ES2328261T3 - Peptido epitopico de un anticuerpo de la enfermedad de crohn y reactivo para ensayar la enfermedad de crohn. - Google Patents
Peptido epitopico de un anticuerpo de la enfermedad de crohn y reactivo para ensayar la enfermedad de crohn. Download PDFInfo
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Abstract
Un péptido característico de un epítopo de un anticuerpo de la enfermedad de Crohn, que se representa mediante los siguientes apartados (a) o (b): (a) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, o una sal del mismo; y (b) un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos modificada de SEQ ID NO: 3, en la que uno o algunos de los aminoácidos están sustituidos, suprimidos o añadidos, o parte de la secuencia de aminoácidos modificada o no modificada de SEQ ID NO: 3, y que tiene la propiedad de unirse a un anticuerpo de la enfermedad de Crohn que se une al péptido (a) anterior, o una sal del mismo.
Description
Péptido epitópico de un anticuerpo de la
enfermedad de Crohn y reactivo para ensayar la enfermedad de
Crohn.
La presente invención se refiere a un péptido
útil para el diagnóstico de la enfermedad de Crohn, y a un reactivo
de ensayo que contiene el mismo como ingrediente activo. El reactivo
de ensayo se puede usar para un método de ensayo de la enfermedad
de Crohn, que se puede llevar a cabo conveniente y rápidamente por
medio de un proceso inmunológico usando una muestra biológica tal
como sangre.
\vskip1.000000\baselineskip
La enfermedad de Crohn, cuya causa es
desconocida, se denomina enfermedad inflamatoria del intestino, que
incluye así mismo la colitis ulcerosa. Cuando se observan de forma
continua dolor abdominal, diarrea, pérdida de peso, fiebre y
síntomas similares en individuos jóvenes (al final de los 10 años
hasta el principio de los 20 años), se debería de sospechar esta
enfermedad. El diagnóstico se basa en una combinación de síntomas
clínicos, radiografía, y endoscopia o examen patológico, etcétera.
Sin embargo, estas técnicas requieren experiencia y pericia, y por
tanto, en algunos casos, el diagnóstico puede ser difícil. En
particular, en una etapa temprana de la enfermedad, en muchos casos
es difícil distinguir la enfermedad de Crohn de la colitis ulcerosa.
Por otro lado, la radiografía intestinal y la endoscopia, que son
las técnicas de diagnóstico principales, son desventajosas por
cuanto son dolorosas, física o psicológicamente, para los pacientes.
En consecuencia, se desea un reactivo y un método para diagnosticar
in vitro la enfermedad de Crohn de manera conveniente y
exacta.
Con respecto a la etiología de la enfermedad
inflamatoria del intestino, desde hace tiempo se ha dado a conocer
que factores exógenos tales como bacterias, virus y antígenos
alimentarios están relacionados con la inflamación intestinal. En
cuanto a la enfermedad de Crohn en particular, se han dado a
conocer casos de infección y detección de Mycobacterium
paratuberculosis (documentos 1 a 4 que no son patentes,
etcétera), casos de detección de anticuerpos contra levadura de
cocina y neutrófilos (documentos 5 y 6 que no son patentes,
etcétera), y casos de detección de un anticuerpo contra amilasa de
cerdo, o de detección de un anticuerpo contra un péptido que se une
a un anticuerpo de la enfermedad de Crohn (véanse los documentos 1
y 2 de patentes). Algunos de estos también dieron a conocer
anticuerpos específicos contra la enfermedad, pero ninguno de ellos
mostró por sí mismo un porcentaje suficiente de positivos para
pacientes con enfermedad de Crohn, planteando un problema de una
elevada tasa de falsos positivos para colitis ulcerosa, que se debe
de discernir de ella. En estas circunstancias, es extremadamente
importante desarrollar un método de ensayo clínico mediante el cual
se pueda diagnosticar específicamente la enfermedad de Crohn de
manera conveniente y rápida con elevada exactitud utilizando un
péptido antigénico específico de la enfermedad de Crohn.
\vskip1.000000\baselineskip
Documento 1 de patente: Patente Japonesa abierta
al público (Kokai) n° H11-190734
(Reivindicaciones).
Documento 2 de patente: Publicación
Internacional WO 02/088175 (Descripción de la invención).
Documento 1 que no es patente: Elsaghier
A, et al. Clin Exp Immunol., 1992, 90,
503-508.
Documento 2 que no es patente: El-Zaatari
F. A. et al. Curr Microbiol., 1999, 39,
115-119.
Documento 3 que no es patente: Naser S,
et al. Vet Microbiol., 2000, 77,
497-504.
Documento 4 que no es patente: Suenaga K,
et al. Dig Dis Sci., 1999, 44,
1202-1207.
Documento 5 que no es patente: Quinton J
F, et al. Gut, 1998, 42, 788-791.
Documento 6 que no es patente: Peeters M,
et al. Am J Gastroenterol., 2001, 96,
730-734.
\vskip1.000000\baselineskip
En las circunstancias descritas anteriormente,
el objeto de la presente invención es proporcionar un péptido
epitópico que se une específicamente a un anticuerpo que se observa
específicamente en pacientes con enfermedad de Crohn y, de este
modo, que es característico de la enfermedad de Crohn; un reactivo
de ensayo y un kit de ensayo que contienen el péptido como
ingrediente activo; y un método de ensayo para examinar conveniente
y rápidamente si los pacientes están afectados o no por la
enfermedad de Crohn, mediante el uso de estos.
A fin de resolver los problemas descritos
anteriormente, se han realizado estudios inmunológicos y de biología
molecular, y se ha descubierto que ciertos péptidos reconocen
específicamente y se unen a anticuerpos específicos que están
presentes en sueros de pacientes con enfermedad de Crohn. Se ha
confirmado que, mediante el uso de estos péptidos, se puede
determinar conveniente y exactamente si los pacientes están
afectados por la enfermedad de Crohn. En consecuencia, la presente
invención se define mediante los siguientes apartados (1) a
(4):
- (1)
- Un péptido característico de un epítopo para un anticuerpo de la enfermedad de Crohn, que se representa mediante los siguientes apartados (a) o (b):
- (a)
- un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, o una sal del mismo; y
- (b)
- un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos modificada de SEQ ID NO: 3, en la que uno o algunos de los aminoácidos están sustituidos, suprimidos o añadidos, o parte de la secuencia de aminoácidos modificada o no modificada de SEQ ID NO: 3, y que tiene la propiedad de unirse a un anticuerpo de la enfermedad de Crohn que se une al péptido (a) anterior, o una sal del mismo.
- (2)
- Un reactivo de ensayo para la enfermedad de Crohn, que comprende, como ingrediente activo, el péptido (a) o (b) anterior característico de un epítopo para un anticuerpo de la enfermedad de Crohn.
- (3)
- Un kit de ensayo para la enfermedad de Crohn, que comprende el reactivo de ensayo anterior para la enfermedad de Crohn como una sustancia antigénica para un anticuerpo de la enfermedad de Crohn.
- (4)
- Un método de ensayo para la enfermedad de Crohn, que comprende la etapa de determinar si está presente o no en una muestra biológica un anticuerpo que se une al péptido (a) o (b) anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
En lo sucesivo, las abreviaturas de aminoácidos,
péptidos, secuencias de bases, etc., se indican en esta memoria
descriptiva según las reglas de IUPAC e IUB, "la Guía para
preparar memorias descriptivas, etc., que contienen secuencias de
bases o secuencias de aminoácidos" (editada por la Oficina de
Patentes Japonesa), y los símbolos convencionales usados en la
técnica.
Además, un anticuerpo de la enfermedad de Crohn
se refiere aquí a un anticuerpo que se genera en un organismo vivo
que sufre la enfermedad de Crohn, y de este modo que es
característico de la enfermedad de Crohn como se describe
anteriormente, y por lo tanto significa un anticuerpo que se
observa específicamente en pacientes con enfermedad de Crohn,
independientemente de los tipos de antígenos causales y de este modo
característico de la enfermedad de Crohn.
Según la presente invención, se proporciona un
péptido epitópico de un anticuerpo de la enfermedad de Crohn que se
une específicamente a un anticuerpo de la enfermedad de Crohn que
se observa específicamente en pacientes con enfermedad de Crohn, y
se incluye en un reactivo de ensayo o en un kit de ensayo para el
diagnóstico de la enfermedad de Crohn. De este modo, también se
proporciona un método de ensayo útil para la enfermedad de Crohn,
que puede examinar y determinar, de manera conveniente, rápida y
exacta, si un paciente está afectado por la enfermedad de Crohn.
El péptido epitópico del anticuerpo de la
enfermedad de Crohn según la presente invención se puede
ejemplificar específicamente mediante un péptido que tiene una
secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3.
Además del péptido que tiene una secuencia de
aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, el péptido epitópico del
anticuerpo de la enfermedad de Crohn según la presente invención
puede ser un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO: 3 en la que uno o algunos (dos o más) de los aminoácidos
están sustituidos, o suplementados con otro aminoácido, o
suprimidos. De este modo, el péptido epitópico del anticuerpo de la
enfermedad de Crohn según la presente invención engloba el péptido
que tiene una secuencia de aminoácidos que está modificada con la
sustitución, supresión o adición de uno o más aminoácidos en cada
una de estas secuencias de aminoácidos, o que tiene una parte de
tales secuencias de aminoácidos, en tanto que el péptido tenga la
propiedad de unirse específicamente al anticuerpo de la enfermedad
de Crohn.
Todos los péptidos descritos anteriormente se
caracterizan por unirse específicamente al anticuerpo de la
enfermedad de Crohn.
No hay ninguna restricción particular en el
grado, sitio o similar, de la sustitución, supresión o adicción de
aminoácidos, en tanto que el péptido modificado se caracterice por
unirse específicamente al anticuerpo de la enfermedad de Crohn de
forma comparable al péptido que tiene una secuencia de aminoácidos
representada por SEQ ID NO: 3.
Aunque la modificación (mutagénesis) de
secuencias de aminoácidos se produce debido a mutación,
modificación postraduccional, o similar, se puede inducir de forma
artificial. Los métodos para la modificación (mutagénesis) de
secuencias de aminoácidos son técnicas bien conocidas en la
técnica, que incluyen técnicas de ingeniería genética tales como
mutagénesis específica del sitio (Methods in Enzymology, 154, 350,
367-382 (1987); Ditto, 100, 468 (1983); Nucleic
Acids Res., 12, 9441 (1984); Zoku Seikagaku Jikken Koza 1
"Idenshi Kenkyuho II" en transliteración Japonesa, que
significa Sequel Biochemical Experiment Lecture 1, "Gene Study
Methodology II", así como técnicas de síntesis química tales
como el método de fosfotriéster y el método de fosforamidito (J.
Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967); Ditto, 91, 3350 (1969); Science,
150, 178 (1968); Tetrahedoron Lett., 22, 1859 (1981); Ditto, 24,
245 (1983)).
Además, en el péptido epitópico del anticuerpo
de la enfermedad de Crohn según la presente invención,
ejemplificado por el péptido de la secuencias de aminoácidos
representadas por SEQ ID NO: 3, el C-terminal puede
ser cualquier grupo carboxido (-COOH), grupo amida (-CONH_{2}), y
grupo ester (-COOR). Aquí, R en el grupo éster incluye, por
ejemplo, grupos alquilo C_{1-6}, tales como
metilo, etilo, n-propilo, isopropilo y
n-butilo; grupos cicloalquilo
C_{3-8}, tales como ciclopentilo y ciclohexilo; y
grupos arilo de C_{6-12}, tales como fenilo y
\alpha-naftilo.
Cuando un péptido usado en la presente invención
tiene un grupo carboxilo en un sitio distinto del
C-terminal, tal grupo carboxilo se puede amidizar o
esterificar, y tal péptido también está incluido en el péptido de
la presente invención. Tales ésteres incluyen en este caso, por
ejemplo, los descritos anteriormente para los ésteres
C-terminales.
Además, los péptidos de la presente invención
también incluyen aquellos en los que un grupo aminoácido del resto
de aminoácido en el N-terminal está protegido por un
grupo protector (por ejemplo, un grupo acilo
C_{1-6} tal como un grupo formilo y un grupo
acetilo); aquellos en los que un resto de glutamina en el
N-terminal generado por escisión en el organismo
vivo se cambia por ácido piroglutámico; aquellos en los que un
sustituyente (por ejemplo, un grupo hidroxilo, grupo mercapto,
grupo amino, grupo imidazol, grupo indol, y grupo guanidino) en una
cadena lateral de un aminoácido en la molécula está protegido por
un grupo protector adecuado; y péptidos complejos tales como los
denominados glucopéptidos, que tiene una cadena de azúcar unida a
los mismos.
Puesto que se cree que el número mínimo de
aminoácidos requeridos para el reconocimiento por el anticuerpo es
cuatro desde el punto de vista inmunológico, el número de
aminoácidos del péptido epitópico descrito anteriormente del
anticuerpo de la enfermedad de Crohn según la presente invención
descrito anteriormente es cuatro o más, pero no tiene ningún límite
superior particular en tanto que tenga la propiedad de unirse
específicamente a y reconocer el anticuerpo de la enfermedad de
Crohn observado en pacientes con enfermedad de Crohn. El número de
aminoácidos generalmente es de cuatro hasta alrededor de 500 desde
el punto de vista de síntesis química, tal como síntesis
peptídica.
Las sales de los péptidos de la presente
invención incluyen sales fisiológicamente aceptables con ácidos o
bases. Los ejemplos de tales sales incluyen sales con ácidos
inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido
bromhídrico y ácido sulfúrico; y sales con ácidos orgánicos tales
como ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido fumárico,
ácido maléico, ácido succinico, ácido tartárico, ácido cítrico,
ácido málico, ácido oxálico, ácido benzoico, ácido metanosulfónico y
ácido benceno-sulfónico. Además, se incluyen, por
ejemplo, sales con metales alcalinos tales como sodio y potasio;
sales con metales alcalino-térreos tales como
magnesio y calcio; sales con aminas tales como monometilamina y
trietilamina; sales con amonio cuaternario tales como
trimetiletilamonio y tetrametilamonio.
Más adelante se describen con detalle
procedimientos de preparación o producción en relación con el
péptido epitópico del anticuerpo de la enfermedad de Crohn según la
presente invención, o una sal del mismo (en lo sucesivo también
denominada colectivamente como el péptido epitópico del anticuerpo
de la enfermedad de Crohn), incluyendo un péptido que tiene una
secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, o una sal
del mismo, así como un péptido que comprende una secuencia de
aminoácidos modificada de SEQ ID NO: 3, en la que uno o algunos
(dos o más) de los aminoácidos están sustituidos, suprimidos o
añadidos, y que tiene la propiedad de unirse específicamente a un
anticuerpo de la enfermedad de Crohn, o una sal del mismo.
El péptido epitópico del anticuerpo de la
enfermedad de Crohn según la presente invención se puede obtener
mediante una técnica de detección usando una librería de fagos de
presentación (una genoteca, una librería de ADNc, o una librería
peptídica al azar). Tal técnica de detección se denomina la técnica
de presentación de fagos, y es usada por muchos de los expertos en
la técnica como un medio conocido para fusionar una proteína de
revestimiento de fagos con un epítopo antigenoso extraño y expresar
el epítopo sobre la superficie del fago, seguido de la selección con
una sonda tal como un anticuerpo (Scott J. K. y Smith G. P.,
Science, 249, 386-390 (1990); Dybwad A., et
al, Clin Exp Immunol, 102, 438-442 (1995);
Bluthner M., et al, J Immunol Methods, 198,
187-198 (1996)).
Los fagos usados para librerías incluyen fagos
filamentosos (M13, f1, fd, 1f1, etc.: Smith G. P., et al,
Science, 228, 1315-1317 (1985); Devlin J. J., et
al, Science, 249, 404-406 (1990); Cwirla S. E.,
et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87,
6378-6382 (1990)); fagos \lambda (Maruyama I. N.,
et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91,
8273-8277 (1994); Santi E., et al, J. Mol
Biol, 296, 497-508 (2000)); y fagos T7 (Patente
U.S. n° 5.766.905; Novagen T7 Select System Manual TB178 (2000)).
Las proteínas como librería son inducidas para ser expresadas sobre
la superficie del fago mediante genomas clonantes, ADNc u
oligonucleótidos al azar en la dirección 5' o en la dirección 3'
del gen que codifica una proteína de revestimiento de fagos
mediante uso de una técnica de manipulación génica bien conocida
para expresarlas como proteínas de fusión capsídicas que entonces se
pueden usar como una librería genómica, una librería de ADNc, o una
librería de péptidos al azar, respectivamente.
Entre los métodos específicos para obtener el
péptido epitópico del anticuerpo de la enfermedad de Crohn usando
la técnica de detección, en la presente invención es adecuado el
siguiente método que usa una librería de ADNc.
En primer lugar, el ARN total se extrae de
células cultivadas, tales como células de cáncer de colon, y el ARN
poli(A)^{+} se purifica con una columna
oligo(dT). A partir de esto, se sintetiza un ADNc
monocatenario usando un oligonucleótido al azar (preferiblemente con
alrededor de ocho bases) y transcriptasa inversa. Después, se
sintetiza ADNc bicatenario usando ARNasaH y ADN polimerasa de E.
coli, se une a secuencias ligadoras, y se digiere
posteriormente con enzima de restricción para obtener ADNc
bicatenario que tiene extremos cohesivos. Finalmente, se escinde un
ADN fágico mediante la misma enzima de restricción, y se liga con
el ADNc anterior mediante ADN ligasa, para construir una librería
de ADNc según un método de empaquetamiento in vitro.
La librería de ADNc resultante se añade a una
microplaca, microperlas, o similar, a la que el anticuerpo del
suero del paciente con enfermedad de Crohn se inmovilizó
previamente vía la Proteína G o similar para capturar fagos que se
unen específicamente al anticuerpo del suero del paciente con
enfermedad de Crohn. No hay ninguna restricción particular para el
anticuerpo del suero de paciente con enfermedad de Crohn a
inmovilizar en una microplaca o similar, en tanto que sea capaz de
unirse al menos a un antígeno. Por ejemplo, se puede usar el propio
suero recogido de un paciente con enfermedad de Crohn. Además, tal
suero se puede precipitar con una disolución de sulfato de amonio,
o se puede purificar con Proteína A antes del uso.
Los fagos que no son de interés, que no se unen
o que se unen débilmente, se eliminan por lavado, y tal
procedimiento se repite varias veces, y después el anticuerpo
inmovilizado del suero de paciente con enfermedad de Crohn y los
fagos se disocian mediante dodecilsulfato de sodio (en lo sucesivo,
abreviado como SDS) o similar, de forma que se puedan eluir los
fagos capaces de unirse al anticuerpo de la enfermedad de Crohn en
un suero de paciente con enfermedad de Crohn.
A fin de seleccionar adicionalmente fagos que
tienen una especificidad por el anticuerpo del suero de paciente
con enfermedad de Crohn, se infecta un hospedante de E. coli
con la suspensión fágica eluída anterior, y se deja que forme
placas individuales en un medio de LB agar que contiene un inductor
de la expresión de proteínas
(isopropil-\beta-D(-)-tiogalactopiranósido,
etc.). Estas placas se transfieren a una membrana de microcelulosa,
etc., y se someten a inmunotinción usando un suero de paciente con
enfermedad de Crohn, de forma que se puedan especificar y aislar
los fagos que se unen al anticuerpo del suero de paciente con
enfermedad de Crohn.
Los fagos resultantes se inmovilizan en una
microplaca o similar vía un anticuerpo antifágico, y se hacen
reaccionar con sueros procedentes de pacientes con enfermedad de
Crohn, procedentes de pacientes con colitis ulcerosa, y procedentes
de población sana, de forma que los fagos que reaccionan
específicamente con el anticuerpo del suero de pacientes con
enfermedad de Crohn se puedan seleccionar basándose en su
reactividad (en lo sucesivo denominado también aquí como ELISA
fágico). Específicamente, los fagos obtenidos anteriormente se
inmovilizan haciéndolos reaccionar con un anticuerpo antifágico
inmovilizado a un soporte dado, tal como una microplaca. Los fagos
inmovilizados se hacen reaccionar con sueros procedentes de
pacientes con enfermedad de Crohn así como con sueros de control,
tales como sueros procedentes de población sana, sueros procedentes
de pacientes con colitis ulcerosa o con otras enfermedades tales
como enfermedad autoinmunitaria, cáncer de colon, enteritis aguda,
úlcera gástrica y úlcera duodenal, de forma que los fagos que
reaccionan específicamente con los sueros de pacientes con
enfermedad de Crohn se puedan seleccionar basándose en su
reactividad.
A partir de los fagos seleccionados mediante la
detección por el ELISA fágico descrito anteriormente, se extraen y
se purifican los ADN, y las secuencias de bases de los ADNc
insertados se pueden determinar mediante el método didesoxi o
similar. Basándose en la secuencia de bases resultante, se puede
determinar una secuencia de aminoácidos, y de este modo se puede
obtener el péptido epitópico del anticuerpo de la enfermedad de
Crohn según la presente invención mediante una síntesis química
general y similar, incluyendo síntesis peptídica mediante un método
en fase líquida o un método en fase sólida.
Específicamente, basándose en la secuencia de
aminoácidos determinada, la síntesis química es posible mediante el
método de alargamiento por etapas o de condensación de fragmentos.
Los métodos conocidos convencionalmente se pueden usar para la
eliminación, condensación, y similar, del grupo protector de
aminoácidos usados en la síntesis peptídica, a fin de preparar un
péptido de interés. Los ejemplos incluyen aquellos métodos
descritos en las siguientes publicaciones: M. Bodanszky y M. A.
Ondetti, "Peptide Synthesis", Interscience Publishers, New
York, 1966; Schroeder and Luebke, "The Peptide", Academic
Press, New York, 1965; Nobuo lzumiya, et al., "Pepuchido
Gosei No Kiso To Jikken" en transliteración japonesa, que
significa Foundation and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen,
1975; Haruaki Yajima y Shunpei Sakakibara, "Seikagaku Jikkenn
Koza 1, Tanpakushitsu No Kagaku IV" en transliteración japonesa,
que significa Biochemical Experiment Lecture 1, Protein Chemistry
IV, 205, 1977; Haruaki Yajima, ed., "Zoku Iyakuhin No Kaihatsu
Vol. 14, Pepuchido Gosei" en transliteración japonesa, que
significa Sequel Drug Development, Vol. 14, Peptide Synthesis,
Hirokawa Publishing.
Adicionalmente, basándose en la secuencia de
aminoácidos determinada, se pueden preparar péptidos modificados
artificialmente, en los que se sustituyen, suprimen o añaden uno o
más aminoácidos. Específicamente, se pueden preparar mediante
técnicas de ingeniería genética, tales como mutagénesis específica
del sitio, y técnicas de síntesis química conocidas
convencionalmente, tales como el método de fosforomidito como se
describe anteriormente. Estos péptidos modificados se pueden usar
como el péptido epitópico del anticuerpo de la enfermedad de Crohn
según la presente invención.
Además, basándose en la secuencia de aminoácidos
determinada, se pueden buscar en las bases de datos secuencias
peptidicas homólogas. Un péptido altamente homólogo, o una proteína
que contiene tal péptido, se puede preparar mediante una técnica de
biología molecular conocida, el cual se puede usar como el péptido
epitópico del anticuerpo de la enfermedad de Crohn según la
presente invención.
El péptido epitópico del anticuerpo de la
enfermedad de Crohn según la presente invención obtenido como se
describe anteriormente se puede aislar y purificar mediante una
combinación de métodos de separación y purificación de proteínas o
péptidos convencionalmente conocidos. Estos métodos de separación y
purificación conocidos incluyen aquellos que usan la solubilidad,
tales como precipitación con sales y precipitación con disolventes;
aquellos que usan principalmente la diferencia de pesos
moleculares, tales como diálisis, ultrafiltración y filtración en
gel; aquellos que usan la diferencia de cargas, tales como
cromatografía de intercambio fónico y electroforesis en
SDS-gel de poliacrilamida; aquellos que usan la
afinidad específica, tales como la cromatografía de afinidad;
aquellos que usan diferencia de hidrofobia, tales como la
cromatografía de líquidos de altas prestaciones de fase inversa; y
aquellos que usan la diferencia del punto isoeléctrico, tal como
enfoque isoeléctrico. Además, la composición de aminoácidos de un
péptido purificado se puede medir y analizar fácilmente usando un
analizador de aminoácidos.
Cuando un péptido obtenido mediante el método
anterior está en forma libre, se puede convertir en una sal
adecuada mediante un método conocido o un método equivalente al
mismo. Por el contrario, cuando un péptido se obtiene como una sal,
se puede convertir en una forma libre u otra sal mediante un método
conocido o un método equivalente al mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido epitópico obtenido anteriormente del
anticuerpo de la enfermedad de Crohn tiene la propiedad de unirse
específicamente al anticuerpo de la enfermedad de Crohn en sueros
de pacientes con enfermedad de Crohn. Aprovechando tal propiedad de
unión, se proporciona un reactivo de ensayo, un kit de ensayo, y un
método de ensayo para la enfermedad de Crohn, los cuales emplean
tal péptido como ingrediente activo.
Específicamente, se proporciona 1) un reactivo
de ensayo para la enfermedad de Crohn, que comprende como
ingrediente activo un péptido epitópico descrito anteriormente del
anticuerpo de la enfermedad de Crohn; 2) un kit de ensayo para la
enfermedad de Crohn, que comprende el reactivo de ensayo descrito
en el apartado 1) anterior; 3) un método de ensayo para la
enfermedad de Crohn, que comprende una etapa de detección de la
ausencia o presencia de un anticuerpo que se une específicamente a
al menos un péptido de los péptidos epitópicos anteriores del
anticuerpo de la enfermedad de Crohn, o una sal del mismo, en una
muestra biológica; y 4) un método de ensayo para la enfermedad de
Crohn, que comprende la etapa de usar el reactivo de ensayo o kit
de ensayo anterior.
Cuando el péptido epitópico anterior del
anticuerpo de la enfermedad de Crohn se usa como ingrediente
activo, el ingrediente activo específico es al menos un péptido o
una sal del mismo seleccionado del grupo que consiste en (a) un
péptido que comprende una secuencia de aminoácidos representada por
SEQ ID NO: 3, o una sal del mismo; y (b) un péptido o una sal del
mismo, en el que el péptido comprende una secuencia de aminoácidos
modificada representada por SEQ ID NO: 3 en la que uno o mas
aminoácidos están sustituidos o suplementados con otro aminoácido, o
suprimidos, o comprende una parte de tal secuencia de aminoácidos,
y tiene la propiedad de unirse específicamente al anticuerpo en
sueros de pacientes con enfermedad de Crohn.
Como el ingrediente activo del reactivo de
ensayo para la enfermedad de Crohn, los péptidos epitópicos
anteriores del anticuerpo de la enfermedad de Crohn se pueden usar
de forma individual o en cualquier combinación de dos o más.
El reactivo de ensayo para la enfermedad de
Crohn según la presente invención se puede usar como un antígeno
que se une específicamente al anticuerpo de la enfermedad de Crohn,
de forma que se pueda llevar a cabo la detección, captura, y
similar, del anticuerpo de la enfermedad de Crohn. Para cubrir el
alcance de estos fines, el ingrediente activo puede ser no sólo los
péptidos epitópicos anteriores del anticuerpo de la enfermedad de
Crohn, sino también una forma marcada (un péptido marcado), en el
que el péptido se marca con algún compuesto marcador. Además, el
reactivo de ensayo puede contener otros componentes.
Como el compuesto marcador de los péptidos
anteriores, se puede usar un compuesto marcador usado habitualmente
en la técnica, y los ejemplos específicos del mismo incluyen
radioisótopos tales como ^{3}H, ^{14}C, ^{131}I, y ^{99m}Tc;
enzimas tales como \beta-galactosidasa,
\beta-glucosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa
y malato deshidrogenasa; sustancias fluorescentes tales como
fluorescamina e isotiocianato de fluoresceína; y sustancias
luminiscentes tales como luciferina, derivados de luminol y
derivados de isoluminol.
Usando un péptido de la presente invención, que
está marcado con una enzima, un radioisótopo o similar, se puede
llevar a cabo la detección, captura, y similar del anticuerpo de la
enfermedad de Crohn. Además, como se describirá con detalle más
adelante, como reactivo de ensayo se puede usar también un péptido
de la presente invención sin marcarlo, utilizando, por ejemplo, un
inmunoensayo, tal como un radioinmunoensayo y un inmunoensayo
enzimático.
Cuando la enfermedad de Crohn se ensaya usando
una muestra biológica tal como sangre (suero o plasma) de un
sujeto, es fácil y conveniente hacer uso de un kit de ensayo que
contiene el reactivo anterior, que comprende como ingrediente
activo el péptido epitópico del anticuerpo de la enfermedad de
Crohn.
El kit de ensayo para la enfermedad de Crohn
según la presente invención puede usar no sólo un péptido epitópico
del anticuerpo de la enfermedad de Crohn según la presente
invención, sino también una forma marcada (un péptido marcado), en
la que el péptido se marca con algún compuesto marcador como se
describe anteriormente, en tanto que el kit de ensayo contenga el
reactivo de ensayo anterior, a fin de permitir que el reactivo se
una al anticuerpo de la enfermedad de Crohn. Además, el péptido se
puede usar en una forma inmovilizada, inmovilizando previamente el
péptido a un soporte dado (una fase sólida).
Además del reactivo anterior, un kit de ensayo
para la enfermedad de Crohn según la presente invención puede usar
opcionalmente otros reactivos, dependiendo de los tipos de métodos
de inmunoensayo y de detección empleados o adaptados para el ensayo
de la enfermedad de Crohn que se describirán más adelante. Por
ejemplo, cuando el péptido epitópico del anticuerpo de la
enfermedad de Crohn se usa en una forma marcada con un
radioisótopo, se requiere un dispositivo de detección de la
radiactividad, tal como un contador de centelleo de líquidos; y
cuando se usa en una forma marcada con una enzima, una sustancia
fluorescente o una sustancia luminiscente, se requiere un
dispositivo de detección correspondiente. Por lo tanto, en el
presente kit de ensayo están contenidos como otros ingredientes un
reactivo de detección, un disolvente, un material base y similar
requeridos para cada fin.
Especialmente, el kit de ensayo de la presente
invención contiene preferiblemente un anticuerpo secundario
(anticuerpo anti-IgG humana, por ejemplo anticuerpo
de ratón anti-IgG humana) para detectar
inmunoglobulina humana (también denominada IgG humana), como
ingrediente distinto del reactivo de ensayo anterior que comprende
como ingrediente activo el péptido epitópico anterior del
anticuerpo de la enfermedad de Crohn. El anticuerpo
anti-IgG humana se puede marcar con un compuesto
marcador descrito anteriormente, o se puede inmovilizar previamente
a un soporte dado (una fase sólida).
Además, el kit de ensayo puede incluir un
sustrato enzimático o una enzima requerida por el compuesto
marcador; un reactivo de detección para detectar una reacción entre
el compuesto marcador y el sustrato enzimático; y otros, para
llevar a cabo convenientemente la medida, incluyendo diversas
muestras adecuadas, disoluciones diluyentes para los reactivos, el
anticuerpo secundario o similar, un anticuerpo estándar, una
disolución tampón, una disolución de lavado, una disolución de
sustrato enzimático, y una disolución de terminación de la
reacción. Además, cuando el reactivo de ensayo anterior o el
anticuerpo anti-IgG humana no está marcado o
inmovilizado, el kit de ensayo puede incluir, como otro componente,
un compuesto marcador descrito anteriormente o un soporte (fase
sólida).
El kit de ensayo para la enfermedad de Crohn
según la presente invención es una combinación del reactivo de
ensayo anterior, que comprende como ingrediente activo el péptido
epitópico del anticuerpo de la enfermedad de Crohn (péptido el cual
puede estar inmovilizado y/o marcado), con al menos uno
seleccionado de forma arbitraria de un anticuerpo
anti-IgG humana (que es el anticuerpo secundario que
puede estar inmovilizado y/o marcado); un sustrato requerido por un
compuesto marcador (un sustrato enzimático cuando el compuesto
marcador es una enzima; una enzima cuando el compuesto marcador es
una sustancia fluorescente o una sustancia luminiscente, etc.); una
disolución diluyente del anticuerpo; un anticuerpo estándar; una
disolución tampón; una disolución de lavado; una disolución de
sustrato enzimático; una disolución de terminación de la reacción;
un soporte (una fase sólida); y un compuesto marcador. En el kit
de ensayo para la enfermedad de Crohn según la presente invención,
es preferible usar una enzima como el compuesto marcador, desde el
punto de vista de operabilidad, seguridad, sensibilidad y exactitud
de medida, y similar.
En el método de ensayo para la enfermedad de
Crohn según la presente invención se puede usar como muestra una
muestra biológica de un sujeto para examinar si cada sujeto está
afectado o no por la enfermedad de Crohn. Específicamente, el hecho
de que cada sujeto esté afectado o no por la enfermedad de Crohn se
examina usando, como marcador, un cierto anticuerpo que está
presente específicamente en muestras biológicas de pacientes con
enfermedad de Crohn. La muestra incluye diversas muestras
biológicas tales como sangre (suero o plasma), orina, sudor, saliva,
semen y fluido de la médula espinal de un sujeto (humano), y es
preferiblemente un suero o plasma.
El método de ensayo para la enfermedad de Crohn
según la presente invención se caracteriza porque como sustancia
antigénica se usa el péptido epitópico anterior del anticuerpo de la
enfermedad de Crohn. Específicamente, cuando el anticuerpo de la
enfermedad de Crohn está presente en una muestra biológica del
sujeto, forma un complejo con el péptido epitópico del anticuerpo
de la enfermedad de Crohn como antígeno, debido a una reacción
antígeno-anticuerpo. Detectando y midiendo tal
complejo, se diagnostica la aparición o no de la enfermedad de Crohn
y similar.
Los métodos para detectar el complejo producido
por la reacción entre el péptido epitópico del anticuerpo de la
enfermedad de Crohn como antígeno y el anticuerpo de la enfermedad
de Crohn característico de pacientes con la enfermedad de Crohn
pueden ser métodos convencionalmente conocidos. Sus ejemplos
incluyen radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático,
inmunocromatografía, y similares. Cuando estos ensayos
inmunológicos se usan para el método de ensayo de la presente
invención, no se requieren condiciones, operaciones, o similares,
especiales. El sistema de medida se puede construir usando
condiciones y operaciones habituales de cada técnica, junto con
consideraciones tecnológicas generales dadas por el experto en la
técnica. Para una descripción detallada de tales técnicas generales,
se hace referencia a repasos y libros. Por ejemplo, se pueden citar
Hiroshi Irie, ed., "Radioimmunoassay" (Kodansha, 1964);
Hiroshi Irie, ed., "Sequel Radioimmunoassay" (Kodansha, 1979);
Eiji Ishikawa, et al., ed., "Koso Meneki Sokuteiho" en
transliteración japonesa, que significa Enzyme Immunoassay
(Igakushoin, 1978); Eiji Ishikawa, et al., ed., "Koso
Meneki Sokuteiho" en transliteración japonesa, que significa
Enzyme Immunoassay (2ª ed.) (Igakushoin, 1982); Eiji Ishikawa, et
al., ed., "Koso Meneki Sokuteiho" en transliteración
japonesa, que significa Enzyme Immunoassay (3ª ed.) (Igakushoin,
1987).
Además, en el método de ensayo para la
enfermedad de Crohn según la presente invención, preferiblemente se
usa el reactivo de ensayo o el kit de ensayo anterior, que
comprende, como ingrediente activo, el péptido epitópico anterior
del anticuerpo de la enfermedad de Crohn.
Específicamente, como el método de ensayo para
la enfermedad de Crohn según la presente invención, se pueden
emplear diversos ensayos inmunológicos que utilizan como sustancia
antigénica el péptido epitópico anterior del anticuerpo de la
enfermedad de Crohn. Por ejemplo, refiriéndonos a un ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzima (en lo sucesivo también denominado
ELISA) en fase sólida, que usa como muestra un suero humano, el
anticuerpo de la enfermedad de Crohn a examinar se puede detectar y
medir mediante el siguiente método.
En primer lugar, el péptido epitópico anterior
del anticuerpo de la enfermedad de Crohn como la sustancia
antigénica se inmoviliza a un soporte o similar, al que se añade
como muestra una muestra biológica. Si el anticuerpo de la
enfermedad de Crohn está presente en la muestra, se une al péptido
inmovilizado. Después, el anticuerpo de la enfermedad de Crohn
presente en la muestra se puede detectar y medir llevando a cabo una
segunda reacción antígeno-anticuerpo, una detección,
y similar, usando un reactivo de detección tal como un anticuerpo
anti-IgG humana (incluyendo el anticuerpo secundario
uno marcado con una sustancia marcadora) que se une específicamente
a IgG humana.
Como alternativa, un reactivo de detección, tal
como un anticuerpo anti-IgG humana, se puede
inmovilizar previamente al soporte, al que se añade una muestra de
forma que se capture el anticuerpo de la enfermedad de Crohn en una
muestra biológica. Después, añadiendo como sustancia antigénica el
péptido epitótico del anticuerpo de la enfermedad de Crohn
anterior, también se puede detectar y medir el anticuerpo de la
enfermedad de Crohn presente en la muestra. La selección de
diversos medios para estas técnicas de ensayo, modificaciones de las
mismas, y similares, son bien conocidos por los expertos en la
técnica, y de este modo todos ellos se pueden usar en la presente
invención (véase "Rinsho Kensaho Teiyo" en transliteración
japonesa, que significa Laboratory Test Methods Synopsis, Kanehara,
1995; etc.).
No hay ninguna restricción particular en los
reactivos de detección, tales como un anticuerpo
anti-IgG humana, para detectar el anticuerpo de la
enfermedad de Crohn, y se pueden usar diversos reactivos
comercialmente disponibles usados habitualmente. Por ejemplo,
preferiblemente se usan anticuerpos anti-IgG humana
que se unen específicamente a IgG humana, los cuales se pueden
obtener sensibilizando especies no humanas tales como ratón, conejo,
cabra y cerdo con IgG humana como antígeno. Estos anticuerpos
anti-IgG humana e IgG humana se pueden marcar con
un compuesto marcador descrito anteriormente. El compuesto marcador
usado para este marcaje incluye los compuestos marcadores descritos
anteriormente. Particularmente, se prefieren aquellos marcados con
compuestos marcadores tales como enzimas. Estos anticuerpos
anti-IgG humana e IgG humanas marcados están
comercialmente disponibles, pero se pueden preparar según métodos
normales.
En el método de ensayo para la enfermedad de
Crohn según la presente invención, preferiblemente se emplean
inmunoensayos enzimáticos, tales como ELISA, que usa una enzima como
compuesto marcador como se describe anteriormente, desde los puntos
de vista de operabilidad, seguridad, sensibilidad y exactitud de la
medida, y similar. Los compuestos marcadores para el marcaje de la
enzima incluyen los descritos anteriormente. Además, los métodos de
marcaje que usan estos compuestos marcadores de enzimas pueden ser
métodos conocidos convencionalmente (Eiji Ishikawa, et al.,
"Koso Meneki Sokuteiho" en transliteración japonesa, que
significa Enzyme Immunoassay, 2ª ed., Igakushoin, 1982; etc.).
Además, cuando en el ensayo anterior se emplea
un método en fase sólida, no hay ninguna restricción particular con
respecto a los soportes, en tanto que sean portadores insolubles e
inertes, y se puedan usar generalmente los empleados de forma
habitual. Sus ejemplos incluyen microplacas, perlas, membranas,
barritas, tubos de ensayo y similares, que están hechos de
materiales tales como vidrio, Sephadex®, Sepharosa®, y resinas
plásticas (poliestireno, polipropileno, policarbonato,
etcétera).
Además, el péptido epitópico del anticuerpo de
la enfermedad de Crohn según la presente invención como el antígeno,
o el anticuerpo anti-IgG humana como el anticuerpo
secundario, se puede hacer insoluble mediante adsorción física.
También se pueden hacer insolubles mediante un método que se basa
en la unión química, que se emplea generalmente para hacer
insolubles o inmovilizar proteínas, enzimas o similares.
En el ELISA anterior, se hace reaccionar una
muestra con el péptido epitópico inmovilizado del anticuerpo de la
enfermedad de Crohn (la reacción primaria), y después el anticuerpo
anti-IgG humana marcado se hace reaccionar con
aquel (la reacción secundaria), seguido de la medida de la
actividad del compuesto marcado sobre el portador inmovilizado. De
ese modo, se puede detectar o cuantificar el anticuerpo de la
enfermedad de Crohn contenido en la muestra. La reacción primaria y
la reacción secundaria se pueden llevar a cabo al mismo tiempo, o a
cierto intervalo. Los métodos para el marcaje e inmovilización
pueden ser similares a los descritos anteriormente. Además, en el
inmunoensayo mediante ELISA, el anticuerpo inmovilizado sobre el
soporte, o el anticuerpo marcado, no debería ser necesariamente de
un tipo, sino que puede ser una mezcla de dos o más tipos de
anticuerpos con el fin de aumentar la sensibilidad de la medida,
etc.
Los disolventes usados en el sistema de medida
anterior pueden ser los empleados habitualmente, en tanto que no
afecten a las reacciones, y sus ejemplos incluyen disoluciones
tampón de pH de alrededor de 6 a 9, tal como una disolución tampón
de fosfato (en lo sucesivo abreviada como PBS), una disolución
tampón de borato, una disolución tampón de tris-HCl,
una disolución tampón de citrato y una disolución tampón de acetato;
y aquellas disoluciones tampón que contienen un tensioactivo tal
como Tween® 20 y Triton®-100, un estabilizante tal como seroalbúmina
bovina (en lo sucesivo abreviada como BSA) y proteína láctea, o un
conservante tal como NaN3.
No hay ninguna restricción en las condiciones de
reacción inmunitaria, y se adaptan condiciones habituales usadas
generalmente para inmunoensayos. En general, las condiciones pueden
ser a una temperatura de alrededor de 4 a 40°C durante alrededor de
0,5 a 24 horas.
En los procedimientos anteriores, el ensayo para
el complejo (que incluye uno en una forma marcada con un compuesto
marcado) que resulta de la reacción
antígeno-anticuerpo se puede llevar a cabo mediante
un método adecuado para el tipo del compuesto marcador en uso. Por
ejemplo, cuando el compuesto marcador es una enzima, la actividad
enzimática de la forma marcada se puede medir según un método
conocido adecuado para el tipo de la enzima en uso.
El ensayo para tal actividad enzimática se puede
llevar a cabo mediante un método usado ampliamente, en el que se
añade un sustrato adecuado para la enzima, por ejemplo
3,3',5,5'-tetrametilbencidina (abreviada como TMB) u
o-fenilendiamina (abreviada como OPD) para
peroxidasa, o fosfato de p-nitrofenilo (abreviado
como pNPP) para fosfatasa alcalina, y se hace reaccionar durante un
intervalo de tiempo dado, seguido de la medida, mediante un
espectrofotómetro o similar, del color generado.
\vskip1.000000\baselineskip
El método de ensayo para la enfermedad de Crohn
según la presente invención se resume a continuación:
- <1>
- El péptido epitópico del anticuerpo de la enfermedad de Crohn como un antígeno se inmoviliza en cada pocillo de una microplaca. Habitualmente, los sitios de unión no específica en el pocillo se bloquean con una proteína tal como BSA y caseína, o un tensioactivo tal como Tween® 20;
- <2>
- Las muestras (muestras de suero o de plasma) se diluyen con una disolución tampón (una disolución que diluye la muestra) que contiene opcionalmente una proteína tal como BSA y caseína, o un tensioactivo tal como Tween® 20, y después se añade a la microplaca inmovilizada anterior, para efectuar de ese modo la reacción antígeno-anticuerpo (la reacción primaria);
- <3>
- La microplaca se lava con una disolución tampón (una disolución de lavado) que contiene preferiblemente un tensioactivo tal como Tween® 20, y entonces se diluye el anticuerpo anti-IgG humana marcado con una disolución tampón (la disolución diluyente) que contiene una proteína tal como BSA y caseína, o un tensioactivo tal como Tween® 20, y se añade a aquella para efectuar la reacción antígeno-anticuerpo (la reacción secundaria); y
- <4>
- Después de que la microplaca se lava con la disolución de lavado anterior, se lleva a cabo un ensayo adecuado para el marcador, esto es, se mide la radioactividad para el radiomarcado, y se mide la actividad enzimática para el marcado enzimático.
\vskip1.000000\baselineskip
En lo sucesivo, se ilustran ejemplos de trabajo
para explicar la presente invención adicionalmente con detalle,
pero la presente invención no se debería de considerar que está
limitada a estos ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajo y se purificó ARN total de alrededor
de 10^{8} células cultivadas de Caco-2 (Calcinoma
de colon humano; RIKEN CELL BANK) usando un kit de extracción de ARN
de Qiagen, para obtener 654 \mug del ARN total. Usando una
columna de oligo(dT)-celulosa, se purificaron
22,8 \mug de poli(A)^{+} ARN a partir de 600
\mug del ARN total, y después se sintetizó un ADNc monocatenario
usando un oligómero al azar (nnnnnnCG) y transcriptasa inversa
(Omni-RT de Qiagen).
Después, usando ARNasaH y ADN polimerasa I de
E. coli, se sintetizó ADNc bicatenario, al cual entonces se
le despuntaron sus extremos mediante T4 ADN polimerasa. Después de
que el ADNc se metilase mediante metilasa, las secuencias ligadoras
(oligoADN de 18 mers) se ligaron mediante T4 ADN ligasa, y después
los extremos del ADNc se escindieron mediante enzimas de restricción
(EcoRI y NotI), seguido de la filtración en gel con una columna de
giro (de Clontech) para eliminar los ligadores sin reaccionar y
pequeños fragmentos escindidos.
Se escindió un vector fágico de T7 (de Novagen)
mediante las mismas enzimas de restricción, al que se ligaron
mediante T4 ADN ligasa los fragmentos de ADNc obtenidos
anteriormente. Para formar las partículas fágicas se usó esta
disolución de ligación y un kit de empaquetamiento in vitro
del fago T7 (de Novagen), con las cuales se infectó entonces el
hospedante E. coli BLT 5615 para permitir su amplificación.
Se preparó una librería de ADNc que tiene un tamaño de alrededor de
1,3 X 10<7>.
Se inoculó una única colonia del hospedante
E. coli BLT 5615 en un medio LB que contiene 50 g/ml de
ampicilina para llevar a cabo el cultivo a 37°C hasta que la
turbidez a 600 nm fue de 0,5. A esta disolución de cultivo de E.
coli se añadió
isopropil-\beta-D(-)-tiogalactopiranósido
(en lo sucesivo abreviado como IPTG), a la concentración final de
1 mM, para llevar a cabo el cultivo a 37°C durante 30 min. Después,
se le añadió la librería de ADNc preparada en 1), o una librería de
ADNc comercialmente disponible derivada de cáncer de colon, para
continuar el cultivo a 37°C hasta que se produjese la lisis total.
Inmediatamente después de la lisis, la mezcla se enfrió en hielo,
seguido de la centrifugación para eliminar fragmentos celulares
lisados, y de ese modo se obtuvo un sobrenadante. A este
sobrenadante se añadió tampón de leche (un tampón de
tris-HCl 25 mM (que contiene 137 mM de NaCl, y 2,68
mM de KCl; pH 7,4) (en lo sucesivo abreviado como TBS) que contiene
5% de leche desnatada y 0,1% de Tween® 20) del volumen equivalente
para obtener una disolución de fagos lisados que se usó en el
siguiente procedimiento.
A una microplaca (de Dynatec Lab.) se añadió
Proteína G (de Sigma), diluida con PBS hasta 20 \mug/ml, para que
reaccionase a 4°C toda la noche. Después de la reacción, la
microplaca se lavó con un tampón de leche, y después se bloqueó con
el mismo tampón para preparar una placa unida a la Proteína G.
Se obtuvieron muestras séricas procedentes de 21
pacientes con enfermedad de Crohn. A partir del conjunto de sueros,
se obtuvo el equivalente sérico en volumen de una a tres muestras de
pacientes, y se diluyó con PBS que contiene 0,05% de NaN_{3}, que
entonces se añadió a la placa unida a la Proteína G. La placa se
dejó reposar a 22°C durante 2 h, de forma que los anticuerpos en el
suero se uniesen a la placa, seguido del lavado tres veces con un
tampón de leche para preparar una placa unida a anticuerpos de
sueros de pacientes con enfermedad de Crohn.
A la placa unida a anticuerpos de sueros de
pacientes con enfermedad de Crohn se añadió la disolución de fagos
lisados anteriores (un título de fagos de alrededor de 1 x
10^{11} pfu), que entonces se agitó suavemente a temperatura
ambiente durante 3 h para permitir que los fagos que expresan los
anticuerpos se unan a aquella. La placa se lavó con un tampón de
leche y TBS para eliminar la suspensión de fagos no unidos, y
después se añadió PBS que contiene 0,5% de SDS y se agitó a
temperatura ambiente durante 20 minutos para eluir los fagos
unidos, y de ese modo se obtuvo un eluato de fagos.
Con el eluato de fagos así obtenido, se infectó
el hospedante E. coli BLT 5615, que entonces se inoculó en
un medio de LB agar que contiene 50 \mug/ml de ampicilina y 1 mM
de IPTG para llevar a cabo el cultivo a 37°C durante 3 h, y de ese
modo se formaron placas. Las placas resultantes se dejaron reposar
a 4°C durante 1 h, las cuales se cubrieron entonces con una
membrana de microcelulosa (de Osmonics). La membrana se dejó
reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos para transferirles
las partículas fágicas.
La membrana se bloqueó con un tampón de leche, y
después se empaparon en un suero de pacientes con enfermedad de
Crohn diluido con el mismo tampón, que entonces se agitó suavemente
a 4°C toda la noche. Esta membrana se lavó tres veces con un tampón
de leche, y después se empapó en una disolución en la que se
diluyeron anticuerpos monoclonales anti-IgG humana
marcados con fosfatasa alcalina (de Sigma) hasta 1/5000 con el
mismo tampón, seguido de la agitación suave a temperatura ambiente
durante 1 h.
Esta membrana se lavó tres veces con un tampón
de leche, después se lavó con 100 mM de tris-HCl
(que contiene 100 mM de NaCl y 5 mM de MgCl_{2}; pH 9,5) (en lo
sucesivo abreviado como tampón AP), y después se empapó en un
tampón AP que contiene una disolución cromógena (0,33 mg/ml de
nitroazultetrazolio (en lo sucesivo abreviado como NBT) y 0,165
mg/ml de fosfato de bromocloroindolilo (en lo sucesivo abreviado
como BCIP)) de forma que se generó color a temperatura
ambiente.
Las placas de fagos aislados inmunoteñidos se
separaron raspando, y se suspendieron en un medio LB que contiene
50 \mug/ml de ampicilina. Una parte del mismo se añadió a una
disolución de cultivo del hospedante E. coli BLT 5615, para
llevar a cabo el cultivo a 37°C hasta que se produjese la lisis
total. Esta disolución lisada se centrifugó para eliminar fragmentos
celulares lisados, y el sobrenadante resultante se suplementó con
CHCl_{3} a la concentración final de 0,3%. Este se almacenó a 4°C
como una disolución de fagos antigénicos clonados que se unen al
anticuerpo de suero de pacientes con enfermedad de Crohn.
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución de cultivo del hospedante E.
coli BLP 5615 se añadieron los fagos antigénicos que se unen al
anticuerpo de suero de pacientes con enfermedad de Crohn obtenidos
en el apartado 3) anterior, para llevar a cabo el cultivo a 37°C
hasta que se produjese la lisis completa. Esta disolución se
centrifugó para eliminar los fragmentos celulares lisados, y el
sobrenadante resultante se suplementó con un volumen de cuatro veces
de un tampón de leche. La disolución resultante se usó para la
reacción primaria en el siguiente procedimiento.
A una microplaca se añadieron anticuerpos
anti-fago T7 (anticuerpos policlonales de conejo)
diluidos con PBS hasta 1 \mug/ml para que reaccionen a 4°C toda
la noche. Después de la reacción, la microplaca se lavó con un
tampón de leche, y después se bloqueó con el mismo tampón para
preparar una placa unida a anticuerpos anti-fago
T7.
La disolución anterior para la reacción primaria
se añadió a la placa unida a anticuerpos anti-fago
T7, y se agitó suavemente a 22°C durante 2 h, de forma que los
fagos se uniesen a la placa, seguido del lavado tres veces con un
tampón de leche. Se le añadieron diversos sueros (derivados de
pacientes con enfermedad de Crohn, pacientes con colitis ulcerosa,
o personas sanas) que se diluyeron hasta 1/250 con el mismo tampón,
y se dejó reposar a 22°C durante 1 h, y después se lavó seis veces
con el mismo tampón. Se le añadió una disolución en la que
anticuerpos monoclonales anti-IgG humana marcados
con fosfatasa alcalina se diluyeron hasta 1/5000 con el mismo
tampón, y se dejó reposar a 22°C durante 1 h, y después se lavó
seis veces con el mismo tampón. Después, la placa se lavó con tampón
AP, y después se suplementó con una disolución de fosfato de
p-nitrofenilo (de Sigma) para efectuar la reacción a
22°C durante 40 min. Se añadió una disolución de terminación (NaOH
2N), para terminar la reacción, y después se midió la absorbancia (a
405 nm) mediante un lector de placas, para comparar los títulos de
anticuerpos en los sueros. A partir de los resultados de
reactividad, se seleccionaron tres clones (por conveniencia,
abreviados como CD#47, CD#336, y CD#353) que mostraron
especificidades elevadas por los sueros de pacientes con enfermedad
de Crohn.
\vskip1.000000\baselineskip
Con los tres fagos antigénicos anteriores que se
unen al anticuerpo del suero de pacientes con enfermedad de Crohn
seleccionados mediante ELISA fágico, se infectó el hospedante E.
coli BLT5615 y después se lisó. De las disoluciones lisadas
resultantes, se extrajeron ADN fágicos usando los kits lambda de
Quiagen (de Quiagen). Las secuencias de bases de ADNc insertadas de
los ADN fágicos se determinaron mediante el método didesoxi. La
secuencia de aminoácidos de cada uno de los clones, determinada
basándose en la secuencia de bases de ADNc insertada respectiva, se
muestra en la Tabla 1 usando un código de una letra.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada péptido lineal que tiene la secuencia de
aminoácidos de cada uno de los clones (por conveniencia, abreviados
como TCP-47, TCP-336, y
TCP-353) se sintetizó y se purificó (por Sigma
Genosis según demanda). Estos péptidos se usaron como péptidos
epitópicos del anticuerpo de la enfermedad de Crohn en los
siguientes experimentos. Las propiedades de cada uno de los péptidos
preparados se muestran en la Tabla 2.
En la Tabla 2, la unidad del peso molecular es
kDa; la pureza se expresa mediante una relación de área basada en
el análisis mediante cromatografía de líquidos (absorbancia a 225
nm); y la hidrofobia es un porcentaje del contenido de aminoácidos
hidrófobos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo un ELISA usando como antígenos
los péptidos epitópicos del anticuerpo de la enfermedad de Crohn
obtenidos en el Ejemplo 1, para estudiar la reactividad con diversos
sueros (procedentes de pacientes con enfermedad de Crohn, pacientes
con colitis ulcerosa, o personas sanas).
A una microplaca, se añadió cada uno de los
péptidos diluido con PBS hasta 2 \mug/ml y se hizo reaccionar a
4°C toda la noche. Después de la reacción, la microplaca se lavó
con un tampón de bloqueo (PBS que contiene 2% de BSA, 5% de
sacarosa, y 0,1% de NaN_{3}), seguido del bloqueo con el mismo
tampón para preparar una placa con péptido inmovilizado.
A una placa con péptido inmovilizado, se
añadieron diversos sueros (sueros de pacientes con enfermedad de
Crohn: 32 muestras, sueros de pacientes con colitis ulcerosa: 32
muestras, y sueros de personas sanas: 32 muestras) que se diluyeron
hasta 1/100 con una disolución diluyente de muestras (PBS que
contiene 1% de BSA y 0,1% de
Tween ® 20), y se dejó reposar a 22°C durante una hora, seguido del lavado seis veces con un tampón de lavado (PBS que contiene 0,1% de Tween ® 20). Después, se le añadió un anticuerpo anti-IgG humana marcado con HRP (de Dako) diluido hasta 1/4000 con el mismo tampón, y se dejó reposar a 22°C durante 1 h, seguido del lavado ocho veces con el mismo tampón de lavado. Se le añadió adicionalmente una disolución de TMB (de Dako) como sustrato cromógeno, y se dejó reaccionar a 22°C durante 30 min., y entonces se añadió una disolución de terminación (H2SO4 2N) para terminar la reacción, seguido de la medida de la absorbancia (de 450 a 600 nm) mediante un lector de placas. Los resultados de la medida se muestran en la Figura 1 como un diagrama de dispersión.
Tween ® 20), y se dejó reposar a 22°C durante una hora, seguido del lavado seis veces con un tampón de lavado (PBS que contiene 0,1% de Tween ® 20). Después, se le añadió un anticuerpo anti-IgG humana marcado con HRP (de Dako) diluido hasta 1/4000 con el mismo tampón, y se dejó reposar a 22°C durante 1 h, seguido del lavado ocho veces con el mismo tampón de lavado. Se le añadió adicionalmente una disolución de TMB (de Dako) como sustrato cromógeno, y se dejó reaccionar a 22°C durante 30 min., y entonces se añadió una disolución de terminación (H2SO4 2N) para terminar la reacción, seguido de la medida de la absorbancia (de 450 a 600 nm) mediante un lector de placas. Los resultados de la medida se muestran en la Figura 1 como un diagrama de dispersión.
Basándose en estos resultados, se llevó a cabo
un ensayo de significancia. Se observa una reactividad
significativamente mayor con el suero de pacientes con enfermedad
de Crohn de los tres péptidos, según se compara con el suero de
pacientes con colitis ulcerosa o el suero de personas sanas. Los
valores de corte se determinaron como se describe más abajo, y,
usando estos, las reacciones positivas se evaluaron para calcular
el porcentaje de positivos para los diversos sueros. Los resultados
se muestran en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Valores de corte:
TCP-47, OD = 0,40: el valor de
OD que da la sensibilidad más elevada en el intervalo de
especificidad de 0,1 o menos de 1 en la curva característica de
funcionamiento del receptor (ROC).
TCP-336, OD = 1,10: lo mismo que
antes.
TCP-353, OD = 0,11: la media de
los valores medidos de los sueros procedentes de personas sanas más
2SD.
\vskip1.000000\baselineskip
En la tabla, el número entre paréntesis indica
el número de muestras.
Como se muestra en la Tabla 3, el porcentaje de
positivos para los sueros de pacientes con enfermedad de Crohn
indicado por TCP-47, TCP-336, y
TCP-353 es 40,6%, 28,1%, y 53,1%, respectivamente,
mientras que el porcentaje de falsos positivos para los sueros de
pacientes con colitis ulcerosa y los sueros de personas sanas fue de
3,1 a 9,4%. Estos resultados demuestran que estos péptidos se unen
específicamente a anticuerpos en los sueros de pacientes con
enfermedad de Crohn.
\vskip1.000000\baselineskip
TCP-353, cuyo porcentaje de
positivos para los sueros de pacientes con enfermedad de Crohn fue
el más elevado (53,1%), y el porcentaje de falsos positivos para
los sueros de pacientes con colitis ulcerosa o para los sueros de
personas sanas fue bajo (6,3% y 3,1%, respectivamente) en el
Ejemplo 2, se usó para medir algunas de las muchas muestras de suero
(sueros de pacientes con enfermedad de Crohn: 60 muestras, sueros
de pacientes con colitis ulcerosa: 109 muestras, sueros de personas
sanas: 71 muestras, sueros de pacientes con enteritis aguda: 11
muestras, sueros de pacientes con cáncer de color: 35 muestras, y
sueros de pacientes con hepatopatía crónica: 49 muestras).
La medida se llevó a cabo de la misma manera
como en el Ejemplo 2, excepto que el suero se diluyó hasta 1/400.
Además, usando una disolución estándar preparada reuniendo sueros
de pacientes positivos, se dibujó una curva estándar, y los valores
de la absorbancia resultantes se convirtieron en valores unitarios.
Los resultados de la medida se muestran en la Figura 3 como un
diagrama de dispersión.
Basándose en estos resultados, se llevó a cabo
un ensayo de significancia. Se observó una reactividad de
TOP-353 con los sueros de pacientes con enfermedad
de Crohn significativamente mayor que con los sueros de pacientes
con colitis ulcerosa, los sueros de personas sanas, los sueros de
pacientes con enteritis aguda, los sueros de pacientes con cáncer de
colon, y los sueros de pacientes con hepatopatía crónica.
Además, el número de sueros de pacientes
positivos y su porcentaje de positivos se muestran en la Tabla 4,
con la condición de que el valor de corte se ajustó para que fuese
un valor de la media de los valores medidos de las 71 muestras de
suero de personas sanas más 3SD.
\vskip1.000000\baselineskip
En la tabla, los números entre paréntesis
indican el número de muestras.
Como se muestra en la Tabla 4, el porcentaje de
positivos para los sueros de pacientes con enfermedad de Crohn es
61,7% (37/60), mientras que el porcentaje de falsos positivos para
los sueros de pacientes con colitis ulcerosa, los sueros de
personas sanas, los sueros de pacientes con enteritis aguda, los
sueros de pacientes con cáncer de co-ion, y los
sueros de pacientes con hepatopatia crónica es 7,3% (8/109), 2,8%
(2/71), 0% (0/11), 11,4% (4/35), y 8,2% (4/49), respectivamente.
Estos resultados demuestran que el presente método de ensayo se
puede usar para detectar la aparición o no de la enfermedad de
Crohn, y distinguir la enfermedad de Crohn de otras enfermedades
relacionadas, en particular colitis ulcerosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió la reactividad del anticuerpo
anti-levadura de cocina (abreviado
ASCA-IgG), el cual se ha dado a conocer que está
relacionado con la enfermedad de Crohn (Gut, 1998, 42,
788-791; Am J Gastroenterol., 2000, 95,
359-367; Am J Gastroenterol., 2001, 96,
730-734), con diversos sueros, y se comparó con
ELISA usando TCP-353 (en lo sucesivo, también
denominado TCP-353 ELISA) en términos de utilidad en
el diagnóstico de la enfermedad de Crohn.
\newpage
La medida mediante ELISA usando
ASCA-IgG (en lo sucesivo, denominado también como
ASCA-IgG ELISA) se realizó usando un kit de GENESIS
Diagnostics según el manual de instrucciones del mismo. Los
resultados de la medida se muestran en la Figura 4 como un diagrama
de dispersión. El valor de corte se predeterminó en
ASCA-IgG ELISA de forma que la especificidad fue
90%, y se obtuvo el porcentaje de reactividad para cada suero. Los
resultados, mediante comparación en el porcentaje de positivos entre
ASCA-IgG ELISA y TCP-353 ELISA, se
muestran en la Tabla 5.
Además, los valores medidos de los sueros de
pacientes con enfermedad de Crohn mediante ASCA-IgG
ELISA y mediante TCP-353 ELISA se representan
gráficamente a lo largo de los ejes vertical y horizontal,
respectivamente, para obtener un coeficiente de correlación y
determinar la ausencia o presencia de correlación entre los dos
sistemas de medida. Los resultados se muestran en la Figura 5.
En la tabla, los números entre paréntesis
indican el número de muestras.
En la Tabla 5:
- La sensibilidad es un valor calculado mediante la siguiente fórmula: (el número de sueros positivos de pacientes con enfermedad de Crohn) / (el número de sueros procedentes de pacientes con enfermedad de Crohn medido) X 100;
- La especificidad es un valor calculado mediante la siguiente fórmula: {1-(el número de sueros positivos de pacientes sin enfermedad de Crohn) / (el número de sueros de pacientes sin enfermedad de Crohn y de personas sanas medido)} X 100;
- Un valor predictivo positivo (PPV) es un valor calculado mediante la siguiente fórmula: (el número de sueros positivos de pacientes con enfermedad de Crohn) / (el número de todos los sueros positivos) X 100; y
- Un valor predictivo negativo (NPV) es un valor calculado mediante la siguiente fórmula: (el número de sueros negativos de pacientes sin enfermedad de Crohn) / (el número de todos los sueros negativos) X 100.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la Figura 4 y de la Tabla 5
muestran que el ELISA que usa TCP-353 es superior a
ASCA-IgG ELISA tanto en sensibilidad como en
especificidad, y también tiene mayores valores predictivos positivos
y negativos, indicando una mayor exactitud en el diagnóstico.
Además, el coeficiente de correlación obtenido a partir de la
Figura 5 es 0,229, indicando que no existe correlación entre los dos
sistemas de ensayo, lo que sugiere que se mide un anticuerpo
diferente mediante cada sistema.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon cuatro tipos de péptidos
ramificados (abreviados como cóctel-MAP; documento
WO 02/088175 A1), que son péptidos que se unen a un anticuerpo de
la enfermedad de Crohn, para comparación con el ELISA que usa
TCP-353 en términos de utilidad en el diagnóstico
de la enfermedad de Crohn.
El ELISA que usa el cóctel-MAP
(denominado también como cóctel-MAP ELISA) se llevó
a cabo según la publicación internacional (WO 02/088175A1), excepto
que se usó la misma disolución estándar que la empleada en
TCP-353 ELISA, y los valores de la absorbancia
medidos se convirtieron en valores de índice. Los resultados de la
medida se muestran en la Figura 6 como un diagrama de dispersión.
Además, el valor de corte se ajustó para que fuese el valor de la
media de los valores medidos de las 71 muestras de suero de
personas sanas más 3SD, con lo que se obtuvo el porcentaje de
reactividad para cada suero.
Los resultados mediante comparación del
porcentaje de positivos entre el cóctel-MAP ELISA y
TCP-353 ELISA se muestran en la Tabla 6. Además,
los valores medidos de los sueros de pacientes con enfermedad de
Crohn mediante cóctel-MAP ELISA y mediante
TCP-353 ELISA se representan gráficamente a lo largo
de los ejes vertical y horizontal, respectivamente, para obtener un
coeficiente de correlación y determinar la ausencia o presencia de
correlación entre los dos sistemas de medida. Los resultados se
muestran en la Figura 7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
En la tabla, los números entre paréntesis
indican el número de muestras. PPV, NPV, etc., son como se definen
en la Tabla 5.
Los resultados anteriores sugieren que el ELISA
que usa TCP-353 es mejor que el
cóctel-MAP ELISA en sensibilidad, especificidad y
exactitud en el diagnóstico. Además, el coeficiente de correlación
obtenido a partir de la Figura 7 es 0,281, indicando que no existe
correlación entre los dos sistemas de medida, lo que sugiere que se
mide un anticuerpo diferente mediante cada sistema.
\vskip1.000000\baselineskip
Para las secuencias de aminoácidos de los
péptidos epitópicos obtenidos del anticuerpo de la enfermedad de
Crohn (TCP-47, TCP-336, y
TCP-353), se llevó a cabo la búsqueda BLAST en busca
de péptidos o proteínas que tengan secuencias de aminoácidos
homólogas. Los resultados se muestran en las Figuras 8, 9, y 10.
TCP-47 es idéntico a la región
C-terminal de la proteína Titin del ser humano o de
la mosca de la fruta, y también se encuentran proteínas homólogas
de virus, bacterias, hongos y protozoos. TCP-336
concuerda en gran medida con una proteína humana.
TCP-353 es idéntica a una proteína de Oryza sativa,
sugiriendo una relación entre la enfermedad de Crohn y un antígeno
alimentario.
El péptido epitópico del anticuerpo de la
enfermedad de Crohn según la presente invención, y el reactivo de
ensayo que usa el mismo péptido, hace posible determinar
conveniente, rápida y exactamente la aparición o no de la enfermedad
de Crohn, y de este modo se puede utilizar para un reactivo de
diagnóstico y un método de ensayo los cuales son ambos
extremadamente útiles en el diagnóstico de la enfermedad de
Crohn.
La Figura 1 son diagramas de dispersión que
muestran los resultados de la medida mediante ELISA de la
reactividad de los péptidos epitópicos del anticuerpo de la
enfermedad de Crohn (TCP-47,
TCP-336, y TCP-353) obtenidos en el
Ejemplo 1 con sueros de pacientes con enfermedad de Crohn (abreviado
como CD) (32 muestras), sueros de pacientes con colitis ulcerosa
(abreviado como UC) (32 muestras), y sueros de personas sanas (32
muestras). En la figura, *, **, ***, y **** indican niveles de
significancia estadística, cuando la reactividad de cada uno de los
péptidos con los sueros de pacientes con enfermedad de Crohn se
comparó con aquella con los sueros de pacientes con colitis
ulcerosa o con aquella con sueros de pacientes sanos (*: p <
0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001, y ****: p < 0,0001;
mediante la prueba de la U de Mann-Whitney).
Además, las líneas discontinuas indican los valores de corte.
La Figura 2 muestra curvas ROC obtenidas
mediante ELISA con TCP-47 o
TCP-336, en las que se obtuvieron la sensibilidad y
la especificidad de 1 y se representaron gráficamente a lo largo de
los ejes vertical y horizontal, respectivamente, basándose en los
valores medidos mediante ELISA de las 32 muestras de los sueros de
pacientes con enfermedad de Crohn y las 32 muestras de los sueros de
personas sanas. En la figura, las líneas discontinuas indican los
valores de corte.
La Figura 3 es un diagrama de dispersión que
muestra los resultados de la medida mediante ELISA de la
reactividad de TCP-353 con sueros de pacientes con
enfermedad de Crohn (CD, 60 muestras), sueros de pacientes con
colitis ulcerosa (UC, 109 muestras), sueros de pacientes con
enteritis aguda (11 muestras), sueros de pacientes con cáncer de
colon (35 muestras), sueros de 1 pacientes con hepatopatía crónica
(49 muestras), y sueros de personas sanas (71 muestras). En la
figura, ** y **** indican niveles de significancia estadística,
cuando la reactividad de TCP-353 con los sueros de
pacientes con enfermedad de Crohn se comparó con aquella con
diversos sueros de pacientes y con aquella con los sueros de
personas sanas (**: p < 0,01, y ****: p < 0,0001; mediante la
prueba de la U de Mann-Whitney). Además, las líneas
discontinuas indican el valor de corte.
La Figura 4 muestra los resultados mediante
comparación entre ASCA-IgG ELISA y
TCP-353 ELISA, que son diagramas de dispersión que
muestran los resultados de la medida mediante ELISA de la
reactividad con sueros de pacientes con enfermedad de Crohn (CD, 60
muestras), sueros de pacientes con colitis ulcerosa (UC, 109
muestras), sueros de pacientes con enteritis aguda (11 muestras),
sueros de pacientes con cáncer de colon (35 muestras), sueros de
pacientes con hepatopatía crónica (49 muestras), y sueros de
personas sanas (71 muestras). Además, las líneas discontinuas
indican los valores de corte.
La Figura 5 muestra la correlación entre
TCP-353 ELISA y ASCA-IgG ELISA. Los
valores medidos de los sueros de pacientes con enfermedad de Crohn
mediante ASCA-IgG ELISA y mediante
TCP-353 ELISA se representaron gráficamente a lo
largo de los ejes vertical y horizontal, respectivamente. La letra
r es un coeficiente de correlación.
La Figura 6 muestra los resultados mediante
comparación entre TCP-353 ELISA y
cóctel-MAP ELISA, que son diagramas de dispersión
que muestran los resultados de la medida mediante ELISA de la
reactividad con sueros de pacientes con enfermedad de Crohn (CD, 60
muestras), sueros de pacientes con colitis ulcerosa (UC, 109
muestras), sueros de pacientes con colitis ulcerosa (UC, 109
muestras), sueros de pacientes con enteritis aguda (11 muestras),
sueros de pacientes con cáncer de colon (35 muestras), y sueros de
pacientes con hepatopatía crónica (49 muestras), y sueros de
personas sanas (71 muestras). Además, las líneas discontinuas
indican los valores de corte.
La Figura 7 muestra la correlación entre
cóctel-MAP ELISA y TCP-353 ELISA.
Los valores medidos de los sueros de pacientes con enfermedad de
Crohn mediante cóctel-MAP ELISA y mediante
TCP-353 ELISA se representaron gráficamente a lo
largo de los ejes vertical y horizontal, respectivamente. La letra r
es un coeficiente de correlación.
La Figura 8 muestra proteínas homólogas en la
secuencia de aminoácidos a TCP-47, que se
encontraron en las bases de datos de proteínas mediante la búsqueda
BLAST. En la figura, | indica que los aminoácidos coinciden, y :
indica que los aminoácidos son similares.
La Figura 9 muestra proteínas homólogas en la
secuencia de aminoácidos a TCP-336, que se
encontraron en las bases de datos de proteínas mediante la búsqueda
BLAST. En la figura, | indica que los aminoácidos coinciden, y :
indica que los aminoácidos son similares.
La Figura 10 muestra proteínas homólogas en la
secuencia de aminoácidos a TCP-353, que se
encontraron en las bases de datos de proteínas mediante la búsqueda
BLAST. En la figura, | indica que los aminoácidos coinciden, y :
indica que los aminoácidos son similares.
<110> TOAGOSEI CO., LTD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PÉPTIDO EPITÓPICO DE UN ANTICUERPO
DE LA ENFERMEDAD DE CROHN Y MÉTODO PARA DETECTAR LA ENFERMEDAD DE
CROHN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> librería fágica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> librería fágica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> librería fágica
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm11
Claims (4)
1. Un péptido característico de un epítopo de un
anticuerpo de la enfermedad de Crohn, que se representa mediante los
siguientes apartados (a) o (b):
- (a)
- un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, o una sal del mismo; y
- (b)
- un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos modificada de SEQ ID NO: 3, en la que uno o algunos de los aminoácidos están sustituidos, suprimidos o añadidos, o parte de la secuencia de aminoácidos modificada o no modificada de SEQ ID NO: 3, y que tiene la propiedad de unirse a un anticuerpo de la enfermedad de Crohn que se une al péptido (a) anterior, o una sal del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un reactivo de ensayo para la enfermedad de
Crohn, que comprende, como ingrediente activo, el péptido definido
en la reivindicación 1.
3. Un kit de ensayo para la enfermedad de Crohn,
que comprende el reactivo de ensayo definido en la reivindicación 2
como una sustancia antigénica de un anticuerpo de la enfermedad de
Crohn.
4. Un método de ensayo para la enfermedad de
Crohn, que comprende la etapa de determinar si un anticuerpo que
se une al péptido definido en la reivindicación 1 está presente o no
en una muestra biológica.
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