ES2318284T3 - Analogo de la hormona de gonadotropinas que se conjuga con hormanas esteroides. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto que consta de un análogo de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) conjugado con una porción de hormona esteroide, o un derivado hidroxi en C11, C17 o C21 de la misma, que es capaz de enlazarse a una proteína de enlace con hormonas plasmáticas seleccionada de globulina de enlace con el cortisol (CBG), globulina de enlace con hormonas sexuales (SHBG) y albúmina, en el cual el análogo de la GnRH es un antagonista de la GnRH seleccionado entre [AcD-Nal 1 , D-Cpa 2 , D-Pal 3 , Arg 5 , D-Lys 6 , D-Ala 10 ] GnRH, [Ac-deltaPro 1 , D-Fpa 2 , D-Trp 3 , D-Lys 6 ] GnRH, Cetrorelix, Ganirelix, Abarelix, Antide, Teverelix, FE200486, Na-Glu, A-75998, A-76154, A-84861, D-26344, D-63153, D21775, ramorelix, degarelix, NBI-42902, Org-30850, detirelix, iturelix, TAK-013, TAK810, AN 207, AcD-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Arg-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2; Ac-deltaPro-D-Fpa-D-Trp-Ser-Tyr- D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2; AcD-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Arg-D-Lys-Lys-Leu-Arg-D-Ala-NH2; D-Pal-Ser-Arg-D- Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH 2; AcD-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Arg-D-Lys-Lys-Arg-Pro-D-Ala-NH 2; [D-Pyr 1 , D-Phe 2 , D- Trp 3-6 ] GnRH; D-Lys 6 Antide; Lys 5 Antide o Lys 8 Antide, o un agonista de la GnRH seleccionado entre pGlu-His-Trp- Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-GlyNH2, Triptorelin, Buserelin, leuprolide, goserelin, deslorelin, ProMaxx-100, avorelin, histrelin, nafarelin, leuprorelin o triptorelin.
Description
Análogo de la hormona liberadora de
gonadotropinas que se conjuga con hormonas esteroides.
Esta invención está relacionada con compuestos
conjugados y en particular con compuestos conjugados de la hormona
liberadora de gonadotropinas.
La hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH)
es una hormona neuroendocrina implicada en el control de la
reproducción, provocando la liberación de gonadotropinas, hormona
luteinizante (LH) y hormona folículoestimulante (FSH).
Los análogos de la GnRH son agentes
farmacológicos extremadamente útiles tanto en la investigación del
eje hipotálamo-pituitaria como en la manipulación
de las gonadotropinas para el tratamiento de enfermedades
hormonodependientes. La mayor parte de los agonistas y antagonistas
de la GnRH son moléculas de péptidos que consisten en
aproximadamente 9 ó 10 aminoácidos, que típicamente contienen
aminoácidos no naturales para modificar la afinidad de enlace del
receptor, la activación del receptor, y para reducir la
proteolisis.
Los análogos de la GnRH tienen una variedad de
aplicaciones clínicas que incluyen el tratamiento del cáncer
hormonodependiente, hipertrofia prostática benigna, endometriosis,
fibromas uterinos, síndrome premenstrual, síndrome de ovario
poliquístico, hirsutismo, acné vulgaris, pubertad precoz, porfiria
intermitente aguda, criptorquidia, pubertad retrasada y tratamiento
de fertilidad (Millar 2003).
Además, los análogos de la GnRH pueden ser
agentes anticonceptivos eficaces. Los antagonistas de la GnRH actúan
inhibiendo la ovulación cuando se administra en el momento del
aumento de la LH; sin embargo el momento de administración de la
dosis es crucial y un pequeño retrazo (horas) es suficiente para
eliminar cualquier efecto^{2,4,6,7}. Alternativamente, la función
del cuerpo lúteo puede ser suprimida mediante el tratamiento
con un antagonista de la GnRH durante la fase luteal^{5} para
inhibir la progresión de un embarazo temprano. Los agonistas de la
GnRH también pueden inhibir la liberación de gonadotropinas, pero
mediante la insensibilización del receptor, la cual requiere dosis
inferiores. Para lograr la inhibición de la liberación de
gonadotropinas, se requieren niveles proporcionalmente más altos de
antagonistas en comparación con los agonistas de la GnRH debido a la
alta ocupación del receptor requerida en el receptor de la
GnRH-(GnRH-R).
La anticoncepción hormonal femenina común emplea
dosis suprafisiológicas de análogos de hormonas esteroides para
suprimir la secreción de gonadotropinas. Debido a que los tejidos
periféricos se exponen a los mismos niveles, pueden aparecer varios
efectos secundarios^{1}. El desarrollo de la anticoncepción
hormonal masculina está basado en el mismo principio en combinación
con la sustitución de andrógenos y enfrenta problemas de efectos
secundarios similares. De esta manera, los antagonistas de la GnRH
tienen el potencial para formar la base de anticonceptivos
masculinos y femeninos combinados con la sustitución de hormonas
esteroides gonadales^{1,3,7,12,18}.
Uno de los problemas principales asociados con
el tratamiento a largo plazo con análogos de la GnRH es la
reducción de hormonas esteroides sexuales gonadales. Se requiere,
por lo tanto, que la terapia de sustitución hormonal prevenga
efectos secundarios, como la pérdida de hueso hipoestrogénica en
mujeres y mantenga características sexuales secundarias en
hombres.
Una dificultad adicional asociada al tratamiento
con análogos de la GnRH es la degradación rápida en el tracto
gastrointestinal de los análogos de la GnRH administrados oralmente.
Además, los análogos de la GnRH tienen un período de eliminación en
la circulación de la porción de los mismos relativamente corto ya
que son excretados vía riñón, a menudo en la primera pase
(t_{1/2}, de 1-7 minutos). Estas dificultades
llevaron al desarrollo de preparaciones inyectables de liberación
lenta para mantener concentraciones in vivo eficaces de los
análogos de
la lGnRH.
la lGnRH.
Actualmente, los antagonistas de péptidos de la
GnRH son administrados mediante inyección. Se encuentran en marcha
esfuerzos encaminados a desarrollar antagonistas no peptídicos y
antagonistas de la GnRH oralmente activos. La conjugación de
análogos de la GnRH con hapténs, como la vitamina B_{12}, la cual
es activamente absorbida en el tracto gastrointestinal, ofrece el
potencial de conferir actividad oral a los antagonistas
peptídicos^{15}. Los antagonistas de la GnRH han sido modificados
anteriormente para incluir porciones funcionales adicionales. Por
ejemplo, se ha reportado la conjugación de la GnRH a una porción de
emodina o la conjugación de la vitamina B_{12} con un antide para
aumentar potencialmente la absorción oral ^{15,20,21}. Aunque la
administración oral de la vitamina B_{12} conjugada ha mostrado
algún aumento de la absorción^{21}, no se demostró ningún aumento
del período de eliminación de la mitad de estos componentes.
Muchas hormonas se enlazan a proteínas
plasmáticas en la circulación. Se piensa que esto sirva a una
variedad de funciones, que incluyen la protección de las mismas ante
la eliminación renal y la degradación metabólica, extendiendo, de
esta manera, el período circulatorio de eliminación de la mitad de
las mismas^{19}.
Existen dos proteínas principales circulatorias
de enlace con esteroides en los humanos y en la mayoría de los
primates más antiguos del mundo, la globulina de enlace con el
cortisol (CBG) (por sus siglas de la expresión inglesa: cortisol
binding globulin) que enlaza el Cortisol a la progesterona, y la
globulina de enlace con hormonas sexuales (SHBG)^{8} que
enlaza la testosterona al estradiol. La especie de roedor
Histricomorfo, como los conejillos de India también tienen una
globulina de enlace con la progesterona (PBG) que se enlaza
específicamente a la
progesterona.
progesterona.
El enlace de esteroides a proteínas plasmáticas
de alto peso molecular impide su eliminación renal y metabólica,
además de inhibir su entrada en las células para interactuar con
receptores del núcleo. De esta manera, la concentración eficaz de
esteroides en la circulación es determinada por la fracción no
enlazada (aproximadamente el 2% en humanos), en un estado de
equilibrio con la fracción enlazada^{16,19}.
Azziz et al (1995) Journal of Clinical
Endocrinology and Metabolism, 80 (12): 3406 (D1) describe un estudio
aleatorio para comparar la administración del análogo de la GnRH
leuprolide en combinación con estrógeno y la administración de
píldoras anticonceptivas orales, para el tratamiento del
hirsutismo.
Irahara et al (2001) Gynecol Obstet
Inviest 52: 217-222 (D2) describe un estudio
aleatorio para determinar el eficacia de la administración en días
alternos de estrógeno equino y acetato de medroxiprogesterona en el
tratamiento con un agonista de la GnRH en mujeres con
endometriosis.
Vincze et al (1994) Cancer Res Clin Oncol
120: 578-584 (D3) describe el efecto antitumor de un
antagonista de la GnRH (MI-1544) y
poli[Lys-(Ac-glu_{0.96}-DL-Ala_{3-1})]
en células de cáncer de mama humanas y sus heterotransplantes.
La WO 90/09799 (D4) muestra que el análogo de la
GnRH se conjuga con varias toxinas que pueden ser usadas en la
esterilización de animales y/o tratar determinadas enfermedades
relacionadas con hormonas sexuales.
Hasta aquí hemos mostrado que la conjugación de
un análogo de la GnRH con una porción hormonal, o con un derivado
hormonal, extiende el período de eliminación de la mitad de la misma
en el plasma y mejora la farmacocinética y la farmacodinámica del
análogo de la GnRH.
Sin ser nuestra intención limitarnos a la
teoría, creemos que el componente hormonal o el componente derivado
hormonal del compuesto conjugado se enlaza a una proteína de enlace
con hormonas plasmáticas que actúa como un almacén para el análogo
de la GnRH, y libera al análogo de la GnRH en una manera lenta y
continua. El secuestro del conjugado mediante el enlace con las
proteínas plasmáticas puede "proteger" al medicamento de la
excreción y del metabolismo hacia formas inactivas, prolongando por
consiguiente, el período de eliminación de la mitad del análogo de
la GnRH.
Hemos mostrado que la formación de un conjugado
de análogo de la GnRH con una hormona amplía su período de
eliminación de la mitad del mismo y la duración de su actividad,
reduciendo la dosis de un análogo de la GnRH requerida para un
efecto biológico. Esto también permite que el conjugado sea
administrado durante un período significativo antes de que se
requiera el antagonismo y bajar la frecuencia y cantidad de la
administración del análogo de la GnRH, reduciendo potencialmente, de
esta manera, cualquier efecto secundario del tratamiento.
Además, como el conjugado se combina tanto con
un análogo de la GnRH como con una hormona sexual esteroide
funcional en una sola molécula, el tratamiento con un análogo de la
GnRH conjugado con una hormona sexual esteroide podría reducir o
aliviar la necesidad de terapia de sustitución hormonal.
Un primer aspecto de la invención proporciona un
compuesto que comprende un análogo de la GnRH como se define en la
Reivindicación 1 conjugado con una porción de hormona esteroide, o
un C11, C17 o C21 hidroxi derivado de la misma, que es capaz de
enlazarse a una proteína de enlace con hormonas plasmáticas
seleccionada de globulina de enlace con el cortisol (CBG),
globulina de enlace con hormonas sexuales (SHBG) y albúmina.
Al usar el término "GnRH" queremos decir el
decapéptido
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH_{2},
en el que pGlu es piroglutamato.
El "análogo de la GnRH" incluye una
molécula peptídica, que se enlaza al receptor de la GnRH. El enlace
de una molécula al receptor de la GnRH puede ser fácilmente
determinado por una persona experta en la técnica usando, por
ejemplo, un ensayo de enlace del receptor o un ensayo de enlace
celular completo tal como se describe más adelante en el Ejemplo
1.
Típicamente, un análogo peptídico de la GnRH es
un péptido que tiene entre 6-12 residuos de
aminoácido. Más preferentemente, un análogo peptídico de la GnRH
tiene 7, 8, 9, 10 ó 11 residuos de aminoácido. Aún más
preferentemente, un análogo peptídico de la GnRH tiene 9 o más
comúnmente 10 residuos de aminoácido.
Los análogos peptídicos de la GnRH típicamente
incluyen al menos un residuo de aminoácido modificado, es decir que
ocurre de forma no natural. Los agonistas de la GnRH son
generalmente producidos modificando los aminoácidos en las
posiciones 6 y 10 de la estructura del decapéptido natural de la
GnRH, mientras que la alteración de las posiciones 1, 2, 3, 5, 6, 8,
y 10 generalmente causan antagonismo (Thau 1984).
Millar (2003) habla de la estructura de la GnRH
y su receptor, así como análogos de la GnRH que pueden ser
apropiados para usarse en la presente invención.
El análogo de la GnRH puede ser un antagonista
de la GnRH. Los antagonistas de la GnRH son típicamente moléculas
peptídicas con una estructura de GnRH modificada que se enlazan a y
bloquean la activación o señalización del receptor de la GnRH
(GnRH-R).
El "antagonista de la GnRH" es un análogo
peptídico de la GnRH, que inhibe, reduce o impide la señalización
del receptor de la GnRH. La inhibición, la reducción o el
impedimento de la señalización del GnRH-R pueden
ser fácilmente determinadas por una persona experta en la técnica,
por ejemplo usando un ensayo de producción de fosfato de inositol
tal como se describe más adelante en el Ejemplo 1.
Millar et al (2000) hablan de
antagonistas de la GnRH que pueden ser apropiados para usarse en la
presente invención.
Cuando no se especifica ningún aminoácido para
una posición específica, esto indica que el mismo residuo de
aminoácido que ocurre de forma natural en la GnRH está presente en
dicha posición.
Las siguientes abreviaturas se usan para
aminoácidos que no ocurren de forma natural:
AcD-Nal-acil
D-naptilalanina;
D-Cpa-D-clorofenilalanina;
D-Pal-D-piridilalanina;
D-Lis-D-lisina;
D-Ala-D-alanina;
Ac-\deltaPro-acil
delta-prolina;
D-Fpa-D-fluorofenilalanina;
D-Trp-D-triptófano;
Lis (Nic)-lisina nicotinamida; y
iPr-Lis-isopropil lisina.
Los antagonistas de la GnRH de la invención
según se define en la Reivindicación 1 son el Cetrorelix (Asta
Medica AG), Ganirelix (Organon), Abarelix (Praecis Pharmaceuticals),
Antide (Ares Serono SA), Teverelix (Ardana), FE200486 (Ferring) y
Nal-Glu (NIH). La estructura de estos antagonistas
de la GnRH se muestra en la Figura 8.
Otros antagonistas de la GnRH de la invención se
definen en la Reivindicación 1 e incluyen A-75998,
A-76154 y A-84861 (producido por
Laboratorios Abbott); D-26344 y
D-63153 (producido por ASTA Medica AG); ramorelix
(producido por Aventis AG); degarelix (producido por Ferring
Research Institute (Reino Unido), NBI-42902
(producido por Neurocrine Biosciences Inc);
Org-30850 (producido por Organon), detirelix
(producido por Roche Bioscience); iturelix (producido por Serono
SA); TAK-013 y TAK810 (producido por Takeda Chemical
Industries Ltd); AN 207 (producido por Tulane University).
Los antagonistas de la GnRH son abordados en las
revisiones siguientes: Goulet (1995) Ann. Reports Med. Chem. 30,
169-178; Nestor & Vickery (1988) Ann. Reports
Med. Chem. 23, 211-220; y Dutta & Barrington
(1985) Ann. Reports Med. Chem. 20, 203-214.
Otros antagonistas peptídicos de la GnRH de la
invención según se define en la Reivindicación 1 incluyen
- AcD-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Arg-D-Lis-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH_{2};
- Ac-\deltaPro-D-Fpa-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lis-Leu-Arg-Pro-Gly-NH_{2};
- AcD-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Arg-D-Lis-Lis-Leu-Arg-D-Ala-NH_{2};
- D-Pal-Ser-Arg-D-Lis-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH_{2};
- AcD-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Arg-D-Lis-Lis-Arg-Pro-D-Ala-NH_{2};
- [D-Pir^{1}, D-Phe^{2}, D-Trp^{3,6}] GnRH (ver Rahimipour et al);
- D-Lis^{6}Antide; Lis^{5}Antide; y Lis^{8}Antide.
\vskip1.000000\baselineskip
El antide y sus derivados son descritos en
Russel-Jones et al (1995) y WO 94/28015
(Biotech Australia Pty. Ltd).
El análogo de la GnRH puede ser un agonista de
la GnRH.
El "agonista de la GnRH" es un análogo
peptídico de la GnRH, que estimula o activa la señalización del
receptor de la GnRH. El estímulo o la activación de la señalización
del receptor de la GnRH pueden ser fácilmente determinados por una
persona experta en la técnica, por ejemplo mediante el uso de un
ensayo de producción de fosfato de inositol tal como se describe en
el Ejemplo 1.
La incorporación de aminoácidos isomorfos D, en
particular en la posición 6, aumenta la potencia agonística de los
análogos de la GnRH. Rahimpour et al (2001) reportan que más
de 3 000 análogos de la GnRH han sido sintetizados y evaluados para
comprobar su bioactividad. La mayor parte de los superagonistas
incorporan un aminoácido D en el lugar de Gly en la posición 6, y
muchos tienen una N-etilo amida en lugar del
terminal Gly-NH_{2}. Se plantea que estas
modificaciones químicas intensifican la conformación bioactiva
\beta-turn de la GnRH en el enlace Gly-Leu
y disminuyen la susceptibilidad del péptido a la degeneración
proteolítica. De esta manera los agonistas de la GnRH incluyen
análogos de la GnRH con una de estas modificaciones o con ambas.
En una realización, al menos uno de los residuos
de aminoácido del análogo de la GnRH es D-lisina.
Típicamente, el D-lisina está en la posición 6 del
análogo, es decir, el análogo de la GnRH es un
[D-Lys^{6}] GnRH.
Los agonistas de la GnRH de la invención según
se define en la Reivindicación 1 incluyen Lupron® (leuprorelin,
TAP), Zoladex® (goserelin, Zeneca), Supprelin® (histrelin Roberts),
Synarel® (nafarelin Searle), Triptorelin (Ferring) y Buserelin
(Hoechst), cada uno de los cuales tiene un residuo que ocurre de
forma no natural en la posición 6. La estructura de estos agonistas
de la GnRH se muestra en la Figura 8.
Otros agonistas de la GnRH de la invención según
se define en la Reivindicación 1 incluyen deslorelin (Balance
Pharmaceuticals), ProMaxx-100 (Epic Therapeutics),
avorelin (Mediolanum Farmceutici SpA), histrelin (Ortho
Pharmaceuticals), nafarelin (Roche Bioscience), leuprolide,
goserelin, leuprorelin y triptorelin.
Los análogos peptídicos de la GnRH pueden
hacerse empleando cualquiera de los métodos conocidos por una
persona experta en la técnica. Por ejemplo, los péptidos pueden ser
sintetizados por el modo Fmoc-poliamida de la fase
sólida de la síntesis de péptidos según lo mostrado por Lu et
al (1981) J. Org. Chem. 46, 3433 y las referencias que aparecen
en la misma. La protección temporal del grupo
N-amino se proporciona mediante el grupo
9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La división
repetitiva de este grupo protector base altamente inestable se
efectúa usando 20% de piperidina en N,
N-dimetilformamida. Las funcionalidades de la cadena
lateral pueden ser protegidas como sus ésteres butilo (en el caso
de serina treonina y tirosina), ésteres butilo en el caso del ácido
glutámico y el ácido aspártico), derivado de butiloxicarbonil (en el
caso de la lisina y la histidina), derivado de tritilo (en el caso
de la cisteína) y derivado de
4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzenosulfonil
(en el caso de la arginina). Donde glutamina o asparagina son
residuos terminales C, se hace uso del grupo
4,4'-dimetoxibenzidril para proteger las
funcionalidades de la cadena lateral amida. El soporte de la fase
sólida está basado en un polímero
polidimetil-acrilamida constituido a partir de los
tres monómeros dimetilacrilamida (monómero principal),
bisacriloiletileno diamina (que permite el enlace cruzado) y el
éster metilo acriloilsarcosina (agente funcionalizador). El agente
enlazado divisible usado para transformar de péptido a resina es el
derivado de ácido, ácido-inestable,
4-hidroximetil-fenoxiacético. Todos
los derivados de aminoácido son añadidos en la forma de sus
derivados de anhídridos simétricos preformados a excepción de la
asparagina y la glutamina, que son añadidas usando un procedimiento
de enlace mediado invertido
N-diciclohexilcarbodiimida/1-hidroxibenzotriazol.
Todas las reacciones de enlace y desprotección son monitoreadas
usando procedimientos de prueba con ninhidrina, ácido sulfónico de
trinitrobenzeno o isotina. Al completarse la síntesis, los péptidos
son separados del soporte de resina junto al retiro simultáneo de
los grupos de protección de cadena lateral mediante tratamiento con
95% de ácido trifluoroacético que contiene una mezcla de depurador
al 50%. Los depuradores comúnmente usados son etaneditiol, fenol,
anisol y agua, la selección exacta del mismo depende de los
aminoácidos constituyentes del péptido que se está sintetizando. El
ácido de Trifluoroacetic se retira mediante la evaporación in
vacuo, con la subsiguiente trituración con éter dietilo lo que
produce el péptido crudo. Cualquier depurador presente es eliminado
mediante un procedimiento simple de extracción el cual mediante la
liofilización de la fase acuosa produce el péptido crudo libre de
depuradores. Los reactivos para la síntesis del péptido están
generalmente disponible en Calbiochem-Novabiochem
(UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK. La purificación puede ser
efectuada mediante cualquiera de las técnicas, o una mediante una
combinación de las mismas, tales como la cromatografía de exclusión
por tamaño, cromatografía de intercambio de iones y (principalmente)
cromatografía con líquidos de alto rendimiento de fase revertida.
El análisis de péptidos puede efectuarse usando cromatografía de
capas finas, cromatografía con líquidos de alto rendimiento de fase
revertida, análisis de aminoácidos después de la hidrólisis ácida y
por análisis espectométrico de masa por bombardeo de átomo rápido
(FAB).
O bien, los análogos peptídicos de la GnRH
pueden ser obtenidos mediante técnicas de biología molecular
estándares, a condición de que los mismos puedan ser codificados en
una molécula de ADN.
Los análogos peptídicos de la GnRH de la
presente invención poseen un átomo o grupo funcional apropiados para
la conjugación a una porción de hormona esteroide o C11, C17 ó C21
hidroxi derivado de la misma.
Grupos funcionales apropiados presentes en
residuos de aminoácidos que ocurren de forma natural incluyen el
grupo sulfhidrilo en un residuo Cys, el grupo hidroxilo en los
residuos de Ser, Thr o Tyr, el grupo
\varepsilon-amino en los residuos de Lys, los
grupos carboxilo en los residuos de Asp y Glu, el grupo guanidino en
los residuos de Arg, los grupos amida en los residuos de Asn y Gln,
el grupo imidazol NH en los residuos de His, la grupo indol NH en
los residuos de Trp, el grupo carboxilo con terminal C y el grupo
amino con terminal N. Los mismos grupos funcionales están presentes
en los isomorfos D de estos residuos de aminoácidos.
Los aminoácidos modificados también pueden tener
grupos funcionales apropiados para la conjugación con una porción
hormonal. Estos incluyen el grupo hidroxilo en residuos de
hidroxiprolina, el grupo fosfato en los residuos de
O-fosfoserina u O-fosfotirosina, ambos grupos el
carboxilo en el residuo de
\gamma-carboxiglutamato, y el grupo
\varepsilon-alkilo amino en los residuos de
iPr-Lys y grupos de citrulina y homocitrulina.
Además, el átomo N del piridilo de los residuos
de la piridilalanina y el átomo N secundario y terciario del
guanidino de los residuos de N-alklcilatad Arg son
grupos funcionales apropiados para la conjugación a una porción de
hormona por vía de la N-quaternización. También en
este caso los isomorfos D y L pueden estar presentes en el análogo
de la GnRH.
\newpage
Los grupos funcionales apropiados para la
conjugación con la porción de hormona que están presentes en los
análogos no-peptídicos de la GnRH incluyen, NH (como
parte de una grupo funcional amino, amido o ureidilo), hidroxilo,
sulfhidrilo, ácido carboxílico y grupos amino terciarios.
La porción de hormona esteroide o el derivado de
la misma que se conjuga con el análogo de la GnRH es el que se
enlaza a una proteína de enlace con hormonas plasmáticas, in
vivo, seleccionados globulina de enlace con el cortisol (CBG),
globulina de enlace con hormonas sexuales (SHBG) y albúmina sérica.
Para evitar cualquier duda, en el contexto de la invención, la
albúmina sérica humana (HSA) (por sus siglas de la expresión
inglesa: human serum albumin) es una proteína de enlace con
hormonas plasmáticas apropiada.
Al usar el término "derivado" de una
porción de hormona incluimos el significado según el cual el
derivado ha sido modificado a partir de la estructura de la porción
de hormona que se encuentra en la naturaleza. Puede haber sido
modificado, por ejemplo, para proporcionar un sitio de conjugación
nuevo o mejorado al análogo de la GnRH, o para mejorar su
estabilidad o su actividad. Sin embargo, el derivado hormonal, como
se define en este documento, no habrá perdido completamente su
capacidad de enlazarse a la proteína de enlace con hormonas
plasmáticas. Se apreciará que el derivado pueda o no tener actividad
hormonal en sí mismo.
En el contexto de la invención, la porción de
hormona es una porción de hormona esteroide. De tal manera, según
se usa en este documento, "porción de hormona" quiere decir
"porción de hormona esteroide".
Las porciones de hormona esteroide y los
derivados de las mismas apropiados para el uso en la presente
invención son los que poseen un átomo o grupo funcional apropiado
para la conjugación con el análogo de la GnRH.
Típicamente, las hormonas esteroides tienen ya
sea un grupo hidroxilo o un grupo ceto en la posición 3. Muchas de
las hormonas esteroides tienen ya sea un grupo hidroxilo o un grupo
ceto en la posición 17. Varias hormonas esteroides tienen un grupo
hidroxilo en la posición 11. Algunas hormonas esteroides tienen un
grupo hidroxilo en la posición 21.
Preferentemente, la porción de hormona esteroide
es estradiol, progesterona, cortisol, corticosterona, estrona,
testosterona y dihidroxitestosterona (DHT).
Los derivados de hormonas esteroides incluyen a
aquellos que han sido modificados añadiendo un grupo hidroxilo en la
posición 11, 17 ó 21. Los derivados de progesterona apropiados
incluyen 11\alpha-hidroxiprogesteronas y
21-hidroxiprogesteronas.
Se apreciará que los derivados de hormonas
esteroides que son esteroides, pero que ya no tienen actividad
hormonal pueden ser usados a condición de que se enlacen a la
proteína de enlace con hormonas plasmáticas.
Los grupos funcionales requeridos para que las
hormonas esteroides se enlacen a una proteína de enlace con
hormonas plasmáticas son conocidos para un experto en la técnica.
Por ejemplo, las investigaciones estructurales usando esteroides
substituidos han demostrado que a fin de interactuar con la SHBG, un
esteroide debe contener un grupo 17
\beta-hidroxilo (Burton & Westphal (1972) y
Cunningham et al (1981)). Varios otros rasgos, como la
adición de un grupo hidroxilo o un grupo ceto en C11 tienen efectos
negativos sobre la afinidad de enlace. La modificación de carbono
2, 6, 9 y 11 en el núcleo del esteroide también redujo la afinidad
de enlace (Cunningham et al (1981)).
Para el enlace de esteroides a la CBG humana, se
ha reportado que los grupos 20-oxo y 10\betametilo
son esenciales y los 3-oxo y 4-ene
también son importantes. Aunque los grupos 11\beta, los
17\alpha- y 21-hidroxi sean relativamente sin
importancia, los grupos hidroxilo debilitan el enlace en las
posiciones 11\alpha, 6\alpha, 6\beta, 12\alpha, 14\alpha,
16\alpha y 19 (Mickelson et al 1981).
De esa manera, una persona experta en la técnica
posee perfectamente la capacidad de conjugar una porción de hormona
o derivado de la misma con un análogo de la GnRH en un grupo
funcional específico con el fin de retener la capacidad de la
porción de hormona de enlazarse a una proteína de enlace con
hormonas plasmáticas.
Se prefiere si los elementos de enlace no
dificultan estéricamente la interacción de la hormona con la
proteína de enlace con hormonas plasmáticas o del análogo de la
GnRH con un receptor de la GnRH. Es preferible si grupos
voluminosos y/o hidrofílicos no están presentes en el elemento de
enlace próximo a la porción de hormona o al análogo de la GnRH.
En algunas realizaciones de preferencia de la
presente invención, la porción de hormona o derivado de la misma
retiene su actividad de esteroide, en parte o completamente, cuando
se conjuga con el análogo de la GnRH. Alternativamente, en otras
realizaciones, se prefiere que la porción de hormona o el derivado
de la misma no retengan ninguna actividad de esteroide cuando se
conjuga con el análogo de la GnRH.
En aquellas realizaciones en las cuales se desea
que haya actividad hormonal, el grupo funcional que se usa para la
conjugación con el análogo de la GnRH no es típicamente uno
requerido para la actividad de esa hormona o derivado hormonal
específicos. Por el contrario, cuando no se desea que haya actividad
hormonal, el grupo funcional que se usa para la conjugación con el
análogo de la GnRH es típicamente uno que se requiere para la
actividad de esa hormona o derivado de la misma específico.
Los grupos funcionales requeridos para la
actividad de las hormonas esteroides son conocidos para una persona
experta en la técnica (por ejemplo, las relaciones estructurales
hormona esteroide-receptor se describen para
estrógenos, glucocorticoides, mineralocorticoides, andrógenos y
análogos metabólicos y antagonistas en Duax et al (1989)
Advances in Drug Research 18, 115-138; Aranyi (1982)
Hung.. Biologia (Budapest) 30, 145-169; Raynaud
& Ojasoo (1983) Nobel Symposium 57, 141-170;
Duax & Griffin (1989) Alfred Benzon Symposium 28,
62-77; Ojasoo et al (1992) Mol. Struct.
Biol. Acto. Esteroids, pp 157-207, CRC, Boca Raton;
y Duax & Griffin (1998) NATO ASI series E: Applied Sciences
352, 1-14. Por lo tanto, una persona experta en la
técnica posee perfectamente la capacidad para conjugar una porción
hormonal o derivado de la misma con un análogo de la GnRH en un
grupo funcional particular con el fin de retener o eliminar la
actividad de la hormona.
Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 1, la
conjugación de un análogo de la GnRH en la posición 21 de
21-hidroxiprogesterona mantiene la actividad de la
progesterona en el compuesto conjugado. Por el contrario, si la
actividad de la hormona esteroide debe ser eliminada, la GnRH puede
ser conjugada al grupo ceto en la posición 3.
Al usar el término "conjugado con"
incluimos el significado en el que se forma un enlace covalente
entre un átomo en el análogo de la GnRH y un átomo en la porción de
hormona, o en el que el análogo de la GnRH y la porción de hormona
están ambos unidos mediante un enlace covalente al mismo grupo de
enlace.
En una realización de preferencia, la
conjugación entre el análogo de la GnRH y la porción de hormona es
divisible, por ejemplo la conjugación incluye un enlace con un
éster que es divisible mediante una estearasa, o un enlace con una
amida que es divisible mediante una amidasa.
En una realización, el análogo de la GnRH y la
porción de hormona están directamente conjugados. Típicamente, en
este caso, un aminoácido sería sintetizado con la porción de hormona
ya enlazada, y este aminoácido modificado sería incorporado en un
péptido análogo de la GnRH. Por ejemplo, la conjugación directa
puede efectuarse mediante la formación de imina entre el grupo ceto
en la hormona y el grupo \varepsilon-amino en Lys.
La imina que resulta puede ser hidrolíticamente inestable in
vivo, produciendo de esta manera, un conjugado con un período
de eliminación de la mitad del mismo corto. El período de
eliminación de la mitad del conjugado puede ser aumentado
reduciendo la imina para obtener una amina. Alternativamente, la
conjugación directa puede producirse mediante la adición de Michael
del grupo \varepsilon-amino en Lys a una
funcionalidad \alpha,\beta-cetona insaturada en
la porción de hormona (por ejemplo, progesterona), o mediante la
reacción de una porción de hormona en la que un grupo OH ha sido
convertido en un grupo que se libera (por ejemplo un hálido o un
éster sulfonato) con un grupo nucleofílico apropiado en un residuo
del análogo de la GnRH (por ejemplo, el grupo
\varepsilon-amino en Lys o el grupo
\beta-OH en Ser).
Al usar el término "grupo de enlace"
queremos decir una estructura formada por uno o varios átomos que no
son endógenos ni al análogo de la GnRH ni a la porción de
hormona.
El grupo de enlace comprende uno o varios
átomos, con la ruta más corta entre el análogo de la GnRH y la
porción de hormona o derivado de la misma que típicamente contiene 2
ó 3 ó 4 ó 5 ó 6 ó 7 ó 8 ó 9 ó 10 ó más enlaces.
El grupo de enlace puede contener una estructura
basada en uno o varios átomos de carbono, opcionalmente junto con
otros átomos, como oxígeno, nitrógeno y/o azufre, y la ruta más
corta entre el análogo de la GnRH y la porción de hormona o el
derivado de la misma típicamente contienen 2 ó 3 ó 4 ó 5 ó 6 ó 7 ó 8
ó 9 ó 10 ó más átomos de carbono, opcionalmente con al menos un
átomo de oxígeno, nitrógeno y/o azufre.
Típicamente, el grupo de enlace es introducido
al hacer reaccionar una porción de enlace precursor difuncional con
el análogo de la GnRH y la porción de hormona, ya sea
simultáneamente o en cualquier orden secuencial. O bien, el grupo
de enlace se forma mediante el enlace de grupos funcionales a
fragmentos estructurales introducidos por derivatisación del análogo
de la GnRH y/o de la porción de hormona.
Los grupos de enlace de la invención incluyen
los representados por la fórmula
-A^{1}-D-A^{2}-, donde D
representa,
- (a)
- alquileno, alquenileno o alkinileno (cuyos tres últimos grupos son opcionalmente interrumpidos o eliminados mediante NH, O o S, un carbociclo o un heterociclo y/o son opcionalmente interrumpidos por-S-S-),
- (b)
- un carbociclo, o
- (c)
- un heterociclo,
o D representa el fragmento estructural
-D^{1}-A^{3}-D^{2}-, donde
D^{1} y D^{2} representan, de manera independiente a D como se
define de (a) a (c) anteriormente; y
A^{1}, A^{2} y A^{3} representan de manera
independiente, un enlace directo,-C(O)-, -C(S)-,
-S(O)-, -S(O)_{2}- o
-P(O)_{2}-, a condición de que A^{3} no represente
un enlace directo cuando D^{1} y D^{2} son ambos eliminados de
manera independiente por O o NH al punto de conexión con A^{3}.
Estará claro que los grupos A^{1} y A^{2} están enlazados a
átomos endógenos al análogo de la GnRH o a la porción de hormona,
por ejemplo el átomo N de un residuo Lys en el análogo de la GnRH y
el átomo O de un grupo hidroxilo en la porción de hormona.
El grupo de enlace puede estar unido en
cualquier dirección al análogo de la GnRH y la porción de hormona
(es decir, el grupo A^{1} del grupo de enlace puede estar enlazado
a un átomo del análogo de la GnRH o a un átomo de la porción de
hormona).
Los grupos alquileno, alquenileno o alquinileno
como se define en este documento pueden contener de uno a doce (por
ejemplo, entre uno y ocho, así como entre uno y seis) átomos de C, y
pueden tener una cadena lineal o, cuando hay un número suficiente
(es decir un mínimo de dos para alquileno y alquenileno, y cuatro
para alkinileno) de átomos de carbono, tener una cadena
ramificada.
Cuando se usa en este documento, el término
"carbociclo" incluye grupos que son estructuras cíclicas
que tienen un estructura de carbono y que contienen uno o más
anillos de tres o más miembros, por ejemplo sistemas de anillos
monocíclicos de 3-8 miembros, sistemas de anillos
bicíclicos de 7-12 miembros y sistemas de anillos
policíclicos de 12-18 miembros (por ejemplo, tri- o
tetra-cíclico). Además, cada carbociclo puede estar
totalmente saturado, insaturado en parte o de carácter total o
parcialmente aromático. Ejemplos de carbociclos totalmente
saturados incluyen el ciclopentilo, ciclohexilo y decalinilo cis- y
trans- y otros por el estilo. Ejemplos de carbociclos insaturados
en parte incluyen ciclohexenilo y otros por el estilo. Ejemplos de
carbociclos parcialmente aromáticos incluyen indenilo y
1,2,3,4-tetrahidronaftilo y otros por el estilo.
Ejemplos de carbociclos totalmente aromáticos incluyen fenilo,
naftilo y otros por el estilo.
Cuando se usa en este documento, el término
"heterociclo" incluye grupos que son un grupo carbocíclico,
como se define anteriormente, en el que uno o varios (por ejemplo,
de uno a tres) átomos C del anillo han sido sustituidos por un
número correspondiente de heteroátomos, cada heteroátomo es
independientemente seleccionado de O, S y N (o, donde es relevante,
NH). Ejemplos de grupos heterocíclicos incluyen azetidinil,
benzodioxanil, benzodioxepanil, benzodioxolil, benzofuranil,
benzofurazanil, benzimidazol, benzomorfolinil, benzotiazolil,
benzotiofenil, benzoxazolil, cromanil, cinnolinil, coumarinil,
dioxanil, furanil, hidantoinil, imidazolil, imidazo piridinilo
[1,2-a], indolil, isoquinolinil, isoxazolil,
maleimido, morfolinil, oxazolil, ftalazinil, piperazinil,
piperidinil, purinil, piranil, pirazinil, pirazolil, piridinil,
pirimindinil, pirrolidinonil, pirrolidinil, pirrolinil, pirrolil,
quinazolinil, quinolinil, 3-sulfolenil,
tetrahidropiranil, tetrahidrofuranil, tiazolil, tienil,
thiocromanil, triazolil y otros por el estilo.
Las realizaciones de la invención que pueden ser
mencionadas incluyen a aquellas en las cuales el grupo de enlace se
representa mediante la fórmula
-A^{1}-D-A^{2}- en la cual:
D representa C_{1-6}
alquileno, C_{2-6} alquenileno o
-D^{1}-D^{3}-D^{2}-;
D^{1} representa C_{2-6}
alquileno opcionalmente interrumpido por -S-S-;
D^{2} representa C_{2-8}
alquileno;
A^{1} y A^{2} ambos representan
C(O);
A^{3} representa C (O) NH.
\vskip1.000000\baselineskip
Los grupos de enlace particulares que pueden ser
mencionados incluyen
C(O)-(CH_{2})_{2}-C(O)
(succinil) y
C(O)-(CH_{2})_{2}-S-S-(CH_{2})_{2}-C(O)NH-(CH_{2})_{6}-NHC(O).
Realizaciones de la invención que pueden ser
mencionadas incluyen a aquellos en los cuales el grupo de enlace une
un grupo \varepsilon-amino de un residuo Lys en un
análogo peptídico de la GnRH como se define en la Reivindicación 1 a
un grupo hidroxilo en una porción de hormona esteroide.
Los métodos y procesos químicos apropiados para
conjugar un análogo de la GnRH a una porción de hormona o derivado
de la misma son conocidos a los expertos en la técnica e incluyen el
método descrito en el Ejemplo 1. Métodos de conjugar un análogo de
la GnRH con otras estructuras químicas mediante un elemento de
enlace se describen en Rahimipour et al (2001) y en Russell
Jones et al (1995). Los métodos para producir conjugados de
la vitamina B_{12}, que tienen aplicación en la formación de
conjugados de la presente invención, se describen en McEwan
et al (1999).
et al (1999).
El análogo de la GnRH puede ser conjugado con
una porción de hormona esteroide o derivado de la misma mediante
cualquiera de las formas convencionales de moléculas de
entrecruzamiento, como los descritos de forma general en O'Sullivan
et al Anal. Biochem. (1979) 100, 100-108. Por
ejemplo, una porción puede ser enriquecida con un grupo tiol y la
otra porción puede hacerse reaccionar con un agente bifuncional
capaz de reaccionar con el grupo tiol, por ejemplo el éster de
ácido iodoacético y N-hidroxisuccinimida (NHIA) o
N-hidroxisuccinimida-1-3-(2-piridilditio)
propionato (SPDP), un agente de entrecruzamiento heterobifuncional
que incorpora un puente de bisulfuro entre las especies conjugadas.
Los enlaces de Amida y tioéter, por ejemplo logrados mediante el
éster de
m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida,
son generalmente más estables in vivo que en enlaces de
bisulfuro.
Otros agentes de entrecruzamiento útiles
incluyen éster de ácido S-acetiltioglucólico y
N-hidroxisuccinimida (SATA) que es un reactivo
usado para introducir una funcionalidad tiol protegida en compuestos
que contienen grupos amino primarios. La desprotección del grupo
tiol acetilado se consigue bajo condiciones moderadas (Julian et
al (1983) Anal. Biochem. 132, 68), es decir mediante la reacción
con diclorhidrato de dimethilsuberimidato y
N,N'-o-fenilenedimaleimida.
En otra realización, el análogo de la GnRH se
conjuga con la porción de hormona mediante el terminal N del grupo
amino.
Ventajosamente, el compuesto según se describe
en este documento, es menos afectado por la eliminación metabólica
o renal in vivo que la GnRH natural, es decir este tiene un
período de eliminación de la mitad del mismo in vivo más
largo. Esto puede ser fácilmente determinado por una persona experta
en la técnica, por ejemplo como se describe más adelante en el
Ejemplo 1.
Preferentemente, el compuesto según se describe
en este documento tiene una duración más larga de su actividad que
la GnRH natural in vivo. Esto también puede ser fácilmente
determinado por una persona experta en la técnica, por ejemplo como
se describe más adelante en el Ejemplo 1.
En una realización de preferencia, los
compuestos pueden tener la fórmula general que se muestra en la
Figura 1A o la Figura 1B.
La invención incluye los compuestos:
AcD-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Arg-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH_{2}
conjugado con 21-hidroxiprogesterona
21-succinato en la \varepsilonamina de
D-Lys en la posición 6;
Ac-\deltaPro-D-Fpa-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH_{2}
conjugado con 21 hidroxiprogesterona 21-succinato de
en la \varepsilon amina de D-Lys en la posición
6;
AcD-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Arg-D-Lys-Lys-Leu-Arg-D-Ala-NH_{2}
conjugado con 21-hidroxiprogesterona
21-succinato en la \varepsilon amina de Lys en la
posición 7;
D-Pal-Ser-Arg-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH_{2}
conjugado con 21-hidroxiprogesterona
21-succinato en el terminal N de la amina;
AcD-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Arg-D-Lys-Lys-Arg-Pro-D-Ala-NH_{2}
conjugado con 21-hidroxiprogesterona
21-succinato en el \varepsilon amina de Lys en la
posición 7;
[DLys^{6}] GnRH conjugado con
11-succinato de
11\alpha-hidroxiprogesterona en el grupo
\varepsilon amino del D-Lys en la posición 6;
[DLys^{6}] GnRH conjugado con
21-hidroxiprogesterona 21-succinato
en el grupo \varepsilon amino del D-Lys en la
posición 6; y
[DLys^{6}] GnRH conjugado con
17-succinato de \beta-estradiol en
el grupo \varepsilon amino del D-Lys en la
posición 6.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización adicional, el compuesto
comprende un análogo de la GnRH conjugado con una porción de hormona
o derivado de la misma que se enlaza a una proteína de enlace con
hormonas plasmáticas, seleccionada de CBG o SHBG, o albúmina.
Los compuestos según esta realización son
ventajosos porque ellos se benefician del efecto protector de la
proteína de enlace inmediatamente después de la administración,
reduciendo la eliminación del análogo de la GnRH a través del riñón
en la primera eliminación, extendiendo más, de esta manera, el
período de eliminación de la mitad del análogo de la GnRH y su
actividad.
Un segundo aspecto de la invención proporciona
una composición farmacéutica que contiene un compuesto según al
primer aspecto de la invención y excipiente, vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
En una realización, la composición farmacéutica
es apropiada para la administración por vía oral.
Los compuestos de la invención serán normalmente
administrados oralmente o por cualquier ruta parenteral, en la
forma de una formulación farmacéutica que contiene el ingrediente
activo, opcionalmente en la forma de un no tóxico orgánico, o
inorgánico, ácido, o base, sal de adición, en una forma de dosis
farmacéuticamente aceptable. Según la enfermedad y el paciente a
ser tratado, así como la ruta de administración, las composiciones
pueden ser administradas en dosis variables.
En la terapia humana, los compuestos de la
invención pueden ser administrados solos, pero serán generalmente
administrados mezclado con un excipiente, diluyente o vehículo
farmacéutico apropiado seleccionado teniendo en cuenta la ruta de
administración que se pretende usar y la práctica farmacéutica
estándar.
Por ejemplo, los compuestos de la invención
pueden ser administrados oralmente, bucal o sublingualmente en la
forma de pastillas, cápsulas, óvulos, elixires, soluciones o
suspensiones, que pueden contener agentes saborizantes o
colorantes, para aplicaciones de liberación inmediata, retardada o
controlada. Los compuestos de la invención también pueden ser
administrados mediante inyección intracavernosa.
Tales pastillas pueden contener excipientes,
como celulosa microcristalina, lactosa, citrato de sodio, carbonato
de calcio, fosfato de calcio dibásico y glicina, desintegrantes,
como almidón (preferentemente maíz, patata o almidón de tapioca),
glicolato almidón sódico, sodio croscarmeloso y ciertos silicatos
complejos, y aglutinantes de granulación, como
polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC),
hidroxi-propilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y
acacia. Además, agentes lubricantes, como el estearato de magnesio,
ácido esteárico, behenato de glicerilo y talco pueden ser
incluidos.
Las composiciones sólidas de un tipo similar
también pueden ser empleadas como rellenos en cápsulas de gelatina.
Los excipientes de preferencia en este caso incluyen lactosa,
almidón, una celulosa, azúcar lácteo o glicoles de polietileno de
pesos moleculares altos. Para suspensiones acuosas y/o elixires, los
compuestos de la invención pueden ser combinados con varios agentes
endulcorantes o saborizantes, colorantes o tintes, con agentes
emulsionantes y/o para suspensión y con diluyentes como agua,
etanol, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los
mismos.
Los compuestos de la invención también pueden
ser administrados parenteralmente, por ejemplo, por vía intravenosa,
intrarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricularmente,
intrasternal, intracraneal, intramuscular o subcutáneal, o pueden
ser administrados por técnicas de infusión. Como mejor se usan es en
la forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras
sustancias, por ejemplo, suficiente sales o glucosa para hacer la
solución isotónica con la sangre. Las soluciones acuosas deben ser
apropiadamente equilibradas con un buffer (preferentemente a un pH
de 3 a 9), si es necesario. La preparación de formulaciones
parenterales apropiadas en condiciones estériles se logra
fácilmente mediante técnicas farmacéuticas estándares conocidas por
los expertos en la técnica.
En una realización, la composición o formulación
farmacéutica es una dosificación de unidad que contiene una dosis o
unidad diaria, subdosis diaria o una fracción apropiada de la misma,
del ingrediente activo, es decir un compuesto como se describe
anteriormente en el primer aspecto de la invención.
En otra realización, la composición o
formulación farmacéutica es una formulación de liberación lenta, por
ejemplo un preparado depot inyectable.
Las formulaciones apropiadas para la
administración parenteral incluyen soluciones estériles para
inyecciones acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes,
buffers, elementos bacteriostáticos y solutos que tornan la
formulación isotónica con la sangre del sujeto que la va recibir; y
suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir
agentes para suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones
pueden ser presentadas en contenedores de dosis unitarias o dosis
múltiples, por ejemplo ámpulas y frascos sellados, y pueden ser
almacenadas de forma congelada y seca (liofilizadas) que requiere
sólo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para
inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones de
inyección extemporáneas y las suspensiones pueden ser preparadas a
partir de polvos estériles, gránulos y tabletas del tipo descrito
anteriormente.
Actualmente, los agonistas de la GnRH son
típicamente administrados a un paciente a aproximadamente 100 \mug
por día, mientras que los antagonistas de la GnRH son típicamente
administrados a un paciente a aproximadamente 1 mg por día. Para la
administración oral y parenteral a pacientes humanos, el nivel de
dosis diario de los compuestos de la invención contendrá por lo
general niveles equivalentes o inferiores del análogo de la GnRH,
administrado en dosis unitarias o divididas.
De esta manera, por ejemplo, las tabletas o
cápsulas del compuesto de la invención pueden contener de 50 \mug
a 1 mg del compuesto activo para administración de una sola o dos o
más a la vez, según lo que sea apropiado. En cualquier caso, el
médico determinará la dosis que será más apropiada para cada
paciente individual y variará según la edad, peso y respuesta del
paciente específico. Las dosis expuestas anteriormente son ejemplos
para el caso promedio. Pueden, por supuesto, existir casos
individuales donde sean necesarias dosis mayores o menores dentro
del ámbito de esta invención.
Los compuestos de la invención también pueden
ser administrados intranasalmente o mediante inhalación y son
adecuadamente suministrados en presentaciones en forma de inhalador
de polvo seco o spray de aerosol en contenedores presurizados,
bombas, sprays o nebulizadores con el uso de un propelente
apropiado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
diclorotetrafluoroetano, un hidrofluoroalcano, como
1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A ^{TM} ó
1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227EA
^{TM}), dióxido de carbono u otro gas apropiado. En caso de los
aerosoles presurizados, la dosificación de unidad puede ser
determinada proporcionando una válvula para administrar una
cantidad medida. El contenedor presurizado, la bomba, el spray o el
nebulizador puede contener una solución o suspensión del compuesto
activo, por ejemplo usando una mezcla de etanol y el propelente
como solvente, los cuales pueden además contener un lubricante, por
ejemplo trioleato de sorbitan. Las cápsulas y cartuchos (hechos,
por ejemplo, de gelatina) para usar en un inhalador o insuflador
pueden ser formulados para contener una mezcla en polvo de un
compuesto de la invención y una base en polvo apropiada, como
lactosa o
almidón.
almidón.
El aerosol o las formulaciones secas en polvo
son preferentemente regulados de modo que cada dosis medida "o
bocanada" contengan al menos 1 mg de un compuesto de la invención
para su administración al paciente. Se apreciará que la dosis
diaria total con un aerosol variará de paciente a paciente, y puede
ser administrada en una dosis unitaria o, por lo general, en dosis
divididas a lo largo del día.
O bien, los compuestos de la invención pueden
ser administrados en forma de supositorios o pesarios, o pueden ser
aplicados por vía tópica en la forma de una loción, solución, crema,
ungüento o polvo de talco. Los compuestos de la invención también
pueden ser administrados por vía transdérmica, por ejemplo, mediante
el uso de un parche en la piel.
Para la aplicación tópica en la piel, los
compuestos de la invención pueden ser formulados en forma de un
ungüento apropiado que contiene el compuesto activo suspendido o
disuelto en, por ejemplo, una mezcla con uno o varios de lo
siguiente: aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, glicol
de propileno, compuesto de polioxietileno y polioxipropileno,
emulsionando cera y agua. O bien, ellos pueden ser formulados en
forma de una loción o crema apropiada, suspendida o se disuelta en,
por ejemplo, una mezcla de uno o varios de lo siguiente: aceite
mineral, monoestearato de sorbitan, un glicol de polietileno,
parafina líquida, polisorbato 60, cera de ésteres cetilo, alcohol
cetearil, 2-octildodecanol, alcohol bencilo y
agua.
Las formulaciones apropiadas para la
administración tópica en la boca incluyen grageas que contienen el
ingrediente activo en una base saborizada, por lo general sacarosa
y acacia o adraganto; pastillas que contienen el ingrediente activo
en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y
acacia; y la colutorios que contienen el ingrediente activo en un
vehículo líquido apropiado.
Generalmente, en humanos, la administración oral
o tópica de los compuestos de la invención es la ruta preferida,
siendo estas las más apropiadas. En circunstancias donde el receptor
sufre de un desorden al tragar o de deterioro de la absorción de un
medicamento después de la administración oral, la medicina puede ser
administrada parenteralmente, por ejemplo, sublingualmente o
bucalmente.
Para el uso veterinario, un compuesto de la
invención es administrado como una formulación apropiadamente
aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria normal y el
cirujano veterinario determinará el régimen de dosificación y ruta
de la administración que sea más apropiada para un animal
específico. Convenientemente, la formulación es una formulación
farmacéutica. Ventajosamente, para el uso veterinario, la
formulación es una formulación veterinaria.
Un tercer aspecto de la invención proporciona un
compuesto según el primer aspecto de la invención o una composición
farmacéutica según el segundo aspecto de la invención, para uso
médico.
De esta manera, el compuesto o composición
farmacéutica se embala y presenta para su uso médico.
Se aprecia que tanto el agonista de la GnRH como
el antagonista de la GnRH conjugados pueden ser usados para reducir
la fertilidad en un individuo inhibiendo la liberación de
gonadotropinas.
Un cuarto aspecto de la invención proporciona el
uso de un compuesto según el primer aspecto de la invención o una
composición farmacéutica según el segundo aspecto de la invención,
en la preparación de un medicamento para reducir la fertilidad de un
individuo.
Típicamente y preferentemente el individuo a ser
tratado es un humano. Sin embargo, la invención puede ser usada
para tratar mamíferos, por ejemplo de las especies siguientes:
vacas, caballos, cerdos, ovejas, gatos y perros, así como otros
primates, monos del viejo mundo y monos del nuevo mundo. De esa
manera, la invención tiene usos tanto en la medicina humana como en
la veterinaria. En particular, en sus aplicaciones veterinarias, el
conjugado puede ser usado para crear un estado de castración en el
ganado, caballos y animales domésticos.
Al usar el término "reducir la fertilidad"
en hembras, incluimos el sentido de reducir la probabilidad de
concepción o un embarazo exitoso o de prevenir concepción o embarazo
exitoso. Así, los compuestos de la invención tienen utilidad en la
anticoncepción femenina.
Al usar el término "reducir la fertilidad"
en varones, incluimos el sentido de reducir los niveles de
testosterona para disminuir los niveles. Así los compuestos de la
invención tienen utilidad en la anticoncepción masculina.
Los métodos de anticoncepción descritos en este
documento son reversibles mediante el cese de la administración del
compuesto, composición farmacéutica o medicamento.
Un quinto aspecto de la invención proporciona el
uso de un compuesto según el primer aspecto de la invención o una
composición farmacéutica según el segundo aspecto de la invención,
en la preparación de un medicamento para combatir una enfermedad o
padecimiento hormonodependiente seleccionada de cáncer
hormonodependiente, hipertrofia prostática benigna, endometriosis,
fibromas uterinos, síndrome premenstrual, síndrome del ovario
poliquístico, hirsutismo, acné vulgaris, pubertad precoz, porfiria
intermitente aguda, criptorquidismo y pubertad retrasada.
\newpage
Al usar el término "combatir" una
enfermedad o padecimiento incluimos el sentido de aliviar los
síntomas del padecimiento (es decir, uso paliativo), o tratar la
enfermedad o padecimiento, o prevención de la enfermedad o
padecimiento (es decir uso profiláctico).
Los cánceres hormonodependientes apropiados para
el tratamiento con la invención expresan receptores de la GnRH, e
incluyen cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer
de endometrio, cáncer de ovario y cáncer de testículos.
Un sexto aspecto de la invención proporciona el
uso de un compuesto según el primer aspecto de la invención o una
composición farmacéutica según el segundo aspecto de la invención,
en la preparación de un medicamento para combatir la infertilidad en
un individuo que necesite del mismo.
Los compuestos de la invención pueden ser usados
para combatir la infertilidad mediante la inhibición de
gonadotropina endógena juntos a la administración controlada de
gonadotropina exógena, sobre todo en la inducción de la ovulación en
técnicas de reproducción asistida.
Así, los compuestos de la invención tienen
utilidad en las técnicas de fertilización in vitro (IVF, por
sus siglas de la expresión inglesa: in vitro
fertilisation).
Un séptimo aspecto de la invención proporciona
el uso de un compuesto según el primer aspecto de la invención o
una composición farmacéutica según el segundo aspecto de la
invención, en la preparación de un medicamento para modular la
producción de gonadotropinas u hormonas sexuales in vivo.
Por ejemplo, en el tratamiento de fertilidad,
los compuestos de la invención pueden ser usados para inhibir
completamente la producción hormonal endógena, la cual es entonces
sustituida, según se desee, ya sea como parte del conjugado, o por
separado. El tipo, la cantidad, la frecuencia y la duración del
reemplazo hormonal para su uso en el tratamiento de fertilidad son
bien conocidos a una persona experta en este campo, y en cualquier
caso sería determinado por un médico.
Los compuestos conjugados de la invención
también pueden ser usados in vitro, o menos probablemente
in vivo, para la diferenciación o desdiferenciación celular
que expresan receptores de la GnRH, como células madre, y células
inmunitarias, como los linfocitos.
Un octavo aspecto de la invención proporciona un
método de modificar un análogo de la GnRH como se define en la
reivindicación 1 con el fin de que tenga un tiempo de eliminación de
la mitad del mismo in vivo aumentado comparado con la GnRH,
el método comprende la conjugación del análogo de la GnRH a una
porción de hormona esteroide, o derivado hidroxi en C11, C17 o C21
de la misma, que es capaz de enlazarse a una proteína de enlace con
hormonas plasmáticas seleccionada de CBG, SHBG y albúmina.
Un noveno aspecto de la invención proporciona un
método de modificar un análogo de la GnRH como se define en la
Reivindicación 1 con el fin de que tenga una duración aumentada de
la actividad in vivo comparado con la GnRH, el método
comprende la conjugación del análogo de la GnRH a una porción de
hormona esteroide, o un derivado hidroxi en C11, C17 o C2 de la
misma, que es capaz de enlazarse a una proteína de enlace con
hormonas plasmáticas seleccionada de CBG, SHBG y albúmina.
Preferentemente, el análogo de la GnRH y la
porción de hormona o derivado de loa misma, son conjugados mediante
un grupo de enlace, como se define en la Reivindicación 9.
En una realización de los aspectos octavo y
noveno de la invención, el método incluye el enlace del análogo de
la GnRH que ha sido conjugado con una porción de hormona esteroide,
o un derivado hidroxi en C11, C17 o C21 de la misma, a una proteína
de enlace con hormonas plasmáticas seleccionada de CBG, SHBG y
albúmina. Típicamente, este enlace se realiza al ponerse en
contacto el análogo de la GnRH que ha sido conjugado con una porción
de hormona esteroide, o un derivado de la misma, con la proteína de
enlace con hormonas plasmáticas en una solución.
Preferencias para el análogo de la GnRH, la
porción de hormona esteroide o derivado de la misma, grupo de
enlace, y métodos para realizar la conjugación, se describen en este
documento en el Ejemplo 1 y anteriormente en lo que respecta al
primer aspecto de la invención.
La invención será descrita ahora más
detalladamente mediante referencia a las siguientes Figuras y
Ejemplos.
La figura 1A muestra la estructura de ciertos
conjugados antagonista de la GnRH-esteroide. Los
conjugados fueron producidos mediante la condensación de la cadena
lateral amina de D-Lisina en la posición seis del
péptido, con el carboxilo del 21-hemisuccinato de
21-hidroxiprogesterona. El resto de los residuos en
la cadena peptídica es representado mediante los números
1-5 y 7-10.
(21-hemisuccinato de
21-hidroxiprogesterona también son conocidos como
21-hemisuccinato de deoxicorticosterona y
21-hemisuccinato de
21-hidroxi-4-pregnena-3,20-diona).
La figura 1B muestra la estructura del agonista
de la GnRH 11-succinato de
11-hidroxiprogesterona.
La figura 2 muestra la afinidad de enlace del
receptor de la GnRH. Desplazamiento del agonista de la
^{125}I-GnRH enlazado a células completas
COS-7 transfectado con el receptor de la GnRH
humano. Péptido A Antagonista de la GnRH (\medcirc), conjugado
péptido A-progesterona (\bullet), péptido B
antagonista de la GnRH (\Box) y conjugado péptido
B-progesterona (\sqbullet).
La figura 3 muestra los efectos del conjugado
péptido A-progesterona y del conjugado péptido
B-progesterona en mamíferos, GnRH (0.1 \muM)
estimuló la producción de fosfato de inositol en células HEK 293 que
establemente expresaron el GnRHR de rata tipo I.
La figura 4 muestra los efectos de la
progesterona (\medcirc), péptido A-progesterona
(\bullet) y péptido B-progesterona
(\blacklozenge) en el enlace
[1,2,6,7-^{3}H]progesterona al plasma de
conejillo de indias embarazado, medidos con suspensión de carbono
cubierta con dextrina.
La figura 5 muestra que las concentraciones de
testosterona de monos tití machos inyectaron subcutáneamente ya sea
con 0.5 mg de péptido A-progesterona (\medcirc) o
con 0.5 mg de péptido A (\sqbullet).
La figura 6 muestra la presencia de agonista de
la GnRH radioetiqueteado-progesterona (\sqbullet)
y [D-Ala^{6}]GnRH (\ding{115}) en toda la
sangre de dos conejos machos inyectados intravenosamente en la vena
del oído con aproximadamente
15 000 000 cpm del conjugado agonistadela ^{125}I-GnRH-progesterona o ^{125}I-D-Ala^{6}] GnRH en 500 \mul de solución salina. La desaparición del conjugado de toda la sangre fue medida durante 3.5 horas.
15 000 000 cpm del conjugado agonistadela ^{125}I-GnRH-progesterona o ^{125}I-D-Ala^{6}] GnRH en 500 \mul de solución salina. La desaparición del conjugado de toda la sangre fue medida durante 3.5 horas.
La figura 7 muestra que el efecto de los
conjugados A, B, C, D y E y la progesterona en la activación del gen
CAT reportado enlazado al receptor de progesterona en células T47D
medido según actividad de CAT.
La figura 8 muestra la secuencia de análogos de
la GnRH preferidos. Los círculos negros indican que el análogo de la
GnRH tiene el mismo aminoácido en esa posición como lo tiene la
GnRH.
Las abreviaturas usadas en la Figura 8 son las
siguientes:
DSer (tBu): D-Ser
t-butileter;
DHis (ImBzl): D-His
benzilimidazol;
NEt: N-etilamida;
DNal: D-naftilalanina;
DCit: D-citrulina;
DhCit: D-homocitrulina;
DhArg(Et)_{2}:
D-dietilhomoarginina;
NMeTyr: N-metil tirosina;
Aph(Hor):
DAph(Cba):
DGlu(AA):
\vskip1.000000\baselineskip
El método de conjugación fue adaptado de Mattox,
Litwiller y Nelson^{9} y Rajkowski y Cittanova^{14}. Todos los
productos químicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich
Company Ltd. (Poole, Dorset) a excepción de los radioquímicos que
fueron comprados en Amersham Pharmacia Biotech UK Limited (Little
Chalfont, Buckinghamshire) y de los casos en que se menciona otro
lugar. El agonista de la GnRH
[D-Lys^{6}]GnRH o los dos antagonistas de
la GnRH fueron amablemente donados por J. Rivier (Salk Institute, La
Jolla, California)) [AcD-Nal^{1},
D-Cpa^{2}, D-Pal^{3}, Arg^{5},
D-Lys^{6},
D-Ala^{10}]GnRH, designado antagonista 1 y
[AcD-Nal1, D-Cpa^{2},
D-Pal^{3}, Arg^{5}, D-Lys^{6},
D-Ala^{10}]GnRH, designado antagonista 2,
fueron disueltos en buffer fosfato a 0,1M (pH 7,0) antes de la
adición de un volumen igual de DMF. El esteroide 20 veces por
encima del necesario (11a-hidroxiprogesterona
11-hemisuccinato en el caso de
[D-Lys^{6}]GnRH o
21-hidroxiprogesterona
21-hemisuccinato para la conjugación del antagonista
de la GnRH) fue disuelto en DMF anhidro con
1-hidroxibenzotriazol (HOBt) y N, N
'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) equimolar. La
mezcla fue agitada y dejada a temperatura ambiente durante 1 hora.
La solución que contenía el esteroide fue transferida en partes
alícuotas de 50 \mul a cada una de las soluciones de péptidos.
Después ser ajustada a un pH> 7 con tributilamina, la mezcla
péptido-esteroide se dejó a 4ºC durante 20
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una purificación inicial a través de
un cartucho Sep-Pak C18 (Millipore UK Ltd., Harrow,
Middlesex) con etilacetato seguido de hexafluropropanol/DMF (70:
30) antes de realizar el análisis de productos mediante la HPLC y
la espectrometría de masa. La RP-HPLC analítica fue
realizado en un Novapak C18 columna (4 \mum tamiz, 3,9 x 150 mm)
conectado a una bomba Beckman Coulter System Gold® LC125 y a un y
detector en serie de diodo LC168. El sistema buffer fue 0,1% de
TFA/agua como buffer A y 0,1% de TFA en acetonitrilo como buffer B.
La columna fue desarrollada con un gradiente de 10% a 100% del
buffer B durante 30 min. a un ritmo de flujo de 1 ml/min.
\vskip1.000000\baselineskip
La espectrometría de masas fue realizada en un
espectrómetro de masas Tofspec 2E MALDI-TOF
(Micromass UK Ltd.) con una matriz de
alfa-ciano-4-ácido
hidroxicinámico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mantuvieron células COS-7 y
COS-1 en DMEM que contenía 10% de suero fetal de
ternero, glutamina y penicilina/estreptomicina (medios normales).
Las células fueron transfectadas con el receptor de GnRH humano
(hGnRH-R) para el ensayo de enlace del receptor
celular completo usando el agente de transfección Superfect (Qiagen,
Crawley, West Sussex) en medios óptimos (Invitrogen Life
Technologies, Paisley, Escocia) durante cuatro horas. Las células
transfectadas fueron analizadas después de permanecer 48 horas
adicionales en medios normales (ver más arriba).
El ensayo de enlace de membrana de los
conjugados agonista de la GnRH-progesterona fue
realizado en células COS-1 transfectadas con
células hGnRH-R. COS-1 en placas de
100 mm, fueron lavadas dos veces en DMEM modificado con HEPES y
transfectadas con 15 \mug de ADN en DEAE dextrina esterilizada
mediante filtrado con buffer salino HEPES,
penicilina/estreptomicina y DMEM. Después de cinco horas incubación
a 37ºC, los medios fueron retirados y sustituidos por DMEM que
contenía penicilina/estreptomicina, 2% de FCS y 2% cloroquina a 10
mM y las placas fueron incubadas durante una hora adicional. Los
medios fueron aspirados, las células fueron lavadas y se añadieron
medios normales hasta el ensayo 24 horas más tarde.
Se usó una línea de células estable de HEK293
que expresa la GnRHR de rata tipo I desarrollada en nuestro
laboratorio para los ensayos de producción de fosfato de inositol.
Esta línea de células fue mantenida en DMEM que contenía 10% de
suero fetal de ternero, glutamina y penicilina/estreptomicina con la
adición de G418 a 500 \mug/ml a lo largo de todo el cultivo.
Donde fue necesario, las placas fueron revestidas con
Poli-L-Lisina para aumentar la
adhesión a los artículos de plástico durante ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células transfectadas COS-1
fueron lavadas en PBS, retiradas de las placas y centrifugadas a
1500 rpm durante cinco minutos para darle forma de pellets. El PBS
fue aspirado y las células fueron suspendidas nuevamente en el
buffer de homogeneización (20 mM Tris, 2 mM MgCl_{2}, pH 7.2),
agitadas y dejadas sobre hielo durante 10 minutos. La suspensión de
células fue transferida a 7 ml de homogeneizador (Jencons
(Scientific) Ltd., Leighton Buzzard, Buckinghamshire) y sumergido
15 veces con un émbolo suelto y 15 veces con un émbolo apretado.
Las células homogeneizadas fueron entonces centrifugadas a 4ºC
durante 10 min. a velocidad máxima y el sobrenadante fue retirado
con una bomba neumática. Los pellets de membrana restantes fueron
suspendidos nuevamente en el buffer de ensayo (40 mM Tris, 2 mM
MgCl_{2}, pH 7,4) y se mantuvo en hielo. Se llenaron tubos de
cristal de 12 mm enfriados previamente con 200 \mul de buffer de
ensayo, 50 \mul de membranas celulares, 100 \muM ^{125}I
[His^{5}, D-Tyr^{6}] GnRH en buffer de ensayo
(aproximadamente 120 000 CPM por tubo) y 50 \mul de ligando frío
(o buffer de ensayo en tubos Bo) en concentraciones crecientes. Los
tubos fueron incubados durante 2 horas en hielo antes de la adición
de 3 ml de polietilenimina acuosa helada al 0,01% (PEE) y filtración
por filtros de fibra de vidrio Whatman GG/C (Whatman International
Ltd., Maidstone, Kent) al vacío (previamente sumergida en PEE al
1%). Los filtros fueron entonces contados inmediatamente en un
contador gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
Células COS-7 fueron colocadas
en placas de 12 contenedores y mantenidas en una incubadora a 37ºC
durante 24 horas antes del ensayo. Las células fueron lavadas dos
veces con PBS antes de la adición de 500 \mul de HEPES modificado
en DMEM + 0,1% de BSA que contenía el ligando activo y el ligando
^{125}I (^{125}I [his^{5}D-Tyr^{6}] GnRH).
Las placas se lavaron dos veces en PBS y se solubilizaron por la
adición de 500 \mul a 0,1M de NaOH y se centrifugaron durante 20
minutos. Las muestras fueron contadas en un contador gamma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se colocaron células HEK293 que expresan la GnRH
receptiva de rata Tipo I en placas de 12 contenedores y fueron
incubadas a 37ºC, 5% de CO_{2} durante 24 horas, luego fueron
incubadas en DMEM especial que contenía 1% de FCS dializado (con
glutamina y penicilina/estreptomicina) y 1 \mul/contenedor de
mio-[2-^{3}H]inositol durante 48 horas
adicionales. Después de aspirar los medios y lavar con buffer de
incubación, se añadieron 500 \mul de un buffer adicional que
contenía 10 mM de LiCl a las placas y fueron incubadas a 37ºC
durante 30 min. Se añadió 1 \muM del agonista a cada contenedor
para una concentración final de 0,1 \muM y las placas fueron
incubadas bajo las mismas condiciones durante una 1 hora adicional.
La reacción fue terminada con 500 \mul de ácido fórmico a 10 mM,
incubadas a 4ºC durante 30 min. Las soluciones de ácido fórmico
fueron transferidas a tubos plásticos de 12 mm que contenían 500
\mul 50% AG1x lechada de resina (Bio-Rad
Laboratories Ltd, Hemel Hempsted, Hertfordshire). Fosfatos de
Inositol fueron extraídos mediante adición gradual, mezclándose por
agitación y retiro de agua destilada (1 ml) y tetraborato sódico,
formato sódico (1 ml, 5 mM, 60 mM). Después de la adición del ácido
fórmico, formato de amonio (1 ml, 0,1M, 1M) y agitación, 800 \mul
del supernadante fue contado mediante fluido de centelleo.
\vskip1.000000\baselineskip
El enlace de proteína plasmática fue determinado
mediante el enlace competitivo de conjugados esteroides, en
presencia de [1,2,6,7^{-3}H]progesterona o
[^{3}H]cortisol, al plasma de conejillo de indias
embarazado o suero de humano embarazado respectivamente. Se
diluyeron 20 \mul de suero con 2 ml de solución de carbono
revestida de dextrina (0,25 g de dextrina T-70, 2,5
g de polvo de carbono decolorante, lavado con ácido activado [Merck
Ltd., Lutterworth, Leicestershire] en 500 ml de PBS) y se incubaron
a temperatura ambiente. Después 30 min. la suspensión fue
centrifugada a 3000 x g durante 10 minutos, el supernadante fue
retirado y se desechó el pellet. 100 \mul de suero diluido fueron
colocados en partes alícuotas en tubos de centrífuga, seguido de la
adición de 1 \mumol de [^{3}H]esteroide/100 \mul de
PBS. Se añadieron 100 \mul de PBS (enlace total) ó 200
\mumol/100 \mul de ligando de competencia no etiquetado (enlace
específico) al suero diluido en duplicado. Los tubos fueron
agitados e incubados a temperatura ambiente durante 1 hora, y luego
durante unos 15 minutos adicionales en hielo. Se añadieron 750
\mul de suspensión de carbono revestida de dextrina adicionales y
se incubó durante 10 minutos en hielo, seguido de centrifugación a
4ºC durante 5 minutos. Se contó el fluido supernadante.
\vskip1.000000\baselineskip
Estudios de mono tití femeninos: Para
identificar la dosis efectiva requerida para inhibir la función del
cuerpo lúteo, se administraron 1,0, 0,5 ó 0,25 mg del conjugado
antagonista de la GnRH-esteroide en forma de bolo
subcutáneo en 1 ml de solución salina en dos sitios durante la fase
lútea media. Las concentraciones de progesterona fueron
monitoreadas mediante RIA. Se extrajo una muestra de sangre de 300
\mul el día antes de la inyección del antagonista de la GnRH. Se
tomaron muestras de la misma cantidad de sangre adicionales a las
0,4 y 8 horas durante el día de la inyección y durante los 3 días
siguientes. Se tomaron muestras de la misma cantidad de sangre tres
veces por semana hasta la siguiente ovulación.
Estudios de mono tití masculinos: para
determinar la duración de la acción en el receptor de la GnRH, se
administraron 0,5 mg del conjugado antagonista de la
GnRH-esteroide en 1 ml de solución salina en forma
de bolo subcutáneo en dos sitios, en seis monos tití machos
adultos. Las concentraciones de testosterona fueron monitoreadas
mediante RIA. Se administró el antagonista de la GnRH (0.5 mg) en
forma de bolo subcutáneo en 1 ml de solución salina en dos sitios
en tres monos tití. Las concentraciones de testosterona fueron
monitoreadas. Se tomó una muestra de sangre de 300 \mul el día
antes de la inyección con el antagonista de la GnRH y a las 0
horas, 4 horas y 8 horas durante el día de inyección y durante los 3
días siguientes. Tres muestras adicionales fueron tomadas durante la
semana subsiguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar el período de eliminación de la
mitad del conjugado agonista de la
GnRH-progesterona, se inyectaron 0,5 ml de solución
salina que contenía aproximadamente 10,000,000 cpm del conjugado
[D-Ala^{6}]GnRH yodada o
[D-Lys^{6}]GnRH-progesterona
en forma de bolo intravenoso en la vena del oído de un conejo macho.
Los conejos fueron sedados con 0,4 ml de Aceprom 10 (Milborrow
Animal Health, Republic of South Africa) inyectado
intramuscularmente 3-4 minutos antes del comienzo
del experimento. Se efectuó una inyección de repetición 2 horas
después. Se colectaron muestras de sangre de 1 ml en tubos
heparinizados desde una cánula interna colocada en una vena del
oído contralateral. Toda la sangre fue contada directamente para
determinar la desaparición de la circulación. Todos los
experimentos fueron realizados de acuerdo con las regulaciones de la
República Sudafricana.
\vskip1.000000\baselineskip
El conjugado agonista de la
GnRH-progesterona se enlazó al receptor humano de la
GnRH tipo I con ED_{50} de 2,9 \pm 1,2x 10^{-10}M (error
estándar, n = 1, los datos no se muestran). Los conjugados
antagonista de la GnRH A-progesterona y antagonista
B-progesterona también se enlazaron al receptor
(Figura 2) como se muestra mediante el ensayo de enlace celular
completo. El ED_{50} del antagonista
A-progesterona fue 1,1 \pm 0,2 x 10^{-7}M (n =
4) comparado con 1,6 \pm 0,4 x 10^{-8}M (n = 4) para la
secuencia del antagonista no modificado (p < 0,01, STT). Los
ED_{50}s para el antagonista B y anta-
gonista B-progesterona fueron 4,7 \pm 1,1 x 10^{-8}M (n = 4) y 1,1 \pm 0,3 x 10^{-7} M (n = 5) respectivamente (p <0,05, STT).
gonista B-progesterona fueron 4,7 \pm 1,1 x 10^{-8}M (n = 4) y 1,1 \pm 0,3 x 10^{-7} M (n = 5) respectivamente (p <0,05, STT).
\vskip1.000000\baselineskip
El conjugado agonista de la
GnRH-progesterona fue capaz de estimular la
producción de fosfato de inositol con un EC_{50} de 5,2 \pm 1,4
x 10^{-10}M (n = 2); este no es considerablemente diferente del
péptido solo (STT, p> 0,05). El antagonismo del GnRHR tanto del
conjugado antagonista A-progesterona como del
antagonista B-progesterona fue confirmado mediante
la inhibición de la producción de fosfato de inositol estimulada por
mamífero la GnRH (0.1PM) de mamíferos (Figura 3). El IC_{50} de
los conjugados antagonista A-progesterona y
antagonista B-progesterona de no eran
considerablemente diferentes (p> 0,05, STT) en 9,7 \pm 4,0 x
10^{-8}M (n = 6) y 8,6 \pm 2,6 x 10^{-8}M (n = 7)
respectivamente. No se observó activación de la producción de
fosfato de inositol ni en el conjugado antagonista
A-proges-
terona ni en el antagonista B-progesterona por sí solos (los datos no se muestran), confirmando el antagonismo puro.
terona ni en el antagonista B-progesterona por sí solos (los datos no se muestran), confirmando el antagonismo puro.
\vskip1.000000\baselineskip
El enlace de las proteínas plasmáticas fue
estudiado en el plasma de conejillo de indias embarazado porque en
esta especie está presente un nivel alto de globulina de enlace con
la progesterona (PBG, por sus siglas de la expresión inglesa:
progesterona binding globulin). Se mostró que la PBG se enlazaba
con la [^{3}H]progesterona en una manera específica y este
enlace fue inhibido mediante la progesterona no etiquetada con un
IC_{50} de 9,6 \pm 1,8 x 10^{-8}M (n = 4), y mediante el
conjugado antagonista A-progesterona con un
IC_{50} de 1,0 \pm 0,3 x 10^{-6}M (n = 6) y mediante el
conjugado antagonista B-progesterona con un
IC_{50} de 5,3 \pm 1,0 x 10^{-7}M (n = 4). La precisión de
esta interacción de proteína plasmática esteroide fue demostrada
mediante la incapacidad del cortisol para inhibir el enlace de
progesterona específica [^{3}H] progesterona, ya que la PBG sólo
se enlaza a la progesterona. También se observó que el conjugado
agonista-progesterona podía impedir el enlace del
[^{3}H]cortisol al suero humano embarazado (que contiene
concentraciones más altas de lo normal de CBGH) con un IC_{50} de
1,2 \pm 0,3 x 10^{-6}M (n = 2) en comparación con el IC_{50}
de 6,7 \pm 2,4 x 10^{-9}M (n = 2) para cortisol no etiquetado y
7,3 \pm 1,5 x 10^{-8}M (n = 3) para progesterona (los datos no
se muestran).
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de la actividad de enzimas CAT reveló
que todos los conjugados antagonista de la GnRH
21-hidroxiprogesterona 21-succinato
eran capaces de enlazar a y activar el receptor de la progesterona
en células T47D y son medidos mediante la actividad de enzimas CAT.
Las potencias de todos conjugados eran similares a la progesterona,
con prácticamente ninguna activación en 1 nM y actividad creciente
hasta 1 \muM. Los 5 conjugados probados son como se muestra en la
Tabla 1, a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de aminoácido de los antagonistas
probados mostradas se alinearon a la GnRH de mamíferos por
comparación. Se usan las siguientes abreviaturas: Glu; ácido de
glutámico, His; histidina, Trp; triptófano, Ser; serina, Tyr:
tirosina, Gly: glicina, Leu: leucina, Arg: arginina, Pro: prolina,
AcD-Nal: acilo de D-naptilalanina,
D-Cpa: D-clorofenilalanina,
D-Pal: D-piridilalanina,
D-Lys: D-lisina,
D-Ala: D-alanina,
Ac-\deltaPro: acilo de delta prolina,
D-Fpa: D-fluorofenilalanina,
D-Trp: D-triptófano.
Los cinco antagonistas son conjugados al mismo
esteroide, 21-hemisuccinato de
21-hidroxiprogesterona en diferentes posiciones
marcadas por el asterisco. En los conjugados A y B que el sitio de
conjugación se realiza mediante la
\varepsilon-amina de D-Lys en la
posición 6. En los conjugados C y E la conjugación se realiza
mediante la \varepsilon-amina de lisina en la
posición 7. En el conjugado D el esteroide es conjugado con el
terminal N de la amina del residuo de D-Pal.
\vskip1.000000\baselineskip
Los estudios de los ciclos de los monos tití
hembras adultos revelaron una reducción de la duración de la fase
luteal de 24,8 \pm 2,2 (n = 6) a 8 días en el animal que recibe
1,0 mg del conjugado antagonista A-progesterona y
en el animal al que se administran 0,5 mg una reducción de 21,0
\pm 1,2 (n = 7) a 11 días. Se juzgó que la ovulación había tenido
lugar cuando la concentración de progesterona en plasma alcanzó 30
ng/ml. Una reducción pasajera de las concentraciones de
progesterona en plasma también fue observada en el tercer mono tití
que recibe 0,25 mg del conjugado antagonista
A-progesterona, pero la regresión luteal completa y
la subsecuente ovulación no ocurrieron en este tiempo.
La administración de 0,5 mg del péptido A a
monos tití machos (n = 3) causó una disminución rápida de las
concentraciones de testosterona en plasma (Figura 5). La reducción
de la concentración de testosterona se mantuvo 8 horas después de
la inyección, pero aumentó aproximadamente a las 24 horas. En
comparación, 0,5 mg del conjugado péptido
A-progesterona (n = 6) también disminuyeron
rápidamente las concentraciones de testosterona, sin embargo esta
se mantuvo hasta al menos 72 horas después de la inyección (p
<0,05 versus 24 horas después de la inyección) y se recuperó
durante el 6^{to} día. Las restricciones de la Oficina Interna de
Permisos existente impidieron muestras de sangre adicionales en el
4º y 5º día.
\vskip1.000000\baselineskip
Los experimentos in vivo con conejo macho
fueron diseñados para investigar el período de eliminación de la
mitad del agonista de la GnRH-progesterona yodada en
comparación con el agonista de la GnRH no modificada (Figura 6). La
desaparición del compuesto yodado se usó para calcular tanto el
período de eliminación de la mitad del compuesto de la primera fase
correspondiente a la distribución de la molécula como para la
segunda fase que representa la eliminación metabólica y renal. El
conjugado agonista de la GnRH-progesterona tuvo un
período de eliminación de la mitad del mismo en la segunda fase de
53 \pm 13 mins (n = 3). El agonista de la GnRH
[D-Ala^{6}]GnRH tuvo un período de
eliminación de la mitad del mismo en la segunda fase de 21 mins
\pm 3 mins (n = 2). La diferencia del período de eliminación de la
mitad del compuesto entre los dos análogos no fue estadísticamente
significativa (p > 0,05, STT), pero la misma pudo haber alcanzado
significación con un mayor número de muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sugiere que la GnRH adopta forma de herradura
de caballo cuando se enlaza al receptor de la GnRH^{10}, por lo
tanto las hormonas fueron conjugadas al aminoácido de
D-Lys en la posición central (6) o en la posición
(7) o al Terminal N usando el grupo amino de la cadena lateral o al
terminal N.
Se esperaba que esto minimizara cualquier
obstáculo estérico resultante de la adición de la molécula
esteroide. De hecho, el cambio adecuado en el ED_{50},
determinado mediante el ensayo de enlace celular completo, para el
antagonista A versus antagonista A-progesterona fue
significativo (p < 0,01, STT), confirmando una afinidad reducida
para el receptor. Sin embargo, este no fue el caso para el
antagonista B versus antagonista B-progesterona,
indicando que cualquier obstáculo estérico depende de la secuencia
del péptido.Se incluyó un análisis del sistema de segundo mensajero
del fosfato de inositol para identificar si la modificación del
análogo de la GnRH tenía el potencial de introducir un agonismo
limitado en el receptor de la GnRH.Esto no se observó en el caso de
ninguno de los antagonistas antagonista
A-progesterona o antagonista
B-progesterona. La habilidad de estimular la
producción de fosfato de inositol también se investigó en el caso
del conjugado agonista de la GnRH-progesterona.
Nuevamente se observó que no ocurrió ninguna reducción significativa
en la estimulación de este sistema como resultado de la conjugación
con esteroides. Por lo tanto se concluyó que los conjugados análogo
de la GnRH-progesterona retienen el enlace de la
GnRH y el antagonismo a pesar de la significativa modificación
química.
Los nuevos antagonistas de la GnRH conjugados
investigados aquí demostraron enlazarce a las proteínas plasmáticas
en ensayos in vitro y este probablemente sea el caso in
vivo. Esto resultará en un período de eliminación de la mitad
de los análogos de la GnRH conjugados extendido, como se observó en
los experimentos de período de eliminación de la mitad de los
compuestos en los conejos. La exposición prolongada al conjugado no
enlazado, liberado continuamente desde las proteínas de enlace, se
enlazará al GnRHR a medida que el compuesto libre es
metabolizado.
Este estudio ha probado que las moléculas de
análogo de la GnRH-esteroide pueden ser
completamente bifuncionales en lo que respecta a enlace y
activación del receptor de la GnRH y la progeterona. Esto contrasta
con el estudio realizado anteriormente por Rahimipour et
al^{22} en el cual solo el aspecto de la GnRH de los
conjugados con ácido emódico es funcional. Esto también proporciona
información importante para la conjugación de otras moléculas con
esteroides, identificando que la modificación química mediante C21
no altera significativamente la interacción entre la progesterona y
su receptor.
La administración a monos tití de antagonistas
de la GnRH conjugados con esteroides y no conjugados ha permitido
el análisis de duración de la acción sin el miedo adicional de que
se enlace con la CBG. La mayoría de los monos del nuevo mundo
comparten una aparente resistencia a los glucocorticoides, con un
aumento del cortisol total y una reducción de las capacidades del
cortisol sérico^{8}. El Callithrix jacchus constituyó, por lo
tanto, un modelo in vivo con poca capacidad de CBG funcional
(confirmado mediante el ensayo de enlace de proteínas plasmáticas,
los datos no se muestran aquí) para permitir el análisis de la
bioactividad sin la interacción de proteínas plasmáticas. En
consecuencia, la depresión prolongada de la producción de
testosterona se debió, muy probablemente, a las propiedades
hidrófobas crecientes de la molécula que causan una extensión del
período de eliminación de la mitad del compuesto debido a
interacciones hidrófobas con las proteínas plasmáticas, membranas y
a un efecto depósito en la grasa. El reconocimiento de este efecto
es vital para entender los resultados observados en otros modelos
de primate con fisiología de la CBG similar a la de los humanos.
Estos datos son de valor debido a las similitudes de la fisiología
de los monos tití a los humanos y la farmacología más compleja de
los antagonistas de la GnRH.
Los experimentos in vivo efectuados en el
conejo macho, una especie que produce CBG^{17}, demostraron el
aumento del período de eliminación de la mitad del conjugado
agonista de la GnRH-progesterona en comparación con
agonista similar no conjugado. El agonista de la GnRH empleado era
hidrofílico en comparación con las secuencias hidrófobas de los
agonistas examinados en este documento. Esto implica que el aumento
del período de eliminación de la mitad del compuesto se debió con
toda probabilidad a la conjugación con la progesterona y, en
consecuencia, al enlace a las proteínas plasmáticas de transporte en
los estudios en el conejo. Por lo tanto, la conjugación de
moléculas peptídicas cortas coma la GnRH y sus análogos es un
mecanismo posible para aumentar el período de eliminación de la
mitad del compuesto en la circulación.
En resumen los conjugados análogo de la
GnRH-hormona esteroide fueron diseñados para
introducir capacidad a la proteína plasmática de enlace con
esteroides, modificando, de ese modo la farmacocinética y la
farmacodinámica de los análogos de la GnRH. Un agonista de la GnRH
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-GlyNH_{2},
y dos antagonistas de la GnRH
[AcD-Nal^{1},D-Cpa^{2},D-Pal^{3},
Arg^{5},D-Lys^{6},D-Ala^{10}]GnRH,
and
[Ac-\deltaPro^{1},D-Fpa^{2},D-Trp^{3},D-Lys^{6}]GnRH,
designados antagonistas A y B respectivamente, fueron conjugados
mediante la cadena lateral D-Lisina en la posición 6
del decapéptido con un elemento de enlace en el C11 o C21 de la
progesterona mediante diclohexilcarodiimida (DCC). Los productos
fueron purificados mediante HPLC del vector diódico e identificados
mediante espectrometría de masa. Los conjugados agonista de la
GnRH-progesterona y antagonista de la
GnRH-progesterona cada uno se enlazó al receptor de
la GnRH pituitario humano tipo I en el ensayo de enlace celular
completo. La inhibición de la producción estimulada de fosfato de
inositol en la GnRHdemostró que todos los conjugados agonistas y
antagonistas eran antagonistas puros en el receptor de la GnRH. Se
mostró que los conjugados tres péptidos-progesterona
compiten con la [^{3}H] progesterona por los sitios de enlace de
la proteína plasmática en el plasma de Conejillo de indias. El
IC_{50} del antagonista péptido A-progesterona
fue de 8,5 \pm 2,8 x 10^{-7}M (n = 5), de 4,5 \pm 0,8 x
10^{-7}M (n = 3) para el antagonista péptido
B-progesterona de y 2,9 \pm 1,2 x 10^{-10}M (n =
1) para el conjugado agonista-progesterona. La
bioactivitidad in vivo de los conjugados
antagonista-progesterona fue demostrada en monos
tití machos mediante la reducción de las concentraciones de
testosterona en plasma después de la inyección subcutánea. La
inyección intravenosa de agonista de la
GnRH-progesterona en conejos machos mostró que el
período de eliminación del antagonista se extendió mediante la
conjugación a una molécula de progesterona.
Para concluir, nuevas moléculas específicas
haptén de la GnRH hechas según la invención han sido diseñadas,
producidas e investigadas tanto in vitro como in vivo.
La modificación química de los análogos de la GnRH no afectó
significativamente la actividad in vitro y el período de
eliminación de la mitad del conjugado agonista de la
GnRH-progesterona en el conejo macho ha sido
extendido. Estas moléculas y otras similares superan algunos
problemas asociados con productos farmacéuticos peptídicos. La
conjugación de antagonistas de la GnRH a moléculas vehículo o su
inclusión en una partícula para su absorsión, además de la hormona
esteroide aumentará potencialmente la biodisponibilidad oral y
prolongará la duración de la acción.
\vskip1.000000\baselineskip
A un paciente que sufre de cáncer de mama se le
administra teverelix conjugado con
21-hidroxiprogesterona mediante un grupo de enlace
succinato en una dosificación cuya cantidad y frecuencia es tal que
el nivel terapéutico del agente activo en el sitio del tratamiento
se mantiene a un nivel ideal de EC90, pero preferentemente no menos
de EC50 a lo largo del período de tratamiento. El el tratamiento se
suministra oralmente o más local en dependencia de la aceptabilidad
del paciente, el objetivo de evitar efectos secundarios y la
biodisponibilidad sistémica.
\vskip1.000000\baselineskip
Un caballo hembra se le administra un
antagonista de la GnRH conjugado con
21-hidroxiprogesterona mediante un grupo de enlace
succinato en una dosificación cuya cantidad y frecuencia están
destinadas a prevenir la concepción. El tratamiento es suministrado
como una formulación de liberación lenta que es administrada
mediante inyección.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Anderson RA (2000) Hormonal
contraception in the male. Br Med Bull
56(3):717-728.
2. Christin-Maitre S,
Olivennes F, Dubourdieu S,
Chabbert-Buffet N, Charbonnel B,
Frydman R, and Bouchard P (2000) Effect of
gonadotropin-releasing hormone (GnRH) antagonist
during the LH surge in normal women and during controlled ovarian
hyperstimulation. Clin Endocrinol (Oxf) 52(6):
721-726.
3. Danforth DR, Williams RF,
Hsiu JG, Roh SI, Hahn D., McGuire JL,
Hodgen GD 1990 Intermittent GnRH antagonist plus
progestin contraception conserving tonic ovarian estrogen secretion
and reducing progestin exposure. Contraception
41(6):623-631.
4. Ditkoff EC, Cassidenti DL,
Paulson RJ, Sauer MV, Paul WL, Rivier J,
Yen SSC, Lobo RA (1991) The
gonadotropinreleasing hormone antagonist (Nal-Glu)
acutely blocks the luteinizing hormone surge but allows for
resumption of folliculogenesis in normal women. Am J Obs Gyne
165(6 Pt 1):1811-1817.
5. Fraser HM, Nestor JJJr,
Vickery BH (1987) Suppression of luteal function by a
luteinizing hormone-releasing hormone antagonist
during the early luteal phase in the stumptailed monkey and the
effects of subsequent administration of human chorionic
gonadotropin. Endocrinol
121(2):612-628.
6. Fraser HM, Lunn SF,
Cowen GM, Smith KB, Conn PM, (1991)
Effect of late follicular phase administration of antide on
ovulation and inhibin secretion in macaques. Contraception
44(6): 667-676.
7. Kenigsberg D, Hodgen GD,
(1986) Ovulation inhibition by administration of weekly
gonadotropin-releasing hormone antagonist. J Clin
Endocrinol Metab 62(4):734-738.
8. Klosterman LL, Murai JT,
Siiteri PK (1986) Cortisol levels, binding, and
properties of corticosteroid-binding globulin in the
serum of primates. Endocrinol
118(1):424-434.
9. Mattox VR, Litwiller RD,
Nelson AN (1979) A comparison of procedures for
attaching steroidal glucosiduronic acids to bovine serum albumin.
J Steroid Biochem 10:167-172.
10. Millar RP, Assefa D,
Ott T, Pawson A, Troskie B, Wakefield L,
Katz A GnRH and GnRH analogues: Structure, actions and
clinical applications. Horm Frontier Gynecol
5(4):77-83.
11. Nestor JJ, Tahilramani R,
Ho TL, Goodpasture JC, Vickery BH,
Ferrandon P (1992) Potent gonadotropin releasing
hormone antagonists with low histamine-releasing
activity. J Med Chem 35(21):
3942-3948.
12. Pavlou SN, Brewer K,
Farley G, Lindner J, Bastias M, Rogers
J, Swift LL, Rivier JE, Vale WW, Conn
PM, Herbert CM (1991) Combined administration of a
gonadotropin-releasing hormone antagonist and
testosterone in men induces reversible azoopermia without loss of
libido. J Clin Endo Metab
73(6):1360-1369.
13. Pavlou SN, Brewer K,
Farley G, Lindner J, Bastias M, Rogers
J, Swift LL, Rivier JE, Vale WW, Conn
PM, Herbert CM (1991) Combined administration of a
gonadotropin-releasing hormone antagonist and
testosterone in men induces reversible azoopermia without loss of
libido. J Clin Endo Metab
73(6):1360-1369.
14. Pavlou SN, Brewer K,
Farley G, Lindner J, Bastias M, Rogers
J, Swift LL, Rivier JE, Vale WW, Conn
PM, Herbert CM (1991) Combined administration of a
gonadotropin-releasing hormone antagonist and
testosterone in men induces reversible azoopermia without loss of
libido. J Clin Endo Metab
73(6):1360-1369.
15. Russell-Jones GJ,
Westwood SW, Farnworth PG, Findlay JK,
Burger HG, (1995) Synthesis of LHRH antagonists
suitable for oral administration via the Vitamin B12 uptake system.
Bioconjugate Chem 6:34-42.
16. Siiteri PK, Murai JT,
Hammond GL, Nisker JA, Raymoure WJ, Kuhn
RW (1982) The serum transport of steroid hormones Rec Prog
Horm Res 38:457-510.
17. Seal US, Doe RP (1965)
Vertebrate distribution of Corticosteroid-binding
globulin and some endocrine effects on concentration.
Steroids 5:827-841.
18. Swerdloff RS, Bagatell CJ,
Wand C, Anawalt BD, Berman N, Steiner B,
Bremner WJ (1998) Suppression of spermatogenesis in
man induced by Nal-Glu gonadotropin releasing
hormone antagonist and testosterone enanthate (TE) is maintained by
TE alone. J Clin Endo Metab
83(10):3527-3533.
19. Westphal U (1993)
Steroid-protein interaction: From past to present.
J Steroid Biochem 19(1):1-15.
20. McEwan JF, Veitch HS,
Russell-Jones GJ (1999) Synthesis and
Biological Activity of
Ribose-5'-Carbamate Derivatives of
Vitamin B12. Bioconjugate Chem. 20, 10,
1131-1136.
21. Alsenz J,
Russell-Jones GJ, Westwood S,
Levet-Trafit B, de Smidt PC
(2000) Oral Absorption of Peptides Through the Cobalamin
(Vitamin B12) Pathway in the Rat Intestine. Pharmaceutical
Research, 21, Vol. 17, No. 7, 2000.
22. Rahimipour S,
Ben-Aroya N, Fridkin M, Koch Y
(2000) Design, Synthesis, and Evaluation of a
Long-Acting, Potent Analogue of
Gonadotropin-Releasing Hormone. J. Med. Chem.
22, 44, 3645-3652.
23. Thau (1984) Luteinizing
hormone-releasing hormone (LHRH) and its analogs for
contraception in women: a review. Contraception,
29(2): 143-162.
24. Millar R.P. (2003)
Gonadatropin-releasing hormones and their receptors,
Chapter 1, Reproductive Medicine: Molecular, Cellular and Genetic
Fundamentals, Eds. B.C.J.M. Fauser et al, The Parthenon
Publishing Group, New York, USA. ISBN:
1-84214-019-1.
25. Millar R.P. et al
(2000) Progress towards the developmnent of
non-peptide orallymactive
gonadatropin-releasing hormone (GnRH) antagonists:
therapeutic implications. Br. Med. Bull. 56(3):
761-772.
26. Burton & Westphal (1972)
Steroid hormone-binding proteins in blood plasma.
Metabolism 21(3): 253-276.
27. Cunningham G.R. et al
(1981) Steroid structural requirements for high affinity
binding to human sex steroid binding protein (SBP). Stenoids
38(3): 243-262.
28. Mickelson K.E. et al
(1981) Steroid-protein interactions. Human
corticosteroid binding globulin: Some physiochemical properties and
binding specificity. Biochemistry 20:
6211-6218.
\vskip1.000000\baselineskip
La lista de referencias citadas por el
solicitante fue hecha solamente para conveniencia del lector. No
forma parte del documento de patente europea. Aún cuando se tuvo
gran cuidado al compilar las referencias, no se pueden excluir
errores u omisiones y la EPO desconoce toda responsabilidad a este
respecto.
- \bullet WO 9009799 A [0016]
- \bullet WO 9428015 A [0036]
Literatura no referente a patentes citada en la
descripción
\bulletAZZIZ et al. Journal of
Clinical Endocrinology and Metabolism, 1995 [0013]
\bulletIRAHARA et al. Gynecol
Obstet Invest, 2001, vol. 52, 217-222
[0014]
\bulletVINCZE et al. Cancer Res
Clin Oncol, 1994, vol. 120, 578-584
[0015]
\bulletGOULET. Ann. Reports Med.
Chem., 1995, vol. 30, 169-178 [0034]
\bulletNESTOR; VICKERY. Ann.
Reports Med. Chem., 1988, vol. 23,
211-220 [0034]
\bulletDUTTA; BARRINGTON. Ann.
Reports Med. Chem., 1985, vol. 20,
203-214 [0034]
\bulletLU et al. J. Org. Chem.,
1981, vol. 46, 3433 [0043]
\bulletDUAX et al. Advances in Drug
Research, 1989, vol. 18, 115-138
[0064]
\bulletARANYI. Hung. Biologia,
1982, vol. 30, 145-169 [0064]
\bulletRAYNAUD; OJASOO. Nobel
Symposium, 1983, vol. 57, 141-170
[0064]
\bulletDUAX; GRIFFIN. Alfred Benzon
Symposium, 1989, vol. 28, 62-77
[0064]
\bulletOJASOO et al. Mol. Struct.
Biol. Act. Steroids. CRC, 1992, 157-207
[0064]
\bulletDUAX; GRIFFIN. NATO ASI series
E: Applied Sciences, 1998, vol. 352,
1-14 [0064]
\bulletO'SULLIVAN et al. Anal.
Biochem, 1979, vol. 100, 100-108
[0082]
\bulletJULIAN et al. Anal.
Biochem, 1983, vol. 132, 68 [0083]
\bulletANDERSON RA. Hormonal
contraception in the male. Br Med Bull, 2000, vol. 56
(3), 717-728 [0168]
\bulletCHRISTIN-MAITRE
S; OLIVENNES F; DUBOURDIEU S;
CHABBERT-BUFFET N;
CHARBONNELB; FRYDMAN R; BOUCHARD P. Effect of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) antagonist during the LH surge in normal women and during controlled ovarian hyperstimulation. Clin Endocrinol (Oxf), 2000, vol. 52 (6), 721-726 [0168]
CHARBONNELB; FRYDMAN R; BOUCHARD P. Effect of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) antagonist during the LH surge in normal women and during controlled ovarian hyperstimulation. Clin Endocrinol (Oxf), 2000, vol. 52 (6), 721-726 [0168]
\bulletDANFORTH DR; WILLIAMS
RF; HSIU JG; ROH SL; HAHN D.; MCGUIRE
JL; HODGEN GD. Intermittent GnRH antagonist plus progestin
contraception conserving tonic ovarian estrogen secretion and
reducing progestin exposure. Contraception, 1990, vol.
41 (6) , 623-631 [0168]
\bulletDITKOFF EC; CASSIDENTI
DL; PAULSON RJ; SAUER MV; PAUL WL;
RIVIER J; YEN SSC; LOBO RA. The
gonadotropin-releasing hormone antagonist
(Nal-Glu) acutely blocks the luteinizing hormone
surge but allows for resumption of folliculogenesis in normal women.
Am J Obs Gyne, 1991, vol. 165,
1811-1817 [0168]
\bulletFRASER HM; NESTOR JJJR;
VICKERY BH. Supretion of luteal function by a luteinizing
hormone-releasing hormone antagonist during the
early luteal phase in the stumptailed monkey and the effects of
subsequent administration of human chorionic gonadotropin.
Endocrinol, 1987, vol. 121 (2),
612-628 [0168]
\bulletFRASER HM; LUNN SF;
COWEN GM; SMITH KB; CONN PM. Effect of late
follicular phase administration of antide on ovulation and inhibin
secretion in macaques. Contraception, 1991, vol. 44
(6), 667-676 [0168]
\bulletKENIGSBERG D; HODGEN GD.
Ovulation inhibition by administration of weekly
gonadotropin-releasing hormone antagonist. J
Clin 1986, vol. 62 (4), 734-738
[0168]
\bulletKLOSTERMAN LL; MURAI JT;
SIITERI PK. Cortisol levels, binding, and properties of
corticosteroid-binding globulin in the serum of
primates. Endocrinol, 1986, vol. 118 (1),
424-434 [0168]
\bulletMATTOX VR; LITWILLER RD;
NELSON AN. A comparison of procedures for attaching steroidal
glucosiduronic acids to bovine serum albumin. J Steroid
Biochem, 1979, vol. 10, 167-172
[0168]
\newpage
\bulletMILLAR RP; ASSEFA D;
OTT T; PAWSON A; TROSKIE B; WAKEFIELD L;
KATZ A GNRH; GNRH ANALOGUES. Structure, actions and clinical
applications. Horm Frontier Gynecol, vol. 5 ((4)),
77-83 [0168]
\bulletNESTOR JJ; TAHILRAMANI
R; HO TL; GOODPASTURE JC; VICKERY BH;
FERRANDON P. Potent gonadotropin releasing hormone
antagonists with low histamine-releasing activity.
J Med Chem, 1992, vol. 35 (21),
3942-3948 [0168]
\bulletPAVLOU SN; BREWER K;
FARLEY G; LINDNER J; BASTIAS M; ROGERS
J; SWIFT LL; RIVIER JE; VALE WW; CONN
PM. Combined administration of a
gonadotropin-releasing hormone antagonist and
testosterone in men induces reversible azoopermia without loss of
libido. J Clin Endo Metab, 1991, vol. 73 (6),
1360-1369 [0168] [0168] [0168]
\bulletRUSSELL-JONES
GJ; WESTWOOD SW; FARNWORTH PG; FINDLAY JK;
BURGER HG. Synthesis of LHRH antagonists suitable for oral
administration via the Vitamin B12 uptake system. Bioconjugate
Chem, 1995, vol. 6, 34-42 [0168]
\bulletSIITERI PK; MURAI JT;
HAMMOND GL; NISKER JA; RAYMOURE WJ; KUHN
RW. The serum transport of steroid hormones. Rec Prog Horm
Res, 1982, vol. 38, 457-510 [0168]
\bulletSEAL US; DOE RP.
Vertebrate distribution of Corticosteroid-binding
globulin and some endocrine effects on concentration.
Steroids, 1965, vol. 5, 827-841
[0168]
\bulletSWERDLOFF RS; BAGATELL
CJ; WAND C; ANAWALT BD; BERMAN N;
STEINER B; BREMNER WJ. Suppression of spermatogenesis
in man induced by Nal-Glu gonadotropin releasing
hormone antagonist and testosterone enanthate (TE) is maintained by
TE alone. J Clin Endo Metab, 1998, vol. 83 (10),
3527-3533 [0168]
\bulletWESTPHAL U.
Steroid-protein interaction: From past to present.
J Steroid Biochem, 1993, vol. 19 (1),
1-15 [0168]
\bulletMCEWAN JF; VEITCH HS;
RUSSELL-JONES GJ. Synthesis and Biological
Activity of Ribose-5'-Carbamate
Derivatives of Vitamin B12. Bioconjugate Chem., 1999,
vol. 20 (10), 1131-1136
\bulletALSENZ J;
RUSSELL-JONES GJ; WESTWOOD S;
LEVET-TRAFIT B; DE SMIDT PC. Oral
Absorption of Peptides through the Cobalamin (Vitamin B12) Pathway
in the Rat Intestine. Pharmaceutical Research, 21,
2000, vol. 17 (7 [0168]
\bulletRAHIMIPOUR S;
BEN-AROYA N; FRIDKIN M; KOCH Y.
Design, Synthesis, and Evaluation of a Long-Acting,
Potent Analogue of Gonadotropin-Releasing Hormone.
J. Med. Chem., 2000, vol. 22 (44),
3645-3652 [0168]
\bulletTHAU. Luteinizing
hormone-releasing hormona (LHRH) and its analogs for
contraception in women: a review. Contraception, 1984,
vol. 29 (2), 143-162 [0168]
\bullet Gonadatropin-releasing
hormones and their receptors. MILLAR R.P. et al.
Reproductive Medicine: Molecular, Cellular and Genetic
Fundamentals. 2003 [0168]
\bulletMILLAR R.P. et al.
Progress towards the developmnent of non-peptide
orallymactive gonadatropin-releasing hormone (GnRH)
antagonists: therapeutic implications. Br. Med. Bull.,
2000, vol. 56 (3), 761-772 [0168]
\bulletBURTON; WESTPHAL. Steroid
hormone-binding proteins in blood plasma.
Metabolism, 1972, vol. 21 (3), 253-276
[0168]
\bulletCUNNINGHAM G.R. et al.
Steroid structural requirements for high affinity binding to human
sex steroid binding protein (SBP). Stenoids, 1981,
vol. 38 (3), 243-262 [0168]
\bulletMICKELSON K.E. et al.
Steroid-protein interactions. Human corticosteroid
binding globulin: Some physiochemical properties and binding
specificity. Biochemistry, 1981, vol. 20,
6211-6218 [168]
Claims (29)
1. Un compuesto que consta de un análogo de la
hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) conjugado con una
porción de hormona esteroide, o un derivado hidroxi en C11, C17 o
C21 de la misma, que es capaz de enlazarse a una proteína de enlace
con hormonas plasmáticas seleccionada de globulina de enlace con el
cortisol (CBG), globulina de enlace con hormonas sexuales (SHBG) y
albúmina, en el cual el análogo de la GnRH es un antagonista de la
GnRH seleccionado entre [AcD-Nal^{1},
D-Cpa^{2}, D-Pal^{3}, Arg^{5},
D-Lys^{6}, D-Ala^{10}] GnRH,
[Ac-\deltaPro^{1}, D-Fpa^{2},
D-Trp^{3}, D-Lys^{6}] GnRH,
Cetrorelix, Ganirelix, Abarelix, Antide, Teverelix, FE200486,
Na-Glu, A-75998,
A-76154, A-84861,
D-26344, D-63153, D21775, ramorelix,
degarelix, NBI-42902, Org-30850,
detirelix, iturelix, TAK-013, TAK810, AN 207,
AcD-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Arg-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH_{2};
Ac-\deltaPro-D-Fpa-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH_{2};
AcD-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Arg-D-Lys-Lys-Leu-Arg-D-Ala-NH_{2};
D-Pal-Ser-Arg-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH_{2};
AcD-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Arg-D-Lys-Lys-Arg-Pro-D-Ala-NH_{2};
[D-Pyr^{1}, D-Phe^{2},
D-Trp^{3-6}] GnRH;
D-Lys^{6}Antide; Lys^{5} Antide o Lys^{8}
Antide, o un agonista de la GnRH seleccionado entre
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-GlyNH_{2},
Triptorelin, Buserelin, leuprolide, goserelin, deslorelin,
ProMaxx-100, avorelin, histrelin, nafarelin,
leuprorelin o triptorelin.
2. Un compuesto según la Reivindicación 1 en el
cual la porción de hormona esteroide es el estradiol, la
progesterona, el cortisol, la corticosterona, la estrona, la
testosterona o la dihidroxitestosterona.
3. Un compuesto según la Reivindicación 2 en el
cual el derivado de la progesterona es la
11\alpha-hidroxiprogesterona o la
21-hidroxiprogesterona.
4. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el cual el compuesto conserva la
actividad hormonal in vivo de la porción de hormona esteroide
o del derivado de la misma.
5. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 1-3 en el cual el compuesto no
presenta la actividad hormonal in vivo de la porción de
hormona esteroide o del derivado de la misma.
6. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el cual la porción de hormona
esteroide se enlaza a la proteína de enlace con hormonas plasmáticas
in vivo.
7. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 1-6 donde el análogo de la GnRH y
la porción de hormona esteroide conjugados son divisibles.
8. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 1-6 donde el análogo de la GnRH y
la porción de hormona esteroide están directamente conjugados.
9. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 1-7 donde el análogo de la GnRH y
la porción de hormona esteroide están conjugados mediante un grupo
de enlace representado por la fórmula
-A^{1}-D-A^{2}-, en la cual D
representa,
- (a)
- un alquileno, un alquenileno o un alquinileno (cuyos tres últimos grupos son opcionalmente interrumpidos o eliminados mediante NH, O o S, un carbociclo o un heterociclo y/o son opcionalmente interrumpidos por -S-S-),
- (b)
- un carbociclo, o
- (c)
- un heterociclo,
o D representa el fragmento estructural
-D^{1}-A^{3}-D^{2}-, en el
cual D^{1} y D^{2} representan, de manera independiente, a D
como se define anteriormente desde el inciso (a) hasta el (c); y
A^{1}, A^{2} y A^{3} representan de manera
independiente, un enlace directo, -C(O)-, -C(S)-,
-S(O)-, -S(O)_{2}- o
-P(O)_{2}-, a condición de que A^{3} no represente
un enlace directo cuando D^{1} y D^{2} son ambos eliminados de
manera independiente por O o NH en el punto de conexión con
A^{3}.
10. Un compuesto según la Reivindicación 9 en el
cual el elemento de enlace es un elemento de enlace succinato o un
derivado del mismo.
11. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el cual el análogo de la GnRH tiene
un residuo D-lisina, y el análogo de la GnRH está
conjugado con la porción de hormona esteroide mediante la
D-lisina.
\newpage
12. Un compuesto según la Reivindicación 1 que
tiene fórmula A:
o fórmula
B
en las cuales los números
1-5 y 7-10 representan residuos en
una cadena
peptídica.
13. Un compuesto según la Reivindicación 1 que
es:
- AcD-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Arg-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH_{2} conjugado con 21-succinato de 21-hidroxiprogesterona en la \varepsilon-amina de D-Lys en la posición 6;
- Ac-\deltapro-D-Fpa-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH_{2} conjugado con 21-succinato de 21-hidroxiprogesterona en la \varepsilonamina de D-Lys en la posición 6;
- AcD-Nal-D-Cpa-D-Pa1-Ser-Arg-D-Lys-Lys-Leu-Arg-D-Ala-NH_{2} conjugado con 21-succinato de 21-hidroxiprogesterona en la \varepsilonamina de Lys en la posición 7;
- D-Pal-Ser-Arg-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH_{2} conjugado con 21-succinato de 21-hidroxiprogesterona en el terminal N de la amina de D-Pal;
- AcD-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Arg-D-Lys-Lys-Arg-Pro-D-Ala-NH_{2} conjugado con 21-succinato de 21-hidroxiprogesterona en la \varepsilonamina de Lys en la posición 7; o
- [DLys^{6}] GnRH conjugado con 11-succinato de 11\alpha-hidroxiprogesterona en el grupo \varepsilonamina de D-Lys en la posición 6.
14. Un compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que está enlazado a la proteína de
enlace con hormonas plasmáticas.
15. Una composición farmacéutica que contiene un
compuesto según cualquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 14 y
un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
16. Una composición farmacéutica según la
Reivindicación 15 que es apropiada para la administración por vía
oral.
17. Una composición farmacéutica según la
Reivindicación 15 que es una formulación de liberación lenta.
18. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 1-14, o una composición
farmacéutica según cualquiera de las Reivindicaciones
15-17, para su uso médico.
19. El uso de un compuesto según cualquiera de
las Reivindicaciones 1-14, o una composición
farmacéutica según cualquiera de las Reivindicaciones
15-17, en la preparación de un medicamento para
reducir la fertilidad de un individuo.
20. El uso de un compuesto según cualquiera de
las 1-14, o una composición farmacéutica según
cualquiera de las Reivindicaciones 15-17, en la
preparación de un medicamento para combatir una enfermedad o
condición hormonodependiente seleccionada entre cáncer
hormonodependiente, hipertrofia prostática benigna, endometriosis,
fibromas uterinos, síndrome premenstrual, síndrome del ovario
poliquístico, hirsutismo, acné vulgaris, pubertad precoz,
porfiria aguda intermitente, criptorquidia y pubertad retrasada.
21. Un uso según la Reivindicación 20 en el cual
el cáncer hormonodependiente es el cáncer de mama, cáncer de
próstata, cáncer de útero o cáncer de endometrio.
22. El Uso de un compuesto según cualquiera de
las Reivindicaciones 1-14, o una composición
farmacéutica según cualquiera de las Reivindicaciones
15-17, en la preparación de un medicamento para
combatir la infertilidad en un individuo que tenga necesidad del
mismo.
23. Un método de modificar un análogo de la GnRH
como se define en la Reivindicación 1 de modo que este tenga un
tiempo de eliminación de la mitad del mismo in vivo mayor
comparado con el de la GnRH, comprendiendo el método la conjugación
del análogo de la GnRH con una porción de hormona esteroide, o un
derivado hidroxi en C11, C17 o C21 de la misma, que sea capaz de
enlazarse a una proteína de enlace con hormonas plasmáticas
seleccionada de CBG, SHBG y albúmina.
24. Un método de modificar un análogo de la GnRH
como se define en la Reivindicación 1 de modo que este tenga una
duración de la actividad in vivo mayor comparado con el de la
GnRH, comprendiendo el método la conjugación del análogo de la GnRH
con una porción de hormona esteroide, o un derivado hidroxi en C11,
C17 o C21 de la misma, que sea capaz de enlazarse a una proteína de
enlace con hormonas plasmáticas seleccionada de CBG, SHBG y
albúmina.
25. Un método según las Reivindicaciones 23 ó 24
donde el paso de la conjugación comprende la conjugación del análogo
de la GnRH y de la porción de hormona esteroide o derivado de la
misma mediante un grupo de enlace como se define en la
Reivindicación 9.
26. Un método según las Reivindicaciones 23, 24
ó 25 que también comprende el enlace de la porción de hormona
esteroide o derivado de la misma a la proteína de enlace con
hormonas plasmáticas.
27. Un compuesto según las Reivindicaciones 1 ó
2 en el cual el derivado de la porción de hormona esteroide es un
derivado hidroxi en C17 o C21 de la misma.
28. Un uso según cualquiera de las
Reivindicaciones 19-22 en el cual el derivado de la
porción de hormona esteroide es un derivado hidroxi en C17 o C21 de
la misma.
29. Un método según cualquiera de las
Reivindicaciones 23-25 donde el derivado de la
porción de hormona esteroide es un derivado hidroxi en C17 o C21 de
la misma.
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE602005026998D1 (de) | 2005-01-14 | 2011-04-28 | Camurus Ab | Somatostatin-analog-formulierungen |
| EP1848403B8 (en) * | 2005-01-14 | 2010-05-19 | Camurus Ab | Topical bioadhesive formulations |
| US9649382B2 (en) | 2005-01-14 | 2017-05-16 | Camurus Ab | Topical bioadhesive formulations |
| SI1845942T1 (sl) | 2005-01-14 | 2014-06-30 | Camurus Ab | Gnrh analogne formulacije |
| US9060935B2 (en) | 2005-01-21 | 2015-06-23 | Camurus Ab | Pharmaceutical lipid compositions |
| JP5198261B2 (ja) | 2005-06-06 | 2013-05-15 | カムルス エービー | Ｇｌｐ−１類似体製剤 |
| EP2609934A1 (en) * | 2007-02-16 | 2013-07-03 | KTB Tumorforschungsgesellschaft mbH | Receptor And Antigen Targeted Prodrug |
| EP2148682A1 (en) * | 2007-04-23 | 2010-02-03 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Combination of progesterone-receptor antagonist together with a lutein-hormone-releasing hormone agonist and antagonist for use in brca mediated diseases |
| GB0711656D0 (en) | 2007-06-15 | 2007-07-25 | Camurus Ab | Formulations |
| GB0716385D0 (en) | 2007-08-22 | 2007-10-03 | Camurus Ab | Formulations |
| ES2633453T3 (es) | 2008-01-24 | 2017-09-21 | Esperance Pharmaceuticals | Constructos de fusión de dominios líticos y métodos de preparación y utilización de los mismos |
| GB0815435D0 (en) | 2008-08-22 | 2008-10-01 | Camurus Ab | Formulations |
| SG175744A1 (en) * | 2009-04-24 | 2011-12-29 | Polypeptide Laboratories As | Method for the manufacture of degarelix |
| US10093961B2 (en) * | 2009-12-22 | 2018-10-09 | Esperance Pharmaceuticals | Methods for diagnosis of and predicting treatment efficacy of hormone receptor expressing tumors, cancers and neoplasias |
| US9216037B2 (en) | 2013-06-21 | 2015-12-22 | Previvo Genetics, Llc | Uterine lavage for embryo retrieval |
| US20150272622A1 (en) | 2011-12-22 | 2015-10-01 | Previvo Genetics, Llc | Recovery and processing of human embryos formed in vivo |
| ES2834318T3 (es) | 2012-05-25 | 2021-06-17 | Camurus Ab | Formulaciones de agonistas de receptores de la somatostatina |
| EP2914633B1 (en) | 2012-10-30 | 2021-12-08 | Esperance Pharmaceuticals, Inc. | Antibody/drug conjugates and methods of use |
| EP4223298A3 (en) * | 2013-03-15 | 2023-08-16 | AbbVie Inc. | Compositions for use in treating heavy menstrual bleeding |
| EP3275888B1 (en) * | 2016-07-28 | 2019-09-25 | Council of Scientific & Industrial Research | Progesterone-cationic lipid hybrid as anticancer agent and the process of synthesis thereof |
| ES2983735T3 (es) | 2016-12-14 | 2024-10-24 | Purdue Research Foundation | Conjugados del receptor de la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH-R) y usos de los mismos |
| IL278082B2 (en) | 2018-04-19 | 2025-03-01 | Abbvie Inc | Methods for treating heavy menstrual bleeding |
| WO2020051319A1 (en) * | 2018-09-05 | 2020-03-12 | Assembly Biosciences, Inc. | Cyclic sulfamide compounds for treatment of hbv |
Family Cites Families (74)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3974135A (en) * | 1971-06-24 | 1976-08-10 | Karl Folkers | Synthetic decapeptide having the activity of the luteinizing hormone releasing hormone and method for producing the same |
| US3953416A (en) * | 1971-12-20 | 1976-04-27 | Karl Folkers | Synthetic decapeptide having the activity of the luteinizing hormone releasing hormone and method for manufacturing the same |
| US3843065A (en) * | 1972-10-13 | 1974-10-22 | Bauer Bros Co | Labyrinth seal ring for pulp refiner |
| US3849389A (en) * | 1972-10-19 | 1974-11-19 | Lilly Co Eli | Intermediates to the 5-phe analog of lh-rh |
| US3813382A (en) * | 1972-12-20 | 1974-05-28 | American Home Prod | Analogs of luteinizing hormone releasing factor substituted in position 9 |
| US3855199A (en) * | 1973-10-03 | 1974-12-17 | American Home Prod | P-glu-d-phe-t rp-ser-tyr-d-ala-leu-arg-pro-gly-nh2-and intermediates |
| US3890437A (en) * | 1973-10-03 | 1975-06-17 | American Home Prod | Method of inhibiting fertility in mammals using D{13 Phe{hu 2{b {13 D{13 Ala{hu 6{b {13 LRF |
| US3914412A (en) * | 1973-10-11 | 1975-10-21 | Abbott Lab | {8 Des{13 Gly{9 {0 10 -Gn{13 RH nonapeptide amide analogs in position 6 having ovulation-inducing activity |
| US4072668A (en) * | 1973-11-06 | 1978-02-07 | The Salk Institute For Biological Studies | LH-RH Analogs |
| US3892723A (en) * | 1974-02-04 | 1975-07-01 | American Home Prod | P-Glu-Trp-Ser-Tyr-D-Pgl-Leu-Arg-Pro-Gly-NH{HD 2 {B and intermediates |
| US3901872A (en) * | 1974-03-13 | 1975-08-26 | American Home Prod | P-glu-his-trp-ser-tyr-d-pgl-leu-arg-pro-gly-nh' 2 'and intermediates |
| US3886135A (en) * | 1974-04-10 | 1975-05-27 | American Home Prod | P-GLU-D-PHE-TRP-SER-TYR-D-PGL-LEU-ARG-PRO-GLY-NH{HD 2 {B and intermediates |
| US3896104A (en) * | 1974-05-22 | 1975-07-22 | American Home Prod | P-glu-his-trp-ser-tyr-d-lys-leu-arg-pro-gly-nh' 2 'and intermediates |
| US3915947A (en) * | 1974-07-11 | 1975-10-28 | Lilly Co Eli | Des-{8 His{hu 2{b ,Gly{hu 10{b {9 -D-Ala{hu 6 {b LHRH ethylamide as an inhibitor of LHRH |
| DE2438350C3 (de) * | 1974-08-09 | 1979-06-13 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Peptide mit starker LH-RH/FSH-RH-Wirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zubereitungen |
| US3929759A (en) * | 1974-11-04 | 1975-12-30 | American Home Prod | P-Glu-D-Phe-Trp-Ser-Tyr-D-Arg-Leu-Arg-Pro-Gly-NH{HD 2 {B and intermediates |
| US3937695A (en) * | 1974-11-04 | 1976-02-10 | American Home Products Corporation | P-Glu-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates |
| US4010125A (en) * | 1975-06-12 | 1977-03-01 | Schally Andrew Victor | [D-Trp6 ]-LH-RH and intermediates therefor |
| FR2329293A1 (fr) * | 1975-10-29 | 1977-05-27 | Parke Davis & Co | Nouveaux nonapeptides et procedes pour leur production |
| US4018914A (en) * | 1975-11-13 | 1977-04-19 | Abbott Laboratories | Parturition inducement |
| US4022760A (en) * | 1976-01-19 | 1977-05-10 | Parke, Davis & Company | Tripeptides and methods for their production |
| US4022759A (en) * | 1976-01-19 | 1977-05-10 | Parke, Davis & Company | Tripeptides and methods for their production |
| US4022761A (en) * | 1976-01-19 | 1977-05-10 | Parke, Davis & Company | Tripeptides and methods for their production |
| US4034082A (en) * | 1976-03-01 | 1977-07-05 | Abbott Laboratories | Method to prevent reproduction in warm-blooded female animals with nonapeptides |
| US4075189A (en) * | 1976-09-15 | 1978-02-21 | Parke, Davis & Company | Hexapeptides |
| US4075192A (en) * | 1977-06-13 | 1978-02-21 | Parke, Davis & Company | Nonapeptides and methods for their production |
| US4101538A (en) * | 1977-06-13 | 1978-07-18 | Warner-Lambert | Nonapeptides and methods for their production |
| US4124577A (en) * | 1977-06-13 | 1978-11-07 | Warner-Lambert | Nonapeptides and methods for their production |
| US4143133A (en) * | 1977-10-03 | 1979-03-06 | American Home Products Corporation | Claudogenic-interceptive nonapeptides |
| US4124578A (en) * | 1978-01-03 | 1978-11-07 | American Home Products Corporation | Antiovulatory polypeptides |
| US4234571A (en) * | 1979-06-11 | 1980-11-18 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Nonapeptide and decapeptide derivatives of luteinizing hormone releasing hormone |
| US4253997A (en) * | 1979-12-17 | 1981-03-03 | American Home Products Corporation | Anti-ovulatory decapeptides |
| US4292313A (en) * | 1980-04-15 | 1981-09-29 | The Salk Institute For Biological Studies | LRF Antagonists |
| US4341767A (en) * | 1980-10-06 | 1982-07-27 | Syntex Inc. | Nonapeptide and decapeptide analogs of LHRH, useful as LHRH antagonists |
| AU9102582A (en) | 1981-12-10 | 1983-06-16 | David Howard Coy | Lh-rh antagonists |
| US4504414A (en) * | 1983-03-28 | 1985-03-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Synthetic pyridyl-alanyl decapeptides having antiovulatory activity |
| US4677193A (en) | 1985-02-22 | 1987-06-30 | The Salk Institute For Biological Studies | Peptides containing an aliphatic-aromatic ketone side chain |
| US4705778A (en) * | 1985-10-22 | 1987-11-10 | Sri International | Orally active LHRH analogs |
| WO1990009799A1 (en) | 1989-02-23 | 1990-09-07 | Colorado State University Research Foundation | GnRH ANALOGS FOR DESTROYING GONADOTROPHS |
| US6156731A (en) | 1989-05-10 | 2000-12-05 | G. D. Searle & Co. | Polypeptide composition for oral administration |
| US5064939A (en) * | 1990-02-06 | 1991-11-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Cyclic gnrh antagonists |
| ATE153345T1 (de) | 1990-03-16 | 1997-06-15 | Applied Research Systems | Behandlung polyzystischer ovarkrankheit |
| EP0592512A1 (en) | 1991-07-01 | 1994-04-20 | University Technologies International Inc. (Uti) | NON-DESENSITIZING ANALOGS OF GnRH AND OTHER BIOLOGICALLY ACTIVE LIGANDS |
| US5371070A (en) * | 1992-11-09 | 1994-12-06 | The Salk Institute For Biological Studies | Bicyclic GnRH antagonists and a method for regulating the secretion of gonadotropins |
| SG50426A1 (en) | 1993-05-20 | 1998-07-20 | Biotech Australia Pty Ltd | Lhrh antagonists |
| US5413990A (en) * | 1993-08-06 | 1995-05-09 | Tap Pharmaceuticals Inc. | N-terminus modified analogs of LHRH |
| JP3662926B2 (ja) | 1993-08-06 | 2005-06-22 | タツプ・ホールデイングス・インコーポレイテツド | Ｌｈｒｈのｎ末端改変類似体 |
| US5502035A (en) * | 1993-08-06 | 1996-03-26 | Tap Holdings Inc. | N-terminus modified analogs of LHRH |
| TW449600B (en) | 1994-04-19 | 2001-08-11 | Takeda Chemical Industries Ltd | Condensed-ring thiophene derivatives, their production and use |
| CA2163325A1 (en) * | 1994-11-21 | 1996-05-22 | Kaneyoshi Kato | Amine compounds, their production and use |
| UY23948A1 (es) | 1995-02-08 | 2001-10-25 | Takeda Chemical Industries Ltd | Derivados de anillos condensados de tiofeno su producción y uso. |
| KR0134534B1 (ko) * | 1995-03-20 | 1998-04-21 | 김은영 | (-)3(s)-메틸벤즈옥사진 유도체의 제조방법 |
| US5756497A (en) | 1996-03-01 | 1998-05-26 | Merck & Co., Inc. | Tocolytic oxytocin receptor antagonists |
| GB2310660A (en) | 1996-03-01 | 1997-09-03 | Merck & Co Inc | Benzoxazinone oxytocin receptor antagonists |
| CA2250895A1 (en) | 1996-04-26 | 1997-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Thienopyridine derivatives, their production and use |
| WO1997044041A1 (en) | 1996-05-20 | 1997-11-27 | Merck & Co., Inc. | Antagonists of gonadotropin releasing hormone |
| WO1997044321A1 (en) | 1996-05-20 | 1997-11-27 | Merck & Co., Inc. | Antagonists of gonadotropin releasing hormone |
| EP0901489A1 (en) | 1996-05-20 | 1999-03-17 | Merck & Co., Inc. | Antagonists of gonadotropin releasing hormone |
| US6500934B1 (en) | 1996-07-24 | 2002-12-31 | Michael Rush Lerner | Bivalent agonists for G-protein coupled receptors |
| EP0882736A1 (en) | 1997-06-02 | 1998-12-09 | Laboratoire Theramex S.A. | LH-RH peptide analogues, their uses and pharmaceutical compositions containing them |
| US6211224B1 (en) * | 1997-10-28 | 2001-04-03 | Merck & Co., Inc. | Antagonists of gonadotropin releasing hormone |
| EP1049472A4 (en) | 1997-10-28 | 2002-04-03 | Merck & Co Inc | GONADOLIBERIN ANTAGONISTS |
| AU1687199A (en) | 1997-12-26 | 1999-07-19 | Takeda Chemical Industries Ltd. | Nitrogen-containing heterocyclic compounds, their production and use |
| EP1068195A1 (en) | 1998-02-11 | 2001-01-17 | Merck & Co., Inc. | Antagonists of gonadotropin releasing hormone |
| WO1999041252A1 (en) | 1998-02-11 | 1999-08-19 | Merck & Co., Inc. | Antagonists of gonadotropin releasing hormone |
| CA2321026A1 (en) | 1998-03-09 | 1999-09-16 | Zealand Pharmaceuticals A/S | Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis |
| AU4393199A (en) | 1998-06-26 | 2000-01-17 | Takeda Chemical Industries Ltd. | Thienopyridine compounds, their production and use |
| US6191115B1 (en) * | 1998-08-12 | 2001-02-20 | Abbott Laboratories | C-terminus modified heptapeptide LHRH analogs |
| WO2000053178A1 (en) | 1999-03-10 | 2000-09-14 | Merck & Co., Inc. | 6-azaindole compounds as antagonists of gonadotropin releasing hormone |
| TWI225863B (en) | 1999-03-24 | 2005-01-01 | Takeda Chemical Industries Ltd | Thienopyrimidine compounds, their production and use |
| US20030134863A1 (en) | 2000-04-13 | 2003-07-17 | Shuichi Furuya | Preventives/remedies for alzheimer's disease |
| PL360294A1 (en) | 2000-07-05 | 2004-09-06 | Yamanouchi Pharmaceutical Co.Ltd. | Propane-1,3-dione derivatives |
| DE60239207D1 (de) | 2001-08-10 | 2011-03-31 | Takeda Pharmaceutical | Gnrh-agonistische kombinationsmittel |
| FR2849380A1 (fr) * | 2002-12-27 | 2004-07-02 | Ernest Loumaye | NOUVELLE UTILISATION D'UN AGONISTE DU GnRH |
-
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