth Innovations Pty Ltd | Induktion der mitochondrialen permeabilitätstransition |
| EP1961824A4 (en) * | 2005-12-14 | 2009-04-08 | Univ Kyushu Nat Univ Corp | MONITORING INTRA-CELLULAR MITOCHONDRIAL LOCALIZATION |
| US8268883B2 (en) * | 2006-11-01 | 2012-09-18 | Newsouth Innovations Pty Limited | Organo-arsenoxide compounds and use thereof |
| ES2684322T3 (es) * | 2006-11-08 | 2018-10-02 | Molecular Insight Pharmaceuticals, Inc. | Heterodímeros de ácido glutámico |
| WO2009043114A1 (en) * | 2007-10-04 | 2009-04-09 | Newsouth Innovations Pty Limited | Arsenoxide compound and method of use |
| EP2073004A1 (en) * | 2007-12-19 | 2009-06-24 | Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Electrophoretic analysis of isolated mitochondria for the detection of cell or tissue damage |
| ITRM20120058A1 (it) * | 2012-02-20 | 2013-08-21 | Pisanelli Giovanni Codacci | Famiglia di molecole a base di zuccheri ad uso terapeutico e relativo procedimento di produzione |
| US10113968B2 (en) * | 2013-12-03 | 2018-10-30 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Specific detection and quantification of cardiolipin and isolated mitochondria by positively charged AIE fluorogens and method of manufacturing thereof |
| JP6468781B2 (ja) * | 2014-10-02 | 2019-02-13 | 株式会社ヘルスケアシステムズ | ミトコンドリア膜透過性の評価方法、ミトコンドリア膜透過性の亢進を抑制する物質のスクリーニング方法、ミトコンドリア膜透過性を亢進する物質のスクリーニング方法、及びミトコンドリア膜透過性の亢進抑制剤 |
| MX2020002273A (es) * | 2017-10-17 | 2020-09-21 | Univ Wollongong | Agente anti-cancer. |
| TWI841540B (zh) * | 2018-10-29 | 2024-05-11 | 伍倫貢大學 | 抗癌劑及其之藥學組合物和用途 |
| EP3733197A1 (en) * | 2019-04-30 | 2020-11-04 | Stephen N. Pitcher | Anaerobic antioxidant composition |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2370092A (en) * | 1942-05-04 | 1945-02-20 | Parke Davis & Co | Organic amine derivatives and method of obtaining same |
| US2409291A (en) * | 1942-05-19 | 1946-10-15 | Squibb & Sons Inc | Chemotherapeutic sulfanilamide derivatives |
| US2465308A (en) * | 1946-11-27 | 1949-03-22 | Hoffmann La Roche | Arsenoso compounds and method of preparation |
| US2664432A (en) * | 1947-01-28 | 1953-12-29 | Ernst A H Friedheim | Heterocyclic metal and sulfur organic compounds |
| US2553515A (en) * | 1948-12-11 | 1951-05-15 | Hoffmann La Roche | N-(p-arsenoso-benzyl)-urea |
| US2951766A (en) * | 1957-07-15 | 1960-09-06 | Le Roy A White | Antiseptic plastic |
| BE786573A (fr) | 1971-07-20 | 1973-01-22 | Hoechst Ag | Medicament a base de composes arsenicaux organiques et de derives du benzimidazole |
| FR2640269B1 (fr) * | 1988-12-13 | 1991-03-15 | Maes Ludo | Composes organometalliques, leurs modes de preparation et compositions pharmaceutiques les contenant |
| US5270196A (en) * | 1989-10-20 | 1993-12-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Arylsulfatase from streptomyces |
| FR2684382B1 (fr) * | 1991-12-02 | 1994-10-21 | Rhone Merieux | Medicaments et preparations pures de dichlorhydrate de melarsomine, leur procede d'obtention et produits intermediaires obtenus. |
| CA2290005A1 (en) | 1997-05-14 | 1998-11-19 | Science & Technology Corporation @ Unm | Inhibition of cell surface protein disulfide isomerase |
| EP1391206B1 (en) | 1997-10-15 | 2008-07-02 | Polarx Biopharmaceuticals, Inc. | Pharmaceutical compositions comprising arsenic trioxide for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma |
| CN1233476A (zh) | 1998-04-24 | 1999-11-03 | 陆道培 | 治疗急性白血病的药物及其制备方法 |
| FR2781674B1 (fr) | 1998-07-31 | 2002-06-28 | Inst Nat Sante Rech Med | Utilisation de nouveaux agents inducteurs de mort cellulaire en synergie avec les interferons |
| IL142895A0 (en) * | 1998-11-03 | 2002-04-21 | Mitokor | Adenine nucleotide translocator polyptides |
| US6191123B1 (en) | 1999-03-19 | 2001-02-20 | Parker Hughes Institute | Organic-arsenic compounds |
| WO2000079274A2 (en) * | 1999-06-22 | 2000-12-28 | Mitokor | Methods for assaying subcellular conditions using energy transfer |
| AUPQ296799A0 (en) * | 1999-09-20 | 1999-10-14 | Unisearch Limited | A cell-membrane impermeable trivalent organoarsenical derivative and use thereof |
| AUPR379801A0 (en) | 2001-03-19 | 2001-04-12 | Unisearch Limited | Use of a substantially cell membrane impermeable compound for treating arthritis |
| AUPR598901A0 (en) | 2001-06-28 | 2001-07-19 | Unisearch Limited | Inhibition of angiogenesis by targeting protein tyrosine phosphatases |
| AUPR874601A0 (en) * | 2001-11-08 | 2001-11-29 | Unisearch Limited | Selective targeting of apoptotic cells |
| DE60328513D1 (de) | 2002-11-07 | 2009-09-03 | Newsouth Innovations Pty Ltd | Induktion der mitochondrialen permeabilitätstransition |
| US8268883B2 (en) | 2006-11-01 | 2012-09-18 | Newsouth Innovations Pty Limited | Organo-arsenoxide compounds and use thereof |
-
2003
- 2003-11-07 DE DE60328513T patent/DE60328513D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-07 EP EP03810339A patent/EP1563099B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-07 AT AT03810339T patent/ATE437239T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-11-07 EP EP09004714.3A patent/EP2088206B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-07 ES ES03810339T patent/ES2330519T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-11-07 US US10/534,922 patent/US20060166208A1/en not_active Abandoned
- 2003-11-07 JP JP2004548941A patent/JP4426456B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-11-07 CN CN2010101672934A patent/CN101863958B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-11-07 WO PCT/AU2003/001483 patent/WO2004042079A1/en active Application Filing
- 2003-11-07 CA CA2504935A patent/CA2504935C/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-08-18 HK HK05107207.9A patent/HK1073868A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2005-08-18 HK HK09111659.0A patent/HK1132015A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-10-25 US US14/063,748 patent/US9353152B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20140121165A1 (en) | 2014-05-01 |
| CA2504935C (en) | 2012-04-10 |
| EP2088206A3 (en) | 2009-09-16 |
| WO2004042079A1 (en) | 2004-05-21 |
| EP1563099A4 (en) | 2008-03-12 |
| US9353152B2 (en) | 2016-05-31 |
| ATE437239T1 (de) | 2009-08-15 |
| EP2088206B1 (en) | 2013-07-03 |
| JP4426456B2 (ja) | 2010-03-03 |
| JP2006518986A (ja) | 2006-08-24 |
| HK1073868A1 (en) | 2005-10-21 |
| EP1563099B1 (en) | 2009-07-22 |
| EP1563099A1 (en) | 2005-08-17 |
| CA2504935A1 (en) | 2004-05-21 |
| CN101863958A (zh) | 2010-10-20 |
| HK1132015A1 (en) | 2010-02-12 |
| CN101863958B (zh) | 2012-07-18 |
| DE60328513D1 (de) | 2009-09-03 |
| US20060166208A1 (en) | 2006-07-27 |
| EP2088206A2 (en) | 2009-08-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9353152B2 (en) | Induction of the mitochondrial permeability transition | |
| US11084932B2 (en) | Phenylethynylnaphthalene dyes and methods for their use | |
| Liu et al. | Zinc (II) complexes containing bis-benzimidazole derivatives as a new class of apoptosis inducers that trigger DNA damage-mediated p53 phosphorylation in cancer cells | |
| ES2239037T3 (es) | Metodos y composiciones para inhibir la deteccion del ciclo celular en g2 y sensibilizar celulas a agentes dañinos del dna. | |
| ES2733357B2 (es) | Compuesto para la deteccion de celulas senescentes y uso del mismo | |
| Czupiel et al. | Cationic block amphiphiles show anti-mitochondrial activity in multi-drug resistant breast cancer cells | |
| ES2886642T3 (es) | Factor antisecretor 17 | |
| Radford et al. | Peptide targeting of fluorescein-based sensors to discrete intracellular locales | |
| Moller et al. | Indicator dyes as probes of electrostatic potential changes on macromolecular surfaces | |
| AU2003275772B2 (en) | Induction of the mitochondrial permeability transition | |
| AU2008200304B2 (en) | Induction of the mitochondrial permeability transition | |
| ES2923022T3 (es) | Agentes que inhiben Ngly1 y métodos de uso de los mismos | |
| EP1476576B1 (en) | Fluorogenic dyes | |
| Ji et al. | Double-component diazeniumdiolate derivatives as anti-cancer agents | |
| WO2009106665A1 (es) | Agentes de etiquetado doble basados en vinilsulfona | |
| ES2448804T3 (es) | Un péptido monofosforilado aislado derivado de alfa-enolasa humana útil para diagnóstico y tratamiento del adenocarcinoma pancreático, anticuerpos dirigidos contra dicho péptido monofosforilado, y sus usos | |
| US10941435B2 (en) | Methods and compositions for detecting or measuring caspases or apoptosis | |
| Oliveira et al. | Improvement of the pharmacological properties of amidated kyotorphin by means of iodination | |
| McNulty et al. | Tissue distribution of GAP1IP4BP and GAP1m: Two inositol 1, 3, 4, 5-tetrakisphosphate-binding proteins | |
| Li et al. | A novel MMP-9 inhibitor exhibits selective inhibition in non-small-cell lung cancer harboring EGFR T790M mutation by blocking EGFR/STAT3 signaling pathway | |
| Eggena et al. | Synthesis and characterization of a long-acting fluorescent analog of vasotocin | |
| Anand et al. | The Multicellular Effects of VDAC1 N-Terminal-Derived Peptide. Biomolecules 2022, 12, 1387 | |
| PL235564B1 (pl) | Zastosowanie białek z grupy ALKBH w sposobie diagnozowania chorób nowotworowych in vitro oraz pochodne antrachinonu do zastosowania do leczenia lub zapobiegania rozwojowi nowotworu nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego | |
| Wang | Fluorescent Probes with N2O‑Type Benzopyrromethene Boron Complexes for Imaging Biological Microenvironment | |
| AU2005201144B9 (en) | A substantially cell membrane impermeable compound and use thereof |