ES2326670T3

ES2326670T3 - Uso terapeutico del factor de crecimiento nsg33.

Info

Publication number: ES2326670T3
Application number: ES05717160T
Authority: ES
Inventors: Mette Gronborg; Philip Kusk; Nikolaj Blom; Thomas Nordahl Petersen; Teit E. Johansen; Soren Brunak; Lars Wahlberg
Original assignee: NsGene AS
Current assignee: NsGene AS
Priority date: 2004-03-30
Filing date: 2005-03-30
Publication date: 2009-10-16
Anticipated expiration: 2025-03-30
Also published as: CN1950397A; EP2289911A3; US9845344B2; US20120184492A1; MXPA06011339A; CA2561577A1; EP2075254A1; NZ550542A; WO2005095450A3; AU2005229434A1; DE602005014354D1; ATE430763T1; BRPI0509278A; KR20070012664A; HK1102598A1; JP2007530064A; WO2005095450A2; CN1950397B; JP5514243B2; DK1745069T3

Abstract

Uso de i) un polipéptido aislado que comprende a) una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID No. 4; b) una variante de secuencia biológicamente activa de la secuencia de aminoácidos, en donde la variante tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con dicha SEQ ID No. 4; o c) un fragmento biológicamente activo de por lo menos 50 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b), teniendo dicho fragmento por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 4 en un intervalo de solapamiento de por lo menos 50 aminoácidos, en donde la actividad biológica es neuroprotección, supervivencia de neuronas, neurogénesis y/o proliferación de precursores neuronales, ii) una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido como el que se define en i) o una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido como el que se define en i), iii) un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico como la que se define en ii), iv) una composición de células huésped, en donde dichas células se transforman o transducen con el vector como se define en iii), siempre que no se incluya el uso de embriones humanos con fines industriales o comerciales, v) una línea de células de empaquetamiento que comprende la secuencia de ácido nucleico como se define en ii), o vi) un dispositivo de células biocompatible implantable, en donde dicho dispositivo comprende: a) una membrana semipermeable que permite la difusión de un polipéptido como el que se define en i) y/o un vector viral; y b) una composición de células como la que se define en iv), o una línea de células de empaquetamiento como se define en v), para la preparación de un medicamento, es donde dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño del sistema nervioso, en donde se han perdido o dañado las células neurales.

Description

Uso terapéutico del factor de crecimiento NsG33.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo del uso terapéutico de proteínas, genes y células, en particular a la terapia basada en la función biológica de una proteína terapéutica secretada, NsG33, en particular para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso, y para el tratamiento de trastornos inmunológicos. NsG33 es un factor de crecimiento y supervivencia nervioso con efectos neuroprotectores y/o de neurogénesis. La invención se refiere también a fragmentos polipeptídicos de NsG33 bioactivos, y a las secuencias de ADN codificantes correspondientes.

Antecedentes técnicos

Las proteínas extracelulares desempeñan funciones importantes, entre otras cosas, en la formación, diferenciación y mantenimiento de organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, crecimiento que incluye proliferación, migración, diferenciación o interacción con otras células, está gobernado típicamente por información recibida de otras células y/o el entorno más cercano. Esta información se transmite con frecuencia por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que, a su vez, son recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o proteínas unidas a membrana. Estos polipéptidos secretados o moléculas de señalización normalmente pasan a través de la vía secretora celular para alcanzar su sitio de acción en el entorno extracelular.

Trastornos tales como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple y lateral amiotrófica, apoplejía, esquizofrenia, epilepsia y neuropatía periférica y dolor asociado, afectan a millones de personas. Es la pérdida de la función neuronal normal, que produce los déficits de comportamiento y físicos que son característicos de cada uno de los diferentes trastornos neurológicos. Además de trastornos neurodegenerativos crónicos y agudos, el proceso de envejecimiento, traumatismo físico en el sistema nervioso y trastornos metabólicos, pueden producir la pérdida, disfunción o degeneración de células neurales acompañadas de los déficits de comportamiento y físicos asociados. Muchas de estas enfermedades son hoy en día incurables, altamente debilitantes, y las farmacoterapias tradicionales fallan con frecuencia. Existe de esta manera una gran necesidad médica de nuevas proteínas terapéuticas que sean modificadoras de la enfermedad, y no sólo para uso sintomático.

Varios factores secretados con expresión en el sistema nervioso o áreas objetivo asociadas, tienen usos terapéuticos importantes en varias indicaciones neurológicas asociadas con la reducción o pérdida de funciones neuronales. Por ejemplo, el NGF es un candidato para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer, neublastina (artemina) un candidato para el tratamiento de neuropatía periférica, y el GDNF es un candidato para el tratamiento de enfermedad de Parkinson.

WO 01/39786 (Innogenetics) divulga polipéptidos SMAF-2 humano y murino y su uso para el tratamiento de trastornos inmunológicos. SMAF-2 humana es idéntica a NsG33 humana.

WO 01/57190 (Hyseq) divulga un polipéptido (SEQ ID No 1401) que es idéntico a NsG33 humano. WO 01/54474 (Human Genome Sciences) divulga un polipéptido (SEQ ID NO 675), que es el 99% similar a NsG33 humano. WO 01/83510 (Human Genome Sciences) divulga dos polipéptidos que son idénticos NsG33 humano en un solapamiento de 103 aminoácidos. Ninguno de estos documentos contiene datos biológicos que podrían sugerir una función creíble para estas secuencias.

Compendio de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere al uso de

i): un polipéptido aislado que comprende

a): una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID No. 4;

b): una variante de secuencia de la secuencia de aminoácidos, en donde la variante tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 4; o

c): un fragmento biológicamente activo de por lo menos 50 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b) teniendo dicho fragmento por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID NO. 4,

\quad: en donde la actividad biológica es neuroprotección, supervivencia de neuronas, neurogénesis y/o proliferación de precursores neuronales,

ii): una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido como se define en i) o una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia complementaria a la secuencia que codifica el polipéptido como se define en i),

iii): un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico como se define en ii),

iv): una composición de células, en donde dichas células se transforman o transducen con el vector como se define en iii), siempre que no incluya el uso de embriones humanos para fines industriales o comerciales,

v): una línea celular empaquetadora que comprende la secuencia del ácido nucleico como se define en ii), o

vi): un dispositivo celular biocompatible implantable, en donde dicho dispositivo comprende:

a): una membrana semipermeable que permite la difusión de un polipéptido como se define en i) y/o un vector vírico; y

b): una composición de células como se define en iv) o una línea celular de empaquetamiento como se define en v)

\quad: para la fabricación de un medicamento, en donde dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño del sistema nervioso, en donde se pierden o dañan células neurales.

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En un aspecto adicional la invención se refiere a un método in vitro de prevenir apoptosis en una célula neuronal de mamífero, comprendiendo dicho método exponer dicha célula neuronal a un polipéptido como se define aquí.

La invención también se refiere a un método in vitro para aumentar la supervivencia de una célula neuronal de mamífero, comprendiendo dicho método exponer dicha célula neuronal a un polipéptido como se define aquí.

En un aspecto la invención se refiere a un método in vitro para generar una neurona, comprendiendo dicho método exponer una celular precursora neuronal o una célula madre neuronal a un polipéptido como se define aquí.

Además, la invención se refiere a un método in vitro para expandir una composición de células neuronales de mamífero, que comprende administrar a dicha composición el polipéptido como se define aquí; o transducir/transfectar las células con el vector de expresión como se define aquí.

En un aspecto la invención se refiere a un método in vitro para diferenciar una composición de células neuronales de mamífero, que comprende administrar a dicha composición el polipéptido como se define aquí; o transducir/transfectar las células con el vector de expresión como se define aquí.

Los métodos in vitro de la presente invención no incluyen el uso de embriones humanos para fines industriales o comerciales.

Los presentes inventores han encontrado que NsG33 es una proteína secretada con características de factor de crecimiento, que se expresa a altos niveles y selectivamente en el sistema nervioso y el ojo, y especialmente en la sustancia negra, el putamen y la médula espinal, así como en el mesencéfalo del embrión humano en desarrollo. Además, los presentes inventores han encontrado que NsG33 es capaz de proteger una línea de células neuronales de muerte celular apoptótica (ejemplo 6). La muerte celular apoptótica contribuye a la pérdida de células neuronales en el sistema nervioso adulto, causando varios trastornos neurológicos tales como apoplejía isquémica, enfermedades neurodegenerativas o traumatismos cerebrales (Becker y Bonni, Prog Neurobiol. Ene 2004; 72(1): 1-25).

NsG33 ha mostrado también efectos neuroprotectores en dos ensayos basados en la generación de neuronas y astrocitos de una línea de células progenitoras neurales humanas y de un cultivo primario de células estriatales de rata. Por lo tanto, los presentes inventores han contemplado el uso de NsG33 en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central, en particular en el tratamiento de enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y trastornos de la médula espinal, tal como ELA. Basado en la actividad neuroprotectora y en la expresión en el cerebelo, el ganglio de la raíz dorsal y la retina, se contempla también a NsG33 para su uso en el tratamiento de neuropatías periféricas y dolor asociado, así como trastornos cerebelares y retinopatías.

Otros factores de crecimiento secretados terapéuticamente relevantes se expresan en el sistema nervioso o subregiones del mismo e incluyen, pero no están limitados a, GDNF, NGF, neurturina, BDNF, NT4/5, NT3 y neublastina (artemina).

El efecto terapéutico de NsG33 puede mediarse a través de un efecto sobre el crecimiento, supervivencia, regeneración, recuperación o mejora de función, y/o sobre diferenciación de células objetivo. Los presentes inventores han mostrado que NsG33 es capaz de proteger a un tipo de célula neuronal contra la muerte celular apoptótica (ejemplo 6, figura 9). Los presentes inventores han mostrado también que una línea de células progenitoras neurales humanas y un cultivo estriatal primario de rata generan un mayor porcentaje de neuronas cuando se exponen a NsG33 que en condiciones control (ejemplos 14 y 15). El último efecto puede estar causado por supervivencia mejorada de neuronas, por diferenciación incrementada de neuronas, y/o por proliferación de precursores neuronales.

\newpage

Basado en estas pruebas biológicas, la presente invención se refiere a un método in vitro para prevenir apoptosis en una célula neuronal de mamífero, comprendiendo dicho método exponer dicha célula neuronal a un polipéptido de la presente invención. La invención se refiere también a un método in vitro para mejorar la supervivencia de una célula neuronal de mamífero, comprendiendo dicho método exponer dicha célula neuronal a un polipéptido de la presente invención. La invención se refiere además a un método in vitro para generar una neurona, comprendiendo dicho método exponer una célula precursora neuronal o una célula madre neuronal a un polipéptido de la presente invención. De preferencia, dicha célula neuronal de mamífero y/o precursor neuronal de mamífero o célula madre neuronal, es una célula humana.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Predicción de la presencia y ubicación del péptido señal en NsG33 humano. Figura 1a: gráfica de SignalP NN (red neural) de NsG33 humano. Figura 1b: gráfica de SignalP HMM (modelo oculto de Markov) de NsG33 humano. Para detalles, refiérase al ejemplo 2.

Figura 2: Resultado del servidor de predicción de la función de proteínas ProtFun2.1 en NsG33 humano de longitud completa (SEQ ID No. 3), péptido N-terminal humano (SEQ ID No. 19) y péptido C-terminal humano (SEQ ID No. 5). Para explicaciones, refiérase al ejemplo 2.

Figura 3a: Alineamiento múltiple de secuencias Clustal W (1.82) de NsG33 humano, parcial de ratón y rata. Las secuencias señal se muestran en negrita. Se ha subrayado un sitio putativo de corte con furina.

Figura 3b: Alineamiento múltiple de secuencias Clustal W (1.82) de NsG33 humano, de ratón y rata. Las secuencias señal predichas se muestran en negrita.

* indica posicionas que tienen un residuo individual completamente conservado.

: indica que uno de los siguientes grupos "fuertes", está complemente conservado:

: -STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW.

. indica que uno de los siguientes grupos "más débiles", está completamente conservado:

: -CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY.

Figuras 4: PCR en tiempo real en NsG33. Para detalles, véase el ejemplo 5.

La figura 4, panel superior muestra la expresión relativa de NsG33 (respecto al tejido con la expresión más baja), asumiendo que se sintetizaron las mismas cantidades de ADNc a partir de cantidades iguales de ARN total usado para el paso de ADNc.

La figura 4, panel inferior, muestra la expresión relativa de NsG33 normalizada a \beta_{2}-microglobulina (respecto al tejido con la expresión normalizada más baja). Los resultados deben interpretarse con cuidado, puesto que los niveles de expresión de \beta_{2}-microglobulina varían entre algunos tejidos.

Figura 5: Alineamiento con Align0 de polipéptido NsG33 humano de longitud completa, contra polipéptido humano de longitud completa (Innog.) del documento WO 93/22437 (Innogenetics SA). Matriz de puntuación BLOSUM50, penalizaciones de espacio: -12/-2. Las diez cisteínas conservadas se muestran en negrita con asteriscos encima o debajo de las secuencias alineadas.

Figura 6: ADNc de NsG33 humano y prepro-NsG33 codificada.

Figura 7a: ADNc parcial de NsG33 de ratón y pre-pro-NsG33 parcial codificada.

Figura 7b: ADNc de longitud completa de NsG33 de ratón y pre-pro-NsG33 codificada.

Figura 8: ADNc de NsG33 de rata y pre-pro-NsG33 codificada.

Figura 9: Efecto de NsG33 sobre la supervivencia de células PC12 en medio sin suero. Para más detalles, véase el ejemplo 6. Se sembraron células en placas de 48 pocillos recubiertos de colágeno, 2x10^{4} células/pocillo en medio de crecimiento. Al día siguiente, las células se transdujeron mediante incubación durante la noche con 10^{5} unidades de transducción de virus/pocillo (MOI = 5) en presencia de 5 \mug/ml de polibreno. Después de la transducción, se cambió el medio a DMEM sin suero (Invitrogen), y se ensayó entonces la supervivencia de células después de 4 días usando el ensayo de MTS. Los datos mostrados son medias \pm EEM (n = 6) de un experimento representativo, y el * indica una diferencia significativa de las células transducidas con ADNc para EGFP (P<0,05, ANOVA unidireccional, método de Dunnett). LV-EGFP: células PC12 transducidas con lentivirus con EGFP. LV-NsG33: células PC12 transducidas con NsG33 humano de longitud completa.

La figura 10A muestra la expresión relativa de mNsG33 medida por RT-PCR cuantitativa (respecto al tejido con la expresión más baja), normalizada para GAPDH en la médula espinal en desarrollo en las etapas embrionarias E10,5, E11,5 y E13,5 (10,5, 11,5 y 13,5 días post-concepción, respectivamente), y en la médula espinal de adulto. Los detalles se describen en el ejemplo 13.

La figura 10B muestra la expresión relativa de mNsG33 en dos regiones del cerebro de ratón (CTX = corteza, Cb = cerebelo) en dos etapas de desarrollo (P1 = post-natal de un día y adulto). La expresión se mide mediante RT-PCR cuantitativa normalizada para la expresión de mGAPDH respecto al tejido con la expresión normalizada más baja. Los detalles se describen en el ejemplo 13.

La figura 11A muestra los porcentajes promedio de células gliales positivas para GFAP (barras grises) y las neuronas positivas para \beta-III-tubulina (barras negras) en cultivos de hNS1 en diferenciación que reciben medio sin suero no condicionado (hNS1), medios condicionados de células ARPE-19 control (Mc C) o de cultivos de células ARPE-19 transducidas con NsG33 (Mc 33). Se describen más detalles en el ejemplo 14.

La figura 11B muestra el número total de células por campo, según se determina contando núcleos teñidos con Hoechst usando un objetivo de 40x en cultivos de hNS1 en diferenciación que reciben medio sin suero no condicionado (hNS1), medios condicionados de células ARPE-19 control (Mc C) o de cultivos de células ARPE-19 transducidas con NsG33 (Mc 33). Se describen más detalles en el ejemplo 14.

La figura 12 muestra los porcentajes promedio de neuronas positivas para \beta-III-tubulina en cultivos estriatales de rata que reciben medio sin suero no condicionado (UCM), medios condicionados diluidos de células HEK293T o ARPE-19 transfectadas control (293T-CM y ARPE-CM, respectivamente), o de los cultivos paralelos transfectados con NsG33 (293T-CM33 y ARPE-CM33, respectivamente) en DIV2. Se describen más detalles en el ejemplo 15.

Definiciones

NsG33, como se usa aquí, se refiere a polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos de NsG33 sustancialmente purificada obtenida de cualquier especie, en particular de mamífero, que incluye chimpancé, bovino, ovino, porcino, murino, equino y de preferencia humano, de cualquier fuente, ya sea natural, sintética, semisintética o recombinante. El término se refiere también a fragmentos biológicamente activos de NsG33 obtenidos de cualquiera de estas especies, así como a variantes de secuencia biológicamente activas de los mismos, y a las proteínas sujetas a modificaciones postraduccionales.

Las características del factor de crecimiento, como se usa aquí, definen características relacionadas con las secuencias similares a los de los factores de crecimiento clásicos, que son proteínas secretadas que actúan sobre una célula objetivo a través de un receptor, para producir una o más de las siguientes respuestas en la célula objetivo: crecimiento que incluye proliferación, diferenciación, supervivencia, regeneración, migración, recuperación de función, mejora de función.

Un "alelo" o "secuencia alélica", como se usa aquí, es una forma alternativa del gen que codifica NsG33. Los alelos se pueden producir de al menos una mutación en la secuencia de ácido nucleico, y pueden producir moléculas de ARNm alteradas o polipéptidos cuya estructura o función puede o no estar alterada. Cualquier gen natural o recombinante determinado puede tener ninguna, una o muchas formas alélicas. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a alelos se atribuyen en general a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleótidos. Cada uno de estos tipos de cambios pueden ocurrir solo, o en combinación con los otros, una o más veces en una secuencia determinada.

Una "deleción", como se usa aquí, se refiere a un cambio en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos, y produce la ausencia de uno o más residuos de aminoácido o nucleótidos.

Una "inserción" o "adición", como se usa aquí, se refiere a un cambio en una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que produce la adición de uno o más residuos de aminoácido o nucleótidos, respectivamente, en comparación con la molécula natural.

Los términos "unión específica" o "que se une específicamente", como se usan aquí, se refieren a la interacción de alta afinidad entre una proteína o péptido y una molécula de unión tal como un anticuerpo y un receptor o fragmentos del mismo. La interacción depende de la presencia de una estructura particular (es decir, el determinante antigénico o epítopo) de la proteína reconocida por la molécula de unión. Por ejemplo, si un anticuerpo es específico para el epítopo "A", la presencia de una proteína que contenga el epítopo A (o A no marcado libre) en una reacción que contenga "A" marcado y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.

El término "sustancialmente purificado", como se usa aquí, se refiere a secuencias de ácido nucleico o aminoácidos que se retiran de su ambiente natural, aisladas o separadas, y están por lo menos libres al 60%, de preferencia libres al 75%, y lo más preferiblemente libres al 90% de otros componentes con los que se asocian naturalmente.

Una "sustitución", como se usa aquí, se refiere al reemplazo de uno o más aminoácidos o nucleótidos por diferentes aminoácidos o nucleótidos, respectivamente.

"Identidad de secuencia":

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático usado para la comparación de dos secuencias, es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, modificado en Karlin y Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Dicho algoritmo está incorporado en los programas BLASTN y BLASTP de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410.

Para caracterizar la identidad, se alinean las secuencias sujeto, de modo que se obtenga la homología (coincidencia) de orden más alto. Basado en estos principios generales, puede determinarse el "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoácidos usando el algoritmo BLASTP [Tatiana A. Tatusova, Thomas L Madden: Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences; FEMS Microbiol. Lett. 1999 174 247-250], que está disponible del sitio web del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), y usando los valores predeterminados sugeridos aquí (es decir, matriz = Blosum62; espacio abierto = 11; espacio de extensión = 1; penalizaciones de espacio x_punto de derivación = 50; expectativa = 10, tamaño de palabra = 3; filtro funcionando). El algoritmo BLAST realiza una operación de dos pasos, alineando primero dos secuencias basado en los ajustes, y determinando entonces el % de identidad de secuencia en un intervalo de solapamiento entre dos secuencias alineadas. Además del % de identidad de secuencia, BLASTP determina también el % de similitud de secuencia basado en los ajustes.

Para caracterizar la identidad, se alinean secuencias sujeto, de modo que se obtenga la homología (coincidencia) de orden más alto. Basado en estos principios generales, puede determinarse el "porcentaje de identidad" de dos secuencias de ácido nucleico usando el algoritmo BLASTN [Tatiana A. Tatusova, Thomas L Madden: Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences; FEMS Microbiol. Lett. 1999 174 247-250], que está disponible del sitio web del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), y usando los valores predeterminados sugeridos aquí (es decir, retribución por una coincidencia = 1; penalización por una no coincidencia = -2; opción de cadena = ambas cadenas; espacio abierto = 5; espacio de extensión = 2; penalizaciones de espacio x_punto de derivación = 50; expectativa = 10; tamaño de palabra = 11; filtro funcionando). El algoritmo BLASTN determina el % de identidad de secuencia en un intervalo de solapamiento entre dos secuencias de nucleótidos alineadas.

Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático usado para la comparación de secuencias, es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), que forma parte del paquete de software de alineamiento de secuencias FASTA (Pearson WR, Methods Mol Biol, 2000, 132: 185-219). Align calcula identidades de secuencias basadas en un alineamiento global. Align0 no penaliza para espacios en el extremo de las secuencias. Cuando se usa el programa ALIGN o Align0 para la comparación de secuencias de aminoácidos, se usa de preferencia una matriz de substitución BLOSUM50 con penalizaciones de apertura/extensión de espacios de -12/-2.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a los usos médicos como se describen aquí de polipéptidos y polinucleótidos que se identifican como NsG33. La proteína NsG33 ha sido identificada en seres humanos (SEQ ID No. 3), ratón (SEQ ID No. 8) y rata (SEQ ID No. 13).

NsG33 humano existe como un precursor de 293 aminoácidos, que puede ser procesado para dar lugar a por lo menos uno y potencialmente varios péptidos biológicamente activos. NsG33 se expresa a altos niveles en el sistema nervioso y el ojo, y en particular en subregiones del cerebro (figuras 4A y 4B). Los polipéptidos NsG33 más largos de ratón (SEQ ID No. 8) y rata (SEQ ID No. 13) consisten en 294 y 291 aminoácidos, respectivamente, y los % de identidades con la proteína humana son del 80,3 y 80,2, respectivamente (véase las tablas 1 y 2 en el ejemplo 2). Debe notarse que las secuencias polipeptídicas de longitud completa predichas de ratón y rata están aún sin verificar, y que por lo menos la secuencia polipeptídica de ratón es parcial en el extremo N-terminal. Se ha publicado una secuencia de proteína de longitud completa de ratón con un extremo N-terminal ligeramente diferente en Nishino et al (The EMBO Journal, 2004, 23: 2998-2008) con un ADNc correspondiente disponible del NCBI con el número de acceso XM128551. La digestión del péptido señal de esta proteína de ratón produce la proteína madura que tiene
SEQ ID No. 9.

NsG33 humano contiene una secuencia de péptido señal N-terminal de 23 aminoácidos, que es digerida en el motivo de secuencia ARA-GY. Este sitio de corte del péptido señal se predice por el método SignalP (véase el ejemplo 2) y la gráfica resultado se muestra en la figura 1. Sin embargo, el experto en la materia reconocerá que el sitio de corte real puede ser diferente del predicho por el programa informático. Por ejemplo, la predicción del péptido señal en NsG33 de rata produce predicciones con probabilidades casi iguales en las posiciones 16 y 21. Se encuentra un sitio de digestión del péptido señal en un sitio similar en NsG33 de ratón (posición 24) y NsG33 de rata (posición 16 ó 21). La digestión del péptido señal produce polipéptidos que tienen SEQ ID No. 4, 9 y 14 para ser humano, ratón y rata, respectivamente. Como se sabe en la técnica, el procesamiento del péptido señal no siempre es exactamente como se predice, y la digestión real puede variar de caso a caso. De esta manera, se espera que el extremo N-terminal de NsG33 madura pueda variar en de uno a dos o tres aminoácidos del sitio de digestión predicho. El extremo N-terminal real de NsG33 madura puede verificarse experimentalmente marcando el extremo C-terminal con, por ejemplo, una etiqueta de histidina, purificación subsiguiente usando un anticuerpo específico de poli-histidina, o purificación en una columna de níquel, y finalmente secuenciación N-terminal del péptido maduro purificado.

Se predice digestión de tipo general de la pro-proteína en NsG33 humano, por el método ProP (Prediction of proprotein convertase cleavage sites. Peter Duckert, Søren Brunak y Nikolaj Blom. Protein Engineering, Design and Selection: 17: 107-112, 2004) en la posición 127 con una puntuación de 0,831, motivo de secuencia "WGPRERR-AL". Se predicen sitios de digestión similares en posiciones homólogas en NsG33 de ratón (en la posición 128) con una puntuación de 0,831, motivo de secuencia "WGPRERR-AL", y en NsG33 de rata (en la posición 125), con una puntuación de 0,831 y el motivo de secuencia "WGPRERR-AL". Se encuentra también un posible sitio de digestión del pro-péptido por furina, en la posición 121 en NsG33 humano en el motivo de secuencia "GGRCVR-WG", y en posiciones correspondientes en NsG33 de rata y ratón. El procesamiento del polipéptido después de la digestión del péptido señal resulta en la formación de un péptido C-terminal y un péptido N-terminal. Si la proteína se procesa realmente en estos sitios predichos, puede depender del tipo de célula en el que se expresa el gen. Puede verificarse experimentalmente la digestión del pro-péptido por medio de marcaje C-terminal con histidina, purificación y secuenciación N-terminal subsiguiente del péptido marcado.

NsG33 pertenece a la categoría de proteínas que actúan como factores de crecimiento. Esta noción está apoyada por predicciones realizadas por el servidor de predicción de la función de proteínas ProtFun, que proporciona posibilidades por encima de 1,0 de este tipo de categoría, como se muestra en la figura 2.

El método ProtFun predice la función de proteínas basado en características derivadas de secuencia, opuestamente a la similitud de secuencia. Las características que son importantes para la discriminación entre las clases de "factor de crecimiento" frente a las demás clases, son: potencial de distribución de proteínas, potencial de direccionamiento de proteínas, potencial del péptido señal, regiones de baja complejidad, estructura secundaria de la proteína, número de residuos negativos y número de átomos. En general, una puntuación de posibilidad de 1 indica una predicción que pudo haber ocurrido por azar. Posibilidades por encima de 1 indican que existe una probabilidad incrementada de que la proteína pertenezca a la clase predicha de genes ontológicos. Cuanto mayor sea la puntuación de posibilidad, mayor será la probabilidad de que la predicción sea correcta.

Los resultados de la PCR en tiempo real cuantitativa se muestran en las figuras 4 A y B. Basadas en las figuras, los tejidos pueden agruparse según al nivel de expresión de NsG33.

Tejidos con alta expresión incluyeron:

putamen, sustancia negra y médula espinal.

Tejidos con expresión intermedia incluyeron:

cerebro entero, cerebelo, retina* y ganglio de la raíz dorsal*.

Tejidos con baja expresión incluyeron:

corazón, riñón, pulmón, próstata, glándula salival, músculo esquelético, testículo, estómago, páncreas y cerebro fetal*.

Tejidos con muy baja expresión o sin expresión incluyeron:

hígado fetal, placenta, timo, tráquea, bazo, útero, colon e intestino delgado.

Cuando se analizaron los resultados después de la normalización a la expresión de \beta_{2}-microglobulina, esencialmente se observaron los mismos resultados, salvo para los tejidos marcados con un *.

Los resultados de PCR en tiempo real para NsG33 de ratón, se muestran en las figuras 10A y 10B. Los valores de C_{T} variaron de 17 a 22. De la figura 10A, es evidente que la expresión de NsG33 se regula durante el desarrollo de la médula espinal, alcanzando un máximo alrededor de E11,5. De la figura 10B, es evidente que NsG33 es regula durante el desarrollo post-natal en el cerebelo, pero no en la corteza.

El patrón de expresión temporal en médula espinal indica un papel en proliferación, diferenciación y/o supervivencia de los progenitores neurales en esta región del SNC. Esto es consistente con la relevancia terapéutica para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y lesiones en la médula espinal que incluyen lesión de médula espinal, ELA y atrofia muscular espinal. Además, este perfil de expresión indica un potencial como reactivo in vitro para la expansión y/o diferenciación de progenitores neurales derivados de la médula espinal.

El aumento de la expresión de NsG33 en el cerebelo adulto, indica un papel para este factor en el mantenimiento y/o supervivencia de uno o más tipos de células cerebelares. Esto es consistente con la relevancia terapéutica para trastornos cerebelares que incluyen, pero no están limitados a, ataxia sensitiva, esclerosis múltiple, trastornos espinocerebelares neurodegenerativos, ataxia hereditaria, atrofias cerebelares (tales como atrofia olivopontocerebelar (OPCA), síndrome de Shy-Drager (atrofia de sistemas múltiples)) y alcoholismo.

A diferencia de las proteínas estructurales, los factores de crecimiento están implicados en la señalización celular y en varias funciones tales como crecimiento, proliferación, diferenciación, supervivencia, regeneración, migración, recuperación de función y mejora de función. Por lo tanto, pueden administrarse y usarse factores de crecimiento para ejercer un efecto terapéutico.

Basado en la expresión específica de tejido y el hecho de que se predice que NsG33 es un factor de crecimiento secretado, y que NsG33 posee actividad antiapoptótica, neuroprotectora y/o de neurogénesis (figuras 9, 11 y 12), se contempla NsG33 para su uso en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso en general (basado en la expresión específica del sistema nervioso), en particular enfermedad de Parkinson (basado en la expresión en la sustancia negra), enfermedad de Huntington (basado en la expresión en el putamen y la sustancia negra), trastornos cerebelares (basado en la expresión en el cerebelo humano, y expresión diferencial en el cerebelo de ratón en desarrollo), lesión de médula espinal (basado en la expresión en la médula espinal de ser humano adulto, y la expresión diferencial en la médula espinal de ratón en desarrollo), ELA (basado en la expresión en la médula espinal del ser humano adulto, y la expresión diferencial en la médula espinal de ratón en desarrollo), neuropatías periféricas (basado en la expresión en el ganglio de la raíz dorsal) y retinopatías (basado en la expresión en la retina). La función para las varias indicaciones puede verificarse en pruebas in vitro e in vivo como se describe en los ejemplos.

Asimismo, se encuentra expresión de factores de crecimiento secretados terapéuticamente relevantes, que incluyen GDNF, NGF y neublastina (artemina) en áreas objetivo del trastorno neurológico que pueden usarse para tratamiento.

El efecto terapéutico de NsG33 puede mediarse a través de un efecto sobre el crecimiento, que incluye proliferación, regeneración, recuperación de función, mejora de función, supervivencia, migración y/o diferenciación de células elegidas como objetivo.

Una función biológica verificada de NsG33, es un efecto neuroprotector contra apoptosis inducida por inanición en células PC12 (feocromocitoma). Los feocromocitomas son tumores con características de células cromafines adultas e inmaduras de la médula suprarrenal. Las células cromafines, neuronas sensitivas y del simpático y células de pigmento (melanocitos), derivan de una célula precursora común en la cresta neural. Su diferenciación en los linajes específicos depende altamente de señales externas que incluyen factores secretados.

PC12 es una línea celular clonal, que se estableció originalmente de un feocromocitoma medular suprarrenal trasplantable de rata (Greene y Tischler, 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 2424). Las células PC12 están disponibles de la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo, número de acceso CRL-1721). Se considera que las células PC12 son la célula cromafín precursora pluripotente, ya que posee la capacidad de diferenciarse a células cromafines maduras, neuronas del simpático y melanocitos, dependiendo de las condiciones de cultivo. Las células PC12 se han usado ampliamente como un sistema modelo para estudios de diferenciación y supervivencia neuronal. En medio que contiene suero, las células PC12 proliferan, mientras que la adición de ciertos factores neurotróficos que incluye NGF, induce la diferenciación de las células PC12 en un fenotipo neuronal muy similar a las neuronas del simpático. En medio sin suero, las células PC12 se vuelven apoptóticas, y mueren a menos que se les suministre ciertos factores de crecimiento, hormonas o pequeñas moléculas que pueden actuar como factores de supervivencia.

Los factores capaces de inducir diferenciación y supervivencia en células PC12, que incluyen una de las neurotrofinas (NGF) y un miembro de la familia de secretina/glucagón/VIP (PACAP), exhiben también una actividad similar tanto en el sistema nervioso central como periférico, indicando que receptores y sistemas de respuesta expresados en células PC12 son compartidos con muchas otras células neuronales.

El NGF es un factor de supervivencia y diferenciación importante para neuronas sensitivas y del simpático sensibles, además de neuronas colinérgicas en el prosencéfalo basal. PACAP promueve la diferenciación de neuronas nacientes del ganglio de la raíz dorsal (DRG), porque incrementa tanto el número de células positivas para marcador neural como axonogénesis, sin que afecte la proliferación de células progenitoras neurales (Nielsen et al., Mol Cell Neurosci. Abr 2004; 25(4): 629-41). PACAP muestra también actividades similares en poblaciones neuronales en el SNC (Vaudry et al., Proc Natl Acad Sci U.SA. 30 Abr 2002; 99(9): 6398-403; Dicicco-Bloom et al., Ann N Y Acad Sci. 11 Dic 1998; 865: 274-89).

La muerte celular apoptótica contribuye a la pérdida de células neuronales en el sistema nervioso adulto, causando varios trastornos neurológicos tales como apoplejía isquémica, enfermedades neurodegenerativas o traumatismos cerebrales (Becker y Bonni, Prog Neurobiol. Ene 2004; 72(1): 1-25). Un factor de crecimiento secretado capaz de proteger las células neuronales contra la muerte celular apoptótica, es por lo tanto un candidato para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso en general, y trastornos neurodegenerativos en particular. De esta manera, la capacidad de un factor secretado para inducir la extensión de neuritas y/o para promover la supervivencia en condiciones que llevan a apoptosis, es una indicación de que este factor tiene un efecto similar en otros tipos de células neuronales del sistema nervioso central y/o periférico, y que este factor es un candidato para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso, en particular trastornos neurodegenerativos.

Otra función biológica de NsG33, es un efecto de estimulación sobre el porcentaje de neuronas generadas por una línea de células madre neurales humanas (hNS1, anteriormente denominada HNSC.100). Células expuestas a medio condicionado de células ARPE-19 transducidas con secuencias codificantes de NsG33 humano, dieron un mayor porcentaje de neuronas respecto a astrocitos en comparación con células hNS1 expuestas a medio condicionado de células ARPE-19 no transducidas. Esto es consistente con el efecto antiapoptótico encontrado en el ensayo de células PC12. El efecto puede estar causado por un efecto de supervivencia sobre neuronas, y/o por neurogénesis y/o por proliferación de precursores neuronales. La línea de células hNS1 se establece de cultivos de neuroesferas humanas del prosencéfalo. Se ha mostrado que otros factores tróficos conocidos con potencial terapéutico, incrementan el número de neuronas generadas de cultivos de neuroesferas humanas. Estos incluyen NT3 y NT4/5 y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (Caldwell et al, Nature Biotechnology, Mayo 2001, 19(5): 475-9. Growth factors regulate the survival and fate of cells derived from human neurospheres). Por consiguiente, estos resultados indican también que NsG33 es un factor candidato para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso y en particular trastornos neurodegenerativos.

En otro ensayo in vitro, medio condicionado de dos líneas de células transfectadas con ADNc que codifica NsG33 humano, incrementó el porcentaje de neuronas en un cultivo primario de células estriatales de rata. Este ensayo es también consistente con un efecto neuroprotector de NsG33. Este efecto puede estar causado por un efecto de supervivencia en neuronas, y/o por neurogénesis y/o por proliferación de precursores neuronales. Otros factores con potencial terapéutico tienen un efecto similar sobre cultivos estriatales de rata, e incluyen factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento insulínico 1 truncado (tIGF), neurotrofina-3 (NT-3), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), la isoforma BB del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) y neurotrofina-4/5 (NT-4/5) (Nakao et al, Exp Neurol 1996, Mar 138(1): 144-57, Differential trophic effects of basic fibroblast growth factor, insulin-like growth factor-1, and neurotrophin-3 on striatal neurons in culture; Nakao et al, Brain Res Dev Barin Res, 1995, 21 Dic; 90(1-2): 92-101, Trophic and protective actions of brain-derived neurotrophic factor on striatal DARPP-32-containing neurons in vitro; Widmer et al Eur J Neurosci, 1 Nov 1994; 6(11): 1669-79, Neurotrophin 4/5 promotes survival and differentiation of rat striatal neurons developing in culture). En consecuencia, estos resultados indican también que NsG33 es un factor candidato para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso y en particular trastornos neurodegenerativos.

NsG33 está estructuralmente relacionada con una proteína descrita en el documento WO 93/22437 (Innogenetics SA), que se identifica en una búsqueda BLASTP. La proteína humana de longitud completa se muestra en la figura 2 del documento WO 93/22437. NsG33 comparte el 42% de identidad (Align0 con valores predeterminados) con la proteína de Innogenetics que incluye 10 residuos de cisteína conservados. Se predice un péptido señal N-terminal de 45 residuos en la proteína de Innogenetics (NsG34). Los datos de expresión recombinante del documento WO 93/22437, indican que la proteína de Innogenetics no está sometida a procesamiento del pro-péptido en las condiciones usadas en esa publicación, sino que se secreta como una proteína de 268 aminoácidos. Esto podría considerarse como una indicación de que la digestión predicha del pro-péptido de NsG33 puede no ocurrir cuando el gen se expresa, por lo menos no en las células usadas en la referencia citada.

Se muestra un alineamiento de NsG33 humano de longitud completa con la proteína humana de Innogenetics en la figura 5. Las 10 cisteínas conservadas se muestran en negrita, y están marcadas con asteriscos. Las dos proteínas en conjunto forman una familia de proteínas basada en los residuos de cisteína conservados y los tramos de alta conservación que son evidentes de la figura 5. Ninguna de las dos proteínas muestra una homología de secuencia significativa con ninguna otra proteína humana conocida. Aunque las dos proteínas son miembros de la misma pequeña familia de proteínas, las dos proteínas son estructuralmente distintas.

Debido a la alta conservación de las cisteínas, se espera que estos residuos desempeñen un papel importante en la estructura secundaria y terciaria de la proteína bioactiva. Una o más de las cisteínas pueden participar en la formación de puentes de cistina intramoleculares y/o intermoleculares.

La proteína de Innogenetics es, entre otras cosas, funcional en la activación de células T y células B, y como un inductor de células inmunosupresoras.

I. Polipéptidos NsG33

Además de NsG33 de longitud completa, NsG33 sustancialmente de longitud completa, pro-NsG33, péptidos C-terminales, péptidos N-terminales y formas truncadas de NsG33, la presente invención proporciona variantes biológicamente activas de los polipéptidos. Un polipéptido o fragmento NsG33 es biológicamente activo si exhibe una actividad biológica de NsG33 natural. Se entenderá que la invención se refiere a NsG33 sustancialmente purificada como se define aquí.

Una actividad biológica es la capacidad para competir con NsG33 natural en un ensayo de unión al receptor.

Otra actividad biológica es la capacidad para unirse a un anticuerpo, que está dirigido a un epítopo, que está presente en NsG33 natural.

Pueden definirse también variantes biológicamente activas con relación a uno o más de los otros ensayos biológicos in vitro y/o in vivo descritos en los ejemplos.

Una actividad biológica preferida, es la capacidad para inducir sustancialmente la misma respuesta que en el ensayo de células PC12 descrito en los ejemplos y en la figura 9. En este ensayo, se transducen células PC12 con secuencias codificantes de NsG33 humano de longitud completa (figura 6). Por sustancialmente la misma respuesta en el ensayo de células PC12, se pretende indicar que el número de células que poseen neuritas es por lo menos el 10% del número obtenido en el ejemplo 6 (transducción con NsG33 humano de longitud completa), más preferiblemente por lo menos el 20%, más preferiblemente por lo menos el 30%, más preferiblemente por lo menos el 40%, más preferiblemente por lo menos el 50%, más preferiblemente por lo menos el 60%, más preferiblemente por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%. El ensayo de células PC12 puede usarse también para documentar el porcentaje de mejora en supervivencia sobre un tratamiento control. Sustancialmente la misma respuesta en este contexto, significa una actividad que resulta en por lo menos el 10% de la mejora obtenida en el ejemplo 6 (figura 9), más preferiblemente por lo menos el 20%, más preferiblemente por lo menos el 30%, más preferiblemente por lo menos el 40%, más preferiblemente por lo menos el 50%, más preferiblemente por lo menos el 60%, más preferiblemente por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%. La actividad biológica de un fragmento o variante de NsG33 puede ser también mayor que la de NsG33 natural. Otras actividades biológicas preferidas incluyen el efecto neuroprotector y/o de neurogénesis mostrado en los ejemplos 14 y 15.

Fragmentos específicos de NsG33 incluyen polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en AA_{128}-AA_{293} de SEQ ID No. 3, AA_{121}-AA_{293} de SEQ ID No. 3, AA_{129}-AA_{294} de SEQ ID No. 8, AA_{122}-AA_{294} de SEQ ID No. 8, AA_{126}-AA_{291} de SEQ ID No. 13, AA_{119}-AA_{291} de SEQ ID No. 13, y variantes de secuencia de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida se cambia a un aminoácido diferente, siempre que no se cambien así más de 15 de los residuos de aminoácido en la secuencia. Estos polipéptidos aislados constituyen péptidos C-terminales de NsG33. De preferencia, cualquier aminoácido cambiado se selecciona de los designados como no conservados, débilmente conservados o fuertemente conservados en la figura 3a. ProtFun 2.1 predice con altas posibi-
lidades (8,0), que los péptidos C-terminales pertenecen a la clase ontológica de genes factor de crecimiento (figura 2).

Otros polipéptidos específicos se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID No. 19, 20, 21, 22, 23 y 24, y variantes de secuencia de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida se cambia a un aminoácido diferente, siempre que no se cambien así más de 15 de los residuos de aminoácido en la secuencia. Estos polipéptidos aislados constituyen péptidos N-terminales de NsG33. De preferencia, cualquier aminoácido cambiado se selecciona de los designados como no conservados, débilmente conservados o fuertemente conservados en la figura 3a. En una forma de realización preferida, se han cambiado menos de 10 aminoácidos, más preferiblemente menos de 5 aminoácidos, más preferiblemente 1 ó 2 aminoácidos, más preferiblemente no se ha cambiado ningún aminoácido. ProtFun 2.1 predice con altas posibilidades (8,1), que los péptidos N-terminales pertenecen a la clase ontológica de genes factor de crecimiento (figura 2).

En un aspecto, formas truncadas preferidas específicas de NsG33 se seleccionan del grupo que consiste en:

1) AA_{30}-AA_{288} de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{25}-AA_{293} de SEQ ID No. 3;

2) AA_{28}-AA_{286} de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{23}-AA_{291} de SEQ ID No. 13;

3) AA_{31}-AA_{289} de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{26}-AA_{294} de SEQ ID No. 8; y

4) variantes de secuencia de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida se cambia a un aminoácido diferente, siempre que no se cambien así más de 20 de los residuos de aminoácido en la secuencia.

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Estas formas truncadas de NsG33 constituyen una secuencia central de la primera a la última cisteína conservada. En una forma de realización preferida, se han cambiado menos de 15 aminoácidos, más preferiblemente menos de 10 aminoácidos, más preferiblemente menos de 5 aminoácidos, tal como 1 ó 2 aminoácidos, más preferiblemente no se ha cambiado ningún aminoácido.

En un aspecto, se seleccionan formas truncadas específicas de NsG33 del grupo que consiste en:

1) AA_{171}-AA_{288} de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{165}-AA_{288} de SEQ ID No. 3;

2) AA_{169}-AA_{286} de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{164}-AA_{291} de SEQ ID No. 13;

3) AA_{172}-AA_{289} de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{167}-AA_{294} de SEQ ID No. 8; y

4) variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida se cambia a un aminoácido diferente, siempre que no se cambien así más de 10 de los residuos de aminoácido en la secuencia.

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Estas formas truncadas constituyen una secuencia de núcleo bioactivo de la primera a la última cisteína conservada en péptidos C-terminales. En una forma de realización preferida, se han cambiado menos de 10 aminoácidos, más preferiblemente menos de 5 aminoácidos, más preferiblemente 1 ó 2 aminoácidos, más preferiblemente no se ha cambiado ningún aminoácido.

1) AA_{30}-AA_{118} de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{25}-AA_{123} de SEQ ID No. 3;

2) AA_{28}-AA_{116} de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{23}-AA_{121} de SEQ ID No. 13;

3) AA_{31}-AA_{119} de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{26}-AA_{124} de SEQ ID No. 8; y

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Estas formas truncadas constituyen secuencias centrales de la primera a la cuarta cisteína conservada en péptidos de NsG33 N-terminales. En una forma de realización preferida, se han cambiado menos de 10 aminoácidos, más preferiblemente menos de 5 aminoácidos, más preferiblemente 1 ó 2 aminoácidos, más preferiblemente no se ha cambiado ningún aminoácido.

Las variantes pueden diferir de NsG33 natural en la secuencia de aminoácidos o en formas que no impliquen secuencia, o en ambas formas. Se producen variantes en secuencia de aminoácidos ("variantes de secuencia"), cuando uno o más aminoácidos en NsG33 natural se sustituyen por un aminoácido natural diferente, un derivado de aminoácido o un aminoácido no nativo. Variantes particularmente preferidas incluyen NsG33 natural, o fragmentos biológicamente activos de NsG33 natural, cuyas secuencias difieran de la secuencia de tipo silvestre en una o más sustituciones de aminoácido conservadoras y/o semiconservadoras que típicamente tienen influencia mínima sobre la estructura secundaria y terciaria y la naturaleza hidrofóbica de la proteína o péptido. Las variantes pueden tener también secuencias que difieran en una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácido no conservadoras, que no suprimen la actividad biológica de NsG33. El alineamiento por Clustal W en la figura 3a o la figura 3b puede usarse para predecir qué residuos de aminoácido se pueden sustituir sin afectar sustancialmente la actividad biológica de la proteína.

Sustituciones dentro del siguiente grupo (Clustal W, grupo de conservación "fuerte"), se considerarán como sustituciones conservadoras dentro del significado de la presente invención:

-STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW.

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Sustituciones dentro del siguiente grupo (Clustal W, grupo de conservación "débil"), se deben considerar como sustituciones semiconservadoras dentro del significado de la presente invención:

-CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY.

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Otras variantes dentro de la invención, son aquellas con modificaciones que incrementan la estabilidad del péptido. Tales variantes pueden contener, por ejemplo, uno o más enlaces no peptídicos (que reemplazan a los enlaces peptídicos) en la secuencia peptídica. También se incluyen: variantes que incluyen residuos diferentes de L-aminoácidos naturales, tales como D-aminoácidos o aminoácidos no naturales o sintéticos, tales como beta o gamma aminoácidos y variantes cíclicas. La incorporación de D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos en el polipéptido, puede incrementar su resistencia a proteasas. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 5219990. Se incluyen específicamente variantes de ayuste en la invención.

Cuando el resultado de una sustitución determinada no pueda predecirse con certeza, los derivados pueden ensayarse fácilmente según los métodos descritos aquí, para determinar la presencia o ausencia de actividad biológica. Preferiblemente, en el ensayo de células PC12 y/o el ensayo de hNS1 y/o el ensayo de cultivo estriatal de rata.

En una forma de realización, el polipéptido es una variante alélica natural de la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 22, 23 y 24. Este polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos que sea la traducción de una secuencia de ácido nucleico que difiere en un sólo nucleótido, de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18.

Un polipéptido variante como se describe aquí, en una forma de realización, comprende un polipéptido en donde se cambia algún aminoácido especificado en la secuencia elegida para proporcionar una sustitución conservadora.

El péptido señal puede ser reemplazado por un péptido señal heterólogo.

Las variantes dentro del ámbito de la invención en una forma de realización, incluyen proteínas y péptidos con secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos el 70% de identidad con NsG33 humano, murino o de rata (SEQ ID NO: 5, 10 y 15). Más preferiblemente, la identidad de secuencia es por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

Variantes preferidas dentro del ámbito de la invención en una forma de realización, incluyen proteínas y péptidos con secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos el 70 por ciento de identidad con un polipéptido que tenga la secuencia de SEQ ID NO: 4, 9 ó 14. Más preferiblemente, la identidad de secuencia es por lo menos del 75%, más preferiblemente por lo menos del 80%, más preferiblemente por lo menos del 85%, más preferiblemente por lo menos del 90%, más preferiblemente por lo menos del 95%, más preferiblemente por lo menos del 98%. SEQ ID No. 4, 9 y 14 corresponden a las proteínas maduras después de digestión del péptido señal y sin digestión del pro-péptido.

Variantes dentro del ámbito de la invención en una forma de realización, incluyen proteínas y péptidos con secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 70 por ciento de identidad con un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3, 8 ó 13. Más preferiblemente, la identidad de secuencia es por lo menos del 75%, más preferiblemente por lo menos del 80%, más preferiblemente por lo menos del 85%, más preferiblemente por lo menos del 90%, más preferiblemente por lo menos del 95%, más preferiblemente por lo menos del 98%.

Variantes dentro del ámbito de la invención en una forma de realización, incluyen proteínas y péptidos con secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos 70% de identidad de secuencia con una proteína que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 19, 20, 21, 22, 23 y 24, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 19, 20, 21, 22, 23 y 24.

Variantes dentro del ámbito de la invención en una forma de realización, incluyen proteínas y péptidos con secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos el 70 por ciento de identidad con un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 19, 20 ó 21. Más preferiblemente, la identidad de secuencia es por lo menos del 75%, más preferiblemente por lo menos del 80%, más preferiblemente por lo menos del 85%, más preferiblemente por lo menos del 90%, más preferiblemente por lo menos del 95%, más preferiblemente por lo menos del 98%.

Variantes dentro del ámbito de la invención en una forma de realización, incluyen proteínas y péptidos con secuencias de aminoácidos que tienen por lo menos el 70 por ciento de identidad con un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID No. 22, 23 o 24. Más preferiblemente, la identidad de secuencia es por lo menos del 75%, más preferiblemente por lo menos de 80%, más preferiblemente por lo menos del 85%, más preferiblemente por lo menos del 90%, más preferiblemente por lo menos del 95%, más preferiblemente por lo menos del 98%.

En una forma de realización preferida, la identidad de secuencia de NsG33 variante se determina con relación a un polipéptido NsG33 humano (SEQ ID No. 3, 4, 5, 19 ó 22).

Para los propósitos de determinación de la homología, la longitud mínima de secuencias de comparación será en general por lo menos 8 residuos de aminoácido, usualmente por lo menos 12 residuos de aminoácido. Para los propósitos de la presente invención, el porcentaje de identidad de secuencia se calcula de preferencia en un intervalo de solapamiento por lo menos 25 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 30 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 35, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 45, más preferiblemente por lo menos 50, más preferiblemente por lo menos 55, más preferiblemente por lo menos 60, tal como por lo menos 70, por ejemplo, por lo menos 80, tal como por lo menos 90, por ejemplo, por lo menos 100, tal como por lo menos 110, por ejemplo, por lo menos 120, tal como por lo menos 130, por ejemplo, por lo menos 150, estando determinado el intervalo mediante BLASTP con valores predeterminados.

En una forma de realización, el porcentaje de identidad de secuencia se calcula usando alineamiento global (GAP o Align), de modo que las secuencias variante y de SEQ ID se alinean, y el número total de residuos de aminoácido idénticos se calcula y divide entre la longitud de SEQ ID NO.

En una forma de realización, una NsG33 variante comprende una variante alélica natural de la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14 y 15. Dicha secuencia variante alélica puede ser una secuencia de aminoácidos que sea la traducción de una secuencia de ácido nucleico que difiera en un sólo nucleótido de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18.

En una forma de realización, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 3, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

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En una forma de realización, las variantes preferidas incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 4, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

En una forma de realización, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 5, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

En una forma de realización, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 8, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

En una forma de realización, las variantes preferidas incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 9, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

En una forma de realización, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 10, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

En una forma de realización, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 13, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

En una forma de realización, las variantes preferidas incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 14, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

En una forma de realización, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 15, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

En una forma de realización, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 19, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

En una forma de realización, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 20, más preferiblemente por lo el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

En una forma de realización, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 21, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

En una forma de realización, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 22, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

En una forma de realización, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 23, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

En una forma de realización, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 24, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

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En una forma de realización, las variantes incluyen proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 26, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%.

En una forma de realización, una NsG33 variante en posiciones correspondientes, comprende los residuos marcados en la figura 3a como completamente conservados (*), más preferiblemente una NsG33 variante comprende también en posiciones correspondientes los residuos marcados en la figura 3a como fuertemente conservados (: grupos fuertemente conservados incluyen: STA, NEQK, NHQK, NEDQ, QHRK, MILV, MILF, HY FYW), más preferiblemente una NsG33 variante comprende también en posiciones correspondientes los residuos marcados en la figura 3a como menos conservados (. grupos menos conservados incluyen: CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY). En particular, se contempla que las cisteínas conservadas (figura 5) deben localizarse en posiciones correspondientes en una NsG33 variante.

Las modificaciones no de secuencia pueden incluir, por ejemplo, derivación química in vivo o in vitro de partes de NsG33, así como acetilación, metilación, fosforilación, carboxilación, PEG-ilación o glicosilación. Ya que es posible reemplazar sustituyentes de la proteína, también es posible sustituir grupos funcionales, que están unidos a la proteína con grupos caracterizados por características similares. Tales modificaciones no alteran la secuencia primaria. Estas serán inicialmente conservadoras, es decir, el grupo de reemplazo tendrá casi los mismos tamaño, forma, hidrofobicidad y carga que el grupo original.

Muchos aminoácidos, incluyendo los aminoácidos terminales, pueden modificarse en un polipéptido determinado, ya sea por procesos naturales tales como la glicosilación y otras modificaciones postraduccionales, o por medio de técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Entre las modificaciones conocidas que pueden estar presentes en los polipéptidos de la presente invención están, por nombrar unas cuantas ilustrativas, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un grupo hemo, unión covalente de un polinucleótido o derivado de polinucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicación, glicosilación, formación de anclaje de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia, tal como arginilación, y ubiquitinación.

Tales modificaciones son bien conocidas por los expertos en la materia, y se han descrito en gran detalle en la literatura científica. Varias modificaciones particularmente comunes, glicosilación, unión de lípidos, sulfatación, carboxilación gamma de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación, por ejemplo, se describen en la mayoría de textos básicos tales como, por ejemplo, I. E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2a. ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York, 1993. Están disponibles muchas revisiones detalladas sobre este tema tales como, por ejemplo, las proporcionadas por Wold, F., en Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, ed., Academic Press, New York, pp 1-12, 1983; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646, 1990, y Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62, 1992.

Además, la proteína puede comprender una etiqueta proteica que permita la purificación subsiguiente y opcionalmente la eliminación de la etiqueta usando una endopeptidasa. La etiqueta puede comprender también un sitio de corte de proteasa que facilite la eliminación subsiguiente de la etiqueta. Ejemplos no limitantes de etiquetas de afinidad, incluyen una etiqueta de polihistidina, una etiqueta de GST, una etiqueta de HA, una etiqueta Flag, una etiqueta C-myc, una etiqueta de HSV, una etiqueta V5, una etiqueta de proteína de unión a maltosa y una etiqueta del dominio de unión a celulosa. De preferencia, para la producción y purificación, la etiqueta es una etiqueta de polihistidina. De preferencia, la etiqueta está en la parte C-terminal de la proteína.

La secuencia señal nativa de NsG33 puede reemplazarse también para incrementar la secreción de la proteína en producción recombinante en otros tipos de células de mamífero.

Se apreciará, como es bien sabido y como se indicó anteriormente, que los polipéptidos no siempre son enteramente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de ubiquitinación, y pueden ser circulares, con o sin ramificación, en general como resultado de eventos postraduccionales, que incluyen eventos de procesamiento naturales y eventos causados por la manipulación humana que no ocurren de forma natural. Pueden sintetizarse polipéptidos circulares, ramificados y circulares ramificados mediante procesos naturales no de traducción, y mediante métodos enteramente sintéticos, también y están dentro del ámbito de la presente invención.

Pueden ocurrir modificaciones en cualquier parte en un polipéptido, incluyendo el esqueleto peptídico, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. De hecho, el bloqueo del grupo amino o carboxilo en un polipéptido, o ambos, por una modificación covalente, es común en polipéptidos naturales y sintéticos, y tales modificaciones pueden estar también presentes en los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, el residuo amino terminal de polipéptidos obtenidos en E. coli antes del procesamiento proteolítico, casi invariablemente será N-formilmetionina.

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Las modificaciones que ocurren en un polipéptido serán con frecuencia una función de cómo se produce. Para polipéptidos que se obtienen expresando un gen clonado en un huésped, por ejemplo, la naturaleza y el ámbito de las modificaciones estarán determinadas en gran parte por la capacidad de modificación postraduccional de la célula huésped y las señales de modificación presentes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por ejemplo, la glicosilación no ocurre con frecuencia en bacterias huésped tales como E. coli. Según esto, cuando se desee glicosilación, un polipéptido debe expresarse en un huésped glicosilante, en general una célula eucariota. Las células de insecto llevan a cabo con frecuencia las mismas glicosilaciones postraduccionales que las células de mamífero y, por esta razón, se han desarrollado sistemas de expresión de células de insecto para expresar eficientemente proteínas de mamífero que tengan patrones nativos de glicosilación, entre otros. Consideraciones similares se aplican a otras
modificaciones.

Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o un grado variable en varios sitios en un polipéptido determinado. Asimismo, un polipéptido determinado puede contener muchos tipos de modificaciones.

En general, como se usa aquí, el término polipéptido abarca todas esas modificaciones, en particular las que están presentes en polipéptidos sintetizados expresando un polinucleótido en una célula huésped.

También se incluyen dentro de la invención agentes que se unen específicamente a una proteína de la invención, o un fragmento de dicha proteína. Estos agentes incluyen proteínas de fusión de inmunoglobulina y anticuerpos (incluyendo fragmentos de cadena sencilla, de cadena doble, F_{ab} y otros, ya sea nativos, humanizados, primatizados o quiméricos). Otras descripciones de estas categorías de agentes están en el documento WO 95/16709.

Anticuerpos se refiere a moléculas intactas, así como a fragmentos de las mismas, tales como F_{ab}, F_{(ab')} y F_{v}, que son capaces de unirse al determinante epitópico. Pueden prepararse anticuerpos que se unen a polipéptidos NsG33, usando polipéptidos intactos o fragmentos que contengan pequeños péptidos de interés como el antígeno inmunizante. El polipéptido u oligopéptido usado para inmunizar a un animal puede derivarse de la traducción de ARN, o puede sintetizarse químicamente y puede conjugarse con una proteína portadora, si se desea. Vehículos usados comúnmente que se acoplan químicamente a péptidos, incluyen seroalbúmina bovina, tiroglobulina y hemocianina de lapa californiana. El péptido acoplado se usa entonces para inmunizar al animal (por ejemplo, un ratón, una rata o un conejo).

Los anticuerpos humanizados, como se usa aquí, se refiere a moléculas de anticuerpo en las que se han cambiado aminoácidos en las regiones de no unión a antígeno para asemejar más estrechamente un anticuerpo humano, mientras retienen aún la capacidad de unión original. Pueden usarse terapéuticamente anticuerpos humanizados para tratar afecciones, donde sea deseable limitar o bloquear la acción de NsG33.

También se incluyen dentro del ámbito de la presente invención, inmunoconjugados de anticuerpos y conjugados seleccionados del grupo que consiste en: un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una toxina o un isótopo radiactivo; un miembro de un par de unión específico, tal como avidina o estreptavidina, o un antígeno; una enzima capaz de producir un producto detectable. Estos inmunoconjugados pueden usarse para dirigir los conjugados hacia células que expresan un receptor de NsG33.

Anticuerpos específicos para cualquier NsG33, son también útiles en inmunoensayos para cuantificar la sustancia para la que un anticuerpo determinado tiene carácter específico. Anticuerpos específicos para una NsG33 pueden unirse también a soportes sólidos, tales como perlas o placas, y pueden usarse para retirar el ligando de una solución, ya sea para su uso en la purificación de la proteína, o en la depuración de la solución. Cada una de estas técnicas es de rutina para los expertos en las técnicas inmunológicas.

También están dentro del ámbito de la presente invención, proteínas de fusión de NsG33. Una proteína de fusión de NsG33 puede usarse para permitir el diagnóstico por imágenes de tejidos que expresen un receptor para NsG33, o en los métodos inmunohistológicos o preparativos descritos anteriormente para anticuerpos para una NsG33. Pueden usarse proteínas de fusión que abarquen una NsG33 para dirigir específicamente terapias médicas contra células que expresen un receptor de NsG33.

II. Secuencias de nucleótidos de NsG33

La invención proporciona el uso médico según la invención de ADN genómico y ADNc que codifica NsG33 incluyendo, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos genómica humana (SEQ ID No. 1), las secuencias genómicas de ratón y rata (SEQ ID No. 6 y 11), la secuencia de nucleótidos de ADNc de NsG33 humano, de ratón y rata (SEQ ID No. 2, 7 y 12), las secuencias que codifican NsG33 sin péptido señal (nucleótidos 187-996 de SEQ ID No. 2, nucleótidos 74-883 de SEQ ID No. 7 y nucleótidos 64-873 de SEQ ID No. 12), y las secuencias que codifican fragmentos N-terminales de NsG33 de origen humano, de ratón y rata (SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17 y SEQ ID No. 18). La invención también proporciona la secuencia de ADNc que codifica NsG33 de longitud completa de ratón (SEQ ID No. 25).

También se incluyen variantes de estas secuencias dentro del ámbito de la presente invención.

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En una forma de realización, una molécula de ácido nucleico aislada para el uso médico de la invención, comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido o su secuencia complementaria, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 22, 23 y 24;

b) una variante de secuencia de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 3, 4, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 22, 23 y 24, en donde la variante tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con dicha SEQ ID No.; y

c) un fragmento biológicamente activo de por lo menos 50 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b).

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La molécula de ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos de una variante alélica de ácido nucleico natural.

La molécula de ácido nucleico de la invención puede codificar un polipéptido variante, en donde el polipéptido variante tiene la secuencia polipeptídica de una variante de polipéptido natural.

En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico difiere en un solo nucleótido de una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18.

De preferencia, el polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 5, 10 y 15, más preferiblemente el 75% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 80% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 90% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 95% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, más preferiblemente en donde el polipéptido tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en dichas SEQ ID Nos.

En una forma de realización preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 3 y 4, más preferiblemente el 75% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 80% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 90% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 95% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, más preferiblemente en donde el polipéptido tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en dichas SEQ ID Nos. Dichas secuencias constituyen NsG33 humano.

En una forma de realización preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 19 y 22, más preferiblemente el 75% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 80% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 90% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 95% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, más preferiblemente en donde el polipéptido tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en dichas SEQ ID Nos. Dichas secuencias constituyen NsG33 humano.

En una forma de realización preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID No. 5, más preferiblemente el 75% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 80% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 90% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 95% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, más preferiblemente en donde el polipéptido tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en dicha SEQ ID No. Dicha secuencia constituye NsG33 humano.

En una forma de realización preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 4, 9 y 14, más preferiblemente el 75% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 80% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 85% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 90% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 95% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, más preferiblemente en donde el polipéptido tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en dichas SEQ ID Nos. Dichas secuencias constituyen NsG33 sin péptido señal.

En una forma de realización preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 3, 8 y 13, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente en donde dicho polipéptido tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 3, 8 y 13.

En una forma de realización preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 19, 20, 21, 22, 23 y 24, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente en donde dicho polipéptido tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 19, 20, 21, 22, 23 y 24.

En una forma de realización preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 3, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente en donde dicho polipéptido tiene la secuencia de SEQ ID No. 3.

En una forma de realización preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 4, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente en donde dicho polipéptido tiene la secuencia de SEQ ID No. 4.

En una forma de realización preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 19, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente en donde dicho polipéptido tiene la secuencia de SEQ ID No. 19.

En una forma de realización preferida, el polipéptido codificado tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 22, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente en donde dicho polipéptido tiene la secuencia de SEQ ID No. 22.

En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18;

b) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18;

c) una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 150 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18;

c) el complemento de un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18 en condiciones muy rigurosas; y

d) la secuencia de ácido nucleico del complemento de cualquiera de los anteriores.

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SEQ ID No. 16, 17 y 18 representan las secuencias que codifican polipéptidos C-terminales de NsG33 humano, de ratón y rata. Para expresión recombinante en un sistema de expresión eucariótico, éstas están ligadas de preferencia a secuencias codificantes de secuencia señal adecuadas que aseguran que el polipéptido NsG33 se secrete de las células.

En una forma de realización preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 2, 7, 12, 16, 17 y 18.

En una forma de realización preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 16, 17 y 18.

En una forma de realización preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 2 y 16.

En una forma de realización preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 187-996 de SEQ ID No. 2, nucleótidos 74-883 de SEQ ID No. 7 y nucleótidos 64-873 de SEQ ID No. 12. Estos fragmentos de secuencia codifican NsG33 sin péptido señal.

En una forma de realización, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, con la secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 1.

En una forma de realización preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 2.

En una forma de realización preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 16.

En una forma de realización, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 6.

En una forma de realización preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 7.

En una forma de realización preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 17.

En una forma de realización, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 11.

En una forma de realización preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 12.

En una forma de realización preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 18.

En una forma de realización preferida, el polinucleótido aislado de la invención tiene por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, de preferencia por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia, con una secuencia de polinucleótidos presentada como SEQ ID NO: 25.

Un grupo preferido de polinucleótidos aislados incluye SEQ ID No. 1, 2 y 16, que son polinucleótidos de NsG33 humano. Otro grupo preferido de polinucleótidos aislados incluye SEQ ID No. 2, 7 y 12, que representan las secuencias de ADNc. En general, la secuencia de ADNc es mucho más corta que las secuencias genómicas, que se insertan más fácilmente en un vector de expresión adecuado, y se transducen/transfectan en una célula de producción o una célula humana in vivo o ex vivo.

Además, las secuencias de nucleótidos de la invención incluyen secuencias que son derivados de estas secuencias. La invención incluye también vectores, liposomas y otros vehículos portadores, que abarcan una de estas secuencias o un derivado de una de estas secuencias. La invención incluye también proteínas transcritas y traducidas de ADNc de NsG33, de preferencia ADNc de NsG33 humano que incluye, pero no está limitado a, NsG33 humano y sus derivados y variantes.

En otra forma de realización, la invención se refiere al uso de los ácidos nucleicos y proteínas de la presente invención, para diseñar sondas para aislar otros genes que codifiquen proteínas con propiedades estructurales o funcionales de las proteínas NsG33 de la invención. Las sondas pueden tener una variedad de pares de bases de longitud. Por ejemplo, una sonda de ácido nucleico puede estar entre aproximadamente 10 pares de bases de longitud a aproximadamente 150 pares de bases de longitud.

De forma alternativa, la sonda de ácido nucleico puede ser mayor de aproximadamente 150 pares de bases de longitud. Se proporcionan métodos experimentales en Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", J. Wiley (ed.) (1999).

El diseño de la sonda de oligonucleótidos (referida también aquí como ácido nucleico), debe seguir de preferencia estos parámetros:

i) debe diseñarse para un área de la secuencia que tenga el menor número de bases ambiguas, si las hay, y

ii) debe diseñarse para que tenga una T_{m} calculada de aproximadamente 80ºC (suponiendo 2ºC por cada A ó T, y 4ºC por cada G ó C).

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El oligonucleótido debe marcarse de preferencia para facilitar la detección de hibridación. El marcaje puede ser con \gamma-^{32}P ATP (actividad específica de 6000 Ci/mmol) y polinucleótido cinasa de T4, usando técnicas usadas comúnmente para el marcaje de oligonucleótidos. Pueden usarse también otras técnicas de marcaje. La marca no incorporada debe eliminarse de preferencia por medio de cromatografía de filtración en gel u otros métodos establecidos. La cantidad de radiactividad incorporada en la sonda debe cuantificarse por medida en un contador de centelleo. De preferencia, la actividad específica de la sonda resultante debe ser de aproximadamente 4 x 10^{6} dpm/pmol. El cultivo de bacterias que contiene al grupo de clones de longitud completa debe descongelarse de preferencia, y deben usarse 100 \muL de la solución madre para inocular un matraz de cultivo estéril que contenga 25 ml de medio de Luria estéril que contenga ampicilina 100 pg/ml.

El cultivo se debe hacer crecer de preferencia hasta saturación a aproximadamente 37ºC, y el cultivo saturado debe diluirse de preferencia en medio de Luria fresco. Deben sembrarse en placa de preferencia alícuotas de estas diluciones para determinar la dilución y el volumen que darán aproximadamente 5000 colonias distintas y bien separadas en medios bacteriológicos sólidos que contengan medio de Luria con ampicilina a 100 pg/ml y agar al 1,5% en una placa Petri de 150 mm cuando se hacen crecer durante la noche a aproximadamente 37ºC. Pueden usarse también otros métodos conocidos para la obtención de colonias distintas bien separadas.

Deben usarse entonces procedimientos estándar de hibridación de colonias para transferir las colonias a filtros de nitrocelulosa y lisarlas, desnaturalizarlas y hornearlas. Condiciones muy rigurosas (referidas también en la presente como "alta severidad"), son aquellas que son por lo menos tan rigurosas como, por ejemplo, SSC 1x a aproximadamente 65ºC, o SSC 1x y formamida al 50% a aproximadamente 42ºC. Condiciones de "severidad moderada", son aquellas que son por lo menos tan rigurosas como SSC 4x a aproximadamente 65ºC, o SSC 4x y formamida al 50% a aproximadamente 42ºC. Condiciones de "severidad reducida", son aquellas que son por lo menos tan rigurosas como SSC 4x a aproximadamente 50ºC, o SSC 6x y formamida al 50% a 40ºC.

El filtro se incuba entonces de preferencia a aproximadamente 65ºC durante 1 hora, con agitación suave en SSC 6X (la solución madre 20x es 175,3 g de NaCl/litro, 88,2 g de citrato de sodio/litro, ajustados a pH 7.0 con NaOH) que contiene SDS al 0,5%, 100 g/ml de ARN de levadura y EDTA 10 mM (aproximadamente 10 mL por filtro de 150 mm). De preferencia, la sonda se añade entonces a la mezcla de hibridación a una concentración mayor que o igual a 1 x 10^{6} dpm/mL. El filtro se incuba entonces de preferencia a aproximadamente 65ºC con agitación suave durante la noche. El filtro se lava entonces de preferencia en 500 mL de SSC 2x/SDS al 0,5% a temperatura ambiente sin agitación, de preferencia seguido por 500 mL de SSC 2x/SDS al 0,1% a temperatura ambiente con agitación suave durante 15 minutos. Un tercer lavado con SSC 0,1x/SDS al 0,5% a aproximadamente 65ºC durante 30 minutos a 1 hora, es opcional. El filtro se seca entonces de preferencia y se somete a autorradiografía durante tiempo suficiente para visualizar los positivos en la película de rayos X. Pueden usarse también otros métodos de hibridación conocidos. Las colonias positivas se recogen entonces, se hacen crecer en cultivo, y se aísla ADN de plásmido usando procedimientos estándar.
Los clones pueden verificarse entonces por análisis de restricción, análisis de hibridación o secuenciación de ADN.

De forma alternativa, condiciones experimentales adecuadas para determinar la hibridación entre una sonda de nucleótidos y una secuencia de ADN o ARN homóloga, implican pre-remojo del filtro que contiene a los fragmentos de ADN, o ARN para hibridar en SSC 5x [cloruro de sodio/citrato de sodio; véase Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY 1989] durante 10 minutos, y prehibridación del filtro en una solución de SSC 5x, solución de Denhardt 5x [véase Sambrook et al; en la obra citada], SDS al 0,5% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón sonicado desnaturalizado [véase Sambrook et al.; en la obra citada], seguido de hibridación en la misma solución que contiene una concentración de 10 ng/ml de una sonda marcada al azar [Feinberg A P y Vogelstein B; Anal. Biochem. 1983 132 6-13], marcada conP-dCTP (actividad específica > 1 x 10^{9} cpm/\mug) durante 12 horas a aproximadamente 45ºC. El filtro se lava entonces dos veces durante 30 minutos en SSC 0,1x, SDS al 0,5% a una temperatura de por lo menos 60ºC (condiciones de severidad media), de preferencia por lo menos 65ºC (condiciones de severidad media/alta), más preferiblemente por lo menos 70ºC (condiciones de alta severidad), y aún más preferiblemente de por lo menos 75ºC (condiciones de muy alta severidad). Las moléculas con las que hibrida la sonda de oligonucleótidos en estas condiciones, pueden detectarse usando una película de rayos X.

En aún otra forma de realización, la invención se refiere a secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN) que hibridan con ácidos nucleicos de NsG33. En particular, ácidos nucleicos que hibridan con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17 o SEQ ID No 18 en condiciones de severidad alta, moderada o reducida como se describió anteriormente.

En otra aún forma de realización, la invención se refiere a un complemento de ácido nucleico de NsG33. En particular, se refiere a complementos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17 y SEQ ID No 18.

En otra forma de realización, la invención se refiere a un homólogo de ARN del ácido nucleico ADN de NsG33. En particular, se refiere a homólogos de ARN de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 12, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17 y SEQ ID No 18.

Se contemplan también moléculas de ácido nucleico con codones optimizados para expresión mejorada en células huéspedes seleccionadas que incluyen, pero no están limitadas a, E. coli, especies de levadura, hámster chino, cría de hámster, insecto y hongo.

Pueden hacerse ácidos nucleicos variantes mediante métodos de mutagénesis del estado de la técnica. Se contemplan también métodos para entremezclar secuencias codificantes humanas con las de ratón, rata o chimpancé. Específicamente, una variante entremezclada se puede dar entre SEQ ID No. 2 por un lado, y 7 y/o 12 por otro. Se incluyen también variantes entremezcladas entre SEQ ID No. 7 y 12.

III. Uso de polipéptidos NsG33, polinucleótidos y células que secretan NsG33 para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso

En una forma de realización, se proporciona NsG33 variante nativa y fragmentos de la misma y/o proteínas de fusión que comprenden NsG33, para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso de mamíferos. Puede usarse NsG33 para estimular el crecimiento de células neurales, que incluye proliferación, función neural, regeneración neural, diferenciación neural, migración neural y/o supervivencia neural en situaciones de enfermedad en donde estas células se pierden o son dañadas.

En una forma de realización, pueden usarse polinucleótidos y/o polipéptidos de la invención para tratar afecciones o enfermedades en donde sea deseable el crecimiento neural, que incluye proliferación, diferenciación, función, supervivencia y/o regeneración. Los polipéptidos de la presente invención pueden usarse directamente, por ejemplo, por medio de composiciones farmacéuticas inyectadas, implantadas o ingeridas, para tratar un proceso patológico sensible a los polipéptidos NsG33. Esto está apoyado por los análisis de bioinformática que muestran que NsG33 es un factor de crecimiento secretado, el hecho de que NsG33 sea capaz de proteger a una línea de células neurales de apoptosis (ejemplo 6), el hecho de que NsG33 produzca la generación de un porcentaje incrementado de neuronas en un ensayo de diferenciación de células progenitoras neurales humanas y en cultivos estriatales primarios de rata, y el hecho de que NsG33 se exprese preferiblemente en el sistema nervioso, incluyendo el ojo (figura 4). El efecto antiapoptótico de NsG33, la hace una proteína/gen candidato para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso que implican muerte celular apoptótica. Tales trastornos incluyen apoplejía, traumatismo y trastornos neurodegenerativos. El efecto neuroprotector y/o de neurogénesis de NsG33, apoya el uso para el tratamiento de trastornos causados por pérdida, disfunción o degeneración de neuronas o sus extensiones.

NsG33 puede actuar sobre una gama de diferentes tipos de células que están presentes en el sistema nervioso. En el contexto de la presente invención, se pretende que el sistema nervioso abarque el sistema nervioso central, el sistema nervioso periférico, el ojo y el complejo cocleovestibular.

En una forma de realización, los polipéptidos NsG33 pueden actuar sobre neuronas que incluyen, pero no están limitadas a, neuronas motoras y neuronas sensitivas.

En otra forma de realización, el efecto terapéutico de los polipéptidos NsG33 puede ser a través de la acción sobre células gliales, tales como oligodendrocitos y/o astrocitos. A través de su acción sobre células gliales, los polipéptidos NsG33 pueden estar implicados en mielinización y en el mantenimiento de la función y supervivencia neuronales.

En otra forma de realización, los polipéptidos NsG33 pueden actuar sobre células sensitivas que incluyen, pero no están limitadas a, células ganglionares retinianas, células fotorreceptoras, tejido de soporte tal como células epiteliales retinianas, y células pilosas del oído.

En una forma de realización adicional, los polipéptidos NsG33 pueden actuar sobre células madre, y células precursoras posteriores que incluyen, pero no están limitadas a, precursores neuronales y precursores gliales. Los polipéptidos NsG33 pueden actuar sobre células madre y/o precursores neuronales o gliales para causar crecimiento que incluye proliferación, para causar diferenciación, y/o migración. La terapia con células madre puede hacerse a través de terapia génica in vivo o ex vivo, o la proteína puede administrarse a un sitio con células madre. Esto está apoyado por el efecto de NsG33 sobre una línea de células progenitoras neurales humanas.

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El trastorno o enfermedad o daño pueden ser daños del sistema nervioso causados por traumatismo, cirugía, isquemia, infección, enfermedades metabólicas, deficiencia nutricional, cáncer o agentes tóxicos, y procesos genéticos o idiopáticos.

En una forma de realización del método de la invención, la enfermedad o trastorno o daño implica lesión en el cerebro, tronco encefálico, la médula espinal y/o nervios periféricos, que produce afecciones tales como apoplejía, lesión cerebral traumática (TBI), lesión de médula espinal (SCI), lesión axonal difusa (DAI), epilepsia, neuropatía, neuropatía periférica y dolor asociado y otros síntomas que estos síndromes pueden causar.

En otra forma de realización, la enfermedad, trastorno o daño implica la degeneración de neuronas y sus extensiones en el cerebro, tronce encefálico, la médula espinal y/o nervios periféricos, tales como trastornos neurodegenerativos que incluyen, pero no están limitados a, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, demencia senil, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), lesión neuronal/axonal asociada con esclerosis múltiple (EM), y síntomas asociados.

En otra forma de realización, la enfermedad, trastorno o daño implica disfunción y/o pérdida de neuronas en el cerebro, tronce encefálico, la médula espinal y/o nervios periféricos, tales como disfunción y/o pérdida causada por enfermedades metabólicas, deficiencia nutricional, lesión tóxica, cáncer y/o afecciones genéticas o idiopáticas que incluyen, pero no están limitadas a, diabetes, disfunción renal, alcoholismo, quimioterapia, agentes químicos, toxicomanía, deficiencias de vitaminas, infección, y síntomas asociados.

En otra forma de realización, la enfermedad, trastorno o daño implica la degeneración o esclerosis de células gliales, tales como oligodendrocitos, astrocitos y células de Schwann en el cerebro, tronco encefálico, la médula espinal y sistema nervioso periférico e incluye, pero no está limitado a, esclerosis múltiple (EM), neuritis óptica, esclerosis cerebral, encefalomielitis post-infecciosa y epilepsia, y síntomas asociados.

En otra forma de realización, la enfermedad, trastorno o daño implica la retina, fotorreceptores y nervios asociados e incluye, pero no está limitado a, retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma, y síntomas asociados.

En otra forma de realización, la enfermedad, trastorno o daño implica el epitelio sensitivo y ganglios asociados del complejo vestibuloacústico e incluye, pero no está limitado a, pérdida de audición inducida por ruido, sordera, acúfenos, otitis, laberintitis, atrofias hereditaria y cocleovestibular, enfermedad de Meniere, y síntomas asociados.

En una forma de realización preferida, los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores de expresión, cápsulas y composiciones farmacéuticas de la invención, se usan en el tratamiento de enfermedad de Parkinson. Esta función se basa en el hallazgo de altos niveles de expresión en el cerebro medio central, en la sustancia negra y en el putamen (véase ejemplo 5), y el hallazgo de expresión en el mesencéfalo durante el desarrollo del embrión humano (ejemplo 3), el hecho de que NsG33 causa la generación de un porcentaje incrementado de neuronas en un ensayo de diferenciación de células progenitoras neurales humanas y en cultivos estriatales primarios de rata, y está apoyada por el hallazgo de protección contra muerte celular apoptótica (ejemplo 6). La función puede verificarse usando el bioensayo para actividades neurotróficas dopaminérgicas (ejemplo 11) e in vivo a través del modelo de lesión intraestriatal con 6-OHDA (ejemplo 12).

La enfermedad de Huntington (EH), es un trastorno autosómico dominante que produce la degeneración progresiva de varias poblaciones neuronales dentro del cerebro, en particular las neuronas espinosas medias GABAérgicas localizadas en el núcleo caudado. Asociadas con esta degeneración, las neuronas de entrada glutaminérgicas corticales degeneran también, y la degeneración combinada da razón de la mayoría de los síntomas característicos de movimientos motores discinéticos progresivos, así como demencia.

En una forma de realización preferida, los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores de expresión, cápsulas y composiciones farmacéuticas de la invención se usan en el tratamiento de enfermedad de Huntington. Esto se basa en el hallazgo de alta expresión en el putamen, combinada con los resultados de los análisis de bioinformática y la actividad neuroprotectora/de neurogénesis de NsG33 (en particular el ejemplo 15, pero también los ejemplos 6 y 14). La enfermedad de Huntington es una enfermedad excitotóxica. Un bioensayo excitotóxico es el ensayo descrito en el ejemplo 12 de la presente invención. Otro ejemplo de bioensayo para la verificación de este efecto neuroprotector de NsG33 incluye, por ejemplo, el bioensayo sobre la protección de cultivos primarios de cortes de hipocampo contra los efectos excitotóxicos de NMDA (véase documento WO 03/004527, ejemplo 5).

En otra forma de realización preferida, los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores de expresión, cápsulas y composiciones farmacéuticas de la invención se usan en el tratamiento de neuropatías periféricas. Esto se basa en el hallazgo de alta expresión en el ganglio de la raíz dorsal, combinada con los resultados de los análisis de bioinformática y con la actividad neuroprotectora/de neurogénesis y el efecto antiapoptótico de NsG33 (ejemplos 6, 14 y 15). La verificación de esta función puede hacerse con el ensayo del cultivo del ganglio de la raíz dorsal descrito en el ejemplo 9. Entre las neuropatías periféricas contempladas para el tratamiento con las moléculas de esta invención, están neuropatías inducidas por traumatismo, por ejemplo, las causadas por lesión física o estado de enfermedad, daño físico a los nervios periféricos, tales como discos herniados y el cerebro, daño físico a la médula espinal, apoplejía asociada con daño cerebral, y trastornos neurológicos relacionados con neurodegeneración. También se contempla el tratamiento de neuropatías inducidas por quimioterapia (tales como las causadas por el suministro de agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, taxol o cisplatino); neuropatías inducidas por toxinas, neuropatías inducidas por fármacos, neuropatías inducidas por deficiencias de vitaminas, neuropatías idiopáticas y neuropatías diabéticas.

En otra forma de realización preferida, los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores de expresión, cápsulas y composiciones de la invención se usan en el tratamiento de trastornos, enfermedades o daños asociados con el cerebelo que incluyen, pero no están limitados a, ataxia sensitiva, esclerosis múltiple, trastornos espinocerebelares neurodegenerativos, ataxia hereditaria, atrofias cerebelares (tales como atrofia olivopontocerebelar (OPCA), síndrome de Shy-Drager (atrofia de sistemas múltiples)), y alcoholismo. Esta función está apoyada por los altos niveles de expresión en el cerebelo humano adulto y la expresión diferencial en el cerebelo de ratón en desarrollo, combinados con los análisis de bioinformática y la actividad neuroprotectora/de neurogénesis y el efecto antiapoptótico de NsG33 (ejemplos 6, 14 y 15). La verificación de esta función puede hacerse con los ensayos descritos en los ejemplos 7 y 8 (protección de células granulares cerebelares de la toxicidad del glutamato y la privación de potasio).

En otra forma de realización preferida, los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores de expresión, cápsulas y composiciones farmacéuticas de la invención se usan en el tratamiento de esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal y lesión de médula espinal (por ejemplo, isquémica o traumática). Esto se basa en el hallazgo de altos niveles de expresión en la médula espinal humana adulta y la expresión diferencial en la médula espinal de ratón en desarrollo, combinados con los resultados de los análisis de bioinformática y con la actividad neuroprotectora/de neurogénesis y el efecto antiapoptótico de NsG33 (ejemplos 6, 14 y 15). La verificación de esta función terapéutica específica, puede hacerse con el ensayo de neuronas motoras descrita en el ejemplo 10.

En una forma de realización preferida, los polipéptidos, ácidos nucleicos, vectores, cápsulas y composiciones de la invención se usan en el tratamiento de enfermedades, trastornos o daños que implican la retina e incluyen, pero no están limitados a, retinitis pigmentosa, degeneración macular y glaucoma. Este uso terapéutico específico está apoyado por los análisis experimentales y de bioinformática que muestran que NsG33 es un factor de crecimiento secretado altamente expresado en la retina (figura 4).

Otros factores de crecimiento tienen usos terapéuticos importantes en el sistema nervioso central y periférico, y en varias indicaciones oculares asociadas con pérdida de células en la retina y/o córnea. Por ejemplo, el NGF, es un candidato tanto para enfermedad de Alzheimer, úlcera corneal (US 6063757 y EP 0 973 872) como retinopatías. Neublastina (artemina) es un candidato tanto para neuropatía periférica (WO 02/078730) como cicatrización de herida corneal (EP 1 223 966). El GDNF es un candidato para enfermedad de Parkinson, ELA, lesión de médula espinal y/o cicatrización de heridas, en particular en córnea (EP 1 223 966).

La confirmación de dicho uso puede lograrse por el uso de varios ensayos in vitro del estado de la técnica (ensayos de explantes retinianos, cultivos de córnea). La verificación de la función puede lograrse también en modelos animales del estado de la técnica para heridas de córnea (lesión corneal en conejos) y retina (modelos de mutantes de retinitis pigmentosa disponibles para ratón y rata).

En otra forma de realización, la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad excitotóxica seleccionada del grupo que consiste en isquemia, epilepsia y traumatismo debido a lesión, paro cardiaco o apoplejía. Esta función está apoyada también por la actividad neuroprotectora/de neurogénesis y la actividad antiapoptótica de NsG33 (ejemplos 6, 14 y 15). El ensayo del cultivo de cortes de hipocampo mencionado anteriormente y el ensayo del ejemplo 7 de la presente invención son ejemplos no limitantes del ensayo, que puede usarse para demostrar un efecto biológico, indicativo de uso terapéutico para el tratamiento de enfermedades excitotóxicas.

Se considera que el término "sujeto", como se usa aquí, significa cualquier mamífero al que pueden administrarse polipéptidos o polinucleótidos NsG33, células terapéuticas o cápsulas biocompatibles. Los sujetos destinados específicamente para el tratamiento con el método de la invención incluyen seres humanos, así como primates no humanos, ovejas, caballos, ganado, cabras, cerdos, perros, gatos, conejos, conejillos de Indias, hámsteres, gerbos, ratas y ratones, así como los órganos, tumores y células que se derivan u originan de estos huéspedes.

V. Administración y formulaciones de polipéptidos

Un tejido objetivo para terapia con NsG33, es una región del cerebro que se selecciona por su capacidad de respuesta retenida a NsG33. En seres humanos, neuronas que retienen la capacidad de respuesta a factores de crecimiento en la edad adulta, incluyen las neuronas basales colinérgicas del prosencéfalo, las neuronas corticales entorrinales, las neuronas talámicas, las neuronas del locus coeruleus, las neuronas sensitivas espinales, las neuronas motoras espinales, neuronas de la sustancia negra, neuronas del simpático, ganglios de la raíz dorsal, neuronas de la retina, neuronas ópticas, neuronas cerebelares y ganglios ciliares. Las células madre, tales como las células madre de la zona subventricular, y células progenitoras neurales y gliales, retienen también la capacidad de respuesta a factores de crecimiento en la edad adulta. Asimismo, los oligodendrocitos mielinizantes retienen la capacidad de respuesta a factores de crecimiento en la edad adulta.

Los polipéptidos NsG33 pueden administrarse de cualquier manera que sea médicamente aceptable. Esto puede incluir inyecciones, por vías parenterales tales como intravenosa, intravascular, intraarterial, subcutánea, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal, intraventricular, intraepidural, intertraqueal, intratecal, intracerebroventricular, intercerebral, interpulmonar u otras, así como nasal, oftálmica, rectal o tópica. La administración de liberación sostenida se incluye también específicamente en la invención, por medios tales como inyecciones de depósito o implantes erosionables. La administración oral es también concebible, siempre que la proteína esté protegida contra la degradación en el estómago.

La administración de una NsG33 según esta invención, puede lograrse usando cualquier medio de administración adecuado, que incluye:

- bomba (véase, por ejemplo, Annals of Pharmacotherapy, 27: 912 (1993); Cancer 41: 1270 (1993); Cancer Research, 44: 1698 (1984),

- microencapsulación (véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos 4352883; 4353888; y 5084350);

- implantes de polímeros de liberación continua (véase, por ejemplo, Sabel, patente de los Estados Unidos
4883666);

- células encapsuladas (véase, sección X);

- injertos de células desnudas o no encapsuladas en el SNC (véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos 5082670 y 5618531);

- inyección, ya sea por vía subcutánea, intravenosa, intraarterial, intramuscular, o en otro sitio adecuado;

- inhalación; y

- administración oral, en cápsula, líquido, comprimido, píldora o formulación de liberación prolongada.

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La administración puede ser por inyecciones periódicas de un bolo de la preparación, o puede hacerse más continua mediante administración intravenosa o intraperitoneal de un depósito que sea externo (por ejemplo, una bolsa IV) o interno (por ejemplo, un implante bioerosionable, un órgano bioartificial, una cápsula biocompatible de células productoras de NsG33 o una colonia de células productoras de NsG33 implantadas). Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 4407957, 5798113 y 5800828. Se describen métodos y aparatos de suministro intrapulmonar, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. 5654007, 5780014 y 5814607.

Aparte de la administración sistémica, se contempla también la administración directamente al SNC o el ojo detrás de las barreras hematoencefálica o hematorretiniana.

La administración localizada puede ser por medios tales como administración a través de un catéter a una o más arterias, tales como la arteria oftálmica en el ojo, y la arteria cerebral en el SNC. Se describen métodos para el suministro local basado en bombas de formulaciones de proteína en el SNC, en el documento US 6042579 (Medtronic). Otro tipo de administración localizada comprende administración usando células encapsuladas (véase sección IX). Otro tipo de administración localizada comprende administración local de vectores de terapia génica, que se inyectan normalmente.

Para el tratamiento de trastornos oculares, la administración puede ser sistémica, o local tal como administración a través de la arteria oftálmica. En otra forma de realización, la administración es por medio de terapia con células encapsuladas, donde las células encapsuladas se implantan intravítreamente. La administración de formulaciones de proteína o vector de terapia génica puede hacerse usando inyecciones subretinianas, inyección intravítrea o inyección transesclerótica.

Para el tratamiento de enfermedad de Parkinson, pueden seguirse varias vías de administración. Pueden administrarse formulaciones de proteína con bombas por vía intracerebroventricular o intraparenquimática, de preferencia en el cuerpo estriado y/o la sustancia negra, más preferiblemente en el intraputamen. Sin embargo, un método de administración más preferido comprende terapia con células encapsuladas, donde las cápsulas se implantan intracerebroventricularmente o intraparenquimáticamente, de preferencia en el cuerpo estriado y/o la sustancia negra, y más preferiblemente en el putamen. En una forma de realización relacionada con el tratamiento de enfermedad de Parkinson, se administra un vector de terapia génica en el cuerpo estriado del cerebro. La inyección en el cuerpo estriado puede marcar sitios objetivo localizados en varias regiones distantes del cerebro, por ejemplo, el globo pálido, amígdala, núcleo subtalámico o la sustancia negra. La transducción de células en el cuerpo pálido causa comúnmente marcaje retrógrado de células
en el tálamo. En una forma de realización preferida, el (o uno de los) sitio(s) objetivo son la sustancia negra.

En una forma de realización para tratar la EH, se aplica NsG33 al cuerpo estriado, de preferencia el núcleo caudado para proteger a las neuronas de la degeneración, resultando tanto en protección de las neuronas del cuerpo caudado como las neuronas de entrada corticales. En una forma de realización preferida, la aplicación debe ocurrir antes del inicio de cambios degenerativos mayores. El tratamiento implicaría el diagnóstico genético de la enfermedad a través de la historia familiar y el análisis del ADN de la sangre, seguido de la aplicación local de NsG33. Esto se lograría mediante administración de NsG33 al cuerpo estriado por medio de bombeo de la proteína con el uso de bombas de infusión y catéteres médicamente aplicables, por ejemplo, la bomba Synchrotron de Medtronic. En una segunda estrategia, podría usarse terapia génica directa usando vectores virales o no virales para modificar las células huéspedes en el cuerpo estriado u otras neuronas afectadas que secretan NsG33. En una tercera estrategia, pueden aplicarse localmente células desnudas o encapsuladas genéticamente modificadas que producen y secretan NsG33 para administrar NsG33 detrás de la barrera hematoencefálica y dentro de la región enferma, de preferencia el cuerpo estriado, aún más preferiblemente, el núcleo caudado.

En ELA, tanto las neuronas motoras superiores como inferiores degeneran, causando parálisis progresiva, llevando finalmente a muerte, más comúnmente a través de complicaciones respiratorias. Para tratar ELA, se administraría NsG33 al SNC, incluyendo la médula espinal a través de la infusión de NsG33 en el espacio intratecal lumbar mezclándola de esta manera con el líquido cefalorraquídeo (LCR), que baña la médula espinal y el cerebro. La administración podría lograrse a través de la implantación de una bomba y catéteres, por ejemplo, la bomba Synchrotron de Medtronic, o a través del uso de dispositivos de células encapsuladas implantados en el espacio intratecal lumbar. Podría usarse también terapia génica directa inyectando vectores que tengan ADN en el LCR, transfiriendo de esta manera el gen a células que revisten el espacio del LCR. Además, pueden inyectarse vectores de transferencia de genes en la médula espinal cervical o lumbar o intracerebral, secretando de esta manera NsG33 en las regiones anatómicas que contienen la mayoría de las neuronas motoras implicadas en las parálisis motoras y la función respiratoria. Estas inyecciones ocurrirían con cirugía asistida por ordenador, y podrían realizarse relativamente con seguridad.

En sujetos con enfermedades neurodegenerativas tales como EA, las neuronas en la región Ch4 (núcleo basal de Meynert) que tienen receptores del factor de crecimiento nervioso (NGF) sufren atrofia marcada, en comparación con controles normales (véase, por ejemplo, Kobayashi, et al., Mol. Chem. Neuropathol., 15: 193-206 (1991)).

En sujetos normales, las neurotrofinas previenen la muerte de neuronas del simpático y sensitivas durante el desarrollo, y previenen la degeneración neuronal colinérgica en ratas y primates adultos (Tuszynski, et al., Gene Therapy, 3: 305314 (1996)). Se piensa que la pérdida resultante de neuronas funcionales en esta región del prosencéfalo basal, está unida causativamente a la decadencia cognoscitiva experimentada por sujetos que sufren afecciones neurodegenerativas tales como EA (Tuszynski, et al., citado anteriormente, y Lehericy, et al., J. Comp. Neurol., 330: 15-31 (1993)).

En general se contempla que puede tratarse la EA con formulaciones de proteína NsG33 administradas por vía intracerebroventricular o intraparenquimática. Dentro del área intraparenquimática, la administración es de preferencia en el prosencefálo basal y en el hipocampo.

Pueden administrarse también vector de terapia génica y células encapsuladas o desnudas que secreten NsG33 en el prosencéfalo basal o el hipocampo.

Para el tratamiento de lesión de médula espinal, pueden administrarse la proteína, el vector de terapia génica o las células encapsuladas o desnudas que secretan NsG33 por vía intratecal en el sitio de la lesión, como se describió anteriormente para el tratamiento de ELA.

Para el tratamiento de neuropatía periférica, la administración es sistémica (usando formulaciones de proteína), por vía intratecal usando formulaciones de proteína, vectores de terapia génica o células encapsuladas o desnudas que secretan NsG33, o por vía intramuscular, dependiendo del transporte retrógrado hacia la médula espinal.

Para el tratamiento de epilepsia, la proteína NsG33 podría administrarse por vía intraparenquimática en el foco de epilepsia. Esto puede hacerse con células encapsuladas o desnudas, con formulaciones de proteína administradas con catéter o bomba, o con un vector de terapia génica administrado en este sitio.

Para el tratamiento de apoplejía o traumatismo, la administración es intratecal, intracerebroventricular o de preferencia intralesional.

El término "vehículo farmacéuticamente aceptable", significa uno o más ingredientes orgánicos o inorgánicos, naturales o sintéticos, con que se combina el polipéptido NsG33 para facilitar su aplicación. Un vehículo adecuado incluye solución salina estéril, aunque otras soluciones estériles isotónicas acuosas y no acuosas y suspensiones estériles que se sabe son farmacéuticamente aceptables, son conocidas por los expertos en la materia. Una "cantidad eficaz", se refiere a esa cantidad que es capaz de mejorar o retardar la progresión de la condición enferma, degenerativa o dañada. Puede determinarse una cantidad eficaz en una base individual y se basará, en parte, considerando los síntomas que se van a tratar y los resultados buscados. Una cantidad eficaz puede ser determinada por los expertos en la materia usando tales factores, y usando no más que experimentación de rutina.

Un sistema de liposomas puede ser cualquier variedad de vesículas unilaminares, vesículas multilaminares o vesículas plurilaminares estables, y pueden prepararse y administrarse según métodos bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, según las enseñanzas de las patentes de los Estados Unidos 5169637, 4762915, 5000958 ó 5185154. Además, puede ser deseable expresar los polipéptidos novedosos de esta invención, así como otros polipéptidos seleccionados, como lipoproteínas, para mejorar su unión a liposomas. Una proteína NsG33 recombinante se purifica, por ejemplo, de células CHO, por cromatografía de inmunoafinidad o cualquier otro método conveniente, y se mezcla entonces con liposomas y se incorpora en ellos con alta eficacia. La proteína encapsulada en liposomas puede ensayarse in vitro para algún efecto sobre la estimulación del crecimiento celular.

Cualquiera de los polipéptidos NsG33 de esta invención puede usarse en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Ácidos y bases adecuados que son capaces de formar sales con un polipéptido NsG33 son bien conocidos por los expertos en la materia, e incluyen bases y ácidos orgánicos e inorgánicos.

Además de los principios activos, las composiciones farmacéuticas pueden comprender ingredientes adecuados. Pueden encontrarse más detalles sobre técnicas para formulación y administración en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA).

Se contemplan varias pautas de dosificación para administración sistémica. En una forma de realización, los métodos para administrar a un sujeto una formulación que comprenda un polipéptido NsG33, incluyen administrar NsG33 a una dosis entre 1 \mug/kg a 30.000 \mug/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En otra forma de realización, la dosificación está entre 10 \mug/kg a 30.000 \mug/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En otra forma de realización, la dosificación está entre 10 \mug/kg a 10.000 \mug/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En una forma de realización diferente, la dosificación está entre 25 \mug/kg a 10.000 \mug/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En aún otra forma de realización, la dosificación está entre 25 \mug/kg a 3,000 \mug/kg de peso corporal del sujeto, por dosis. En una forma de realización más preferible, la dosificación está entre 50 \mug/kg a 3.000 \mug/kg de peso corporal del sujeto, por dosis.

Se proporciona orientación para dosificaciones y métodos de administración particulares en la literatura; véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 4657760; 5206344; ó 5225212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán eficaces para diferentes compuestos de tratamiento y diferentes trastornos, que la administración que se dirige a un órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar de administración en una forma diferente de la de otro órgano o
tejido.

Donde se desee administración de liberación sostenida de un polipéptido NsG33 en una formulación con características de liberación adecuadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno que requiera la administración de un polipéptido NsG33, se contempla la microencapsulación de un polipéptido NsG33. Se ha realizado con éxito la microencapsulación de proteínas recombinantes para liberación sostenida, con hormona de crecimiento humano (rhGH), interferón-(rhIFN-), interleucina-2 y MN rgp120. Johnson et al., Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman, eds. (Plenum Press: Nueva York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; y la patente de EE.UU. No. 5654010.

Se desarrollaron formulaciones de liberación sostenida de estas proteínas, usando polímero de ácido poli-láctico-coglicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplia gama de propiedades biodegradables. Los productos de degradación de PLGA, ácidos láctico y glicólico, pueden depurarse rápidamente del cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero puede ajustarse de meses a años, dependiendo de su peso molecular y composición. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", en: M. Chasin y R. Langer (eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: Nueva York, 1990), pp. 1-41.

La dosis administrada debe ajustarse cuidadosamente a la edad, peso y estado del individuo que se esté tratando, así como la vía de administración, forma y pauta posológicas y el resultado deseado, y la dosificación exacta debe ser determinada por el médico general.

VI. Preparaciones farmacéuticas para terapia génica

Para formar una composición de NsG33 para uso en terapia génica en la invención, pueden colocarse vectores virales de expresión que codifiquen NsG33 en una suspensión, solución o emulsión farmacéuticamente aceptable. Los medios adecuados incluyen solución salina y preparaciones liposomales.

Más específicamente, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Vehículos acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, que incluyen solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, solución de Ringer con lactato o aceites no volátiles.

Los vehículos intravenosos incluyen regeneradores de fluidos y nutrientes, regeneradores de electrólitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares.

Pueden estar presentes también conservadores y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, y similares. Además, puede liofilizarse una composición de transgenes de NsG33 usando medios bien conocidos en la técnica, para reconstitución y uso subsiguientes según la invención.

Puede usarse también un sistema de dispersión coloidal para la administración dirigida de genes. Los sistemas de dispersión coloidales incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas, y liposomas. Los liposomas son vesículas de membrana artificiales que son útiles como vehículos de administración in vitro e in vivo. Se ha mostrado que vesículas unilaminares grandes (LUV), que varían en tamaño de 0,2-4,0 \mum, pueden encapsular un porcentaje sustancial de un tampón acuoso que contiene grandes macromoléculas. ARN, ADN y viriones intactos pueden encapsularse dentro del interior acuoso, y pueden administrarse a células en una forma biológicamente activa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6: 77, 1981). Además de células de mamífero, se han usado liposomas para la administración de transgenes codificantes operativamente en células de plantas, levaduras y bacterias. Para que un liposoma sea un vehículo de transferencia de genes eficaz, deben estar presentes las siguientes características: (1) encapsulación de los genes que codifican NsG33 con alta eficacia, sin que comprometan su actividad biológica; (2) unión preferencial y sustancial a una célula objetivo en comparación con células no objetivo; (3) distribución de los contenidos acuosos de la vesícula en el citoplasma de la célula objetivo con alta eficacia; y (4) expresión precisa y eficaz de información genética (Mannino, et al., Biotechniques, 6: 682, 1988).

La composición del liposoma es usualmente una combinación de fosfolípidos, en particular fosfolípidos de alta temperatura de transición de fase, usualmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. Pueden usarse también otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes.

Ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas, incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Particularmente útiles son los diacilfosfatidilgliceroles, donde el grupo lipídico contiene de 14-18 átomos de carbono, en particular de 16-18 átomos de carbono, y es saturada. Fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina.

El direccionamiento de los liposomas puede clasificarse basado en factores anatómicos y mecanicistas. La clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por ejemplo, específico de órganos, específico de células y específico de orgánulos. El direccionamiento mecanicista puede distinguirse basado en si es pasivo o activo. El direccionamiento pasivo usa la tendencia natural de los liposomas a distribuirse en las células del sistema reticuloendotelial (RES) en órganos que contienen capilares sinusoidales.

El direccionamiento activo, por otra parte, incluye la alteración del liposoma acoplando el liposoma a un ligando específico tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glicolípido o proteína, o cambiando la composición o el tamaño del liposoma para lograr el direccionamiento hacia órganos y tipos de células diferentes de los sitios de localización naturales.

La superficie del sistema de administración de genes dirigido, puede modificarse de varias formas. En el caso de un sistema de administración de liposomas dirigido, pueden incorporarse grupos de lípidos en la bicapa lipídica del liposoma, para mantener el ligando de direccionamiento en asociación estable con la bicapa liposomal. Pueden usarse varios grupos de enlace para unir las cadenas de lípidos al ligando de direccionamiento.

Otro ejemplo de un sistema de administración incluye el trasplante, en el área terapéutica, de una composición de células de empaquetamiento capaces de producir partículas del vector como se describe en la presente invención. Métodos para la encapsulación y el trasplante de dichas células son bien conocidos en la técnica, en particular del documento WO 97/44065 (citoterapéutica). Seleccioanado de una línea de células de empaquetamiento capaz de producir partículas lentivirales, se logra la transducción de células que no se dividen en el área terapéutica. Mediante el uso de partículas retrovirales capaces de transducir sólo células en división, la transducción se restringe a células diferenciadas de novo en el área terapéutica.

VII. Requisitos de dosificación y protocolo de administración para terapia génica

Un parámetro importante es la dosificación del vector de terapia génica de NsG33 que se administrará en el tejido objetivo. Para vectores virales, la concentración puede definirse por medio del número de unidades de transducción/ml. Óptimamente, para la administración usando un vector de expresión viral, cada unidad de dosificación comprenderá de 2,5 a 25 \muL de una composición, en donde la composición incluye un vector de expresión viral en un líquido farmacéuticamente aceptable, y proporciona de 10^{8} hasta 10^{10} unidades de transducción de NsG33 por ml.

De modo importante, se seleccionan sitios específicos de administración de genes in vivo, de modo que se agrupen en un área de pérdida, daño o disfunción de células neurales, células gliales, células retinianas, células sensitivas o células madre. Tales áreas pueden identificarse clínicamente usando muchas técnicas conocidas, que incluyen imágenes por resonancia magnética (MRI) y biopsia. En seres humanos, se preferirán métodos de imágenes in vivo no invasivos tales como MRI. Una vez que se identifican las áreas de pérdida neuronal, se seleccionan sitios de administración para distribución estereotáxica, de modo que cada unidad de dosificación de NsG33 se suministre en el cerebro a, o dentro de, 500 \mum de una célula diana, y no más de aproximadamente 10 mm de otro sitio de suministro.

Dentro de un sitio objetivo determinado, el sistema de vectores puede transducir una célula objetivo. La célula objetivo puede ser una célula presente en el tejido nervioso, tal como una neurona, astrocito, oligodendrocito, microglia, células madre, células precursoras neurales o células del epéndimo.

\newpage

El sistema de vectores se administra de preferencia por medio de inyección directa. Métodos para la inyección en el cerebro son bien conocidos en la técnica (Bilang-Bleuel et al. (1997) Proc. Acad. Natl. Sci. USA 94: 8818-8823; Choi-Lundberg et al (1998) Exp. Neurol. 154: 261-275; Choi-Lundberg et al (1997) Science 275: 838-841; y Mandel et al (1997) Proc. Acad. Natl. Sci. USA 94: 14083-14088). Pueden administrarse inyecciones estereotáxicas.

Como se mencionó anteriormente, para la transducción en tejidos tales como el cerebro, es necesario usar volúmenes muy pequeños, de modo que la preparación viral se concentra por medio de ultracentrifugación. La preparación resultante debe tener por lo menos 10^{8} u.t./ml, de preferencia de 10^{8} a 10^{10} u.t./ml, más preferiblemente por lo menos 10^{9} u.t./ml (el título se expresa en unidades de transducción por ml (u.t./ml), como se describe en el ejemplo 6). Se ha encontrado que puede lograrse dispersión mejorada de la expresión de transgenes aumentando el número de sitios de inyección, y disminuyendo la velocidad de inyección (Horellou y Mallet (1997) como anteriormente). Usualmente, se usan entre 1 y 10 sitios de inyección, más comúnmente entre 2 y 6. Para una dosis que comprende 1-5x10^{9} u.t./ml, la velocidad de inyección está comúnmente entre 0,1 y 10 \mul/min, usualmente aproximadamente 1 \mul/min.

La composición del virus se administra a cada sitio de administración de célula en el tejido objetivo, por medio de microinyección, infusión, carga por raspado ("scrape loading"), electroporación, u otros medios adecuados que administran directamente la composición directamente en el tejido del sitio de administración a través de una incisión quirúrgica. La administración se logra lentamente, tal como durante un período de aproximadamente 5-10 minutos (dependiendo del volumen total de composición del virus que se va a administrar).

VIII. Vectores virales

En general, la terapia génica busca transferir nuevo material genético a las células de un paciente con beneficio terapéutico resultante para el paciente. Dichos beneficios incluyen tratamiento o profilaxis de una amplia gama de enfermedades, trastornos y otras afecciones.

Los procedimientos de terapia génica ex vivo incluyen modificación de células aisladas (que incluyen, pero no están limitadas a, células madre, células precursoras neurales y gliales y células madre fetales), que después se infunden, injertan o de otra manera trasplantan, en el paciente. Véase, por ejemplo, las patentes de EU.UU. Nos. 4868116, 5399346 y 5460959. La terapia génica in vivo busca dirigirse a tejido del paciente huésped in vivo.

Virus útiles como vectores de transferencia de genes, incluyen papovavirus, adenovirus, virus de la vacuna, virus adenoasociados, virus de herpes y retrovirus. Retrovirus adecuados incluyen el grupo que consiste en VIH, SIV, FIV, EIAV y MoMLV. Un grupo adicional de retrovirus adecuados incluye el grupo que consiste en VIH, SIV, FIV, EIAV y CIV. Otro grupo de vectores virales preferidos incluye el grupo que consiste en alfavirus, adenovirus, virus adenoasociados, baculovirus, HSV, coronavirus, virus del papiloma bovino, Mo-MLV, de preferencia virus adenoasociados.

Virus preferidos para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central, son lentivirus y virus adenoasociados. Ambos tipos de virus pueden integrarse en el genoma sin divisiones celulares, y ambos tipos se han ensayado en estudios preclínicos en animales para indicaciones en el sistema nervioso, en particular en el sistema nervioso central.

Se describen métodos para la preparación de AAV en la técnica, por ejemplo, los documentos US 5677158, US 6309634 y US 6683058, que describen ejemplos de la administración de AAV al sistema nervioso central.

De preferencia, el vector de lentivirus es una partícula de lentivirus deficiente para replicación. Tal partícula de lentivirus puede producirse a partir de un vector lentiviral que comprende una LTR lentiviral 5', un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento, un promotor operativamente unido a una señal de polinucleótidos que codifica dicha proteína de fusión, un origen de síntesis de la segunda cadena de ADN, y una LTR lentiviral 3'. Se describen métodos para la preparación y administración in vivo de lentivirus a células neurales, en el documento US 20020037281 (métodos para transducir células neurales usando vectores lentivirales).

Los vectores retrovirales son los vectores que se usan más comúnmente en ensayos clínicos humanos, puesto que tienen 7-8 kb, y puesto que tienen la capacidad de infectar a células integrar su material genético establemente en la célula huésped con alta eficacia. Véase, por ejemplo, los documentos WO 95/30761 y WO 95/24929. Los Oncovirinae requieren por lo menos una ronda de proliferación en células objetivo, para la transferencia e integración de secuencias exógenas de ácido nucleico en el paciente. Los vectores retrovirales se integran aleatoriamente en el genoma del paciente. Pueden usarse retrovirus para dirigirse a células madre del sistema nervioso ya que tienen lugar pocas divisiones celulares en otras células del sistema nervioso (en particular el SNC).

Se han descrito tres clases de partículas retrovirales: ecotrópicas, que pueden infectar eficazmente células murinas, y anfotrópicas, que pueden infectar células de muchas especies. La tercera clase incluye a los retrovirus xenotróficos, que pueden infectar células de otra especie diferente de la especie que produjo el virus. Su capacidad para integrarse sólo en el genoma de las células en división, ha hecho a los retrovirus atractivos para marcar linajes de células en estudios de desarrollo, y para la administración de genes terapéuticos o suicidas a cánceres o tumores.

Para su uso en pacientes humanos, los vectores retrovirales deben ser deficientes en replicación. Esto previene más generación de partículas retrovirales infecciosas en el tejido objetivo - más bien, el vector deficiente en replicación llega a ser un transgén "cautivo" incorporado establemente en el genoma de la célula objetivo. Típicamente, en vectores deficientes en replicación, se han eliminado los genes gag, env y pol (junto con la mayor parte del resto del genoma viral). Se inserta el ADN heterólogo en lugar de los genes virales eliminados. Los genes heterólogos pueden estar bajo el control del promotor heterólogo endógeno, otro promotor heterólogo activo en la célula objetivo, o la LTR 5' retroviral (la LTR viral es activa en diversos tejidos). Típicamente, los vectores retrovirales tienen una capacidad de transgenes de aproximadamente 7-8 kb.

Los vectores retrovirales deficientes en replicación requieren el suministro en trans de las proteínas virales necesarias para la replicación y el ensamblaje a, por ejemplo, líneas de células de empaquetamiento manipuladas. Es importante que las células de empaquetamiento no liberen virus competentes en replicación y/o virus auxiliares. Esto se ha logrado expresando proteínas virales de moléculas de ARN que carecen de la señal \Psi, y expresando los genes gag/pol y el gen env de unidades de transcripción separadas. Además, en algunos retrovirus de 2ª y 3ª generación, las LTR 5' se han reemplazado con promotores no virales que controlan la expresión de estos genes, y el promotor 3' se ha reducido al mínimo para contener sólo el promotor proximal. Estos diseños reducen al mínimo la posibilidad de recombinación que lleva a la producción de vectores competentes en replicación, o virus auxiliares.

IX. Vectores de expresión

La construcción de vectores para expresión recombinante de polipéptidos NsG33 para su uso en la invención, puede lograrse usando técnicas convencionales que no requieren explicación detallada para los expertos en la materia. Sin embargo, para una revisión, los expertos en la materia pueden desear consultar Maniatis et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (NY 1982). Pueden usarse vectores de expresión para la generación de células productoras para la producción recombinante de polipéptidos NsG33 para uso médico, y para la generación de células terapéuticas que secretan polipéptidos NsG33 para terapia con células desnudas o encapsuladas.

Brevemente, la construcción de vectores de expresión recombinantes usa técnicas de ligación estándar. Para el análisis que confirma las secuencias correctas en vectores construidos, los genes se secuencian usando, por ejemplo, el método de Messing, et al. (Nucleic Acids Res., 9: 309, 1981), el método de Maxam, et al. (Methods in Enzymology, 65: 499, 1980), u otros métodos adecuados que son bien conocidos por los expertos en la materia.

La separación por tamaño de los fragmentos digeridos, se lleva a cabo usando electroforesis en gel convencional como se describe, por ejemplo, en Maniatis et al. (Molecular Cloning, pp. 133-134, 1982).

Para la generación de vectores de expresión eficaces, estos deben contener secuencias reguladoras necesarias para la expresión del gen codificado en el marco de lectura correcto. La expresión de un gen se controla a los niveles de transcripción, traducción o post-traducción. El inicio de la transcripción es un evento temprano y crítico en la expresión génica. Esto depende de las secuencias de promotor y potenciador, y está influido por factores celulares específicos que interaccionan con estas secuencias. La unidad de transcripción de muchos genes consiste en el promotor y, en algunos casos, en elementos potenciadores o reguladores (Banerji et al., Cell 27: 299 (1981); Corden et al., Science 209: 1406 (1980); y Breathnach y Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50: 349 (1981)). Para retrovirus, los elementos de control implicados en la replicación del genoma retroviral residen en la repetición terminal larga (LTR) (Weiss et al., eds., The molecular biology of tumor viruses: RNA tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory (NY 1982)). Las LTR del virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) y el virus del sarcoma de Rous (RSV), contienen secuencias de promotor y potenciador (Jolly et al., Nucleic Acids Res. 11: 1855 (1983); Capecchi et al., en: Enhancer and eukaryotic gene expression, Gulzman y Shenk, eds., pp. 101-102, Cold Spring Harbor Laboratories (NY 1991). Otros promotores potentes incluyen los derivados de citomegalovirus (CMV) y otros promotores virales de tipo silvestre.

Se han descrito también las regiones de promotor y potenciador de muchos promotores no virales (Schmidt et al., Nature 314: 285 (1985); Rossi y deCrombrugghe, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5590-5594 (1987)). Métodos para mantener e incrementar la expresión de transgenes en células quiescentes, incluyen el uso de promotores que incluyen los promotores de de colágeno de tipo I (1 y 2) (Prockop y Kivirikko, N. Eng. J. Med. 311: 376 (1984); Smith y Niles, Biochem. 19: 1820 (1980); de Wet et al., J. Biol. Chem. 258: 14385 (1983)), SV40 y de LTR.

Según una forma de realización de la invención, el promotor es un promotor constitutivo seleccionado del grupo que consiste en: promotor de ubiquitina, promotor del CMV, promotor JeT (US 6555674), promotor de SV40, promotor del factor de elongación 1-alfa (EF1-alfa), RSV y Mo-MLV-LTR. Ejemplos de promotores inducibles/reprimibles, incluyen: Tet-On, Tet-Off, promotor inducible por rapamicina y Mx1.

Un grupo de promotores preferidos incluye CMV, UbiC humano, JeT, RSV, promotor regulable por Tet, Mo-MLV-LTR, Mx1 y EF-1alfa.

Además del uso de promotores virales y no virales que dirigen la expresión de transgenes, puede usarse una secuencia de potenciador para incrementar el nivel de expresión del transgén. Los potenciadores pueden incrementar la actividad de transcripción no sólo de su gen nativo, sino también de algunos genes exógenos (Armelor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2702 (1973)). Por ejemplo, en la presente invención, pueden usarse secuencias de potenciador de colágeno con el promotor de colágeno 2 (I) para incrementar la expresión del transgén. Además, puede usarse el elemento potenciador presente en virus SV40 para incrementar la expresión del transgén. Esta secuencia de potenciador consiste en una repetición de 72 pares de bases, como se describe en Gruss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 943 (1981); Benoist y Chambon, Nature 290: 304 (1981) y Fromm y Berg, J. Mol. Appl. Genetics, 1: 457 (1982). Esta secuencia de repetición puede incrementar la transcripción de muchos genes virales y celulares diferentes, cuando está presente en serie con varios promotores (Moreau et al. Nucleic Acids Res. 9: 6047 (1981).

Secuencias adicionales que intensifican la expresión incluyen, pero no están limitadas a, elemento de regulación postranscripcional del virus de la hepatitis de Woodchuck, WPRE, SP163, potenciador del CMV, y aislador de [beta]-globina de pollo, y otros aisladores.

Puede incrementarse también la expresión del transgén para expresión estable a largo plazo, usando citocinas que modulan la actividad del promotor. Se han descrito varias citocinas que modulan la expresión del transgén de promotores de colágeno 2 (I) y LTR (Chua et al., connective Tissue Res., 25: 161-170 (1990); Elias et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 580: 233-244 (1990)); Seliger et al., J. Immunol. 141: 2138-2144 (1988) y Seliger et al., J. Virology 62: 619-621 (1988)). Por ejemplo, el factor de crecimiento transformante (TGF), la interleucina (IL)-I y el interferón (INF), disminuyen la expresión de transgenes dirigida por varios promotores tales como LTR. El factor de necrosis tumoral (TNF) y el TGF 1 aumentan, y pueden usarse para controlar, la expresión de transgenes dirigida por un promotor. Otras citocinas que pueden demostrar ser útiles, incluyen el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF).

Puede usarse también el promotor de colágeno con la secuencia de potenciador de colágeno (Coll (E)), para incrementar la expresión del transgén suprimiendo cualquier respuesta inmune al vector que pueda generarse en el cerebro tratado, sin importar su estado inmunoprotegido. Además, pueden administrarse agentes antiinflamatorios que incluyen esteroides, por ejemplo, dexametasona, al huésped tratado inmediatamente después de la administración de la composición de vector, y continuarse, de preferencia, hasta que disminuya toda respuesta inflamatoria mediada por citocinas. Puede administrarse también un agente de inmunosupresión tal como ciclosporina para reducir la producción de interferones, que disminuyen el promotor de LTR y el promotor-potenciador Coll (E) y reducen la expresión de transgenes.

El vector puede comprender otras secuencias tales como una secuencia que codifica para la proteína recombinasa Cre, y secuencias LoxP. Una forma adicional de asegurar la expresión temporal de NsG33, es por medio del uso del sistema Cre-LoxP que produce la escisión de parte de la secuencia de ADN insertada tras la administración de la recombinasa Cre a las células (Daewoong et al, Nature Biotechnology 19: 929-933), o incorporando un gen que codifica la recombinasa en la construcción del virus (Plück, Int J Exp Path, 77: 269-278). La incorporación de un gen para la recombinasa en la construcción del virus junto con los sitios LoxP y un gen estructural (una NsG33 en el presente caso), resulta con frecuencia en la expresión del gen estructural durante un período de aproximadamente cinco días.

X. Cápsulas biocompatibles

Se puede administrar NsG33 al sistema nervioso usando cápsulas biocompatibles como se describe aquí. La terapia con células encapsuladas se basa en el concepto de aislar células del sistema inmune del huésped receptor, rodeando las células con un material biocompatible semipermeable antes de la implantación en el huésped. La invención incluye un dispositivo en el que se encapsulan células que secretan NsG33 en una cápsula inmunoaisladora. Una "cápsula inmunoaisladora" significa que la cápsula, tras implantación en un huésped receptor, reduce al mínimo los efectos deletéreos del sistema inmune del huésped sobre las células en el núcleo del dispositivo. Las células se inmunoaislan del huésped encerrándolas dentro de cápsulas poliméricas implantables formadas por una membrana microporosa. Este procedimiento previene el contacto célula a célula entre los tejidos del huésped y los implantados, eliminando el reconocimiento del antígeno a través de la presentación directa. Las membranas usadas pueden adaptarse también para controlar la difusión de moléculas, tales como anticuerpo y complemento, basado en su peso molecular (Lysaght et al., 56 J. Cell Biochem. 196 (1996), Colton, 14 Trends Biotechnol. 158 (1996)). Mediante el uso de técnicas de encapsulación, las células se pueden trasplantar en un huésped sin rechazo inmune, ya sea con o sin el uso de fármacos inmunosupresores. Las cápsulas de polímeros biocompatibles útiles contienen usualmente un núcleo que contiene células, ya sea suspendidas en un medio líquido o inmovilizadas en una matriz de inmovilización, y una región circundante o periférica de matriz o membrana permoselectiva ("cubierta") que no contiene células aisladas, que es biocompatible, y que es suficiente para proteger las células en el núcleo del ataque inmunológico perjudicial. La encapsulación impide que los elementos del sistema inmune entren a la cápsula, protegiendo de esta manera las células encapsuladas de la destrucción inmune. La naturaleza semipermeable de la membrana de la cápsula, permite también que la molécula biológicamente activa de interés difunda fácilmente desde la cápsula en el tejido circundante del huésped.

La cápsula puede hacerse de un material biocompatible. Un "material biocompatible" es un material que, después de la implantación en un huésped, no induce una respuesta perjudicial del huésped suficiente para dar como resultado el rechazo de la cápsula o hacerla inoperable, por ejemplo, a través de degradación. El material biocompatible es relativamente impermeable a grandes moléculas, tales como componentes del sistema inmune del huésped, pero es permeable a pequeñas moléculas, tales como insulina, factores de crecimiento tales como polipéptidos NsG33 y nutrientes, mientras que permite que se eliminen los desechos metabólicos. Varios materiales biocompatibles son adecuados para la administración de factores de crecimiento por la composición de la invención. Se conocen numerosos materiales biocompatibles, que tienen varias morfologías de la superficie exterior y otras características mecánicas y estructurales. De preferencia, la cápsula de esta invención será similar a las descritas en los documentos WO 92/19195 ó WO 95/05452; o las patentes de EE.UU. Nos. 5639275; 5653975; 4892538; 5156844; 5283187; o la patente de EE.UU. No. 5550050. Tales cápsulas permiten el paso de metabolitos, nutrientes y sustancias terapéuticas, mientras que reducen al mínimo los efectos perjudiciales del sistema inmune del huésped. Los componentes del material biocompatible pueden incluir una membrana semipermeable circundante y el andamiaje interno que sostiene a las células. De preferencia, las células alteradas genéticamente se siembran sobre el andamiaje, que está encapsulado por la membrana permoselectiva. El andamiaje filamentoso que sostiene a las células puede hacerse de cualquier material biocompatible seleccionado del grupo que consiste en acrílico, poliéster, polietileno, polipropileno, poliacetonitrilo, tereftalato de polietileno, nylon, poliamidas, poliuretanos, éster de polibutilo, seda, algodón, quitina, carbono, o metales biocompatibles. Asimismo, pueden usarse estructuras de fibras aglutinadas para implantación de células (patente de EE.UU. No. 5512600). Polímeros biodegradables incluyen los que comprenden ácido poli(láctico) PLA, ácido poli(láctico-co-glicólico) PLGA y ácido poli(glicólico) PGA, y sus equivalentes. Se han usado andamiajes de espuma para proporcionar superficies sobre las que pueden adherirse las células trasplantadas (WO 98/05304). Se han usado tubos de malla tejida como injertos vasculares (WO 99/52573). Además, el núcleo puede formarse de una matriz de inmovilización formada de un hidrogel, que estabiliza la posición de las células. Un hidrogel es una red tridimensional de polímeros hidrofílicos entrelazados en la forma de un gel, formado sustancialmente de agua.

Pueden usarse varios polímeros y combinaciones de polímeros para fabricar la membrana semipermeable circundante, incluyendo poliacrilatos (que incluyen copolímeros de acrílico), polivinilidenos, copolímeros de cloruro de polivinilo, poliuretanos, poliestirenos, poliamidas, acetatos de celulosa, nitratos de celulosa, polisulfonas (que incluyen poliéter sulfonas), polifosfazenos, poliacrilonitrilos, poli(acrilonitrilo/co-cloruro de vinilo), así como derivados, copolímeros y mezclas de los mismos. De preferencia, la membrana semipermeable circundante es una membrana de fibras huecas semipermeable biocompatible. Tales membranas, y métodos para fabricarlas, se describen en las patentes de EE.UU. Nos. 5284761 y 5158881. La membrana semipermeable circundante se forma de una fibra hueca de poliéter sulfona, tales como las descritas en las patentes de EE.UU. No. 4976859 ó 4968733. Un material alternativo de la membrana semipermeable circundante, es poli(acrilonitrilo/co-cloruro de vinilo).

La cápsula puede tener cualquier configuración adecuada para mantener actividad biológica y proporcionar acceso para la administración del producto o función incluyendo, por ejemplo, cilíndrica, rectangular, en forma de disco, en forma de parche, ovoide, estrellada o esférica. Además, la cápsula puede estar enrollada o envuelta en una estructura de tipo malla o anidada. Si la cápsula se va a recuperar después de que sea implantada, no se prefieren configuraciones que tiendan a producir la migración de las cápsulas desde el sitio de implantación, tales como cápsulas esféricas lo bastante pequeñas para viajar en los vasos sanguíneos del huésped receptor. Ciertas formas, tales como rectángulos, parches, discos, cilindros y hojas planas ofrecen mayor integridad estructural, y se prefieren donde se desee recuperación.

Cuando se usan macrocápsulas, se encapsulan de preferencia entre 10^{3} y 10^{8} células, lo más preferiblemente se encapsulan de 10^{5} a 10^{7} células en cada dispositivo. La dosificación puede controlarse implantando un número mayor o menor de cápsulas, de preferencia entre 1 y 10 cápsulas por paciente.

El andamiaje puede recubrirse con moléculas de la matriz extracelular (ECM). Ejemplos adecuados de moléculas de la matriz extracelular incluyen, por ejemplo, colágeno, laminina y fibronectina. La superficie del andamiaje puede modificarse también por medio de tratamiento con irradiación de plasma que imparte carga para mejorar la adhesión de las células.

Puede usarse cualquier método adecuado para sellar las cápsulas, incluyendo el uso de adhesivos de polímero o corrugado, anudamiento y termosellado. Además, puede usarse también cualquier método de sellado "en seco" adecuado tal como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. No. 5653687.

Los dispositivos de células encapsuladas se implantan según técnicas conocidas. Se contemplan muchos sitios de implantación para los dispositivos y métodos de esta invención. Estos sitios de implantación incluyen, pero no están limitados a, el sistema nervioso central, que incluye el cerebro, la médula espinal (véase las patentes de EE.UU. Nos. 5106627, 5156844 y 5554148), y los humores acuoso y vítreo del ojo (véase el documento WO 97/34586).

Se describen métodos y aparatos para la implantación de cápsulas en el SNC, en el documento US 5487739. Se describen métodos y aparatos para la implantación de cápsulas en el ojo, en los documentos US 5904144, US 6299895, US 6439427 y US 20030031700.

En un aspecto, la invención se refiere a una cápsula biocompatible que comprende: un núcleo que comprende células de empaquetamiento vivas que secretan un vector viral para infección de una célula objetivo, en donde el vector viral es un vector según la invención; y una cubierta externa que rodea a dicho núcleo, comprendiendo dicha cubierta un material biocompatible permeable, teniendo dicho material una porosidad seleccionada que permita el paso de vectores retrovirales de aproximadamente 100 nm de diámetro a través, permitiendo la liberación de dicho vector viral desde dicha cápsula.

De preferencia, el núcleo comprende además una matriz, estando inmovilizadas las células de empaquetamiento por la matriz. Según una forma de realización, la cubierta comprende un hidrogel o material termoplástico.

Ejemplos de células adecuadas para líneas de células de empaquetamiento, incluyen células HEK293, NIH3T3, PG13 y ARPE-19. Células preferidas incluyen células PG13 y 3T3.

Las líneas de células de empaquetamiento pueden encapsularse y administrarse usando los métodos y las composiciones que se describen en los documentos US 6027721 y WO 97/01357.

XI. Matriz soporte para células productoras de NsG33

La presente invención comprende además el cultivo de células productoras de NsG33 in vitro, sobre una matriz soporte antes de la implantación en el sistema nervioso de mamífero. La preadhesión de células a microvehículos antes de la implantación, está diseñada para intensificar la viabilidad a largo plazo de las células trasplantadas y proporcionar beneficio funcional a largo plazo.

Para aumentar la viabilidad a largo plazo de las células trasplantadas, es decir, células trasplantadas que secretan NsG33, las células que serán trasplantadas pueden unirse in vitro a una matriz soporte antes del trasplante. Materiales que puede comprender la matriz soporte, incluyen aquellos materiales a los que se adhieren las células después de incubación in vitro, y sobre los que las células pueden crecer, y que pueden ser implantados en el cuerpo del mamífero sin producir una reacción tóxica o una reacción inflamatoria que destruiría las células implantadas o de otra manera interferiría con su actividad biológica o terapéutica. Tales materiales pueden ser sustancias químicas sintéticas o naturales, o sustancias que tengan un origen biológico.

Los materiales de la matriz incluyen, pero no están limitados a, vidrio y otros óxidos de silicio, poliestireno, polipropileno, polietileno, fluoruro de polivinilideno, poliuretano, polialginato, polisulfona, alcohol polivinílico, polímeros de acrilonitrilo, poliacrilamida, policarbonato, polipentent, nylon, amilasas, gelatina natural y modificada y colágeno natural y modificado, polisacáridos naturales y modificados, incluyendo dextrano y celulosas (por ejemplo, nitrocelulosa), agar y magnetita. Pueden usarse materiales resorbibles o no resorbibles. Se proponen también materiales de matriz extracelular, que son bien conocidos en la técnica. Los materiales de matriz extracelular pueden obtenerse comercialmente, o pueden prepararse haciendo crecer células que secreten dicha matriz, eliminando las células secretoras, y permitiendo que las células que serán trasplantadas interaccionen con la matriz y se adhieran a la misma. El material de la matriz sobre el que crecen las células que serán implantadas, o con el que se mezclan las células, puede ser un producto nativo de células RPE. De esta manera, por ejemplo, el material de la matriz puede ser matriz extracelular o material de la membrana basal, que se produce y secreta por células RPE que serán implantadas.

Para mejorar la adhesión, supervivencia y función de las células, la matriz sólida puede recubrirse opcionalmente en su superficie externa con factores que se sabe en la técnica que promueven la adhesión, el crecimiento o la supervivencia de las células. Tales factores incluyen moléculas de adhesión celular, matriz extracelular tales como, por ejemplo, fibronectina, laminina, colágeno, elastina, glucosaminoglicanos o proteoglicanos, o factores de crecimiento.

De forma alternativa, si la matriz sólida a la que se unen las células implantadas se construye de material poroso, el factor o los factores que promueven el crecimiento o la supervivencia pueden incorporarse en el material de la matriz, a partir del que se liberarían lentamente después de la implantación in vivo.

Cuando se unen al soporte según la presente invención, las células usadas para el trasplante están en general sobre la "superficie exterior" del soporte. El soporte puede ser sólido o poroso. Sin embargo, aún en un soporte poroso, las células están en contacto directo con el medio externo sin una membrana intermedia u otra barrera. De esta manera, según la presente invención, se considera que las células están sobre la "superficie exterior" del soporte, aún cuando la superficie a la que se adhieren puede estar en la forma de pliegues o circunvoluciones internos del material de soporte poroso, que no están en el exterior de la partícula o perla misma.

La configuración del soporte es de preferencia esférica, como en una perla, pero puede ser cilíndrica, elíptica, una hoja plana o tira, en forma de una aguja u horquilla, y similares. Una forma preferida de la matriz soporte es una perla de vidrio. Otra perla preferida es una perla de poliestireno.

El tamaño de las perlas puede variar de aproximadamente 10 \mum a 1 mm de diámetro, de preferencia de aproximadamente 90 \mum a aproximadamente 150 \mum. Para una descripción de varias perlas de microvehículo véase, por ejemplo, Isher Biotech Source 87-88, Fisher Scientific Co., 1987, pp. 72-75; Sigma Cell Culture Catalog, Sigma Chemical Co., St., Louis, 1991, pp. 162-163; Ventrex Product Catalog, Ventrex Laboratories, 1989. El límite superior del tamaño de la perla puede estar determinado por la estimulación de la perla de reacciones no deseadas en el huésped, que pueden interferir con la función de las células trasplantadas o causar daño al tejido circundante. El límite superior del tamaño de la perla puede estar determinado también por el método de administración. Tales limitaciones son fácilmente determinables por los expertos en la materia.

XII. Células huésped

En un aspecto, la invención se refiere a células huésped aisladas y modificadas genéticamente con el vector según la invención.

Según una forma de realización, las células huésped son células procariotas tales como E. coli, que son capaces de producir proteína recombinante en grandes cantidades, y que pueden producirse fácilmente a escala industrial. El uso de células productoras procariotas puede requerir replegamiento y glicosilación de NsG33 para obtener una proteína biológicamente activa. En otra forma de realización, las células huésped son células productoras eucariotas no de mamíferos que incluyen, pero no están limitadas a, células productoras conocidas tales como levadura (Saccharomyces cerevisiae), hongos filamentosos tales como Aspergillus, y células de insecto tales como Sf9.

Según otra forma de realización, las células son de preferencia células huésped de mamífero, porque estas células son capaces de secretar y procesar correctamente la NsG33 codificada. Especies preferidas incluyen el grupo que consiste en humano, felino, porcino, simio, canino, murino, rata, conejo, ratón y hámster.

Ejemplos de cultivos primarios y líneas celulares que son buenos candidatos para transducción o transfección con los vectores de la presente invención, incluyen el grupo que consiste en células CHO, CHO-K1, HEI193T, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b, células neuronales, células fetales, ARPE-19, C2C12, HeLa, HepG2, células del cuerpo estriado, neuronas, astrocitos e interneuronas. Líneas celulares preferidas para producción recombinante en mamíferos, incluyen células CHO, CHO-1, HEI193T, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b y BHK.

Para terapia génica ex vivo, el grupo preferido de células incluye células neuronales, células precursoras neuronales, células progenitoras neuronales, células madre y células fetales.

La invención se refiere también a células adecuadas para bioadministración de NsG33 a través de células desnudas o encapsuladas, que están modificadas genéticamente para sobreexpresar NsG33, y que se pueden trasplantar al paciente para administrar localmente polipéptido NsG33 bioactivo. Tales células se pueden denominar ampliamente como células terapéuticas.

En una forma de realización preferida de la invención, no se ha inmortalizado una línea de células terapéutica con la inserción de un gen de inmortalización heterólogo. Puesto que la invención se refiere a células que son particularmente adecuadas para el trasplante de células, ya sea como células desnudas o de preferencia como células encapsuladas, dichas líneas de células inmortalizadas son menos preferidas, ya que existe un riesgo inherente de que comiencen a proliferar de forma incontrolada dentro del cuerpo humano, y formen potencialmente tumores.

De preferencia, la línea celular es una línea celular inhibida por contacto. Por una línea celular inhibida por contacto, se pretende indicar una línea de células que cuando crece en cultivos bidimensionales, crece hasta confluencia, y entonces sustancialmente deja de dividirse. Esto no excluye la posibilidad de que un número limitado de células escape de la capa bidimensional. Las células inhibidas por contacto pueden crecer también en un entorno tridimensional, por ejemplo, dentro de una cápsula. También dentro de las cápsulas, las células crecen hasta confluencia, y entonces retrasan significativamente su velocidad de proliferación, o dejan de dividirse completamente. Un tipo de células particularmente preferido, incluye células epiteliales que por su naturaleza se inhiben por contacto, y que forman monocapas estables en cultivo.

Aún más preferidas, son las células epiteliales pigmentarias retinianas (células RPE). La fuente de células RPE es mediante aislamiento de células primarias de la retina de mamíferos. Los protocolos para recoger células RPE, están bien definidos (Li y Turner, 1988, Exp. Eye Res. 47: 911-917; López et al., 1989, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30: 586-588), y se consideran una metodología de rutina. En la mayoría de los informes publicados de co-trasplante de células RPE, las células derivan de la rata (Li y Turner, 1988; López et al., 1989). Según la presente invención, las células RPE derivan de seres humanos. Además de células RPE primarias aisladas, pueden usarse líneas de células RPE humanas cultivadas en la práctica de la invención.

Para la encapsulación, las células necesitan ser capaces de sobrevivir y mantener una secreción de NsG33 funcional a los bajos niveles de tensión de oxígeno del SNC. De preferencia, la línea de células de la invención es capaz de sobrevivir a una tensión de oxígeno menor del 5%, más preferiblemente menor del 2%, más preferiblemente menor del 1%. Una tensión de oxígeno del 1% corresponde aproximadamente al nivel de oxígeno en el cerebro.

Para ser una línea celular de plataforma para un sistema de administración basado en células encapsuladas, la línea celular debe tener el mayor número posible de las siguientes características: (1) las células deben ser resistentes en condiciones severas (las células encapsuladas deben ser funcionales en cavidades de los tejidos vasculares y avasculares, tales como en el sistema nervioso central intraparenquimáticamente, o dentro de los espacios de fluido ventriculares o intratecales o el ojo, especialmente en el ambiente intraocular). (2) Las células deben ser capaces de ser modificadas genéticamente para expresar NsG33. (3) Las células deben tener una duración de vida relativamente larga (las células deben producir suficiente progenie para ser depositadas en un banco, caracterizadas, manipuladas, ensayadas con seguridad y fabricadas en lotes clínicos). (4) Las células deben ser de origen humano (que aumenta la compatibilidad entre las células encapsuladas y el huésped). (5) Las células deben exhibir más del 80% de viabilidad durante un período mayor de un mes in vivo en el dispositivo (que asegura la administración a largo plazo). (6) Las células encapsuladas deben administrar una cantidad eficaz de NsG33 (que asegure eficacia del tratamiento). (7) Cuando están encapsuladas, las células no deben causar una reacción inmune significativa en el huésped (que asegura la longevidad del injerto). (8) Las células no deben ser tumorígenas (para proporcionar seguridad añadida al huésped, en caso de fuga del dispositivo).

Para la encapsulación, las células preferidas incluyen células epiteliales pigmentadas retinianas, que incluyen células ARPE-19; fibroblastos humanos inmortalizados; y astrocitos humanos inmortalizados.

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La línea de células ARPE-19 es una línea de células de plataforma superior para la tecnología de administración basada en células encapsuladas, y es también útil para la tecnología de administración basada en células no encapsuladas. La línea de células ARPE-19 es resistente (es decir, la línea de células es viable en condiciones severas, tal como implantación en el sistema nervioso central o el ambiente intraocular). Las células ARPE-19 pueden ser modificadas genéticamente para que secreten una sustancia de interés terapéutico. Las células ARPE-19 tienen una vida relativamente larga. Las células ARPE-19 son de origen humano. Además, las células ARPE-19 encapsuladas tienen buena viabilidad en el dispositivo in vivo. Las células ARPE-19 pueden administrar una cantidad eficaz de factor de crecimiento. Las células ARPE-19 inducen una reacción inmune despreciable en el huésped. Además, las células ARPE-19 no son tumorígenas. Se describen métodos para el cultivo y la encapsulación de células ARPE-19 en el documento US 6361771.

En otra forma de realización, la línea de células terapéutica se selecciona del grupo que consiste en: líneas celulares de fibroblastos humanos, líneas celulares de astrocitos humanos, línea de células mesencefálicas humanas, y línea de células endoteliales humanas, de preferencia inmortalizadas con TERT, SV40T o vmyc.

El método para la generación de líneas celulares de astrocitos humanos inmortalizados, se ha descrito previamente (Price TN, Burke JF, Mayne LV. A novel human astrocyte cell line (A735) with astrocyte-specific neurotransmitter function. in vitro Cell Dev Biol Anim. Mayo 1999; 35(5): 279-88). Este protocolo puede usarse para generar líneas celulares de astrocitos.

Las tres modificaciones siguientes de ese protocolo, se hacen de preferencia para generar otras líneas celulares de astrocitos humanos.

Puede usarse tejido de cerebro fetal humano disecado, de fetos de 5 a 12 semanas, en lugar de tejido de 12 a 16 semanas.

Puede usarse el gen de inmortalización v-myc, o TERT (telomerasa) en lugar del antígeno T de SV40.

Puede usarse la transferencia de genes retrovirales en lugar de la transfección con plásmidos, mediante la técnica de precipitación con fosfato de calcio. Estos métodos no incluyen el uso de embriones humanos para fines industriales o comerciales.

XIII. Producción recombinante y purificación de polipéptidos NsG33 de la invención

Los polipéptidos NsG33 de la invención pueden producirse usando sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos del estado de la técnica. Se describen métodos ejemplares en el documento WO 93/22437 (Innogenetics). Debido a la similitud estructural entre los polipéptidos NsG33 y los polipéptidos descritos en el documento WO 93/22437, se contempla que puedan producirse polipéptidos NsG33 usando los métodos de producción descritos en esta publicación. Los protocolos descritos en el documento WO 93/22437 describen la purificación de una proteína que tiene un peso molecular predicho de 29 kDa. En el caso de la expresión de fragmentos de NsG33, que pueden ser considerablemente más cortos debido a la posible digestión del propéptido, deben modificarse los protocolos para tomar en cuenta la diferencia en peso molecular.

Estos ejemplos incluyen expresión en E. coli (ejemplo 5 del documento WO 93/22437), expresión en células COS1 (ejemplo 6 del documento WO 93/22437), expresión en un sistema de expresión de baculovirus (ejemplo 7 del documento WO 93/22437) y expresión en un sistema de virus de la vacuna (ejemplo 8 del documento WO 93/22437). Cada uno de los sistemas de expresión referidos produjo la expresión de cantidades significativas de los polipéptidos descritos en el documento WO 93/22437.

La purificación de las proteínas NsG33 puede realizarse usando el método de purificación descrito en el documento WO 93/22437. Brevemente, se recoge medio condicionado de células COS1 transfectadas con el ADNc de la invención después de 48 horas, y se filtra sobre un filtro de 0.22 \mum para eliminar los restos de células. Una purificación típica comienza de 600 a 1000 ml de medio de transfección de células COS1. A esto se añaden MgCl_{2} y sulfato de dextrano 500.000 (Pharmacia, Uppsala, Suecia), hasta una concentración final de 60 mM y 0,02%, respectivamente. Después de 1 hora de incubación a 4ºC, el precipitado se precipita mediante centrifugación (12.000 g, 30 min., 4ºC). La fracción de sobrenadante, que contiene la NsG33, se dializa contra Hepes 50 mM, pH 7,0, EDTA 4 mM, se ajusta a pH 8,0, y se carga a una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto en una columna de 4 ml de agarosa-fenilboronato (PBA 30, Amicon, MA, USA) equilibrada en Hepes 50 mM, pH 8,5. La NsG33 se eluye de la matriz con sorbitol 100 mM.

El pico eluido del sorbitol se hace pasar entonces a una velocidad de flujo de 0,5 ml/minuto sobre una columna de intercambio iónico FPLC Mono Q de 1 ml (Pharmacia) equilibrada en Hepes pH 8,5 y se eluye con un gradiente lineal de sal de NaCl de 0 a 1 M a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto.

El eluato se concentra aproximadamente 40 veces por medio de Centricon 10.000 (Amicon), y se carga por lotes (3 veces 0,25 ml) sobre una columna de filtración en gel SMART Superdex 75 (Pharmacia) equilibrada contra PBS. Este protocolo puede producir elución de proteína de alta pureza.

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Pueden usarse también otros protocolos de purificación de proteínas del estado de la técnica, para proporcionar proteína bastante pura para realizar las pruebas in vitro e in vivo descritas en los ejemplos.

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XIV. Usos de NsG33 in vitro

Pueden usarse polipéptidos NsG33 y/o polinucleótidos que codifiquen NsG33 como factores de crecimiento o factores tróficos in vitro. Este uso se basa en el hallazgo de que NsG33 es una proteína secretada con rasgos estructurales de un factor de crecimiento u hormona, y en el hallazgo por los presentes inventores de que NsG33 causa la generación y/o supervivencia de neuronas, y/o la proliferación de precursores neurales en varios ensayos in vitro. El efecto neuroprotector y/o de neurogénesis se ha encontrado en una línea de células precursoras neurales (hNS1) y en un cultivo primario (cultivo estriatal de rata). Además, se ha encontrado un efecto antiapoptótico en una línea de células con potencial neuronal (PC12).

Puede administrarse NsG33 al cultivo como una composición de proteína, o las células pueden transducir o transfectar con ADNc que codifique NsG33. Si NsG33 sería efectiva en el tratamiento de un tipo particular de célula o tejido, se puede determinar fácilmente por los expertos en la materia usando cualquiera de una variedad de ensayos conocidos en la técnica. Por ejemplo, con respecto a proporcionar soporte trófico para las células, los factores tróficos pueden producir efectos bioquímicos y morfológicos beneficiosos y, en algunas circunstancias, pueden promover la supervivencia celular. Con respecto a neuronas, se sabe en la técnica que la privación del soporte trófico a una neurona puede producir una disminución en la actividad metabólica, es decir, absorción de glucosa, síntesis de ARN y síntesis de proteínas, requeridas para el funcionamiento y crecimiento normales. Deckwerth y Johnson, J. Cell Biol. 123: 1207-1222, 1993. La eliminación del soporte trófico puede resultar también en una reducción en tamaño del cuerpo celular de la neurona. Quizá como una consecuencia de la pérdida de los efectos metabólicos de los factores tróficos, la privación de factores tróficos puede resultar en una disminución o cese del crecimiento de extensiones, y puede resultar en retracción de extensiones neuronales. Además del requerimiento del factor trófico para estos aspectos de la biología neuronal, la neurona puede requerir el factor neurotrófico para mantener su supervivencia; de esta manera, los ensayos de supervivencia son un medio que se usa con frecuencia para detectar o cuantificar las acciones de un factor neurotrófico. Sin embargo, el soporte trófico puede manifestarse también como cambios morfológicos, bioquímicos y funcionales, independientes del número de neuronas o cualquier efecto sobre la supervivencia.

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Ejemplos Ejemplo 1 Secuencias de NsG33

SEQ ID No. 1, secuencia genómica de NsG33 humano con 100 pares de bases extra añadidos en los extremos de 5' y 3'.

SEQ ID No. 2, ADNc de NsG33 humano.

SEQ ID No. 3, secuencia de aminoácidos de longitud completa de NsG33 humano.

SEQ ID No. 4, proteína NsG33 humana sin péptido señal.

SEQ ID No. 5, polipéptido C-terminal de NsG33 humano.

SEQ ID No. 6, secuencia genómica de NsG33 de ratón con 100 pares de bases extra añadidos en los extremos de 5' y 3'.

SEQ ID No. 7, ADNc parcial de NsG33 de ratón.

SEQ ID No. 8, secuencia de aminoácidos parcial de NsG33 de ratón.

SEQ ID No. 9, proteína NsG33 de ratón sin péptido señal.

SEQ ID No. 10, polipéptido C-terminal de NsG33 de ratón.

SEQ ID No. 11, secuencia genómica de NsG33 de rata con 100 pares de bases extra añadidos en los extremos de 5' y 3'.

SEQ ID No. 12, ADNc de NsG33 de rata.

SEQ ID No. 13, secuencia de aminoácidos de longitud completa de NsG33 de rata.

SEQ ID No. 14, proteína NsG33 de rata sin péptido señal.

SEQ ID No. 15, polipéptido C-terminal de NsG33 de rata.

SEQ ID No. 16, secuencia de nucleótidos que codifica el péptido C-terminal de NsG33 humano.

SEQ ID No. 17, secuencia de nucleótidos que codifica el péptido C-terminal de NsG33 de ratón.

SEQ ID No. 18, secuencia de nucleótidos que codifica el péptido C-terminal de NsG33 de rata.

SEQ ID No. 19, péptido N-terminal humano.

SEQ ID No. 20, péptido N-terminal de ratón.

SEQ ID No. 21, péptido N-terminal de rata.

SEQ ID No. 22, péptido N-terminal humano.

SEQ ID No. 23, péptido N-terminal de ratón.

SEQ ID No. 24, péptido N-terminal de rata.

SEQ ID No. 25, ADNc de ratón.

SEQ ID No. 26, secuencia de aminoácidos de longitud completa de ratón.

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En el listado de secuencias, los intrones están marcados en minúscula, y los exones en MAYÚSCULA. En las secuencias polipeptídicas, los péptidos señal están marcados en negrita.

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Secuencia de nucleótidos genómica de NsG33 humano (SEQ ID No. 1).

1

NsG33 humano (1109 pb; CDS=118-999) (SEQ ID No. 2).

>gi|34147349|ref|NM_024042.2| proteína hipotética MGC2601 (MGC2601) de Homo sapiens, ARNm.

2

Secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido C-terminal de NsG33 humano (SEQ ID No. 16).

3

Secuencia de aminoácidos de longitud completa de NsG33 humano (SEQ ID No. 3).

>IPI00031531.1 REFSEQ_NP:NP_076947 TREMBL:Q9UJH9 ENSEMBL:ENSP00000219542 Tax_Id=9606
C380A1.2.1 (proteína novedosa).

4

Proteína NsG33 humano, sin péptido señal (SEQ ID No. 4).

5

Polipéptido C-terminal de NsG33 humano (SEQ ID No. 5).

6

Péptido N-terminal de humano (SEQ ID No. 19).

7

Péptido N-terminal humano (SEQ ID No. 22).

8

Secuencia genómica de nucleótidos de NsG33 de ratón (SEQ ID No. 6).

Cromosoma genómico 17 (cadena inversa):

9

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ADNc parcial de NsG33 de ratón (1048 pb; CDS=<2-886) (SEQ ID No. 7).

11

ADNc de NsG33 de ratón, 1363 pb, CDS 84..959 (SEQ ID No. 25).

NM_133719. Meteorina de Mus musculus [gi.56550040].

12

Secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido C-terminal de NsG33 de ratón (SEQ ID No. 17).

13

NsG33 parcial de ratón (SEQ ID No. 8), es decir, extremo N-terminal que falta.

>giI23274274IgbIAAH37181.1l proteína 1810034B16Rik [Mus musculus].

14

Secuencia de aminoácidos de longitud completa de NsG33 de ratón (SEQ ID No. 26).

ref|NP_598480.1I meteorina [Mus musculus].

15

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Proteína NsG33 de ratón, sin péptido señal (SEQ ID No. 9).

16

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Polipéptido C-terminal de NsG33 de ratón (SEQ ID No. 10).

17

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Polipéptido N-terminal de NsG33 de ratón (SEQ ID No. 20).

18

Polipéptido N-terminal de NsG33 de ratón (SEQ ID No. 23).

19

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Secuencia genómica de NsG33 de rata con 100 pares de bases extra añadidos en los extremos de 5' y 3' (SEQ ID No. 11). Cromosoma genómico 10 (cadena inversa):

20

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SEQ ID No. 12, NsG33 de rata (1026 pb; CDS=876).

>gi|34870570Iref|XM_213261.2| Rattus norvegicus, similar a la proteína 1810034B16Rik (LOC287151), ARNm.

21

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Secuencia codificante de polipéptido C-terminal de NsG33 de rata (SEQ ID No. 18).

22

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Secuencia de aminoácidos de longitud completa de NsG33 de rata (SEQ ID No. 13).

23

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Proteína NsG33 de rata, sin péptido señal (SEQ ID No. 14).

24

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Polipéptido C-terminal de NsG33 de rata (SEQ ID No. 15).

25

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Polipéptido N-terminal de NsG33 de rata (SEQ ID No. 21).

26

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Polipéptido N-terminal de NsG33 de rata (SEQ ID No. 24).

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Ejemplo 2 Análisis de bioinformática Descripción general

NsG33 humana es una proteína factor de crecimiento secretada expresada como un precursor de 293 aminoácidos a altos niveles en el sistema nervioso central y subregiones del mismo, en el sistema nervioso periférico, en la retina y el mesencéfalo humano en desarrollo. Los homólogos de ratón (SEQ ID No. 8) y rata (SEQ ID No. 13) tienen longitudes completas de 294 y 291 aminoácidos, y los % de identidades son 80,3 y 80,2, respectivamente.

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Procesamiento de la proteína

NsG33 humana contiene una secuencia de péptido señal N-terminal de 23 aminoácidos, que es digerida en el motivo de secuencia ARA-GY. Este sitio de digestión del péptido señal se predice mediante el método SignalP (Nielsen et al., 1997) y la gráfica resultado se muestra en la figura 1. Un sitio de digestión del péptido señal se encuentra en una localización similar en la NsG33 de ratón (posición 24) y la NsG33 de rata (posición 16 ó 21). La digestión más probable de NsG33 de rata es en la posición 21, ya que esto se corresponde a la posición de digestión predicha tanto en la NsG33 humana como en la de ratón. Esto significa que el extremo N-terminal más probable de SEQ ID No. 14, 21 y 24 es GYSEDRCS y no el ASARAGYSED mostrado en el listado de secuencias.

La predicción del péptido señal en la NsG33 de ratón, proporciona el mismo sitio de digestión para la secuencia parcial de NsG33 (SEQ ID No. 8) y para la secuencia de longitud completa de NsG33 de ratón (SEQ ID No. 26).

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Procesamiento de la proproteína

Se predice la digestión de tipo general de proproteína en NsG33 humana (SEQ ID No. 3), mediante el método ProP en la posición 127 con una puntuación de 0,831, motivo de secuencia "WGPRERR-AL". De forma similar, se predice un sitio de digestión en NsG33 de ratón (SEQ ID No. 8) en la posición 128 con una puntuación de 0,831, motivo de secuencia "WGPRERR-AL", y en NsG33 de rata (SEQ ID No. 13) en la posición 125 con una puntuación de 0,831 y el motivo de secuencia "WGPRERR-AL".

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Función de la proteína

NsG33 pertenece a la categoría de proteínas que actúan como factores de crecimiento. Esta noción está apoyada por predicciones hechas por el servidor de predicción de la función de proteínas ProtFun (Jensen et al., 2002 y 2003), que proporciona puntuaciones de posibilidad por encima de 1 para exactamente este tipo de categoría, como se muestra en la figura 2. El método de ProtFun predice la función de las proteínas basado en características derivadas de secuencia, opuestamente a similitud de secuencia. Características que son importantes para la discriminación entre las clases de "factor de crecimiento" frente a todas las demás clases, son: potencial de distribución de la proteína, potencial de direccionamiento de la proteína, potencial del péptido señal, regiones de baja complejidad, estructura secundaria de la proteína, número de residuos negativos, y número de átomos (Jensen et al., 2003).

Los cálculos de identidad de secuencia siguientes se han hecho con el programa align0, usando una matriz BLOSUM50 y penalizaciones de espacio -12/-2.

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La tabla 1 muestra el % de identidad de secuencia entre NsG33 humana de longitud completa, frente a las secuencias de ratón y rata.

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La tabla 2 muestra el % de identidad de secuencia entre NsG33 humana, frente a las secuencias de ratón y rata después de la eliminación del péptido señal N-terminal.

29

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Referencias

ProP: Prediction of proprotein convertase cleavage sites. Peter Duckert, Søren Brunak y Nikolaj Blom. Protein Engineering, Design and Selection: 17: 107-112, 2004.

SignalP: Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, Søren Brunak y Gunnar von Heijne, Protein Engineering 10, 1-6 (1997).

ProtFun: Ab initio prediction of human orphan protein function from post-translational modifications and localization features. L. Juhl Jensen, R. Gupta, N. Blom, D. Devos, J. Tamames, C. Kesmir, H. Nielsen, H. H. Staerfeldt, K. Rapacki, C. Workman, C. A. F. Andersen, S. Knudsen, A. Krogh, A. Valencia y S. Brunak. J. Mol. Biol., 319: 1257-1265, 2002.

Prediction of human protein function according to Gene Ontology categories, LJ. Jensen, R. Gupta, H. H. Staerfeldt, S. Brunak. Bioinformatics, 19, 635-642 (2003).

align0 Optimal alignments in linear space. Myers, E. W. y Miller, W. Comput. Appl. Biosci., 4, 11-17 (1998).

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Ejemplo 3 Experimentos con chips de genes

El material humano provino de piezas de tejido desechadas obtenidas de interrupciones provocadas de embarazos usando la técnica corriente de aspiración al vacío. La recogida de tejido residual para el estudio fue aprobada por el Comité de Ética Humana del Hospital de la Universidad de Huddinge, Karolinska Institute (Diario Nr. 259/00) y la Universidad de Lund (970401), y estuvo de acuerdo con las normas de la Comisión Nacional Sueca de Salud y Bienestar (Socialstyrelsen), incluyendo un consentimiento informado de las mujeres embarazadas que solicitaron abortos. El tejido nervioso recuperado se microdisecó a las dos horas de la cirugía, y se disociaron fragmentos de tejido adecuados adicionalmente para el aislamiento de células.

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Aislamiento de ARN

Se obtuvo tejido fetal humano (8 semanas) en dos rondas, ambas de 8 semanas de gestación. Se usaron regiones de VM y DM disecadas para aislamiento de ARN total con buenos resultados y rendimientos.

Se aisló ARN total con extracción con Trizol siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen) de las regiones mesencefálicas ventral y dorsal subdisecadas de tejido fetal humano, de 8 semanas de gestación. Para concentrar el ARN, y para eliminar trazas de ADN cromosómico, se usan columnas Rneasy combinadas con el conjunto de DNasa libre de RNasa, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se preparó ARNc biotinilado a partir de 5 \mug de ARN total, y se fragmentó como se describe en los protocolos de Affymetrix (GeneChip Expression Analysis, Technical Manual 2000) y se hibridó (15 \mug) con GeneChips U133B humano de Affymetrix (que contenía aproximadamente 22.000 genes), según las instrucciones del fabricante. Se analizaron imágenes de barrido, y se convirtieron a valores de índice de expresión usando el paquete de software de análisis GenePublisher (Knudsen S, Workman C, Sicheritz-Ponten T, Friis C. (2003) "GenePublisher: Automated analysis of DNA microarray data", Nucleic Acids Res. 31(13): 3471-6).

Mediante el uso de GeneChips U133 de Affymetrix, se analizó la expresión de NsG33 humano (GeneChip acc. 232269_x_at on U133 B y acc. 219051_x_at on U133 A; Affymetrix, Inc., Santa Clara, Calif.). Se observó la expresión de NsG33 humano en muestras de tejido de mesencéfalo (cerebro medio) fetal humano de ocho semanas, indicando que NsG33 humana puede desempeñar un papel en el desarrollo temprano del cerebro fetal. La expresión de un factor de crecimiento en el mesencéfalo de humano durante el desarrollo embrionario, es predictiva de una posible función terapéutica en el tratamiento de enfermedad de Parkinson.

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Ejemplo 4 Obtención de una secuencia codificante de longitud completa

NsG33 se amplificó por PCR de un clon de IMAGE (The I.M.A.G.E. Consortium: "An integrated molecular analysis of genomes and their expression", Lennon, Auffray, Polymeropoulos y Soares [1996], Genomics 33: 151-152) obtenido de RZPD, Berlín, Alemania (clon RZPD, ID: IRALp962D105Q2), usando los siguientes cebadores:

Cebador 5':	5'-GCGGATCCAGCGGTGGTGAGAGCCCCGAC-3'

Cebador 3':	5'-TATACTCGAGGCCCACCCTCCCTCCTACCAG-3'.

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Se establecieron tres reacciones de PCR idénticas con 50 ng/\mul del clon RZPD como molde de ADN, en un volumen de reacción de 50 \mul. Se aplicó una polimerasa correctora de errores (polimerasa pfu-turbo, Stratagene) para la amplificación por PCR, con el siguiente perfil de amplificación: paso de predesnaturalización: 95ºC, 1' seguido de 35 ciclos de 3 pasos: paso de desnaturalización: 95ºC, 30''; paso de alineamiento: 57ºC, 30''; paso de elongación: 72ºC, 90''. Después, un paso de elongación: 72ºC, 2', seguido de enfriamiento a 4ºC.

Se agruparon las reacciones de PCR, y el fragmento de PCR de NsG33 de 988 pb, se purificó en gel de agarosa, y se cortó con BamHI y XhoI. El ahora fragmento de PCR de NsG33 de 976 pb digerido con BamHI/XhoI se purificó en gel. Se digirieron cinco \mug de un vector de transferencia lentiviral, pHsCXW (número de acceso del GenBank: AY468486) con BamHI y XhoI, y el esqueleto del vector fue purificada en gel.

El fragmento de PCR de NsG33 BamHI/XhoI se ligó en los sitios BamHI y XhoI del vector de transferencia lentiviral pHsCXW, seguido de transformación en células electrocompetentes XL1-B.

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Ejemplo 5 PCR en tiempo real en NsG33

Los tejidos investigados para la expresión de NsG33, fueron ARN total de retina, cerebro entero, putamen, sustancia negra, ganglio, hígado fetal, cerebelo, cerebro entero, hígado fetal, corazón, riñón, pulmón, placenta, próstata, glándula salival, músculo esquelético, bazo, testículo, timo, tráquea, útero, colon, intestino delgado, médula espinal, estómago, páncreas y cerebro fetal.

Se preparó la primera cadena de ADNc a partir de ARN total, usando la transcriptasa inversa Superscript II (Life Technologies) y un cebador HT11V usando procedimientos estándar. Para el análisis de expresión por PCR en tiempo real, se usó como molde el producto de la transcripción inversa equivalente a 20 ng de cada ARN, en reacciones de PCR en tiempo real.

Se realizó la PCR en tiempo real en un termociclador Opticon-2 (MJ Research), usando el kit LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche). Se llevaron a cabo estudios por duplicado usando los cebadores 5'-CCAGC
GACTTCGTAATTCAC-3' (cebador 5') y 5'-AGCCCATGAAGAGGAAGG-3' (cebador 3'). Para la PCR en tiempo real, se preparó una curva patrón mediante dilución en serie de un producto de PCR purificado en gel, preparado usando los cebadores anteriores. La curva patrón se usó para verificar que los valores de punto de cruce (CT) de todas las muestras estuvieran dentro del intervalo exponencial de la reacción de PCR, y para calcular los niveles de expresión finales. Todas las amplificaciones por RT-PCR se llevaron a cabo en un volumen total de 10 \mul que contenía MgCl_{2} 3 mM, sacarosa al 12% y tampón de reacción 1x incluido en el kit LightCycler. El perfil del ciclo de la PCR consistió de un paso de predesnaturalización de 10 minutos a 98ºC y 35 ciclos de tres pasos a 98ºC durante 10 segundos, a 62ºC durante 20 segundos y a 72ºC durante 20 segundos. Después del paso de extensión de cada ciclo, se añadió un paso de lectura de placa (80ºC, 2 segundos) para cuantificar los productos de PCR recién formados. La especificidad de la reacción de amplificación se determinó realizando un análisis de curva de fusión de los fragmentos de PCR, elevando lentamente la temperatura de 52ºC a 95ºC con adquisición continua de datos.

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Para propósitos de normalización, todas las moléculas de ADNc se sometieron a PCR en tiempo real usando cebadores para \beta_{2}-microglobulina (B2M, 5'-TGTGCTCGCGCTACTCTCTC-3' y 5'- CTGAATGCTCCACTTTTTCAATTCT-3'). Se prepararon curvas patrón para \beta_{2}-microglobulina similares a NsG33. Se llevó a cabo PCR en tiempo real del gen de mantenimiento usando el mismo kit que para el gen objetivo, salvo que se usaron temperaturas de alineamiento óptimas para el gen de mantenimiento.

Se determinó el patrón de expresión del gen de mantenimiento a partir de las curvas patrones respectivas, y se usaron los niveles de expresión relativa para normalizar los niveles de expresión de los genes objetivo en los tejidos que se analizaron. Después de la normalización con la \beta_{2}-microglobulina, se calcularon los niveles de expresión relativa del gen objetivo usando el tejido con la expresión más baja como referencia. Los resultados normalizados con respecto a \beta_{2}-microglobulina deben interpretarse con precaución, puesto que la \beta_{2}-microglobulina puede no expresarse al mismo nivel en todos los tejidos ensayados.

Análisis de las muestras de ARN total (mostradas en las figuras 4A y 4B):

Alta expresión (valores de C(T)\men{1}22):

Putamen, sustancia negra, médula espinal

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Expresión intermedia (22<valores de C(T)\men{1}24):

Cerebro entero, cerebelo, retina, DRG

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Baja expresión (24<valores de C(T)\men{1}26):

Corazón, riñón, pulmón, próstata, glándula salival, músculo esquelético, testículo, estómago, páncreas, cerebro fetal

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Expresión muy baja o nula (valores de C(T)\may{1}26):

Hígado fetal, placenta, timo, tráquea, bazo, útero, colon, intestino delgado.

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Basado en la expresión específica del tejido, y en el hecho de que se predice que NsG33 es un factor de crecimiento secretado (véase ejemplo 2), se contempla NsG33 para su uso en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso en general (basado en la expresión específica en el sistema nervioso), en particular enfermedad de Parkinson (basado en la expresión en la sustancia negra), enfermedad de Huntington (basado en la expresión en el putamen), trastornos cerebelares (basado en la expresión en el cerebelo), lesión de médula espinal y ELA (basado en la expresión en la médula espinal), neuropatías periféricas (basado en la expresión en el ganglio de la raíz dorsal) y retinopatías (basado en la expresión en la retina). La función para las varias indicaciones puede verificarse en pruebas in vitro e in vivo como se describe más adelante.

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Ejemplo 6 Ensayo de efecto neuroprotector general (ensayo de células PC12) Generación de solución madre de virus

La secuencia codificante de NsG33 se subclonó en pHsCXW usando sitios de restricción adecuados como se describe en el ejemplo 4. Para generar soluciones madre de virus, el vector de transferencia lentiviral resultante se co-transfectó en células 293T con dos plásmidos auxiliares (pMD.G y pBR8.91) que proporcionan los genes virales necesarios, gag-pol y env, respectivamente, en trans. Brevemente, se sembraron 2x10^{6} células 293T en cada una de 20 botellas de cultivo T75. Al día siguiente, cada botella T75 se transfectó con 15 \mug de ppBR8.91, 5 \mug de pMD.G y 20 \mug de vector de transferencia usando Lipofectamine+ siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Se recogió medio que contenía al virus 2-3 días después de la transfección, y se esterilizó por filtración a través de un filtro de acetato de celulosa o polisulfónico de 0.45 \mum. El virus se precipitó por ultracentrifugación doble a 50.000xg durante 90 minutos a 4ºC, y se resuspendió entonces en medio DMEM. Se tituló el virus usando un ensayo de transcriptasa inversa (RT) (Current Protocols in Molecular Biology, editores: Ausubel et al., Wiley). Se calculó el número de unidades de transducción (UT)/ml de la actividad de RT resultante, y la frecuencia de células fluorescentes obtenidas por transducción de células 293T con un lentivirus con GFP equivalente. La solución madre de virus se almacenó en alícuotas a -80ºC hasta su uso.

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Transducción de células PC12

Para el ensayo, se usaron células PC12 (número de acceso de ATCC: CRL-1721) adaptadas a medio DMEM. Las células PC12 se cultivan en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/l de glucosa y glutamax (Life Technologies #32430-027) con suero de caballo donante al 7,5% (Life Technologies #16050-098) y SBF al 7,5% (Life Technologies # 10099-141) en presencia de CO_{2} al 5% a 37ºC. Se cambia el medio cada 2-3 días, y las células se subcultivan 1:3-1:6 dos veces por semana golpeando la botella y dispensando en botellas nuevas. El día anterior a la transducción, se sembraron células en placas de seis pocillos recubiertos de colágeno. Se añadió virus de la solución madre a 1 ml del medio de cultivo junto con o sin polibreno 5 \mug/ml (concentración final). El virus se incubó con las células durante al menos 3 horas en un incubador de CO_{2}. Se añadió retrovirus con GFP a un cultivo paralelo para estimar la eficiencia de transducción y para servir como control.

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Efecto sobre la diferenciación de células PC12

Se siguió el curso de cultivos en placas de 6 pocillos, y se puntuaron para el número de células que poseen neuritas, después de 2-5 días.

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Efecto sobre la supervivencia de células PC12

Se resembraron las células transducidas de placas de 6 pocillos en placas de 96 pocillos recubiertos de colágeno, en medio de cultivo. Al día siguiente, el medio se cambió a DMEM sin suero, y se midió la viabilidad de las células después de 24-72 horas usando el ensayo de MTS siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega). Los resultados de un experimento se muestran en la figura 9. La actividad de MTS en células PC12 transducidas con un lentivirus que contenía ADNc de NsG33 de longitud completa, incrementó significativamente en comparación con células PC12 control transducidas con un lentivirus que poseía un gen marcador (EGFP). MTS es una medida de la actividad metabólica en la población total de células. De esta manera, el incremento en la actividad de MTS en rLV-NsG33 respecto al cultivo control, puede reflejar la presencia de un número incrementado de células viables en el cultivo, y/o viabilidad incrementada de las células supervivientes.

Un efecto positivo en el ensayo de extensión de neuritas y/o de supervivencia, es indicativo de un potencial efecto terapéutico de la proteína NsG33 en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos.

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Ejemplo 7 Protección de células granulares cerebelares de la toxicidad del glutamato

Se lleva a cabo un ensayo para los efectos de supervivencia, transduciendo cultivos de células granulares cerebelares que subsiguientemente se exponen a concentraciones tóxicas de glutamato, esencialmente como se describe (Daniels y Brown, 2001; J. Biol. Chem. 276: 22446-22452).

Se disecan neuronas granulares cerebelares (CGN) de crías de ratón de 7-8 días. Se disocian las células de cerebelos recién disecados mediante disolución enzimática en presencia de tripsina y DNasa, y se siembran entonces en placas de 24 pocillos pre-recubiertos de poli-D-lisina (Nunc) a una densidad de 1-2 x 10^{6} células/cm^{2} en medio DMEM suplementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 10%. Las células se cultivan a 37ºC en una atmósfera humidificada, y se añade arabinósido de citosina (10 \muM) al medio de cultivo después de 24 horas para detener el crecimiento de las células no neuronales.

Se transducen los cultivos con un lentivirus que contiene NsG33 preparado como se describe en el ejemplo 6 en DIV1 por la adición de solución madre del virus a medio DMEM que contiene suero de bovino fetal al 10% y polibreno 4 \mug/ml. Se transducen cultivos control paralelos con un lentivirus de proteína fluorescente verde (GFP). Cinco horas después de la transducción, se reemplaza el medio con medio precondicionado en CGN.

En DIV5, se añade glutamato (0,1-1 mM) al cultivo, y después de dos días más, se ensaya la supervivencia de las células usando el ensayo de MTT. El grado de reducción de MTT a formazano se mide espectrofotométricamente a 570 nm. Brevemente, se retira el medio de cultivo, y las células se lavan en solución salina de sodio (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, MgCl_{2}.6H_{2}O 1 mM, NaH_{2}PO_{4} 1 mM, CaCl_{2} 1,5 mM, glucosa 5,6 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4). Se añade entonces a las células MTT (concentración final 0,5 mg/ml), preparado justo antes, y mantenido en la oscuridad en solución salina de sodio. Después de una incubación de 3 horas a 37ºC, se añade un volumen igual de ácido-isopropanol (HCl 0,04 M en isopropanol), y se mezcla por completo a temperatura ambiente hasta que se disuelvan todos los cristales de formazano. La viabilidad de las células se expresa como un porcentaje de la densidad óptica de células control. Los cultivos paralelos se dejan sin tratar.

Puede considerarse este ensayo como un ensayo general para probar la protección contra el daño excitotóxico, así como un ensayo predictivo para factores con potencial terapéutico en el tratamiento de trastornos cerebelares.

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Ejemplo 8 Protección de células granulares cerebelares de la apoptosis inducida por privación de potasio

Se lleva a cabo el ensayo de efectos de supervivencia, transduciendo células granulares cerebelares privadas de potasio, esencialmente como se describe (Nomura et al., 2001; Dev. Neurosci. 23: 145-152).

Se disecan neuronas granulares cerebelares (CGN) de crías de ratas Sprague-Dawley de 8 días. Se disocian células de cerebelos recién disecados mediante disolución enzimática en presencia de tripsina y DNasa, y se siembran entonces en placas de 96 pocillos pre-recubiertos de poli-D-lisina (Nunc) a una densidad de 3,5 x 10^{5} células/cm^{2} en medio basal de Eagle que contiene KCl 25 mM y suplementado con suero fetal de ternera inactivado por calor al 10% y glutamina 2 mM. Las células se cultivan a 37ºC en una atmósfera humidificada, y se añade arabinósido de citosina (10 \muM) al medio de cultivo después de 24 horas para detener el crecimiento de las células no neuronales.

Se transducen los cultivos con un lentivirus que contiene NsG33 preparado como se describe en el ejemplo 6 ["ensayo en células PC12"] en DIV1 mediante la adición de solución madre del virus a medio DMEM que contiene suero bovino fetal al 10% y polibreno 4 \mug/ml. Se transducen cultivos control paralelos con un lentivirus con GFP. Cinco horas después de la transducción, se reemplaza el medio con medio precondicionado en CGN.

En DIV2, se induce apoptosis en cultivos inmaduros cambiando las células a medio sin suero que contiene KCl 5 mM, mientras que las células no tratadas reciben medio condicionado que contiene KCl 25 mM. Se mide la supervivencia en DIV3, usando el ensayo de MTS.

En DIV8, se induce apoptosis en cultivos diferenciados (neuronales), cambiando las células a medio sin suero que contiene KCl 5 mM, mientras que las células no tratadas reciben medio condicionado que contiene KCl 25 mM. Se mide la supervivencia después de 24-72 horas, usando el ensayo de MTS.

El ensayo de MTS se lleva a cabo usando el ensayo no radiactivo de proliferación de células CellTiter 96® AQ_{ueous} (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Puede considerarse este ensayo como un ensayo general para efectos neuroprotectores, así como un ensayo que predice factores con potencial terapéutico en el tratamiento de trastornos cerebelares.

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Ejemplo 9 Efecto sobre cultivos de DRG Preparación de medios condicionados de células ARPE-19 transducidas

Para transducir células ARPE-19 con un lentivirus que contiene ADNc que codifica el gen de NsG33, las células se siembran a una densidad de 1x10^{5} células/pocillo en una placa de 6 pocillos en medio DMEM/F12 suplementado con suero bovino fetal al 10%. Al día siguiente, se añade el virus de la solución madre al medio de cultivo junto con polibreno 5 \mug/ml (concentración final). Se incuba el virus con las células durante la noche en un incubador de CO_{2}. Se añade lentivirus con GFP a un cultivo paralelo. Al día siguiente, se cambian los cultivos a medio sin suero UltraCULTURE (1 ml/pocillo), y se recogen medios condicionados después de otros dos días de incubación.

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Aislamiento y cultivo de células DRG en P1

Se retiran los DRG de todos los niveles espinales de ratas Sprague-Dawley en P1 (día 1 post-natal). Los tejidos se disocian enzimáticamente en 125-250 U/ml de colagenasa tipo 1 (Worthington, Freehold, N.J.) a 37ºC durante 30 minutos. Las muestras se trituran con pipetas Pasteur pulidas al fuego, y se filtran a través de malla estéril de 70 \mum para producir suspensiones de células individuales. Las células se presiembran en placas de cultivo de tejidos no recubiertas durante 2 horas, para eliminar células no neuronales. Las células no adherentes se siembran a 15.000 células/pocillo en placas de cultivo de 24 pocillos que se habían recubierto con poli-d-ornitina (Life Technologies) y laminina (Collaborative Biomedical). Los controles negativos se cultivan en medio sin suero UltraCULTURE^{TM} (BioWhittaker, Walkersville, MD) que contiene 2,5 \mug/ml de anticuerpo policlonal anti-NGF neutralizante de oveja (Chemicon, Temecula, CA). Los controles positivos tratados con NGF carecían del anticuerpo policlonal anti-NGF neutralizante. Se añaden a los cultivos diferentes diluciones de medio condicionado recogido de células ARPE-19 transducidas con NsG33 o transducidas con GFP, después de centrifugación y filtración a través de un filtro estéril de 0,4 \mum. Los cultivos se alimentan cada dos días, remplazando los medios.

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Inmunocitoquímica

Después de siete días en cultivo, se fijan las células en formaldehído al 4% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se bloquean previamente las células en suero de cabra al 4%, NP40 al 0,1% durante 30 minutos a temperatura ambiente, y se incuban entonces con anti-\betaIII tubulina de ratón (1:100) durante la noche a 4ºC. Después de lavar en solución de prebloqueo, los cultivos se incuban con un anticuerpo secundario anti-murino acoplado a Cy-3 durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de un lavado final en solución de prebloqueo, se cuentan las células de una tira de la parte media de cada pocillo usando óptica de fluorescencia. Todas las células positivas para \betaIII-tubulina se puntúan como neuronas, y se determina la supervivencia por el número de neuronas contadas por pocillo. Todos los anticuerpos se diluyen en solución de prebloqueo.

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Interpretación de resultados

Los efectos protectores en este ensayo, indican potencial terapéutico en neuropatías periféricas y dolor neuropático.

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Ejemplo 10 Efecto sobre cultivos de neuronas motoras

El ensayo para efectos de supervivencia en cultivos de neuronas motoras, se lleva a cabo usando lentivirus que contienen NsG33, esencialmente como se describe en Cisterni et al. 200 (J. Neurochem. 74, 1820-1828). Brevemente, se disecan y se disocian médulas espinales ventrales de embriones de ratas Sprague Dawley del día embrionario 14,5 (E14,5). Las neuronas motoras se purifican usando un protocolo basado en la purificación por inmunoafinidad de neuronas motoras con anticuerpos contra el dominio extracelular del receptor de neurotrofina, p75, seguida de distribución de las células usando microperlas magnéticas (Arce et al. 1999). Se siembran neuronas motoras purificadas en placas de cultivo de 4 pocillos pre-recubiertos con poliornitina/laminina a una densidad de 500 células por pocillo. El medio de cultivo es medio de cultivo Neurobasal (Life Technologies) suplementado con el complemento B27 (Life Technologies), suero de caballo (2% en v/v), L-glutamina (0,5 mM) y 2-mercaptoetanol (25 \muM). Se añade al medio L-glutamato (25 \muM) durante los primeros 4 días de cultivo, y se omite subsiguientemente.

Las neuronas motoras cultivadas durante 16 horas, se transducen con un lentivirus que contiene NsG33 preparado como se describió anteriormente, mediante la adición de solución madre del virus al medio de cultivo (que corresponde a MOI = 4). Se transducen cultivos control paralelos con el lentivirus de GFP. Ocho horas después de la transducción, se reemplaza el medio con medio fresco (DIV1).

Se cuantifica la supervivencia de las neuronas motoras en DIV3, contando el número de neuronas grandes de fase brillante con largas extensiones axonales en un área predeterminada de 1,5 cm^{2} en el centro de placas por duplicado.

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Interpretación de resultados

Los efectos protectores en este ensayo, indican potencial terapéutico en enfermedades de neuronas motoras que incluyen ELA, lesión de médula espinal, AME (atrofia muscular espinal) y DMD (distrofia muscular de Duchenne).

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Ejemplo 11 Bioensayo para actividades neurotróficas dopaminérgicas Condiciones de cultivo

Se preparan cultivos de células mesencefálicas disociadas como se describió previamente (Friedman y Mytilineou 1987 Neurosci. Lett. 79: 65-72), con modificaciones menores. Brevemente, se disecan tegumentos mesencefálicos rostrales de cerebros de embriones de rata Sprague-Dawley, en los días 13-16 de gestación, bajo el microscopio en condiciones estériles, se recogen en solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato libre de Ca^{2+} y Mg^{2+} (Gibco, Gaithersburg, Md.), y se disocian mecánicamente mediante trituración moderada. Las células se siembran en 100 \mul por pocillo en placas de cultivo de tejidos de 16 mm de diámetro (Falcon, Lincoln Park, NJ., placa de 24 pocillos) que contienen 400 \mul de medio, para dar una densidad de 2,5-3,5x10^{5} células por pocillo. Las pocillos de cultivo se habían expuesto previamente a 0,1 mg/ml de solución de poli L-ornitina en borato de sodio 10 mM, pH 8,4, durante 3 horas a 37ºC, y lavados tres veces en agua milli-Q y una vez en solución salina equilibrada de Earle (Gibco). El medio nutritivo (10/10) consiste en medio esencial mínimo (MEM, Gibco) suplementado con glucosa (33 mM), bicarbonato de sodio (24,5 mM), glutamina (2 mM), HEPES (15 mM), penicilina G (5 U/ml), estreptomicina (5 \mug/ml), suero fetal de ternera inactivado por calor al 10% (Gibco) y suero de caballo inactivado por calor al 10% (Gibco). Los cultivos se mantienen a 37ºC en una atmósfera saturada de agua que contiene CO_{2} al 6,5%. Después de 3 horas, cuando la mayoría de las células se han adherido al fondo del pocillo, el medio se reemplaza con 500 \mul de medio fresco. En este momento, se añade a cada pocillo por duplicado una dilución en serie de la muestra que se va a ensayar para actividad neurotrófica dopaminérgica (medio condicionado), y las placas se incuban en el incubador a 37ºC. Después de una semana, los cultivos se tratan durante 24 horas con fluorodesoxiuridina (13 \mug/ml) y uridina (33 \mug/ml) para prevenir la proliferación excesiva de células gliales, y se alimentan subsiguientemente con el medio anterior sin suero fetal de ternera. El medio nutritivo se cambia semanalmente.

De forma alternativa, se usa medio sin suero definido químicamente en el que se reemplaza el suero con una mezcla de proteínas, hormonas y sales. El medio definido (MD) consiste en una mezcla de medio nutritivo MEM y F12 (ambos de Gibco, 1:1; en vol/vol) con glucosa (33 mM), glutamina (2 mM), NaHCO_{3} (24,5 mM) y HEPES (15 mM), suplementado con transferrina (100 \mug/ml), insulina (25 \mug/ml), putrescina (60 \muM), progesterona (20 nM), selenito de sodio (30 nM), penicilina G (5 U/ml) y estreptomicina (5 \mug/ml). La osmolaridad del MD se ajusta a 325 mediante la adición de agua milli-Q (110-125 ml de H_{2}O/l).

El estado funcional de las neuronas dopaminérgicas se puede ensayar en estos cultivos, midiendo la absorción de dopamina a través de transportadores "depuradores" específicos en las neuronas dopaminérgicas, y contando el número de neuronas positivas para la enzima de la síntesis de dopamina, tirosina hidroxilasa, usando inmunohistoquímica como se describe en Karlsson et al, 2002, Brain Res. 15 Nov 2002; 955(1-2): 268-80.

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Preparación de la muestra

Antes de ensayar la actividad neurotrófica dopaminérgica en los cultivos de células mesencefálicas, todas las muestras de medio condicionado se desalan de la manera siguiente. Se añaden 100 \mul del medio 10/10 (como vehículo) a un Centricon-10 (Amicon), y se dejan reposar durante 10 minutos. Se añaden alícuotas de la muestra que se va a ensayar al Centricon, seguido de 1 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco de alto contenido en glucosa, sin bicarbonato, pero conteniendo HEPES 10 mM, pH 7,2 (solución A), y se centrifugan a 5.000Xg durante 70 minutos. El material retenido (aproximadamente 0,1 ml) se lleva de nuevo a 1,1 ml con solución A fresca, y se reconcentra dos veces. La muestra se filtra a través de una unidad Durapore estéril Ultrafree-MC de 0,11 \muM (Millipore, Bedford Mass.), antes de que sea añadida al pocillo de cultivo.

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Absorción de ^{3}H-dopamina

La absorción de dopamina tritiada (^{3}H-DA) se realiza en cultivos en el día 6 o el día 7 como se describió previamente (Friedman y Mytilineou (1987) Neurosci. Lett. 79:65-72) con modificaciones menores, y todas las soluciones se mantienen a 37ºC. Brevemente, el medio de cultivo se retira, lavando dos veces con 0,25 ml del tampón de absorción que consiste en tampón fosfato Krebs-Ringer, pH 7,4, que contiene glucosa 5,6 mM, EDTA 1,3 mM, ácido ascórbico 0,1 mM y pargilina 0,5 mM, un inhibidor de monoamina oxidasa. Los cultivos se incuban con 0,25 ml de ^{3}H-DA 50 nM (New England Nuclear, Boston, Mass., actividad específica de 36-37 Ci/mmol) durante 15 minutos a 37ºC. Se detiene la absorción de ^{3}H-DA eliminando la mezcla de incubación, y las células se lavan entonces dos veces con 0,5 ml del tampón de absorción. Para liberar la ^{3}H-DA de las células, los cultivos se incuban con 0,5 ml de etanol al 95% durante 30 minutos a 37ºC, y se añaden entonces a 10 ml de EcoLite (ICN, Irvine, Calif.), y se cuentan en un contador de centelleo. Se obtienen los valores blanco añadiendo al tampón de absorción GBR-12909 0,5 mM (RBI), un inhibidor específico de la bomba de absorción de alta afinidad de las neuronas de dopamina (Heikkila et al. 1984 Euro J. Pharmacol. 103: 241-48).

Un incremento en el número de neuronas positivas para TH y/o un incremento en la absorción de 3H-dopamina, en comparación con un tratamiento control, es una indicación de una posible función de NsG33 en el tratamiento de enfermedad de Parkinson.

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Ejemplo 12 Evaluación de la neuroprotección de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra in vivo, en el modelo de lesión intraestriatal con 6-OHDA

Se producen vectores pseudotipificados de VSV-G (rLV) como se describió previamente (Zufferey et al., 1997, J. Virol, 73: 2886-2892; Rosenblad et al. In vivo protection of nigral dopamine neurons by lentiviral gene transfer of the novel GDNF-family member neublastin/artemin. Mol Cell Neurosci. Feb de 2000; 15(2): 199-214). Brevemente, los plásmidos de transferencia pHR'CMV-W que poseen el ADNc para proteína fluorescente verde (GFP) o NsG33, se co-transfectan con los plásmidos auxiliares pMD.G y pCMVDR8.91 en células 293T. Se recogen sobrenadantes que contienen viriones en los días 2 y 3 después de la transfección, y se concentran a 116.000 g mediante ultracentrifugación. El título de la solución madre del vector rLV-GFP es de 1,1x10^{8} U.T./ml, según se determina por dilución en serie del sobrenadante concentrado en células 293T. El título de las partículas virales se determina para soluciones madre de los virus rLV-NsG33 y rLV-GFP, usando una técnica de transferencia por ranuras de ARN como se describió previamente (von Schwedler et al. Vif is crucial for human immunodeficiency virus type 1 proviral ADN synthesis in infected cells. Virol. Ago de 1993; 67(8): 4945-55), y de la relación entre el título de U.T. y de las partículas virales que se obtienen de rLV-GFP, se estima que el título del vector rLV-NsG33 es de 1,2x10^{8} U.T./ml.

Todos los trabajos que implican animales experimentales se llevan a según las normas establecidas por el Comité de Ética para Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Lund. Los animales se enjaulan en un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 horas con acceso a pienso para ratas y agua. Se usan ratas hembras Sprague Dawley (\sim220 g al tiempo de la cirugía). Para la cirugía estereotáxica, se anestesia a los animales usando halotano, y se inyecta un total de dos microlitros de rLV-GFP (n = 8) o rLV-NsG33 de una solución madre viral 1:2 (1,0-1,2 x 10^{5} U.T.) en dos tractos en el cuerpo estriado derecho en las siguientes coordenadas: (1) AP = +1,0 mm, ML = -2,6 mm, DV = -5,0 y -4,5 mm, Tb = 0,0 y (2) AP = 0,0 mm, ML = -3,7 mm, DV = -5,0 y -4,5 mm, Tb = 0.0. Después de dos semanas, se anestesia de nuevo a los animales, y se colocan en una estructura estereotáxica. Se aplica una inyección de 6-hidroxidopamina (20 \mug [calculada como la base libre] por 3 \mul de vehículo [solución salina con ácido ascórbico al 0,2%] en el cuerpo estriado derecho, en las siguientes coordenadas: AP = +0.5 mm, ML = -3,4 mm, DV = -5,0 y -4,5 mm, Tb = 0,0.

Cuatro semanas después de la lesión, se anestesia profundamente a los animales con pentobarbital (70 mg/kg, Apoteksbolaget, Suecia), y se perfunde transcardiacamente a los mismos con 50 ml de solución salina a temperatura ambiente, seguido de 200 ml de paraformaldehído al 4% tamponado con fosfato enfriado en hielo (pH 7,2-7,4). Los cerebros se fijan posteriormente durante 3-6 horas en el mismo fijador, se transfieren a sacarosa al 30% durante 24 horas, y se cortan en 6 series de secciones de 40 \mum de espesor en un micrótomo de congelación.

Se realiza inmunohistoquímica para detección de tirosina hidroxilasa inmunorreactiva en la sustancia negra, como se describió previamente (Rosenblad et al. In vivo protection of nigral dopamine neurons by lentiviral gene transfer of the novel GDNF-family member neublastin/artemin. Mol Cell Neurosci. Feb de 2000; 15(2): 199-214). Se evalúa el número de neuronas TH-IR y VMAT-IR de la sustancia negra contando bajo el microscopio todas las neuronas inmunorreactivas laterales al núcleo terminal medio de la vía óptica accesoria en tres secciones consecutivas a través del SN, como se describió previamente (Sauer y Oertel, 1994, Neuroscience 59: 401-15).

Un incremento en el número de TH-IR en comparación con el control de GFP, es una fuerte indicación de una función en el tratamiento de enfermedad de Parkinson. Un incremento en el número de VMAT-IR refuerza además la conclusión.

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Ejemplo 13 Análisis por PCR en tiempo real de NsG33 en tejidos de SNC murino en desarrollo Materiales y métodos Iniciadores

Se usaron los siguientes iniciadores para PCR en tiempo real:

mNsG33:

mNsG33 intronspan 284 pb 5':	5'-GTCTTCGCTGAACGTATGAC-3'

mNsG33 intronspan 623 pb 3':	5'-CTGATTCTTGCAGCTCTGTG-3'

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GAPDH:

mGAPDH-s904:	5'-AACAGCAACTCCCACTCTTC-3'

mGAPDH-as1067:	5'-TGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3'.

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Se aisló tejido de diferentes regiones del cerebro de ratones adultos y en desarrollo, y se preparó ARN por extracción con Trizol. Se realizó tratamiento subsiguiente con DNasa en columna usando columnas de centrifugación RNeasy para eliminar trazas de ADNg, y para limpiar además el ARN. Se usaron como molde alícuotas de 2,5 \mug de ARN para la síntesis de ADNc con una transcriptasa inversa deficiente en RNasa H derivada de MoMLV (Superscript) y cebador poli-dT. Se sintetizó al mismo tiempo el ADNc de todas las muestras usando la misma mezcla maestra para evitar variaciones. El volumen final de la reacción de ADNc fue 120 \mul, que se almacenó en alícuotas a -80ºC para evitar congelación y descongelación repetidas. Para analizar la expresión de NsG33 en el desarrollo en médula espinal (ME) en desarrollo, se prepararon moléculas de ADNc derivadas de tejidos de embriones de 10,5, 11,5 y 13,5 días (E10,5, E11,5 y E13,5, respectivamente), además de tejidos de ratones adultos. Se analizó la regulación de la expresión de NsG33 en el desarrollo en el cerebelo (Cb) y corteza (CTX), usando ADNc derivadas de tejido de P1 y adulto.

Para el análisis de expresión en PCR en tiempo real, se usaron como molde aproximadamente 20 ng de cada ADNc. La PCR en tiempo real se realizó en un termociclador Opticon-2 (MJ Research), usando el kit LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche). Se llevaron a cabo estudios por duplicado usando los cebadores descritos anteriormente. Para la PCR en tiempo real, se preparó una curva patrón mediante dilución en serie de un producto de PCR purificado en gel, preparado usando los cebadores anteriores. La curva patrón se usó para verificar que los valores de punto de cruce (C_{T}) de todas las muestras estuvieran dentro del intervalo exponencial de la reacción de PCR, y para calcular los niveles de expresión finales. Todas las amplificaciones por PCR en tiempo real se llevaron a cabo en un volumen total de 10 \mul que contenía MgCl_{2} 3 mM, sacarosa al 12% y tampón de reacción 1x incluido en el kit LightCycler. El perfil del ciclo de la PCR consistió de un paso de pre-desnaturalización de 10 minutos a 98ºC y 35 ciclos de tres pasos a 98ºC durante 10 segundos, a 62ºC (mGAPDH) ó 60ºC (mNsG33) durante 20 segundos y a 72ºC durante 20 segundos. Después del paso de extensión de cada ciclo, se añadió un paso de lectura de placa (80ºC, 2 segundos) para cuantificar los productos de PCR recién formados. La especificidad de la reacción de amplificación se determinó realizando un análisis de curva de fusión de los fragmentos de PCR, elevando lentamente la temperatura de 52ºC a 95ºC con adquisición continua de datos.

Para propósitos de normalización, todos los ADNc se sometieron a PCR en tiempo real usando cebadores para el gen de mantenimiento GAPDH. El análisis de GAPDH por PCR en tiempo real, se llevó a cabo de igual manera que para los genes objetivo. El patrón de expresión de mantenimiento se determinó a partir de las curvas patrones respectivas, y los niveles de expresión relativa se usaron para normalizar los niveles de expresión de los genes objetivo en los tejidos que se analizaron. Después de la normalización con GAPDH, se calcularon los niveles de expresión relativa de los genes objetivo usando como referencia el tejido con la expresión más baja.

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Resultados

La expresión relativa de GAPDH varió no más que entre 1,0 y 1,3 entre las diferentes edades y tejidos lo que muestra que GAPDH podría usarse para normalización.

Los resultados de PCR en tiempo real para NsG33 de ratón, se muestran en las figuras 10A y 10B. Los valores de C_{T} variaron de 17 a 22. De la figura 10A, es evidente que la expresión de NsG33 se regula durante el desarrollo de la médula espinal, alcanzando un máximo alrededor de E11,5. De la figura 10B, es evidente que NsG33 se regula durante el desarrollo post-natal en cerebelo, pero no en corteza.

NsG33 es una molécula secretada que está altamente conservada a través de las especies, con características de un factor de crecimiento u hormona con un patrón de expresión que en combinación con sus otras características, predice fuertemente un uso terapéutico para el tratamiento de trastornos neurológicos.

El patrón de expresión temporal en médula espinal indica una función en proliferación, diferenciación y/o supervivencia de los progenitores neurales en esta región del SNC. Esto es de relevancia terapéutica consistente para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y lesiones en la médula espinal, que incluyen lesión de médula espinal, ELA y atrofia muscular espinal. Además, este perfil de expresión indica un potencial como reactivo in vitro para expansión y/o diferenciación de progenitores neurales derivados de la médula espinal.

El aumento de la expresión de NsG33 en el cerebelo del adulto, indica un papel para este factor en el mantenimiento y/o supervivencia de uno o más tipos de células cerebelares. Esto es consistente con la relevancia terapéutica para trastornos cerebelares que incluyen, pero no están limitados a, ataxia sensitiva, esclerosis múltiple, trastornos espinocerebelares neurodegenerativos, ataxia hereditaria, atrofias cerebelares (tales como atrofia olivopontocerebelar (OPCA), síndrome de Shy-Drager (atrofia de sistemas múltiples)), y alcoholismo.

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Ejemplo 14 Efecto de hNsG33 sobre la diferenciación de células progenitoras neurales humanas Generación de medios condicionados

Se generaron células que secretan hNsG33, transduciendo células ARPE-19 con una construcción lentiviral que contiene ADNc de hNsG33, LV-sC.NsG33.W. Brevemente, se sembraron células en placas de 6 pocillos al 50-70% de confluencia (1x10^{5} células/pocillo) en medio DMEM/F12 (1:1) suplementado con SFT al 10%. Después de una incubación la noche anterior, se añadió a las células polibreno (5 \mug/ml) y virus. Al día siguiente, las células se pasaron a botellas T25. Se congelaron alícuotas de células transducidas después de un pase adicional.

Para recoger medio condicionado de los cultivos de células ARPE-19 transducidas y parentales (control), se sembraron células en botellas T25. Después de 4 días de incubación, se cambiaron los cultivos a medio HSC sin suero. Después de otras 24 horas, los medios condicionados de células ARPE-19 control y NsG33 se recogieron, y se procesaron mediante centrifugación a 3000x g durante 5 minutos antes de su adición a los cultivos de hNS1.

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Ensayo en células hNS1

hNS1 (anteriormente llamada HNSC.100), es una línea de células clonales embrionarias multipotentes derivadas del prosencéfalo de células madre neurales, que se ha descrito previamente (Villa et al., Exp Neurol, 2000, 161(1): 67-84). Villa et al 2004, Exp Cell Res. 1 Abr; 294(2): 559-70). Se obtuvieron células de Alberto Martínez Serrano, Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Universidad Autónoma de Madrid-CSIC, Campus de Cantoblanco, Madrid, 28049, España. Se expandieron cultivos de células hNS1 en botellas TC recubiertas de poli-L-lisina con CO_{2} al 5% y 37ºC, en medio HSC sin suero suplementado con 20 ng/ml de EGF y bFGF. El medio HSC consistía de medio DMEM/F12 (1:1) suplementado con N_{2} y BSA al 1%. Para experimentos de diferenciación, se sembraron células hNS1 sobre cubreobjetos pre-recubiertos con 50 \mug/ml de poli-lisina en medio HSC sin mitógeno que contenía SBF al 0,5% a una densidad de 10^{5} células/cm^{2}. Un día después de la siembra, se cambió el medio de diferenciación a medio condicionado al 100% recogido de células ARPE-19 parentales (Mc C) o células ARPE-19 transducidas con hNsG33 lentiviral (Mc 33). Un cultivo control recibió medio HSC no condicionado. Se reemplazaron dos terceras partes del medio al día siguiente, y después cada dos o tres días. Cuatro días después de la siembra, los cultivos se fijaron durante 10 minutos en paraformaldehído al 4%, y se tiñeron mediante inmunohistoquímica.

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Inmunohistoquímica

Después de bloquear en suero normal de caballo al 10%, se incubaron los cultivos con anticuerpos primarios para GFAP (anticuerpo policlonal anti-vaca de conejo, 1:1000, DAKO) y \beta-tubulina (anticuerpo monoclonal, clon SCL: 3D10, 1:1000, Sigma). Después de lavar, los cultivos se incubaron con anticuerpos secundarios biotinilados, anti-ratón de caballo (Vector Laboratories, 1:200), seguido de detección usando Strep-Cy3 (Jackson InmunoResearch, 1/200), y anti-conejo de cabra marcado con Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, 1:200), respectivamente. Los núcleos de las células se contratiñeron con Hoechst 33258 0,2 \mug/ml (Villa et al., 2004). Para el análisis, se contó el número total de células (núcleos) además de las células positivas para GFAP y \beta-tubulina, por microscopía confocal usando un objetivo de 63x.

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Resultados

Como se muestra en la figura 11A, la adición de medio condicionado de células ARPE-19 transducidas con una construcción lentiviral que contenía ADNc de hNsG33 (Cm 33), incrementó el porcentaje de neuronas positivas para \beta-III-tubulina un 73% respecto a cultivos control (hNS1), mientras que el medio condicionado de células ARPE-19 control (Cm C) no tuvo efecto alguno. El incremento observado con medio Cm 33 respecto tanto medio de hNS1 como medio Cm C, fue estadísticamente significativo en una prueba t (P<0,05).

Los medios condicionados de células ARPE-19 transducidas con NsG33, parecieron también incrementar significativamente el número de células gliales positivas para GFAP en comparación con el medio de hNS1 (17 frente al 11%, respectivamente). Sin embargo, se observó un incremento similar con medio condicionado control (Cm C) (16 frente al 11%, respectivamente), aunque este no fue estadísticamente significativo. La adición de medio condicionado de células ARPE-19 control (Cm C) y células ARPE-19 transducidas con una construcción lentiviral que contenía ADNc de hNsG33, no alteró significativamente el número total de células como se muestra en la figura 11B.

El número neuronal incrementado puede resultar de diferenciación incrementada de células progenitoras neuronales presentes en los cultivos, y/o un efecto de supervivencia sobre las neuronas diferenciadas. Estos datos son consistentes con un potencial neuroprotector y regenerativo de NsG33.

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Ejemplo 15 Ensayo del efecto de NsG33 sobre cultivos estriatales Preparación de medios condicionados para ensayar

Se prepararon medios condicionados de células ARPE-19 y HEK293T transfectadas transitoriamente con una construcción de expresión que contenía ADNc de hNsG33 (pHsC.NsG33.W), además de células ARPE-19 y HEK293T transfectadas control.

Se sembraron células ARPE-19 en placas de 6 pocillos (1x10^{5} células/pocillo) en medio DMEM:F12 (1:1) suplementado con SFT al 10%. Después de incubar durante la noche, las células se transfectaron con Fugene usando 3 \mug de ADN/pocillo según las instrucciones del fabricante (Roche).

Se sembraron células HEK293T en placas de 6 pocillos (3x10^{5} células/pocillo) en medio DMEM suplementado con SFT al 10%. Después de incubar durante la noche, las células se transfectaron con Lipofectamine+ usando 2 \mug de ADN/pocillo según las instrucciones del fabricante (Invitrogen).

El día después de la transfección, se cambió el medio a medio DMEM:F12 sin suero. Después de 24 horas de condicionamiento, se recogieron los medios de las células transfectadas, y se procesaron mediante centrifugación a 300Ox g durante 5 minutos. Los medios condicionados clarificados se diluyeron con DMEM:F12 (6:16) antes de su adición a los cultivos estriatales. La expresión del ARNm de NsG33 se analizó por RT-PCR cuantitativa usando cebadores específicos para el ADNc de hNsG33.

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RT-PCR cuantitativa

Se preparó ARN total de los cultivos transfectados por extracción con Trizol, seguido de tratamiento con DNasa en columna usando columnas de centrifugación RNeasy para eliminar las trazas de ADNg y para limpiar además el ARN. Se sintetizó el ADNc usando transcriptasa inversa, y cada ADNc que correspondía a aproximadamente 20 ng de ARN total se usó como molde para el análisis de expresión por PCR en tiempo real con cebadores de hNsG33 como se describe en el ejemplo 5.

Para propósitos de normalización, todos los ADNc se sometieron a PCR en tiempo real usando los cebadores 4842 y 4843 para el gen de mantenimiento GAPDH [4842: 5'-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3' y 4843: 5'-GATCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3']. Después de normalización con GAPDH, se calcularon los niveles de expresión relativa de los genes objetivo usando muestras de ADNc con la expresión de hNsG33 más baja como referencia.

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Generación y ensayo de cultivos estriatales

Se prepararon cultivos de células del cuerpo estriado embrionario de rata, esencialmente como se describió previamente (Nakao et al., 1996 Exp. Neurol. 138, 144-157). Brevemente, las eminencias ganglionares lateral y media se disecaron selectivamente de embriones de rata de E14,5 (Sprague-Dawley, B&K Universal, Suecia). Se incubaron trozos de tejido con tripsina/DNasa a 37ºC, se lavaron y se disociaron mecánicamente. Las células disociadas se sembraron en portaobjetos con cámara de cuatro pocillos (100.000 células/cm^{2}) pre-recubiertos con 50 \mug/ml de poli-l-lisina y 10 \mug/\mul de laminina en medio DMEM suplementado con HEPES 15 mM, piruvato de sodio 1 mM y SFT al 10%. Después de 2 días in vitro, se cambió el medio a DMEM:F12 (1:1) sin suero suplementado con HEPES 1,5 mM, piruvato de sodio a 1 mM y B27 (1:50), no condicionado o condicionado por células HEK293T o ARPE-19 transfectadas control o transfectadas con NsG33 generadas como se describió anteriormente. Después de 4 días de incubación en medio sin suero, los cultivos se procesaron para inmunohistoquímica.

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Inmunohistoquímica

Brevemente, se fijaron cultivos de células durante 20 minutos en paraformaldehído al 4%. Después de preincubar en suero de bloqueo al 5%, los cultivos se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con anticuerpo anti-\beta-III-tubulina (Sigma, 1:333). Después de lavar, los cultivos se incubaron con anticuerpo secundario anti-ratón de asno conjugado con FITC (1:200, Jackson Lab) durante dos horas, a temperatura ambiente. Los núcleos de las células se contratiñeron con DAPI. Para el análisis, se contó el número total de células (núcleos) y el número de células positivas para \beta-III-tubulina en 16 campos aleatorios por condición (número total de células promedio = 260), usando el aumento de 40x.

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Resultados

La expresión del ARNm de hNsG33 en cultivos transfectados transitoriamente, se confirmó usando transcripción inversa-PCR cuantitativa. En cultivos de HEK293T transfectadas transitoriamente con pHsC.NsG33.W, se determinaron mediante qRT-PCR niveles normalizados del ARNm de hNsG33 40-6000 veces mayores que en cultivos no transfectados. También en cultivos de células ARPE-19 transfectadas, se detectó un nivel mayor de ARNm de hNsG33 (30-35 veces el nivel control en cultivos transfectados control).

Como se muestra en la figura 12, la adición de medios condicionados de células ARPE-19 transfectadas con una construcción de expresión que contenía ADNc de hNsG33, incrementó el porcentaje de neuronas positivas para \beta-III-tubulina con el 49% en los cultivos estriatales, respecto a cultivos que recibieron medio condicionado de células ARPE-19 transfectadas control (48% frente al 32%). El incremento fue estadísticamente significativo en una prueba t (P<0,05).

Similarmente, se observó un incremento estadísticamente significativo del 34% en el porcentaje de neuronas en cultivos que recibieron medio condicionado de células HEK293T transfectadas con la construcción de hNsG33 respecto a cultivos HEK293T transfectados control (50% frente al 37%).

No se observó ningún efecto de la adición de medios condicionados de cualquiera de los cultivos transfectados controles respecto a cultivos control que recibieron medio no condicionado (UCM). El incremento en el porcentaje de células neuronales no se debió a un incremento en el número total de células determinado contando núcleos teñidos con DAPI, sino un número incrementado de neuronas en los cultivos que recibieron medios que contenían hNsG33. El número incrementado de células neuronales puede resultar de diferenciación incrementada de células progenitoras neuronales presentes en los cultivos, y/o un efecto de supervivencia sobre las neuronas estriatales diferenciadas. Estos datos son consistentes con el efecto neuroprotector y regenerativo general de NsG33, y específicamente, un potencial terapéutico de NsG33 en enfermedad de Huntington.

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> NsGene A/S

\hskip1cm

Nordahl Petersen, Thomas

\hskip1cm

Blom, Nikolaj

\hskip1cm

Grønborg, Mette

\hskip1cm

Kusk, Philip

\hskip1cm

Johansen, Teit

\hskip1cm

Wahlberg, Lars

\hskip1cm

Brunak, Søren

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Uso terapéutico de un factor de crecimiento, NSG33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 522-204-WO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> DK PA 2004 00510

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 30-03-2004

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> DK PA 2004 00843

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 28-05-2004

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/575,086

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 28-05-2004

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2508

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

30

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (118)..(999)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

32

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 293

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

34

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(78)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, ó t

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

39

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1048

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(886)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

41

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

43

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

45

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

47

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica miscelánea

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)..(66)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, ó t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

48

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1026

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(876)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

50

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 275

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Potencialmente parte de péptido señal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

54

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

56

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 498

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 498

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

59

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 498

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

62

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Potencialmente parte de péptido señal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

65

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus norvegicus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CARACTERÍSTICA MISCELÁNEA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Potencialmente parte de péptido señal

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

68

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1363

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (84)..(959)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

70

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

72

73

Claims

1. Uso de

i): un polipéptido aislado que comprende

a): una secuencia de aminoácidos que consiste en SEQ ID No. 4;

b): una variante de secuencia biológicamente activa de la secuencia de aminoácidos, en donde la variante tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con dicha SEQ ID No. 4; o

c): un fragmento biológicamente activo de por lo menos 50 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b), teniendo dicho fragmento por lo menos el 70% de identidad de secuencia con SEQ ID No. 4 en un intervalo de solapamiento de por lo menos 50 aminoácidos,

ii): una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido como el que se define en i) o una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia complementaria a una secuencia que codifica un polipéptido como el que se define en i),

iii): un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico como la que se define en ii),

iv): una composición de células huésped, en donde dichas células se transforman o transducen con el vector como se define en iii), siempre que no se incluya el uso de embriones humanos con fines industriales o comerciales,

v): una línea de células de empaquetamiento que comprende la secuencia de ácido nucleico como se define en ii), o

vi): un dispositivo de células biocompatible implantable, en donde dicho dispositivo comprende:

a): una membrana semipermeable que permite la difusión de un polipéptido como el que se define en i) y/o un vector viral; y

b): una composición de células como la que se define en iv), o una línea de células de empaquetamiento como se define en v),

\quad: para la preparación de un medicamento, es donde dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño del sistema nervioso, en donde se han perdido o dañado las células neurales.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID Nos. 3, 5, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 22, 23 y 24.

3. El uso de la reivindicación 1, en donde el polipéptido tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 3, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 3.

4. El uso de la reivindicación 1, en donde el polipéptido tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 4, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 4.

5. El uso de la reivindicación 1, en donde el polipéptido tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 5, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 5.

6. El uso como de la reivindicación 1, en donde el polipéptido tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 19, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 19.

7. El uso de la reivindicación 1, en donde el polipéptido tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 22, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID No. 22.

8. El uso de la reivindicación 1, en donde el fragmento se selecciona del grupo que consiste en:

i): AA_{30}-AA_{288} de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{25}-AA_{293} de SEQ ID No. 3;

ii): AA_{28}-AA_{286} de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{23}-AA_{291} de SEQ ID No. 13;

iii): AA_{31}-AA_{289} de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{26}-AA_{294} de SEQ ID No. 8; y

iv): variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida se cambia a un aminoácido diferente, siempre que no se cambien así más de 20 de los residuos de aminoácido en la secuencia.

9. El uso de la reivindicación 1, en donde el fragmento se selecciona del grupo que consiste en:

i): AA_{171}-AA_{288} de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{165}-AA_{288} de SEQ ID No. 3;

ii): AA_{169}-AA_{286} de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{164}-AA_{291} de SEQ ID No. 13;

iii): AA_{172}-AA_{289} de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{167}-AA_{294} de SEQ ID No. 8; y

iv): variantes de dichos polipéptidos, en donde cualquier aminoácido especificado en la secuencia elegida se cambia a un aminoácido diferente, siempre que no se cambien así más de 10 de los residuos de aminoácido en la secuencia.

10. El uso de la reivindicación 1, en donde el fragmento se selecciona del grupo que consiste en:

i): AA_{30}-AA_{118} de SEQ ID No. 3, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{25}-AA_{123} de SEQ ID No. 3;

ii): AA_{28}-AA_{116} de SEQ ID No. 13, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{23}-AA_{121} de SEQ ID No. 13;

iii): AA_{31}-AA_{119} de SEQ ID No. 8, y polipéptidos que tienen de uno a cinco aminoácidos extra de la secuencia nativa en uno o ambos extremos, hasta AA_{26}-AA_{124} de SEQ ID No. 8; y

11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido es capaz de formar por lo menos un puente intramolecular de cisteína.

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido comprende un dímero de NsG33 unido a través de un puente intermolecular de cisteína.

13 El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido comprende adicionalmente una etiqueta de afinidad, tal como una etiqueta de polihistidina, una etiqueta de GST, una etiqueta de HA, una etiqueta Flag, una etiqueta C-myc, una etiqueta de HSV, una etiqueta V5, una etiqueta de proteína de unión a maltosa, una etiqueta de dominio de unión a celulosa.

14. El uso de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

a): la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18;

b): una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18;

c): una secuencia de ácido nucleico de por lo menos 150 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18;

d): el complemento de un ácido nucleico capaz de hibridar con un ácido nucleico que tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID No. 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17 y 18 en condiciones muy severas; y

e): la secuencia de ácido nucleico del complemento de cualquiera de los anteriores.

15. El uso de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico tiene por lo menos el 70%, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98% de identidad de secuencia con una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 187-996 de SEQ ID No. 2, nucleótidos 74-883 de SEQ ID No. 7 y nucleótidos 64-873 de SEQ ID No. 12.

16. El uso de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 1, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 1.

17. El uso de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico tiene por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 2, más preferiblemente por lo menos el 75%, más preferiblemente por lo menos el 80%, más preferiblemente por lo menos el 95%, más preferiblemente por lo menos el 98%, más preferiblemente un ácido nucleico que tiene la secuencia de SEQ ID No. 2.

18. El uso de la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico es una variante entremezclada entre SEQ ID No. 2 y 7 y/o 12.

19. El uso de la reivindicación 1, en donde el vector comprende adicionalmente un promotor operativamente unido a la molécula de ácido nucleico.

20. El uso de la reivindicación 19, en donde el promotor se selecciona del grupo que consiste en: CMV, UbiC humano, JeT, RSV, promotor regulable por Tet, Mo-MLV-LTR, Mx1 y EF-1alfa.

21. El uso de la reivindicación 1, en donde el vector se selecciona del grupo que consiste en vectores derivados de la familia Retroviridae que incluye lentivirus, VIH, SIV, FIV, EAIV y CIV.

22. El uso de la reivindicación 1, en donde el vector se selecciona del grupo que consiste en alfavirus, adenovirus, virus adenoasociados, baculovirus, HSV, coronavirus, virus del papiloma bovino y Mo-MLV, preferiblemente virus adenoasociados.

23. El uso de la reivindicación 1, en donde la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en células de E. coli, levadura, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus y Sf9 de insecto.

24. El uso de la reivindicación 1, en donde la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en células epiteliales pigmentadas retinianas inmortalizadas, tales como células ARPE-19, fibroblastos humanos inmortalizados y astrocitos humanos inmortalizados.

25. El uso de la reivindicación 24, en donde la célula huésped está unida a una matriz.

26. El uso de la reivindicación 24, en donde la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en células madre, incluyendo células madre o precursoras neurales humanas, células madre o precursoras gliales humanas y células madre fetales.

27. El uso de la reivindicación 24, en donde la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en células CHO, CHO-K1, HEI193T, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b y BHK.

28. El uso de la reivindicación 1, en donde la línea de células de empaquetamiento es capaz de producir una partícula viral infecciosa, comprendiendo dicha partícula viral un genoma derivado de Retroviridae que comprende una LTR retroviral 5', un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento, un promotor operativamente unido a una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido como el que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un origen de síntesis de segunda cadena de ADN y una LTR retroviral 3'.

29. El uso de la reivindicación 28, en donde el genoma deriva de lentivirus y las LTR son lentivirales.

30. El uso de la reivindicación 1, en donde la membrana semipermeable es inmunoaisladora.

31. El uso de la reivindicación 1, en donde la membrana semipermeable es microporosa.

32. El uso de la reivindicación 1, en donde el dispositivo comprende adicionalmente una matriz dispuesta dentro de la membrana semipermeable.

33. El uso de la reivindicación 1, en donde el dispositivo comprende adicionalmente un ancla de atadura.

34. El uso de la reivindicación 1, en donde dicho dispositivo comprende un núcleo que comprende células de empaquetamiento vivas que secretan un vector viral para la infección de una célula objetivo, en donde el vector viral es un retrovirus, comprendiendo el vector un gen heterólogo que codifica un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, operativamente unido a un promotor que regula la expresión de dicho polipéptido en la célula objetivo; y una cubierta externa que rodea a dicho núcleo, comprendiendo dicha cubierta un material biocompatible permeable, teniendo dicho material una porosidad seleccionada para permitir el paso de vectores retrovirales de aproximadamente 100 nm de diámetro a través del mismo, permitiendo la liberación de dicho vector viral de dicha cápsula.

35. El uso de la reivindicación 34, en donde el núcleo comprende adicionalmente una matriz, estando inmovilizadas las células de empaquetamiento por la matriz.

36. El uso de la reivindicación 34, en donde la cubierta comprende un hidrogel o material termoplástico.

37. El uso de la reivindicación 1, en donde dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño que implica lesión al cerebro, tronco encefálico, médula espinal y/o nervios periféricos que incluye, pero no está limitado a afecciones tales como apoplejía, lesión cerebral traumática, lesión de médula espinal, lesión axonal difusa, epilepsia, neuropatía, neuropatía periférica y dolor asociado.

38. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde el trastorno del sistema nervioso implica degeneración de neuronas y sus extensiones en el cerebro, tronco encefálico, la médula espinal y/o los nervios periféricos que incluye, pero no está limitado a enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, demencia senil, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y lesión neuronal asociada con esclerosis múltiple.

39. El uso de la reivindicación 38, en donde la enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Parkinson.

40. El uso de la reivindicación 38, en donde la enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Huntington.

41. El uso de la reivindicación 38, en donde la enfermedad neurodegenerativa es esclerosis lateral amiotrófica.

42. El uso de la reivindicación 1, en donde el trastorno del sistema nervioso es una enfermedad, trastorno o daño que implica disfunción y/o pérdida de neuronas en el cerebro, tronco encefálico, la médula espinal, y/o nervios periféricos que incluye, pero no está limitado a afecciones causadas por enfermedades metabólicas, deficiencia nutricional, lesión tóxica, cáncer y/o afecciones genéticas o idiopáticas que incluyen, pero no están limitadas a diabetes, disfunción renal, alcoholismo, quimioterapia, agentes químicos, toxicomanía, deficiencia de vitaminas e infección.

43. El uso de la reivindicación 42 ó 37, en donde la enfermedad es neuropatía periférica y dolor asociado.

44. El uso de la reivindicación 1, en donde el trastorno del sistema nervioso es una enfermedad, trastorno o daño que implica degeneración o esclerosis de células gliales tales como oligodendrocitos, astrocitos y células de Schwann en el cerebro, tronco encefálico, la médula espinal y los nervios periféricos que incluye, pero no está limitado a esclerosis múltiple, neuritis óptica, esclerosis cerebral, encefalomielitis post-infecciosa y epilepsia.

45. El uso de la reivindicación 44, en donde la enfermedad o trastorno es esclerosis múltiple, ataxia sensitiva, trastornos espinocerebelares neurodegenerativos, ataxia hereditaria, atrofias cerebelares y alcoholismo.

46. El uso de la reivindicación 1, en donde el trastorno, enfermedad o daño del sistema nervioso implica la retina, fotorreceptores y nervios asociados que incluye, pero no está limitado a retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma y retinopatía diabética.

47. El uso de la reivindicación 1, en donde el trastorno, enfermedad o daño del sistema nervioso implica el epitelio sensitivo y ganglios asociados del complejo vestibuloacústico que incluye, pero no está limitado a pérdida de la audición inducida por ruido, sordera, acúfenos, otitis, laberintitis, atrofias hereditaria y cocleovestibular y enfermedad de Meniere.

48. Un método in vitro para prevenir la apoptosis en una célula neuronal de mamífero, comprendiendo dicho método exponer dicha célula neuronal a un polipéptido como el que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en donde dicho método no incluye el uso de embriones humanos con fines industriales o comerciales.

49. Un método in vitro para mejorar la supervivencia de una célula neuronal de mamífero, comprendiendo dicho método exponer dicha célula neuronal a un polipéptido como el que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en donde dicho método no incluye el uso de embriones humanos con fines industriales o comerciales.

50. Un método in vitro para generar una neurona, comprendiendo dicho método exponer una célula precursora neuronal o una célula madre neuronal a un polipéptido como el que se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en donde dicho método no incluye el uso de embriones humanos con fines industriales o comerciales.

51. Un método in vitro para expandir una composición de células de mamífero, que comprende administrar a dicha composición el polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22; o transducir/transfectar las células con el vector de expresión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 44, en donde dicho método no incluye el uso de embriones humanos con fines industriales o comerciales.

52. Un método in vitro para diferenciar una composición de células neuronales de mamífero, que comprende administrar a dicha composición el polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22; o transducir/transfectar las células con el vector de expresión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 44, en donde dicho método no incluye el uso de embriones humanos con fines industriales o comerciales.