ES2328579T3 - Derivados de insulina de larga duracion y procedimientos asociados. - Google Patents
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Abstract
Un derivado de insulina que comprende una molécula de insulina y un grupo reactivo para unir covalentemente un componente sanguíneo, siendo dicho grupo reactivo un grupo que contiene maleimido, y en el que el grupo reactivo está acoplado a un grupo amino disponible de la molécula de insulina seleccionado de los grupos alfa-amino de los aminoácidos del extremo N-terminal de las cadenas A y B y el grupo épsilon-amino de Lys B29.
Description
Derivados de insulina de larga duración y
procedimientos asociados.
La presente invención se refiere a un derivado
de insulina de larga duración. Más particularmente, el derivado de
insulina comprende una molécula de insulina y un grupo reactivo
acoplado a la misma, siendo el grupo reactivo para unir
covalentemente un componente sanguíneo generando por tanto un
derivado de insulina de larga duración.
La insulina es una hormona endocrina vital que
se une a un receptor de la superficie celular dando lugar a una
cascada de acontecimientos que culminan con la absorción de glucosa
desde la sangre. Niveles alterados de insulina conducen a graves
trastornos tales como diabetes tipos I y II. La diabetes tipo I es
una enfermedad potencialmente mortal en la que el paciente debe
autoadministrarse diariamente múltiples dosis de insulina para su
supervivencia. La diabetes tipo II es también una grave enfermedad
médica en la que los niveles endógenos de insulina ya no pueden
mantener niveles correctos de glucemia para el paciente debido a una
tolerancia desarrollada por el paciente a niveles endógenos de
insulina. Con el fin de reducir la aparición de consecuencias a
largo plazo, se hace necesario un tratamiento con insulina tras el
fallo en el cambio de estilo de vida o cuando los fármacos
tradicionales que controlan la glucemia se vuelven ineficaces.
El éxito en el control del trastorno glucémico
está sumamente relacionado con la conformidad de los pacientes con
el tratamiento, y es deseable reducir la frecuencia de inyección
necesaria. Para hacer esto, sería sumamente deseable disponer de un
nuevo derivado de insulina de larga duración.
Jonassen et al Fatty acid acylated
insulins display protracted action due to binding serum albumin'
Peptide Science: Present and Future, proceedings of the
international peptide symposium (1999) 674-677, dan
a conocer un derivado de insulina en el que un aminoácido lisina en
la posición B29 está selectivamente acilado mediante ácidos grasos.
Como resultado, se encuentra que el derivado de insulina tiene una
afinidad de unión aumentada por la albúmina sérica humana.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la presente invención, se proporciona un
derivado de insulina que comprende una molécula de insulina y un
grupo reactivo para unir covalentemente un componente sanguíneo,
siendo dicho grupo reactivo un grupo que contiene maleimido, y en
el que el grupo reactivo está acoplado a un grupo amino disponible
de la molécula de insulina que se selecciona de los grupos
\alpha-amino de los aminoácidos del extremo
N-terminal de las cadenas A y B o un grupo
\varepsilon-amino de Lys B29.
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(Fórmula pasa a página
siguiente)
\newpage
En una realización preferida de la presente
invención, la molécula de insulina es de fórmula I:
y el grupo reactivo está acoplado a
un aminoácido de la molécula de insulina en una posición
seleccionada de las posiciones Gly A1, Phe B1 y Lys
B29.
En una realización preferida de la presente
invención, el grupo reactivo es MPA (ácido
3-maleimidopropiónico).
En una realización preferida de la presente
invención, el grupo reactivo está acoplado a un aminoácido de la
molécula de insulina mediante un conector, tal como, pero sin
limitarse a etilendiamina (EDA), ácido
2-[2-(2-amino)etoxi)]etoxi-acético
(AEEA), AEEA-AEEA,
-NH_{2}-(CH_{2})_{n}-COOH en el que n
es un número entero entre 1 y 20 y un motivo de cadena de alquilo
(C1-C10) saturada o insaturada en la que podrían
incorporarse átomos de oxígeno, nitrógeno o azufre, tales como,
pero sin limitarse a glicina, ácido
3-aminopropiónico (APA), ácido
8-aminooctanoico (OA) y ácido
4-aminobenzoico (APhA) y combinación de los
mismos.
En una realización preferida de la presente
invención, el componente sanguíneo es una proteína sanguínea, más
preferiblemente es albúmina sérica.
Según la presente invención, se proporciona un
conjugado de insulina que comprende un derivado de insulina de la
presente invención y un componente sanguíneo, en el que el grupo
reactivo y el componente sanguíneo están conjugados a través de un
enlace covalente formado entre dicho grupo reactivo y dicho
componente sanguíneo. Este conjugado se forma in vivo o
ex vivo.
Según la presente invención, se proporciona una
composición farmacéutica que comprende el derivado de insulina de
la presente invención en asociación con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Según la presente invención, se proporciona una
composición farmacéutica que comprende el conjugado de insulina de
la presente invención en asociación con un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Según la presente invención, se proporciona un
procedimiento para tratar un trastorno o una enfermedad relacionado
con la glucemia en un sujeto que padece dicho trastorno o dicha
enfermedad relacionada con la glucemia, que comprende administrar
al menos uno de los derivados de insulina de la presente invención,
el conjugado de la presente invención y las composiciones
farmacéuticas de la presente invención al sujeto.
La figura 1 ilustra del ejemplo I al ejemplo
VIII derivados de insulina humana nativa;
la figura 2 ilustra la unión competitiva de
insulina, derivados de insulina y conjugado de derivados de insulina
sobre la membrana del hígado de ratas wistar;
la figura 3 ilustra la unión competitiva de
insulina, derivados de insulina y conjugado de derivados de insulina
sobre membranas de hígado de ratas wistar;
las figuras 4A, 4B, 4C, 5A, 5B, 6A, 6B presentan
diversas fases de estadios de diferenciación de adipocitos 3T3
L1;
la figura 7 ilustra el transporte de glucosa en
adipocitos 3T3-L1 para la insulina, ejemplo III y IV
y su conjugado correspondiente;
la figura 8 ilustra el transporte de glucosa en
células grasas del epidídimo de adipocitos de ratas wistar para la
insulina, ejemplo III y VI y su conjugado correspondiente;
la figura 9 ilustra la delta glucemia en función
del tiempo en animales tratados con insulina a 3,6 mg/kg;
la figura 10 ilustra la delta glucemia en
función del tiempo en animales tratados con derivados de insulina
de los ejemplos I, II y III a 3,6 mg/kg;
la figura 11 ilustra la delta glucemia en
función del tiempo en animales tratados con derivados de insulina
de los ejemplos I, II y III a 17,9 mg/kg;
la figura 12 ilustra la delta glucemia en
función del tiempo en animales tratados con insulina y derivado de
insulina del ejemplo I a 3,6 mg/kg y derivado de insulina del
ejemplo I a 17,9 mg/kg;
la figura 13 ilustra la delta glucemia en
función del tiempo en animales tratados con insulina y derivado de
insulina del ejemplo II a 3,6 mg/kg y derivado de insulina del
ejemplo II a 17,9 mg/kg;
la figura 14 ilustra la delta glucemia en
función del tiempo en animales tratados con insulina y derivado de
insulina del ejemplo III a 3,6 mg/kg y derivado de insulina del
ejemplo III a 17,9 mg/kg;
la figura 15 ilustra el perfil farmacocinético
de la insulina nativa inyectada por vía subcutánea y por vía
intravenosa;
la figura 16 ilustra el perfil farmacocinético
del conjugado del ejemplo III inyectado por vía subcutánea y por
vía intravenosa;
la figura 17 ilustra el perfil farmacocinético
del ejemplo III inyectado por vía subcutánea y por vía
intravenosa;
la figura 18 ilustra el perfil farmacocinético
comparativo de la insulina, ejemplo III y el conjugado del ejemplo
III inyectados por vía subcutánea;
la figura 19 ilustra el perfil farmacocinético
comparativo de la insulina, ejemplo III y el conjugado del ejemplo
III inyectados por vía intravenosa;
la figura 20 ilustra el perfil farmacodinámico
comparativo tras inyecciones subcutáneas de insulina, ejemplo I a
IV y vehículo en rata diabética inducida con estreptozocina;
la figura 21 ilustra el perfil farmacodinámico
comparativo tras inyecciones subcutáneas de insulina, el conjugado
del ejemplo I a IV y vehículo en rata diabética inducida con
estreptozocina;
la figura 22 ilustra el perfil farmacodinámico
comparativo de inyecciones subcutáneas repetidas de ejemplo II I
(día 1 frente a día 6 frente a día 12 frente a control); y
la figura 23 ilustra el perfil farmacodinámico
comparativo de inyecciones subcutáneas repetidas del conjugado del
ejemplo III (día 1 frente a día 6 frente a día 12 frente a
control).
\vskip1.000000\baselineskip
Según la presente invención, se proporciona un
derivado de insulina de larga duración. Más particularmente, el
derivado de insulina comprende una molécula de insulina y un grupo
reactivo acoplado a la misma, siendo el grupo reactivo para unir
covalentemente un componente sanguíneo. En la presente solicitud, se
pretende que la unión covalente, que da como resultado la formación
de un conjugado de insulina-grupo
reactivo-componente sanguíneo pueda formarse in
vivo tras la administración del derivado de insulina de la
presente invención. Se pretende también que la unión covalente
pueda producirse ex vivo poniendo en contacto el derivado de
insulina de la presente invención con una fuente de albúmina que
puede ser albúmina recombinante, o extraída del plasma de un
sujeto, o que se proporciona a partir de cualquier otra fuente
adecuada, fuente que podría conocer un experto en la técnica.
La molécula de insulina puede ser insulina
humana nativa. (Véase la secuencia de la insulina humana nativa a
continuación en la fórmula I) o un análogo de la misma tal como una
molécula de insulina con sustitución/sustituciones de aminoácidos,
deleción/deleciones de aminoácidos o adición/adiciones de
aminoácidos. Lo siguiente se enumera como ejemplos de análogo de
insulina que puede usarse según la presente invención sin intención
de limitar el presente análogo de ninguna manera: insulina glargina
denominada Lantus® de Aventis Pharmaceuticals Inc., que tiene una
glicina sustituida en la posición A21 y dos residuos de arginina
añadidos en el extremo C-terminal de la de la
cadena B; insulina detemir denominada Levemir® de Novo Nordisk A/S,
que es una insulina humana nativa en la que se deleciona la
treonina en la posición B30 y se añade tetradecanoil en la cadena
lateral de la lisina B29; insulina lispro denominada Humalog® de
Eli Lilly, que es insulina humana Lys B28, Pro B29; insulina aspart
denominada NovoLog® de Novo Nordisk A/S, que es insulina humana Asp
B28; e insulina glulisina denominada Apidra® de Aventis, que es
insulina humana Lys B3, Glu B29.
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El grupo reactivo puede acoplarse a diferentes
funcionalidades en la molécula de insulina o análogo de la misma.
Preferiblemente, el grupo reactivo está acoplado a un grupo amino
disponible de la molécula de insulina, tal como los grupos
a-amino del aminoácido del extremo N-terminal
de las cadenas A y B o el grupo \varepsilon-amino
de Lys B29. Según la invención, el análogo de insulina que contiene
aminoácido(s) sustituido(s) y/o añadido(s)
puede contener un grupo amino adicional para acoplar el grupo
reactivo; u otras funcionalidades apropiadas para acoplar el grupo
reactivo al mismo. Grupos reactivos preferidos que pueden unirse
covalentemente a un componente sanguíneo in vivo o ex
vivo, son aceptores de Michael (resto carbonilo
\alpha,\beta-insaturado), grupos que contienen
succinimidilo y grupos que contienen maleimido. El grupo reactivo
más preferido es un grupo que contiene maleimido, y más
particularmente MPA (ácido
3-maleimidopropiónico).
Opcionalmente, el grupo reactivo está acoplado
opcionalmente a la molécula de insulina mediante un conector. El
conector se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en
motivos de hidroxietilo tales como ácido
(2-amino)etoxi-acético (AEA),
etilendiamina (EDA), ácido
amino-etoxi-etoxi-succinímico
(AEES), ácido
2-[2-(2-amino)etoxi)]etoxi-acético
(AEEA), AEEA-AEEA,
-NH_{2}-(CH_{2})_{n}-COOH en el que n
es un número entero desde 1 hasta 20; una o más cadenas de alquilo
(C1-C10) saturadas o insaturadas en las que podrían
incorporarse motivos con átomos de oxígeno, nitrógeno o azufre
tales como glicina, ácido 3-aminopropiónico (APA),
ácido 8-aminooctanoico (OA), ácido
4-aminobenzoico (APhA). Los ejemplos de
combinaciones de conectores incluyen, sin limitaciones,
AEEA-EDA, AEEA-AEEA,
AEA-AEEA, AEES-AEES y similares. El
conector preferido es el ácido 8-aminooctanoico
(AOA) o el uso de ningún conector con el grupo reactivo MPA. Un
experto en la técnica conocería fácilmente qué tipo de conector es
adecuado para el fin de la presente invención.
La presente invención también se refiere a un
conjugado de insulina. El conjugado comprende un derivado de
insulina en el que su grupo reactivo ha reaccionado con un
componente sanguíneo in vivo o ex vivo de modo que se
forma un enlace covalente. Por tanto, el conjugado puede formarse
in vivo mediante la administración del derivado de insulina,
o ex vivo poniendo en contacto el derivado de insulina con
una disolución sanguínea o componentes sanguíneos purificados ex
vivo en condiciones que permiten la formación del enlace
covalente. Pueden proporcionarse componentes sanguíneos purificados
mediante extracción y purificación a partir de una muestra de
sangre o producirse mediante técnicas recombinantes. El componente
sanguíneo preferido es una proteína sanguínea, y más
preferiblemente, albúmina sérica.
La presente invención se refiere además a un
procedimiento para tratar trastornos o enfermedades relacionados
con la glucemia, que comprende la administración de los derivados de
insulina o conjugados de insulina. Los trastornos o las
enfermedades relacionados con la glucemia incluyen diabetes de tipo
I y II y diabetes gestacional. Se sabe también que la insulina es
un factor de crecimiento y por tanto los derivados de insulina o
conjugados de insulina de la presente invención pueden ser útiles
en administración tópica para curar heridas y otras indicaciones
relacionadas.
Los siguientes ejemplos son para el fin de
ilustrar adicionalmente la invención tal como se describió
anteriormente en vez de para el fin de limitar el alcance de la
presente invención.
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La figura 1 ilustra la molécula de insulina y
los sitios Gly A1, Phe B1 y Lys B29 a los que se hace referencia a
lo largo de los siguientes ejemplos.
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Se disolvió insulina (100 mg) en DMF
(dimetilformamida) (2 ml) y TFA (100 ul). A la disolución, se le
añadieron NMM (4-metilmorfolina, 200 ul) y
MPA-OSu (3-maleimidopropanoato de
N-succinimidilo, 9,2 mg, 2,5 equivalentes) y se
agitó la reacción durante 2 h. Se extinguió la reacción mediante
adición de agua y se ajustó a pH 4 con AcOH (ácido acético). Se
añadió acetonitrilo para disolver el precipitado y el volumen total
de agua/acetonitrilo (3:1) era de 20 ml. Se inyectó la disolución
en una HPLC semi-preparativa. Columna Phenomenex
Luna fenil-hexilo 10 m de 21 mm X 250 mm
equilibrada con una disolución acuosa de TFA (TFA al 0,1% en
H_{2}O, disolvente A) y una disolución de TFA en acetonitrilo
(TFA al 0,1% en acetonitrilo, disolvente B). Se logró la elución a
9,5 ml/min. haciendo pasar un gradiente del 27% al 31% de B a lo
largo de 120 min. Se detectaron las fracciones que contenían
péptidos mediante absorbancia UV a 214 nm y 254 nm. Se recogieron
las fracciones en alícuotas de 9,5 ml. Se identificaron las
fracciones que contenían el perfil de producto deseado mediante
detección de masa tras inyección directa sobre CL/EM. Se recogieron
las fracciones puras a Rt = 36-46 min., se
combinaron y se liofilizaron dando un polvo blanco (40 mg) junto
con 23 mg de insulina recuperada.
La masa calculada es de 5958,5 g/mol, y la
medida mediante CL-EM es de 5958,0 g/mol.
La tabla 1 muestra el análisis de la secuencia
de aminoácidos (degradación de Edman usando isotiocianato de
fenilo) que se realizó para confirmar que el extremo
N-terminal de la cadena A estaba bloqueado y que el
extremo N-terminal de la cadena B (fenilalanina)
estada todavía libre.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió insulina (100 mg) en DMSO
(dimetilsulfóxido) (4 ml) y Et_{3}N (trietilamina) (100 ul) con
sonicación. A la disolución, se le añadió Boc_{2}O (dicarbonato
de di-terc-butilo) (9,3 mg, 2,5
equivalentes) y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante
30 min. Se extinguió la reacción mediante adición de agua (15 ml) y
acetonitrilo (5 ml) y se ajustó la disolución a pH 4 con AcOH. Se
inyectó la disolución en una HPCL semi-preparativa.
Columna Phenomenex Luna fenil-hexilo 10 m de 21 mm X
250 mm equilibrada con una disolución acuosa de TFA (TFA al 0,1% en
H_{2}O, disolvente A) y una disolución de TFA en acetonitrilo (TFA
al 0,1% en acetonitrilo, disolvente B). Se logró la elución a 9,5
ml/min. haciendo pasar un gradiente del 27% al 40% de B a lo largo
de 120 min. Se detectaron las fracciones que contenían péptidos
mediante absorbancia UV a 214 nm y 254 nm. Se recogieron las
fracciones en alícuotas de 9,5 ml. Se identificaron las fracciones
que contenían el perfil de producto deseado mediante detección de
masa tras inyección directa sobre CL/EM. Se aislaron tres productos
(Boc-insulina, Gly A1 Lys
B29-BisBoc-insulina y
TrisBoc-insulina) y se combinaron las fracciones de
(GlyA1 Lys B29)-BisBoc-insulina
deseadas y se liofilizaron dando un polvo blanco (72 mg).
Se hizo reaccionar (Gly A1 Lys
B29)-BisBoc-insulina (51 mg) en DMF
(3 ml) con MPA-OSu (36 mg) en presencia de
Et_{3}N (30 ul). Se agitó la reacción durante 2 h a temperatura
ambiente. Se evaporó la DMF mediante un a vacío. Se trató el
residuo con TFA (2 ml) durante 10 min. y luego se evaporó el TFA. Se
disolvió el producto bruto en agua/acetonitrilo (3:1) y se inyectó
la disolución en una HPCL semi-preparativa. Columna
Phenomenex Luna fenil-hexilo 10 m de 21 mm X 250 mm
equilibrada con una disolución acuosa de TFA (TFA al 0,1% en
H_{2}O, disolvente A) y una disolución de TFA en acetonitrilo
(TFA al 0,1% en CH3CN, disolvente B). Se logró la elución a 9,5
ml/min. haciendo pasar un gradiente del 27% al 32% de B a lo largo
de 120 min. Se detectaron las fracciones que contenían péptidos
mediante absorbancia UV a 214 nm y 254 nm. Se recogieron las
fracciones en alícuotas de 9,5 ml. Se identificaron las fracciones
que contenían el perfil de producto deseado mediante detección de
masa tras inyección directa sobre CL/EM. Se combinaron las
fracciones puras y se liofilizaron dando un polvo blanco (29
mg).
La masa calculada es de 5958,5 g/mol, y la
medida mediante CL-EM es de 5958,4 g/mol.
Se usó el análisis de la secuencia de
aminoácidos (degradación de Edman usando isotiocianato de fenilo)
para confirmar que el extremo N-terminal de la
cadena B estaba bloqueado y que el extremo
N-terminal de la cadena A (glicina) estaba todavía
libre (véase la tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se hizo reaccionar (Gly A1 Lys
B29)-BisBoc-insulina (39 mg) en DMF
(3 ml) y Et_{3}N (30 ul) con
MPA-OA-OSu
([8-N-(3-maleimidopropanilcarbonil)aminooctanoato
de N-succinimidilo] 25 mg) durante 4 h. Se evaporó
la DMF y se trató el residuo con TFA durante 10 min. Tras la
evaporación del TFA, se disolvió el residuo en agua/acetonitrilo
(1:3). Se inyectó la disolución en una HPCL
semi-preparativa. Columna Phenomenex Luna
fenil-hexilo 10 m de 21 mm X 250 mm equilibrada con
una disolución acuosa de TFA (TFA al 0,1% en H_{2}O, disolvente A)
y una disolución de TFA en acetonitrilo (TFA al 0,1% en
acetonitrilo, disolvente B). Se logró la elución a 9,5 ml/min.
haciendo pasar un gradiente del 27% al 36% de B a lo largo de 120
min. Se detectaron las fracciones que contenían péptidos mediante
absorbancia UV a 214 nm y 254 nm. Se recogieron las fracciones en
alícuotas de 9,5 ml. Se identificaron las fracciones que contenían
el perfil de producto deseado mediante detección de masa tras
inyección directa sobre CL/EM. Se combinaron las fracciones puras y
se liofilizaron dando un polvo blanco (21 mg).
La masa calculada es de 6099,5 g/mol, y la
medida mediante CL-EM es de 6099,6 g/mol.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió insulina (74 mg) en DMSO (2 ml) y
AcOH (46 ul). A la disolución se le añadió Boc_{2}O (6,9 mg, 2,5
equivalentes) y se agitó la reacción durante 5 h a temperatura
ambiente. Se añadieron agua (15 ml) y acetonitrilo (5 ml) y se
inyectó la disolución en una columna de HPCL
semi-preparativa (C18 fenil-hexilo)
en un caudal de 9,5 ml/min. y con un gradiente desde el
27-40% a lo largo de 120 min. Se combinaron las
fracciones a 43 min. y se liofilizaron dando (Gly A1 Phe
Bl)-Boc2-insulina (30 mg).
Se hizo reaccionar (Gly A1 Phe
B1)-Boc_{2}-insulina (30 mg) en
DMF (2 ml) y NMM (4-metilmorfolina, 100 ul) con
MPA-OSu (10 mg) durante 60 min. Se evaporó la DMF y
se trató el residuo con TFA durante 10 min. Se disolvió el residuo
en agua/acetonitrilo (3:1) y se inyectó la disolución en una HPCL
semi-preparativa. Columna Phenomenex Luna
fenil-hexilo 10 m de 21 mm X 250 mm equilibrada con
una disolución acuosa de TFA (TFA al 0,1% en H_{2}O, disolvente
A) y una disolución de TFA en acetonitrilo (TFA al 0,1% en
acetonitrilo, disolvente B). Se logró la elución a 9,5 ml/min.
haciendo pasar un gradiente del 27% al 32% de B a lo largo de 120
min. Se detectaron las fracciones que contenían péptidos mediante
absorbancia UV a 214 nm y 254 nm. Se recogieron las fracciones en
alícuotas de 9,5 ml. Se identificaron las fracciones que contenían
el perfil de producto deseado mediante detección de masa tras
inyección directa sobre CL/EM. Se combinaron las fracciones puras y
se liofilizaron dando un polvo blanco (22,2 mg).
La masa calculada es de 5958,5 g/mol, y la
medida mediante CL-EM es de 5958,0 g/mol.
Se usó el análisis de la secuencia de
aminoácidos (degradación de Edman usando isotiocianato de fenilo)
para confirmar que tanto el extremo N-terminal de
la cadena B (fenilalanina) como el de la cadena A (glicina) estaban
libres (véase la tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la cromatografía en columna de
resolución rápida usando un sistema modular de "cromatografía de
resolución rápida 40i" Biotage®. Se realizaron las purificaciones
mediante HPCL semipreparativa en un sistema "Breeze" de la
serie 1500 de Waters usando una columna Phenomex luna (RP- 18,
fenil-hexilo 10 u de 250 X 21,2 mm) con un caudal
de fase móvil de 9,5 ml/min. Se usó un sistema Gilson 690 para la
purificación a escala preparativa usando una columna Phenomex luna
(RP-18, fenil-hexilo 10 u de 250 X
50,0 mm) con un caudal de fase móvil de 50 ml/min. Se usó un
gradiente de acetonitrilo (CH_{3}CN) (TFA al 0,1%) en agua (TFA
0,1%) con detalles adicionales indicados en cada procedimiento
sintético del compuesto. Se realizó la CL-EM usando
un espectrómetro de masas de cuadrupolo sencillo
LC-MSD de la serie 1100 de Agilent con una fuente de
electropulverización ES1.
\newpage
Síntesis del conector
MPA-(AEES)_{2}-COOH
\vskip1.000000\baselineskip
Se hizo reaccionar
2-(2-aminoetoxi)etanol (50,0 g) en metanol
(150 ml) con Boc_{2}O (93,4 g) durante 30 min. Se evaporó el
metanol a vacío y se llevó el residuo a acetato de etilo, se lavó
con agua, salmuera y se secó con sulfato de sodio. Tras la
evaporación del disolvente, se usó el producto bruto para la
siguiente etapa. EM m/z 205.
Se disolvió el alcohol protegido en
N,N-dimetilformamida (500 ml) en presencia de
Et_{3}N (66 ml). Se añadió gota a gota MsCl (cloruro de mesilato)
(33,4 ml) a 0ºC a lo largo de 30 min. y luego se agitó a temperatura
ambiente durante 1 h. Entonces se añadió NaN_{3} (127,6 g) a la
mezcla de reacción seguido de NMM (N-metilmorfolina,
215 ml) y se agitó la reacción a 40-50ºC durante 16
h. Se vertió la mezcla de reacción en acetato de etilo (2 l) y se
lavó con agua. Se extrajo de nuevo la fase de agua con acetato de
etilo (2 l) y se lavaron las fases de acetato de etilo combinadas
con agua, salmuera y se secaron. Tras la evaporación del disolvente,
se usó el producto bruto para la siguiente etapa (101,4 g contienen
algo de DMF). EM m/z 231.
Se disolvió el producto bruto (62,4 g) en
metanol (300 ml) seguido de la adición de
Pd(OAc)_{2} (3,0 g) y ácido fórmico (96%, 62 g).
Tras la finalización de la reacción, se eliminaron las especies de
Pd mediante filtración a través de Celite. Se eliminó el metanol a
vacío y se secó adicionalmente a vacío. Se usó el producto bruto en
la siguiente etapa.
Se disolvió el producto bruto en diclorometano y
se neutralizó mediante Et_{3}N hasta que era básico. Se añadió
anhídrido succínico (32,3 g) en una porción. Se agitó la reacción a
temperatura ambiente durante 1 h. Se eliminó el disolvente a vacío
y se acidificó el residuo mediante HCl 1 N hasta pH 3. Se extrajo el
producto con acetato de etilo. Se hizo pasar la fase de acetato de
etilo a través de un tapón de gel de sílice (1 kg). Entonces se
lavó el gel de sílice con metanol al 2-4% en acetato
de etilo. Se combinaron las fracciones puras (tal como se valoró
mediante cromatografía en capa fina) y se eliminó el disolvente a
vacío dando Boc-AEES como un residuo aceitoso (36
g, 44%). EM m/z 305.
Se trató Boc-AEES (5,5 g) con
N-hidroxisuccinimida (NHS, 4,57 g) y clorhidrato de
etil-(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, 7,62 g) en
diclorometano (30 ml) durante 2 h. Se vertió el éster NHS en acetato
de etilo (500 ml), se lavó con HCl 0,1 N y se secó con sulfato de
sodio. Se eliminó el disolvente a vacío y se usó el residuo como
tal en la siguiente etapa.
Se trató Boc-AEES (6,05 g) con
ácido trifluoroacético (TFA, 10 ml) durante 10 min. Se eliminó el
TFA a vacío y se secó adicionalmente a vacío. Se disolvió el
aminoácido (AEES) en N,N-dimetilformamida (20 ml) y
se basificó con NMM en exceso. Entonces se añadió el producto bruto
del ejemplo V y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante
1 h. Se evaporó el disolvente a presión reducida y se inyectó el
residuo en HPCL preparativa usando un gradiente del
5-40% a lo largo de 60 min. Se eliminó el disolvente
y se secó el residuo a vacío dando
Boc-(AEES)_{2}-COOH como un aceite (5,64 g,
84%). EM m/z 478.
Se trató
Boc-(AEES)_{2}-COOH (3,60 g) con ácido
trifluoroacético (TFA, 10 ml) durante 10 min. Se eliminó el TFA a
vacío y se secó adicionalmente a vacío. Se disolvió el aminoácido
(AEES)_{2} en N,N-dimetilformamida y se
basificó con NMM. Se añadió MPA-OSu (2,94 g) y se
agitó la mezcla durante 30 min. Se eliminó la
N,N-dimetilformamida a vacío. Se disolvió el
residuo en agua y se inyectó en HPCL preparativa usando un gradiente
del 5-40% a lo largo de 60 min. Se combinaron las
fracciones puras y se eliminó el disolvente dando
MPA-(AEES)_{2}-COOH como un sólido de
color hueso (3,8 g, 95%). EM m/z 542,2.
Se disolvió
MPA-(AEES)_{2}-COOH (3,04 g) en
N,N-dimetilformamida (20 ml) y en presencia de NMM
(1,13 ml) y se trató con cloroformiato de
p-nitrofenilo (1,13 g). Se agitó la mezcla de
reacción a temperatura ambiente durante 2 h. Se eliminó la
N,N-dimetilformamida a vacío. Se purificó el residuo
mediante cromatografía en columna de resolución rápida usando el
sistema Biotage®. Se enjuagó la columna con acetato de etilo (500
ml) seguido de metanol al 10% en acetato de etilo (1 l). Se
combinaron las fracciones puras y se eliminó el disolvente dando
MPA-(AEES)_{2}-CO_{2}PNP como un sólido
(1,39 g, 37%). EM m/z 663.
Se acopló Gly A1, Lys
B29-BisBoc-insulina (200 mg) en
N,N-dimetilformamida (10 ml) con
MPA-(AEES)_{2}-CO_{2}PNP del ejemplo
VIII (200 mg) en presencia de NMM (200 ul) a temperatura ambiente
durante 16 h. Se eliminó la N,N-dimetilformamida a
vacío y se trató el residuo con TFA durante 10 min. Se eliminó el
TFA a vacío, se disolvió el residuo en agua y se inyectó en HPCL
usando un gradiente del 27-32% a lo largo de 120
min. Se combinaron las fracciones puras y se liofilizó el
disolvente dando (Phe
B1)-MPA(AEES)_{2}-insulina
como un polvo blanco (95,0 mg, 43,7%). EM m/z 6330,4.
\vskip1.000000\baselineskip
Se acopló Gly A1 Phe
B1-BisBoc-insulina (200 mg) en
N,N-dimetilformamida (10 ml) con
MPA-(AEES)_{2}-CO2PNP como del ejemplo VI
(200 mg) en presencia de NMM (200 ul) a temperatura ambiente durante
16 h. Se eliminó la N,N-dimetilformamida a vacío y
se trató el residuo con TFA durante 10 min. Tras eliminar el TFA a
vacío, se disolvió el residuo en agua y se inyectó en HPCL usando
un gradiente del 27-32% a lo largo de 120 min. Se
combinaron las fracciones puras y se liofilizó el disolvente dando
(Lys
B29)-MPA(AEES)_{2}-insulina
como un polvo blanco (56,3 mg, 25,9%). EM m/z 6328,8.
\vskip1.000000\baselineskip
Se acopló Gly A1 Phe
B1-BisBoc-insulina (205 mg) en
N,N-dimetilformamida (10 ml) con
MPA-OA-CO_{2}Su (139 mg) en
presencia de NMM (20 ul) a temperatura ambiente durante 16 h. Se
eliminó el disolvente a vacío y se trató el residuo con TFA durante
10 min. Tras eliminar el TFA a vacío, se disolvió el residuo en agua
y se inyectó en HPCL usando un gradiente del 27-36%
a lo largo de 120 min. Se combinaron las fracciones puras y se
liofilizó el disolvente dando (Lys
B29)-MPA(OA)-insulina como un
polvo blanco (64,2 mg, 31%). EM m/z 6098,8.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incubaron membranas de hígado de ratas Wistar
con [1251]insulina y concentraciones crecientes de insulina,
DAC:insulina tal como se describe en la figura 1 y su conjugado
correspondiente durante 16 horas a 4ºC. Se filtraron las membranas
y se lavaron 3 veces y se contaron los filtros para determinar la
[1251]insulina específicamente unida. Se calculó la CI50
usando el programa GraphPad Prism.
Los resultados de la CI50 se ilustran en la
tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 2 y la figura 3 ilustran la unión de
insulina en membrana de hígado de rata en cuanto al % de inhibición
en función de la concentración del derivado de insulina de la
presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó la captación de glucosa en adipocitos
para evaluar la actividad in vitro. Se diferenciaron células
3T3-L1, una línea celular de fibroblastos murina, en
adipocitos para su uso en el bioensayo. Se sembraron en placa las
células 3T3-L1 y se hicieron crecer hasta la
confluencia en DMEM y 10% de FBS, seguido de una incubación durante
dos días. Se indujo la diferenciación añadiendo dexametasona e
insulina (D0). En el día 7, más del 90% de las células presentaban
un fenotipo de adipocitos, es decir, una acumulación de gotitas de
lípidos. Las figuras 4A-4C muestran preadipocitos,
células tras 3 días y adipocitos a los 7 días. Las figuras 5A y 5B
muestran la tinción con aceite rojo O de adipocitos a los 4 días y
adipocitos a los 7 días. Las figuras 6A y 6B muestran la tinción
con aceite rojo O y azul de metileno a los 4 días y a los 7
días.
Se privaron de alimento los adipocitos
3T3-L1 durante la noche en DMEM que contenía glucosa
5 mM y 0,5% de FBS. Se aclararon las células en tampón
Kreb's-Ringer-Hepes que contenía BSA
al 1% y se incubaron con concentraciones crecientes de insulina,
DAC:derivados de insulina y su conjugado correspondiente durante 20
minutos a 37ºC y con
[^{14}C]-2-desoxi-D-glucosa
(1 \muCi/pocillo) durante otros 20 minutos. Se solubilizaron las
células y se midió la radiactividad. Se calculó la captación de
glucosa (%) frente al control de insulina y se calculó la CE50
usando el programa GraphPad Prism^{TM}.
La tabla 3 muestra los resultados de la CE50
para los compuestos sometidos a prueba y la figura 7 ilustra la
captación de glucosa en % del control en función de la concentración
(M) de los compuestos.
Además, se usó la captación de glucosa en otra
fuente de adipocitos para evaluar la actividad in vitro. Se
usa grasa del epidídimo obtenida de ratas macho derivadas Wistar que
pesaban 175 g \pm 25 g. Se degrada el tejido (0,03 g/ml) mediante
colagenasa en disolución de HEPES modificada pH 7,4 a 37ºC. Se
incuba el compuesto de prueba y/o el vehículo con alícuotas de 500
\mul en tampón HEPES modificado pH 7,4 y entonces se añade
D-[3-3H]glucosa (2,5 \muCi/ml) durante una
incubación de 2 horas. El aumento de la incorporación de glucosa
inducido por el compuesto de prueba en más del 50 por ciento o más
(\geq50%) en relación con la respuesta de insulina 2 nM control
indica una posible actividad agonista del receptor de insulina. La
inhibición por el compuesto de prueba de la respuesta de
incorporación de glucosa inducida por insulina en más del 50% indica
una actividad antagonista del receptor de insulina. Se examinan los
compuestos a 10, 1, 0,1, 0,01 y 0,001 \muM.
La tabla 4 muestra los resultados de la CE50
para los compuestos sometidos a prueba y la figura 8 ilustra la
captación de glucosa en % del control en función de la concentración
(M) de los compuestos.
Se comparan la eficacia hipoglucemiante de la
insulina humana recombinante frente a derivados de insulina de la
presente invención cuando se administran por vía subcutánea a
ratones db/db hembra diabéticos.
Se administraron los compuestos de prueba
mediante una única inyección en bolo subcutánea en ratones db/db
hembra de 5-6 semanas de edad que pesaban de 24,3 g
a 33,3 g. El volumen promedio de disolución de dosificación
inyectada fue de 0,35 ml/ratón (12,5 ml/kg).
Se proporciona insulina humana recombinante
(E. coli) (denominada a continuación en el presente documento
"insulina rH") por ICNTM a una concentración de 28 UI/mg.
Se prepararon disoluciones madre de derivados de
insulina a 14,29 mg/ml (\sim 400 UI/ml) reconstituyendo los
derivados de insulina sintetizados con agua acidificada (- pH 2). Se
diluyeron posteriormente las disoluciones madre con NaCl al 0,9% y
se filtraron a 0,22 \mum (Millex GV) obteniendo las disoluciones
de dosificación mostradas en la tabla 5. El grupo 1 recibió NaCl al
0,9% según la USP como disolución control.
Los grupos y tratamientos se resumen en la tabla
6.
Se realizó la toma de muestras de sangre (una
gota) a través de la punta de la cola y se determinaron los niveles
de glucosa usando un glucómetro manual (modelo: One Touch UltraTM,
Lifescan Canadá). Se determinaron los niveles de glucosa en sangre
para todos los animales una vez antes de la administración (antes de
la dosis), y a 1, 2, 3, 4, 6, 24, 30, 48 y 72 horas tras la
dosis.
Todos los animales parecían normales antes de la
administración de los compuestos sometidos a prueba. Aproximadamente
una hora tras la dosis, el grupo 2 de animales tratados por vía
subcutánea con 100 UI/kg de insulina humana recombinante (insulina
rH) presentó una ligera disminución en la actividad y una marcha no
coordinada. Otros animales tratados parecían normales a lo largo de
todo el experimento. Se observó una ligera disminución de consumo
de alimentos en los animales tratados con 17,9 mg/kg de compuesto
del ejemplo III.
La tabla 7 muestra el consumo de alimentos (peso
total/jaula (g)) tras una única administración de insulina rH y
derivados de insulina.
La tabla 8 muestra el consumo de alimentos
frente al control (peso total/jaula (g)) tras una única
administración de insulina rH y derivados de insulina.
\vskip1.000000\baselineskip
La delta glucemia calculada a partir de los
niveles de glucosa en sangre del nivel de glucosa tras la dosis
frente al nivel de glucosa antes de la dosis para cada ratón
individual se notifica en las figuras 9, 10, 11, 12, 13, y 14. En
general, los derivados de insulina (ejemplo I, ejemplo II y ejemplo
III) pudieron reducir las concentraciones de glucosa en sangre de
una manera dependiente de la dosis y la insulina recombinante,
sometida a prueba a un nivel de dosis sólo (100 UI/kg) era activa
durante 2 horas. A 3,6 mg/kg, el ejemplo 2 era activo como insulina
durante las primeras 2 horas mientras que sólo se observó un efecto
marginal con el ejemplo I y el ejemplo III. El efecto reductor de
la insulina rH era más pronunciado a 17,9 mg/kg ya que se observó
durante hasta 24 horas. Aunque el panorama global tiende a demostrar
que los derivados de insulina eran activos durante hasta 24 horas
(en comparación con el grupo control), es importante indicar que los
niveles de glucosa disminuyeron a las 1-2 horas
tras la dosis, aumentaron luego a las 3-4 horas y
disminuyeron de nuevo a las 6 horas. Esta respuesta de "subida y
bajada" podría indicar que los hábitos de alimentación y el
metabolismo de los ratones son parámetros importantes que pueden
afectar a la eficacia del fármaco. Es importante mencionar que los
ratones db/db desarrollan resistencia a la insulina con la edad, lo
que podría explicar la dosis de insulina muy alta que tuvo que
inyectarse para observar el efecto hipoglucemiante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se administraron la insulina rh, el derivado de
insulina del ejemplo III y el conjugado del derivado de insulina
del ejemplo III a ratas CD macho de 7-8 semanas de
edad o bien a 36 hmol/kg por vía subcutánea (sc) o bien a 12
nmol/kg por vía intravenosa (iv). Se tomaron muestras de sangre
hasta las 72 horas (solo hasta las 3 horas para animales tratados
con insulina rh). Se determinaron los niveles de fármaco usando un
kit de ELISA para insulina humana (Linco). Se calcularon los
parámetros farmacocinéticos mediante análisis no compartimental
usando el programa WinNonlin, N=4 ratas por compuesto/vía. La figura
15 es el perfil farmacocinético de insulina en ratas SD normales en
las que se administró insulina sc a 36 nmol/kg e iv a 12 nmol/kg. La
figura 16 es el perfil farmacocinético del conjugado del ejemplo
III en ratas SD normales en las que se administró el conjugado sc a
36 nmol/kg e iv a 12 nmol/kg. La figura 17 es el perfil
farmacocinético del derivado de insulina del ejemplo III en ratas
SD normales en las que se administró el derivado de insulina sc a 36
nmol/kg e iv a 12 nmol/kg. La figura 18 es el perfil PK subcutáneo
de la administración de insulina, derivado de insulina del ejemplo
III y el conjugado del derivado de insulina del ejemplo III. La
figura 19 es el perfil PK intravenoso de la administración de
insulina, derivado de insulina del ejemplo III y el conjugado del
derivado de insulina del ejemplo III.
\vskip1.000000\baselineskip
Se indujo diabetes en ratas CD macho con una
única inyección i.v. de estreptozotocina (60 mg/kg). Dos días más
tarde, las ratas recibieron una única inyección sc de
DAC^{TM}:derivados de insulina a 120 nmol/kg, conjugados
preformados a 300 nmol/kg, insulina rh a 20 U/kg (120 nmol/kg) o
vehículo. Se midió el nivel de glucosa en sangre con un glucómetro
manual justo antes de la inyección y a las 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 11,
24, 30 y 48 horas tras la dosis sometiéndose a prueba 5 ratas/grupo
excepto para el vehículo que fueron 3 ratas/grupo. La glucemia de
ratas normales oscilaba entre 5,2 mmol/l y 7,6 mmol/l.
La figura 20 muestra el nivel de glucosa en
sangre en ratas tras la administración de 120 nmol/kg del ejemplo I
al IV. La figura 21 muestra el nivel de glucosa en sangre en ratas
tras la administración del conjugado correspondiente del ejemplo I
al IV de la presente invención a 300 nmol/kg.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó este ensayo para evaluar la potencia
del derivado de insulina del ejemplo II y su conjugado frente a la
insulina recombinante humana tras inyecciones subcutáneas repetidas
en ratas CD® macho adultas.
Se indujo diabetes tipo I ratas CD® macho en el
día 1 de estudio mediante una única inyección intravenosa (i.v.) de
estreptozotocina (60 mg/kg, pH 4,5). Se confirmó la hiperglucemia
usando un monitor de glucosa en sangre para someter a prueba la
sangre. Se administró el compuesto de prueba una vez al día en los
días 3 hasta 14 de estudio a 1 ml/kg de peso corporal mediante
inyección subcutánea (s.c.). Se sometieron a prueba los niveles de
glucosa en sangre justo antes de la administración de la dosis cada
día y a las 2,8 y 18 horas tras la administración. Se controlaron
diariamente el consumo de alimentos y agua. Se recogieron los pesos
corporales en los días 1, 3, 6, 9, 12, 15 y 17 de estudio.
La figura 22 ilustra el perfil diario de glucosa
en sangre en el día 1, 6 y 12 para el derivado de insulina del
ejemplo III y la figura 23 ilustra el perfil diario de glucosa en
sangre en el día 1, 6 y 12 para el conjugado del derivado de
insulina del ejemplo III.
Aunque la invención se ha descrito con respecto
a realizaciones específicas de la misma, se entenderá que pueden
realizarse modificaciones adicionales y esta solicitud pretende
cubrir cualquier variación, uso o adaptaciones de la invención
siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo
tales desviaciones de la presente descripción tal como se producen
dentro de la práctica conocida y habitual dentro de la técnica a la
que pertenece la invención y tal como puede aplicarse a las
características esenciales expuestas anteriormente en el presente
documento, y tal como sigue en el alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
Claims (27)
1. Un derivado de insulina que comprende una
molécula de insulina y un grupo reactivo para unir covalentemente
un componente sanguíneo, siendo dicho grupo reactivo un grupo que
contiene maleimido, y en el que el grupo reactivo está acoplado a
un grupo amino disponible de la molécula de insulina seleccionado de
los grupos \alpha-amino de los aminoácidos del
extremo N-terminal de las cadenas A y B y el grupo
\varepsilon-amino de Lys B29.
2. El derivado de insulina según la
reivindicación 1, en el que el grupo amino disponible es el grupo
\varepsilon-amino de Lys B29.
3. El derivado de insulina según la
reivindicación 1, en el que el grupo amino disponible es el grupo
\alpha-amino de Gly A1 o Phe B1.
4. El derivado de insulina según cualquier
reivindicación anterior, en el que la molécula de insulina se
selecciona de insulina humana nativa o una molécula de insulina con
sustitución/sustituciones de aminoácidos, deleción/deleciones de
aminoácidos o adición/adiciones de aminoácidos.
5. El derivado de insulina según cualquier
reivindicación anterior, en el que la molécula de insulina es de
fórmula I:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y el grupo reactivo está acoplado a
un aminoácido de la molécula de insulina en una posición
seleccionada de las posiciones Gly A1, Phe B1 y Lys
B29.
\vskip1.000000\baselineskip
6. El derivado de insulina según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que el grupo reactivo acoplado al
grupo amino disponible de la molécula de insulina es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
7. El derivado de insulina según cualquier
reivindicación anterior, en el que el grupo reactivo está acoplado
al grupo amino disponible de la molécula de insulina mediante un
conector.
8. El derivado de insulina según la
reivindicación 7, en el que el grupo reactivo se acopla al grupo
amino disponible de la molécula de insulina haciendo reaccionar un
conector con el grupo reactivo y el grupo amino disponible de la
molécula de insulina, y en el que el conector se selecciona del
grupo constituido por etilendiamina (EDA), ácido
2-[2-(2-amino)etoxi)]etoxi-acético
(AEEA), AEEA-AEEA y
NH_{2}-(CH_{2})_{n}-COOH en el que n
es un número entero entre 1 y 20.
9. El derivado de insulina según la
reivindicación 7, en el que dicho conector es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
10. El derivado de insulina según la
reivindicación 5, en el que la molécula de insulina está acoplada en
la Gly terminal de A1 con 3-maleimidopropanamida, y
en el que el grupo \alpha-amino de Gly es el
nitrógeno de amida de la
3-maleimidopropanamida.
11. El derivado de insulina según la
reivindicación 5, en el que la molécula de insulina está acoplada en
la Phe terminal de B1 con 3-maleimidopropanamida, y
en el que el grupo \alpha-amino de Phe es el
nitrógeno de amida de la
3-maleimidopropanamida.
12. El derivado de insulina según la
reivindicación 5, en el que la molécula de insulina está acoplada en
la Phe terminal de B1 con
8-N-(3-maleimidopropanilcarbonil)aminooctanamida,
y en el que el grupo \alpha-amino de Phe es el
nitrógeno de amida de la octanamida de
8-N-(3-maleimidopropanilcarbonil)aminooctanamida.
13. El derivado de insulina según la
reivindicación 5, en el que la molécula de insulina está acoplada en
la B29 Lys con 3-maleimidopropanamida y en el que
el grupo \varepsilon-amino de Lys es el nitrógeno
de amida de la 3-maleimidopropanamida.
14. El derivado de insulina según cualquier
reivindicación anterior, en el que dicho componente sanguíneo es una
proteína sanguínea.
15. El derivado de insulina según la
reivindicación 14, en el que dicha proteína sanguínea es albúmina
sérica.
16. Un conjugado de insulina que comprende un
derivado de insulina según una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 15 y un componente sanguíneo, en el que el grupo reactivo está
unido covalentemente al componente sanguíneo.
17. El conjugado de insulina según la
reivindicación 16, en el que el componente sanguíneo es una proteína
sanguínea.
18. El conjugado de insulina según la
reivindicación 17, en el que la proteína sanguínea es albúmina
sérica.
19. El conjugado de insulina según la
reivindicación 16, formándose dicho conjugado ex vivo.
20. El conjugado de insulina según la
reivindicación 17, en el que dicha proteína sanguínea es albúmina
recombinante.
21. El conjugado de insulina según la
reivindicación 16, en el que dicho componente sanguíneo se produce
mediante técnicas recombinantes.
22. Uso del derivado según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, o el conjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 21, para la preparación de un medicamento para
el tratamiento de un trastorno o una enfermedad relacionado con la
glucemia.
23. El uso según la reivindicación 22, en el que
dicho trastorno o dicha enfermedad relacionado con la glucemia se
selecciona del grupo constituido por diabetes, diabetes de tipo I,
diabetes de tipo II y diabetes gestacional.
24. El uso según la reivindicación 22, en el que
el trastorno o la enfermedad relacionado con la glucemia se
selecciona del grupo constituido por diabetes de tipo I y diabetes
de tipo II.
25. El derivado según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, o el conjugado según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 21, para su uso en el tratamiento de
trastornos o enfermedades relacionados con la glucemia.
26. El derivado o conjugado según la
reivindicación 25, en el que dicho trastorno o dicha enfermedad
relacionado con la glucemia se selecciona del grupo constituido por
diabetes, diabetes de tipo I, diabetes de tipo II y diabetes
gestacional.
27. El derivado o conjugado según la
reivindicación 25, en el que el trastorno o la enfermedad
relacionado con la glucemia se selecciona del grupo constituido por
diabetes de tipo I y diabetes de tipo II.
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