ES2324168T3

ES2324168T3 - Procedimiento de preparacion de una disolucion de alfa-1-antitripsina.

Info

Publication number: ES2324168T3
Application number: ES04764046T
Authority: ES
Inventors: Petra Schulz; Jurgen Romisch
Original assignee: Octapharma AG
Current assignee: Octapharma AG
Priority date: 2003-08-12
Filing date: 2004-08-12
Publication date: 2009-07-31
Anticipated expiration: 2024-08-12
Also published as: IL172868A0; EP1654284A1; CN1867582A; CN1867582B; KR20060070543A; AU2004262578B2; US20060194300A1; RU2006107533A; UA86775C2; SI1654284T1; BRPI0412835A; RU2370500C2; PT1654284E; DK1654284T3; DE602004020632D1; NO20060109L; AU2004262578A1; JP4668904B2; EP1654284B1; ATE428730T1

Abstract

Un procedimiento para purificar A1AT a partir de otros componentes proteínicos en disoluciones que contienen A1AT, que comprende los siguientes pasos: (a) someter una disolución que contiene A1AT a cromatografía de intercambio de iones; (b) añadir detergentes y opcionalmente un disolvente para inactivar virus envueltos por lípidos; (c) seguido de aumentar la concentración de sal para salificar los detergentes.

Description

Procedimiento de preparación de una disolución de alfa-1-antitripsina.

La invención versa acerca de un procedimiento para prepara una disolución que contiene alfa-1-antitripsina (A1AT), y acerca de una A1AT.

La A1AT es una glucoproteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 55.000 Dalton y pertenece a la familia de inhibidores de serina-proteasa. La A1AT puede inhibir la actividad de un número de proteasas, por ejemplo, la tripsina, de la que deriva el nombre del inhibidor por razones históricas. Fisiológicamente, la elastasa es una proteasa diana que está implicada especialmente tanto en procesos de reconstrucción como de degradación de tejido y de matriz y se libera por células como los granulocitos y está implicada de esta manera en los procesos inflamatorios. La duración de la actividad elastasa está limitada en tiempo y espacio y se regula esencialmente mediante el inhibidor A1AT. La desregulación de dicha actividad lleva a la degradación rápida del tejido y puede tener consecuencias patofisiológicas. Además, se inician y/o se promueven los procesos inflamatorios. Un ejemplo conocido de un control reducido o carente de elastasa es la degradación progresiva de tejido local en el pulmón con fenómenos inflamatorios acompañantes, que lleva progresivamente a un enfisema y está acompañado de esta manera de una función pulmonar limitada, en parte significativa. En la etapa final, esto puede llevar a la muerte del paciente, que puede ser evitada finalmente únicamente por medio de un transplante pulmonar.

Dichos pacientes sufren de carencia de A1AT o de una A1AT limitada en su función. El inhibidor se produce normalmente y se segrega en cantidades relativamente elevadas por el hígado y circula en el plasma sanguíneo en concentraciones relativamente elevadas (una concentración típica es de 1,3 mg/ml). Además, en los órganos se encuentran concentraciones fisiológicamente efectivas y suficientes de A1AT, especialmente en el fluido pulmonar (fluido del revestimiento epitelial), de personas sanas. Si esta concentración de A1AT se reduce significativamente o si la A1AT presente está limitada en su función o es inactiva (inactivada), hay una degeneración no controlada del tejido pulmonar con las consecuencias mencionadas anteriormente.

Las razones para una carencia de A1AT o una A1AT reducida en su función inhibidora son principalmente defectos genéticos. Lo que se denomina mutación "Z", especialmente es individuos homocigotos (PiZZ), da como resultado una polimerización de las moléculas de A1AT que ya se encuentran en las células que las sintetizan. En consecuencia, la A1AT ya no puede alcanzar la circulación, o solo puede hacerlo en cantidades muy pequeñas. Esto da como resultado, por una parte, en una actividad inhibidora ausente, que se manifiesta especialmente en el pulmón durante periodos prolongados de tiempo, y por otra parte, en un enriquecimiento de los polímeros en las células hepáticas y de esta manera en correspondientes trastornos funcionales. Los individuos heterocigotos PiZ tienen un potencial inhibidor reducido de manera correspondiente. Se conocen mutaciones adicionales con defectos similares.

Conforme a las estimaciones actuales, la prevalencia de la mutación PiZZ en los EE. UU. es del orden de 1/1600 de la población; en consecuencia, el número de portadores de la mutación es significativamente mayor, de los que, presumiblemente, solo han sido identificados el 10%.

De entre los pacientes que padecen trastornos funcionales pulmonares (enfisema progresivo) basados en la deficiencia de A1AT o A1AT de función reducida, no todos pueden ser tratados en la actualidad dado que la A1AT para el tratamiento y/o la profilaxis no está disponible suficientemente como un medicamento aprobado. Un tratamiento implantado está basado en la administración intravenosa de disoluciones que contienen A1AT preparadas a partir de plasmas de donantes. La dosis establecida y recomendada en la actualidad es de 60 mg de A1AT por kg de peso corporal a la semana, que se corresponde con un consumo medio de 16-20 gramos de A1AT por paciente al mes. Esto a su vez se corresponde con una cantidad que está contenida de media en 15 litros de plasma. Considerando que únicamente se obtiene parte del inhibidor contenido en el material plasmático de partida de una forma pura como un preparado, se requiere un múltiplo de los 15 l de plasma normal como una materia prima para un paciente cada mes. El volumen total de plasma requerido como materia prima para recuperar la A1AT y, por ende, para el tratamiento permanente de pacientes es, en consonancia, elevado.

Los procedimientos de preparación implantados para producir preparaciones de A1AT utilizan lo que se denomina pasta de Cohn IV1 como un material de partida. Esta se prepara mediante el procedimiento de Cohn-Oncley, con el que está familiarizado el experto, o mediante una modificación del mismo, en base a la separación fraccional de las proteínas del plasma al variar, esencialmente, la concentración de etanol añadido, el valor de pH ajustado y la temperatura de la disolución. Además de A1AT, lo que se denomina fracción IV1 contiene normalmente una amplia variedad de otras proteínas del plasma, en parte en cantidades ya reducidas por pasos previos de precipitación. Una variación de este procedimiento es el procedimiento de Kistler-Nitschmann. En consecuencia, también pueden ser utilizadas como material de partida una fracción que es similar a la fracción de Cohn IV1, al igual que otras fracciones que contienen A1AT, tal como lo que se denomina sobrenadante I+II+III.

Se han descrito diversos procedimientos para preparar un preparado más o menos pura de A1AT. Se ha informado repetidas veces del uso de la cromatografía de intercambio iónico para el enriquecimiento de la A1AT, especialmente mediante intercambiadores de aniones (Gray et al., 1960; Crawford et al., 1973; Chan et al., 1973, etc.). Sin embargo, este paso de preparación por sí solo no produce un preparado de A1AT que tenga una pureza que se corresponda con la situación actual de la técnica. Por lo tanto, se emplean otros pasos de preparación, en parte en combinación con intercambiadores de iones. Por ejemplo, se utilizan procedimientos de adsorción o de precipitación, tal como la incubación con polietilenglicol (US-A-4.379.087), con quelato de cinc o adsorbentes de heparina (US-A-4.629.567) u otros. Estos procedimientos se utilizan para la purificación (adicional) de A1AT, pero se debe soportar una pérdida de producción más o menos elevada en cada uno de ellos. En principio, la pérdida de producto aumenta según aumenta el número de pasos de la preparación. Además, esto se acompaña a menudo con una extensión del tiempo de preparación, que puede tanto disminuir la integridad y la actividad de la A1AT como aumentar el coste de producción.

Además de los pasos de la preparación de la proteína, lo que se denomina pasos de inactivación de virus o pasos de empobrecimiento es parte esencial de los procedimientos de preparación de los productos de proteína preparados a partir del plasma. Además de lo que se denomina procedimiento SD (disolvente/detergente), que inactiva los virus correspondientes al dañar sus envoltorios lipídicos de protección, se aplican procedimientos térmicos de inactivación, por ejemplo, la pasteurización (tratamiento térmico durante 10 horas a 60ºC), para aumentar la seguridad contra los virus. La filtración a través de "nanofiltros" retiene los virus, estén envueltos por lípidos o libres de lípidos, normalmente dependiendo del tamaño de los virus. Es la situación actual de la técnica integrar conjuntamente dos pasos de procedimiento, cada uno de los cuales es efectivo por sí mismo y están basados en distintos principios, en un procedimiento de producción para una protección máxima contra los virus.

Dependiendo de la proteína, se añaden estabilizadores, por ejemplo, aminoácidos o azúcares, durante estos pasos del procedimiento para estabilizar la proteína. En consecuencia, estos deben ser eliminados más adelante de la disolución que contiene A1AT. En el procedimiento SD, se añaden detergentes como agentes activos para la inactivación de los virus que deben ser eliminados en el curso adicional del procedimiento de la preparación mediante procedimientos adecuados. Para este fin, se ha establecido la adsorción a matrices hidrófobas, como la cromatografía con cadenas C18 inmovilizadas. Dicha cromatografía está acompañada de nuevo por pérdidas de producción e incluye los inconvenientes mencionados anteriormente de cada paso (adicional) cromatográfico en un procedimiento. Además, estas matrices se utilizan de forma repetida por norma, es decir, se requieren pasos de regeneración de matriz de costo elevado y que llevan mucho tiempo.

En consecuencia, se ha descrito un procedimiento alternativo, efectivo y rápido para la eliminación cualitativa de detergentes que dispenses con un paso cromatográfico (WO 94/26287. US-A-5.817.765). De esta manera, la disolución de proteínas que contiene el detergente se lleva a concentraciones fisiológicas (\geq 0,5 M) de una sal, por ejemplo, citrato de Na, para formar partículas que contienen detergente que pueden ser separadas simplemente por medio de filtración, por ejemplo. En lo que sigue, este procedimiento se denomina procedimiento de "detergente/salificación".

En los ejemplos del documento WO 94/26287, el procedimiento de "detergente/salificación" se aplica a tres proteínas aisladas en disolución, que son transferrina, antitrombina III y albúmina. En los ejemplos, el procedimiento lleva a una recuperación de la actividad de la proteína del 95%, respectivamente, y a la reducción de la concentración del detergente. Si se aplica el procedimiento bajo condiciones, de forma que la producción de la proteína diana no se vea afectada demasiado, frecuentemente la concentración de Triton en el producto sigue siendo elevada. En el ejemplo 4 del documento WO 94/26287, los inventores son capaces de recuperar el 95% de la actividad de la albúmina, pero obtienen un producto constituido por 250 ppm de Triton X-100 y 35 ppm de TNBP. Especialmente cuando se producen preparaciones médicas, se deberían evitar las concentraciones de Triton X-100 superiores a 50 ppm, preferiblemente superiores a 10 ppm, y es deseable en general reducir los contenidos de detergente tanto como sea posible.

El objeto de la invención era proporcionar un procedimiento para purificar un preparado de A1AT que da como resultado un producto de pureza y protección elevadas tan efectiva y rápidamente como sea posible. Preferiblemente, durante el procedimiento, no se debería afectar negativamente la actividad y/o la calidad de la A1AT y se deberían de eliminar los detergentes hasta niveles que sean aceptables para las preparaciones médicas.

Era otro objeto de la invención proporcionar un procedimiento para la purificación de las disoluciones que comprenden A1AT, durante el cual, se eliminan los otros componentes proteínicos. Preferiblemente, la disolución de A1AT también debería ser empobrecida de otros componentes como los lípidos o los virus.

El objeto se logra por medio de un procedimiento para purificar A1AT a partir de disoluciones que contienen A1AT, de otros componentes proteínicos que comprenden los pasos de:

(a): someter la disolución que contiene A1AT a una cromatografía de intercambio de iones;

(b): añadir detergentes y opcionalmente un disolvente para inactivar virus envueltos por lípidos;

(c): seguido de aumentar la concentración de sal para salificar los detergentes.

Además, el problema de la invención se soluciona por medio de las realizaciones tal como se definen en las reivindicaciones 1 a 11. El procedimiento para purificar A1AT a partir de disoluciones que contienen A1AT de otros componentes proteínicos, por ejemplo, a partir de la fracción IV1 (Cohn) reconstituida de plasma, en principio consiste en únicamente dos pasos muy eficientes del procedimiento en términos de su enriquecimiento de A1AT: es decir, cromatografía por medio de un intercambiador de aniones, y tratamiento de inactivación SD de virus con Triton
X-100 y TnBP, seguido de la salificación de los agentes de inactivación de los virus.

Se ha descubierto que el último paso mencionado también puede ser utilizado muy efectivamente en disoluciones que contienen A1AT.

El procedimiento de la invención es especialmente útil cuando la disolución que comprende A1AT comprende cantidades significativas de proteínas distintas de A1AT. Sorprendentemente, bajo las condiciones del procedimiento, este paso del procedimiento puede ser utilizado no solo para eliminar detergentes para la inactivación de virus, sino que además tienen un efecto significativo de purificación con respecto a la separación de cualquier proteína, lipoproteína e impurezas lipídicas presentes sin afectar de manera adversa la producción de A1AT. En combinación con la cromatografía de intercambio de aniones mencionada anteriormente, se obtiene esencialmente un producto de A1AT que tiene una pureza de > 90%, preferiblemente > 95% y que contiene A1AT en su forma activa. El paso del procedimiento del tratamiento de detergente disolvente y salificación recupera la A1AT activa a un rendimiento \geq 80%. Si se utiliza pasta reconstituida IV1 como el material de partida por ejemplo, el procedimiento de la invención permite la purificación de A1AT debido a la eliminación de \alpha-2-macroglobulina, haptoglobina, \alpha-1 glucoproteína ácida, IgG, IgA e IgM de las disoluciones que comprenden A1AT. En realizaciones específicas de la invención, la disolución que comprende A1AT después del paso de salificación recupera < 10% de \alpha-2-macroglobulina, < 40% de haptoglobina, < 10% de \alpha-1 glucoproteína ácida, < 10% de IgG, < 10% de IgA y/o < 10% de IgM, haciendo referencia a la disolución de A1AT antes del tratamiento de disolvente/detergente, que es, por ejemplo, el eluido de una cromatografía de intercambio de aniones previa. En las realizaciones preferidas de la invención, la disolución inicial que comprende A1AT comprende hasta el 50, hasta el 20 o hasta el 10% (p/p) de otras proteínas. Preferiblemente, la disolución inicial comprende al menos un 1, 2 o 5% (p/p) de otras proteínas.

Además, también se observó que, sorprendentemente, el procedimiento de la invención es también útil como un paso de inactivación y/o empobrecimiento de los virus. Aunque se recupera A1AT en producciones elevadas, el producto no solo está empobrecido o reducido de otros componentes proteínicos sino también de virus. Esto es especialmente útil para virus con revestimiento no lipídico, porque los virus revestidos con lípidos ya estarán inactivados por el tratamiento con el detergente. El procedimiento de la invención es también así un procedimiento para la inactivación de los virus, especialmente de virus revestidos con no lípidos, en disoluciones que comprenden A1AT.

Es sorprendente el descubrimiento de que un procedimiento de "detergente/salificación" como se describe en el documento WO 94/26287 es aplicable en el caso presente, lleve a una eliminación de detergente a niveles aceptables en preparaciones médicas, y además de como resultado un enriquecimiento de A1AT altamente específico. Se podría suponer que el procedimiento del documento WO 94/26287 daría como resultado productos que tienen concentraciones reducidas de detergente, que no obstante pueden ser aún demasiado elevadas para productos farmacéuticos, y en los que todas las proteínas y otros componentes excepto los detergentes se recuperan a ritmos similares. Por lo tanto, no se podría suponer que el procedimiento del documento WO 94/26287 fuese útil en la purificación de una proteína de entre otras proteínas.

El uso de cromatografía hidrófoba (interacción) (HIC), por ejemplo, sobre Phenyl-Sepharose®, es deseable si se quiere obtener un producto de A1AT que tiene un grado aún mayor de pureza. La ejecución de este paso es obvia, en particular, subsiguientemente al tratamiento de detergente/salificación, dado que el enlace proteínico a una matriz o a enlaces hidrófobos está mediado normalmente en la presencia de una concentración suprafisiológica de sal. Luego, se efectúa la elución de las proteínas enlazadas, por ejemplo, al reducir las concentraciones de sal. De manera consonante, después de la eliminación del detergente "salificado" directamente, o después de una disminución razonable de la concentración de sal (mediante disolución o ultrafiltración/diafiltración; UF/DF), la disolución que contiene A1AT puede ser puesta en contacto con la matriz hidrófoba y llevarse a cabo la cromatografía como está familiarizado el experto en la técnica.

Además del tratamiento SD de la disolución que contiene A1AT, se puede integrar al menos un paso adicional para la inactivación de los virus, eliminación de los virus y/o la eliminación de los priones, por ejemplo, una inactivación térmica de los virus de la disolución que contiene A1AT. Estos pasos se pueden llevar a cabo, en particular, en disolución siguiendo directamente el paso de salificación, dado que las cantidades de sal contenidas en la disolución, especialmente el citrato de sodio, sirven como estabilizadores durante el tratamiento térmico. Como otra posibilidad, el tratamiento térmico del producto liofilizado es obvio. De forma alternativa o además, se puede incluir cualquier procedimiento adecuado de filtración para la eliminación de los virus o priones. En especial, el experto está familiarizado con la nanofiltración y puede estar integrada en el procedimiento, preferiblemente con filtros disponibles comercialmente que tengan tamaños de poro en el rango desde 15 a 20 nm o cualquier filtración adecuada para eliminar virus y/o priones. La eliminación de virus puede mejorarse con la adición de aminoácidos, preferiblemente a una concentración de 0,1 M para cada aminoácido. En una realización preferida se añade glicina a una concentración superior a 0,2 M. Yokoyama et al. (2004, Vox Sanguinis 86, 225-229) describen un procedimiento preferido.

En general, son adecuadas las disoluciones que contienen A1AT obtenidas a partir de plasma y sus fracciones o A1AT expresada de manera recombinante o transgénica.

En una realización preferida del procedimiento, se reconstituye la pasta IV1 (Cohn) con agua o una disolución tamponada, más preferiblemente con una disolución tamponada con Tris de 20 mM para alcanzar una relación de disolución a pasta de \geq 3:1 (preferiblemente > 10:1), puesta en contacto subsiguientemente con un gel de intercambio de iones, preferiblemente un gel de intercambio de aniones, en una realización preferida un DEAE Sepharose® (Amersham), más preferiblemente DEAE-Sepharose® Fast Flow, se lava el gel, y se eluye A1AT al aumentar la fuerza de los iones. La inactivación de los virus se efectúa, por ejemplo, por medio del procedimiento conforme al documento EP-A-0 131 740. La adición opcional de agentes estabilizantes es seguida de la adición de agentes de inactivación de virus, preferiblemente Triton X-100, Polisorbato 80 (Tween 80), TnBP y/o ácido caprílico/caprilato, preferiblemente a concentraciones finales de \geq 0,1% (p/p) de Triton y Tween 80, \geq 0,03% (p/p) de TnBP, \geq 0,1 mM de ácido caprílico/caprilato. Después de un tiempo apropiado de incubación, preferiblemente \geq 0,1 horas, más preferiblemente \geq 1 hora, a \geq 4ºC, más preferiblemente a \geq 15ºC, se aumenta la concentración de sal, especialmente a una concentración de \geq 0,5 M, especialmente con citrato. Se eliminan las partículas formadas de ese modo, especialmente mediante filtración. Relavar los filtros o las partículas separadas puede llevar a un aumento de la producción de A1AT. Esto puede ser seguido de un paso adicional de inactivación de virus, preferiblemente pasteurización en la presencia de \geq 0,5 M de citrato de sodio, aminoácidos, azúcares o mezclas de estas sustancias. La disminución subsiguiente de la concentración de las sustancias añadidas se efectúa preferiblemente mediante ultra/diafiltración. Más preferiblemente, la separación subsiguiente de las partículas de virus se efectúa por medio de nanofiltros, preferiblemente por medio de filtros que tienen tamaños de poro de 15-20 nm. La A1AT obtenida de esta manera puede ser almacenada como una preparación líquida o congelada, o liofilizada mediante procedimientos con los que está familiarizado el experto en la técnica.

El producto de A1AT obtenido de esta manera puede ser administrado como una disolución de manera subcutánea, intramuscular, tópica o como un aerosol, preferiblemente de manera intravenosa. Como un material secado, también puede ser utilizado para la inhalación en una forma en polvo. Es posible la aplicación en mezcla con otras disoluciones, por ejemplo, para una aplicación intravenosa. Una dosis posible es de, por ejemplo, 60 mg/kg de peso corporal por semana, o 250 mg/kg por mes.

Otro procedimiento preferido incluye HIC además de los pasos del procedimiento mencionados anteriormente, preferiblemente HIC por medio de una matriz de fenilo, preferiblemente después del tratamiento SD y de salificación de los agentes antivíricos y otras impurezas, como se ha expuesto anteriormente. Preferiblemente, se lleva a cabo una purificación negativa, es decir, la valiosa sustancia A1AT pasa la matriz cromatográfica sin enlazarse, y se enlazan sustancias no deseables y se eliminan de esta manera de la disolución del procedimiento.

En otro procedimiento preferido que puede incluir la HIC mencionada anteriormente, se lleva a cabo una cromatografía sobre heparina inmovilizada, preferiblemente mediante heparina-sefarosa o heparina-fractogel. De esta manera, la disolución que contiene A1AT se pone en contacto con el gel de heparina en una columna o en un procedimiento por lotes. La A1AT enriquecida pasa la columna sin enlazarse, o se encuentra en el sobrenadante después de la separación del gel. Preferiblemente, este paso del procedimiento se lleva a cabo antes o después de la cromatografía de intercambio de iones mencionada, o después de la salificación del detergente y de reducir la fuerza de los iones de la disolución, por ejemplo, por medio de diálisis.

El procedimiento conforme a la invención se ilustra adicionalmente por medio del siguiente Ejemplo:

Ejemplo 1

Para la reconstitución, se disuelve pasta de Cohn IV1 congelada en 20 mM de disolución de Tris a una relación de peso de 1:9 con agitación durante 3 horas a un pH alcalino.

Cromatografía de intercambio de aniones

Un material cromatográfico preferido para este paso del procedimiento es DEAE-Sepharose FF (Fast Flow) (Flujo rápido DEAE-Sefarosa), aunque las condiciones también pueden ser adaptadas por el experto para cada material de intercambio de aniones. Se equilibra una columna cromatográfica rellena de DEAE-Sepharose FF con una disolución de Tris de 20 mM (pH 8,0). A partir de entonces, se aplica pasta de Cohn IV1 disuelta a un pH de 8,0. El lavado se efectúa con un tampón de equilibrio, seguido de un paso de lavado con una disolución tampón. Entonces, se puede eluir la A1AT enlazada a la matriz al lavar la columna con 20 mM de Tris, 0,075 M NaCl, pH 8,0. La actividad específica de la disolución de A1AT obtenida de esta manera es aproximadamente de 0,5 PEU/mg de proteína (PEU: unidad equivalente de plasma; corresponde a la cantidad o actividad de A1AT que se encuentra de media en un mililitro de plasma humano). Se eluye la columna con un tampón con elevada concentración de sal (por ejemplo, 2 M NaCl), y se puede regenerar subsiguientemente el gel cromatográfico mediante procedimientos conocidos per se.

Tratamiento de disolvente/detergente

El eluido obtenido de esta manera está concentrado mediante ultrafiltración. Subsiguientemente, se añade una disolución mezclada previamente de Triton X-100, TnBP y agua para un uso farmacéutico (WFI) para alcanzar una concentración final de un 1% (p/p) de Triton X-100 y un 0,3% (p/p) de TnBP. El tratamiento de SD se lleva a cabo durante 4 horas a 20ºC con una leve agitación.

Salificación

Para eliminar los reactivos de SD y precipitar las proteínas no deseables acompañantes, se diluye la disolución que contiene A1AT con una disolución que contiene 1,5 M de citrato de sodio y 20 mM de Tris a un pH de 7,0. La adición a una concentración de citrato de 1 M se efectúa durante al menos 15 minutos con agitación. Subsiguientemente, se incuba la disolución del procedimiento durante al menos una hora con una leve agitación. El precipitado blancuzco formado se separa subsiguientemente mediante filtración. Esto disminuye la concentración de reactivos de SD hasta menos de 10 ppm, y también se separan las proteínas no deseables acompañantes y la A1AT desnaturalizada.

Después de este paso de producción, la actividad específica de A1AT es de al menos 0,8 PEU/mg (PEU: unidad equivalente de plasma; corresponde a la cantidad o actividad de A1AT que se encuentra de media en un mililitro de plasma humano).

Nanofiltración

Después de la eliminación de sustancias de tamaño molecular reducido por medio de UF/DF, se filtra la disolución obtenida de esta manera con un tamaño nominal de exclusión de 15-20 nm, tal como filtros DV20 de la empresa Pall, para aumentar adicionalmente la protección del producto de A1AT contra los virus.

Resultados

Las concentraciones de Triton X-100 y de TNBP en el producto después de la filtración fueron menores de 5 ppm. Se determinó la cantidad de A1AT y de otros componentes proteínicos en el producto y se comparó con las cantidades determinados antes del tratamiento de disolvente/detergente. Se calcularon las siguientes producciones:

A1AT: > 80%

\alpha-2-macroglobulina: < 10%

haptoglobina: < 40%

\alpha-1 glucoproteína ácida: < 10%

IgG: < 10%

IgA: < 10%

IgM: < 10%

Los resultados muestran que se recuperó el en el producto de A1AT específicamente en cantidades elevadas, mientras que el producto fue empobrecido de forma significativa de otros componentes proteínicos. Esto se ilustra adicionalmente por medio de la figura 1, que muestra el resultado de un SDS-PAGE de la disolución antes del tratamiento de disolvente/detergente (calle 2) y después del paso de salificación (calle 3). La A1AT se corresponde con la banda ancha ligeramente por encima de 50 kD (en comparación con el marcador del peso molecular en la calle 1). Se reducen significativamente los otros diversos componentes proteínicos claramente detectables en la disolución de partida.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Modificando el procedimiento como se describe en el Ejemplo 1, el eluido que contiene A1AT de la cromatografía de intercambio de iones entra en contacto con heparina-sefarosa. La A1AT pasa la columna de heparina-sefarosa sin enlazarse. Si se emplea una operación por lotes, la A1AT permanece en el sobrenadante. El tratamiento adicional del eluido de la columna o del sobrenadante de la variante del lote se efectúa como se describe en el Ejemplo 1. El producto obtenido de esta manera se caracteriza por un aumento de su pureza.

La Figura 1 muestra el resultado de un SDS-PAGE bajo condiciones reductoras, gradiente de 4-20%, tinción con Coomassie, 5 \mug proteína/calle. Calle 1: marcador del peso molecular; calle 2: medición de una disolución conforme al ejemplo 1 antes del tratamiento de disolvente/detergente; calle 3: medición de una disolución conforme al ejemplo 1 después del paso de salificación.

Claims

1. Un procedimiento para purificar A1AT a partir de otros componentes proteínicos en disoluciones que contienen A1AT, que comprende los siguientes pasos:

(a): someter una disolución que contiene A1AT a cromatografía de intercambio de iones;

2. El procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que dicha disolución que contiene A1AT ha sido obtenida a partir de plasma sanguíneo o sus fracciones, preferiblemente de una fracción IV1 (Cohn) de plasma reconstituido, o está derivada de una preparación A1AT expresada de manera recombinante o transgénica o de un sobrenadante de fermentación.

3. El procedimiento conforme a la reivindicación 1 y/o 2, en el que la cromatografía de intercambio de iones se lleva a cabo sobre un gel de intercambio de aniones, preferiblemente DEAE-Sepharose® o DEAE-Sepharose® Fast Flow.

4. El procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha inactivación de los virus conforme al paso (b) se efectúa con Triton X-100, Polisorbato 80 (Tween 80), TnBP y/o ácido caprílico o caprilato, preferiblemente a concentraciones finales de \geq 0,1% (p/p) de Triton y Tween 80, \geq 0,03% (p/p) de TnBP,
\geq 0,1 mM de ácido caprílico o caprilato, con un tiempo de incubación de \geq 0,1 horas, preferiblemente \geq 1 hora, a
\geq 4ºC, especialmente a \geq 15ºC.

5. El procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la concentración de sal de la disolución es llevada hasta \geq 0,5 M en el paso (c) y las partículas formadas de ese modo se eliminan preferiblemente mediante filtración.

6. El procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se lleva a cabo la cromatografía sobre materiales cromatográficos hidrófobos.

7. El procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se lleva a cabo un tratamiento de la fracción que contiene A1AT con un material que contiene heparina en una forma inmovilizada (gel de heparina).

8. El procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que se lleva a cabo un paso adicional de inactivación de los virus con posterioridad, de preferencia pasteurización en la presencia de \geq 0,5 M de citrato de sodio, aminoácidos, azúcares o mezclas de los mismos.

9. El procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la fuerza de los iones de la disolución se reduce, de preferencia por medio de ultra/diafiltración.

10. El procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se lleva a cabo una separación de las partículas de los virus, de preferencia mediante nanofiltración, de preferencia con filtros que tienen tamaños de poro de 15-20 nm.

11. El procedimiento conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la fracción de A1AT obtenida se almacena como una preparación líquida, congelada o liofilizada.