ES2319259T3

ES2319259T3 - Antagonistas de canales calcicos de tipo n para el tratamiento del dolor.

Info

Publication number: ES2319259T3
Application number: ES01981242T
Authority: ES
Inventors: Marc Chapdelaine; Lucius Kemp; John Mccauley
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2000-11-06
Filing date: 2001-10-31
Publication date: 2009-05-06
Anticipated expiration: 2021-10-31
Also published as: US20040053965A1; AU2002212897A1; SE0004056D0; ATE421502T1; EP1339690B1; EP1339690A1; DE60137534D1; US6841680B2; JP2004513118A; WO2002036569A1

Abstract

Cualquier compuesto de acuerdo con el diagrama estructural I, ** ver fórmula** en el que: R 1 es halofenilo; R 2 es NE 1 E 2 , donde E 1 se selecciona entre hidrógeno y alquilo C 1-3 y E 2 se selecciona entre alquilo C 1-3 y (CH 2) nfenilo, donde n se selecciona entre 1, 2 ó 3, y R 3 se selecciona entre fenilo, 1,3-benzodioxolilo y fenilo sustituido con uno, dos o tres restos seleccionados independientemente de halo, alquilo C1-3, perhaloalquilo C1-3, HC(O)-, alcoxi C1-3 y alquil(C1-3)carbonilo.

Description

Antagonistas de canales cálcicos de tipo N para el tratamiento del dolor.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a compuestos y métodos para el tratamiento o prevención del dolor o nocicepción.

Técnica relacionada

El dolor causa mucho sufrimiento y es una experiencia sensorial distinta a las sensaciones de tacto, presión, calor y frío. Es descrito a menudo por los que lo padecen mediante términos como vivo, sordo, persistente, punzante, cortante o ardiente, y se considera generalmente que incluye tanto la sensación original como la reacción a esa sensación. Este intervalo de sensaciones, así como la variación en la percepción del dolor por individuos diferentes, hace difícil una definición precisa del dolor. Donde el dolor es causado por la estimulación de receptores nociceptivos y transmitido sobre rutas neuronales intactas, esto se denomina dolor nociceptivo. El dolor también puede ser causado por un daño en las estructuras neuronales, y el dolor se manifiesta a menudo como supersensibilidad neuronal; este tipo de dolor se denomina dolor neuropático.

El nivel de estimulación al cual se percibe dolor se denomina "umbral de dolor". Donde se eleva el umbral de dolor, por ejemplo, mediante la administración de un fármaco analgésico, se requiere una mayor intensidad o un estímulo más prolongado antes de que se experimente dolor. Los analgésicos son una clase de agente farmacéutico que, después de la administración a un paciente necesitado de tal tratamiento, alivia el dolor sin pérdida de conciencia. Esto está en contraste con otros fármacos aliviadores del dolor, por ejemplo, anestésicos generales que reducen el dolor produciendo un paréntesis en la conciencia, o anestésicos locales que bloquean la transmisión en las fibras nerviosas periféricas impidiendo de este modo el dolor.

Se ha informado de que los antagonistas de las taquicininas inducen antinocicepción en animales, lo que se cree que es análogo a la analgesia en el hombre (para una revisión, véase Maggi et al, J. Auton. Pharmacol. (1993) 13, 23-93). En particular, se ha demostrado que los antagonistas del receptor NK-1 no peptídicos producen tal analgesia, así, por ejemplo, en ensayos clásicos de quimio-nocicepción (ensayo del retorcimiento de dolor inducido por fenilbenzoquinona y de la formalina) el antagonista del receptor NK-1 RP 67.580 produjo analgesia con una potencia comparable a la de la morfina (Garret et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 88, 10208-10212).

Los analgésicos opioides son una clase bien establecida de agentes analgésicos. Se acepta generalmente que estos compuestos incluyen, en un sentido genérico, todos los fármacos, naturales o sintéticos, con acciones similares a la de la morfina. Los analgésicos opioides sintéticos y semisintéticos son derivados de cinco clases químicas de compuestos: fenantrenos; fenilheptilaminas; fenilpiperidinas; morfinanos; y benzomorfanos. Farmacológicamente, estos compuestos tienen diversas actividades, así, algunos son fuertes agonistas en los receptores opioides (p.ej. morfina); otros son agonistas moderados a leves (p.ej. codeína); aún otros exhiben una actividad mixta agonista-antagonista (p.ej. nalbufina); y aún otros son agonistas parciales (p.ej. nalorfina). Aunque un agonista opioide parcial tal como la nalorfina, (el análogo N-alquilo de la morfina) antagonizará los efectos analgésicos de la morfina, cuando se da solo puede ser un potente analgésico por sí mismo. De todos los analgésicos opioides, la morfina sigue siendo el más ampliamente usado y es un compuesto arquetípico adecuado. Por desgracia, aparte de sus útiles propiedades terapéuticas, la morfina también tiene varios inconvenientes, que incluyen depresión respiratoria, motilidad gastrointestinal disminuida (que da como resultado estreñimiento) y, en algunos individuos, se pueden producir náuseas y vómitos. Otra característica es el desarrollo de tolerancia y dependencia física, que pueden limitar el uso clínico de tales compuestos.

Los compuestos antiinflamatorios dirigidos a bloquear o reducir la inflamación sinovial, y de este modo mejorar la función, y los analgésicos dirigidos a reducir el dolor, son en la actualidad el principal método de tratamiento de las enfermedades reumatoides y la artritis. La aspirina y otros compuestos de salicilato se usan frecuentemente en el tratamiento para interrumpir la amplificación del proceso inflamatorio y reducir temporalmente el dolor. Otros compuestos farmacológicos usados para estos fines incluyen derivados del ácido fenilpropiónico, tales como Ibuprofeno y Naproxina, Sulindaco, fenilbutazona, corticosteroides, antimaláricos tales como cloroquina y sulfato de hidroxicloroquina, y fenematos. Para una revisión completa de diversos fármacos utilizados en el tratamiento de las enfermedades reumáticas, se hace referencia a J. Hosp. Pharm., 36:622 (mayo de 1979).

Los canales del calcio son proteínas que abarcan la membrana, de subunidades múltiples, que permiten la entrada controlada de iones Ca^{++} en las células desde el fluido extracelular. Tales canales se encuentran en todo el reino animal, y han sido identificados en células bacterianas, fúngicas y vegetales. Comúnmente, los canales del calcio son dependientes del voltaje. En tales canales, la apertura permite un flujo de entrada inicial de iones Ca^{++} a las células, lo que disminuye la diferencia de potencial entre el interior de la célula que tiene el canal y el medio extracelular que baña la célula. La velocidad del flujo de entrada de iones Ca^{++} a la célula depende de esta diferencia de potencial. Todas las células "excitables en animales", tales como las neuronas del sistema nervioso central ("SCN"), células nerviosas periféricas y células musculares, incluyendo las de los músculos esqueléticos, músculos cardíacos y músculos lisos venosos y arteriales, tienen canales de calcio dependientes del voltaje. Los canales del calcio son fisiológicamente importantes, porque los canales tienen un papel central en la regulación de los niveles de los iones Ca^{++} intracelulares. Estos niveles son importantes para la viabilidad y función celulares. Así, las concentraciones intracelulares del ión Ca^{++} están implicadas en varios procesos vitales en animales, tales como la liberación de neurotransmisores, la contracción muscular, la actividad del nodo sinoatrial y la secreción de hormonas.

Se cree que los canales del calcio son relevantes en ciertos estados de enfermedad. Se piensa que varios compuestos útiles en el tratamiento de diversas enfermedades cardiovasculares en animales, incluyendo los seres humanos, ejercen sus efectos beneficiosos modulando funciones de los canales de calcio dependientes del voltaje presentes en el músculo liso cardíaco y/o vascular. Muchos de estos compuestos se unen a los canales del calcio y bloquean, o reducen la velocidad de, el flujo de entrada de los iones Ca^{++} en las células en respuesta a la despolarización de la membrana celular. Una comprensión de la farmacología de los compuestos que interactúan con los canales del calcio en otros sistemas de órganos, tales como el sistema nervioso central, y la capacidad de diseñar racionalmente compuestos que interactúen con estos subtipos específicos de canales del calcio humanos para tener efectos terapéuticos deseados, p.ej., tratamiento de trastornos neurodegenerativos, han sido dificultados por una incapacidad de determinar independientemente cuántos tipos diferentes de canales del calcio existen o la naturaleza molecular de los subtipos individuales, particularmente en el SNC, y la no disponibilidad de preparaciones puras de subtipos de canal específicos, es decir, sistemas para evaluar la especificidad de compuestos con efectos sobre los canales del
calcio.

Se han detectado múltiples tipos de canales del calcio en base a estudios electrofisiológicos y farmacológicos de diversas células mamíferas de diversos tejidos (p.ej., músculo esquelético, músculo cardíaco, pulmón, músculo liso y cerebro), Bean, B. P., Annu Rev. Physiol. 51:367-384 (1989) y Hess, P., Annu. Rev. Neurosci. 56:337 (1990). Estos diferentes tipos de canales del calcio han sido catalogados de manera amplia en cuatro clases, tipo L, T, N y P, distinguidos por la cinética de corriente, la sensibilidad al potencial basal y la sensibilidad a agonistas y antagonistas de los canales del calcio. Se han propuesto cuatro subtipos de canales del calcio neuronales dependientes del voltaje, Swandulla, D. et al., Trends Neurosci 14:46 (1991). Los canales de tipo L, N y P han sido implicados cada uno en la nocicepción, pero sólo el canal de tipo N ha sido implicado consistentemente en el dolor agudo, persistente y neuropático. Una versión sintética de la \omega-conotoxina MVIIA, un péptido de 25 aminoácidos derivado del veneno del caracol marino piscívoro Conus magus, se ha usado por vía intratecal en seres humanos y tiene una tasa de éxito de \sim85% para el tratamiento del dolor, con una mayor potencia que la morfina.

Aunque las terapias con fármacos conocidas tienen utilidad, hay inconvenientes a su uso. Por ejemplo, pueden hacer falta hasta seis meses de uso consistente de algunas medicaciones para que el producto tenga efecto en el alivio del dolor del paciente. Por consiguiente, un sujeto particular puede estar recibiendo tratamiento y continuar sufriendo durante hasta seis meses antes de que el médico pueda evaluar si el tratamiento es eficaz. Muchos fármacos existentes tienen además efectos secundarios adversos sustanciales en ciertos pacientes, y por tanto se debe hacer un seguimiento cuidadoso de los sujetos. Adicionalmente, la mayoría de los fármacos existentes llevan sólo un alivio temporal a los enfermos y deben ser tomados consistentemente en una base diaria o semanal para un alivio continuado. Finalmente, con la progresión de la enfermedad, la cantidad de medicación necesitada para aliviar el dolor puede aumentar, aumentando así el potencial para efectos secundarios. Por tanto, hay aún una necesidad de un tratamiento eficaz y seguro para aliviar el dolor.

Chemical Abstracts, vol. 106, nº 21, 25 de mayo de 1987, resumen nº 17614V, XP002908046, describe derivados de quinolina que tienen propiedades analgésicas. Estos derivados de quinolina, sin embargo, tienen un patrón de sustitución diferente.

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Compendio de la invención

En un aspecto, la presente invención proporciona compuestos que tienen una acción selectiva en los canales del calcio de tipo N y que son útiles para el tratamiento del dolor.

Los compuestos de la presente invención que muestran acción selectiva en los canales del calcio de tipo N son compuestos de acuerdo con el diagrama estructural I,

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1

en el que:

\quad: R^{1} es halofenilo;

\quad: R^{2} es NE^{1}E^{2}, donde E^{1} se selecciona entre hidrógeno y alquilo C_{1-3} y E^{2} se selecciona entre alquilo C_{1-3} y (CH_{2})_{n} fenilo, donde n se selecciona entre 1, 2 ó 3, y

\quad: R^{3} se selecciona entre fenilo, 1,3-benzodioxolilo y fenilo sustituido con uno, dos o tres restos seleccionados independientemente de halo, alquilo C_{1-3}, perhaloalquilo C_{1-3}, HC(O)-, alcoxi C_{1-3} y alquil(C_{1-3})carbonilo.

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Los compuestos particulares de la invención son aquellos en los que:

\quad: R^{1} es fluorofenilo;

\quad: R^{2} es NE^{1}E^{2}, donde E^{1} se selecciona entre hidrógeno y metilo, y E^{2} es metilo, y

\quad: R^{3} se selecciona entre fenilo, 1,3-benzodioxol-5-ilo y fenilo sustituido con uno, dos o tres restos seleccionados independientemente de cloro, fluoro, metilo, etilo, metoxi, etoxi, trifluorometilo, HC(O)-, y CH_{3}C(O)-.

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Son compuestos particulares de la invención aquellos en los que:

\quad: R^{1} es 3-fluorofenilo;

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Los compuestos más particulares de la invención son los ejemplificados en la presente memoria.

En otro aspecto, la invención comprende el uso de los compuestos acordes con el diagrama estructural I para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor, administrando una cantidad eficaz aliviadora del dolor de cualquiera de tales compuestos.

Una realización de la invención comprende el uso de los compuestos acordes con el diagrama estructural I para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor agudo, persistente o neuropático.

En un aspecto adicional, la invención comprende métodos para preparar compuestos de acuerdo con el diagrama estructural I.

En aún otro aspecto, la invención comprende composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de acuerdo con el diagrama estructural I junto con excipientes, diluyentes o estabilizantes, como se describe adicionalmente en la presente memoria, útiles para el tratamiento del dolor agudo, persistente o neuropático.

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Descripción detallada de la invención

Los compuestos de la invención son aquellos que están dentro del alcance de la descripción genérica y particularmente aquellos compuestos ejemplificados más adelante.

Las sales adecuadas farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención incluyen sales de adición ácida tales como metanosulfonato, fumarato, hidrocloruro, hidrobromuro, citrato, tris(hidroximetil)aminometano, maleato y sales formadas con ácido fosfórico y ácido sulfúrico.

Donde los compuestos de la presente invención posean un centro quiral es de entender que la invención abarca todos los isómeros ópticos y diastereoisómeros de tales compuestos.

Donde los compuestos de la presente invención puedan tautomerizarse, es de entender que la invención abarca todas las formas tautoméricas de tales compuestos. Donde los compuestos de la presente invención puedan existir en formas no solvatadas así como solvatadas tales como, por ejemplo, formas hidratadas, es de entender que la invención abarca todas las tales formas solvatadas y no solvatadas.

Otro aspecto de la invención proporciona procedimientos para preparar los compuestos de la invención, como sigue:

a): hacer reaccionar una acetofenona sustituida acorde con el diagrama estructural II con anhídrido acético e hidruro de sodio para formar un éster etílico del ácido 3-oxo-propiónico acorde con el diagrama estructural III, como sigue:

2

b): hacer reaccionar un compuesto del diagrama estructural III con 4-bromoanilina para formar un éster butílico del ácido 3-(4-bromofenilamino)acrílico sustituido en 3 acorde con el diagrama estructural IV, como sigue:

3

c): ciclar un compuesto del diagrama estructural IV para formar una 6-bromo-4-hidroxi-quinolina sustituida en 2 acorde con el diagrama estructural V, como sigue:

4

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d): clorar un compuesto del diagrama estructural V para formar un compuesto acorde con el diagrama estructural VI, como sigue:

5

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e): reemplazar de manera selectiva el resto de cloro de un compuesto del diagrama estructural VI para formar un compuesto acorde con el diagrama estructural VII, como sigue:

6

f): reemplazar de manera selectiva el resto de bromo de un compuesto del diagrama estructural VII por reacción con un ácido borónico sustituido para formar un compuesto acorde con el diagrama estructural I, como sigue:

7

\quad: en donde, si fuera necesario, en las etapas a), b), c), d), e) y f) cualquier grupo funcional se protege con un grupo protector, y después de esto,

g): retirar cualquier dicho grupo protector;

h): convertir un compuesto acorde con el diagrama estructural I en otro compuesto acorde con el diagrama estructural I mediante los procedimientos descritos en los Métodos A a L en la presente memoria, y

i): purificar dicho compuesto del diagrama estructural I hasta el punto necesario y, si fuera necesario, formar una sal farmacéuticamente aceptable.

Para usar un compuesto de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para el tratamiento terapéutico, que puede incluir tratamiento profiláctico, del dolor en mamíferos, que pueden ser seres humanos, el compuesto se puede formular de acuerdo con la práctica farmacéutica estándar como una composición farmacéutica. Por consiguiente, un aspecto adicional de la invención proporciona una composición farmacéutica que contiene un compuesto del diagrama estructural I como se define en la presente memoria o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con un aditivo farmacéuticamente aceptable tal como un excipiente o vehículo.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas que contienen un compuesto de la invención se pueden administrar de maneras convencionales, por ejemplo por administración oral, tópica, parenteral, bucal, nasal, vaginal o rectal, o por inhalación. Para estos fines un compuesto de la invención se puede formular por medios conocidos en la técnica, en forma de, por ejemplo, comprimidos, cápsulas, disoluciones acuosas u oleosas, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, geles, atomizadores nasales, supositorios, polvos finamente divididos o aerosoles para inhalación, y para uso parenteral (incluyendo intravenoso, intramuscular o infusión) disoluciones o suspensiones estériles acuosas u oleosas o emulsiones estériles. Una ruta preferida de administración es por vía oral, por comprimido o cápsula.

Además de un compuesto de la presente invención, una composición farmacéutica de esta invención también puede contener uno o más de otros agentes farmacológicamente activos. Alternativamente, una composición farmacéutica que contiene un compuesto de esta invención se puede coadministrar simultánea o secuencialmente con uno o más de otros agentes farmacológicamente activos compatibles.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención se administrarán normalmente para que el sujeto reciba una dosis diaria eficaz aliviadora del dolor. La dosis diaria se puede dar en dosis divididas como sea necesario, dependiendo la cantidad precisa de compuesto recibido y la ruta de administración del peso, edad y sexo del paciente que es tratado y del estado de la enfermedad particular que es tratada de acuerdo con los principios conocidos en la técnica. Un régimen de dosificación preferido es una vez al día.

Aún otra realización más de la invención proporciona el uso de un compuesto del diagrama estructural I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento útil para unirse a los canales del calcio de tipo N en un animal de sangre caliente tal como un ser humano.

Aún otra realización de la invención proporciona el uso de un compuesto de la invención para unirse a los canales del calcio de tipo N en un animal de sangre caliente tal como un ser humano, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor, administrando a dicho animal una cantidad eficaz de un compuesto del diagrama estructural I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Un aspecto adicional de la invención proporciona una composición farmacéutica que incluye un compuesto de la presente invención como se define en la presente memoria o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con un aditivo farmacéuticamente aceptable tal como un excipiente o vehículo.

Un aspecto adicional más de la presente invención es un compuesto de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en terapia.

Definiciones

Cuando se usa en la presente memoria, "halo" o "halógeno" significa fluoro, cloro, bromo o yodo;

cuando se expresa en la presente memoria que los sustituyentes se "seleccionan de" o se "seleccionan independientemente de" un grupo de restos, es de entender que están incluidos aquellos compuestos donde todos los sustituyentes son los mismos y los compuestos donde cada sustituyente es diferente;

cuando se usa en la presente memoria el término "alquilo" como en, por ejemplo, alquilo C_{1-6}, a menos que se defina de otro modo, incluye grupos alquilo de cadena tanto lineal como ramificada. Las referencias a grupos alquilo individuales, tal como "propilo", significan la forma normal, de cadena lineal, esto es, n-propilo;

cuando se usa en la presente memoria, un término tal como "alquilo C_{1-6}" significa grupos alquilo que tienen 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 átomos de carbono y grupos colectivos tales como alquilo C_{1-4} e incluye restos lineales y ramificados tales como metilo, etilo, isopropilo y t-butilo, de manera similar, un término tal como "alcoxi C_{1-3}" incluye restos particulares tales como metoxi, etoxi y propoxi, y los términos usados en la presente memoria que no estén definidos de otro modo se pretende que tengan su significado entendido convencionalmente.

Los Métodos y Ejemplos que siguen pretenden ilustrar pero no limitar la invención. En los Métodos y Ejemplos, a menos que se exprese de otro modo:

\quad: las concentraciones se llevaron a cabo por evaporación rotatoria a vacío;

\quad: las operaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente, esto es, en el intervalo 18-26ºC y en una atmósfera de nitrógeno;

\quad: la cromatografía en columna (por el procedimiento instantáneo) se realizó en sílice Merck Kieselgel (Art. 9.385);

\quad: los rendimientos se proporcionan con fines ilustrativos solamente y no son necesariamente los máximos alcanzables;

\quad: la estructura de los compuestos de la invención se confirmó de manera general por técnicas convencionales de NMR y de espectroscopía de masas, las multiplicidades de picos se muestran así: s, singlete; bs, singlete ancho; d, doblete; AB o dd, doblete de dobletes; t, triplete; dt, doblete de tripletes; m, multiplete; bm, multiplete ancho; Los datos FAB m/s se obtuvieron usando un espectrómetro Platform (suministrado por Micromass) funcionando en electropulverización y, donde fue apropiado, se recogieron datos de ión positivo o bien de ión negativo, en la presente memoria se proporciona (M+H)^{+};

\quad: la pureza de los compuestos intermedios fue evaluada en general por análisis m/s o NMR; y donde se usaron, las siguientes abreviaturas tienen los significados que siguen:

DCM: es diclorometano,

DMF: es N,N-dimetilformamida,

DMSO: es dimetilsulfóxido,

CDCl_{3}: es cloroformo deuterado,

FAB: es bombardeo de átomos rápidos,

m/s: es espectroscopía de masas o espectral de masas,

NMR: es Resonancia Magnética Nuclear,

NMP: es N-metilpirrolidinona, y

THE: es tetrahidrofurano.

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Métodos biológicos I. Ensayo FLIPR (Lector de Placas por Imagen de Láser Fluorescente) del canal N

Los métodos descritos en la presente memoria proporcionan una lectura de salida fiable basada en FLIPR de la eficacia y potencia con la que los compuestos de ensayo inhiben el flujo de calcio a través del canal del calcio de tipo N expresado en su forma nativa en una línea celular de neuroblastoma derivada del ser humano diferenciada químicamente a un fenotipo neuronal. El grado al cual un compuesto a una concentración particular inhibió el flujo de calcio en el canal N se determinó comparando la amplitud del aumento del pico de calcio en presencia del compuesto con un control de estímulo de K^{+} 80 mM en pocillos sin el compuesto. Los resultados obtenidos para este ensayo FLIPR se validaron de dos modos:

a): la toxina peptídica específica del canal N, conotoxina MVIIA, mostró una IC_{50} = 3 nM (determinada a partir del ajuste a un análisis de respuesta a la concentración de cinco puntos), compatible con el valor conocido en la bibliografía; y

b): los valores de la IC_{50} se determinaron para un juego de 18 moléculas pequeñas de una serie química principal (intervalo pIC_{50}: 4,67-7,02).

La potencia de estos mismos compuestos de ensayo como inhibidores de la corriente de calcio de tipo N también se determinó por medición electrofisiológica directa, bien en células IMR-32 neuronalmente diferenciadas, o bien en neuronas ganglionares cervicales superiores de rata recién aisladas. Las pIC_{50}s proporcionadas por las dos metodologías para el juego de compuestos fueron estrechamente comparables (r = 0,91; p<0,001).

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A. Cultivo celular

Se usó una línea celular inmortalizada, IMR32, derivada de células de neuroblastoma humanas obtenidas del ATCC (producto #CCL-127) para todos los experimentos. Las células se cultivaron en matraces T75 que contenían medio mínimo esencial de Eagle (MEM) con sales de Earle y aminoácidos no esenciales sin glutamina (Cat. #SLM-034-B, Specialty Media, Philipsburg, NJ), FBS al 10% y glutamina al 1%. Las células se cultivaron a una confluencia de -70-80% (por estimación microscópica visual) antes del subcultivo. Para mantener un cultivo reserva, los cultivos se dividieron en una relación de 1:3-1:4 creando una suspensión de células por trituración, y pipeteando un volumen de la suspensión de células suficiente para dar esta relación final en matraces nuevos que contenían -20 ml de medio nuevo. El subcultivo se realizó generalmente dos veces por semana. Para la preparación de placas de 96 pocillos (de paredes negras; Cat # 3603, Costar Co., Cambridge, MA), un matraz T75 que contenía células de la confluencia deseada se llevó hasta un volumen de 120 ml con el medio. Después las células fueron liberadas por trituración, y la suspensión de células se puso en placas de 12-96 pocillos para dar un volumen de pocillo final de 100 \mul.

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B. Diferenciación de las células a fenotipo neuronal

Las células fueron inducidas a diferenciarse en un medio de diferenciación que consistía en: MEM, FBS al 10%, glutamina al 1%, 2-butil-cAMP 1\muM (49,1 mg/100 ml de medio (Cat. # D-0627, Sigma Corp., St Louis, MO), y bromo-desoxi-uridina 2,5 mM (reserva: 30,7 mg/10 ml de medio, 25 ml de la reserva anterior/100 ml de medio; Sigma Cat. # B-9285). Para inducir la diferenciación, se trataron las células con medio de diferenciación (por cambio de medio completo) 2 días después de una puesta en placa inicial en placas de 96 pocillos. La confluencia en este momento fue \sim40%. Se realizó posteriormente cada 2-3 días un cambio de medio completo con medio de diferenciación recién preparado. Las células fueron expuestas a estas condiciones de diferenciación durante 6 a 11 días antes de ser usadas en los experimentos FLIPR.

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C. Disoluciones patrón experimentales

Se usaron disoluciones de la siguiente composición (en mM) en los experimentos (los Amortiguadores sin probenicida fueron adquiridos en Specialty Media (Amortiguadores A y B: Cat. # BSS053A; Amortiguadores C y D: Cat. # BSS056A).

Amortiguador A (amortiguador de primer lavado): amortiguador de Krebs-Ringer-HEPES (KRH): NaCl: 125, KCl: 5, MgSO_{4}: 1,2, KH_{2}PO_{4}: 1,2, CaCl_{2} 2H_{2}O: 2, Glucosa: 6, HEPES: 25, pH: 7,4 (pH ajustado con NaOH)

Amortiguador B (amortiguador de carga del tinte) amortiguador KRH con probenicida 2,5 \muM: el mismo que el amortiguador A, pero con probenicida añadida hasta la concentración final de 2,5 \muM. Probenecida (Cat. #P-8761, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) preparada como una disolución reserva a 250 mM.

Amortiguador C (amortiguador de lavado del tinte) amortiguador KRH con K^{+} 0 mM y probenicida 2,5 \muM: NaCl: 130, MgSO_{4}:1,2, NaH_{2}PO_{4}: 1,2, CaCl_{2} H_{2}O: 2, Glucosa: 6, HEPES: 25, pH: 7,4 (pH ajustado con NaOH).

Amortiguador D (amortiguador de dilución de compuestos): Amortiguador C con 0,1% p/v de albúmina de suero bovino (BSA; Sigma).

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D. Estándares farmacológicos y compuestos

Se usaron las siguientes disoluciones para obtener los datos descritos en la presente memoria.

- Nitrendipina: (RBI Chemicals, Natick, MA): Reserva: 10 mM en DMSO; Disolución de pipeteo: 9 \muM; pipetear 20 \mul en 120 \mul de volumen en pocillo para concentración de pocillo final: 1 \muM.

w-Conotoxina MVIIA: (Cat. # H-8210; Bachem Inc., Torrance, CA): Reserva: 1 mM en H_{2}O de calidad HPLC con BSA al 0,1%; Disolución de pipeteo: 4,5 \muM; pipetear 20 \mul en 140 \mul de volumen en pocillo para concentración de pocillo final: 1 \muM.

Preparación de la reserva y disoluciones de compuestos de ensayo: Compuestos preparados diariamente como reservas a 10 mM en 100% de DMSO; Disolución de pipeteo: 45 \muM o diluciones seriadas de la misma; pipetear 20 \mul en 140 \mul de volumen en pocillo para concentración de pocillo final: 1 \muM o diluciones a 10 veces de la misma.

Disolución de alto contenido en potasio (despolarización): Amortiguador C con K^{+} 240 mM añadido; pipetear 80 \mul en 160 \mul de volumen en pocillo para una concentración de pocillo final de 80 mM de K^{+}.

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E. Carga de las células con tintes fluorescentes

Preparación de las disoluciones de tintes fluorescentes: Se usó un tinte indicador del calcio, Fluo-4, éster acetilmetílico (Fluo 4-AM; Cat. # F-124201; Molecular Probes, Eugene, OR) para medir los cambios en el calcio libre intracelular con FLIPR. Se preparó una disolución reserva de Fluo-4 AM 1 mM por disolución en DMSO. Después esta reserva se diluyó a 4,6 \muM con Amortiguador B (disolución de trabajo de Fluo-4 AM).

Procedimiento de carga de las células: Las placas que contenían las células se lavaron con Amortiguador A usando un lavador de células automatizado (Modelo #: 5161552, Labsystems Oy, Helsinki, Finlandia) con los controles ajustados a los siguientes parámetros: altura de celda: C/D; pulso de celda: 4/5, lavados: 3; volumen: 5; ajuste en posición SECO. Estos ajustes dieron como resultado una profundidad residual de 70 \mul de amortiguador sobre las células en cada pocillo. Después se añadieron 100 \mul de la disolución de trabajo de Fluo-4 AM a cada pocillo, dando como resultado una concentración final de Fluo-4 AM de 2,7 \muM. Se incubaron las células en esta disolución a 37ºC durante 1-1,5 h. Después se lavaron las células con Amortiguador C cinco veces, usando el lavador de células con los mismos parámetros que los lavados de precarga anteriores, con las excepciones de: lavados: 5; ajuste en posición HÚMEDO. Después se realizó un lavado final cambiando los parámetros como sigue: lavados: 1; volumen: 2. Esto dio como resultado un volumen de pocillo final de 120 \mul. Se dejaron equilibrar las células bajo estas condiciones durante 10 min, y después se usaron en el protocolo FLIPR.

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F. Protocolo FLIPR

Instrumentación: Los cambios en tiempo real en el calcio libre intracelular en respuesta a la despolarización inducida por potasio en ausencia o presencia de inhibidores del canal N putativos se midieron bien por un instrumento FLIPR I o bien FLIPR II (configurado para un formato de 96 pocillos) (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se usaron ajustes y protocolos idénticos con cada instrumento, y los resultados obtenidos de los dos instrumentos fueron indistinguibles para un juego de compuestos estándar de referencia.

Ajustes de hardware de FLIPR: La potencia del láser se ajustó a aproximadamente 0,3 watios. La longitud de onda de excitación se ajustó a un pico de 488 nm, y la longitud de onda de emisión a 540 nm. La apertura de la cámara se ajustó a 2. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (20-22ºC).

Diseño de placa - señales de referencia: Ciertos pocillos en cada placa fueron destinados a estándares para determinar la señal fluorescente específica mínima y máxima contra la cual se normalizaron los efectos inhibitorios de los compuestos. Los estándares de referencia fueron distribuidos en ubicaciones de la placa que incluían pocillos de bordes e interiores.

Señal máxima (canal N + no específicos): Se incubaron 12 pocillos en una disolución de nitrendipina (1 \muM) y se añadió K^{+} 80 mM para determinar el aumentó máximo de Ca^{2+} mediado por los canales N + no específicos (aumento de la fluorescencia no mediado por L ni N). El coeficiente de variación entre estos pocillos para el aumento de pico provocado por K^{+} en unidades de fluorescencia fue típicamente menor que 12%.

Señal mínima (no específica): Se incubaron 6 pocillos en nitrendipina (1 \muM) + w-conotoxina MVIIA y se añadió K^{+} 80 mM para determinar el Ca^{2+} de fondo con todos los canales N farmacológicamente ocluidos. El componente de señal pico no específica fue típicamente menor que 15% de la amplitud de pico de señal máxima.

Molécula pequeña de referencia del canal N: Un compuesto que había sido caracterizado extensamente con respecto a la actividad inhibitoria del canal N tanto en FLIPR como electrofisiología de pinzamiento zonal ("Patch Clamp") se incluyó en cada placa por triplicado a 1 \muM (cerca de la IC_{50}) para establecer un punto de referencia.

Compuestos de ensayo: Se evaluó la potencia de 5 compuestos de ensayo en cada placa. Cada compuesto se ensayó a 5 concentraciones crecientes que abarcaban unidades semilogarítmicas y que alcanzaron típicamente una concentración máxima de 10 \muM. Cada concentración se ensayó en pocillos triplicados.

Estructura de protocolo: El protocolo FLIPR se configuró como tres secuencias de adición/muestreo de disolución (véase más adelante). Se añadió conotoxina (1 \muM de conc. final) a pocillos apropiados antes de poner la placa en el instrumento FLIPR. Los pocillos contenían inicialmente un volumen de disolución total de 100 \mul, y después de las tres adiciones de disolución contenían 240 \mul. La opción de mezcla activa (por la pipeta) no se usó en ninguna secuencia.

Secuencia de adición de nitrendipina: 28 s de duración total con muestreo de señal de fluorescencia a 1 Hz durante 2 s, seguido de la adición de 20 \mul de disolución patrón de nitrendipina a 10 \mul/s, seguido de muestreo a 0,5 Hz durante 24 s.

Secuencia de adición de compuesto de ensayo: 64 s de duración total con muestreo a 0,5 Hz durante 4 s, adición de la disolución de ensayo de 40 \mul a 20 \mul/s, seguido de muestreo a 0,2 Hz durante 60 s.

Secuencia de incubación del compuesto, despolarización de las células y lectura de salida del calcio: 1024 s de duración total con muestreo a 0,0167 Hz durante 840 s, seguido de adición de 80 \mul de disolución de alto contenido en K^{+} (despolarización), seguido de muestreo a 1 Hz durante 180 s. Este intervalo de muestreo final de 180 s representó así el tiempo en el que se produjo el aumento de pico en el calcio intracelular debido al flujo a través de canales N activados.

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G. Análisis de datos

Software de FLIPR: Antes de la exportación, los datos fueron normalizados dentro del módulo de software de FLIPR para dos efectos.

Corrección de línea de base: La línea de base fue corregida poniendo a cero a la muestra nº 57 (inmediatamente antes de la adición de KCl). Esta normalización sirvió para corregir la compensación del eje y del trazo fluorescente de cada pocillo de tal modo que todos los trazos tuvieron un punto común justo antes del inicio del aumento fluorescente relevante provocado.

Factor de corrección de la uniformidad espacial: Los datos fueron normalizados por un procedimiento que calcula una media sobre la placa de unidades fluorescentes a partir de la primera muestra, y después multiplica los datos de cada pocillo por un escalar que ajusta el valor de la primera muestra a este valor medio, normalizando así las diferencias en fluorescencia absoluta de línea de base entre los pocillos causada por diferencias en densidades de células o carga del tinte.

Software externo: Los datos fueron exportados de FLIPR a Excel como ficheros de extensión "*.squ". Después de la exportación, se realizaron operaciones en Excel para calcular la amplitud de pico máxima (relativa a la línea de base llevada a cero) del aumento de fluorescencia que sigue a la adición de potasio en cada pocillo. Las medidas de los pocillos en los que se añadió un compuesto de ensayo fueron normalizadas después como un porcentaje entre las amplitudes medias desde los pocillos de referencia que proporcionaban los componentes de señal máxima (100%) y no específica (0%), como se describe anteriormente. Se consideró que el tanto por ciento de inhibición resultante por los compuestos de ensayo reflejaba la inhibición del flujo de calcio en el canal de tipo N.

II. Ensayo FLIPR del canal L

Los métodos descritos a continuación proporcionaron una lectura de salida fiable basada en FLIPR de la eficacia y potencia con las que los compuestos de ensayo inhibieron el flujo de calcio a través del canal del calcio de tipo L expresado de forma nativa en una línea celular de neuroblastoma derivada de seres humanos, SK-N-SH. El grado al que una concentración de un compuesto dado inhibió el canal L se determinó comparando el aumento de la amplitud de pico del calcio para un estímulo con K^{+} 80 mM en el pocillo de ensayo con el aumento de pico en pocillos sin compuesto. El ensayo fue validado obteniendo curvas concentración-respuesta de 5 puntos, y determinando de este modo los valores IC_{50} para los bloqueadores del canal L de referencia, nitrendipina (30 nM), nifedipina y verapamilo. Estos valores fueron compatibles con los valores conocidos en la bibliografía para estos agentes para bloquear el flujo de Ca^{2+} a través del canal L.

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A. Cultivo celular

Se usó una línea celular inmortalizada, SK-N-SH, derivada de células de neuroblastoma humanas (producto ATCC # HTB-11) para todos los experimentos. Se cultivaron las células en matraces T75 que contenían medio mínimo esencial de Eagle (MEM) con sales de Earle, con aminoácidos no esenciales 0,1 mM, piruvato de sodio 1,0 mM y suero bovino fetal al 10% (FBS; Cat. # SLM-034-B, Specialty Media). Las células se cultivaron a una confluencia de 100% (por estimación microscópica visual) antes del subcultivo. Las células fueron subcultivadas a una relación de 1:3 aclarando primero con 3 ml de PBS, reemplazando el PBS con PBS que contenía tripsina al 0,25% hasta que las células se despegaron de la superficie. Después se añadió 1 ml de la suspensión resultante a un nuevo matraz que contenía 10 ml de medio nuevo. Después se incubaron las células (37ºC, 5% de CO_{2}), y se cambiaron los medios aproximadamente 3 días después del subcultivo.

B. Preparación de las células para los experimentos

Las células usadas para los experimentos estuvieron en una fase de crecimiento de 100% de confluencia. Cada matraz proporcionó suficientes células para tres placas de 96 pocillos. Las células fueron despegadas del matraz por adición de tripsina al 0,25%, como se describe para el protocolo de subcultivo. Una vez despegadas, se añadieron 7 ml de medio nuevo al matraz, y se trituró suavemente la disolución. Después se añadieron 20 ml de medio adicionales, y después se añadieron 100 \mul de esta suspensión de células final a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Antes del uso en los experimentos se incubaron las placas a 37ºC en 5% de CO_{2} hasta que las células alcanzaron el 100% de confluencia (1-2 días).

C. Procedimientos experimentales

La composición de disoluciones, ajustes de hardware, diseño de placas, estructure del protocolo FLIPR y ajustes y procedimientos analíticos fueron idénticos a los descritos en la presente memoria para los ensayos del canal N, con las siguientes diferencias en cuanto al diseño de placas y señales de referencia.

Señal máxima (canal L+ no específica): 12 pocillos recibieron 20 \mul de adición de amortiguador solamente (sin nitrendipina) en la primera secuencia de adición de disolución para definir el aumento de Ca^{2+} máximo provocado por K^{+} mediado por los canales L + no específico (aumento de la fluorescencia no mediada por el canal L). El coeficiente de variación entre estos pocillos para el aumento de pico provocado por K^{+} en unidades de fluorescencia fue típicamente menor que 12%.

Señal mínima (no específica): Se incubaron 6 pocillos en nitrendipina (1 \muM), seguido de K^{+} 80 mM añadido para determinar el Ca^{2+} de fondo con todos los canales L farmacológicamente ocluidos. El componente de señal pico no específica fue típicamente menor que 15% de la amplitud de pico de señal máxima.

Molécula pequeña de referencia del canal L: Se incluyó nitrendipina en pocillos triplicados en cada placa a 30 nM (cerca de la IC_{50}) para una lectura de salida de referencia.

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III. Electrofisiología de pinzamiento zonal del canal N

Se usaron técnicas convencionales de registro de células enteras para medir directamente la capacidad de los compuestos de ensayo de inhibir la corriente de Ca^{2+} a través de los canales del calcio de tipo N. Las corrientes de tipo N se registraron a partir de tanto células IMR-32 neuronalmente diferenciadas como neuronas nativas recientemente disociadas de ganglios cervicales superiores de ratas postnatales tempranas. Cada día, las corrientes en ambos tipos de célula fueron confirmadas como corrientes N, mostrando que más del 90% de la corriente de entrada total durante las etapas de despolarización fue bloqueada por una concentración supramáxima (3 mM) de w-conotoxina MVIIA. Adicionalmente, se determinó periódicamente que la potencia de la w-conotoxina MVIIA era aproximadamente 3 nM (IC_{50}), un valor consistente con el reportado en la bibliografía. Los resultados para un subconjunto de compuestos ensayados en ambos tipos de células no difirieron significativamente, con lo que los datos se consideran como un juego de datos a menos que se especifique de otro modo.

A. Cultivo y diferenciación de células IMR-32

Las células IMR32 se cultivaron y diferenciaron neuronalmente usando procedimientos idénticos a los descritos para el ensayo FLIPR de canales N, excepto que para la diferenciación las células se pusieron en platos de cultivo de plexiglás de 35 mm, en lugar de placas de 96 pocillos.

B. Disociación de neuronas de ganglios cervicales superiores (GCS) de rata

Se sometieron a eutanasia crías de rata de 7-10 días en una cámara que contenía una atmósfera con un alto contenido en CO_{2}. Inmediatamente, se aislaron quirúrgicamente GCSs, se retiraron y se pusieron en una disolución salina balanceada de Hank (HBSS) en baño de hielo. Los GCSs fueron desvainados, abiertos por corte y colocados en una disolución de HBSS que contenía 20 U/ml de papaína (37ºC) durante 15 min. Después la disolución de papaína se cambió por HBSS (37ºC) que contenía 16 mg/ml de dispasa y 400 U/ml de colagenasa durante 40 min con trituración suave del tejido cada 15 min. Después se recuperaron las células por centrifugación y se almacenaron en medio L-15 a 4ºC para el uso en el mismo día. Para el registro, se puso una gota de la disolución que contenía las células en un plato de cultivo de plexiglás de 35 mm revestido con poli-L-lisina, y se dejó que las células se adhirieran durante varios minutos.

C. Procedimientos electrofisiológicos

Disoluciones: Se adaptaron disoluciones de registro de las descritas por Thompson y Wong (1991) J. Physiol., 439: 671-689. Las disoluciones se almacenaron como alícuotas durante no más de un mes (intracelular, -20ºC, extracelular, 4ºC) antes de los experimentos. La disolución de pipeta (intracelular) contenía (en mM): TRIS, 130; CsBAPTA, 10; HEPES, 10; Mg^{2+}ATP, 5; pH hasta 7,3 con ácido metanosulfónico; osmolalidad -315 mOsm. La disolución extracelular contenía (en mM): TRIS 120; CsCl, 5; HEPES, 10; Mg^{2+}Cl, 1; Ba^{2+}Cl, 5, glucosa, 25; cloruro de tetraetilamonio, 15; tetrodotoxina, 200 (añadida en el momento del experimento); pH hasta 7,4 con ácido metanosulfónico; osmolalidad -320 mOsm.

Registro de células enteras y análisis: La configuración de pinzamiento del voltaje de células enteras de la técnica de pinzamiento zonal descrita por Hamill et al. (1981) Pflügers Arch. 391: 85-100, se empleó para aislar las corrientes de calcio dependientes del voltaje. Se pusieron los platos de cultivo que contenían las células en una cámara en la plataforma de un microscopio invertido. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (20-22ºC). Se fabricaron pipetas zonales a partir de vidrio de pared fina (1,5 mm OD, 1,12 mm ID; World Precision Instruments, New Haven, CN) en el Brown-Flaming P-86 puller (resistencia DC: 3-6 M\Omega; Sutter Instr. Co., Novato, CA). Se usó un amplificador Axopatch 1B (Axon Instruments, Foster City, CA) para obtener señales de corriente y este se conectó a un ordenador personal bien por una interfaz TL-1 (Scientific Solutions, Solon, OH) o bien Digidata 1200 (Axon Instr.). La señal de corriente fue balanceada a cero con la pipeta inmersa en el baño justo antes de formar un sello en la neurona. La resistencia del sello osciló de 1 a más que 10 G\Omega. La resistencia en serie fue usualmente menor que 10 M\Omega, y no fue compensada electrónicamente. La adquisición de datos digitalizados y los protocolos de etapas de voltaje se llevaron a cabo con el software pClamp 6.0 (Axon Instr). Los datos fueron filtrados a paso bajo a menos que una mitad de la tasa de muestreo digital antes de digitalizar. Para registrar corrientes de tipo N para la evaluación de la potencia inhibitoria de los compuestos (análisis de la concentración-respuesta en estado estacionario), se administraron etapas de voltaje de 200 ms a +10 mV a intervalos de 15 s desde un potencial basal de -90 mV. Las corrientes registradas fueron restadas de fugas en línea con un protocolo de subpulsos P-4 ó P-6 en el software pClamp. Para evaluar el bloqueo del canal abierto de los compuestos, se administraron etapas de voltaje de 10 ms a +10 mV a frecuencias variantes desde un potencial basal de 90 mV sin usar la substracción de fugas en línea. Estos protocolos de voltaje dieron ambos amplitudes de corriente de entrada constantes a lo largo de 5-10 minutos de registro. La amplitud del pico de corriente se analizó usando el módulo "ajuste de pinza" ("clampfit") del software pClamp. Se usó el software Origin 5.0 (Microcal Corp, Northampton, MA) para ajustar iterativamente los datos de concentración-respuesta a una función Hill estándar, y para proporcionar representaciones gráficas para los trazos de corriente y datos analizados.

Preparación y administración del fármaco/compuesto: Los compuestos de ensayo se prepararon como disoluciones de reserva 10 mM en DMSO, y se disolvieron volúmenes apropiados de estas disoluciones de reserva en amortiguador extracelular para dar las concentraciones deseadas. Se aplicaron localmente disoluciones que contenían los fármacos/compuestos desde cualquiera de seis tubos revestidos de vidrio dispuestos linealmente (200 mm o.d., Hewlett Packard, Wilmington, DE) posicionados a \sim100 mm de la neurona registrada. Cada disolución fue liberada del tubo deseado por un sistema de válvulas solenoides controlado electrónicamente (BME Systems, Baltimore, MD). Este sistema consiguió un equilibrado rápido (<100 ms) de la disolución del fármaco en la fase extracelular sin alterar las características del registro.

IV. Ensayo de la formalina

El ensayo de la formalina es un ensayo del dolor bien establecido (Dubuisson y Dennis, 1977; Wheeler-Aceto et al., 1990; Coderre et al., 1993) que evalúa los efectos inhibitorios de antagonistas del canal del calcio de tipo N administrados por vía oral sobre comportamientos nocifensivos inducidos por formalina en ratas. Este ensayo consiste en dos fases distintas de comportamiento inducido por formalina. La respuesta de primera fase, que se produce entre 0 y 5 minutos, es causada por nocicepción aguda al producto químico nocivo (formalina) inyectado en la pata. Esto es seguido por un periodo sin síntomas de entre 5 y 15 min después de la inyección. Una respuesta de segunda fase, que se produce después de 15 minutos y que dura hasta 60 minutos, es causada por sensibilización de las neuronas centrales en el asta dorsal. La sensibilización central aumenta la entrada aferente nociva y una descarga de dolor más fuerte es transmitida al cerebro. La inhibición de la respuesta de segunda fase es indicativa de un mecanismo central de la acción del fármaco.

El procedimiento para el ensayo de la formalina es como sigue: se ponen ratas macho en una cámara de plexiglás y se observan durante 30-45 min para observar su actividad de línea de base. Se pretratan grupos múltiples de animales bien con vehículo o bien diferentes dosis de un compuesto de ensayo. Los animales son dosificados con el fármaco de interés bien 40 min., si es por vía intraperitoneal, o bien 90 min., si es por vía oral, antes de la inyección de formalina en una pata trasera (bajo la piel dorsal; 0,05 ml de formalina estéril al 5%). El número de estremecimientos de la pata y lamidos durante la primera fase (0-5 min) y la segunda fase (20-35 min) son marcados y registrados. Las respuestas de estremecimientos y lamidos se calculan como porcentaje de inhibición comparado con la puntuación media de un grupo de control con suero salino. Las potencias del fármaco se expresan como la dosis que causa 50% del efecto inhibitorio máximo ("ID_{50}"). Se usan pruebas t de Student para el análisis estadístico para determinar la significancia de los efectos del fármaco. Los compuestos se consideran activos en base a su capacidad de inhibir la respuesta de estremecimiento.

V. Ensayo de lesión constrictiva crónica

El ensayo de Lesión Constrictiva Crónica ("LCC") o Modelo de Dolor Neuropático evalúa el dolor neuropático asociado con lesiones nerviosas que pueden surgir directamente de trauma y compresión, o indirectamente de enfermedades que abarcan desde infección a cáncer, dolencias metabólicas, toxinas, deficiencias nutricionales, disfunción inmunológica y cambios musculoesqueléticos. En el modelo LCC (Bennett y Xie, 1988) se produce una neuropatía periférica unilateral en ratas por ligación nerviosa parcial.

Se anestesian ratas Sprague-Dawley (250-350 g) con pentobarbital sódico y el nervio ciático común es expuesto a nivel de medio muslo por disección roma a través del bíceps femoral. Una sección del nervio (aproximadamente 7 mm), proximal a la trifurcación ciática, es expuesta y ligada 4 veces con sutura de tripa crómica. La sutura se ata con aproximadamente 1 mm de espacio entre ligaduras. La incisión se cierra en capas y se deja que se recobren los animales. Se mide la hiperalgesia térmica usando el ensayo de retirada de la pata (Hargreaves et al, 1988). La compresión nerviosa debida a la ligación nerviosa parcial causa latencias más cortas para la retirada de la pata comparado con la latencia de la retirada de pata de patas normales o de operación simulada. Los animales son habituados a un suelo de vidrio elevado. Se apunta una fuente de calor radiante a la pata trasera medio plantar (territorio del nervio ciático) a través del suelo de vidrio con un corte a los 20 segundos usado para impedir lesiones en la piel. Se registran las latencias para el reflejo de retirada en ambas patas. Las respuestas a los compuestos de ensayo se evalúan en diferentes tiempos después de la administración oral para determinar el inicio y duración del efecto del fármaco. Se realizan estudios de respuesta a la dosis con grupos múltiples de ratas LCC dosificadas por vía oral bien con vehículo o bien con el compuesto de ensayo durante 5 días. Las latencias de la retirada de la pata se miden cada día antes de la primera dosis diaria. Los análisis de datos se realizan por comparación de medias múltiples (ensayo de Dunnett) y las potencias de los fármacos se expresan como la dosis que causa 50% de la eficacia máxima ("EC_{50}").

Los compuestos de la invención se unen generalmente a los canales del calcio de tipo N con IC_{50}s, medidas en el ensayo FLIPR descrito en la presente memoria, de aproximadamente 10 \muM o menos. Por ejemplo, los compuestos de los Ejemplos 12, 13, 14, 15 y 16, exhiben respectivamente IC_{50}s de 10,53, 8,60, 8,82, 5,38 y 5,78.

Método químico ejemplar

El siguiente método describe la preparación de 6-(3,5-diclorofenil)-2-(3-fluorofenil)-N-metil-4-quinolinamina, el compuesto del Ejemplo 17, a continuación. Otros compuestos ejemplificados en la presente memoria se prepararon por procedimientos análogos a los descritos a continuación a partir de precursores adecuados de acetofenona sustituida y ácido borónico sustituido.

Éster etílico del ácido 3-(3-fluorofenil)-3-oxo-propiónico

En un matraz de fondo redondo de tres cuellos, de 2 l, equipado con un embudo de adición, entrada de nitrógeno, agitador magnético, camisa calefactora, termopar y condensador, se pusieron 21,7 g (0,543 moles) de una dispersión en aceite al 60% de hidruro de sodio. A esto se le añadió 1 l de hexano seco y la suspensión resultante se agitó durante 15 minutos. Se detuvo la agitación y se dejaron depositar los sólidos, y después el sobrenadante transparente que contenía el hexano y aceite disuelto se retiró mediante una cánula. Se añadió carbonato de dietilo (1 l) a los sólidos y se calentó la suspensión hasta 120ºC. A la suspensión caliente se le añadió cautelosamente gota a gota, a lo largo de 40 minutos, una disolución de 100 g (0,494 moles) de m-fluoroacetofenona disuelta en 250 ml de carbonato de dietilo. Según procedió la adición se inició una reacción, se desprendió hidrógeno y el color cambió a marrón claro. Después de completarse la adición del derivado de acetofenona, se calentó la reacción durante 1 hora adicional. La mezcla de reacción se enfrió y se vertió en un embudo separador de 2 l. La capa de carbonato de dietilo se lavó dos veces con una disolución de ácido acético al 10%, se secó sobre MgSO_{4} y se filtró. El producto se purificó por destilación a vacío (p.eb. 114-117ºC a 0,8-0,9 mm Hg) en 91% de rendimiento.

Éster butílico del ácido 3-(4-bromo-fenilamino)-3-(3-fluorofenil)-acrílico

En un matraz de fondo redondo de un solo cuello, de 1 litro, equipado con un aparato extractor Soxhlet con condensador, agitador magnético y entrada de nitrógeno se pusieron 50,25 g (0,183 moles) de éster etílico del ácido 3-(4-ciclohexil-fenil)-3-oxo-propiónico, 25 g (0,167 moles) de 4-bromoanilina, 1,55 g (0,008 moles) de sal hidrocloruro de 4-bromoanilina y 500 ml de n-butanol seco. En el dedal Soxhlet (33 x 118 mm) se pusieron tamices 4A altamente activados (bolas de 1,7-2,4 mm). Estos tamices se activan inmediatamente antes del uso a alto vacío con calentamiento (400ºC durante 30 min). Después la mezcla se llevó a reflujo de tal modo que el butanol retiró azeotrópicamente el agua, dirigiendo la reacción de equilibrio, y el agua fue retirada del butanol por los tamices antes de ser devuelta al frasco de extracción. Se dejó continuar la reacción durante 48 h. Fue necesario reemplazar la carga de tamices después de las primeras 24 h. La transesterificación al éster butílico junto con la retirada de etanol se produce al mismo tiempo que la formación de enamina. Después de 48 h se enfrió el frasco de reacción, después se puso en un congelador a -40ºC y se dejaron formar cristales a lo largo de 24 h. Los cristales se recogieron por filtración a vacío y los sólidos se lavaron con etanol frío. Después el producto se secó en una estufa de vacío para dar 73,8 g (98%) de la enamina deseada.

6-Bromo-2-(3-fluorofenil)-quinolin-4-ol

A un matraz de tres cuellos, de 3 l, equipado con agitador mecánico, adaptador Claisen que sostenía una sonda termopar y condensador de reflujo con entrada de nitrógeno, se le añadieron 0,75 l de Dowtherm A (una mezcla eutéctica de 26,5% de difenilo y 73,5% de óxido de difenilo) y se calentó el disolvente hasta 250ºC. A esto se le añadió cautelosamente en pequeñas porciones 77,0 gramos (0,215 moles) de éster butílico del ácido 3-(4-bromo-fenilamino)-3-(3-fluorofenil)-acrílico a lo largo del curso de 0,25 horas. La mezcla fue mantenida a 250ºC durante 1,5 horas y después se dejó enfriar hasta 90ºC a lo largo del curso de 2 horas. La mezcla se trató con 1,0 l de hexanos, y se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente mientras se agitaba durante una noche. Los sólidos marrón claro se recogieron por filtración por succión y se lavaron con tres porciones de 0,15 l de hexanos. Los sólidos se secaron a vacío a 50ºC durante una noche para dar 58,63 gramos (96,0%) del compuesto del título.

6-Bromo-4-cloro-2-(3-fluorofenil)-quinolina

En un matraz de fondo redondo de tres cuellos, de 500 ml, equipado con un condensador, agitador magnético y entrada de nitrógeno, se pusieron 5,2 g (16,3 mmoles) de 6-bromo-2-(3-fluorofenil)-quinolin-4-ol. A esto se le añadieron 15,2 ml (25,0 g, 163 mmoles, 10 equiv.) de oxicloruro de fósforo con agitación. Se calentó la mezcla hasta 110ºC durante 4 h. Al final de este tiempo se enfrió la reacción hasta la temperatura ambiente y se añadió agua cautelosamente, gota a gota, hasta que todo el POCl_{3} se consumió. El producto cristalizó del agua y los sólidos se recogieron por filtración. Los sólidos se lavaron con agua, se pusieron en un Erlenmeyer de 250 ml y se trituraron con agua. Después de la recogida por filtración, lavado con agua y secado en una estufa de vacío, se obtuvieron 4,6 g (84%) del producto.

N-[6-Bromo-2-(3-fluorofenil)-4-quinolinil]-N,N-dimetilamina

En un matraz de fondo redondo de tres cuellos, de 500 ml, equipado con agitador magnético, entrada de nitrógeno, salida de gases, condensador y baño calefactor, se pusieron 20 g (59,4 mmoles) de 6-bromo-4-cloro-2-(3-fluorofenil)-quinolina. El material se disolvió en 150 ml de N-metilpirrolidinona y se añadieron 250 ml de una disolución acuosa al 40% de dimetilamina a la mezcla en agitación. Después se calentó la reacción hasta 60ºC durante 48 h. Al final de este tiempo se enfrió la reacción, en 3 l de agua en un matraz Erlenmeyer de 4 l, y la mezcla se agitó hasta que se formaron sólidos. Los sólidos se recogieron por filtración a vacío y se secaron en una estufa de vacío. El producto fue recristalizado desde etanol en un congelador a -20ºC para dar 19,6 g (95%) de rendimiento del producto aminado.

La N-[6-bromo-2-(3-fluorofenil)-4-quinolinil]N,N-dimetilamina se preparó alternativamente como sigue. En una bomba Parr de 1 l equipada con agitación mecánica, termopar, calentador con controlador y manómetro de presión se pusieron 20 g (59,4 mmoles) de 6-bromo-4-cloro-2-(3-fluorofenil)-quinolina. A esto se le añadieron 350 ml de etanol y 350 ml de una disolución acuosa al 40% de dimetilamina. Se selló la bomba y después la mezcla agitada se calentó hasta 100ºC dando como resultado una presión de aproximadamente 1 MPa. Se continuó el calentamiento durante 24 h. Al final de este tiempo se dejó enfriar la reacción hasta la temperatura ambiente y después se ventiló. Después el contenido se vertió en 3 l de agua en un matraz Erlenmeyer de 4 l y se agitó la mezcla hasta que se formaron sólidos. Los sólidos se recogieron por filtración a vacío y después se secaron en una estufa de vacío. El producto en bruto se recristalizó desde etanol en un congelador a -20ºC para dar 18,15 g (92%) de rendimiento del producto aminado.

6-(3,5,Diclorofenil)-2-(3-fluorofenil)-N-metil-4-quinolinamina

A 0,4 g. (1,2 mmoles) de N-[6-bromo-2-(3-fluorofenil)-4-quinolinil]-N-metilamina se le añadieron 0,275 g. (1,45 mmoles) de ácido 3,5-diclorofenilborónico y una cantidad catalítica de tris(dibencilidenacetona)dipaladio (0), 0,0109 g (0,012 mmoles). La mezcla se disolvió en 7 ml de N-metil-2-pirrolidinona. Se disolvió carbonato de sodio, 0,105 g. (1,45 mmoles) en una cantidad mínima de agua y se añadió en una sola porción a la disolución de reacción de N-metil-2-pirrolidinona. Se calentó la mezcla hasta 80ºC durante 10 horas. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, la mezcla se diluyó hasta 10 ml de volumen total con metanol y se filtró a través de un tapón de sílice. El compuesto del título se aisló por HPLC de fase inversa en una columna Dynamax phenyl de 2 pulgadas usando un gradiente de disolvente desde 85:15 metanol:agua hasta 100% de metanol, rendimiento 0,320 g. (67%).

Ejemplos

Los compuestos ejemplares 1 a 22, inclusive, se describen en la Tabla 1, que muestra el nombre de cada compuesto, la fórmula molecular y el resultado de la espectroscopía de masas determinado para el compuesto particular.

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TABLA 1

8

9

Claims

1. Cualquier compuesto de acuerdo con el diagrama estructural I,

10

en el que:

\quad: R^{1} es halofenilo;

\quad: R^{2} es NE^{1}E^{2}, donde E^{1} se selecciona entre hidrógeno y alquilo C_{1-3} y E^{2} se selecciona entre alquilo C_{1-3} y (CH_{2})_{n}fenilo, donde n se selecciona entre 1, 2 ó 3, y

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2. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que:

\quad: R^{1} es fluorofenilo;

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3. Un compuesto según la reivindicación 2, en el que:

\quad: R^{1} es 3-fluorofenilo;

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4. Uso de un compuesto acorde con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor.

5. Uso de un compuesto acorde con la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del dolor agudo, persistente o neuropático.

6. Un método para preparar los compuestos acordes con la reivindicación 1, comprendiendo dicho método:

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\quad: en el que R^{1}, R^{2} y R^{3} son como se define en la reivindicación 1;

g): retirar cualquier dicho grupo protector;

7. Una composición farmacéutica para el tratamiento del dolor agudo, persistente o neuropático, que comprende un compuesto acorde con la reivindicación 1 junto con uno o más aditivos seleccionados entre excipientes, diluyentes o estabilizantes.