ES2315196B1 - STUDY OF GENETIC INFORMATIVITY. - Google Patents
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Abstract
Estudio de informatividad genética.Study of genetic informativity.
La presente invención se refiere al uso de gametos únicos para la realización de estudios de informatividad genética, especialmente en aquellos casos donde la alteración genética ocurre de novo en una familia o bien no se dispone de muestras biológicas de afectos o portadores de miembros de la misma familia.The present invention relates to the use of unique gametes for the conduct of studies of genetic informativity, especially in those cases where the genetic alteration occurs de novo in a family or biological samples of affections or carriers of members thereof are not available. family.
Description
Estudio de informatividad genética.Study of genetic informativity.
La presente invención se engloba dentro del área de ciencias de la salud, dentro del sector de aplicación de Medicina Reproductiva, Genética y Biología Molecular, principalmente.The present invention is encompassed within the area of health sciences, within the application sector of Reproductive Medicine, Genetics and Molecular Biology, mainly.
El Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP) es una novedosa técnica al servicio de la Medicina Reproductiva que permite la selección de embriones provenientes de ciclos de reproducción asistida libres de una determinada anomalía genética o cromosómica, antes de ser transferidos al útero materno. Actualmente, es una de las principales vías de innovación e investigación.Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) It is a novel technique at the service of Reproductive Medicine that allows the selection of embryos from cycles of assisted reproduction free of a certain genetic abnormality or chromosomal, before being transferred to the mother's womb. Currently, it is one of the main innovation paths and investigation.
El DGP se ofrece a parejas portadoras o afectas de una determinada enfermedad genética o cromosomopatía, ya que se enfrentan a un importante riesgo reproductivo pudiendo elegir entre diferentes opciones: (a) diagnóstico prenatal, (b) donación de gametos, (c) adopción o (d) no tener descendencia. El DGP es una alternativa al diagnóstico prenatal evitando que la pareja tenga que someterse a una interrupción del embarazo en caso de que el feto se encuentre afecto.The DGP is offered to carrier or affected couples of a certain genetic disease or chromosomopathy, since it face an important reproductive risk being able to choose between different options: (a) prenatal diagnosis, (b) donation of gametes, (c) adoption or (d) have no offspring. The DGP is a alternative to prenatal diagnosis preventing the couple from having to undergo an interruption of pregnancy in case the Fetus is affectionate.
La primera aplicación fue realizada por A. Handyside en 1990 consiguiendo la selección de embriones libres de una enfermedad genética ligada a los cromosomas sexuales. En la actualidad, el DGP permite el diagnóstico de cromosomopatías incluyendo el cribado de aneuploidías cromosómicas, el sexado en parejas portadoras de enfermedades ligadas a los cromosomas sexuales y anomalías cromosómicas estructurales, empleando la hibridación in situ fluorescente (FISH). En combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se puede realizar el diagnóstico de enfermedades monogénicas. De modo que se diferencian en el DGP dos grandes bloques, desde el punto de vista de la metodología diagnóstica y del nivel de estudio: anomalías cromosómicas y enfermedades monogénicas.The first application was made by A. Handyside in 1990 getting the selection of embryos free of a genetic disease linked to sex chromosomes. At present, the DGP allows the diagnosis of chromosomopathies including screening for chromosomal aneuploidies, sexing in couples carrying diseases linked to sex chromosomes and structural chromosomal abnormalities, using fluorescent in situ hybridization (FISH). In combination with the polymerase chain reaction (PCR), the diagnosis of monogenic diseases can be made. Thus, two large blocks differ in the DGP, from the point of view of the diagnostic methodology and the level of study: chromosomal abnormalities and monogenic diseases.
La limitación principal del DGP de enfermedades monogénicas es la cantidad de DNA disponible para realizar el diagnóstico, ya que disponemos de una única célula para realizar el estudio. Los métodos empleados deben ser altamente sensibles y eficaces, a la vez que rápidos, extremando al máximo las medidas encaminadas a prevenir la contaminación. Entre los métodos empleados para el DGP de las enfermedades monogénicas, los fragmentos amplificados mediante PCR se pueden analizar por: digestión con enzimas de restricción, secuenciación y análisis de polimorfismos.The main limitation of the disease DGP monogenic is the amount of DNA available to perform the diagnosis, since we have a single cell to perform the study. The methods used must be highly sensitive and effective, as well as fast, maximizing the measures aimed at preventing pollution. Between the methods employees for the DGP of monogenic diseases, PCR amplified fragments can be analyzed by: restriction enzyme digestion, sequencing and analysis of polymorphisms
Los diagnósticos que dependen de la amplificación del ADN mediante PCR están sujetos a una serie de problemas, tales como:The diagnoses that depend on the DNA amplification by PCR are subject to a series of problems such as:
- "allele dropout" (ADO) fenómeno que ocurre cuando solamente uno de los dos alelos presentes es amplificado, provocando errores de diagnóstico en embriones heterocigotos.- "allele dropout" (ADO) phenomenon that occurs when only one of the two alleles present is amplified, causing diagnostic errors in embryos heterozygous
- Contaminación con ADN exógeno debido al gran número de ciclos de PCR necesarios para la amplificación de un único genoma y a la posibilidad de contaminación con células del cúmulo materno o de espermatozoides. De ahí la necesidad de testar rigurosamente los reactivos utilizados para la PCR, así como liberar completamente el embrión de células del cúmulo y utilizar la inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI) como técnica de fertilización.- Contamination with exogenous DNA due to the large number of PCR cycles necessary for amplification of a single genome and the possibility of contamination with cells of the maternal or sperm cluster. Hence the need to test rigorously the reagents used for PCR, as well as completely release the embryo from cluster cells and use intracytoplasmic sperm injection (ICSI) as fertilization technique
- Reducida o limitada eficacia de amplificación.- Reduced or limited effectiveness of amplification.
La utilización de polimorfismos ligados a los genes objeto del diagnóstico es la estrategia más eficaz y segura al evitar los posibles errores debido al ADO, al tiempo que permite detectar los posibles casos de contaminación con ADN exógeno, que también podrían producir errores de interpretación y por tanto diagnósticos erróneos. Para incrementar la sensibilidad del diagnóstico se incluye más de un polimorfismo. Generalmente, se emplean dos polimorfismos que flanquean el gen o la mutación responsable de la enfermedad, la combinación de los mismos conforman el haplotipo asociado o ligado a la enfermedad.The use of polymorphisms linked to genes under diagnosis is the most effective and safe strategy by avoiding possible errors due to the ADO, while allowing detect possible cases of contamination with exogenous DNA, which they could also produce interpretation errors and therefore misdiagnosis To increase the sensitivity of the Diagnosis includes more than one polymorphism. Generally employ two polymorphisms that flank the gene or mutation responsible for the disease, the combination thereof make up the haplotype associated or linked to the disease.
El primer paso previo a cualquier DGP de enfermedades monogénicas es el estudio genético del caso índice. A partir del cual se debe realizar un estudio de informatividad familiar con el que poder conocer cuales son los polimorfismos asociados a la enfermedad. Para ello, debe existir algún otro miembro de la familia vivo, afecto o portador, y así comparando miembros sanos y afectos poder establecer cual es el haplotipo de riesgo en esa familia.The first step before any DGP of Monogenic diseases is the genetic study of the index case. TO from which an informativity study should be carried out familiar with whom to know what polymorphisms are associated with the disease To do this, there must be someone else live family member, affection or bearer, and so comparing healthy and affectionate members to be able to establish which is the haplotype of risk in that family.
En casos en los que la mutación responsable de la enfermedad genética ha ocurrido de de novo en una familia, es decir, sólo hay un miembro afecto vivo o bien no se dispone de muestras biológicas de afectos o portadores, el estudio de polimorfismos o segregación, a pesar de ser la mejor estrategia para el DGP no puede ser utilizada.In cases where the mutation responsible for the genetic disease has occurred de novo in a family, that is, there is only one living affection member or there are no biological samples of affections or carriers, the study of polymorphisms or segregation, Despite being the best strategy for the DGP, it cannot be used.
Otro grupo de candidatos en los que se contempla la posibilidad de llevar a cabo un DGP son aquellas parejas en la que uno de sus miembros es portador de una anomalía cromosómica. Usualmente, suelen ser portadores de anomalías cromosómicas estructurales (translocaciones, grandes inversiones) aunque también serían candidatos potenciales aquellos individuos que presentan mosaicismo para anomalías cromosómicas numéricas (mosaicos para el Síndrome de Klinefelter, mosaicos 47, XYY, etc.). Una reorganización cromosómica conlleva la producción de una cierta proporción de gametos desequilibrados y por lo tanto a la obtención de embriones cromosomicamente anormales. La probabilidad de obtener embriones cromosomicamente equilibrados, desequilibrados pero viables (y por lo tanto de posibles descendientes afectos de síndromes debidos a anomalías cromosómicas) o cromosomicamente desequilibrados no viables (que suelen cursar en abortos de primer trimestre) dependerá de cada reorganización concreta.Another group of candidates in which it is contemplated the possibility of carrying out a DGP are those couples in the that one of its members is a carrier of a chromosomal abnormality. Usually, they are usually carriers of chromosomal abnormalities structural (translocations, large investments) but also would be potential candidates those individuals who present mosaicism for numerical chromosomal anomalies (mosaics for the Klinefelter syndrome, mosaics 47, XYY, etc.). A chromosomal reorganization entails the production of a certain proportion of unbalanced gametes and therefore to obtain of chromosomally abnormal embryos. The probability of obtaining chromosomally balanced embryos, unbalanced but viable (and therefore of possible descendants affected by syndromes due to chromosomal abnormalities) or chromosomally unbalanced unfeasible (which usually occur in first-time abortions quarter) will depend on each specific reorganization.
Los portadores de anomalías cromosómicas también suelen ser pacientes fenotipicamente normales. No obstante, en su mayoría, conocen su riesgo reproductivo ya que es frecuente que la reorganización cromosómica de que son portadores tenga un origen familiar. Por otra parte, no es de extrañar que sean parejas que consultan por infertilidad debido a su dificultad para conseguir un embarazo o para obtener gestaciones evolutivas. La posibilidad de llevar a cabo un DGP en estos pacientes dependerá de cada reorganización cromosómica en concreto.Carriers of chromosomal abnormalities also They are usually phenotypically normal patients. However, in his Most know their reproductive risk since it is common for the chromosomal reorganization that they are carriers has an origin family. On the other hand, it is not surprising that they are couples who they consult for infertility due to their difficulty in getting a pregnancy or to obtain evolutionary gestations. The possibility of performing a PGD in these patients will depend on each chromosomal reorganization in particular.
A lo largo de los últimos años el DGP ha aumentado ampliamente su espectro de aplicación. Otros candidatos y posibilidades diagnósticas que algunos grupos incluyen en sus programas de DGP son: pacientes con edad reproductiva avanzada, en las cuales de sugiere una selección embrionaria a través de un estudio cromosómico con el objetivo de mejorar las tasas de implantación en este grupo y reducir su riesgo de transmisión de cromosomopatías a la descendencia; pacientes provenientes de ICSI (Inyección Citoplasmática de Espermatozoides) por factor masculino severo en los cuales se ha detectado un incremento significativo de anomalías cromosómicas en los espermatozoides; pacientes con fallos repetidos de FIV implantación en los que se sospecha de posibles anomalías cromosómicas como las causantes de los resultados negativos obtenidos; pacientes en los que se sospecha de la existencia de un mosaicismo gonadal e individuos de riesgo para la transmisión de carcinomas hereditarios.Over the past few years the DGP has Widely increased its application spectrum. Other candidates and diagnostic possibilities that some groups include in their PGD programs are: patients with advanced reproductive age, in which of suggests an embryonic selection through a chromosomal study with the aim of improving the rates of implementation in this group and reduce their risk of transmission of offspring chromosomopathies; ICSI patients (Cytoplasmic Sperm Injection) by male factor severe in which a significant increase in chromosomal abnormalities in sperm; patients with failures repeated IVF implantation in which suspected possible chromosomal abnormalities as the cause of the results negatives obtained; patients in whom the existence of a gonadal mosaicism and individuals at risk for transmission of hereditary carcinomas.
La primera limitación técnica que impone el diagnóstico preimplantacional es la fuente de embriones ya que las parejas candidatas a un DGP deben someterse a una FIV con los consiguientes tratamientos, desventajas y limitaciones que el procedimiento implica. Así pues, la tasa de éxito de la FIV, estimada en un 50% de forma global, representa también una importante limitación para el DGP.The first technical limitation imposed by the Preimplantation diagnosis is the source of embryos since the Couples candidates for a DGP must undergo IVF with the consequent treatments, disadvantages and limitations that the procedure implies. Thus, the IVF success rate, estimated at 50% globally, it also represents a important limitation for the DGP.
Por otra parte, no debemos olvidar que el número y la calidad de los embriones obtenidos condicionarán el éxito de un diagnóstico preimplantacional.On the other hand, we must not forget that the number and the quality of the embryos obtained will condition the success of a preimplantation diagnosis.
Una limitación importante de la aplicación de DGP a partir de embriones se debe al estadio embrionario en el cual se practica la biopsia, ya que ha de permitir la retirada de uno o dos blastómeros sin que afecte a la viabilidad del embrión. Por otra parte, hemos de disponer de tiempo suficiente para llevar a cabo del estudio genético y la transferencia en el mismo ciclo evitando, dentro de lo posible, la congelación de los embriones biopsiados.An important limitation of the application of DGP from embryos is due to the embryonic stage in which The biopsy is performed, since it must allow the withdrawal of one or two blastomeres without affecting the viability of the embryo. By On the other hand, we must have enough time to take out of the genetic study and transfer in the same cycle avoiding, as far as possible, the freezing of embryos biopsied
La identificación del haplotipo de riesgo de una determinada enfermedad monogénica se puede establecer empleando el ADN obtenido a partir de linfocitos de sangre periférica. Como resultado de la amplificación por PCR se obtienen dos alelos por cada polimorfismo en caso de que se trate de un individuo heterocigoto y un único alelo en caso de ser homocigoto. Los polimorfismos que se encuentren en estado homocigoto no pueden ser empleados para realizar estudios de segregación ya que no aportan información de cromosomas independientes. En el caso de los heterocigotos claramente se diferencian dos alelos. Cada alelo proviene de un progenitor, uno materno y otro paterno, sin poder distinguirlos sin disponer de la historia familiar.The identification of the risk haplotype of a certain monogenic disease can be established using the DNA obtained from peripheral blood lymphocytes. How result of PCR amplification two alleles are obtained per each polymorphism in the case of an individual heterozygous and a single allele if it is homozygous. The polymorphisms that are in homozygous state cannot be employees to carry out segregation studies since they do not contribute independent chromosome information. In the case of Heterozygous clearly differentiate two alleles. Each allele It comes from a parent, a mother and a father, without power distinguish them without having family history.
Por lo tanto, de lo que se conoce en la técnica se deriva que es muy deseable disponer de métodos alternativos que permitan llevar a cabo estudios de informatividad genética, particularmente en aquellos casos en los que la mutación responsable de la enfermedad genética ha ocurrido de novo en una familia o bien no se dispone de muestras biológicas de afectos o portadores.Therefore, from what is known in the art, it is derived that it is very desirable to have alternative methods that allow studies of genetic informativity, particularly in those cases in which the mutation responsible for the genetic disease has occurred de novo in a family or biological samples of affections or carriers are not available.
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Los inventores han encontrado que es posible utilizar la amplificación de ADN de gametos únicos individualizados para llevar a cabo un estudio de informatividad genética, e.g. polimorfismos, segregación o mutacional, en aquellos casos en los que la mutación responsable de la enfermedad genética ha ocurrido de novo en una familia o bien no se dispone de muestras biológicas de afectos o portadores.The inventors have found that it is possible to use DNA amplification of single individualized gametes to carry out a study of genetic informativity, eg polymorphisms, segregation or mutational, in those cases in which the mutation responsible for the genetic disease has occurred de novo in a family or biological samples of affections or carriers are not available.
Así pues, de acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, ésta proporciona el uso de gametos únicos individualizados para llevar a cabo un estudio de informatividad genética.Thus, according to a first aspect of the present invention, this provides the use of unique gametes individualized to carry out an informativity study genetics.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el estudio de informatividad genética se emplea para la identificación del haplotipo de riesgo de una determinada enfermedad monogénica. Preferentemente, el estudio de informatividad genética se emplea para el estudio de polimorfismos, segregación o mutacionales.In accordance with an embodiment of the present invention, the study of genetic informativity is used for the identification of the risk haplotype of a given monogenic disease Preferably, the study of Genetic informativity is used to study polymorphisms, segregation or mutational.
De acuerdo con otra realización particular de la presente invención, el estudio de informatividad genética se emplea para el propósito de selección de embriones en el contexto de fertilización in-vitro.In accordance with another particular embodiment of the present invention, the study of genetic informativity is used for the purpose of embryo selection in the context of in-vitro fertilization.
Según una realización preferida de la presente invención, el estudio de informatividad genética se emplea para el propósito de diagnóstico genético preimplantacional.According to a preferred embodiment of the present invention, the study of genetic informativity is used for the purpose of preimplantation genetic diagnosis.
Según otra realización preferida, el estudio de informatividad genética se lleva a cabo en aquellos casos en los que la mutación responsable de la enfermedad genética ha ocurrido de novo en una familia o bien no se dispone de muestras biológicas de afectos o portadores.According to another preferred embodiment, the study of genetic informativity is carried out in those cases in which the mutation responsible for the genetic disease has occurred de novo in a family or biological samples of affections or carriers are not available.
Un segundo aspecto de la presente invención hace referencia a un método de estudio de informatividad genética que comprende la amplificación del ADN de gametos únicos individualizados mediante amplificación genómica por desplazamiento múltiple (MDA).A second aspect of the present invention makes reference to a method of study of genetic informativity that comprises amplification of single gamete DNA individualized by genomic displacement amplification multiple (MDA).
En una realización del método de la presente invención, dicha amplificación se lleva a cabo empleando la ADN polimerasa del bacteriofago phi29. El resultado de la reacción se utilizará para realizar los estudios de informatividad genética, p.e. mediante la amplificación de los polimorfismos y de la mutación pudiendo establecer el haplotipo de riesgo en casos en los que no se puedan realizar estudios de informatividad familiar (casos de novo).In an embodiment of the method of the present invention, said amplification is carried out using the bacteriophage phi29 DNA polymerase. The result of the reaction will be used to carry out the studies of genetic informativity, eg by amplifying the polymorphisms and the mutation, being able to establish the risk haplotype in cases in which family informativity studies cannot be carried out ( de novo cases) .
La confluencia de dos alelos en una célula somática se debe a que la dotación genética de los humanos es diploide. En el caso de los organismos con reproducción sexual, antes o después de la formación del zigoto se debe reconstituir la dotación del individuo para mantener la genética de la especie. En los humanos ocurre durante la gametogenésis en la que tras la meiosis, los gametos o células germinales poseen la mitad de la dotación genética, haploide, que permitirá tras la fecundación completar la dotación genética diploide de la especie. De modo, que en cada gameto encontramos independizados todos y cada uno de los alelos del genotipo del individuo.The confluence of two alleles in a cell somatic is because the genetic endowment of humans is diploid In the case of organisms with sexual reproduction, before or after the formation of the zygote, the endowment of the individual to maintain the genetics of the species. In humans occur during gametogenesis in which after the meiosis, gametes or germ cells own half of the genetic endowment, haploid, which will allow after fertilization complete the diploid genetic endowment of the species. So that in each gamete we find each and every one of the independent alleles of the genotype of the individual.
De acuerdo con lo descrito en la presente invención, es posible llevar a cabo un estudio de forma independiente de cada gameto, lo que supone una importante ventaja respecto a las técnicas empleadas hasta la fecha, ya que en la misma célula germinal es posible identificar la presencia o ausencia de la mutación, así como los polimorfismos asociados. No siendo necesario comparar los resultados obtenidos con ningún miembro de la familia para establecer el haplotipo de riesgo ya que al tratarse de una célula haploide por si mismos son concluyentes.As described herein invention, it is possible to conduct a study in a independent of each gamete, which is an important advantage regarding the techniques used to date, since in the same germ cell it is possible to identify the presence or absence of the mutation, as well as the associated polymorphisms. Not being it is necessary to compare the results obtained with no member of the family to establish the risk haplotype since when treated of a haploid cell by themselves are conclusive.
De modo que la estrategia propuesta por la presente invención, podrá ser aplicada de forma universal a cualquier caso para evitar requerir a miembros de la familia en el estudio. Así mismo, cualquier estudio genético en que se necesite realizar un análisis de polimorfismos, segregación o mutacional puede ser efectuado siguiendo este procedimiento.So the strategy proposed by the This invention may be applied universally to any case to avoid requiring family members in the study. Also, any genetic study in which it is needed perform an analysis of polymorphisms, segregation or mutational It can be done following this procedure.
De este modo, de acuerdo con una realización preferida de la presente invención, los estudios de polimorfismos, segregación o mutacionales se emplean para el estudio de informatividad genética.Thus, according to one embodiment. Preferred of the present invention, polymorphism studies, segregation or mutational are used to study genetic informativity
De acuerdo con una realización de la presente invención, el material biológico de partida para la obtención de los gametos únicos individualizados se selecciona entre una muestra seminal, ovocitos y corpúsculo polar de ovocitos maduros. Preferiblemente, como material biológico de partida se emplea una muestra seminal.In accordance with an embodiment of the present invention, the biological starting material for obtaining single individualized gametes are selected from a sample seminal, oocytes and polar corpuscle of mature oocytes. Preferably, a biological starting material is used as a seminal sample.
Por lo tanto, de acuerdo con una realización particularmente preferida, la invención se refiere al uso de un espermatozoide como gameto único individualizado para la realización de estudios de informatividad genética.Therefore, according to one embodiment particularly preferred, the invention relates to the use of a sperm as a single individualized gamete for conducting studies of genetic informativity.
Según una realización particular de la presente invención, el método comprende las siguientes etapas:According to a particular embodiment of the present invention, the method comprises the following steps:
a) aislar un único gameto de una muestra;a) isolate a single gamete from a sample;
b) poner en contacto el gameto único individualizado con un tampón de lisis alcalino;b) contact the single gamete individualized with an alkaline lysis buffer;
c) neutralizar la lisis alcalina; yc) neutralize alkaline lysis; Y
d) realizar la amplificación con la ADN polimerasa del bacteriofago phi29.d) perform the amplification with the DNA Phi29 bacteriophage polymerase.
En el contexto de la presente invención, por ADN polimerasa del bacteriofago phi29 se entiende cualquier ADN polimerasa aislada de células infectadas con fagos del tipo phi29, que empleen una proteína terminal para la iniciación de la replicación del ADN. Estos fagos están descritos de forma general en Salas y col., The Bacteriophages 169, 1988.In the context of the present invention, by DNA Phi29 bacteriophage polymerase means any DNA polymerase isolated from cells infected with phage type phi29, that employ a terminal protein for the initiation of replication of DNA. These phages are described in general in Salas et al., The Bacteriophages 169, 1988.
La amplificación genómica por desplazamiento múltiple (Multiple Displacement Amplification, MDA) es una técnica conocida para la amplificación del genoma completo (Whole Genome Amplification, WGA) de células. Esta técnica, MDA, se describe en US 6977148. En la actualidad se comercializan kits para llevar a cabo dicha técnica, p.e. Genomiphi de Amersham Biosciences, UK. Es conocida la limitación de esta técnica para la amplificación del genoma de células únicas y/o de muestras de ADN menores de 1 ng. Sin embargo, de manera sorprendente, los inventores de la presente invención, han encontrado que es posible la amplificación del ADN de un único gameto mediante ésta técnica para su empleo posterior en estudios de informatividad genética.Genomic displacement amplification Multiple (Multiple Displacement Amplification, MDA) is a technique known for complete genome amplification (Whole Genome Amplification, WGA) of cells. This technique, MDA, is described in US 6977148. At present, kits are marketed to carry perform said technique, e.g. Genomiphi from Amersham Biosciences, UK. Is known the limitation of this technique for the amplification of genome of single cells and / or DNA samples less than 1 ng. However, surprisingly, the inventors of the present invention, they have found that DNA amplification of a single gamete using this technique for later use in studies of genetic informativity.
La siguiente descripción general se refiere al método de la presente invención en caso de utilizarse una muestra seminal como material biológico de partida para la obtención de los gametos únicos individualizados:The following general description refers to method of the present invention if a sample is used seminal as biological starting material to obtain the single individualized gametes:
Tras lavado de la muestra para eliminar el plasma seminal que pueda interferir en pasos sucesivos se realizará la individualización de un único espermatozoide. Para ello se utilizan técnicas de micromanipulación, aspirando los espermatozoides, uno a uno mediante pipetas estándares de microinyección a 400 aumentos bajo el microscopio invertido. Los espermatozoides individualizados se introducirán en tubos para termocicladores que contienen tampón de lisis alcalino que junto con un choque térmico se conseguirá desestructurar la membrana plasmática con su consiguiente rotura dejando disponible el material genético del espermatozoide. Este paso no sólo permite la lisis del espermatozoide sino también la descompactación de la cromatina que deja accesible la molécula de ADN para los pasos sucesivos. La lisis alcalina debe ser neutralizada para poder realizar la amplificación con la ADN polimerasa del bacteriofago phi29 cuyo pH óptimo esta cerca de la neutralidad. Una vez, equilibrado el pH y disponible la molécula de ADN del espermatozoide se lleva a cabo la amplificación del ADN con una incubación a temperatura constante durante toda una noche que finaliza con la inactivación de la enzima. El producto de la amplificación se purificará para eliminar sales o reactivos que puedan interferir en el análisis posterior. Una vez purificado ya disponemos de gran cantidad de ADN de un solo espermatozoide que se podrá emplear para realizar los estudios genéticos descritos anteriormente: análisis de polimorfismos y estudios mutacionales.After washing the sample to remove the seminal plasma that may interfere in successive steps will be performed the individualization of a single sperm. To do this they use micromanipulation techniques, aspiring sperm, one by one using standard pipettes of 400-magnification microinjection under the inverted microscope. The individualized sperm will be introduced into tubes to thermal cyclers containing alkaline lysis buffer that together with a thermal shock will destroy the membrane plasma with its subsequent break leaving the genetic material of the sperm. This step not only allows the sperm lysis but also the decompaction of the chromatin that leaves the DNA molecule accessible for the steps successive The alkaline lysis must be neutralized in order to perform amplification with bacteriophage DNA polymerase phi29 whose optimal pH is close to neutrality. One time, equilibrated the pH and available the DNA molecule of the sperm DNA amplification is carried out with a constant temperature incubation overnight It ends with the inactivation of the enzyme. The product of the amplification will be purified to remove salts or reagents that may interfere in the subsequent analysis. Once purified already we have a large amount of DNA from a single sperm that is may be used to perform the genetic studies described Previously: analysis of polymorphisms and studies mutational
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos.Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants not they intend to exclude other technical characteristics, additives, components or steps.
En el contexto de la presente invención, y tal y como se conoce en el estado de la técnica, el término "informatividad" se define como estudios genéticos que permiten establecer el haplotipo de riesgo de una determinada enfermedad en una familia.In the context of the present invention, and such and as is known in the state of the art, the term "informativity" is defined as genetic studies that allow to establish the risk haplotype of a given disease in a family
Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be partly detached of the description and in part of the practice of the invention. The The following examples are provided by way of illustration, and are not It is intended to be limiting of the present invention.
Como material biológico de partida se empleó una muestra seminal. Se realizó el lavado de la misma para eliminar el plasma seminal que pudiera interferir empleando PBS en proporción 1:2 centrifugando a 1.700 rpm durante 5 minutos. Tras el centrifugado se eliminó el plasma seminal y se resuspendió en un volumen de 400 \mul. En una placa de Petri para ICSI se colocaron dos gotas de 2 \mul del semen lavado junto con 2 \mul de PVP para conseguir ralentizar la movilidad de los espermatozoides. En esa misma gota se colocaron gotas 5 \mul de tampón MOPS para el lavado de los espermatozoides individualizados. Se emplearon técnicas de micromanipulación, aspirando los espermatozoides, uno a uno mediante pipetas estándares de microinyección a 400 aumentos bajo el microscopio invertido.A biological material was used as a seminal sample. It was washed to eliminate the seminal plasma that could interfere using PBS in proportion 1: 2 centrifuging at 1,700 rpm for 5 minutes. Behind the centrifugal seminal plasma was removed and resuspended in a volume of 400 µl. In a Petri dish for ICSI they were placed two drops of 2 µl of the semen washed together with 2 µl of PVP to slow down the mobility of sperm. In that same drop 5 µm drops of MOPS buffer were placed for the washing of individualized sperm. Were used micromanipulation techniques, aspirating sperm, each other one by standard 400-magnification microinjection pipettes under the inverted microscope.
Los espermatozoides individualizados se
introdujeron en tubos para termocicladores de 0.2 ml que
contenían
0.5 \mul tampón de lisis alcalino (200 mM NaOH,
50 mM DTT). Los tubos se incubaron a -80ºC durante 30 minutos. Y
posteriormente a 65ºC durante 10 minutos. Finalmente con la adición
de 0.5 \mul del tampón 200 mM Tricina pH 4.95 se consiguió
neutralizar la lisis.Individualized sperm were introduced into 0.2 ml thermocycler tubes containing
0.5 µl alkaline lysis buffer (200 mM NaOH, 50 mM DTT). The tubes were incubated at -80 ° C for 30 minutes. And then at 65 ° C for 10 minutes. Finally, with the addition of 0.5 µL of the 200 mM Tricine buffer pH 4.95, the lysis was neutralized.
Los lisados celulares se emplearon directamente para la reacción de amplificación con la ADN polimerasa del bacteriofago phi29. Se añadieron los reactivos para la reacción siguiendo las recomendaciones del kit comercial Genomiphi de Amersham Biosciences, UK en un volumen final de 20 \mul. La reacción se incubó a 30ºC durante toda una noche. Tras la incubación la reacción se detuvo a 65ºC durante 10 minutos. El ADN amplificado se almacenó a -20ºC.Cell lysates were used directly for the amplification reaction with the DNA polymerase of Phi29 bacteriophage. Reactants for reaction were added following the recommendations of the Genomiphi commercial kit of Amersham Biosciences, UK in a final volume of 20 µl. The reaction was incubated at 30 ° C overnight. After incubation The reaction was stopped at 65 ° C for 10 minutes. Amplified DNA It was stored at -20 ° C.
Para llevar a cabo los diferentes estudios genéticos se llevó a cabo la purificación del ADN amplificado empleando cualquier kit comercial de purificación de productos de PCR. Una vez purificado se dispuso de gran cantidad de ADN de un solo espermatozoide que se pudo emplear para realizar los estudios genéticos descritos anteriormente: análisis de polimorfismos y estudios mutacionales.To carry out the different studies genetic amplified DNA purification was carried out using any commercial product purification kit PCR Once purified, a large amount of DNA was available from a only sperm that could be used to perform the studies Genetic described above: analysis of polymorphisms and mutational studies
Dado que la aplicación principal del procedimiento es el DGP se expone como ejemplo la realización de la invención en un estudio de informatividad del Síndrome de Carney complex tipo 1 (CNC1; OMIM #160980). El síndrome de Carney complex tipo 1 es una enfermedad autosómica dominante que afecta al gen PRKARIA localizado en el brazo largo del cromosomal7 (17q23-q24) causando neoplasias múltiples.Since the main application of procedure is the DGP set forth as an example the realization of the invention in a study of informativity of Carney Syndrome complex type 1 (CNC1; OMIM # 160980). Carney complex syndrome type 1 is an autosomal dominant disease that affects the gene PRKARIA located on the long arm of the chromosomal7 (17q23-q24) causing multiple malignancies.
El estudio se realizó en un varón que es portador de la mutación (C769T) responsable del síndrome sin antecedentes familiares de la enfermedad que desea tener descendencia libre del síndrome. Por ello, se propuso realizar un DGP en el que el estudio de polimorfismos no podría realizarse debido a que se trata de un caso de novo, teniendo que emplear estrategias de diagnóstico que implican un elevado porcentaje de error. El empleo del procedimiento de la invención nos permite poder utilizar estudios de segregación en el DGP realizando diagnósticos más seguros y fiables.The study was conducted in a male who is a carrier of the mutation (C769T) responsible for the syndrome without a family history of the disease who wishes to have offspring free of the syndrome. Therefore, it was proposed to perform a DGP in which the study of polymorphisms could not be performed because it is a de novo case, having to employ diagnostic strategies that involve a high percentage of error. The use of the method of the invention allows us to be able to use segregation studies in the DGP making safer and more reliable diagnoses.
Se buscaron polimorfismos que estén localizados flanqueando la mutación. Concretamente se emplearon D17S189 y D17S1821 ((Dib, C. y col. "A comprehensive genetic map of the human genome based on 5,264 microsatellites" Nature 380 (6570), 152-154 (1996)) que permitieron establecer el haplotipo de riesgo de la enfermedad.Polymorphisms that are located were searched flanking the mutation. Specifically, D17S189 and D17S1821 ((Dib, C. et al. "A comprehensive genetic map of the human genome based on 5,264 microsatellites "Nature 380 (6570), 152-154 (1996)) that allowed establishing the Haplotype of disease risk.
Se llevó a cabo el procedimiento de acuerdo con el ejemplo 1, empleando una muestra seminal que tras ser lavada, una alícuota de la misma fue empleada para la individualización de los espermatozoides en tubos de termociclador que contenían el tampón de lisis, tras el choque térmico se neutralizó y se procedió a la amplificación y purificación del ADN de cada espermatozoide individualizado.The procedure was carried out in accordance with Example 1, using a seminal sample that after being washed, an aliquot of it was used for the individualization of the sperm in thermocycler tubes that contained the lysis buffer, after thermal shock was neutralized and proceeded to the amplification and purification of the DNA of each sperm individualized
Como resultado de la amplificación se obtuvo ADN suficiente para poder amplificar, del mismo espermatozoide, los polimorfismos y el exón en el que se localiza la mutación responsable del Carney. De este modo la mitad de los espermatozoides fueron portadores de un haplotipo determinado que en el que no se identificó la mutación, mientras que la otra mitad fue portador de otra combinación de polimorfismos en el que si se identificó la mutación pudiendo establecer el haplotipo de riesgo asociado al Síndrome de Carney en este individuo. Esta información únicamente se podría haber obtenido utilizando este procedimiento y es por tanto la única estrategia para poder realizar el DGP del síndrome de Carney complex tipo 1 de forma totalmente fiable.As a result of the amplification DNA was obtained enough to be able to amplify, of the same sperm, the polymorphisms and the exon in which the mutation is located Carney responsible. In this way half of the sperm were carriers of a certain haplotype that in which the mutation was not identified, while the other half he was the bearer of another combination of polymorphisms in which if identified the mutation being able to establish the risk haplotype associated with Carney syndrome in this individual. This information it could only have been obtained using this procedure and It is therefore the only strategy to be able to carry out the DGP of the Carney complex type 1 syndrome completely reliably.
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