ES2314816T3 - Vacuna contra hbv y hpv. - Google Patents
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Abstract
Una composición de vacuna que comprende un antígeno superficial de hepatitis B y un antígeno del papilomavirus humano (HPV) que comprende la proteína principal de la cápsida L1 de HPV de HPV 6 y/o HPV 11, junto con un adyuvante que preferentemente estimula una respuesta celular TH1, en la que la composición de vacuna no comprende un antígeno vírico de herpes símplex, en la que la composición es adecuada para el tratamiento o profilaxis de infecciones de papilomavirus humano e infecciones de hepatitis B.
Description
Vacuna contra HBV y HPV.
Esta invención se refiere a formulaciones de
vacuna novedosas, procedimientos para prepararlas y su uso en
terapia. En particular la presente invención se refiere a vacunas
combinadas para su administración a adolescentes.
Los papilomavirus son virus tumorales pequeños
de ADN, que son muy específicos de especie. Hasta la fecha, se han
descrito más de 70 genotipos de papilomavirus (HPV) humanos
individuales. Los HPV generalmente son específicos o bien de la
piel (por ejemplo HPV- 1 y -2) o de las superficies mucosas (por
ejemplo HPV-6 y -11) y habitualmente provocan
tumores benignos (verrugas) que persisten durante varios meses o
años. Dichos tumores benignos pueden ser angustiosos para los
individuos implicados, pero tienden a no ser potencialmente
mortales, con algunas excepciones.
Algunos HPV también están asociados con
cánceres. La asociación positiva más fuerte entre un HPV y el cáncer
humano es la que existe entre HPV-16 y
HPV-18 y el carcinoma de cuello de útero. El cáncer
de cuello de útero es el cáncer más habitual entre los países en
desarrollo, produciéndose aproximadamente 500.000 casos nuevos en
el mundo al año. Ahora es técnicamente factible combatir de forma
activa las infecciones primarias por HPV-16, e
incluso los cánceres establecidos que contienen
HPV-16, usando vacunas. Para una revisión sobre las
posibilidades de la vacunación profiláctica y terapéutica contra
HPV-16 véase Cason J., Clin. Immunother. 1994;
1(4) 293-306 y Hagenesee M.E., Infections in
Medicine 1997 14(7) 555-556,
559-564.
Actualmente, los diferentes tipos de HPV se han
aislado y caracterizado con la ayuda de sistemas de clonación en
bacterias y más recientemente mediante amplificación por PCR. La
organización molecular de los genomas de HPV se ha definido por
comparación con el del bien caracterizado papilomavirus bovino de
tipo 1 (BPV1).
Otros serotipos de HPV de interés particular son
31, 33 y 45.
Aunque existen variaciones menores, todos los
genomas de los HPV que se han descrito tienen al menos siete genes
tempranos, E1 a E7 y dos genes tardíos L1 y L2. Además, una región
reguladora aguas arriba aloja las secuencias reguladoras que parece
que controlan la mayoría de los eventos de transcripción del genoma
de HPV.
Los genes E1 y E2 están implicados en la
replicación vírica y en el control de la transcripción,
respectivamente y tienen a ser alterados por la integración vírica.
E6 y E7, y según indicios recientes también E5, están implicados en
la transformación vírica.
En los HPV implicados en el carcinoma de cuello
de útero tales como los HPV 16 y 18, el procedimiento oncógeno se
inicia después de la integración del ADN vírico. La integración
provoca la inactivación de genes que codifican las proteínas de la
cápsida L1 y L2 y que se instale la hiperexpresión continuada de dos
proteínas tempranas E6 y E7 que provocarán una pérdida gradual de
la diferenciación celular normal y el desarrollo del carcinoma.
El carcinoma de cuello de útero es habitual
entre las mujeres y se desarrolla a través de una etapa intermedia
precancerosa hasta el carcinoma invasivo que con frecuencia provoca
la muerte. Las etapas intermedias de la enfermedad se conocen como
neoplasia intraepitelial de cuello de útero y se califican en una
escala de I a III según su
gravedad.
gravedad.
Clínicamente, la infección HPV del tracto
anogenital femenino se manifiesta en forma de condilomas planos en
el cuello de útero, cuya característica fundamental es la
coilocitosis que afecta de forma predominante a las células
superficiales e intermedias del epitelio escamoso del cuello del
útero.
Los coilocitos que son consecuencia de un efecto
citopático del virus, aparecen en forma de células multinucleadas
con un halo transparente perinuclear. El epitelio se engrosa con una
queratinización anormal responsable del aspecto verrugoso de la
lesión.
Dichos condilomas planos, cuando son positivos
para los serotipos HPV 16 ó 18, son factores de alto riesgo de
evolución hacia neoplasia intraepitelial de cuello de útero (CIN) y
carcinoma in situ (CIS) que en sí mismas se consideran
lesiones precursoras del carcinoma invasivo de cuello de útero.
El documento WO 96/19496 describe variantes de
las proteínas E6 y E7 del papilomavirus humano, en particular de
las proteínas de fusión de E6/E7 con una deleción en ambas de las
proteínas E6 y E7. Se dice que esas proteínas de fusión con
deleciones are son inmunógenas.
Las vacunas con base de HPV L1 se describen en
los documentos WO94/00152, WO94/20137, WO93/02184 y WO94/05792.
Dicha vacuna puede comprender el antígeno L1 en forma de monómero,
un capsómero o una partícula similar a un virus. Dichas partículas
además pueden comprenden proteínas L2. Las vacunas basadas en L2 se
describen por ejemplo en el documento WO93/00436. Otras vacunas de
HPV se basan en las proteínas tempranas, tales como E7 o proteínas
de fusión tales como L2-E7.
Las vacunas para la profilaxis de las
infecciones de la hepatitis B, que comprenden uno o más antígenos de
la hepatitis B, son bien conocidas. Por ejemplo, la vacuna
Engerix-B (Nombre comercial) de SmithKline Beecham
Biologicals se usa para prevenir la hepatitis B. Esta vacuna
comprende un antígeno superficial de la hepatitis B
(específicamente el antígeno S de 226 aminoácidos que se describe en
Harford y cols en Postgraduate Medical Journal, 1987, 63 (Supl.
2), páginas 65-70) y se formula usando hidróxido de
aluminio como adyuvante.
Existe la necesidad de vacunas combinadas para
evitar enfermedades a las que las adolescentes tienen una tendencia
particular.
La presente invención proporciona una
composición de vacuna que comprende un antígeno superficial de
hepatitis B y un antígeno del papilomavirus humano (HPV), junto con
un adyuvante que estimula preferentemente una respuesta celular
TH1, en la que la composición de vacuna no comprende un antígeno
vírico de herpes símplex, en la que la composición es
adecuada para el tratamiento o profilaxis de infecciones por el
papilomavirus humano y hepatitis B, y en la que el antígeno de HPV
comprende la proteína principal de la cápsida L1 de HPV de HPV 6 y/u
11.
Tindle y cols, Virology vol. 200, 1994,
547-557, describen la inserción de las secuencias de
ADN que codifican epítopos de linfocitos B lineales
inmunodominantes y un epítopo de linfocito T cooperador
"universal" de E7 del papilomavirus humano (HPV) de tipo 16
que transforma la proteína en el gen de HBcAg completo clonado en
un plásmido de expresión bacteriano inducible (pPN1.0).
El documento WO9517209 describe una composición
de vacuna que comprende una emulsión de aceite en agua opcionalmente
con monofosforil lípido A 3
des-O-acilado y QS21.
La composición de vacuna de la invención es muy
beneficiosa para la administración a adolescentes que pueden
presentar un riesgo particular de ser infectados por HBV, y/o
HPV.
Opcionalmente, la composición de vacuna de la
invención además comprende uno o más de un número de otros antígenos
tal como se describe más adelante.
Se ha encontrado que las composiciones de vacuna
de acuerdo con la invención sorprendentemente no muestran
interferencia, es decir, que la respuesta inmunitaria a cada
antígeno de la composición de la invención es esencialmente igual
que la que se obtiene al administrar cada antígeno individualmente
junto con un adyuvante que sea un estimulador de la respuesta
celular TH1 preferentemente.
La vacuna Havrix (Nombre comercial), también de
SmithKline Beecham Biologicals es un ejemplo de una vacuna que
puede usarse para prevenir las infecciones por hepatitis A. Está
formulada con hidróxido de aluminio como adyuvante. Esta vacuna
comprende una cepa atenuada del virus de la Hepatitis A
HM-175 inactivado con formol (formaldehído); véase
Andre y cols (Prog. med. Virol., vol. 37, páginas
1-24).
Tal como se usa en el presente documento, el
término antígeno vírico de la hepatitis A (HAV) se usa para
referirse o bien a una proteína que se deriva del virus de la
hepatitis A o a una cepa atenuada de HAV, opcionalmente inactivada,
por ejemplo con formaldehído. Si el antígeno de HAV es una proteína
que se deriva del virus de la hepatitis A opcionalmente puede ser
una proteína recombinante.
La vacuna Twinrix (Nombre comercial) es una
combinación de un antígeno recombinante de la hepatitis B con el
virus de la hepatitis A atenuado inactivado mencionado
anteriormente. La vacuna puede usarse para proteger contra la
hepatitis A y hepatitis B de forma simultanea.
La patente europea 0 339 667 (Chemo Sero)
describe el concepto general de combinar un antígeno de la hepatitis
A y un antígeno de la hepatitis B proporcionando una vacuna
combinada. En esa memoria descriptiva se afirma que el adyuvante
que se usa no es crítico: sólo debe ser capaz de potenciar la
actividad inmunitaria hasta un grado deseado y no provocar efectos
secundarios. Se afirma que puede usarse el gel de aluminio, en
particular gel de hidróxido de aluminio y gel de fosfato de
aluminio.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona una composición de vacuna que comprende un antígeno
superficial de hepatitis B y un antígeno del papilomavirus humano
(HPV), junto con un adyuvante que estimula preferentemente una
respuesta celular TH1, en la que la composición de vacuna no
comprende un antígeno vírico de herpes símplex, en la que la
composición es adecuada para el tratamiento o profilaxis de
infecciones por el papilomavirus humano y hepatitis B, y en la que
el antígeno de HPV comprende la proteína principal de la cápsida L1
de HPV de HPV 6 y/o 11, y en la que la vacuna además comprende un
antígeno vírico de la hepatitis A (HAV).
Dicha vacuna es muy beneficiosa para la
administración a adolescentes que pueden presentar un riesgo
particular de ser infectados por HPV y/o HAV.
Una respuesta inmunitaria puede dividirse en
líneas generales en dos categorías extremas, o bien una respuesta
inmunitaria humoral o mediada por células (caracterizadas
tradicionalmente por anticuerpos y mecanismos celulares efectores
de protección respectivamente). Estas categorías de respuesta se han
denominado respuestas de tipo TH1 (respuesta mediada por células),
y respuestas inmunitarias de tipo TH2 (respuesta humoral).
Las respuestas inmunitarias de tipo TH1 extremas
pueden caracterizarse por la generación de linfocitos T citotóxicos
con haplotipo restringido y respuestas de linfocitos citolíticos
naturales específicos de antígeno. En los ratones, las respuestas
de tipo TH1 se caracterizan a menudo por la generación de
anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en el ser humano
corresponden a los anticuerpos de tipo IgG1. Las respuestas
inmunitarias de tipo TH2 se caracterizan por la generación de un
amplio abanico de isotipos de inmunoglobulinas que incluyen IgG1,
IgA, e IgM en ratones.
Puede considerarse que el motor impulsor del
desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunitarias son las
citocinas. Los niveles elevados de citocinas de tipo TH1 tienden a
favorecer la inducción de las respuestas inmunitarias mediadas por
células contra el antígeno dado, aunque los niveles elevados de
citocinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de
respuestas inmunitarias humorales contra el antígeno.
La distinción entre las respuestas inmunitarias
de tipo TH1 y de tipo TH2 no es absoluta. En realidad, un individuo
desarrollará una respuesta inmunitaria que se describe como
predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, a
menudo es conveniente considerar las familias de citocinas en
términos de lo que se describe en los clones de linfocitos T
murinos positivos para CD4 en Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y
Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of
lymphokine secretion lead to different functional properties.
Annual Review of Immunology, 7, páginas 145-173).
Tradicionalmente, las respuestas de tipo TH1 se asocian a la
producción de citocinas INF-\gamma y citocinas
IL-2 por los linfocitos T. Otras citocinas asociadas
a menudo directamente a la inducción de respuestas inmunitarias de
tipo TH1 no son producidas por los linfocitos T, tales como
IL-12. Por el contrario, las respuestas de tipo TH2
se asocian a la secreción de IL-4,
IL-5, IL-6, IL-10 y
el factor de necrosis tumoral. Por el contrario, las respuestas de
tipo TH2 se asocian a la secreción de IL-4,
IL-5, IL-6, IL-10 y
el factor de necrosis tumoral-\beta
(TNF-\beta).
Se sabe que ciertos adyuvantes de vacunas son
particularmente adecuados para la estimulación de las respuestas de
citocinas de tipo TH1 o TH2. Tradicionalmente los mejores
indicadores del equilibrio entre TH1 y TH2 en la respuesta
inmunitaria después de una vacunación o infección incluyen la
medición directa de la producción de citocinas TH1 o TH2 por los
linfocitos T in vitro después de la reestimulación con
antígeno, y/o las mediciones (al menos en ratones) de la proporción
entre IgG1:IgG2a en las respuestas de anticuerpos específicas de
antígeno.
Así, un adyuvante de tipo TH1 es aquel que
estimula las poblaciones de linfocitos T aisladas para producir
niveles elevados de citocinas de tipo TH1 cuando se vuelven a
estimular con antígeno in vitro, e induce respuestas de
inmunoglobulinas específicas de antígeno asociadas al isotipo de
tipo TH1.
Los adyuvantes que son capaces de una
estimulación preferencial de la respuesta de linfocitos TH1 se
describen en las solicitudes de patente internacional n.º WO
94/00153 y WO 95/17209.
El monofosforil lípido A 3
des-O-acilado
(3D-MPL) es uno de dichos adyuvantes. Se conoce a
partir del documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla
de monofosforil lípido A 3
des-O-acilado con cadenas 4, 5 ó 6
aciladas y lo fabrica Ribi Immunochem, Montana. Una forma preferida
de monofosforil lípido A 3
des-O-acilado se describe en la
patente europea 0 689 454 B 1 (SmithKline Beecham Biologicals
SA).
Preferiblemente, las partículas de
3D-MPL son lo suficientemente pequeñas para
esterilizarse por filtración a través de una membrana de 0,22
micras (tal como se describe en la patente europea número 0 689
454).
El 3D-MPL estará presente en el
intervalo de de 10 \mug - 100 \mug preferiblemente
25-50 \mug por dosis en la que el antígeno
habitualmente estará presente en un intervalo de
2-50 \mug por dosis.
Otro adyuvante preferido comprende QS21, un una
fracción no tóxica purificada por HPLC que se deriva de la corteza
de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente esta puede
mezclarse con monofosforil lípido A 3
des-O-acilado
(3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.
El procedimiento de producción de QS21 se
describe en la patente de Estados Unidos n.º 5.057.540.
Anteriormente se han descrito formulaciones de
adyuvante reactógenas que contienen QS21 (documento WO 96/33739).
Se ha demostrado que dichas formulaciones que comprenden QS21 y
colesterol son adyuvantes que estimulan con éxito TH1 cuando se
formulan junto con un antígeno. Así, las composiciones de vacuna que
forman parte de la presente invención pueden incluir una
combinación de QS21 y colesterol.
Otros adyuvantes que son preferentemente
estimuladores de la respuesta celular TH1 incluyen oligonucleótidos
inmunoestimuladores, por ejemplo secuencias de CpG no metiladas tal
y como se describe en el documento WO 96/02555.
Las combinaciones de diferentes adyuvantes que
estimulan TH1, tales como las que se mencionan anteriormente en el
presente documento, también se contemplan como adyuvantes que
estimulan preferentemente la respuesta celular TH1. Por ejemplo,
QS21 puede formularse junto con 3D-MPL. La
proporción entre QS21 y 3D-MPL habitualmente será
del orden de 1:10 a 10:1; preferiblemente de 1:5 a 5:1 y a menudo
sustancialmente 1:1. El intervalo preferido para una sinergia
óptima es de 2,5:1 a 1:1 de 3D-MPL: QS21.
Preferiblemente también hay un vehículo presente
en la composición de vacuna de acuerdo con la invención. El
vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua, o una sal de
aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.
Una emulsión de aceite en agua preferida
comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno, alfa
tocoferol y Tween 80. Además emulsión de aceite en agua puede
contener Span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.
En un aspecto preferido particular, los
antígenos de la composición de vacuna de acuerdo con la invención
se combinan con 3D-MPL y alumbre.
Habitualmente para la administración a seres
humanos QS21 y 3D-MPL estarán presentes en una
vacuna en el intervalo de 1 \mug - 200 \mug, tal como
10-100 \mug, preferiblemente 10 \mug - 50 \mug
por dosis. Habitualmente la emulsión de aceite en agua comprenderá
de 2 a 10% de escualeno, de 2 a 10% de alfa tocoferol y de 0,3 a 3%
de Tween 80. Preferiblemente la proporción entre escualeno y alfa
tocoferol es igual o inferior a 1 ya que esto proporciona una
emulsión más estable. También puede estar presente Span 85 a un
nivel de 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas
de la presente invención contengan además un estabilizante.
Las emulsiones de aceite en agua no tóxicas
preferiblemente contienen un aceite no tóxico, por ejemplo escualano
o escualeno, un emulgente, por ejemplo Tween 80, en un vehículo
acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina
tamponada con fosfato.
En el documento WO 95/17210 se describe una
formulación adyuvante particularmente potente que contiene QS21,
3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en
agua.
El antígeno de HPV en la composición de la
invención se deriva de HPV 6 y/o 11.
El antígeno de HPV en la composición de vacuna
de acuerdo con la invención comprende la proteína principal de la
cápsida L1 de HPV y opcionalmente la proteína L2. En esta
realización, la forma preferida de la proteína L1 es una proteína
L1 truncada. Preferiblemente la L1 está en forma de una partícula
similar a un virus (VLP). La proteína L1 puede estar fusionada a
otra proteína VLP, en particular E7 formando una fusión de
L1-E7. Se prefieren particularmente las VLP
quiméricas que comprenden L1-E o
L1-L2-E.
Las proteínas de la presente invención
preferiblemente se expresan en E. coli. En una realización
preferida las proteínas se expresan con una cola de histidina que
comprende entre 5 y 9 y preferiblemente seis restos de histidina.
Estas son ventajosas para ayudar a la purificación. La descripción
de la fabricación de dichas proteínas se incluye al completo en la
solicitud de patente del Reino Unido en tramitación con la presente
número GB 9717953.5.
El antígeno de HPV en la composición de vacuna
puede estar absorbido sobre Al(OH)_{3}.
Preferiblemente la VLP L1 está adsorbida sobre
Al(OH)_{3}.
El antígeno vírico de la hepatitis B (HBV) en la
composición de la invención es un antígeno superficial de la
hepatitis B.
La preparación del antígeno superficial de la
hepatitis B (HBsAg) está bien documentada. Véase por ejemplo,
Harford y cols. en Develop. Biol. Standard 54, página 125 (1983),
Gregg y cols. en Biotechnology, 5, página 479 (1987), documentos
EP-A- 0 226 846, EPA- 0 299 108 y las referencias
que se citan en ellos.
Tal como se usa en el presente documento la
expresión "antígeno superficial de la hepatitis B", que se
abrevia en el presente documento a "HBsAg" o "HBS"
incluye cualquier antígeno de HBsAg o fragmento del mismo que
presenta la capacidad inmunógena del antígeno superficial de HBV.
Se entenderá que además de la secuencia de 226 aminoácidos del
antígeno S de HBsAg (véase Tiollais y cols Nature, 317, 489 (1985)
y las referencias que se citan en él) HBsAg tal y como se describe
en el presente documento puede, si se desea, contener todo o parte
de una presecuencia de S tal como se describe en las referencias
anteriores y en el documento EP-A- 0 278 940. HBsAg
como se describe en el presente documento también puede referirse a
variantes, por ejemplo el "mutante de escape" que se describe
en el documento WO 91/14703. En un aspecto adicional el HBsAg puede
comprender una proteína que se describe como L* en la solicitud de
patente europea número 0 414 374, es decir una proteína, cuya
secuencia de aminoácidos está constituida por partes de la secuencia
de aminoácidos de la proteína grande (L) del virus de la hepatitis
B (subtipo ad o ay), caracterizada porque la secuencia de
aminoácidos de la proteína está constituida o bien
por:
por:
(a) los restos 12 - 52, seguidos por los restos
133 - 145, seguidos por los restos 175 - 400 de dicha proteína L;
o
(b) el resto 12, seguido por los restos 14 - 52,
seguidos por los restos 133 - 145, seguidos por los restos 175 -
400 de dicha proteína L.
HBsAg también se refiere a los polipéptidos que
se describen en el documento EP 0 198 474 o EP 0 304 578.
\newpage
Normalmente el HBsAg estará en forma de
partícula. Puede comprender proteína S sola o puede estar en forma
de partículas compuestas, por ejemplo (L*,S) en la que L* es tal
como se define anteriormente y S denota la proteína S del antígeno
superficial de la hepatitis B.
El HBsAg puede estar adsorbido sobre fosfato de
aluminio tal como se describe en el documento WO93/24148.
Preferiblemente el antígeno de la hepatitis B
que se usa en la formulación de la invención es el antígeno S de
HBsAg tal como se usa en el producto comercial
Engerix-B (Nombre comercial; SmithKline Beecham
Biologicals).
Una vacuna que comprende el antígeno superficial
de hepatitis B junto con 3D-MPL se describió en la
solicitud de patente europea 0 633 784.
A continuación se describen ejemplos de
antígenos de patógenos adicionales que pueden incluirse en las
composiciones de acuerdo con la invención.
El virus de Epstein Barr (EBV), un miembro del
grupo de los herpesvirus, provoca mononucleosis infecciosa como
enfermedad primaria en los seres humanos. Predominantemente afecta a
los niños o a adultos jóvenes. Más del 90% de la población adulta
media está infectada por el EBV que persiste durante toda la vida en
los linfocitos B periféricos. El virus se produce durante toda la
vida en la glándula paratiroides y se extiende principalmente por
intercambio de saliva de individuos que propagan el virus. Los niños
infectados con EBV en su mayoría no muestran síntomas o tienen
síntomas muy leves, mientras que los adolescentes y los adultos que
sufren la infección habitualmente desarrollan mononucleosis
infecciosa típica, que se caracteriza por fiebre, faringitis y
adenopatía. La gente que ha sido infectada mantiene anticuerpos
contra EBV durante el resto de sus vidas y por lo tanto son inmunes
a una infección posterior.
Además de sus cualidades infecciosas, se ha
demostrado que el EBV transforma los linfocitos en células que se
dividen rápidamente y por lo tanto ha sido implicado en varios
linfomas diferentes, que incluyen el linfoma de Burkitt africano
(BL). El EBV también puede estar implicado en el carcinoma
nasofaríngeo (NPC). En todo el mundo se estima que se producen
80.000 casos de carcinoma nasofaríngeo y es más predominante entre
las poblaciones de etnia china. La mononucleosis infecciosa es
consecuencia de la infección primaria por el EBV. No es una
enfermedad potencialmente mortal si no existen factores de riesgo
adicionales.
Se han descrito cuatro proteínas de la cubierta
vírica del EBV que constituyen el denominado complejo de antígenos
de la membrana. Habitualmente se denomina gp 220/350 o gp 250/350 o
simplemente gp 250 o 350 (véase el documento
EP-A-151079). Existen indicios
convincentes de que gp 350 y gp 250 inducen la producción de
anticuerpos neutralizadores y de que los anticuerpos contra gp 350
y gp 250 tienen capacidad neutralizadora. Estas proteínas son por lo
tanto candidatas para una posible vacuna contra EBV. Para más
información sobre la aplicación de gp 250/350 para la profilaxis y
el tratamiento de enfermedades relacionadas con EBV véase el
documento EP 0 173 254.
La glucoproteína gp350/220 superficial principal
de EBV infecta a células diana humanas a través de la interacción
con la proteína de la membrana celular, CD21. Gp350/220 es la diana
primaria para los anticuerpos que neutralizan EBV en los seres
humanos y se ha demostrado que algunas formas de gp350/220 protegen
contra la enfermedad relacionada con EBV. Preferiblemente una
composición de vacuna de acuerdo con la invención comprende gp 350
de EBV aunque pueden usarse otros antígenos protectores.
En un aspecto preferido, la composición de
vacuna de la invención además comprende un antígeno vírico de
varicella zóster (antígeno de VZV). Los antígenos adecuados
de VZV para la inclusión en la formulación de vacuna incluyen
gpI-V descrito por Longnecker y cols., Proc Natl
Acad Sci USA 84, 4303-4307 (1987).
En una realización preferida se usa gpI (véase
Ellis y cols., patente de Estados Unidos 4.769.239). Véase también
la Patente europea n.º 0 405 867 B1.
En otro aspecto preferido, la composición de
vacuna de la invención además comprende un antígeno de
citomegalovirus humano (CMVH). El CMVH es un virus de ADN humano
que pertenece a la familia de los herpesvirus. El CMVH es endémico
en la mayor parte de los países del mundo. Entre dos poblaciones, el
CMVH es responsable de afecciones médicas graves. El CMVH es una
causa principal de defectos congénitos en los recién nacidos. La
segunda populación de riesgo son los pacientes inmunocomprometidos
tales como los que padecen una infección por VIH y los que se
someten a trasplantes. La enfermedad clínica provoca una variedad de
síntomas que incluyen fiebre, hepatitis, neumonía y mononucleosis
infecciosa. Un antígeno preferido para usar en una vacuna contra
CMVH es el gB685** tal como se describe en el documento WO
95/31555. También pp65 proporciona inmunógenos para usar en las
vacunas contra CMVH, una proteína de la matriz de CMVH tal como se
describe en el documento WO 94/00150 (City of Hope).
En un aspecto preferido, la composición de
vacuna de la invención además comprende tanto un antígeno de VZV
como de CMVH, en particular los antígenos que se describen
anteriormente.
En otro aspecto preferido, la composición de
vacuna de la invención además comprende un antígeno de Toxoplasma
gondii. El Toxoplasma gondii es un protozoo parásito
intracelular obligado responsable de la toxoplasmosis en animales
de sangre caliente, incluido el hombre. Aunque generalmente no
presenta síntomas clínicos en los individuos sanos, la
toxoplasmosis puede provocar complicaciones graves en las mujeres
embarazadas y en los pacientes inmunocomprometidos. Un antígeno
preferido para usar en una vacuna contra Toxoplasma gondii
es SAG 1 (también conocido como P30) tal como se describe en el
documento WO96/02654 o Tg34 tal como se describe en el documento
WO92/11366.
En un aspecto preferido, la composición de
vacuna de la invención además comprende o bien un antígeno de VZV o
bien un antígeno de CMVH combinado con un antígeno de Toxoplasma
gondii, en particular los antígenos que se describen
anteriormente.
En un aspecto preferido, la composición de
vacuna de la invención es una vacuna multivalente, por ejemplo una
tetravalente o pentavalente.
Las formulaciones de la presente invención son
muy eficaces para inducir una inmunidad protectora, incluso con
dosis muy bajas de antígeno (por ejemplo a partir de 5 \mug de
rgD2t).
Proporcionan una protección excelente contra la
infección primaria y estimulan de forma ventajosa respuestas
inmunitarias tanto humoral específica (anticuerpos neutralizadores)
como también efectora mediada por células (DTH).
La presente invención en un aspecto adicional
proporciona una formulación de vacuna como se describe en el
presente documento para usar en el tratamiento médico, en particular
para usar en el tratamiento o la profilaxis de infecciones por
papilomavirus humano e infecciones por el virus de la hepatitis
B.
La vacuna de la presente invención contendrá una
cantidad inmunoprotectora de los antígenos y puede prepararse
mediante técnicas convencionales.
Las preparación de vacunas se describe de forma
general en Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design -
the subunit and adjuvant approach, editado por Powell y Newman,
Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines,
editado por Voller y cosl., University Park Press, Baltimore,
Maryland, EE. UU.. 1978. La encapsulación en liposomas se describe,
por ejemplo, en Fullerton, patente de Estados Unidos 4.235.877. La
conjugación de proteínas con macromoléculas se describe, por
ejemplo, en Likhite, patente de Estados Unidos 4.372.945 y en
Armor y cols., patente de Estados Unidos 4.474.757.
La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna
se selecciona como una cantidad que induce una respuesta
inmunoprotectora sin efectos adversos significativos, en las
vacunas típicas. Dicha cantidad variará dependiendo del inmunógeno
específico que se emplee. Generalmente, es de esperar que cada dosis
comprenderá 1-1000 \mug de proteína,
preferiblemente 2-100 \mug, lo más preferiblemente
4-40 \mug. Una cantidad óptima para una vacuna
particular puede evaluarse mediante estudios estándar que implican
la observación de las valoraciones de anticuerpos y otras
respuestas en sujetos. Tras una vacunación inicial, los sujetos
pueden recibir un refuerzo en aproximadamente 4 semanas.
Además de para la vacunación de personas
susceptibles de ser infectadas por HPV o HBV, las composiciones
farmacéuticas de la presente invención pueden usarse para tratar
mediante inmunoterapia a pacientes que padecen dichas infecciones
víricas.
En un aspecto adicional de la presente invención
se proporciona un procedimiento de fabricación tal como se describe
en el presente documento, en el que el procedimiento comprende
mezclar un antígeno del papilomavirus humano (HPV) y un antígeno
del virus de la hepatitis B con un adyuvante que induce una
respuesta TH-1, por ejemplo 3D-MPL
y, preferiblemente, un vehículo, por ejemplo alumbre.
Si se desea, pueden añadirse otros antígenos, en
cualquier orden conveniente, para proporcionar composiciones de
vacuna multivalentes tal como se describe en el presente
documento.
El siguiente ejemplo ilustra pero no limita la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Partícula similar a un virus L1 de HPV16
(VLP-16)
2. Partícula similar a un virus L1 de HPV18
(VLP-18)
3. PD 1/3 16E7 2 M de HPV-16
(E7)
4. HBsAg
se formularon con alumbre/3D-MPL
(AS04) usando vacunas monovalentes previamente adsorbidas de
antígeno o 3D-MPL sobre Al(OH)_{3}
o AlPO_{4}. Las formulaciones de
3D-MPL/Al(OH)_{3} se denominan
AS04D, mientras que las formulaciones con base de
3D-MPL/Al(OH)_{3} se denominan
AS04C.
Se evaluaron las siguientes vacunas:
1. VLP16 + VLP18 con AS04D;
2. Formulaciones con base de E7,
3. HBs con AS04C
y se evaluó el potencial de combinar estas
vacunas.
Los objetivos de este experimento eran los
siguientes:
1) Comparar la capacidad inmunógena de
diferentes combinaciones de AS04 con VLP16 +VLP18 o E7 y HBsAg.
2) Dado que las vacunas monovalentes están
formuladas en AS04C o AS04D:
comparar la capacidad inmunógena de diferentes
formulaciones de HBs y AS04 preparadas con AlPO_{4} o una mezcla
de AlPO_{4}/Al(OH)_{3} con diferentes proporciones
de formas de alumbre; y
evaluar el efecto de la adsorción de
3D-MPL en una fracción de Al(OH)_{3}
y AlPO_{4} comparado con
3D-MPL/Al(OH)_{3} combinada que
contiene los antígenos de las VLP o E7.
El protocolo experimental se describe
completamente en la sección de Materiales y métodos.
En resumen, se inmunizó a grupos de 10 ratones
por vía intramuscular dos veces a intervalos de 3 semanas con
diversas formulaciones con base de Ag (1/10HD). Se controló la
respuesta de anticuerpos contra los Ag HBs, E7 y las VLP y el
perfil de los isotipos inducidos por la vacunación mediante ELISA el
día 14 después de II. En el mismo momento, se analizó la CMI
(respuesta de proliferación de linfocitos o la producción de
citocinas (IFN-\gamma/IL5)) después de la
reestimulación in vitro de esplenocitos con los antígenos
HBs, VLP o E7.
\vskip1.000000\baselineskip
VLP16, VLP18,
PD1/3-HPV16E7-His, y HBs en AS04C o
AS04D.
Se añade granel purificado de VLP 16 y VLP 18 a
Al(OH)_{3} a 2 \mug de VLP/10 \mug de
Al(OH)_{3}. La mezcla se almacena entre
2-8ºC hasta la formulación final.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclan 2 \mug de Hbs con 40 \mug de
AlPO_{4}. La mezcla se almacena entre 2-8ºC hasta
la formulación final. Se mezclan 2 \mug de Hbs con 10 \mug de
AlPO_{4}. La mezcla se almacena entre 2-8ºC hasta
la formulación final.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclan 2 \mug de E7 con 10 \mug de
Al(OH)_{3}. La mezcla se almacena entre
2-8ºC hasta la formulación final.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezclan 5 \mug de 3D-MPL
con 10 \mug de Al(OH)_{3}. La mezcla se almacena
entre 2-8ºC hasta la formulación final. Se mezclan
5 \mug de 3D-MPL con 10 \mug de AlPO_{4}. La
mezcla se almacena entre 2-8ºC hasta la formulación
final. Se mezclan 2,5 \mug de 3D-MPL con 5 \mug
de Al(OH)_{3}. La mezcla se almacena entre
2-8ºC hasta la formulación final. Se mezclan 2,5
\mug de 3D-MPL con 5 \mug de AlPO_{4}. La
mezcla se almacena entre 2-8ºC hasta la formulación
final.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezcla H_{2}O y NaCl (concentración de 10
veces) y después de 10 minutos de agitación a temperatura ambiente,
se añaden los diferentes componentes: antígeno adsorbido,
3D-MPL y Al(OH)_{3} adsorbidos
(Véase la tabla a continuación). Se agitan a temperatura ambiente
durante 10 minutos y se almacenan a 4ºC hasta la inyección. Después
puede realizarse la caracterización in vitro de la
formulación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Tabla de grupos y detalles de
las
formulaciones
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La cuantificación de los anticuerpos contra HBs
se realizó mediante ELISA usando HBs (Hep 286) como antígeno para
el recubrimiento. Se usaron soluciones de antígeno y anticuerpo a 50
\mul por pocillo. El antígeno se diluyó a una concentración final
de 1 \mug/ml en PBS y se adsorbió toda la noche a 4ºC en los
pocillos de placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb
Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). Las placas después
se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía 1% de
albúmina de suero bovina y 0,1% de Tween 20 (tampón de saturación).
Se añadieron diluciones por un factor de dos de suero (empezando por
una dilución de 1/100) en el tampón de saturación a las placas
recubiertas con HBs y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37ºC.
Las placas se lavaron cuatro veces con PBS 0,1% de Tween 20 y se
añadió Ig contra ratón conjugada con biotina (Amersham, Reino
Unido) diluida 1/1500 o IgG1, IgG2a, IgG2b (IMTECH, USA) diluidas
respectivamente a 1/4000, 1/8000, 1/4000 en tampón de saturación a
cada pocillo y se incubaron durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC.
Después de una etapa de lavado, se añadió complejo de estreptavidina
y peroxidasa biotinilada (Amersham, Reino Unido) diluido 1/1000 en
tampón de saturación durante otros 30 minutos más a 37ºC. Las placas
se lavaron como anteriormente y se incubaron durante 20 minutos con
una solución de o-fenilendiamina (Sigma) al 0,04%,
H_{2}O_{2} al 0,03% en 0,1% de Tween 20, tampón de citrato 0,05
M a pH 4,5. La reacción se terminó con H_{2}SO_{4} 2 N y se
leyó a 490/630 nm. Las valoraciones mediante ELISA se calcularon a
partir de una referencia mediante SoftmaxPro (usando una ecuación
de cuatro parámetros) y se expresaron en
UE/ml.
UE/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
La cuantificación de los anticuerpos contra E7
se realizó mediante ELISA usando anticuerpos contra E7 PD1/3 16E7
2M como antígeno para el recubrimiento. Se usaron soluciones de
antígeno y anticuerpo a 100 \mul por pocillo. El antígeno se
diluyó a una concentración final de 0,5 \mug/ml en PBS y se
adsorbió toda la noche a 4ºC en los pocillos de placas de
microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb
Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). Las placas después
se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía 1% de
albúmina de suero bovina y 0,1% de Tween 20 (tampón de saturación).
Se añadieron diluciones a la mitad de suero (empezando por una
dilución de 1/100 o 1/400) en el tampón de saturación a las placas
recubiertas con E7 y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37ºC.
Las placas se lavaron cuatro veces con PBS, 0,1% de Tween 20 y se
añadieron Ig, IgG1, IgG2a, IgG2b contra ratón conjugadas con
biotina (Amersham, Reino Unido) diluidas 1/1500 en tampón de
saturación a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a
37ºC. Después de una etapa de lavado, se añadió complejo de
estreptavidina y peroxidasa biotinilada (Amersham, Reino Unido)
diluido 1/5000 en tampón de saturación durante otros 30 minutos más
a 37ºC. Las placas se lavaron como anteriormente y se incubaron
durante 20 minutos con una solución de tetrametilbencidina (TMB)
(Biorad, USA) diluida por un factor de 2 en tampón de citrato (0,1
M pH = 5,8). La reacción se terminó con H_{2}SO_{4} 0,5 N y se
leyó a 450/630 nm. Las valoraciones mediante ELISA se calcularon a
partir de una referencia mediante SoftmaxPro (usando una ecuación
de cuatro parámetros) y se expresaron en UE/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
La cuantificación de los anticuerpos contra
VLP16 y contra VLP18 se realizó mediante ELISA usando VLP16 503/1
(20/12/99) y VLP18 504/2 (25/10/99F) como antígenos de
recubrimiento. Se usaron soluciones del antígeno y anticuerpo a 50
\mul por pocillo. El antígeno se diluyó a una concentración final
de 0,5 \mug/ml en PBS y se adsorbió toda la noche a 4ºC en los
pocillos de placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb
Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). Las placas después
se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía 1% de
albúmina de suero bovina. Se añadieron diluciones por un factor de
dos de suero (empezando por una dilución de 1/400) en el tampón de
saturación a las placas recubiertas con las VLP y se incubaron
durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron cuatro
veces con PBS, 0,1% de Tween 20 y se añadió Ig contra ratón
conjugada con biotina (Amersham, Reino Unido) diluida 1/1500 en
tampón de saturación a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora
30 minutos a 37ºC. Después de una etapa de lavado, se añadió
complejo de estreptavidina y peroxidasa biotinilada (Amersham,
Reino Unido) diluido 1/1000 en tampón de saturación durante otros 30
minutos más a 37ºC. Las placas se lavaron como anteriormente y se
incubaron durante 20 minutos con una solución de
o-fenilendiamina (Sigma) al 0,04%, H_{2}O_{2}
al 0,03% en 0,1% de tween 20, tampón de citrato 0,05 M a pH 4,5. La
reacción se terminó con H_{2}SO_{4} 2 N y se leyó a 490/630 nm.
Las valoraciones mediante ELISA se calcularon a partir de una
referencia mediante SoftmaxPro (usando una ecuación de cuatro
parámetros) y se expresaron en UE/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Dos semanas después de la segunda inmunización,
se sacrificó a los ratones, se extrajeron los bazos de forma
aséptica y se juntaron (1 grupo de 5 órganos por grupo). Se
prepararon suspensiones celulares en medio RPMI 1640 (GE3CO) que
contenía L-glutamina 2 mM, antibióticos,
2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M, y 1% de suero de
ratón normal singénico. Las células esplénicas se cultivaron a una
concentración final de 2 x 10^{6} células/ml en 200 \mul en
placas de 96 pocillos de fondo redondo con concentraciones
diferentes (10-0,03 \mug/ml) de cada uno de los
Ag (antígeno de las VLP, E7 o HBs). Cada prueba se realizó por
cuadruplicado. Después de 96 horas de cultivo a 37ºC en 5% de
CO_{2}, las células se pulsaron durante 18 horas con
^{3}H-timidina (Amersham, Reino Unido, 5 Ci/mmol)
a 0,5 PCi/pocillo y después se recolectaron en placas Unifilter
(Packard) con un recolector de células. La radioactividad
incorporada se midió en un escintilómetro (Topcount,Packard). Los
resultados se expresan en cpm (cpm medios en pocillos
cuadruplicados) o en términos de índices de estimulación (cpm
medios en cultivos de células con antígeno/cpm medios en cultivos de
células sin antígeno).
\vskip1.000000\baselineskip
Dos semanas después de la segunda inmunización,
se sacrificó a los ratones, se extrajeron los bazos de forma
aséptica y se juntaron. Se prepararon suspensiones celulares en
medio RPMI 1640 (GIBCO) que contenía L-glutamina 2
mM, antibióticos, 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M,
y 5% de suero de ternero fetal. Las células se cultivaron a una
concentración final de 5 x 10^{6} células/ml, en 1 ml en placas de
24 pocillos de fondo redondo con diferentes concentraciones
(10-1 \mug/ml) de cada uno de los Ag (antígeno de
las VLP, E7 o HBs). Los sobrenadantes se recolectaron 96 horas
después y se congelaron hasta que se analizaron para determinar la
presencia de IFN-\gamma e IL5 mediante
Elisa.
Elisa.
\vskip1.000000\baselineskip
La cuantificación de
IFN-\gamma se realizó mediante Elisa usando
reactivos de Genzyme. Se usaron muestras y soluciones de
anticuerpos a 50 \mul por pocillo. Las placas de microtitulación
de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc,
Dinamarca) se recubrieron toda la noche a 4ºC con 50 \mul de
anticuerpo de hámster contra IFN-\gamma de ratón
diluido a 1,5 \mug/ml en tampón de carbonato pH 9,5. Las placas
después se incubaron durante 1 hora a 37ºC con 100 \mul de PBS
que contenía 1% de albúmina de suero bovina y 0,1% de Tween 20
(tampón de saturación). Se añadieron diluciones por un factor de dos
de sobrenadante de la estimulación in vitro (empezando por
1/2) en tampón de saturación a las placas recubiertas con anticuerpo
contra IFN-\gamma y se incubaron durante 1 hora 30
minutos a 37ºC. Las placas se lavaron 4 veces con PBS Tween al 0,1%
(tampón de lavado) y se añadió anticuerpo de cabra contra
IFN-\gamma de ratón conjugado con biotina diluido
en tampón de saturación a una concentración final de 0,5 \mug/ml
a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Después de una
etapa de lavado, se añadió conjugado de AMDEX (Amersham) diluido
1/10000 en tampón de saturación durante 30 minutos a 37ºC. Las
placas se lavaron como anteriormente y se incubaron con 50 \mul de
TMB (Biorad) durante 10 minutos. La reacción se terminó con
H_{2}SO_{4} 0,4N y se leyó a 450/630 nm. Las concentraciones se
calcularon usando una curva de patrones (patrón de
IFN-\gamma de ratón) con SoftmaxPro (ecuación de
cuatro parámetros) y se expresaron pg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
La cuantificación de IL5 se realizó mediante
Elisa usando reactivos de Pharmingen. Las muestras y las soluciones
de anticuerpo se usaron a 50 \mul por pocillo. Las placas de
microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb
Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) se recubrieron toda
la noche a 4ºC con 50 \mul de anticuerpo de rata contra
IL-5 de ratón diluido a 1 \mug/ml en tampón de
carbonato pH 9,5. Las placas después se incubaron durante 1 hora a
37ºC con 100 \mul de PBS que contenía 1% de albúmina de suero
bovina y 0,1% de Tween 20 (tampón de saturación).diluciones
seriadas de factor dos de sobrenadante de la estimulación in
vitro (empezando a partir de 1/2) en tampón de saturación a las
placas recubiertas con IL-5 y se incubaron durante 1
hora 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron 4 veces con PBS Tween
al 0,1% (tampón de lavado) y se añadió anticuerpo de rata contra
IL-5 de ratón bioconjugado diluido en tampón de
saturación a una concentración final de 1 \mug/ml a cada pocillo
y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Después de una etapa de
lavado, se añadió conjugado de AMDEX (Amersham) diluido 1/10000 en
tampón de saturación durante 30 minutos a 37ºC. Las placas se
lavaron como anteriormente y se incubaron con 50 \mul de TMB
(Biorad) durante 15 minutos. La reacción se terminó con
H_{2}SO_{4} 0,4N y se leyó a 450/630 nm. Las concentraciones se
calcularon usando una curva de patrones (IL-5 de
ratón recombinante) con SoftmaxPro (ecuación de cuatro parámetros)
y se expresaron pg/ml.
\newpage
Se inmunizó a grupos de 10 ratones Balb/C por
vía intramuscular con las siguientes formulaciones:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los detalles de la formulación se describen
anteriormente en la tabla de los Materiales y métodos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las respuestas humorales (Ig e isotipos) se
midieron mediante Elisa usando HBsAg (Hep286) como antígeno de
recubrimiento. Se analizaron los sueros del día 14 después de
II.
La Figura 1 muestra las respuestas de
anticuerpos contra HBs medidas en sueros individuales el día 14
después de II.
No se observaron diferencias en la respuesta de
anticuerpos contra HBs entre los protocolos aplicados para adsorber
el 3D-MPL: en Al(OH)_{3} solo o
AlPO_{4} solo (grupos C, D, E) con diferentes proporciones de
Al(OH)_{3} y AlPO_{4} en la vacuna (GMT de 27905
UE/ml comparado con 30832 o 26670 UE/ml).
Se observó una respuesta ligeramente menor en
los anticuerpos contra HBs en los grupos G y H con la combinación
que contenía los antígenos de las VLP y de HBs comparado con el HBs
solo (grupo C) (GMT respectivamente de 10635 o 15589 UE/ml
comparado con 27905 UE/ml). Las GMT contra HBs obtenidas en la
combinación de E7/HBs alcanzaron 19235 UE/ml.
Antes del análisis estadístico, se aplicó una
prueba T de Grubbs a cada población para la exclusión de datos. Un
ratón del grupo C se eliminó para el análisis.
Se realizó un análisis de la varianza de una vía
en valoraciones contra HBs después de la transformación en
logarítmicos de los datos posteriores a II. Se observaron
diferencias significativas entre las formulaciones (valor de =
0,0108) y después se aplicó la prueba de Student Newman Keuls para
comparaciones múltiples. No se observó ninguna diferencia
estadísticamente significativa entre la combinación del grupo H
(VLP/HBs) o del grupo F (HBs/E7) y el grupo C (HBs AS04C). Se
demostró una diferencia estadísticamente significativa entre el
grupo G (VLP/HBs) y el grupo C (HBs AS04C) (valor de p = 0,0291),
sin embargo los intervalos de confianza al 95% de los 2 grupos se
superponen y la diferencia que alcanza una proporción de 2,5 puede
no ser biológicamente relevante.
El reparto de isotipos analizado en los sueros
juntos fue el siguiente y no mostró diferencias importantes entre
los 6 grupos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las respuestas humorales (Ig e isotipos) se
midieron mediante Elisa usando PD1/3 16E7 2 M como antígeno de
recubrimiento. Se analizaron los sueros del día 14 después de II de
los grupos B y F.
La Figura 2 muestra las respuestas de
anticuerpos contra E7 medidas en sueros individuales el día 14
después de II.
Se observó un ligero descenso en la respuesta
contra E7 con un descenso de dos veces en la GMT para las
combinaciones de HBs/E7 comparadas con E7 solo (9626 contra 22447
UE/ml). Esto se estableció que era estadísticamente no
significativo usando la prueba de Student Newman Keuls.
No se observaron diferencias en el perfil de los
isotipos inducidos por las dos formulaciones: principalmente una
respuesta de IgG1 (97-98% de IgG1) tal como se
recoge en la tabla siguiente.
El reparto de isotipos analizado en los sueros
juntos fue el siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Se midieron las respuestas humorales (Ig)
mediante Elisa usando VLP16 503-1 (20/12/99) como
antígeno de recubrimiento. Se analizaron los sueros del día 14
después de II.
La Figura 3 muestra las respuestas de
anticuerpos contra VLP16 medidas en sueros individuales el día 14
después de II.
Se obtuvieron valoraciones similares contra
VLP16 después de la inmunización con la combinación de HBs y las
VLP (grupos G y H) que con la formulación monovalente de VLP (grupo
A) (GMT de 19570 o 23448 UE/ml contra 30311 UE/ml)
Se observaron valoraciones equivalentes entre
las dos combinaciones preparadas usando una de las dos de las
formas de adsorber el 3D-MPL:
Al(OH)_{3} solo (grupo G) comparada con la adsorción
mixta en Al(OH)_{3} y AlPO_{4} (grupo H) (GMT de
19570 UE/ml contra 23448 UE/ml).
Se demostró que estas diferencias eran
estadísticamente no significativas usando un análisis unidireccional
de la varianza.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midieron las respuestas humorales (Ig)
mediante Elisa usando VLP18 504-2 (25/10/99) como
antígeno de recubrimiento. Se analizaron los sueros del día 14
después de II.
La Figura 4 muestra la respuesta de anticuerpos
contra VLP18 medidas en sueros individuales el día 14 después de
II.
Se obtuvieron valoraciones similares contra
VLP16 después de la inmunización con la combinación de HBs y las
VLP (grupos G y H) que con la formulación monovalente de VLP (grupo
A) (GMT de 37285 o 51202 UE/ml contra 56504 UE/ml).
Se observaron valoraciones equivalentes (grupos
G y H) las combinaciones preparadas usando una de las dos de las
formas de adsorber el 3D-MPL:
Al(OH)_{3} solo (grupo G) comparada con la adsorción
mixta en Al(OH)_{3} y AlPO_{4} (grupo H).
Se demostró que estas diferencias eran
estadísticamente no significativas usando un análisis unidireccional
de la varianza.
Se evaluaron las respuestas inmunitarias
mediadas por células (proliferación de linfocitos, producción
de
IFN-\gamma/IL5) el día 14 después de II tras la reestimulación in vitro de esplenocitos con antígenos HBs, E7 o VLP. Para cada uno grupo de ratones, se constituyeron grupos de 5 órganos. El procedimiento experimental se describe de forma completa anteriormente en Materiales y Métodos.
IFN-\gamma/IL5) el día 14 después de II tras la reestimulación in vitro de esplenocitos con antígenos HBs, E7 o VLP. Para cada uno grupo de ratones, se constituyeron grupos de 5 órganos. El procedimiento experimental se describe de forma completa anteriormente en Materiales y Métodos.
La Figura 5 muestra la producción de citocinas
controlada en esplenocitos después de 96 horas de la reestimulación
in vitro con HBs.
Se observó una producción baja de
IFN-\gamma e IL-5 para todos los
grupos pero, tal como se muestra en la Tabla 2, se observa una
mayor producción de IFN-\gamma comparada con la
producción de IL-5, donde la proporción entre
IFN-\gamma/IL-5 indica que se
induce una respuesta comparable de TH1 con las vacunas monovalentes
y combinadas. Los resultados del grupo C no deberían tomarse en
cuenta ya que los datos por debajo del umbral pueden indicar la
ausencia de antígeno para la reestimulación.
La Figura 6 muestra la producción de citocinas
controlada en esplenocitos después de 96 horas de la reestimulación
in vitro con antígeno E7.
Se observó un efecto del intervalo de la dosis
al comparar la dosis de AG de 10 \mug y 1 \mug Ag para la
reestimulación.
Se observó una respuesta no específica para los
grupos inmunizados con VLP L1 de HPV16/18 usando 10 \mug de Ag
para la reestimulación.
El IFN-\gamma se produce a una
concentración mucho mayor que IL-5 (Tabla 3) lo que
indica un perfil claro de TH-1 de la respuesta
inmunitaria en todos los grupos evaluados (monovalente comparado con
combinación).
Las Figuras 7 y 8 muestran la proliferación de
linfocitos después de la reestimulación in vitro con VLP16 o
VLP18 el día 14 después de II.
Se observaron perfiles comparables para todas
las formulaciones que contenían las VLP (índices de estimulación
integrados entre 12-29) con cpm de aproximadamente
30000 para una dosis de reestimulación de 10 \mug de Ag, lo que
indica la ausencia de interferencia entre las diferentes
formulaciones en esta lectura.
La Figura 9 muestra la producción de citocinas
controlada en esplenocitos después de 96 horas de reestimulación
in vitro con VLP16.
La Figura 10 muestra la producción de citocinas
controlada en esplenocitos después de 96 horas de la reestimulación
in vitro con VLP18.
No se observó efecto por el intervalo de las
dosis usando dosis de Ag de 10 \mug y 1 \mug para la
reestimulación con ninguno de los dos antígenos VLP sobre la
producción de ambas citocinas.
Se observó un perfil TH1 claro con todas las
formulaciones.
Se evaluó el efecto de la combinación de VLP/HBs
o E7/HBsAg formulados en AS04 sobre la capacidad inmunógena en
ratones Balb/C:
Con respecto al análisis serológico, no se
observó interferencia de la combinación de Ag sobre la serología
contra HBs, contra E7 y contra las VLP.
La combinación de VLP y HBs o de los antígenos
E7 y HBs no interfirió con el perfil de isotipos de la respuesta
contra los anticuerpos de la vacuna monovalente.
El procedimiento de adsorción de
3D-MPL (Al(OH)_{3}, AlPO_{4}, o
mezclas de Al(OH)_{3} y AlPO_{4}) no interfirió
con los resultados serológicos.
En los ensayos de proliferación de linfocitos,
se obtuvieron los resultados tras la reestimulación con las VLP. En
estos grupos, no se observaron efectos negativos de la combinación
de Ag sobre la respuesta proliferativa.
Para la evaluación de las citocinas, se obtuvo
una baja producción de las citocinas (IL-5 y
IFN-\gamma) tras la reestimulación con HBsAg pero
las respuestas fueron comparables en las vacunas monovalentes y en
las combinadas. Después de la reestimulación con E7 o con las VLP,
se produjeron niveles comparables de citocinas respectivamente en
la combinación de E7/HBs o de VLP/HBs comparadas con los grupos
monovalentes. El perfil de TH-1 observado con cada
vacuna monovalente se conservó en los grupos de vacunas
combinadas.
Claims (16)
1. Una composición de vacuna que comprende un
antígeno superficial de hepatitis B y un antígeno del papilomavirus
humano (HPV) que comprende la proteína principal de la cápsida L1 de
HPV de HPV 6 y/o HPV 11, junto con un adyuvante que preferentemente
estimula una respuesta celular TH1, en la que la composición de
vacuna no comprende un antígeno vírico de herpes símplex, en
la que la composición es adecuada para el tratamiento o profilaxis
de infecciones de papilomavirus humano e infecciones de hepatitis
B.
2. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1 que además comprende un vehículo.
3. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2 en la que el compuesto que
estimula preferentemente la respuesta celular TH1 se selecciona a
partir del grupo de adyuvantes que comprende:
3D-MPL, 3D-MPL en el que el tamaño
de las partículas de 3D-MPL es de forma preferible
aproximadamente 100 nm o inferior, QS21, una mezcla de QS21 y
colesterol, y un oligonucleótido de CpG.
4. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 3 en la que el compuesto que estimula preferentemente
la respuesta celular TH1 es 3D-MPL.
5. Una composición de vacuna de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que además hay
presente un antígeno del virus de Epstein Barr (EBV).
6. Una composición de vacuna tal como se define
en reivindicación 5 en la que el antígeno de EBV es gp 350.
7. Una composición de vacuna de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que además hay
presente un antígeno de la hepatitis A.
8. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 7, en la que el antígeno vírico de la hepatitis A
(HAV) se deriva de la cepa HM-175.
9. Una composición de vacuna de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la que el vehículo se
selecciona a partir de grupo que comprende hidróxido de aluminio,
fosfato de aluminio y tocoferol y una emulsión de aceite en
agua.
10. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 1-9 que además comprende un antígeno
vírico de varicella zóster (VZV).
11. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 10 en la que el antígeno de VZV es gpl.
12. Una composición de vacuna de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que además comprende
un antígeno de citomegalovirus humano (CMVH).
13. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 12 en la que el antígeno de CMVH es gB685* o
pp65.
14. Una composición de vacuna de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que además comprende
un antígeno de Toxoplasma gondii.
15. Una composición de vacuna de acuerdo con la
reivindicación 14 en la que el antígeno de Toxoplasma gondii
es SAG1 o TG34.
16. Una composición de vacuna de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende L2, E6,
E7, proteína D-E6, proteína D-E7 o
L2-E7 de HPV y opcionalmente además una o más de
EBVgp 350; VZVgpl; cepa inactivada HM-175 de HAV;
gB685** o pp65 de CMVH y los antígenos SAG1 o TG34 de Toxoplasma
gondii.
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