ES2316302B1

ES2316302B1 - Metodo de analisis inmunologico, su utilizacion y kit para su realizacion.

Info

Publication number: ES2316302B1
Application number: ES200702641A
Authority: ES
Inventors: Antonio Nuñez Roldan; Isabel Aguilera Garcia; Ingeborg Wichmann Schlipf
Original assignee: Fundacion Reina Mercedes para la Investigacion Sanitaria
Current assignee: Fundacion Reina Mercedes para la Investigacion Sanitaria
Priority date: 2007-09-27
Filing date: 2007-09-27
Publication date: 2010-01-26
Anticipated expiration: 2027-09-27
Also published as: WO2009040451A1; JP2010540921A; ES2316302A1; EP2202244A4; EP2202244A1; US20110039281A1

Abstract

Método de análisis inmunológico, su utilización y kit para su realización.

El objeto de la presente invención es un método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana (anti-hGSTT1). Constituye igualmente un objeto de la presente invención la utilización de dicho método de análisis inmunológico para el diagnóstico, pronóstico de aparición, seguimiento y monitorización de condiciones patológicas asociadas a la presencia en fluidos biológicos de anti-GSTT1, así como un conjunto de útiles (kit) para la puesta en práctica de dicho método.

Description

Método de análisis inmunológico, su utilización y kit para su realización.

Sector de la técnica

El sector de la técnica en el que se encuadra la presente invención es el médico-sanitario, y su ámbito de aplicación es el de los sistemas de análisis para el diagnóstico de procesos autoinmunes y para la prevención del rechazo a trasplantes. También podría ser de interés para investigadores del campo de la investigación biomédica y clínica.

Objeto de la invención

Estado de la técnica

Dentro del fenómeno de la autoinmunidad, las investigaciones sobre la tolerancia o el rechazo de células o tejidos en pacientes trasplantados han demostrado la naturaleza multifactorial de ambos procesos. De esta forma, por ejemplo, se han identificado los fenómenos de alo-reconocimiento y reacción alo-inmune, por los cuales genes expresados en el material trasplantado darían lugar a la aparición de anticuerpos (alo-anticuerpos) en el paciente receptor que ocasionarían el rechazo a ciertos trasplantes (Aguilera, I., et al (2001). Clin Exp Immunol, 126, 535-539). Recientemente se ha descrito por primera vez la existencia de una nueva forma de rechazo a trasplantes de hígado, que afecta principalmente a niños. Ésta da lugar a una enfermedad caracterizada por la presencia de alteraciones histológicas propias de la hepatitis crónica, una elevada concentración de IgG, aparición de anticuerpos no-órgano-específicos y respuesta a tratamientos inmunosupresores. De ahí que se la haya denominado hepatitis de novo post-trasplante (Kerkar, N., et al (1998). Lancet, 351, 409-413; Jones, D.E., et al (1999). Hepatology, 30, 53-57). Debido a que clínicamente es indistinguible de otras hepatitis, el diagnóstico diferencial de la hepatitis de novo post-trasplante es difícil y a menudo requiere la práctica de biopsias, con las consecuentes molestias para el paciente. Éstas revelan alteraciones histológicas poco frecuentes, como necrosis en puente (porto-portal y porto-central), daños centrolobulillares e interrupciones periportales, y junto con otros datos serológicos, radiológicos y de biología molecular ayudan a confirmar el diagnóstico (Salcedo, M., et al (2002). Hepatology, 35, 349-356). Aunque no se conocen los mecanismos que controlan su evolución, distintos estudios apoyan la hipótesis de que la hepatitis de novo post-trasplante está originada por una respuesta de tipo alo-inmune contra un antígeno expresado en el órgano del donante (Aguilera, I., et al (2001). Clin Exp Immunol, 126, 535-539; Aguilera, I., et al (2004). Liver Transpl, 10, 1166-1172; Rodriguez-Mahou, M., et al (2007). Transplantation, 83, 1126-1129). De este modo se ha identificado una proteína, la Glutation-S-Transferasa T1 (GSTT1), que parece desempeñar un papel importante en el desarrollo de esta nueva patología, actuando como un alo-antígeno. La GSTT1 es un enzima implicado en la destoxificación celular, y sus niveles de expresión son elevados en eritrocitos, hígado, riñón y otros tejidos. Esta proteína es codificada por un gen polimórfico simple que tiene dos alelos, positivo o nulo, lo que explica su ausencia en un 20% de la población caucásica y entre un 11 y un 58% de individuos de otros orígenes étnicos (Sprenger, R., et al (2000). Pharmacogenetics, 10, 557-565; Landi, S., (2000). Mutat Res, 463, 247-283). Estudios en pacientes receptores de un hígado trasplantado con síntomas clínicos y signos analíticos propios de la hepatitis de novo post-trasplante, revelan la presencia de niveles elevados de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 (anti-GSTT1). El análisis genético de estos casos ha demostrado que el donante era positivo para el gen de la GSTT1, y por tanto, el hígado trasplantado expresaba este enzima. Por el contrario, el paciente receptor era carente en la GSTT1 (Aguilera, I., et al (2004). Liver Transpl, 10, 1166-1172; Rodriguez-Mahou, M., et al (2007). Transplantation, 83, 1126-1129). Estas investigaciones refuerzan la hipótesis alo-inmune de la hepatitis de novo post-trasplante, presentan la incompatibilidad GSTT1 como un elemento fundamental en su desarrollo, y apuntan a los anticuerpos anti-GSTT1 como marcadores de rechazo a trasplantes. Por otra parte, se ha demostrado la presencia de anticuerpos anti-GSTT1 en pacientes receptores de otros tipos de trasplantes, por ejemplo de riñón, y también en pacientes que no recibieron ningún órgano sólido, pero que en algún momento necesitaron una transfusión sanguínea o bien experimentaron un embarazo (Aguilera, I., et al (2005). Transplantation Proceedings, 37, 1457-1458; Aguilera, I., et al (2005). Am JKidney Dis, 46, 345-350; Wichmann, I., et al (2006). Transfusion, 46, 1505-1509). En algunos de estos pacientes se ha podido confirmar la correlación entre la aparición de anticuerpos contra la GSTT1 y el desarrollo de una respuesta alo-inmune con síntomas clínicos adversos (Aguilera, I., et al (2007). Tissue Antigens, 69, 396).

Los métodos para detectar anticuerpos anti-GSTT1 existentes en la actualidad, consisten en ensayos de inmunofluorescencia indirecta y ensayos Western Blot (Rodríguez-Díaz, Y., et al (2006). Transplantation Proceedings, 38, 1467-1470; Aguilera, I., et al (2005). Transplantation Proceedings, 37, 3968-3969). En los ensayos de inmunofluorescencia indirecta, diferentes diluciones de las muestras a analizar se ponen en contacto con células o tejidos portadores del antígeno específico y fijados en porta-objetos. De esta forma, los anticuerpos presentes en las muestras se unen a los antígenos expuestos en el porta-objeto, formando complejos antígeno-anticuerpo. Estos complejos son detectados mediante la unión a los mismos de otros anticuerpos anti-inmunoglobulinas humanas marcados con fluoresceína, y la observación bajo el microscopio de la fluorescencia resultante. La mayor dilución de una muestra capaz de producir una fluorescencia detectable en el microscopio por el ojo humano, se establece como el título del anticuerpo (Wheatley, S.P., et al (1998). Methods Cell Biol, 57, 313-332). En los ensayos Western Blot, las muestras a analizar se ponen en contacto con membranas, de nitrocelulosa o de polivinil-dieno-difluoruro, que contienen extractos celulares procedentes de bacterias modificadas genéticamente con un vector de clonación con el cDNA de la GSTT1, que le permite expresar niveles suficientes del antígeno específico. En este caso, los complejos antígeno-anticuerpo formados son detectados mediante la unión a los mismos de otros anticuerpos fusionados a un enzima, la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, que produce una reacción colorimétrica o quimioluminiscente en presencia de sustratos específicos. Los resultados se interpretan como positivos o negativos para un anticuerpo, dependiendo de si aparece o no reacción en la membrana (Simons, B., et al (2006). J Immuno.l Methods, 315, 88-98). Ambas técnicas, inmunofluorescencia indirecta y Western Blot, pueden ser válidos para la detección de anticuerpos. Sin embargo, son métodos de análisis semi-cuantitativos, complejos, poco automatizables y laboriosos para su realización.

Explicación de la invención

Constituye un primer objeto de la presente invención un método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana (anti-hGSTT1) que incluye las siguientes etapas:

(a): Expresión en un organismo heterólogo y purificación de la proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas;

(b): inmovilización de dicha proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas en un soporte;

(c): contacto de dicha proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas con el fluido biológico a ser testado, en condiciones tales que los anticuerpos presentes en el fluido biológico con especificidad para dicha proteína hGSTT1 recombinante, se unen a dicho material formando complejos antígeno-anticuerpo;

(d): separación de anticuerpos no unidos y otros componentes del fluido biológico de los complejos antígeno-anticuerpo;

(e): medida de la cantidad de complejos antígeno-anticuerpo detectada en el fluido biológico, que será positivamente correlacionada con la cantidad de anticuerpos anti-GSTT1 definida por el control positivo.

La proteína hGSTT1 recombinante marcadora se fusiona a una secuencia polipeptídica con al menos 5 aminoácidos de histidinas, que le permite su purificación por cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC), expresándose en un microorganismo, en particular en una cepa de E. coli, portador del plásmido pCASb-GSTT1.

El soporte en el cual se inmoviliza dicha proteína hGSTT1 recombinante marcadora es cualquier superficie que permita dicha inmovilización y el posterior análisis de la unión del anticuerpo anti-hGSTT1, preferentemente pocillos de una placa multipocillo, una membrana de nylon, filtro de celulosa, membrana de nitrocelulosa, una micropartícula coloreada, una micropartícula fluorescente, una superficie de cristal o un soporte metálico. El soporte de inmovilización de la proteína hGSTT1 recombinante marcadora y del anticuerpo anti-hGSTT1 es una micromatriz de polipéptidos en superficie plana.

La etapa de detección de los complejos antígeno-anticuerpo se puede llevar a cabo mediante Western Blot, mediante técnica de ELISA o bien mediante micropartículas codificadas recubiertas por la proteína hGSTT1 recombinante marcadora.

Constituye igualmente objeto de la presente invención la utilización del método de análisis inmunológico detector en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1, para el diagnóstico de condiciones patológicas asociadas a la presencia en fluidos biológicos de anticuerpos anti-GSTT1, para el pronóstico de aparición de condiciones patológicas asociadas a la presencia en fluidos biológicos de anti-GSTT1 o para el seguimiento y monitorización de condiciones asociadas a la presencia en fluidos biológicos de anti-GSTT1.

Los fluidos biológicos en los que se detecta la presencia de anti-GSTT1 son hemoderivados y la condición patológica es el rechazo de células, tejidos u órganos procedentes de un trasplante, injerto o transfusión, estando particularmente indicado cuando el órgano transplantado es el hígado, el riñón, el corazón, la médula ósea o cualquier otro órgano donde se exprese la secuencia hGSTT1, y muy particularmente indicado cuando el órgano transplantado es el hígado o el riñón y también en pacientes transfundidos con sangre o cualquier hemoderivado desde donadores que expresan la proteína hGSTT1.

Por último, constituye también un objeto de la presente invención un conjunto de útiles (Kit) para la realización del método de análisis inmunológico detector en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1. El kit incluye:

a): un soporte en el cual se ha inmovilizado la proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas.

b): un anticuerpo secundario anti IgG humano conjugado a moléculas indicadoras, preferentemente enzimas, fluoróforos, micropartículas coloreadas o micropartículas fluorescentes que permite revelar la unión al anticuerpo anti-hGSTT1 en un suero prueba cuando se pone en contacto con el soporte en el cual se ha inmovilizado la proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas.

c): medios para la detección de la actividad de las citadas moléculas indicadoras conjugadas al anticuerpo secundario IgG humano.

d): un suero humano control que contiene anticuerpos anti-hGSTT1.

e): un suero humano control que no contiene anticuerpos humanos anti-hGSTT1.

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Preferentemente, el kit está compuesto por:

a): una placa multipocillo apta para la detección de los complejos antígeno- anticuerpo mediante técnica de ELISA, con la proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas inmovilizada en cada uno de los pocillos.

b): un vial de anticuerpo secundario anti IgG humano conjugado a peroxidasa.

c): un vial con un sustrato indicador de la actividad enzimática peroxidasa, preferentemente 3,3',5,5' tetrametil benzidina.

d): control positivo consistente en una muestra diluida de suero humano con anticuerpos anti-GSTT1.

e): control negativo consistente en una muestra diluida de suero humano sin anticuerpos anti-hGSTT1.

f): soluciones tamponadas para realizar diluciones de la muestra a analizar, del anticuerpo secundario conjugado, de los controles y del sustrato enzimático indicador correspondiente.

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Alternativamente, el kit está compuesto por:

a): una placa multipocillo apta para la detección de los complejos antígeno-anticuerpo mediante técnica de ELISA, con la proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas inmovilizada en cada uno de los pocillos.

b): un vial de anticuerpo secundario anti IgG humano conjugado a fosfatasa alcalina.

c): un vial con un sustrato indicador de la actividad enzimática fosfatasa alcalina, preferentemente p-nitrofenil fosfato disódico.

d): control positivo consistente en una muestra diluida de suero humano con anticuerpos anti-GS TT 1.

e): control negativo consistente en una muestra diluida de suero humano sin anticuerpos anti-hGSTT 1.

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Descripción de las figuras

Figura 1. Análisis de la purificación de la GSTT1 humana recombinante. M, marcador de pesos moleculares (BioRad); 1, proteínas insolubles del cultivo; 2, proteínas solubles del cultivo; 3, proteínas no retenidas por la columna; 4, 5 y 6, proteínas expulsadas en el 1^{er}, 2º y 3^{er} lavado respectivamente; 7-18, eluciones sucesivas en gradiente de imidazol.

Figura 2. Detección de anticuerpos anti-GSTT1 en mediante un ensayo Western Blot. M, marcador de pesos moleculares (BioRad); 1-6, diferentes cantidades de GSTT1 humana recombinante: 5000 ng, 1000 ng, 200 ng, 40 ng, 8 ng, y 1.6 ng respectivamente.

Figura 3. Detección de anticuerpos anti-GSTT1 mediante un ensayo tipo ELISA indirecto. 1 y 2, muestras portadoras de anticuerpos anti-GSTT1 (GSTT1); 3 y 4, muestras sin anticuerpos anti-GSTT1 (Controles); 5, muestras portadoras de anticuerpos frente a antígenos nucleares (ANA); 6, muestra portadora de anticuerpos anti-HLA Clase I (HLA-I); 7, muestra portadora de anticuerpos anti-HLA Clase II (HLA-II); 8, muestra portadora de anticuerpos anti-HLA Clase I y Clase II (HLA-I/HLA-II). Los datos representados corresponden a la media de tres valores por muestra analizada.

Figura 4. Detección de marcadores de rechazo en pacientes receptores de un trasplante de hígado. 1-8, muestras analizadas, según se describe en la Tabla 1; 9, Control +; 10, Control -. Los datos representados corresponden a la media de tres valores por muestra analizada.

Figura 5. Detección de marcadores de rechazo en pacientes receptores de un trasplante de riñón. 1-8, muestras analizadas, según se describe en la Tabla 2; 9, Control +; 10, Control -. Los datos representados corresponden a la media de tres valores por muestra analizada.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al uso de la proteína GSTT1 humana (hGSTT1) expresada y aislada desde un microorganismo, preferentemente la bacteria Escherichia coli, para el diagnóstico del rechazo de grupos de células heterólogas trasplantadas desde donadores que expresan dicha secuencia a receptores que no tienen dicha secuencia. El grupo de células puede constituir tejidos u órganos, preferentemente referidos al hígado o riñón, o ser parte de fluidos biológicos como el sanguíneo. El rechazo se detectaría por la presencia de anticuerpos que se unen a la secuencia polipeptídica hGSTT1 en sueros del individuo transplantado. El dispositivo diagnóstico para determinar la presencia de anticuerpos frente a la hGSTT1 se realizaría por inmovilización de dicha secuencia polipeptídica aislada a una superficie, que pueden ser los pocillos de una placa multipocillo, una membrana, una micropartícula fluorescente, coloreada y/o magnética, o cualquier otro tipo de inmovilización habituales que se realizan en ensayos inmunológicos que permita detectar finalmente la unión de anticuerpos del suero del individuo trasplantado a dicha proteína. Preferentemente, el ensayo se realizará mediante un kit de ELISA que consta de placas multipocillo con la proteína GSTT1 unida a sus pocillos donde se introduce la muestra de suero humano diluida y que se revelaría con un anticuerpo anti IgG humana conjugado a un enzima y un sustrato colorimétrico o fluorimétrico.

El objeto de la invención comprende el uso de un material polipeptídico recombinante para la detección de marcadores de rechazo a trasplantes, los anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana o anti-GSTT1 y su aplicación en el diagnóstico y seguimiento de dichas reacciones de rechazo. El método objeto de la presente invención mejora los métodos existentes, descritos en algunas publicaciones científicas (Rodríguez-Díaz, Y., et al (2006). Transplantation Proceedings, 38, 1467-1470), ya que se define el uso de una GSTT1 humana recombinante aislada como antígeno inmovilizado en una superficie y abre un abanico de posibilidades de utilización en ensayos inmunológicos y sistemas ya disponibles comercialmente.

La presente invención describe concretamente el uso de un material polipeptídico recombinante, la proteína GSTT1 humana, unida a una etiqueta (tag) de histidinas (Histag), el cual es super-producido en un microorganismo, preferentemente la bacteria Escherichia coli, modificado con respecto al usado en el estado de la técnica anterior y purificado mediante técnicas de cromatografia de afinidad a metales inmovilizados (IMAC).

Las características más novedosas del objeto de la presente invención se pueden resumir en los siguientes puntos:

1. La detección de anticuerpos anti-GSTT1 como marcadores de rechazo a trasplantes puede realizarse en muestras biológicas procedentes de pacientes, de una forma preferente en suero sanguíneo.

2. El uso de una GSTT1 humana recombinante aislada (de alto grado de pureza) como antígeno para la detección de anticuerpos anti-GSTT1 humanos, minimiza el riesgo de reacciones inespecíficas con otros anticuerpos dirigidos contra otras proteínas de origen bacteriano, evitando así la aparición de falsos positivos y los errores en la interpretación de las muestras analizadas.

3. Con el fin de facilitar el desarrollo de un dispositivo de detección de los anticuerpos anti-GSTT1 sensible, de corta duración, fácilmente reproducible y automatizable, y que permita incluso el análisis simultáneo de multitud de muestras, la presente invención incluye usar la GSTT1 humana recombinante aislada en distintos ensayos inmunológicos habituales para cualquier técnico de la materia. Según el tipo de análisis:

i): la GSTT1 humana recombinante (rhGSTT1) aislada se encontraría inmovilizada en una superficie, que podría ser una de las siguientes:

(a): Para ensayos ELISA, estaría inmovilizada en placas multipocillo compuestas por diferentes polímeros, ya disponibles comercialmente por distintos fabricantes.

(b): Para ensayos de Western Blot, Dot Blot o tiras inmunocromatográficas, se inmovilizaría en papeles o membranas, formados por derivados de la celulosa como la nitrocelulosa, o bien por otros compuestos poliméricos como el polivinil-dieno-difluoruro o el nylon.

(c): Para ensayos tipo Luminex u otras tecnologías basadas en ensayos múltiples sobre matrices fluídicas, se encontraría inmovilizada en micro o nanopartículas de distintos compuestos poliméricos como el poliestireno o la silicona, o bien co-polímeros.

(d): Para ensayos de interacción en soportes cromatográficos o geles de electroforesis, podría estar inmovilizada en polímeros tales como celulosa, poliacrilamida o agarosa.

(e): Para biosensores, micromatrices en portas, y otros tipos de ensayos inmunológicos avanzados, podrían utilizarse otras superficies que permitan la inmovilización de proteínas.

ii): la muestra a analizar se pone en contacto con dicha superficie, de forma que los anticuerpos anti-GSTT1 de la muestra se unirían a la GSTT1 humana recombinante expuesta formando complejos antígeno-anticuerpo.

iii): los complejos antígeno-anticuerpo serían detectados por técnicas habituales en ensayos inmunológicos, tales como:

(a): la unión a la región constante de los anticuerpos humanos, de otros anticuerpos conjugados a moléculas fluorescentes o bien a enzimas que generan productos fluorescentes, luminiscentes o fosforescentes, detectables en microscopios, escáners, citómetros de flujo u otros dispositivos habitualmente empleados en biotecnología.

(b): la unión a la región constante de los anticuerpos humanos, de otros anticuerpos conjugados a enzimas, como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, que producen una reacción colorimétrica, fluorescente o quimioluminiscente en presencia de sustratos específicos (Simons, B., et al (2006). J Immunol Methods, 315, 88-98).

iv): la detección de los complejos antígeno-anticuerpo sería indicativa de la presencia de anticuerpos anti-GSTT1 en la muestra analizada.

Aplicación industrial de la invención

Mediante el empleo de técnicas habituales en biotecnología, la presente invención puede ser útil para:

1. Diseñar kits o dispositivos que permitan la detección de anticuerpos anti- GSTT1, basados en las siguientes técnicas:

a.: ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).

b.: Western Blot o Dot Blot.

c.: Tiras inmunocromatográficas.

d.: Microarrays o arrays (micromatrices o matrices) de proteínas.

e.: Citometría de flujo.

f.: Micropartículas paramagnéticas para separación específica magnética.

g.: Biosensores que detectan la unión antígeno-anticuerpo de forma cuantitativa.

2. Utilización de estos dispositivos a nivel clínico para el diagnóstico y seguimiento de reacciones de tipo alo-inmune como las originadas por:

a.: rechazo a trasplantes de células, tejidos u órganos heterólogos en pacientes que no expresan la GSTT1 humana.

b.: reacciones hemolíticas (por paso trasplacentario) en fetos o recién nacidos,no explicadas por reacciones convencionales conocidas, tipo incompatibilidad a Rh o a grupos eritrocitarios menores.

c.: en casos de intolerancia durante el embarazo en madres GSTT1 alelo negativas con feto GSTT1 alelo positivo.

d.: intolerancias a la administración de hemoderivados GSTT1 en receptores GSTT1 alelo negativo.

Modo de realización de la invención Ejemplo 1 Producción y purificación de GSTT1 humana recombinante

El presente ejemplo describe como puede obtenerse la proteína recombinante GSTT1 humana de forma aislada. Se lleva a cabo la construcción de un plásmido para expresar en bacterias la proteína GSTT1 humana fusionada a una etiqueta (tag) de seis histidinas (Histag). Éste puede ser empleado para la producción y purificación de la GSTT1 humana recombinante mediante técnicas de cromatografía de afinidad a metales inmovilizados (IMAC).

La construcción del plásmido de expresión en bacterias se realiza según se describe a continuación. En primer lugar, a partir de un clón obtenido mediante rastreo de una genoteca de expresión Uni-Zap XR vector (Aguilera, I., et al (2001). Clin Exp Immunol, 126, 535-539), se amplifica mediante PCR la secuencia codificante del enzima GSTT1 (acceso GenBank NM 000853), utilizando la Pfu DNA polimerasa (Bioneer) y como cebadores los oligonucleótidos CLONTI-F (SEQ ID Nº 1) y CLONT1-R (SEQ ID Nº 2). El producto de PCR obtenido se digiere con las enzimas BamHI y HindIII, y el fragmento resultante se clona en el plásmido pCASb (www.activemotif.com) previamente digerido con los mismos enzimas. De esta forma se obtiene el plásmido pCASb-GSTT1 que expresa la proteína recombinante GSTT-1 humana fusionada a un Histag.

A continuación, para purificar la GSTT1 humana recombinante, se transforma el plásmido pCASb-GSTT1 en la cepa comercial bacteriana REG-1 (Biomedal, ref. BS-3262). A partir del transformante se realizan cultivos en medio LB líquido con 100 \mug/ml de ampicilina que son incubados a 37ºC con agitación hasta alcanzar una D.O._{600} entre 0.8-1.0, y entonces son incubados a 30ºC con agitación durante 4 horas más en presencia 2 mM salicilato. Las células son recogidas por centrifugación a 5000 g durante 10 minutos a 4ºC, y se resuspenden en la solución de lisis comercial PROLYSE 1x (Biomedal, ref. RS-3406) suplementada con 0.25 mg/ml lisozima. La suspensión resultante se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos agitando periódicamente, se congela a -80ºC durante 1 hora y, tras su descongelación a 37ºC, se somete a varios pulsos de sonicación en hielo. Después de una centrifugación a 9000 g durante 10 minutos a 4ºC para eliminar restos celulares, se extrae el sobrenadante con las proteínas solubles del cultivo. Este se pasa dos veces a través de una columna con resina IMAC (HIS-Select^{TM} Cartridge, Sigma-Aldrich) pre-equilibrada con 6 volúmenes de columna de un tampón de equilibrado compuesto por 50 mM tampón fosfato potásico pH 8.0, 1.5 M NaCl, 0.1% Tritón X-100, 20 mM imidazol. Entonces, la columna se lava tres veces con 20 volúmenes de columna del tampón de equilibrado. Finalmente se eluye la proteína GSTT1 humana recombinante aplicando repetidas veces 1 volumen de columna de tampones compuestos por 50 mM tampón fosfato potásico pH 8.0, 1.5 M NaCl, 0.1% Tritón X-100 y que incrementan progresivamente la concentración de imidazol desde 20 mM hasta 300 mM. Los resultados de la purificación son analizados por SDS-PAGE en geles con 12% de acrilamida teñidos con Coomassie (Figura 1), y el grado de pureza de las eluciones se determina utilizando el sistema Experion^{TM} System (Bio-Rad). Tanto la cantidad producida (8.28 mg de proteína purificada por litro de cultivo) como el alto grado de pureza (superior a 96%) permiten la aplicación de la GSTT1 humana recombinante en diferentes tipos de ensayos, minimizando el riesgo de reacciones inespecíficas con otras proteínas de origen bacteriano.

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Ejemplo 2 Método de detección de anticuerpos anti-GSTT1 utilizando como antígeno la GSTT1 humana recombinante purificada en un ensayo tipo Western Blot

El siguiente ejemplo muestra como puede detectarse la presencia de anticuerpos anti-GSTT1. Para ello se realiza un ensayo tipo Western Blot utilizando como antígeno la GSTT1 humana recombinante descrita en el Ejemplo 1.

Diferentes cantidades de proteína GSTT1 humana recombinante se someten a un SDS-PAGE en geles con 12% de acrilamida. Seguidamente, las proteínas del gel son transferidas a una membrana de polivinil-dieno-difluoruro (GE Healthcare) utilizando un sistema de transferencia semi-seco (SV20-SDB, Sigma-Aldrich). Tras lavar la membrana dos veces durante 5 min en agua destilada, ésta se seca a temperatura ambiente durante 1 ó 2 horas. Entonces, la membrana se incuba a 4ºC toda una noche con una muestra de suero portadora de anticuerpos anti-GSTT1, diluida 1:100 en un tampón compuesto por 50 mM Tris-HC1 pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.02% Tween-20 y suplementado con 0.5% leche descremada. Tras someter la membrana a tres lavados de 5 minutos en un tampón de lavado compuesto por 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora con una solución de anticuerpo anti-human IgG-AP conjugate (Promega), diluido 1:1000 en un tampón compuesto por 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl y suplementado con 0.5% leche descremada. Finalmente, y tras someter la membrana a tres nuevos lavados de 5 minutos en tampón de lavado, los complejos antígeno- anticuerpo formados sobre la membrana se revelan con un sustrato colorimétrico (sistema SIGMA FAST - BCIP/NBT, Sigma-Aldrich). Los resultados de este ensayo se muestran en la Figura 2. Como puede observarse la muestra es capaz de reaccionar y producir una señal positiva desde cantidades muy pequeñas (40 ng) de GSTT1 humana recombinante.

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Ejemplo 3 Desarrollo de un dispositivo para detectar anticuerpos anti-GSTT1 utilizando como antígeno la GSTT1 humana recombinante en un ensayo tipo ELISA

El presente ejemplo describe como puede fabricarse un dispositivo, basado en ensayos tipo ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), que permite la detección de anticuerpos anti-GSTT1 utilizando la GSTT1 humana recombinante descrita en el Ejemplo 1 inmovilizada en la superficie de una placa multipocillo.

En primer lugar, se prepara una solución con 1 \mug/ml de GSTT1 humana recombinante disuelta en un tampón compuesto por 50 mM Tris-HC1 pH 7.5, 150 mM NaCl. Seguidamente se añaden 100 \mul de esta solución de GSTT1 y 100 pl de 100 mM tampón carbonato sódico pH 9.6 a cada uno de los pocillos de una placa multipocillo (Maxisorp ELISA plates, Nunc). Entonces la placa se incuba a 37ºC durante 1 hora, después a 4ºC toda una noche, y finalmente a 37ºC durante 30 minutos. Tras eliminar el contenido, los pocillos se lavan dos veces con 300 \mul de un tampón de lavado compuesto por 50 mM Tris-HC1 pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, incubando cada lavado a temperatura ambiente durante 5 min y asegurando que al final no queda líquido residual en los pocillos. Después se añaden a cada pocillo 300 \mul de una solución de bloqueo compuesta por 5% leche descremada disuelta en tampón de lavado, y la placa se incuba a temperatura ambiente durante 1 ó 2 horas. Mientras tanto, se preparan diluciones 1:500 en solución de bloqueo de muestras de sueros humanos, portadoras de los siguientes anticuerpos:

-: Anticuerpos anti-GSTT1 (GSTT1).

-: Anticuerpos frente a antígenos nucleares (ANA).

-: Anticuerpos anti-HLA Clase I (HLA-I).

-: Anticuerpos anti-HLA Clase I (HLA-II)

-: Anticuerpos anti-HLA Clase I y Clase II (HLA-I/HLA-II).

-: Muestras sin anticuerpos (Controles).

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Tras eliminar el contenido, se añaden a los pocillos 100 \mul de las muestras diluidas, y la placa se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras eliminar el contenido, los pocillos se lavan cinco veces con 300 \mul de tampón de lavado, asegurando que al final no queda líquido residual en los pocillos. Después se añaden a cada pocillo 100 \mul de una solución con anticuerpo anti-human IgG-AP conjugate (Promega), diluido 1:5000 en solución de bloqueo, y la placa se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras eliminar el contenido, los pocillos se lavan cinco veces con 300 \mul de un tampón de lavado, asegurando que al final no queda líquido residual en los pocillos. Después se añaden a cada pocillo 100 pl de una solución con 1 mg/ml de p-Nitrofenil fosfato disódico (Aldrich), disuelto en un tampón compuesto 100 mM Glicina, 1 mM MgCl_{2}, 1 mM ZnCl_{2} pH 10.4, y la placa se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora en oscuridad. Tras añadir a cada pocillo 25 \mul de 0.5 M NaOH para detener la reacción, se realiza una lectura de absorbancias a una longitud de onda de 405 nm. Los resultados de este ensayo se muestran en la Figura 3. Como puede observarse, los valores de absorbancia obtenidos muestran diferencias significativas (incrementos de hasta cinco veces) entre las muestras portadoras de anticuerpos anti-GSTT1 (GSTT1) y las muestras carentes de ellos (Controles). Por otra parte, el ensayo ELISA no presenta reacciones cruzadas o inespecíficas con muestras que contienen otros tipos de anticuerpos no-GSTT1 (ANA, HLA-I, HLA-II y HLA-I/HLA-II), revelando la elevada especificidad de este método.

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Ejemplo 4 Diagnóstico de reacciones de rechazo a trasplante hepático por detección de anticuerpos anti-GSTT1 mediante un ensayo tipo ELISA

Este ejemplo muestra cómo un dispositivo tipo ELISA, que utiliza la GSTT1 humana recombinante inmovilizada en placas multipocillo, puede permitir el diagnóstico y seguimiento de pacientes con rechazo a trasplantes de hígado mediante la detección de marcadores de reacción alo-inmune, los anticuerpos anti-GSTT1.

Una batería de sueros humanos, suministrados por el Servicio de Inmunología del Hospital Universitario Virgen de Rocío (Sevilla - España) y descritos en la Tabla 1, procedentes de pacientes receptores hepáticos con diferentes títulos de anticuerpos anti-GSTT1, medidos por técnicas de inmunofluorescencia indirecta y/o Western Blot, se utilizan como muestras en un ensayo tipo ELISA como se describe en el Ejemplo 3. Como referencia se utiliza una muestra portadora de anticuerpos anti-GSTT1 (Control +) y otra muestra sin anticuerpos (Control -).

TABLA 1 Descripción de las muestras analizadas

1

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Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 4. Como puede observarse el ensayo ELISA propuesto es capaz de detectar la presencia de anticuerpos anti-GSTT1 desde títulos muy bajos (1/40). Además, muestras portadoras de anticuerpos anti-GSTT1 pero que son consideradas como negativas en el análisis por Western Blot (muestra 7), presentan valores similares al Control +. Esto indica la mejora de la sensibilidad del ensayo ELISA sobre otros sistemas de detección de anticuerpos anti-GSTT1 disponibles en la actualidad, sobre todo porque también detecta positividad en aquellos sueros falsos negativos en Western Blot por reconocer sólo determinantes nativos.

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Ejemplo 5 Diagnóstico de reacciones de rechazo a trasplante renal por detección de anticuerpos anti-GSTT1 utilizando un ensayo tipo ELISA

El presente ejemplo muestra cómo un kit tipo ELISA, que utiliza placas multipocillo con la GSTT1 humana recombinante inmovilizada, puede permitir el diagnóstico y seguimiento pacientes con rechazo a trasplantes de riñón mediante la detección de marcadores de reacción alo-inmune, los anticuerpos anti-GSTT1.

Diferentes sueros humanos, suministrados por el Servicio de Inmunología del Hospital Universitario Virgen de Rocío (Sevilla - España) y descritos en la Tabla 2, procedentes de pacientes receptores renales con diferentes títulos de anticuerpos anti-GSTT1, medidos por técnicas de inmunofluorescencia indirecta y/o Western Blot (Wichmann, I., et al (2006). Transfusion, 46, 1505-1509; Aguilera, I., et al (2005). Transplantation Proceedings, 37, 3968-3969), se utilizan como muestras en un ensayo tipo ELISA como se describe en el Ejemplo 3. Como referencia se utiliza una muestra portadora de anticuerpos anti-GSTT1 (Control +) y otra muestra sin anticuerpos (Control -).

TABLA 2 Descripción de las muestras analizadas

2

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Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 5. Como puede observarse el ensayo ELISA es capaz de detectar la presencia de anticuerpos anti-GSTT1 en muestras con títulos muy bajos (1/80) y que son consideradas como negativas en el análisis por Western Blot. Esto indica la mejora de la sensibilidad del ensayo ELISA sobre otros sistemas de detección de anticuerpos anti-GSTT1 disponibles en la actualidad. Como puede observarse el ensayo ELISA descrito puede de detectar la presencia de anticuerpos anti-GSTT1 desde títulos muy bajos (1/80). Además, muestras portadoras de anticuerpos anti-GSTT1 pero que son consideradas como negativas en el análisis por Western Blot (muestras 4, 5 y 6), presentan valores similares al Control +. Esto indica la mejora de la sensibilidad del ensayo ELISA sobre otros sistemas de detección de anticuerpos anti-GSTT1 disponibles en la actualidad.

SEQ ID Nº 1

LONGITUD: 26 nucleótidos.

TIPO: ADN.

SECUENCIA:

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3

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SEQ ID Nº 2

LONGITUD: 26 nucleótidos.

TIPO: ADN.

SECUENCIA:

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4

Claims

1. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana (anti-hGSTT1) que incluye las siguientes etapas:

a): Expresión en un organismo heterólogo y purificación de la proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas;

b): inmovilización de dicha proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas en un soporte;

c): contacto de dicha proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas con el fluido biológico a ser testado, en condiciones tales que los anticuerpos presentes en el fluido biológico con especificidad para dicha proteína hGSTT1 recombinante, se unen a dicho material formando complejos antígeno-anticuerpo;

d): separación de anticuerpos no unidos y otros componentes del fluido biológico de los complejos antígeno-anticuerpo;

e): medida de la cantidad de complejos antígeno-anticuerpo detectada en el fluido biológico, que será positivamente correlacionada con la cantidad de anticuerpos anti-GSTT1 definida por el control positivo.

2. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana según las reivindicación 1 caracterizado porque la proteína hGSTT1 recombinante marcadora se expresa fusionada a una secuencia polipeptídica con al menos 5 aminoácidos de histidinas que le permite su purificación por afinidad a soportes cromatográficos de intercambio iónico.

3. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana según la reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la la proteína hGSTT1 recombinante marcadora se expresa y purifica en un microorganismo, en particular en una cepa de E. coli, portador del plásmido pCASb-GSTT1.

4. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana según las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque el soporte en el cual se inmoviliza dicha proteína hGSTT1 recombinante marcadora es cualquier superficie que permita dicha inmovilización y el posterior análisis de la unión del anticuerpo anti-hGSTT1, preferentemente pocillos de una placa multipocillo, una membrana de nylon, filtro de celulosa, membrana de nitrocelulosa, una micropartícula coloreada, una micropartícula fluorescente, una superficie de cristal o un soporte metálico.

5. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana según la reivindicación 4, caracterizado porque el soporte de inmovilización de la proteína hGSTT1 recombinante marcadora y del anticuerpo anti-hGSTT1 es una micromatriz de polipéptidos en superficie plana.

6. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana según las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la etapa de detección de los complejos antígeno-anticuerpo se lleva a cabo mediante Western Blot.

7. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana según las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la etapa de detección de los complejos antígeno-anticuerpo se lleva a cabo mediante técnica de ELISA.

8. Método de análisis inmunológico para la detección en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 humana según las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la etapa de detección de los complejos antígeno-anticuerpo se lleva a cabo mediante micropartículas codificadas recubiertas por la proteína hGSTT1 recombinante marcadora.

9. Utilización del método de análisis inmunológico detector en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1, para el diagnóstico de condiciones patológicas asociadas a la presencia en fluidos biológicos de anticuerpos anti- GSTT1, para el pronóstico de aparición de condiciones patológicas asociadas a la presencia en fluidos biológicos de anti-GSTT1 o para el seguimiento y monitorización de condiciones patológicas asociadas a la presencia en fluidos biológicos de anti-GSTT1.

10. Utilización del método de análisis inmunológico según la reivindicación 9, caracterizado porque los fluidos biológicos en los que se detecta la presencia de anti-GSTT1 son hemoderivados.

11. Utilización del método de análisis inmunológico según las reivindicaciones 9 y 10, caracterizado porque la condición patológica es el rechazo de células, tejidos u órganos procedentes de un trasplante, injerto o transfusión.

12. Utilización del método de análisis inmunológico según la reivindicación 11 caracterizado porque el órgano transplantado es el hígado, el riñón, el corazón, la médula ósea o cualquier otro órgano donde se exprese la secuencia hGSTT1.

13. Utilización del método de análisis inmunológico según la reivindicación 12, caracterizado porque el órgano transplantado es el hígado.

14. Utilización del método de análisis inmunológico según la reivindicación 12, caracterizado porque el órgano transplantado es el riñón.

15. Utilización del método de análisis inmunológico según la reivindicación 11, caracterizado porque la condición patológica es el rechazo en pacientes transfundidos con sangre o cualquier hemoderivado desde donadores que expresan la secuencia hGSTT1.

16. Conjunto de útiles (Kit) para la realización del método de análisis inmunológico detector en fluidos biológicos de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1, caracterizado porque incluye:

b): un anticuerpo secundario anti IgG humano conjugado a moléculas indicadoras, preferentemente enzimas, fluoróforos, micropartículas coloreadas o micropartículas fluorescentes que permite revelar la unión al anticuerpo anti-hGSTT1 en un suero prueba cuando se pone en contacto con el soporte en el cual se ha inmovilizado la la proteína hGSTT1 recombinante marcadora de propiedades antigénicas.

d): un suero humano control que contiene anticuerpos anti-hGSTT1.

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17. Conjunto de útiles (Kit) según la reivindicación 16, caracterizado porque está compuesto por:

d): control positivo consistente en una muestra diluida de suero humano inactivado con anticuerpos anti-GSTT1.

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18. Conjunto de útiles (Kit) según la reivindicación 16, caracterizado porque está compuesto por:

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