ES2314985T3 - Procedimiento para la determinacion de un analito mediante el empleo de un elemento de analisis universal. - Google Patents
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Abstract
EL OBJETO DE LA INVENCION ES UN ELEMENTO DE ANALISIS PARA LA DETERMINACION DE UN COMPUESTO CONTENIDO DENTRO O SOBRE EL MATERIAL, QUE POSIBILITA UN TRANSPORTE DE LIQUIDOS ENTRE LAS ZONAS (1,2,4,5), UNA ZONA DE TOMA DE MUESTRAS (1) Y UNA ZONA DE DETECCION COLOCADA MAS ABAJO (2), CONTENIENDO LA ZONA DE DETECCION (2) UNA PAREJA 1 INMOVILIZADA DE UN PAR ESPECIFICO DE UNION 1 , DE TAL MANERA QUE ESTA EN LA SITUACION DE UNIRSE CON LA PAREJA 2 DEL PAR ESPECIFICO DE UNION 1, QUE NO ES UN COMPUESTO, SI CONTACTA CON EL, CARACTERIZADO PORQUE MAS ARRIBA DE LA ZONA DE DETECCION (2) HAY UNA PAREJA MARCADA 1 DE UN PAR ESPECIFICO DE UNION 2 Y QUE SE ENCUENTRA IMPREGNADO SOBRE UN MATERIAL, Y QUE SE PUEDE RETIRAR MEDIANTE UN LIQUIDO, Y ESTA EN LA SITUACION DE UNIRSE CON LA PAREJA 2 DEL PAR ESPECIFICO DE UNION 2, QUE NO ES UN COMPUESTO, SI SE PONE EN CONTACTO CON EL, ASI COMO UN PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION DE UN COMPUESTO CON ESTE ELEMENTO DE ANALISIS.
Description
Procedimiento para la determinación de un
analito mediante el empleo de un elemento de análisis universal.
La invención se refiere a un procedimiento para
la determinación de un analito mediante el empleo de un elemento de
análisis contenido en o sobre un material, que hace posible un
transporte de líquido entre zonas, una zona de aplicación de la
muestra y una zona de detección colocada corriente abajo, en donde
la zona de detección contiene un socio 1 del par de unión
específico 1, inmovilizado de manera que está en situación, con el
socio 2 del par de unión específico 1, el cual no es el analito, de
formar una unión, cuando éste entra en contacto con él, así como un
procedimiento para la determinación de un analito mediante pares
específicos de unión. Se describe también un kit para la
determinación de un analito, el cual contiene un elemento de
análisis.
En el estado actual de la técnica ya son
conocidos ciertos elementos de análisis, los cuales tienen los
reactivos necesarios para la determinación de un analito, en o
sobre materiales de soporte. Como ejemplos pueden citarse las
patentes: patente US 4.861.711, patente US 5.591.645 y patente
EP-A-0 291 194. A los elementos de
análisis descritos en estos documentos, es común que son
especialmente adecuados para la ejecución de procedimientos
inmunológicos de detección. Estos elementos de análisis contienen
una zona de aplicación de la muestra y una zona de detección
colocada corriente abajo. Una muestra líquida recorre a base de
fuerzas capilares por dentro de un material soporte poroso, las
diferentes zonas entre la zona de entrega de la muestra y la zona de
detección, absorbe los reactivos necesarios para la detección del
analito, y hace que el analito de la muestra entre en reacción con
los mismos.
En la zona de detección existe un socio de unión
inmovilizado, que está en situación de unirse específicamente al
analito que hay que determinar. Esto requiere que en el caso de
diferentes analitos deben ser inmovilizados diferentes socios de
unión para el analito sobre una fase sólida.
A partir de la patente US 4.861.711, es también
conocido, a partir de la figura 1 en unión con la descripción, por
ejemplo en la columna 5 línea 57, hasta la columna 6 línea 48, el
inmovilizar en la zona de detección un socio 1 de un par de unión
específico 1, el cual no está unido al analito, sino que puede
emplearse allí universalmente, puesto que forma un epitopo como
socio 2 del par de unión específico 1, el cual está presente sobre
una substancia que se une específicamente al analito. De esta forma
se fija el complejo movible del analito y esta substancia de unión
en el transcurso de la reacción de detección en la zona de
detección, y se separa de los componentes de reacción movibles no
complejados.
La patente US 5141850 describe una tira de
ensayo que comprende tres zonas. Una de ellas es una zona de entrega
de la muestra, otra está impregnada con un anticuerpo específico
del analito marcado con oro, y la tercera está impregnada con un
anticuerpo específico del analito marcado con biotina. La muestra se
mueve a lo largo de la tira de ensayo y forma un complejo sandwich
con dos anticuerpos marcados. El complejo es captado en la zona de
detección mediante un complejo inmovilizado de
látex-avidina, y es detectado.
Una substancia específica para el analito,
marcada, juega un papel muy esencial, puesto que solamente su unión
al analito y la posterior inmovilización del complejo formado del
analito y de la substancia marcada dirigida contra la analito, en
la zona de detección, así como la eliminación de los componentes de
reacción movibles sin reaccionar de la zona de detección, permite
señalar la presencia del analito en la muestra líquida. Las
substancias marcadas ya conocidas a partir del estado actual de la
técnica son específicas para el analito, es decir, en el caso de
ensayos sandwich, se trata de substancias marcadas, como anticuerpos
o antígenos, las cuales reaccionan específicamente con el analito
que hay que determinar (antígeno o anticuerpo). Esto requiere sin
embargo que según la clase de analito deben prepararse diferentes
socios de unión específicos marcados, para el analito.
Como marcado se conoce ya, en el estado actual
de la técnica, un gran número de substancias. Mientras que en
tiempos pasados se emplearon marcadores radiactivos con todas sus
desventajas, más tarde estos marcadores fueron substituidos
principalmente por marcadores enzimáticos. Actualmente se emplean en
los elementos de análisis, como se describe en los documentos
anteriormente descritos del estado actual de la técnica,
principalmente marcadores especiales, en particular partículas de
oro o látex. La obtención del conjugado del marcador y la
substancia que se une específicamente al analito es antieconómica y
debe optimizarse, cuando deben determinarse diferentes analitos,
para cada socio de unión individual específico para el analito.
Además, en los elementos de análisis, el material sobre el cual
está presente este conjugado y sobre el cual es transportado, debe
adaptarse a los requisitos de forma óptima, caso por caso. Ante
todo, deben resolverse a menudo, problemas de estabilidad.
Es tarea de la presente invención, por lo tanto,
el proporcionar una construcción utilizable universalmente, de un
elemento de análisis, el cual independientemente del analito a
determinar puede ser utilizado siempre, en tanto este analito o una
substancia derivada y representativa de este analito sea detectable
mediante la unión a un par específico.
Esta tarea se resuelve mediante el procedimiento
de la invención como está descrito en las reivindicaciones.
Se describe un elemento de análisis para la
determinación de un analito contenido en o sobre el material, el
cual hace posible el transporte de líquido entre zonas, una zona de
entrega de la muestra y una zona de detección colocada corriente
abajo de la misma, en donde el socio 1 de la zona de detección
contiene un par específico de unión 1 y movilizado de tal forma que
está en situación de formar una unión con el socio 2 del par de
unión específico 1, el cual no es el analito, cuando contacta con el
mismo, caracterizado porque corriente arriba de la zona de
detección está presente impregnado separable por el líquido, un
socio marcado 1 de un par de unión específica 2 sobre un material,
y está en situación de formar una unión con el socio número del par
de unión específico 2, el cual no es el analito, cuando éste
contacta con él, en donde el socio 2 del par de unión específico 1
y el socio 2 del par de unión específico 2 están unidos
específicamente al analito que hay que determinar o por reacción
mediante distribución de las partes del analito a determinar son una
de las substancias derivadas del analito y representativas del
mismo.
Se describe también un kit para la determinación
de un analito que contiene un elemento de análisis, como ha sido
caracterizado anteriormente, así como contiene también por lo menos,
un socio del grupo de socios 2 del par específico de unión 1, y un
socio 2 del par específico de unión 2.
Objeto de la invención es un procedimiento para
la determinación de un analito mediante un par específico de unión,
caracterizado porque contiene una substancia derivada del analito y
representativa del mismo, el socio 2 de un par específico de unión
1 y el socio 2 de un par específico de unión 2, se pone en contacto
en un elemento de análisis para la determinación de un analito, con
el socio marcado del par específico de unión 2, se mueve mediante
el transporte del líquido, dentro del elemento de análisis en
dirección a la zona de detección colocada corriente abajo de la
zona de entrega de la muestra, se une en la zona de detección al
socio 1 del par específico de unión 1, y se determina a la vista del
marcador del socio 1 del par específico de unión 2.
Es esencial para el elemento de análisis, que el
líquido dentro del elemento de análisis pueda moverse en dirección
a la zona de detección. Un líquido de esta clase es posible por
ejemplo en un cuerpo hueco correspondientemente adaptado a la
fuerza de la gravedad. Dispositivos que hacen posible un transporte
de líquido mediante la fuerza centrífuga como una forma de la
fuerza de gravedad, son conocidos por ejemplo a partir de la patente
EP-B 0 052 769. Sin embargo, los elementos de
análisis contienen de preferencia materiales absorbentes, que
permiten que el líquido se mueva mediante la acción de fuerzas
capilares. Los materiales de las zonas individuales del elemento de
análisis pueden ser iguales o también diferentes. A menudo ocurre
que las distintas zonas están formadas por materiales diferentes
cuando deben satisfacer óptimamente su tarea.
Como posibles materiales capilarmente
absorbentes entran fundamentalmente en cuestión todos aquellos que
generalmente están descritos en los llamados "ensayos en
seco", como se describen por ejemplo en las patentes
US-A 4.861.711, US-A 5.591.645 ó
EP-A-0 291 194, pueden emplearse
para la absorción de líquido. Como ventajosos se han mostrado por
ejemplo materiales porosos, como membranas, por ejemplo membranas de
nitrocelulosa. Pueden emplearse sin embargo también materiales
matriciales a base de fibras, absorbentes, como napa, tejido o
género de punto. La napa es particularmente preferida. Los
materiales matriciales a base de fibras pueden ser de vidrio,
celulosa, derivados de celulosa, poliéster, poliamida, pero pueden
contener también viscosa, lana de celulosa y polivinilalcohol. La
napa de fibras a base de celulosa, fibras de polimerizado a base de
poliéster y/o poliamida y un agente aglutinante orgánico el cual
tiene grupos -OH y/o éster, como ya es conocido a partir de la
patente EP-B-0 326 135 pueden
emplearse por ejemplo según la invención. Los materiales de napa que
contienen fibras de copoliésteres de fusión junto a fibras de
vidrio, fibras de poliéster, fibras de poliamida, fibras de celulosa
o fibras de derivados de celulosa, como se describe en la solicitud
de patente europea 0 571 941, pueden también emplearse en el
elemento de análisis. Ciertos papeles, como por ejemplo papel para
bolsas de té pueden también emplearse satisfactoriamente.
Para mejorar la manipulación del elemento de
análisis puede aplicarse un material absorbente capilarmente
activo, o pueden emplearse diferentes materiales absorbentes,
capilarmente activos, sobre un material de soporte rígido, el cual
por su parte no es permeable para el líquido, no influye
negativamente sobre el flujo de líquido en el material matricial, y
se comporta de forma inerte con respecto a las reacciones que tienen
lugar en el elemento de análisis. El material de soporte preferido
puede ser por ejemplo una lámina de poliéster, sobre la cual se ha
fijado el material matricial que permite el transporte de
líquido.
En el elemento de análisis pueden estar
dispuestas las zonas individuales una sobre otra, una junto a otra
o, en parte una sobre otra y en parte una junto otra, en el material
de soporte. Particularmente preferido es un elemento de análisis en
el cual la zona de entrega de la muestra y la zona de detección se
encuentran una junto otra sobre el material de soporte. Una junto a
otra significa a este respecto, que estas zonas una junto a otra
están en contacto directo entre sí, o están colocadas separadas por
otras zonas, esencialmente en un plano.
La zona de entrega de la muestra es la zona del
elemento de análisis sobre la cual se recibe la muestra, en la cual
debe determinarse si está presente un analito determinado o una
substancia derivada y representativa del analito, y eventualmente
en qué cantidad está presente uno u otra.
La zona de detección es la zona del elemento de
análisis en la cual tiene lugar la determinación, tanto si está
presente en la muestra entregada sobre el elemento de análisis el
analito investigado, o está respectivamente la substancia derivada
del analito y representativa del mismo. Esta determinación puede ser
cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa. Semicuantitativa
significa en este caso, que para el analito o respectivamente para
la substancia derivada del analito y representativa del mismo, no
se determina ningún valor concreto de la concentración sino que se
determina un intervalo de concentraciones dentro del cual se
encuentra la concentración del analito.
En la zona de detección se encuentra el socio 1
de un par específico de unión 1, inmovilizado de tal forma que está
en situación de formar una unión con el socio 2 del par específico
de unión 1, el cual no es el analito, cuando éste contacta con él.
La inmovilización puede lograrse mediante una reacción química, es
decir mediante la formación de una unión covalente. Puede tener
lugar también mediante fuerzas adsorbentes, entre las cuales están
comprendidas todas las posibilidades a excepción de la formación de
uniones covalentes. A menudo se emplea para la zona de detección
una membrana de nitrocelulosa, a la cual se unen firmemente
proteínas, aunque también ácidos nucleicos, mediante impregnación,
aunque sin formar una unión covalente.
Según la invención, debe encontrarse en el
elemento de análisis además del socio 1 de un par específico de
unión 1, también un socio marcado 1 de un par específico de unión 2.
Este socio no debe estar inmovilizado sino que debe estar
impregnado de forma que pueda separarse por el líquido, es decir,
este socio marcado debe ser transportable por el líquido en
dirección a la zona de detección. Ventajosamente este socio marcado
debe poderse separar por la menor cantidad posible de líquido, del
material de la matriz sobre la cual está impregnado, completamente,
es decir, cuantitativamente. Como material para la matriz, se ha
mostrado particularmente adecuada la napa, como se describe por
ejemplo en la patente EP-B-0 326
135.
Son ya conocidos a partir del estado actual de
la técnica pares específicos de unión, que comprenden por ejemplo
pares como un hapteno y un anticuerpo, un antígeno y un anticuerpo,
lectina y azúcar o un sacárido, avidina o estreptavidina y biotina,
así como ácidos nucleicos y ácidos nucleicos, ligando y receptor. Un
antígeno puede ser a este respecto cualquier molécula la cual está
experimentalmente en situación de crear un anticuerpo contra si
misma. También un anticuerpo o un determinado sitio de un
anticuerpo, que recibe el nombre de epitopo, puede ser un antígeno
y ser reconocido específicamente por un anticuerpo y unirse al
mismo. Con la denominación de ácidos nucleicos se comprenden todas
las formas posibles de ácidos nucleicos, que están en situación de
formar uniones mediante bases complementarias. Especialmente, pero
no como últimos de la lista, pueden citarse el ADN, ARN, pero
también los análogos de ácidos nucleicos, como los ácidos
peptidonucleicos (PNA, ver por ejemplo en la patente WO 92/20702).
Ligando y receptor significan muy en general una acción de unión
recíproca específica entre dos socios, como por ejemplo entre una
hormona y el receptor de la hormona.
En una versión preferida, el socio 1 de un par
específico de unión 1, es un anticuerpo, el cual reconoce un
epitopo sobre otro anticuerpo, el cual está dirigido contra el
analito. El epitopo contra el cual el anticuerpo está dirigido,
corresponde entonces al socio 2 del par específico de unión 1. Muy
particularmente preferido se emplea como socio 1 del par específico
de unión 1, la avidina o estreptavidina, la cual está en situación
de formar una unión específica con la biotina. La biotina forma
entonces el socio 2 del par específico de unión 1.
En una versión preferida, el socio 1 del par
específico de unión 2, es un anticuerpo contra el socio 2 del par
específico de unión 2. Este socio 2 del par específico de unión 2 es
según la invención de preferencia, un hapteno, principalmente un
hapteno que no está presente en la muestra que se está investigando.
Con particular preferencia se emplean la digitoxigenina,
digitoxina, digoxigenina o digoxina, como hapteno.
Como marcador del socio 1 del par específico de
unión 2 son posibles en principio todos los marcadores ya conocidos
para los inmunoensayos en el estado actual de la técnica. Estos son
en particular los marcadores radiactivos o las marcas enzimáticas
como por ejemplo la peroxidasa, la fosfatasa alcalina, la
galactoxidasa, o el fluoróforo. Con particular preferencia se
emplean sin embargo las llamadas marcas directas, es decir,
marcadores que sin más pasos de manipulación son reconocibles a
simple vista. Marcadores ventajosos de esta clase son por ejemplo
ciertas partículas insolubles en agua como partículas metálicas o de
látex, pero también pigmentos como silicato, hollín o selenio. En
particular se emplean de preferencia como marcadores según la
invención las partículas metálicas. El oro coloidal se prefiere en
particular como marcador. El marcador puede estar unido al socio 1
del par específico de unión 2, covalentemente, o también por
adsorción, en donde la unión por adsorción comprende todas las
posibilidades a excepción de la unión covalente. En el caso de
partículas coloreadas de látex como marcadores directos está de
preferencia una unión covalente. En el caso de metales coloidales
como marcadores directos, en particular en el caso del oro coloidal,
se utilizan de preferencia uniones por adsorción.
La obtención de conjugados
anticuerpo-oro es ya conocida por ejemplo, a partir
de Roth, J. "The coloidal gold marker system for light and
electron microscopic cytochemistry" ("El sistema marcador de
oro coloidal para la citoquímica microscópica óptica y
electrónica"), en Bullock, G.R. y Petrusz, P. eds. "Techniques
in Immunocytochemistry" ("Técnicas en inmunocitoquímica"),
vol. 2., Nueva York, Academic Press 1983 págs.
216-284.
El socio marcador 1 del par específico de unión
2, puede encontrarse en diferentes lugares del elemento de
análisis. Esto depende por ejemplo, de la proyectada conducción de
la reacción, de la cantidad de muestra disponible, o depende
respectivamente, de la concentración de analito, cuando el elemento
de análisis para la determinación de muestras líquidas está ya
determinado.
Así, se puede encontrar el socio marcador 1 del
par específico de unión 2 en la zona de entrega de la muestra,
puede estar colocado corriente abajo de la zona de entrega de la
muestra entre la zona de entrega de la muestra y la zona de
detección, o bien puede encontrarse también corriente arriba de la
zona de entrega de la muestra. El último caso presupone por lo
menos, que el elemento de análisis posee además de la zona de
entrega de la muestra también una zona de entrega del medio de
elución. Una zona de entrega del medio de elución de esta clase, se
encuentra entonces corriente arriba de la zona en la cual se
encuentra el socio marcado 1 del par específico de unión 2, ó esta
zona en donde el socio marcado 1 del par específico de unión 2 está,
es idéntica a la zona de entrega del medio de elución. Por lo
tanto, la zona de entrega del medio de elución puede estar corriente
arriba de la zona de entrega de la muestra, o bien puede estar en el
lugar de la zona de entrega de la muestra sobre el elemento de
análisis. Una zona de entrega del medio de elución de esta clase, es
independiente de donde se encuentre el socio marcado 1 del par
específico de unión 2, y de preferencia estará siempre previsto
que, cuando la muestra que se está investigando no sea líquida o no
sea muy líquida, sea suficiente para la determinación del analito,
es decir, para el transporte del analito y los reactivos necesarios
hasta la zona de detección.
La construcción descrita anteriormente de un
elemento de análisis es adecuada universalmente para la
determinación de cualquier analito, que sea detectable mediante la
unión específica a un par. Para ello debe solamente ponerse en
contacto una substancia derivada del analito y representativa del
mismo, el socio 2 de un par específico de unión 1 y el socio 2 de
un par específico de unión 2 contenidos en un elemento de análisis,
con el socio marcado 1 del par específico de unión 2, desplazarse
mediante el transporte del líquido en el elemento de análisis a la
zona de detección colocada en dirección corriente abajo de la zona
de entrega de la muestra, unirse en la zona de detección al socio 1
del par específico de unión 1, y en vistas al marcado del socio 1
del par específico de unión 2, ser determinado. Para esta
determinación es particularmente ventajoso, cuando son movibles, no
eliminar de la zona de detección los componentes inmovilizados de la
reacción por el líquido fuera de la zona de detección. Cuando en
caso de una muestra líquida, la liquidez de la muestra no sea
suficiente para eliminar los componentes movibles, no inmovilizados
de la reacción, fuera de la zona de detección, puede añadirse
líquido adicional al elemento de análisis, con lo cual esta tarea
puede efectuarse sobre la zona de entrega de la muestra o sobre una
zona específica de entrega del medio de
elución.
elución.
La substancia representativa del analito puede
ser creada de diferentes formas y maneras. En el caso de que el
analito sea un antígeno, es posible por ejemplo que el analito
reaccione con dos anticuerpos los cuales se unen al analito. Uno de
los dos anticuerpos lleva el socio 2 del par específico de unión 1 y
el otro anticuerpo lleva el socio 2 del par específico de unión 2.
Cuando el analito por ejemplo contiene un determinado epitopo
varias veces, es posible que los dos anticuerpos sean idénticos.
Según la invención no es imprescindiblemente necesario que la
mezcla de analito, el anticuerpo con el socio 2 del par específico
de unión 1 y el anticuerpo con el socio 2 del par específico de
unión 2, solamente entonces se ponga en contacto con el socio 1 del
par específico de unión 2 sobre el elemento de análisis, cuando el
complejo-sandwich entre los dos anticuerpos y el
analito esté completamente formado. Finalmente es importante, que en
la zona de detección en el momento de la determinación del
resultado del análisis, esté unido un complejo sandwich al socio 1
del par específico de unión 1. Esta formación del sandwich puede ya
ser decisiva mediante la tarea de la mezcla del analito y los dos
anticuerpos que forman el sandwich sobre el elemento de análisis,
aunque puede efectuarse también durante el transporte del líquido
del reactivo entre la zona de entrega del progen y la zona de
detección. En el caso más extremo tiene lugar la realización de la
reacción sandwich en la zona de detección. La expresión
"substancia derivada del analito y representativa del mismo",
comprende por lo tanto también una mezcla de componentes creadores
de una substancia de este tipo, en tanto estos componentes produzcan
por lo menos en la zona de detección la substancia derivada del
analito y representativa del mismo.
En el caso de la determinación de un anticuerpo
como analito puede emplearse en analogía a la reacción previamente
descrita, en lugar de los dos anticuerpos, los antígenos o los
oligopéptidos representativos del epitopo de los antígenos, en
donde una parte de la molécula de antígeno la lleva el socio 2 del
par específico de unión 1, y la otra parte de la molécula del
antígeno la lleva el socio 2 del par específico de unión 2. Para la
determinación se forma un complejo doble
antígeno-sandwich, a partir del anticuerpo que hay
que determinar y cualquier antígeno con el socio 2 del par
específico de unión 1, y un antígeno con el socio 2 del par
específico de unión 2, para lo cual sirve el análogo obtenido
anteriormente para la determinación del antígeno.
La construcción del elemento de análisis de
empleo universal es muy adecuada también para la determinación de
ácidos nucleicos. Para ello el ácido nucleico a determinar debe ser
a menudo multiplicado, para tener disponibles suficientes
cantidades para la detección. Esto puede tener lugar por ejemplo
mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ya conocida
por el experto, o la reacción en cadena de la ligasa (LCR). Para una
multiplicación mediante la PCR, a partir de un oligonucleótido de
nucleótidos empleado como cebador, unido a un ácido nucleico
complementario del ácido uncleico a determinar, y unido al cebador,
puede por ejemplo el socio 2 del par específico de unión 1 ó el
socio 2 del par específico de unión 2, unirse a dicho nucleótido, o
introducir un cebador en la copia del ácido nucleico. Si el
producto de amplificación hibrida con el ácido nucleico, el socio 2
del correspondiente par de unión, el cual no presenta el ácido
nucleico multiplicado complementario, está a disposición de una
substancia derivada del analito y representativa del mismo, la cual
se ha fijado sobre el elemento de análisis, en el socio 1
inmovilizado en la zona de detección del par específico de unión 1,
y con el socio marcado del par específico de unión 2, es posible su
determinación.
Además, si la cantidad de ácidos nucleicos es
suficiente, es posible evitar una multiplicación, o bien efectuar
la multiplicación de ácidos nucleicos sin el socio 2 del par
específico de unión 1 ó 2. A continuación se genera la substancia
representativa del analito, mediante hibridación con dos sondas, las
cuales llevan en cada caso el socio 2 del par específico de unión 1
y el socio 2 del par específico de unión 2.
Es particularmente preferido para una
multiplicación del ácido nucleico que hay que determinar, emplear un
nucleótido que lleva un socio 2 del par específico de unión 1, o un
socio 2 del par específico de unión 2, mezclado con nucleótidos sin
marcar, e hibridar el ácido nucleico multiplicado que lleva el socio
2 del par específico de unión 1 ó el socio 2 del par específico de
unión 2, con un ácido nucleico el cual lleva el socio 2 del
correspondiente par específico de unión, el cual no estaba presente
en la mezcla de nucleótidos utilizada para la multiplicación. De
esta forma se obtiene un ácido nucleico de doble cadena, en el cual
cada cadena lleva un socio diferente del par específico de unión.
En lugar de un nucleótido que lleva el socio 2 del par específico
de unión 1 ó el socio 2 del par específico de unión 2, puede
emplearse también un oligonucleótido que lleva precisamente estos
socios, como cebador juntamente con nucleótidos sin marca. Como
socio 2 del par específico de unión 1 se emplea con particular
preferencia la biotina, y como socio 2 del par específico de unión
2, se emplea un hapteno, como por ejemplo, la fluoresceína, la
rodamina, la digoxina o muy preferentemente, la digoxigenina. Como
particularmente ventajosos en el empleo de los cebadores, se han
mostrado los cebadores biotinilados.
Por este motivo los nucleótidos y cebadores
biotinilados pueden adquirirse comercialmente o pueden adquirirse
kits, con los cuales pueden obtenerse los ácidos nucleicos que
llevan dichas substancias como hapteno, por ejemplo la
fluoresceína, rodamina, digoxina o en particular la digoxina, o
fragmentos de ácido nucleico, lo cual es posible muy fácilmente
para el experto, en particular para fines de investigación de
substancias derivadas de ácidos nucleicos y representativas de los
mismos, que hay que determinar, y detectar rápida y fácilmente, por
medio del elemento de análisis.
Para la determinación de analitos es también
posible disponer de un kit, el cual no solamente tiene el elemento
de análisis de empleo universal, sino que tiene también el socio 2
del par específico de unión 1 ó el socio 2 del par específico de
unión 2, ó ambos socios. Estos socios están conjugados por ejemplo a
un nucleótido, oligonucleótido, un ácido nucleico, un anticuerpo,
un hapteno o un antígeno o respectivamente un epitopo o a una
lectina o a un receptor para un ligando. Estas substancias tienen el
significado ya aclarado anteriormente. De esta forma es posible,
tener a disposición del interesado además del elemento de análisis
de empleo universal, partes o también todos los otros reactivos
necesarios para la determinación de una analito especial. A este
respecto es esencialmente insignificante, si el socio 2 del par
específico de unión 1, y el socio 2 del par específico de unión 2,
se encuentran en recipientes separados o juntos en un mismo
recipiente. Esto sirve en particular para aquellos sistemas, en los
cuales el analito que va a determinarse, se detecta mediante dos
anticuerpos o mediante antígenos sobre un complejo sandwich. Si debe
montarse un kit para la determinación de un ácido nucleico, es
ventajoso que los ácidos nucleicos o los cebadores que llevan el
socio 2 del par específico de unión 1, ó el socio 2 del par
específico de unión 2, se preparen por separado de un ácido nucleico
complementario del ácido nucleico que va a determinarse, el cual
lleva el socio 2 del correspondiente par específico de unión, el
cual es distinto del socio, el cual está conjugado con el nucleótido
o respectivamente el cebador.
El elemento de análisis de empleo universal
descrito, ofrece ante todo ventajas en las determinaciones de
analitos en la investigación y desarrollo, en donde el analito puede
ser muy diferente. Es particularmente ventajoso el elemento de
análisis empleado en particular para la determinación de ácidos
nucleicos. Los nucleótidos y oligonucleótidos que están conjugados
con los socios 2 de un par específico de unión 1, ó respectivamente
con el socio 2 de un par específico de unión 2, pueden adquirirse
comercialmente en una amplia multiplicidad. Lo mismo es válido
también para las sondas de ácidos nucleicos que llevan el socio 2 de
un par específico de unión 1 ó el socio 2 de un par específico de
unión 2, los cuales pueden obtenerse fácilmente con los kits
comercialmente adquiribles. En particular, se obtienen fácilmente de
esta forma, las sondas de ácidos nucleicos que llevan biotina y/o
digoxina o respectivamente digoxigenina.
La construcción del elemento de análisis de
empleo universal es también ventajosa porque habitualmente en los
inmunoensayos con socios de unión del analito marcados, el socio de
unión marcado constituye un componente crítico. Hasta ahora era
habitual obtener según fuera el analito, un correspondiente socio de
unión marcado para el cual debían crearse para el elemento de
análisis, óptimas condiciones para la reacción y almacenamiento.
Esto exigía en el pasado un alto dispendio económico. Con el
elemento de análisis se pone ahora a disposición un elemento que
puede emplearse universalmente. Los reactivos específicos pueden
obtenerse a corto plazo y con un coste pequeño como reactivos
líquidos. Se prescinde del trabajo de optimización en particular con
referencia a la capacidad de almacenamiento de dichos reactivos
sobre los elementos de análisis.
Además es también posible, en caso que se desee,
que el elemento de análisis se emplee no solamente como elemento de
análisis universal juntamente con los reactivos específicos como
reactivos líquidos, sino que a partir del elemento de análisis, se
puede crear un elemento de análisis que contenga para la detección
específica de un analito el necesario conjunto de todos los
reactivos. Para la detección de un antígeno mediante la formación
de un complejo sandwich, los anticuerpos necesarios, de los cuales
uno está conjugado con el socio 2 de un par específico de unión 1,
y el otro con el socio 2 de un par específico de unión 2, pueden por
ejemplo, estar presentes integrados sobre un elemento de análisis.
Lo mismo sirve también para un elemento de análisis, el cual para
la detección de un anticuerpo se determina mediante la formación de
un complejo sandwich. En este caso una parte del antígeno necesario
está presente conjugada con el socio 2 de un par específico de unión
1, y la otra parte del antígeno está presente conjugada con el
socio 2 de un par específico de unión 2, integrados sobre el
elemento de análisis. Estos conjugados pueden estar colocados en una
zona común o en zonas vecinas una sobre otra o una junto a otra,
del elemento de análisis. A este respecto, ambos conjugados pueden
estar colocados en la zona de entrega de la muestra, o uno de los
conjugados en la zona de entrega de la muestra y el otro en una
zona entre la zona de entrega de la muestra y la zona de detección,
o ambos conjugados, separados o juntos, en una zona entre la zona
de entrega de la muestra y la zona de detección. En el caso de la
zona del medio de elución colocada corriente arriba de la zona de
entrega de la muestra, además de las posibilidades mencionadas
antes, es posible que los antígenos o anticuerpos que llevan el
socio 2 del par específico de unión 1 y 2, estén colocados también,
separados o juntos, entre la zona del medio de elución y la zona de
entrega de la muestra. Dichos elementos de análisis que contienen
todos los reactivos necesarios para la determinación de un analito,
poseen la ventaja de una fácil y universal construcción, y son muy
fáciles de manejar por el usuario, puesto que solamente debe
añadirse una muestra, por lo demás, no son necesarios más pasos de
manipulación antes de leer el resultado en la zona de
detección.
Un elemento de análisis puede emplearse también
para la determinación por lo menos de uno de varios analitos. Por
ejemplo hoy en día en la investigación de muestras sobre una
infección por HIV, es usual comprobar si está presente uno o varios
tipos posibles de anticuerpos, a saber, el anticuerpo contra el HIV
1, contra el HIV 2, ó contra el HIV 1 subtipo O. La presencia de
anticuerpos contra uno de los tipos, es suficiente para evaluar una
muestra como positiva. Contra cuál tipo los anticuerpos encontrados
están dirigidos exactamente, es por lo menos de una importancia
subordinada al procedimiento de screening. Un elemento de análisis
apropiado para dicha determinación contiene siempre un par de
conjugados de antígeno contra cada anticuerpo, a partir del cual
puede investigarse una muestra. Cada par contiene el antígeno
conjugado con el socio 2 del par específico de unión 1 y el
antígeno conjugado con el socio 2 del par específico de unión 2, en
donde el antígeno se une específicamente a un determinado tipo de
anticuerpo. Los conjugados de antígeno pueden estar presentes cada
vez por separado. Sin embargo es también posible que todos los
conjugados de antígeno estén mezclados y estén aplicados juntos en
una zona. Para la localización de dichos conjugados en un elemento
de análisis son válidas las declaraciones efectuadas anteriormente
en general para los conjugados de antígenos o anticuerpos con los
socios 2 de los pares específicos de unión 1 y 2.
Un elemento de análisis análogo para la
determinación de la gripe puede detectar la presencia de virus de
la gripe A y/o virus de la gripe B. Para ello se emplean conjugados
de anticuerpos contra el virus de la gripe A con los socios 2 de
los pares específicos de unión 1 y 2, así como conjugados de
anticuerpos contra el virus de la gripe B con los socios 2 del par
específico de unión 1 y 2. Cuando está presente por lo menos uno de
los dos tipos de virus, el elemento de análisis muestra en la zona
de detección un resultado positivo.
Además es posible, que un elemento de análisis
contenga todavía otras zonas funcionales. Por ejemplo se ha
mostrado como ventajoso para la investigación de sangre entera,
preveer en el elemento de ensayo una zona en la cual el plasma o
respectivamente el suero, se separa como un líquido claro de la
sangre entera y las células de la sangre quedan retenidas.
Solamente el líquido claro es transportado a continuación hasta la
zona de detección. Para la separación del plasma o respectivamente
del suero de la sangre entera, son apropiados por ejemplo la napa
de fibra de vidrio, como se describe en la patente
EP-A-0 045 476. Un medio apropiado
para la separación del plasma o respectivamente del suero de la
sangre entera, puede por ejemplo colocarse en la zona de entrega de
la muestra o entre la zona de entrega de la muestra y la zona de
detección.
A partir de la construcción del elemento de
análisis de empleo universal, el desarrollo de los elementos de
análisis, que contienen todos los reactivos para la detección de uno
o más analitos, teniendo presente los gastos de desarrollo hasta
ahora, es esencialmente más fácil y así, los tiempos de desarrollo
pueden acortarse.
En las figuras 1 y 2 están representados dos
elementos de análisis particularmente preferidos.
La figura 1 muestra un elemento de análisis de
empleo universal, el cual contiene sobre una lámina de soporte
(6),
una zona de entrega del medio de elución
(4),
una zona que contiene el socio marcado 1 del par
específico de unión 2 (3),
una zona de entrega de la muestra (1),
una zona de detección (2) con una línea de
detección incolora (7), que contiene el socio 1 inmovilizado del
par específico de unión 1 y una línea incolora de control (8), la
cual contiene un anticuerpo contra el socio 1 del par específico de
unión 2,
así como posee una zona de recogida del líquido
(5). Las zonas están colocadas uno al lado de otra, esencialmente
en un plano, sobre la lámina de soporte (6), en donde la expresión
"una al lado de otra" comprende aquí un ligero solapado de la
zona anterior con la zona siguiente en dirección al transporte del
líquido, de manera que el paso del líquido de una zona a otra esté
garantizado.
El elemento de análisis que está representado en
la figura 2 es un elemento de análisis completamente integrado, es
decir, posee todos los reactivos necesarios para la realización de
una determinación analítica. Además es adecuado para la
investigación de sangre entera. Sobre una lámina de soporte (6)
están dispuestas
una zona de entrega de la muestra (1),
una zona con los socios 2 de los pares
específicos de unión 1 y 2 (9),
una zona con el socio marcado 1 del par
específico de unión 2 (3),
una zona de separación del plasma o
respectivamente del suero (10),
una zona de detección (2) con una línea de
detección incolora (7), que contiene el socio 1 inmovilizado del
par específico de unión 1, y una línea de control incolora (8), la
cual contiene un anticuerpo contra el socio 1 del par específico de
unión 2,
así como una zona de recogida del líquido (5),
colocadas una al lado de la otra.
La invención se aclara más exactamente mediante
los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se construyó una tira de ensayo según la figura
1. Sobre una lámina de soporte (6) de 5 mm de ancho y 10 cm de
largo, de poliéster (Melinex®, de 350 \mum el grueso, de Imperial
Chemistry Industries, Gran Bretaña), se fijaron con adhesivo de
fusión (Dynapol® S 1358 de Hüls AG Alemania), una junto a otra,
- una napa de 1,5 mm de grueso y 1,5 cm de
largo, compuesta de 100 partes de fibras de vidrio (diámetro 0,49 a
0,58 \mum, longitud 1000 \mum) y 5 partes de fibras de
polivinilalcohol (Kuralon® VPB 105-2 de Kuraray),
con un peso superficial de 180 g/m^{2}, como zona de recogida de
líquido (5),
- una membrana de nitrato de celulosa de 1,5 cm
de largo (tipo CN 11301 de Sartorius, Alemania), como zona de
detección (2),
- una napa de 8 mm de largo que contiene 80
partes de fibras de poliéster, 20 partes de celulosa y 20 partes de
polivinilalcohol con un grueso de 0,32 mm y un peso superficial de
80 g/m^{2}, cuya obtención está descrita en el ejemplo 1 del
documento de patente europea 0 326 135, como zona de entrega de la
muestra (1),
- una napa de 8 mm de largo, de 80 partes de
fibras de poliéster, 20 partes de celulosa y 20 partes de fibras de
polivinilalcohol, de un grueso de 0,32 mm y un peso superficial de
80 g/m^{2}, cuya obtención está descrita en el ejemplo 1 del
documento de patente europea 0 326 135, el cual contiene un
conjugado de oro como zona con socio marcado del par específico de
unión 2 (3) y
- una napa de 30 mm de largo (tipo Binzer TI 05
de Binzer, Alemania) como zona de entrega del medio de elución (4),
fijadas una al lado de otra ligeramente solapadas.
Sobre la membrana de nitrato de celulosa
anteriormente descrita se aplica mediante dosificación de línea una
solución acuosa de estreptavidina (7 mg/ml). Para ello la
dosificación se escogió de forma que apareciera una línea con un
ancho de aproximadamente 0,5 mm. Esta línea (7) sirve para la
detección del analito que hay que determinar. La membrana se secó a
continuación al aire.
A una distancia de aproximadamente 4 mm de la
línea de la estreptavidina se aplicó mediante dosificación de
línea, una solución acuosa de un anticuerpo policlonal de IgG de
perro contra IgG de ratón (referencia: DAKO Diagnostica GmbH,
Hamburg, Alemania) (0,5 mg/ml). También aquí se escogió la
dosificación de tal manera que apareciera una raya con un ancho de
aproximadamente 0,5 mm. Esta raya (8) sirve para el control del
funcionamiento de la tira de ensayo. La membrana se secó a
continuación al aire.
- Se preparó un sol de oro con un diámetro medio
de partícula de aproximadamente 40 nm, según el método de Frens
(Frens, G, "Preparation of gold dispersions of varying particle
size: controlled nucleation for the regulation of the particle size
in monodisperse gold suspensions" ("Preparación de
dispersiones de oro de tamaño de partícula variable: nucleación
controlada para la regulación del tamaño de partícula en
suspensiones de oro monodispersas", en Nature: Physical Science
241 (1973), 20-22), mediante la reducción de
una solución de ácido tetracloroaúrico al 0,01 por ciento,
calentando a ebullición mediante citrato trisódico.
La preparación del
anticuerpo-conjugado de oro se efectuó de acuerdo
con el método de Roth, J. "The colloidal gold marker system for
light and electron microscopic cytochemistry" ("Sistema
marcador de oro coloidal para citoquímica microscópica óptica y
electrónica"), en Bullock, G.R. y Petrusz, P., eds.,
"Techniques in Immunocytochemistry" ("Técnicas de
Inmunocitoquímica"), vol. 2, Nueva York, Academic Press, 1983,
216-284.
Después de enfriar a temperatura ambiente la
solución de sol de oro descrita anteriormente, se ajustó el valor
del pH del sol de oro con K_{2}CO_{3} 0,2 M, de forma que
resultara alrededor de 0,5 a 1,0 unidades de pH por encima del
punto isoeléctrico del anticuerpo. La densidad óptica (OD) del sol
de oro (extinción a 525 nm y 1 cm de luz) fue típicamente de 1,0.
Para el sol de oro se añadió una solución dializada de un anticuerpo
IgG monoclonal frente a digoxigenina (MAK <digoxigenina>IgG)
(referencia Boehringer Mannheim GmbH, Alemania). La cantidad de
solución de anticuerpo se escogió de forma que su concentración en
la solución de sol de oro fue típicamente de
2 \mug/ml. Después de 30 minutos de agitación a temperatura ambiente, se saturó el conjugado de oro mediante la adición de una solución de albúmina de suero bovino de alta concentración (concentración final en la solución de conjugado: 1 mg/ml).
2 \mug/ml. Después de 30 minutos de agitación a temperatura ambiente, se saturó el conjugado de oro mediante la adición de una solución de albúmina de suero bovino de alta concentración (concentración final en la solución de conjugado: 1 mg/ml).
El conjugado de oro se concentró mediante
ultrafiltración contra un tampón de Tris 20 mM de pH 8,0 a una
densidad óptica de típicamente 20. La solución de conjugado se
almacenó a continuación a 100 \muM Brij® y 0,05% en peso de
NaN_{3}.
El conjugado de oro así preparado (densidad
óptica, OD = 20) se ajustó con un tampón de impregnación en una
relación de volúmenes 1:1 con una densidad óptica, OD = 10. El
tampón de impregnación contenía los siguientes componentes:
1% en peso de sacarosa
200 mM de HEPES
100 mM de NaCl
140 mM de urea
6 mM de N-acetilcisteína
2 mM de EDTA
0,1% en peso de Tween® 20.
La napa mezcla de
poliéster-celulosa-polivinilalcohol
se pasó en primer lugar a través de una solución de impregnación en
una cuba a velocidad constante y continuación se escurrió a través
de dos cilindros de acero inoxidable colocados a una distancia de
250 \mum, y a continuación se secó mediante un secador con
recirculación de aire. Entre las condiciones descritas, la
absorción de líquido de impregnación por la napa es típicamente
alrededor de 270 ml/m^{2}.
Se amplificó un fragmento del plásmido críptico
(7,5 Kb) de la Chlamydia trachomatis con 143 pares de bases. Para
ello se empleó el cebador de la Chlamydia trachomatis y el set de
cebador y sonda de captura (Boehringer Mannheim, Alemania) (cebador
uno: 20-mer, posición 274-225;
cebador 2: 24-mer, posición 393-416
rev.).
- El marcado se efectuó con
DIG-11-dUTP (DIG tiene el
significado de digoxigenina), y una sonda de captura marcada con
5'-biotina (Boehringer Mannheim GmbH, Alemania)
- La mezcla maestra de la PCR, contiene 2,5 U de
Taq-polimerasa, 10 \mul de tampón 10 veces de PCR,
incluyendo cloruro de magnesio 25 mmolar, 0,2 \mu molar de ambos
cebadores, 0,1 mmolar de cada desoxinucleótido y 0,02 mmolar de
DIG-11-dUTP. De esto se deduce una
estequiometría del marcador, de 1:5
DIG-11-dUTP al desoxinucleótido. La
mezcla maestra se pipeteó con 10 \mul de una solución que contenía
aproximadamente 100 copias/\mul del fragmento del plásmido
críptico, y se completó con agua destilada hasta 100 \mul. La
mezcla maestra se fundió 10 minutos a 94ºC, y se sometió 35 veces a
un ciclo, en el cual se mantuvo cada vez 40 segundos a 94ºC, 30
segundos a 52ºC, y 45 segundos a 72ºC. El producto de la PCR se
controló en un gel de agarosa al 2,5%, el cual se coloreó con
bromuro de etidio.
- Para la hibridación, se añadió 1 \mul de una
sonda de captura marcada con 5'-biotina (posición
354-374) a una concentración de 30 \mumolar a 50
\mul del producto de amplificación. La sonda de captura marcada
estaba presente de esta forma en una concentración de 0,6 \mu
molar. La sonda se fundió a continuación durante 5 minutos a 95ºC y
a continuación se hibridó durante 15 minutos a 37ºC.
- Para la determinación del ácido nucleico sobre
las tiras de ensayo anteriormente descritas según la figura 1, se
añadieron 5 \mul del producto de hibridación sobre la zona de
entrega de la muestra (1). A continuación se sumergieron las tiras
de ensayo con la zona de entrega del medio de elución (4) durante 5
segundos en un tampón de cromatografía, teniendo cuidado de que la
zona (3) con el conjugado de oro no se sumergiera en el líquido. El
tampón de cromatografía tenía la siguiente composición: 0,9% en peso
de sal común, 50 mM de fosfato de potasio, 0,09% en peso de azida
sódica, 2% en peso de albúmina de plasma bovino, y 0,25% en peso de
Tween® 20.
Después de 10 minutos, el tampón de
cromatografía había pasado de la zona de entrega del medio de
elución (4) a la zona de recogida de líquido (5). En la zona de
detección estaban claramente visibles 2 líneas rojas, en donde la
raya roja de detección (la cual contiene estreptavidina) señaliza un
resultado positivo y la raya de control roja (la cual contiene
PAK<Fcy de ratón>), señaliza el correcto funcionamiento del
elemento de análisis.
Ejemplo
2
Se preparó una tira de ensayo según la figura 1.
El conjunto de componentes del elemento de análisis fueron los
mismos que los elementos de análisis descritos en el ejemplo 1 para
la determinación de ácidos nucleicos.
Se obtuvieron anticuerpos para la detección de
la nucleoproteína de los virus de la gripe A y de la gripe B, de la
firma Fitzgerald Industries Int., Concord, Massachussets, USA.
- Para la obtención de un anticuerpo monoclonal
marcado con biotina, a partir de la IgG de ratón contra la
nucleoproteína de la gripe A, se añadió a una solución de 20 mg/ml
de anticuerpo en fosfato de potasio 0,1 M de pH 8,5, un derivado de
éster de succinimida de la biotina en un exceso de 6 veces molar. La
mezcla se incubó durante 90 minutos a 25ºC con agitación. La
reacción se interrumpió añadiendo lisina a la solución a una
concentración final de 10 mM. El reactivo en exceso de la
biotinilización se eliminó por diálisis y la solución se
congeló.
- Para la obtención de un anticuerpo monoclonal
biotinilado contra la nucleoproteína de la gripe B, se procedió de
manera análoga.
- Para la obtención de un anticuerpo monoclonal
digoxigenilado contra la nucleoproteína de la gripe A, se añadió a
una solución de 10 mg/ml del anticuerpo monoclonal en 0,1M de
fosfato de potasio, un derivado de éster de succinimida en
sulfóxido de dimetilo (DMSO), de la digoxigenina en un exceso 4
veces molar, de tal forma que la concentración final en DMSO en la
solución fue del 5% en volumen. La mezcla se incubó durante 60
minutos a 25ºC con agitación. La reacción se interrumpió a
continuación mediante la adición de una solución acuosa de lisina 1
molar, de manera que la concentración final de lisina fue de 10 mM.
El reactivo en exceso de la digoxigenilización fue eliminado
mediante diálisis frente a tampón de fosfato de potasio 20 mM, de
pH 8,0, y la solución se congeló hasta que fue
utilizada.
utilizada.
- La obtención de un anticuerpo monoclonal
digoxigenilado contra la nucleoproteína de la gripe B tuvo lugar de
manera análoga a la digoxigenilización antes descrita del anticuerpo
monoclonal contra la nucleoproteína de la gripe A.
Los anticuerpos de la gripe A y de la gripe B
empleados, son específicos típicos, es decir, el anticuerpo de la
gripe A, reconoce solamente la nucleoproteína de los virus de la
gripe A, mientras que los anticuerpos monoclonales de la gripe B
reconocen solamente la nucleoproteína de los virus de la gripe B.
Los anticuerpos no son sin embargo subtipos específicos, es decir,
los anticuerpos monoclonales contra la gripe A reconocen todos los
subtipos de la gripe A.
Como material de pruebas para la comprobación de
la sensibilidad del elemento de análisis según la invención se
emplearon sobrenadantes diluidos de cultivos de virus. El cultivo de
virus se efectuó sobre células MDCK, una cepa celular permanente de
riñones de perro. El cultivo se efectuó en un medio habitual de
cultivo durante aproximadamente 7 días a 33ºC. Como representativa
de la gripe A se cultivó el subtipo H3N2 (cepa Beijing 32/92), y
como representativa de la gripe B, la cepa B/Harbin 7/94. Los
sobrenadantes de los cultivos se diluyeron con medio de cultivo en
pasos dobles.
De cada diferente dilución se pipetearon 65
\mul de sobrenadante de cultivo, 15 \mul de tampón de lisis (6%
de Zwittergent® 3-10 en solución fisiológica de sal
común conteniendo albúmina de suero bovina), y 5 \mul cada vez,
de una solución del anticuerpo monoclonal biotinilado contra la
gripe A y el anticuerpo monoclonal digoxigenilado contra la gripe
A, para la detección de la gripe A ó respectivamente 5 \mul de
cada solución de anticuerpo monoclonal biotinilado contra la gripe
B y el anticuerpo monoclonal digoxigenilado contra la gripe B en un
matraz Eppendorf (la concentración de las soluciones madre de
anticuerpo conjugado, fue en cada caso de 20 \mug/ml). La muestra
lisada se homogeneizó brevemente por agitación, y a continuación se
pipetearon 80 \mul sobre la napa de conjugado de oro (3) de la
tira de ensayo según la figura 1. A continuación se sumergieron las
tiras de ensayo durante aproximadamente 5 segundos con la zona de
entrega del medio de elución (4) en el tampón de cromatografía
(0,9% en peso de sal común, 50 mM de fosfato potásico, 0,09% en peso
de azida sódica, 2% en peso de albúmina de plasma bovino, y 0,25%
en peso de Tween® 20). El resultado del ensayo pudo leerse después
de 10 minutos en la zona de detección
(2).
(2).
En el sobrenadante del cultivo de la gripe A
pudo reconocerse un resultado positivo hasta una dilución del
cultivo de 1:64, una línea de detección roja como señal de un
resultado positivo. En el sobrenadante del cultivo de la gripe B,
las diluciones se reconocieron como positivas hasta el paso 1:128.
La línea de control mostró en todos los casos mediante su color
rojo, que la función de la tira de ensayo era correcta.
Se preparó una tira de análisis según la figura
2. Sobre una lámina soporte (6) de 4 mm de ancho y 10 cm de largo,
de poliéster (Melinex®, 350 \mum de espesor, de Imperial Chemistry
Industries, Gran Bretaña), se aplicaron con adhesivo a fusión
(Dynapol® S 1358, de Hüls AG, Alemania),
- una napa de 0,9 mm de espesor y 1,4 cm de
largo, de 100 partes de fibras de vidrio (diámetro 0,49 a 0,58
\mum, largo 1000), y 5 partes de fibras de polivinilalcohol
(Kuralon® VPB 105-2 de Kuraray) con un peso
superficial de 100 g/m^{2} como zona de recogida de líquidos
(5),
- una membrana de nitrato de celulosa de 1,5 cm
de largo (tipo CN 11301 de Sartorius, Alemania), como zona de
detección (2),
- una napa de 1,2 cm de largo, de 100 partes de
fibras de vidrio (diámetro 0,49 a 0,58 \mum, largo 100 \mum), y
5 partes de fibras de polivinilalcohol (Kuralon® VPB
105-2 de Kuraray) con un peso superficial de 100
g/m^{2} se impregnó con Brij® (1% en peso) como zona de
separación de plasma o respectivamente de suero (10),
- una napa de 12 mm de largo de 80 partes de
fibras de poliéster, 20 partes de celulosa, y 20 partes de fibras
de polivinilalcohol, un espesor de 0,32 mm y un peso superficial de
80 g/m^{2}, cuya obtención está descrita en el ejemplo 1 del
documento de la patente europea 0 326 135, conteniendo conjugado de
oro como zona con el socio marcado del par específico de unión 2
(3),
- una napa de 12 mm de largo de 80 partes de
fibras de poliéster de 20 partes de celulosa y 20 partes de fibras
de polivinilalcohol, un espesor de 0,32 mm y un peso superficial de
80 g/m^{2}, cuya obtención está descrita en el documento de la
patente europea 0 326 135, ejemplo 1, conteniendo el antígeno de HIV
digoxigenilado y biotinilado, como zona con los socios 2 de los
pares específicos de unión 1 y 2 (9),
y
- un tejido de poliéster de 8 mm de largo (PE
280 HC de gasa de seda, Thal, Suiza), impregnado con un humectante
como zona de entrega de la muestra (1), fijadas una junto a otra
ligeramente solapadas.
Sobre la membrana de nitrato de celulosa
descrita anteriormente, se aplicó mediante dosificación de línea,
una solución acuosa de estreptavidina (4 mg/ml). Para ello se
escogió la dosificación de tal forma que apareció una línea con un
ancho de aproximadamente 0,4 mm. Esta línea sirve para la detección
de los anticuerpos del HIV. La membrana se secó al aire, a
continuación.
A una distancia de aproximadamente 4 mm de la
línea de estreptavidina se aplicó mediante dosificación en línea
una solución acuosa de un anticuerpo policlonal de IgG de conejo
contra IgG de ratón (fuente: DAKO Diagnostica GmbH, Hamburgo,
Alemania) (0,5 mg/ml). También en este caso se escogió la
dosificación de forma que apareció una línea con un ancho de
aproximadamente 0,4 mm. Esta línea (8) sirve para el control del
funcionamiento de la tira de ensayo. La membrana se secó a
continuación, al aire.
- Se obtuvo un sol de oro con un diámetro medio
de partícula de aproximadamente 40 nm, como se ha descrito en el
ejemplo 1a.
- La obtención de
anticuerpo-conjugado de oro, se efectuó también como
se ha descrito en el ejemplo 1a.
El conjugado de oro así obtenido (densidad
óptica, OD = 20) se ajustó con un tampón de impregnación a una
densidad óptica OD = 3 (extinción hasta 525 nm y 1 cm de luz). El
tampón de impregnación contenía los siguientes componentes:
100 mM de HEPES, pH 7,5
50 mM de NaCl
0,5% en peso de sacarosa
70 mM de urea
3 mM de N-acetilcisteína
1 mM de EDTA, y
0,1% en peso de Tween® 20
La napa mezcla de
poliéster-celulosa-polivinilalcohol
se pasó a una velocidad constante en primer lugar a través de una
cuba conteniendo una solución de impregnación, a continuación se
escurrió a través de dos cilindros de acero inoxidable colocados a
una distancia de 250 \mum, y a continuación se secó mediante un
secadero con recirculación de aire. Entre las condiciones
descritas, la absorción de impregnación de la napa fue típicamente
alrededor de 270 ml/m^{2}.
La obtención de péptidos digoxigenilados o
respectivamente péptidos biotinilados de la región gp 41 del HIV I,
están descritos en la solicitud de patente internacional WO 9603423
en el ejemplo 1. Los correspondientes péptidos se emplearon cada
vez en forma de un par como derivados de digoxigenina y de biotina.
Sus concentraciones en la mezcla en la solución de impregnación
fueron entre 0,7. 10^{-7} moles/litro, y 3. 10^{-7} moles/litro.
La solución de impregnación contenía además,
100 mM de tampón MES, de pH 6,0
50 mM de NaCl
2% en peso de sacarosa
1% en peso de albúmina de suero bovino
3 mM de N-acetilcisteína
0,06% en peso de Tween® 20
1 mM de de EDTA
La napa mezcla de
poliéster-celulosa-polivinilalcohol
se impregnó en esta solución de impregnación y a continuación se
secó en un secadero con recirculación de aire. La absorción de
impregnación fue típicamente alrededor de 270 ml/m^{2}.
Sobre la zona de entrega de la muestra (1) de la
tira de ensayo anteriormente descrita, según la figura 2, se
aplicaron aproximadamente 60 \mul de volumen de muestra (plasma o
respectivamente de suero). Después de un tiempo de espera de 15
minutos se evaluó visualmente la zona de detección (2). Una línea de
color rojo violeta en la posición de la línea de control (8)
significa una muestra no reactiva (infección por HIV no
detectable). Dos líneas de color rojo violeta una en la posición de
la línea de control (8) y una en la posición de la línea de
detección (7) significan una muestra reactiva (infección por HIV
detectable).
Claims (9)
1. Procedimiento para la determinación de un
analito por medio de pares específicos de unión mediante el empleo
de un elemento de análisis que contiene en o sobre el mismo, un
material que hace posible el transporte de un líquido entre zonas,
una zona de entrega de la muestra y una zona de detección colocada
corriente abajo, en donde la zona de detección contiene el socio 1
de un par específico de unión 1, inmovilizado de tal manera que
está en situación de formar una unión con el socio 2 del par
específico de unión 1, el cual no es el analito, cuando contacta
con él, y corriente arriba de la zona de detección, un socio 1
marcado, de un par específico de unión 2, está sobre un material
impregnado mediante un líquido soluble, en situación de formar con
el socio 2 del par específico de unión 2, el cual no es el analito,
una unión cuando éste se pone en contacto con él,
caracterizado porque,
una substancia derivada del analito y
representativa del mismo, la cual contiene el socio 2 del par
específico de unión 1 y el socio 2 del par específico de unión 2,
se pone en contacto en el elemento de análisis con el socio marcado
del par específico de unión 2, se mueve mediante el transporte de
líquido en el elemento de análisis en dirección a la zona de
detección colocada corriente abajo de la zona de aplicación de la
muestra, se une en la zona de detección, al socio 1 del par
específico de unión 1, y se determina a la vista del marcado del
socio 1 del par específico de unión 2.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se escogen los socios conjuntamente
pertenecientes de los pares específicos de unión, del grupo hapteno
y anticuerpo, antígeno y anticuerpo, lectina y azúcar/sacárido,
ligando y receptor, avidina/estreptavidina y biotina, ácidos
nucleicos y ácidos nucleicos.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque, el socio 1 del par específico de unión
1, es avidina o estreptavidina.
4. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque, el socio 1 del par específico de unión
2 es un anticuerpo contra el socio 2 del par específico de unión
2.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque, el socio 1 del par específico de unión
2 es un anticuerpo contra la digoxigenina o la digoxina.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque para la
obtención de la substancia derivada del analito y representativa
del mismo, se mezcla el analito con anticuerpos, que se unen al
analito, en donde una parte del anticuerpo lleva el socio 2 del par
específico de unión 1, y la otra parte del anticuerpo lleva el
socio 2 del par específico de unión 2.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque, para la
obtención de la substancia derivada del analito y representativa
del mismo, se mezcla el analito con antígenos, haptenos u
oligopéptidos, en donde el socio 2 del par específico de unión 1
lleva una parte de los antígenos, haptenos u oligopéptidos, y el
socio 2 del par específico de unión 2, lleva la otra parte de los
antígenos, haptenos u oligopéptidos.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 al 5, caracterizado porque el analito es
un ácido nucleico, el cual se multiplica, el socio 2 del par
específico de unión 1 ó el socio 2 del par específico de unión 2 se
une a un nucleótido o se forma un oligonucleótido en la copia del
ácido nucleico, y el producto de amplificación se hibrida con el
ácido nucleico, el cual lleva el socio 2 de aquel par de unión, el
cual no presenta el ácido nucleico complementario.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el analito es un
ácido nucleico el cual es hibridado con 2 sondas de ácidos
nucleicos, en donde una de ellas contiene el socio 2 del par
específico de unión 1, y la otra contiene el socio 2 del par
específico de unión 2.
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| EP0926498A1 (de) | 1999-06-30 |
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