ES2311857T3 - Composiciones inmunogenas que comprenden vectores de replicon del virus de la encefalitis equina venezolana y antigenos de proteina de paramixovirus. - Google Patents
Composiciones inmunogenas que comprenden vectores de replicon del virus de la encefalitis equina venezolana y antigenos de proteina de paramixovirus. Download PDFInfo
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Abstract
Molécula aislada de ácido nucleico recombinante que codifica una replicasa del virus de la encefalitis equina venezolana, una glucoproteína F del virus paragripal de tipo 3, y una glucoproteína HN del virus paragripal de tipo 3.
Description
Composiciones inmunógenas que comprenden
vectores de replicón del virus de la encefalitis equina venezolana
y antígenos de proteína de paramixovirus.
La presente invención se refiere al campo de
composiciones inmunógenas para el tratamiento o la prevención de
enfermedades infecciosas causadas por paramixovirus tales como el
virus paragripal de tipo 3. La presente invención también se
refiere al campo del ADN recombinante y a procedimientos para
expresar genes foráneos en las células hospedadoras.
Los paramixovirus son virus con envoltura, de
ARN monocatenario no segmentado, de sentido negativo, cuyos
miembros pueden ser extremadamente infecciosos, frecuentes y
patógenos. Los ejemplos incluyen los virus del sarampión, de la
parotiditis, el virus respiratorio sincicial y los virus
paragripales. La Organización Mundial de la Salud (OMS) está
organizando campañas concertadas para tratar de erradicar
paramixovirus tales como el virus del sarampión. Otros
paramixovirus, tales como el virus de la enfermedad de Newcastle
causan estragos en poblaciones de animales de granja.
En Estados Unidos, el virus respiratorio
sincicial (RSV) y el virus paragripal (PIV) de tipo 1, 2, 3 y 4 son
las principales causan de hospitalización debida a enfermedades
respiratorias en niños pequeños y en adultos. Por ejemplo, el RSV y
el PIV son responsables conjuntos de la mayoría de los casos de
bronquiolitis y laringotraqueobronquitis en niños. Asimismo, el RSV
y el PIV son responsables de la mitad de los casos de neumonía y
enfermedades semejantes a la gripe en niños. Además, ambos virus
pueden transmitirse en gotitas en aerosoles, con lo que contribuyen
a la diseminación de infecciones nosocomiales.
Durante más de 30 años se ha intentado aliviar
el impacto del RSV y del PIV en la salud humana y en la economía
mundial, con escaso éxito. Por ejemplo, el desarrollo de vacunas
para el RSV se vio obstaculizado en fecha temprana por los
decepcionantes resultados de una vacuna con virus RSV completos
inactivados con formol. En este incidente los individuos
inmunizados con virus completos inactivados con formol contrajeron
una enfermedad más grave tras la inmunización. Véase Kim et
al., Am. J. Epidemiol. 89: 422-434 (1969). Los
intentos anteriores para preparar vacunas eficaces con virus PIV y
RSV inactivados con formaldehído no habían proporcionado la
protección adecuada contra la infección. Véase Chin, J., et
al., Am. J. Epidemiol. 89: 449-463 (1969).
En la actualidad se han evaluado en ensayos
clínicos dos candidatos de vacunas con microorganismos vivos
atenuados: un derivado (cp45) del virus PIV3 (cepa JS) obtenido
mediante propagación por pases en frío, y un virus paragripal
bovino de tipo 3. Véase Jones, T., Current Opinion in
Investigational Drugs, 2(7): 890-892 (2001).
Como resultado, el cp45 se considera una vacuna prometedora contra
el PIV3.
Otro aspecto importante de la investigación
sobre el RSV y el PIV se refiere a la prevención de las
complicaciones de la enfermedad en personas ancianas o en las que
ya presentan trastornos de la salud tales como neumonía e
infecciones de las vías respiratorias inferiores. En este sentido se
han realizado intentos para desarrollar antígenos basados en
vectores y en proteínas purificadas para su administración a las
poblaciones de pacientes afectados. Véase Crowe, J. E., et
al. Virus Genes 13(3): 26-273 (1996).
Se ha probado la capacidad de diversos vectores
para incorporar y expresar genes heterólogos de virus de la familia
Paramyxoviridae. Dichos virus incluyen, por ejemplo, el virus
vacunal de tipo salvaje o una forma atenuada del virus vacunal
modificado de Ankara (MVA) (Durbin et al., Vaccine 16:
1234-1330 (1998); Elango, N., et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83: 1906-1910 (1986)), vector
de adenovirus humano capaz de replicación (Mittal S. K., et
al., Intervirology 41(6): 253-260 (1998)
), virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Kahn S. J., J. Virol
75(22): 11079-87 (2001)), virus del bosque de
Semliki (SFV) ((Peroulis, l., et al., Archives of Virology,
144: 107-116 (1999), el propio virus PIV3 humano
como posible vector que porta genoma del virus PIV1/2 o del virus
del sarampión (Skiadopoulos M. H., et al. Virology
29(1): 136-152 (2002)), y el PIV3 bovino que
porta genoma del PIV3 humano (Haller A. A., et al., J.
Virology 74(24): 11626-35 (2000)). Los
estudios preclínicos con todos los vectores mencionados
anteriormente han demostrado niveles prometedores de eficacia
protectora contra los correspondientes patógenos.
A pesar de la prevalencia y la gravedad de la
enfermedad causada por el RSV y el PIV, y de los numerosos intentos
anteriores de producir una vacuna, no existe en la actualidad
ninguna composición inmunógena para prevenir dichas infecciones.
Por consiguiente, hay una necesidad de obtener composiciones
inmunógenas y procedimientos para inducir inmunidad protectora
contra el RSV, el PIV y otros paramixovirus.
La presente invención se refiere a composiciones
inmunógenas para la inmunización de mamíferos contra paramixovirus
tales como RSV y PIV. Más en particular, la presente invención se
refiere a composiciones inmunógenas que comprenden una población de
partículas con replicón del virus (VRP) de la encefalitis equina
venezolana que comprenden genes de la replicasa del virus de la
encefalitis equina venezolana, proteínas de la replicasa del virus
de la encefalitis equina venezolana, glucoproteína E1 del virus de
la encefalitis equina venezolana, glucoproteína E2 del virus de la
encefalitis equina venezolana, gen de la glucoproteína F del virus
paragripal de tipo 3, y gen de la glucoproteína HN del virus
paragripal de tipo 3. En determinadas formas de realización, las
partículas con replicón del virus de la encefalitis equina
venezolana provocan efectos citopáticos cuando se utilizan para
infectar monocapas de células BHK cultivadas. En otra realización,
los sobrenadantes de células infectadas con las partículas con
replicón provocan, cuando se transfieren a monocapas de células no
infectadas, efectos citopáticos en ausencia de las partículas con
replicón. En formas de realización particulares, el efecto
citopático en células BHK cultivadas es la formación de sincicios,
la alteración de las monocapas o la apoptosis. En otra forma de
realización, la población de partículas con replicón del virus (VRP)
de la encefalitis equina venezolana no contiene virus de la
encefalitis equina venezolana detectables capaces de replicarse. En
una forma de realización, las partículas con replicón del virus de
la encefalitis equina venezolana generan una respuesta inmunitaria
protectora en un hospedador mamífero. En cierta realización, la
respuesta inmunitaria protectora previene la infección de las vías
respiratorias inferiores por el virus paragripal de tipo 3 en un
hospedador mamífero. En otra forma de realización, la respuesta
inmunitaria protectora reduce la gravedad de la infección de las
vías respiratorias superiores por el virus paragripal de tipo 3 en
un hospedador mamífero. En una realización particular, la
composición inmunógena comprende, además, un portador y/o un
adyuvante farmacéuticamente aceptables.
En una realización, la presente invención
proporciona una composición inmunógena que comprende una población
de partículas con replicón del virus (VRP) de la encefalitis equina
venezolana que comprenden genes de la replicasa del virus de la
encefalitis equina venezolana, proteínas de la replicasa del virus
de la encefalitis equina venezolana, glucoproteína E1 del virus de
la encefalitis equina venezolana, glucoproteína E2 del virus de la
encefalitis equina venezolana, y por lo menos un gen de
glucoproteína de paramixovirus. En cierta realización, el
paramixovirus se selecciona de entre el grupo constituido por virus
paragripal de tipo 1, virus paragripal de tipo 2, virus paragripal
de tipo 3, virus paragripal de tipo 4 y virus respiratorio
sincicial. En otra realización, la glucoproteína del paramixovirus
se selecciona de entre el grupo constituido por la glucoproteína HN
del virus paragripal de tipo 1, la glucoproteína F del virus
paragripal de tipo 1, la glucoproteína HN del virus paragripal de
tipo 2, la glucoproteína F del virus paragripal de tipo 2, la
glucoproteína HN del virus paragripal de tipo 3, la glucoproteína F
del virus paragripal de tipo 3, la glucoproteína HN del virus
paragripal de tipo 4, la glucoproteína F del virus paragripal de
tipo 4. En otra realización adicional, ambas glucoproteínas HN y F
de un virus paragripal particular se combinan y se seleccionan de
entre el grupo constituido por el gen de la glucoproteína F del
virus paragripal de tipo 1 y el gen de la glucoproteína HN del virus
paragripal de tipo 1 HN; el gen de la glucoproteína F del virus
paragripal de tipo 2 y el gen de la glucoproteína HN del virus
paragripal de tipo 2; el gen de la glucoproteína F del virus
paragripal de tipo 3 y el gen de la glucoproteína HN del virus
paragripal de tipo 3; y el gen de la glucoproteína F del virus
paragripal de tipo 4 y el gen de la glucoproteína HN del virus
paragripal de tipo 4. En una realización alternativa, el
paramixovirus es el virus respiratorio sincicial y la glucoproteína
es la glucoproteína de adhesión (G) del virus respiratorio
sincicial y/o la glucoproteína de fusión (F) del virus respiratorio
sincicial. En una realización de la presente invención las
partículas con replicón del virus de la encefalitis equina
venezolana provocan efectos citopáticos cuando se utilizan para
infectar monocapas de células BHK cultivadas. En otra realización,
los sobrenadantes de células infectadas con las partículas con
replicón provocan, cuando se transfieren a monocapas de células no
infectadas, los efectos citopáticos en ausencia de las partículas
con replicón. En una realización particular de la presente
invención, el efecto citopático se selecciona de entre el grupo
constituido por formación de sincicios, alteración de las monocapas
y apoptosis.
En una forma de realización, la presente
invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico
recombinante que codifica una replicasa del virus de la encefalitis
equina venezolana, una glucoproteína F del virus paragripal de tipo
3, y una glucoproteína HN del virus paragripal de tipo 3. En otra
realización, la presente invención proporciona una molécula aislada
de ácido nucleico recombinante que codifica una replicasa del virus
de la encefalitis equina venezolana, una glucoproteína F del virus
paragripal de tipo 3, y una glucoproteína HN del virus paragripal
de tipo 3 que tiene la secuencia de ácido nucleico presentada en la
SEC. ID nº 4. En una realización alternativa, la replicasa del
virus de la encefalitis equina venezolana, la glucoproteína F del
virus paragripal de tipo 3, y la glucoproteína HN del virus
paragripal de tipo 3 están codificadas por el ácido nucleico
presentado en la SEC. ID nº 1. En una realización particular, la
replicasa del virus de la encefalitis equina venezolana, la
glucoproteína F del virus paragripal de tipo 3, y la glucoproteína
HN del virus paragripal de tipo 3 comprenden las secuencias de
aminoácidos presentadas en la SEC. ID nº 2; la SEC. ID nº 3 y la
SEC. ID nº 4. En otra realización, la composición inmunógena
comprende, además, un portador y/o un adyuvante aceptables desde el
punto de vista farmacéutico.
En una forma de realización, la presente
invención proporciona una composición inmunógena que comprende una
población de partículas con replicón del virus (VRP) de la
encefalitis equina venezolana que comprenden genes de la replicasa
del virus de la encefalitis equina venezolana, proteínas de la
replicasa del virus de la encefalitis equina venezolana,
glucoproteína E1 del virus de la encefalitis equina venezolana,
glucoproteína E2 del virus de la encefalitis equina venezolana, y
por lo menos un gen de glucoproteína de paramixovirus; en la que
dicha población no contiene virus de la encefalitis equina
venezolana detectables capaces de replicarse; y en la que los
sobrenadantes de células infectadas con dichas partículas con
replicones provocan, cuando se transfieren a monocapas de células
no infectadas, efectos citopáticos en ausencia de las partículas con
replicón; para su utilización en la inmunización de un mamífero
contra la infección de las vías respiratorias causada por un
paramixovirus.
En una realización se incluye la inmunización de
un mamífero contra la infección de las vías respiratorias causada
por un paramixovirus, en la que dicho procedimiento comprende
administrar a dicho individuo una cantidad eficaz desde el punto de
vista inmunológico de: (a) una composición inmunógena que comprende
una población de partículas con replicón del virus (VRP) de la
encefalitis equina venezolana que comprenden genes de la replicasa
del virus de la encefalitis equina venezolana, proteínas de la
replicasa del virus de la encefalitis equina venezolana,
glucoproteína E1 del virus de la encefalitis equina venezolana,
glucoproteína E2 del virus de la encefalitis equina venezolana, y
por lo menos un gen de glucoproteína de paramixovirus; y (b) un
portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico, en una
cantidad suficiente para generar la respuesta inmunitaria. En una
realización específica, el paramixovirus es el virus paragripal de
tipo 3, y la glucoproteína es la glucoproteína de la
hemaglutinina-neuraminidasa (HN) del virus
paragripal de tipo 3 o la glucoproteína de fusión (F) del virus
paragripal de tipo 3. En otra realización, la glucoproteína incluye
tanto a la glucoproteína F como a las glucoproteínas HN del virus
paragripal de tipo 3. En otra realización adicional, los
sobrenadantes de células infectadas con las partículas con replicón
provocan, cuando se transfieren a monocapas de células no
infectadas, efectos citopáticos en ausencia de las partículas con
replicón. En una realización particular, el efecto citopático en
células BHK cultivadas es la formación de sincicios, la alteración
de las monocapas o la apoptosis. En una realización particular, la
población de partículas con replicón del virus (VRP) de la
encefalitis equina venezolana no contiene virus de la encefalitis
equina venezolana detectables capaces de replicarse. En otra
realización, el paramixovirus es el virus respiratorio sincicial y
la glucoproteína es la glucoproteína de adhesión (G) del virus
respiratorio sincicial o la glucoproteína de fusión (F) del virus
respiratorio sincicial. En una realización alternativa, la
glucoproteína incluye tanto a la glucoproteína G como a la
glucoproteína F del virus respiratorio sincicial. En cierta
realización, la infección está localizada en las vías respiratorias
inferiores; mientras que en otra realización la infección está
localizada en las vías respiratorias superiores.
La presente invención también proporciona
composiciones inmunógenas que comprenden una población de vesículas
autopropagantes que comprenden genes de la replicasa del virus de la
encefalitis equina venezolana, proteínas de la replicasa del virus
de la encefalitis equina venezolana, gen de la glucoproteína F del
virus paragripal de tipo 3, glucoproteína F del virus paragripal de
tipo 3, gen de la glucoproteína HN del virus paragripal de tipo 3 y
glucoproteína HN del virus paragripal de tipo 3. En una realización
particular las vesículas son fusogénicas. En otra realización, las
vesículas autopropagantes se obtienen a partir del sobrenadante de
células infectadas con una población de partículas con replicón
(VRP) del virus de la encefalitis equina venezolana, en la que las
partículas con replicón comprenden los genes de la replicasa del
virus de la encefalitis equina venezolana, proteínas de la
replicasa del virus de la encefalitis equina venezolana,
glucoproteína E1 del virus de la encefalitis equina venezolana,
glucoproteína E2 del virus de la encefalitis equina venezolana, un
gen de la glucoproteína F del virus paragripal y un gen de la
glucoproteína HN del virus paragripal. En otra realización, las
vesículas autopropagantes provocan efectos citopáticos cuando se
utilizan para infectar monocapas de células BHK cultivadas. Más
particularmente, los sobrenadantes de células infectadas con las
vesículas autopropagantes provocan, cuando se transfieren a
monocapas de células no infectadas, efectos citopáticos en ausencia
de las partículas con replicón. En una forma de realización
particular de la presente invención, las vesículas provocan uno o
más de los siguientes efectos citopáticos en células BHK cultivadas:
formación de sincicios, alteración de las monocapas y apoptosis. En
otra realización, la población de vesículas no contiene virus de la
encefalitis equina venezolana detectables capaces de replicarse. En
cierta realización, las vesículas autopropagantes generan una
respuesta inmunitaria protectora en un hospedador mamífero. En otra
realización, la respuesta inmunitaria protectora previene la
infección o reduce la gravedad de la infección en las vías
respiratorias superiores provocada por el virus paragripal de tipo 3
en un hospedador mamífero.
Algunas formas de realización de la presente
invención comprenden la inmunización de un mamífero contra la
infección causada por un paramixovirus. Por ejemplo, esta estrategia
puede comprender administrar a un individuo una cantidad eficaz
desde el punto de vista inmunológico de una composición inmunógena
que comprende una población de vesículas autopropagantes que
comprenden: (a) genes de la replicasa del virus de la encefalitis
equina venezolana, proteínas de la replicasa del virus de la
encefalitis equina venezolana, por lo menos un gen de glucoproteína
de paramixovirus y por lo menos una glucoproteína de paramixovirus,
(b) un portador aceptable desde el punto vista farmacéutico; y la
composición inmunógena se administra en una cantidad suficiente para
generar la respuesta inmunitaria. En cierta realización, las
vesículas autopropagantes se obtienen a partir del sobrenadante de
células infectadas con una población de partículas con replicón del
virus (VRP) de la encefalitis equina venezolana, en la que las
partículas con replicón comprenden genes de la replicasa del virus
de la encefalitis equina venezolana, proteínas de la replicasa del
virus de la encefalitis equina venezolana, glucoproteína E1 del
virus de la encefalitis equina venezolana, glucoproteína E2 del
virus de la encefalitis equina venezolana, y por lo menos un gen de
glucoproteína de paramixovirus. En cierta formas de realización, el
paramixovirus se selecciona de entre el grupo constituido por virus
paragripal de tipo 1, virus paragripal de tipo 2, virus paragripal
de tipo 3, virus paragripal de tipo 4 y virus respiratorio
sincicial. En otra realización, la glucoproteína de paramixovirus
se selecciona de entre el grupo constituido por HN del virus
paragripal de tipo 1, F del virus paragripal de tipo 1, HN del virus
paragripal de tipo 2, F del virus paragripal de tipo 2, HN del
virus paragripal de tipo 3, F del virus paragripal de tipo 3, HN del
virus paragripal de tipo 4, F del virus paragripal de tipo 4. En
una realización específica, tanto las glucoproteínas HN como F de
un virus paragripal particular se combinan y se seleccionan de entre
el grupo constituido por gen de la glucoproteína F del virus
paragripal de tipo 1 y gen de la glucoproteína HN del virus
paragripal de tipo 1; gen de la glucoproteína F del virus
paragripal de tipo 2 y gen de la glucoproteína HN del virus
paragripal de tipo 2; gen de la glucoproteína F del virus
paragripal de tipo 3 y gen de la glucoproteína HN del virus
paragripal de tipo 3; y gen de la glucoproteína F del virus
paragripal de tipo 4 y gen de la glucoproteína HN del virus
paragripal de tipo 4. En otra realización, el paramixovirus es el
virus respiratorio sincicial y la glucoproteína es la glucoproteína
de adhesión (G) del virus respiratorio sincicial, y/o la
glucoproteína de fusión (F) del virus respiratorio sincicial. En
otra realización, las vesículas son fusogénicas. En otra
realización de la presente invención las vesículas provocan efectos
citopáticos cuando se utilizan para infectar monocapas de células
BHK cultivadas. En otra realización, los sobrenadantes de células
infectadas con las vesículas provocan, cuando se transfieren a
monocapas de células no infectadas, efectos citopáticos en ausencia
de las partículas con replicón. En una realización particular de la
presente invención, el efecto citopático se selecciona de entre el
grupo constituido por formación de sincicios, alteración de las
monocapas y apoptosis.
En una realización alternativa, la composición
inmunógena que comprende las vesículas fusogénicas autopropagantes
comprende, además, un portador aceptable desde el punto de vista
farmacéutico. En otra realización, la composición inmunógena
comprende vesículas fusogénicas autopropagantes que comprenden,
además, un adyuvante.
En otro aspecto, la presente invención implica
la inmunización de un mamífero contra la infección de las vías
respiratorias causada por un paramixovirus, que comprende
administrar a dicho individuo una cantidad eficaz desde el punto de
vista inmunológico de: (a) una composición inmunógena que comprende
una población de vesículas autopropagantes que comprenden genes de
la replicasa del virus de la encefalitis equina venezolana,
proteínas de la replicasa del virus de la encefalitis equina
venezolana, un gen de la glucoproteína F del virus paragripal, una
glucoproteína F del virus paragripal, un gen de la glucoproteína HN
del virus paragripal y una glucoproteína HN del virus paragripal;
(b) un portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico; y en
una cantidad suficiente para generar la respuesta inmunitaria. En
una realización, las vesículas autopropagantes se obtienen a partir
del sobrenadante de células infectadas con una población de
partículas con replicón (VRP) del virus de la encefalitis equina
venezolana, en la que dichas partículas con replicón comprenden
genes de la replicasa del virus de la encefalitis equina
venezolana, proteínas de la replicasa del virus de la encefalitis
equina venezolana, glucoproteína E1 del virus de la encefalitis
equina venezolana, glucoproteína E2 del virus de la encefalitis
equina venezolana, un gen de la glucoproteína F del virus
paragripal, un gen de la glucoproteína HN del virus paragripal. En
cierta realización, la población no contiene virus de la encefalitis
equina venezolana detectables capaces de replicarse, y los
sobrenadantes de células infectadas con las vesículas
autopropagantes provocan, cuando se transfieren a monocapas de
células no infectadas, efectos citopáticos en ausencia de las
partículas con replicón. En otra realización, el virus paragripal se
selecciona de entre el grupo constituido por virus paragripal de
tipo 1, virus paragripal de tipo 2, virus paragripal de tipo 3, y
virus paragripal de tipo 4. En otra realización, la glucoproteína
HN es la glucoproteína de la
hemaglutinina-neuraminidasa (HN) del virus
paragripal de tipo 3, y la glucoproteína F es la glucoproteínas de
fusión (F) del virus paragripal de tipo 3. En una realización
particular, la glucoproteína incluye tanto la glucoproteína F como
las glucoproteínas NH del virus paragripal de tipo 3.
En una realización, la presente invención
comprende la inmunización de un mamífero contra la infección causada
por el virus paragripal de tipo 3, que comprende administrar a
dicho individuo una cantidad, eficaz desde el punto de vista
inmunológico, de: (a) una composición inmunógena que comprende una
población de vesículas autopropagantes que comprenden genes de la
replicasa del virus de la encefalitis equina venezolana, proteínas
de la replicasa del virus de la encefalitis equina venezolana, gen
de la glucoproteína F del virus paragripal de tipo 3, glucoproteína
F del virus paragripal de tipo 3, gen de la glucoproteína HN del
virus paragripal de tipo 3, y glucoproteína HN del virus paragripal
de tipo 3; (b) un portador aceptable desde el punto de vista
farmacéutico; y en una cantidad suficiente para generar la respuesta
inmunitaria. En otra realización, las proteínas de la replicasa del
virus de la encefalitis equina venezolana, la glucoproteína F del
virus paragripal de tipo 3, y la glucoproteína HN del virus
paragripal de tipo 3 tienen las secuencias de aminoácidos
presentadas en la SEC. ID nº 2, la SEC. ID nº 3 y la SEC. ID nº 4.
En una realización particular, las vesículas autopropagantes se
obtienen a partir del sobrenadante de células infectadas con una
población de partículas con replicón (VRP) del virus de la
encefalitis equina venezolana, en la que dichas partículas con
replicón comprenden los genes de la replicasa del virus de la
encefalitis equina venezolana, proteínas de la replicasa del virus
de la encefalitis equina venezolana, glucoproteína E1 del virus de
la encefalitis equina venezolana, glucoproteína E2 del virus de la
encefalitis equina venezolana, gen de la glucoproteína F del virus
paragripal de tipo 3, gen de la glucoproteína HN del virus
paragripal de tipo 3; en una cantidad suficiente para generar la
respuesta inmunitaria. En otra realización, la población no contiene
virus de la encefalitis equina venezolana detectables capaces de
replicarse. En una realización particular, los sobrenadantes de
células infectadas con las vesículas autopropagantes, cuando se
transfieren a monocapas de células no infectadas, provocan dichos
efectos citopáticos en ausencia de las partículas con replicón.
La Figura 1 representa el plásmido con el
replicón VRP-F/HN que muestra el gen de la replicasa
del VEE, el gen de F del PIV3, y el gen de HN del PIV3.
Los alfavirus han sido modificados por
ingeniería genética para formar sistemas de suministro de genes en
mamíferos y en células de insectos para utilizaciones in vivo
y ex vivo. Los genomas de los alfavirus constan de un ARN
monocatenario de sentido positivo que está dividido en dos regiones:
el gen de la proteína no estructural (NSP) en 5', seguido por un
promotor subgenómico que regula la transcripción de los genes
estructurales. El gen NSP se traduce inmediatamente después de la
liberación del núcleo vírico en el citoplasma. El complejo NSP
funciona como replicasa para sintetizar antigenomas y genomas de
longitud completa, y como transcriptasa que sintetiza transcritos
subgenómicos que codifican los genes estructurales. Los ejemplos de
alfavirus incluyen el virus de la encefalitis equina venezolana
(VEE), el virus Sindbis, y el virus del bosque de Semliki.
La replicación de los alfavirus es independiente
de los genes estructurales; por consiguiente, dichos genes pueden
eliminarse y puede colocarse en su lugar un gen foráneo. La
introducción de dicha molécula de ARN recombinante en las células
da lugar a una ronda de replicación y expresión del producto génico
foráneo. En este sentido, dichos genomas se denominan vectores o
"replicones" "suicidas". Las dos ventajas principales del
suministro de genes foráneos con vectores de alfavirus son: 1) se
obtiene un alto nivel de expresión, y 2) apoptosis (o muerte
celular programada) de la célula infectada, que da lugar a señales
de "peligro" que alertan al sistema inmunitario y generan
respuestas inmunitarias robustas.
Un vector con replicón puede utilizarse en forma
de ARN desnudo, incorporarse en forma de ADNc en vehículos de
suministro plasmídicos basados en el promotor pol II eucariótico, o,
como alternativa, empaquetarse en partículas con replicón
infecciosas semejantes a virus. El suministro eficaz del vector con
replicón da lugar a una expresión robusta del gen foráneo y a la
muerte celular programada. En todos los casos, el vector experimenta
una sola ronda de replicación y, a diferencia de los virus vivos,
no se transmite de célula a célula.
El sistema del replicón se describe en detalle
en las siguientes patentes US: patente US n.º 5.185.440 titulada
"Clon de ADNc que codifica el virus de la encefalitis equina
venezolana y mutaciones atenuantes del mismo", concedida a N. L.
Davis et al.; patente US n.º 5.505.947 titulada "Mutaciones
atenuantes en el virus de la encefalitis equina venezolana",
concedida a R. E. Johnston et al.; patente US n.º 6.156.558
titulada "Sistemas de replicón de ARN de alfavirus", concedida
a R. E. Johnston et al.; y patente US n.º 6.531.135 titulada
"Sistemas de replicón de ARN de alfavirus", concedida a R. E.
Johnston et al.
La presente invención describe un nuevo
procedimiento para el suministro de vectores de expresión con
replicón. Un vector con replicón del virus de la encefalitis equina
venezolana (VEE) se modificó por ingeniería genética para expresar
de forma simultánea las proteínas de la hemaglutinina (HN) y de
fusión (F) de un paramixovirus, el virus paragripal de tipo 3
(PIV3). Durante la caracterización de las partículas con replicón
(VRP) del VEE, se observó que, en contraposición con lo que se
conoce sobre replicones, este sistema producía partículas
infecciosas tras la infección con el replicón de VRPF/HN en cultivo
de tejidos. Dichas partículas infecciosas: 1) expresaban HN y F del
PIV3, y el complejo NSP del VEE, 2) eran capaces de autopropagarse,
3) contenían las proteínas HN y F en su superficie, 4) eran
estables después de ciclos repetidos de
congelación-descongelación, 5) eran de tamaño
heterogéneo y parte de ellas se filtraban a través de filtros de 0,2
micrómetros, 6) eran muy inmunógenas y 7) podían utilizarse como
composición inmunógena eficaz contra la infección por el PIV3 en un
modelo de hámster sirio. La invención se describe a continuación con
detalle.
En el curso de los presentes estudios, los genes
HN y F del PIV3 se clonaron en un vector con replicón. El vector
resultante (VRP-F/HN) eran muy inmunógeno y protegía
a hámsteres contra la infección por PIV3 a dosis tan bajas como
1x10^{4} unidades infecciosas (UI), por vía intranasal o
intramuscular. La coexpresión de HN y F durante el empaquetamiento
de VRP da lugar a la formación de grandes sincicios, por lo que se
observó que los títulos de este VRP particular nunca alcanzaban más
de 1x10^{5} VRP por reacción de empaquetamiento, un título
10^{4-5} veces menor que el de otros vectores
VRP.
Pudo lograrse la producción de vesículas
infecciosas o "autopropagantes" infectando células con
VRP-F/HN, o, como alternativa, transfectando
células sólo con el ARN del vector con replicón
VEE-F/HN. Las "vesículas infecciosas" o
"vesículas autopropagantes" se refieren a vesículas fusogénicas
de la membrana externa o a partículas fusogénicas que portan los
genes HN y F del PIV3 o alguna otra proteína o proteínas de fusión
víricas en la superficie, y que son capaces de autopropagarse. Los
términos "vesículas infecciosas", "vesículas
autopropagantes", vesículas, y "partículas fusogénicas" se
utilizarán ocasionalmente de modo intercambiable. Las vesículas,
cuando se administraban en forma de composición inmunógena, eran
capaces de proteger las vías respiratorias superiores e inferiores
de hámsteres sirios contra la infección por el PIV3 a dosis tan
bajas como 10^{4} unidades formadoras de sincicios (UFS). Estos
estudios preclínicos demostraron que las partículas infecciosas
podrían utilizarse como composiciones inmunógenas para el PIV3.
La presente invención presenta varias
utilizaciones inmediatas. En primer lugar, la utilización de
partículas con replicón del VEE para expresar de forma simultánea
los genes HN y F del PIV3. En segundo lugar, la utilización de
partículas con replicón del VEE para generar vesículas
autopropagantes que tienen proteínas/glucoproteínas del PIV u
proteínas/glucoproteínas fusogénicas en la superficie. En tercer
lugar, la utilización de vesículas autopropagantes fusogénicas como
inmunógenos.
En una realización de la presente invención, se
comprobó que la coexpresión de los genes HN y F era más eficaz que
la expresión de cualquiera de los genes por separado, o en
combinación [HN + F] tras la expresión individual, para generar
inmunidad contra el PIV3 en un modelo de hámster sirio. Sin ceñirnos
a la teoría, la inmunogenicidad de este vector puede estar
relacionada con un mayor nivel de presentación y/o una mayor
semivida del complejo F/HN. Como alternativa, las partículas o
vesículas fusogénicas liberadas de las células infectadas pueden
aumentar la longevidad de la expresión y/o el número de células que
se infectan.
En otra realización de la presente invención,
las partículas o vesículas fusogénicas que contienen las proteínas
HN y F en su superficie constituían también composiciones
inmunógenas eficaces contra la infección por el PIV3 en el modelo
de hámster sirio. Se producen aproximadamente 10-100
vesículas por cada célula infectada in vitro, por lo que
dicho sistema es adecuado para la producción a gran escala. Las
vesículas eran estables después de varios ciclos de
congelación-descongelación. Las vesículas
autopropagantes pueden generarse infectando células con
VRP-F/HN o con vesículas, o, como alternativa,
mediante electroporación del replicón del VEE-ARN de
F/HN.
Una realización particular de la presente
invención constituye la inclusión de uno o más genes adicionales
que podrían conferir protección contra un patógeno heterólogo. El
hecho de que las partículas fusogénicas sean autopropagantes ofrece
una ventaja sobre las composiciones inmunógenas generadas in
vitro. Por ejemplo, también pueden utilizarse otras proteínas
fusogénicas procedentes de otros virus (virus del sarampión, SV5, o
HIV) en lugar de HN y F del PIV3, aumentando de este modo el
repertorio de composiciones inmunógenas.
Los replicones procedentes del virus de la
encefalitis equina venezolana (VEEV) representan un sistema
alternativo de vector para el diseño de composiciones inmunógenas.
Se ha demostrado que los replicones del VEE son capaces de infectar
diversos tipos de células de animales. Los replicones del VEE se han
utilizado para el suministro de antígenos de origen vírico y
bacteriano [Davis N. L., et al., J. Virology
70(6):3781-3787 (1996); Lee J. S., et
al., J. Infect. Dis., 185(8): 1192-6
(2002)], y generan con éxito potentes respuestas de inmunidad tanto
humoral como celular dirigiéndose a las células dendríticas
[MacDonald G. H., et al. J. Virology, 74(2):
914-922 (2000)].
Los replicones del VEE aprovechan ciertas
propiedades de la cepa progenitora del virus de la encefalitis
equina venezolana. El virus de la encefalitis equina venezolana
(VEE) es un miembro del género alfavirus de la familia
Togaviridae. El genoma vírico es un ARN monocatenario de
sentido positivo, modificado en el extremo 5' con una caperuza
metilada, y en el extremo 3' con un fragmento de poli-(A) de
longitud variable. Las subunidades estructurales contienen una sola
proteína (c) de la cápside asociada al genoma de ARN en una
nucleocápside icosaédrica. En el virión la cápside está rodeada de
una envoltura lipídica cubierta por un entramado regular de
proyecciones de proteínas transmembranarias, cada una de las cuales
está constituida por un complejo heterodimérico de dos
glucoproteínas, E1 y E2. Véase Pedersen, C. E. y Eddy, G. A., J.
Mol. Biol. 168: 1-15 (1974). La organización del
genoma del VEE y la estrategia general de expresión de genes del VEE
es semejante a la de los alfavirus prototípicos: el virus Sindbis y
el virus del bosque de Semliki. (Para una revisión, véase
Schlesinger, S. y Schlesinger, M. J., The Togaviridae and
Flaviviridae. Plenum Publishing Corp., New York (1986). Por ejemplo,
los detalles de la secuencia parcial del genoma de la cepa del asno
de Trinidad del VEE muestran que las proteínas estructurales del
VEE se traducen en forma de una poliproteína a partir de un ARNm
subgenómico de 26S que corresponde al tercio de 3' del genoma
vírico. Véase Kinney et al., Virology 152: 400 (1986). El
procesamiento proteolítico produce las proteínas presentes en el
virión maduro. Los genes de las proteínas no estructurales del
alfavirus están localizados en los dos tercios de 5' del genoma en
el orden NSP1, NSP2, NSP3 y NSP4. Las proteínas se expresan
inicialmente en forma de precursores poliproteicos, y después se
procesan por proteólisis hasta dar lugar a sus formas maduras. Las
proteínas no estructurales maduras son necesarias para la
replicación del genoma de ARN y la síntesis de la subunidad de ARNm
genómico
de 26S.
de 26S.
El genoma del VEE está constituido por una sola
molécula de ARN monocatenario de sentido positivo. Tiene una
longitud de aproximadamente 11 kb, con una estructura de caperuza en
5' y una cola de poli-A en 3'. La replicación
avanza a través de un intermediario de la cadena negativa de ARN,
que se utiliza como molde para la síntesis de genomas víricos
adicionales y para la transcripción de un ARNm subgenómico. Cuando
se utiliza como vector para el suministro de genes, el tercio de 3'
del genoma que codifica las proteínas estructurales víricas que no
son necesarias para la replicación del ARN vírico se elimina y se
sustituye con el gen o genes que codifican el antígeno o antígenos
de interés. El empaquetamiento de dichos replicones se logra
mediante la cotransfección de ARN auxiliares defectuosos que
codifican las proteínas estructurales del VEE. Las partículas con
replicón resultantes incorporan el gen o genes que codifican el
antígeno o antígenos de interés, pero que ya no son capaces de
generar partículas víricas infecciosas. Sin embargo, los replicones
pueden dirigir la expresión de grandes cantidades del producto
génico heterólogo, por lo que sirven como instrumento eficaz para el
suministro de antígenos.
Con el fin de evaluar si los replicones del VEE
pueden utilizarse como vectores en el diseño de composiciones
inmunógenas para los virus de la familia Paramyxoviridae, se
seleccionó el virus PIV3 debido a que se utiliza ampliamente como
virus experimental para la investigación de composiciones
inmunógenas para paramixovirus. El desarrollo de vacunas con
subunidades de PIV y RSV se ha visto obstaculizado debido a que no
se conoce completamente la antigenicidad y la inmunogenicidad de
las proteínas víricas individuales. Por ejemplo, el genoma del PIV3
contiene seis marcos abiertos de lectura (ORF), que codifican las
siguientes proteínas internas no estructurales: nucleocápside (NP),
matriz (M), fosfoproteína (P), la proteína grande de la polimerasa
(L) y dos glucoproteínas de la superficie: la
hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y la proteína de
fusión (F). Los ORF también codifican otras dos proteínas, C y V,
debido a la edición del ARN y a la iniciación alternativa de la
traducción, respectivamente. Es posible que se exprese una tercera
proteína, D, pero su función no se ha determinado en la actualidad.
Hasta el momento, existe muy poca información sobre el papel
desempeñado por dichas proteínas internas en la protección contra
la infección por el PIV3. Se ha demostrado que la nucleoproteína
(NP) del PIV1, que comparte una homología de aproximadamente 85% con
la NP del PIV3, codifica un péptido dominante que se une al
complejo MHC de la clase I y provoca respuestas muy potentes
limitadas al complejo MHC de la clase l, y puede proteger a ratones
contra la infección por PIV1. Asimismo, HN y F son dos importantes
antígenos neutralizantes que contienen por lo menos seis sitios
neutralizantes para la proteína HN y ocho sitios para la proteína
F.
La HN es una glucoproteína de tipo II que poseen
actividades internas de hemaglutinación y de neuraminidasa. La HN
participa en la unión del virus a las células y fomenta el proceso
de fusión. Elimina el ácido siálico para liberar las partículas del
virus y prevenir la agregación. La proteína F es una glucoproteína
de tipo I que es importante para la penetración del virus y la
formación de sincicios. La escisión proteolítica de Fo da lugar a
dos subunidades unidas por enlaces disulfuro, F1 y F2, y es
necesaria para la actividad de fusión. La coexistencia de HN y F en
la superficie del virus parece tener importantes consecuencias
biológicas, dado que la actividad de fusión in vitro de F
requiere la presencia de la proteína HN. Los estudios preclínicos
con composiciones inmunógenas que contiene subunidades del PIV3 han
proporcionado datos sobre la importancia de la utilización de HN y
F como antígenos preventivos.
En general, el diseño de composiciones
inmunógenas contra paramixovirus tales como los virus paragripales
(PIV) y el virus respiratorio sincicial (RSV) está dirigida a la
prevención de la infección de las vías respiratorias inferiores
(LRT). Por ejemplo, las proteínas HN del PIV3, purificadas o
expresadas con vectores, con complemento de adyuvantes,
proporcionan protección contra la infección de las LRT en modelos
con animales, mientras que la proteína F purificada o expresada con
vectores proporcionaba una protección parcial o nula. Las
estrategias que utilizaban una combinación de HN y F recombinantes
o la proteína quimérica F/HN demostraron protección contra la
infección de las LRT. Se iniciaron estudios como se describe en la
presente memoria para construir VRP que expresaban de forma
simultánea las proteínas HN y F. En la presente memoria se describe
una composición inmunógena eficaz basada en el VEE con subunidades
del PIV, con una característica nueva que puede contribuir
posiblemente a su elevada potencia.
Tal como se utiliza en la presente memoria, él
término "vesículas infecciosas", o "vesículas
autopropagantes" o "vesículas" se refiere a vesículas
fusogénicas de la membrana externa que portan los genes HN y F del
PIV3 (o alguna otra proteína o proteínas de fusión víricas) en la
superficie, que son capaces de autopropagación. Los términos
"vesículas infecciosas", "vesículas autopropagantes",
vesículas, y "partículas fusogénicas" se utilizarán
ocasionalmente de modo intercambiable. La autopropagación está
dirigida por proteínas a través de la proteína de fusión en la
superficie la vesícula. Sin embargo, las vesículas también contienen
replicón de ARN, de modo que cuando se fusionan con una nueva
célula, el replicón de ARN se transcribe y la proteína o proteínas
de fusión se expresan en la superficie de la célula, y el proceso
comienza de nuevo. Se demostró que las vesículas autopropagantes de
la presente invención eran eficaces como composiciones inmunógenas
contra el PIV3. Se produjeron aproximadamente
10-100 vesículas autopropagantes por cada célula
infectada in vitro, por lo que el sistema es adecuado para
la producción a gran escala. Las vesículas autopropagantes eran
estables después de varios ciclos de
congelación-descongelación. Las vesículas
autopropagantes se generaron infectando células con
VRP-F/HN o con partículas fusogénicas, o, como
alternativa, mediante electroporación del replicón del
VEE-ARN de F/HN. El hecho de que las vesículas
infecciosas son autopropagantes supone una ventaja respecto a la
subunidades de proteínas generadas in vitro.
El término "alfavirus" tiene el significado
convencional en la técnica, e incluye las diversas especies de los
alfavirus, tales como el virus de la encefalitis equina oriental
(EEE), el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), el virus
de la encefalitis equina occidental (WEE), el virus Sindbis, el
arbovirus sudafricano n.º 86, el virus del bosque de Semliki, y
otros. Para una revisión, véase Field's Virology, 4.ª edición,
capítulo 30: Alphaviruses; págs. 917-962, de
Griffin, D. E., Editorial: Lippincott Williams & Wilkins, New
York (2001). Los transcritos de ARN de alfavirus preferidos para su
utilización en la presente invención incluyen el VEE, el virus
Sindbis y el virus del bosque de Semliki.
Las células permisivas para alfavirus utilizadas
en los procedimientos de la presente invención son células que,
tras la transfección con el transcrito de ARN vírico, son capaces de
producir partículas víricas. Los alfavirus tienen un amplio
espectro de hospedadores. Los ejemplos de células de mamífero
hospedadoras incluyen, sin limitarse a las mismas, células Vero,
células de riñón de cría de hámster (BHK), fibroblastos de embrión
de pollo (CEF) y células del riñón de mono Rhesus
(LLC-MK2).
Las VRP se propagaron en células de la línea
BHK-21. En este caso, las células BHK procedían de
un clon CCL-10 para distinguirlas de otras
poblaciones clonales de células BHK que puede que no compartan las
mismas características fenotípicas. Tal y como se define la
presente memoria, las células pueden denominarse BHK21 o simplemente
células BHK.
El término "proteínas no estructurales", o
"NSP", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a
la función de polimerasa del replicón. Por ejemplo, en el virus de
la encefalitis equina venezolana (VEE), la función de polimerasa la
proporcionan las proteínas NSP1, NSP2, NSP3 y NSP4 traducidas en
forma de un poliproteína única. Los genes de las proteínas no
estructurales son necesarios como parte del replicón de ARN para la
replicación autónoma.
Las expresiones "proteína estructural" o
"proteína estructural de alfavirus", tal como se utilizan la
presente memoria, se refieren a las proteínas codificadas que son
necesarias para la replicación del replicón de ARN, e incluyen la
proteína de la cápside, la glucoproteína E1 y la glucoproteína E2.
Como se describe la presente memoria, las proteínas estructurales
del alfavirus están codificadas en uno o más ARN auxiliares (es
decir, un primer ARN auxiliar y un segundo ARN auxiliar). Además,
una o más proteínas estructurales pueden estar codificadas en la
misma molécula de ARN que incorpora el replicón de ARN, con tal de
que la región que codifica por lo menos una proteína estructural
esté eliminada del replicón de ARN, de modo que el replicón y la
partícula de alfavirus resultantes sean incapaces de replicación.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos
"eliminado" o "eliminación" significan bien la eliminación
total del segmento de ácido nucleico especificado o la eliminación
de una porción suficiente del segmento especificado que haga que el
segmento sea inoperante o no funcional, conforme a la utilización
estándar. Véase, por ejemplo, la patente US n.º 4.650.764, concedida
a Temin et al. El término "deficiente para la
replicación", tal como se utiliza en la presente memoria,
significa que el replicón de ARN no puede formar nuevas partículas
víricas en la célula hospedadora en ausencia del ARN auxiliar. El
replicón de ARN es deficiente para la replicación debido a que el
replicón de ARN no codifica todas las proteínas estructurales de
alfavirus necesarias para la replicación, ya que por lo menos una
de las proteínas estructurales necesarias está eliminada del
mismo.
La célula auxiliar para la expresión de la
partícula infecciosa de alfavirus, deficiente para la replicación,
comprende un conjunto de ARN, como se ha descrito anteriormente. El
conjunto de ARN incluye un primer ARN auxiliar y un segundo ARN
auxiliar. El primer ARN auxiliar incluye ARN que codifica por lo
menos una proteína estructural de alfavirus pero no codifica todas
las proteínas estructurales del alfavirus. Es decir, el primer ARN
auxiliar no codifica por lo menos una proteína estructural de
alfavirus; dicha por lo menos una proteína estructural de alfavirus
no codificada está eliminada en el primer ARN auxiliar. En una
realización, el primer ARN auxiliar incluye ARN que codifica la
glucoproteína E1 del alfavirus, estando la proteína de la cápside
del alfavirus y la glucoproteína E2 del alfavirus eliminadas del
primer ARN auxiliar. En otra realización, el primer ARN auxiliar
incluye ARN que codifica la glucoproteína E2 del alfavirus, estando
la proteína de la cápside del alfavirus y la glucoproteína E1 del
alfavirus eliminadas del primer ARN auxiliar. En una tercera
realización, el primer ARN auxiliar incluye ARN que codifica la
glucoproteína E1 del alfavirus y la glucoproteína E2 del alfavirus,
estando la proteína de la cápside del alfavirus eliminada del primer
ARN auxiliar.
El segundo ARN auxiliar incluye ARN que codifica
por lo menos una proteína estructural de alfavirus que es distinta
de dicha por lo menos una proteína estructural codificada por el
primer ARN auxiliar. De este modo, el segundo ARN auxiliar codifica
por lo menos una proteína estructural de alfavirus que no está
codificada por dicha por lo menos una proteína estructural
codificada por el primer ARN auxiliar. El segundo ARN auxiliar no
codifica dicha por lo menos una proteína estructural de alfavirus
que está codificada por el primer ARN auxiliar, de modo que los ARN
auxiliares primero y segundo no codifican proteínas estructurales
duplicadas. El segundo ARN auxiliar codifica una proteína
estructural diferente de la codificada por el primer ARN auxiliar.
En la realización en la que el primer ARN auxiliar incluye ARN que
codifica sólo la glucoproteína E1 del alfavirus, el segundo ARN
auxiliar puede incluir ARN que codifica una o ambas de las proteínas
de la cápside del alfavirus y la glucoproteína E2 del alfavirus que
están eliminadas del primer ARN auxiliar. En la realización en la
que el primer ARN auxiliar incluye ARN que codifica sólo la
glucoproteína E2 del alfavirus, el segundo ARN auxiliar puede
incluir ARN que codifica una o ambas de las proteínas de la cápside
del alfavirus y la glucoproteína E1 del alfavirus, que están
eliminadas del primer ARN auxiliar. En la realización en la que el
primer ARN auxiliar incluye ARN que codifica tanto la glucoproteína
E1 del alfavirus como la glucoproteína E2 del alfavirus, el segundo
ARN auxiliar puede incluir ARN que codifica la proteína de la
cápside del alfavirus, que está eliminada del primer ARN
auxiliar.
En una realización, el segmento de
empaquetamiento o "secuencia de inclusión en la cápside" está
eliminado en por lo menos el primer ARN auxiliar. En otra
realización, el segmento de empaquetamiento está eliminado tanto en
el primer ARN auxiliar como en el segundo ARN auxiliar.
En una realización en la que el segmento de
empaquetamiento está eliminado tanto en el primer ARN auxiliar como
en el segundo ARN auxiliar, la célula auxiliar contiene
preferentemente un replicón de ARN además del primer ARN auxiliar y
el segundo ARN auxiliar. El replicón de ARN codifica el segmento de
empaquetamiento y un ARN heterólogo insertado. El ARN heterólogo
insertado puede ser ARN que codifica una proteína de fusión vírica,
o proteínas necesarias para la producción de la actividad de fusión,
o un péptido capaz de participar en la actividad de fusión.
Típicamente, el ARN heterólogo insertado codifica una proteína o un
péptido cuya expresión es deseable para el hospedador, la célula
permisiva para el alfavirus o el participante en la fusión con las
vesículas autopropagantes, e incluye el promotor y las secuencias
reguladoras necesarias para la expresión de dicha proteína o
péptido en la célula. Los ejemplos de ARN heterólogo insertado
incluyen ARN vírico procedente de una amplia gama de virus,
incluidos, sin limitarse a los mismos, virus paragripal de tipo 1,
virus paragripal de tipo 2, virus paragripal de tipo 3, virus
paragripal de tipo 4, virus respiratorio sincicial, virus de la
inmunodeficiencia humana, virus de la estomatitis vesicular, y virus
de la gripe.
Los ejemplos de genes de ARN críticos adecuados
que pueden ser utilizados para proporcionar el ARN heterólogo
insertado incluyen, sin limitarse a los mismos, los genes HN y F del
virus paragripal de tipo 1 a 4, en particular los genes HN y F del
virus paragripal de tipo 3, el gen de la hemaglutinina del virus de
la gripe, el gen de la neuraminidasa del virus de la gripe, el gen
de la glucoproteína de la envoltura de lentivirus, el gen gp160 de
la envoltura del VIH, y el gen de fusión
cápside-matriz del VIH. En otra realización de la
presente invención, el ARN heterólogo insertado codifica la
glucoproteína de fusión (F) del virus respiratorio sincicial, la
glucoproteína de adhesión (G) del virus respiratorio sincicial o
ambas proteínas F y G del virus respiratorio sincicial.
En una realización, el replicón de ARN, el
primer ARN auxiliar y el segundo ARN auxiliar se proporcionan en
moléculas separadas de modo que una primera molécula, por ejemplo:
el replicón de ARN, incluye ARN que codifica el segmento de
empaquetamiento y el ARN heterólogo insertado que codifica una
actividad de fusión; una segunda molécula, por ejemplo: el primer
ARN auxiliar, incluye ARN que codifica por lo menos una pero no
todas las proteínas estructurales necesarias del alfavirus; y una
tercera molécula, por ejemplo: el segundo ARN auxiliar, incluye ARN
que codifica por lo menos una pero no todas las proteínas
estructurales necesarias del alfavirus. Por ejemplo, en otra
realización de la presente invención, la célula auxiliar incluye un
conjunto de ARN que comprenden: (a) un replicón de ARN que incluye
ARN que codifica una secuencia de empaquetamiento de alfavirus y un
ARN heterólogo insertado que codifica una actividad de fusión, (b)
un primer ARN auxiliar que incluye ARN que codifica la
glucoproteína E1 del alfavirus y la glucoproteína E2 del alfavirus,
y (c) un segundo ARN auxiliar que incluye ARN que codifica la
proteína de la cápside del alfavirus, de modo que la glucoproteína
E1 del alfavirus, la glucoproteína E2 del alfavirus y la proteína de
la cápside se ensamblan conjuntamente en las partículas con
replicón del alfavirus en la célula hospedadora.
En una realización alternativa, el replicón de
ARN y el primer ARN auxiliar se encuentran en moléculas separadas,
y el replicón de ARN y el segundo ARN auxiliar se encuentran juntos
en una sola molécula, de modo que una primera molécula, por
ejemplo: el primer ARN auxiliar, incluye ARN que codifica por lo
menos una pero no todas las proteínas estructurales necesarias del
alfavirus; y una segunda molécula, por ejemplo: el replicón de ARN
y el segundo ARN auxiliar, incluyen ARN que codifica el segmento de
empaquetamiento, el ADN heterólogo insertado y la proteína de la
cápside. De este modo, la proteína de la cápside está codificada por
el segundo ARN auxiliar, pero el segundo ARN auxiliar está
localizado en la segunda molécula junto con el replicón de ARN. Por
ejemplo, en una realización de la presente invención, la célula
auxiliar incluye un conjunto de ARN que comprenden: (a) un replicón
de ARN que incluye ARN que codifica una secuencia de empaquetamiento
de alfavirus, un ARN heterólogo insertado, y una proteína de la
cápside del alfavirus, y (b) un primer ARN auxiliar que incluye ARN
que codifica la glucoproteína E1 del alfavirus y la glucoproteína E2
del alfavirus, de modo que la glucoproteína E1 del alfavirus, la
glucoproteína E2 del alfavirus
y la proteína de la cápside se ensamblan conjuntamente en las partículas del alfavirus en la célula hospedadora.
y la proteína de la cápside se ensamblan conjuntamente en las partículas del alfavirus en la célula hospedadora.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "efecto citopático" (CPE) se refiere a profundos
cambios morfológicos provocados en una célula o células cultivadas
individuales debidos a la infección por el virus. En general, los
CPE son claramente visibles con el microscopio óptico. Los CPE
incluyen, sin limitarse a los mismos, los siguientes fenómenos
celulares: formación de sincicios, alteración de las monocapas,
redondeo, contracción, aumento de la refringencia, fusión,
agregación, pérdida de la adhesión o lisis. Estos fenómenos pueden
darse por separado o en combinación, en función del virus
particular, el tipo de célula y las condiciones.
Las composiciones inmunógenas de la presente
invención pueden contener un adyuvante. Un adyuvante es una
sustancia que aumenta la respuesta inmunitaria cuando se administra
junto con un inmunógeno o antígeno. Se ha demostrado que varias
citocinas o linfocinas tienen actividad moduladora de la inmunidad,
por lo que pueden utilizarse como adyuvantes, incluidas, sin
limitarse las mismas, las interleucinas 1-\alpha,
1-\beta, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (véase, por
ejemplo, la patente US n.º 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y
sus formas mutantes), los interferones \alpha, \beta y
\gamma, el factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrófagos (véase, por ejemplo, la
patente US n.º 5.078.996), el factor estimulante de colonias de
macrófagos, el factor estimulante de colonias de granulocitos, GSF,
y los factores de necrosis tumoral \alpha y \beta. Otros
adyuvantes adicionales útiles en la presente invención incluyen una
quimiocina, incluidas sin limitación, MCP-1,
MIP-1\alpha, MIP-1\beta, y
RANTES. También pueden ser útiles como adyuvantes moléculas de
adhesión, tales como una selectina, por ejemplo,
L-selectina, P-selectina y
E-selectina. Otros adyuvantes útiles adicionales
incluyen, sin limitación, una molécula del tipo de las mucinas, por
ejemplo, CD34, GlyCAM-1 y MadCAM-1;
un miembro de la familia de las integrinas, tal como
LFA-1, VLA-1, Mac-1
y p150.95; un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas,
tal como PECAM, ICAM, por ejemplo: ICAM-1,
ICAM-2 e ICAM-3, CD2 y
LFA-3; moléculas coestimuladoras tales como CD40 y
CD40L, factores de crecimiento, incluidos el factor de crecimiento
vascular, el factor de crecimiento nervioso, el factor de
crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento epidérmico,
B7.2, PDGF, BL-1, y el factor de crecimiento del
endotelio vascular, moléculas de receptores, incluidas Fas,
receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55,
WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD,
NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, y DR6.
Otras moléculas adyuvantes adicionales incluyen la caspasa (ICE).
Véanse asimismo las publicaciones de patente internacional
n.º^{s} WO98/17799 y WO99/43839.
Los adyuvantes adecuados utilizados para
potenciar la respuesta inmunitaria incluyen, sin limitación,
MPL^{TM} (monofosforil-lípido A
3-O-desacilado; Corixa, Hamilton,
MT), que se describe en la patente US n.º 4.912.094. También son
útiles para su utilización adyuvantes que son análogos sintéticos
del lípido A o compuestos de fosfato de
aminoalquil-glucosamina (AGP), o derivados o
análogos de los mismos, que están comercializados por Corixa
(Hamilton, MT), y que se describen en la patente de Estados Unidos
n.º 6.113.918. Uno de dichos AGP es el
2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil-2-desoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranósido,
también denominado 529 (denominado previamente RC529). Este
adyuvante 529 está formulado en forma acuosa o como emulsión
estable.
Otros adyuvantes adicionales incluyen emulsiones
de aceite mineral y agua, sales de aluminio (alum), tales como
hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, etc., Amphigen,
avridina, L121/escualeno,
D-lactida-polilactida/glucósido,
polioles de Pluronic, muramil-dipéptido, células
muertas de Bordetella, saponinas tales como Stimulon^{TM}
QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), descritas en la
patente US n.º 5.057.540, y partículas generadas a partir de las
mismas, tales como ISCOMS (complejos inmunesestimulantes),
Mycobacterium tuberculosis, lipopolisacáridos bacterianos,
polinucleótidos sintéticos tales como oligonucleótidos que contienen
un motivo de CpG (Patente US n.º 6.207.646), una toxina pertúsica
(PT), o una toxina termolábil de E. coli (LT), en particular
LT-K63, LT-R72,
pT-K9/G129; véanse, por ejemplo, las publicaciones
de patente internacional n.º^{s} WO 93/13302 y WO 92/19265.
También son útiles como adyuvantes las toxinas
coléricas y los mutantes de las mismas, incluidos los descritos en
la publicación de solicitud de patente internacional número WO
00/18434 (en la que el ácido glutámico en la posición aminoácida 29
está sustituido por otro aminoácido (distinto de ácido aspártico),
preferentemente una histidina). Toxinas CT similares o mutantes se
describen en la publicación de solicitud de patente internacional
número WO 02/098368 (en la que la isoleucina en la posición
aminoácida 16 está sustituida por otro aminoácido, bien solo o en
combinación con la sustitución de la serina en la posición
aminoácida 68 por otro aminoácido; y/o en la que la valina en la
posición aminoácida 72 está sustituida por otro aminoácido). Otras
toxinas CT se describen en la publicación de solicitud de patente
internacional número WO 02/098369 (en la que la arginina en la
posición aminoácida 25 está sustituida por otro aminoácido; y/o un
aminoácido está insertado en la posición aminoácida 49; y/o dos
aminoácidos están insertados en las posiciones aminoácidas 35 y
36).
La presente invención se describe mediante los
ejemplos presentados a continuación. Sin embargo, la utilización de
dichos ejemplos, u otros, en cualquier lugar de la descripción es
únicamente ilustrativa y no limitativa del alcance ni el
significado de la invención, ni de cualquier término presentado como
ejemplo. Asimismo, la invención no se limita a ninguna realización
particular descrita en la presente memoria. De hecho, los expertos
en la materia podrán apreciar, tras la lectura de la presente
descripción, que pueden realizarse muchas modificaciones y
variaciones de la invención sin apartarse de su espíritu y
alcance.
La presente invención utiliza
PIV-3 humano como modelo de virus paragripal. Se
preparó una reserva de virus PIV3 humanos (cepa Washington
47885/57) como se ha descrito previamente. Véase Stokes, A. et
al. Virus Research 25: 91-103 (1992). La
reserva de virus se purificó por precipitación con polietilenglicol
(PEG). El ARN se extrajo con Trizol-LS (Life
Technologies) y se utilizó como molde para la PCR con transcripción
inversa utilizando el sistema Titan de RT-PCR en un
tubo único (Roche). Se utilizaron cebadores para amplificar
fragmentos que flanqueaban todos los marcos abiertos de lectura
(ORF) de N, P, M, C, HN y F, incluida una secuencia consenso de
Kozak en 5'. Después se digirieron los fragmentos resultantes con
las siguientes endonucleasas de restricción: Clal y HindIII para F,
EcoRI y BamHl para HN, PstI y EcoRI para NP, Accl y Xbal para P y C,
y HindIII y Xbal para M. Los fragmentos resultantes se clonaron en
el plásmido lanzadera, pKSR1. A continuación se subclonaron casetes
Apal-ORF-Notl de los plásmidos
lanzadera en pVR200 corriente abajo y bajo el control del promotor
subgenómico 26S de VEEV, para generar los plásmidos de expresión con
replicón pVR(NP), pVR(P), pVR(M),
pVR(C), pVR(F) y pVR(HN).
Para generar el replicón que contenía dos genes
del PIV, se subclonó una segunda casete
Apal-ORF(HN)-Notl en el
plásmido pVR(F) corriente abajo del gen F, para generar el
plásmido con replicón pVR-F/HN que contenía dos
genes exógenos. Véase la Figura 1. Además, se utilizaron dos
plásmidos auxiliares capaces de expresar la proteína de la cápside
de VEE
(pV3014delta520-7505delta8495-11229)
o las glucoproteínas superficiales gp E1/E2
(pV3014delta520-7505delta7565-8386)
para el empaquetamiento del replicón. Véase Pushko et al.
Virology 239: 389-401 (1997). Los plásmido
resultantes fueron secuenciados utilizando secuenciación con ciclos
de terminación con cromóforos y el secuenciador de ADN 377 ABI
(Applied Biosystems, Foster City, CA).
El presente ejemplo describe la generación de
VRP que expresaban cada uno de los antígenos del PIV3 mediante la
introducción, por electroporación, del ARN de los plásmidos
construidos en el Ejemplo 1 en células BHK21. El plásmido original
del VEE, pVR100, y los plásmidos auxiliares: pHC (cápside) y pHC
(gpE1/E2) se obtuvieron de AlphaVax (Durham, NC). Véase Pushko
et al. Virology 239: 389-401 (1997). Los
fragmentos obtenidos por RT-PCR de los genes de las
glucoproteínas del PIV3 fueron clonados en pVR200 de forma
individual, o en pVR100 (HN y F juntos). A continuación se
sometieron los plásmidos generados a transcripción in vitro
para generar ARN. Los ARN se introdujeron después por
electroporación en células BHK21 para generar VRP que codificaban
los genes NP, M, P, C, F y/o HN (VRP-NP, -M, -P, -C,
-HN, -F, -F/HN), respectivamente.
Tras obtener los genes individuales del PIV y
clonarlos en vectores de expresión adecuados, se prepararon
transcritos de ARN con caperuza in vitro utilizando moldes de
plásmidos linealizados con NotI y el kit de
ARN-polimerasa de T7 mMessage mMACHINE (Ambion,
Austin, TX). Las reacciones se llevaron a cabo siguiendo las
instrucciones del fabricante. Se generaron células que producían
partículas del replicón introduciendo, mediante electroporación, 50
\mug de cada ARN de cada uno de los plásmidos pVR(NP),
pVR(M), pVR(P), pVR(C), pVR(HN),
pVR(F), pVR(HN) más pVR(F), o
pVR-F/HN, junto con 50 \mug de ARN de los
plásmidos auxiliares en células BHK21. Véase Pushko et al.
Virology 239: 389-401 (1997). Las células BHK
tratadas se incubaron después en un matraz T-175 a
37ºC con CO_{2} al 5%. El medio estaba compuesto por medio de
Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), con concentración elevada de
glucosa, suero de ternero fetal al 10% y piruvato de sodio al 1%. A
continuación, se recogieron los sobrenadantes del cultivo 48 horas
después de la electroporación, y se clarificaron por centrifugación
a 3.200 rpm. Las VRP se resuspendieron en PBS y los títulos se
determinaron infectando células BHK21 y preparando inmunotinciones
utilizando anticuerpos adecuados específicos contra el PIV3.
Los replicones de VEE (VRP) que expresaban
proteínas y glucoproteínas del PIV fueron sometidos a titulación
utilizando procedimientos inmunohistoquímicos. Los VRP se propagaron
en células de la línea BHK-21. En este caso las
células BHK procedían de un clon CCL-10 para
distinguirlas de otras poblaciones clonales de BHK que puede que no
compartan las mismas características fenotípicas. Tal como se define
en la presente memoria, las células pueden denominarse BHK21 o
simplemente células BHK. Se infectaron monocapas de células BHK21
con diluciones en serie de replicones del VEE: VRPNP;
VRP-P; VRP-M; VRP-C;
VRP-HN; VRP-F;
VRP-F/HN y VRP-GFP, y se incubaron
a 37ºC durante 16-20 horas. Después se fijaron las
monocapas con acetona/metanol 1:1 durante 5 minutos y se tiñeron
con anticuerpos de conejo contra la proteína NSP1 del VEE, expresada
en bacterias, anticuerpo policlonal Ab r835, o suero de caballo
contra el PIV3. Después se detectaron las placas con anticuerpos
caprinos, conjugados con cyTM3, contra la inmunoglobulina de conejo
(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) o con anticuerpos contra
la inmunoglobulina de caballo (Kirkegaard & Perry, Maryland, MD)
conjugados con peroxidasa de rábano (HOURP) junto con un kit de
sustrato de peroxidasa con aminoetilcarbazol (AEC) (Enzo Life
Sciences, Farmingdale, NY). El recuento del número de placas se
llevó a cabo con un microscopio y se notificó en forma de unidades
infecciosas por ml (UI/ml) para los replicones del VEE, o en forma
de unidades formadoras de sincicios por ml (UFS/ml) para las
partículas infecciosas secundarias generadas a partir de la
infección con el replicón de VRP-F/HN.
Los títulos de la reserva de virus de la cepa
Wash47885/57 del PIV3 o de los homogeneizados de tejidos se
determinaron utilizando un protocolo de ensayo de hemadsorción
modificado (HAD), como se ha descrito. Véase Durbin et al.,
Virology 235: 323-332 (1997); Durbin et al.,
Vaccine 16: 1234-1330 (1998). Brevemente, se
titularon muestras de diluciones en series de 10 veces en placas de
96 pocillos con monocapas de LLC-MK2 a 37ºC. Los
sobrenadantes se recogieron después de 6-7 días en
cultivo y se sometieron al ensayo de HA con eritrocitos de cobaya
al 0,5%. Se calculó la media del valor de Log_{10}TCID50 por ml de
muestra.
La inmunización de hámsteres no inmunes con
replicones de VRP que expresaban proteínas particulares del PIV
generaba inmunidad protectora contra la infección posterior por el
PIV. Se inmunizaron hámsteres sirios dorados de cinco a ocho
semanas de edad, que eran seronegativos para el PIV3, con replicones
del VEE: VRP-NP; VRP-P;
VRP-M; VRP-C; que expresaban
proteínas NP, P, M, C del PIV-3, o GFP como testigo,
bien por vía intranasal (i.n.), o bien por vía intramuscular
(i.m.). Las dosis se presentan en la Tabla 1. Los animales
recibieron dosis de refuerzo 3 semanas y 5 semanas después de la
inmunización inicial con la misma dosis (Tabla 1). Siete semanas
después, los hámsteres fueron sometidos a exposición con 1x10^{6}
LogTCID_{50} del PIV3 (cepa Wash47885/57 del virus). Cuatro días
después de la exposición se extrajeron y homogeneizaron los cornetes
nasales y el tejido pulmonar. Véase Durbin et al., Virology
235: 323-332 (1997); Durbin et al., Vaccine
16: 1234-1330 (1998). La replicación del PIV3 en
estos homogeneizados se analizó mediante el ensayo de HAD como se
ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3. Todos los hámsteres
sirios dorados y los ratones BALB/c fueron adquiridos a Charles
River Laboratory (Wilmington, MA) y alojados con arreglo a las
normas actuales de los NIH que figuran en la "Guía para el
cuidado y utilización de animales de laboratorio", así como la
normativa federal y estatal, y los procedimientos de trabajo en
vigor en Wyeth Research's BioResources.
En una realización de la presente invención las
partículas con replicón del virus de la encefalitis equina
venezolana provocan efectos citopáticos cuando se utilizan para
infectar monocapas de células BHK cultivadas. En otra realización,
los sobrenadantes de células infectadas con las partículas con
replicón provocan, cuando se transfieren a monocapas de células no
infectadas, efectos citopáticos en ausencia de las partículas con
replicón. En otra realización de la presente invención, el efecto
citopático se selecciona de entre el grupo constituido por
formación de sincicios, alteración de las monocapas y apoptosis.
Se investigó la capacidad de las proteínas
internas del PIV3 para proporcionar protección contra la infección
por el PIV3 en animales utilizando hámsteres como modelo
experimental, debido a que los hámsteres constituyen el modelo con
animales más pequeños capaces de admitir la replicación del PIV3 y
la infección por el VEE. Véase Durbin et al., Vaccine 16:
1234-1330 (1999). La Tabla 1 presenta los títulos
víricos obtenidos en las LRT y las URT tras la inmunización y la
exposición. Ninguna de las VRP que expresaban indistintamente NP,
P, M o C a dosis en el intervalo entre 1x10^{6} y 1x10^{7} U.I.
administradas por vía i.n. o por vía i.m. demostró conferir
protección obvia, en comparación con los grupos que habían recibido
VRP-GFP y PBS (Tabla 1). Sólo el cp45, que es un
virus PIV3 vivo atenuado, fue capaz de proteger a los hámsteres de
la infección por el PIV3. Por consiguiente, se concluyó que las
proteínas internas NP, P, M y C tenían una eficacia muy escasa o
nula como candidatos para su inclusión en composiciones inmunógenas
contra el PIV3.
Se investigó la capacidad de HN y/o F expresadas
en VRP para proporcionar protección. Se inmunizaron hámsteres con
arreglo a la misma pauta y a las mismas dosis indicadas en la Tabla
2. Los resultados se presentan en la Tabla 2 e indican que sólo los
animales inmunizados con VRP-F/HN estaban casi
completamente protegidos de la infección en las URT. Los hámsteres
inmunizados sólo con VRP-HN presentaban títulos
víricos reducidos en aproximadamente 100 veces en las URT. La
inmunización de hámsteres con
VRP-HN+VRP-F por vía i.n., en vez
de con VRP-F/HN, redujo la replicación vírica en las
URT solamente 10 veces. Además, la inmunización con
VRP-F no generó títulos neutralizantes en suero ni
protección de la infección en las URT, y sólo produjo una reducción
de 10 veces en la replicación vírica en las LRT (Tabla 2, Expt. 1).
Por consiguiente, utilizando la inmunización por vía i.n., la
composición inmunógena que comprende VRP-F/HN dio
lugar a niveles significativos de títulos neutralizantes, así como
una protección
completa contra la infección por el PIV3 de las LRT, y redujo la gravedad de la infección por el PIV3 en las URT.
completa contra la infección por el PIV3 de las LRT, y redujo la gravedad de la infección por el PIV3 en las URT.
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En general, la inmunización intramuscular fue
menos eficaz que la inmunización intranasal a la hora de generar
inmunidad protectora contra el PIV3. Por ejemplo, los animales que
fueron inmunizados por vía intramuscular (i.m.) con
VRP-HN y
VRP-HN+VRP-F presentaron una
reducción de los títulos víricos en las LRT de aproximadamente 3
log_{10} (Tabla 2, Expt. 1), en comparación con la inmunización
intranasal con dichos replicones, que dio lugar a una protección
completa contra la exposición posterior a la infección en las
LRT.
Una vez más, la inmunogenicidad más eficaz se
obtuvo con VRP-F/HN, que confirió una protección
completa contra la exposición posterior a la infección en las LRT
(Tabla 2, Expt. 2) tanto en la inmunización por vía i.m. como en
inmunización por vía i.n. No se obtuvieron ejemplos de protección
completa mediante inmunización por vía i.m. utilizando VRP
distintas de VRP-F/HN (Tabla 2).
Los datos demostraron que era posible obtener
diversos grados de protección en forma de reducción de los títulos
víricos y reducción de la gravedad de la infección en las URT
mediante la inmunización por vía i.m. Específicamente, la
inmunización intramuscular utilizando VRP-HN,
VRP-F, VRP-HN +
VRP-F, dio lugar a reducciones de los títulos
víricos en un intervalo de aproximadamente 10 veces hasta
aproximadamente 100 veces en comparación con el testigo con PBS
(Tabla 2, Expt. 1 y 2). VRP-F/HN fue el mejor
candidato para conferir protección contra la infección de las LRT
cuando se administraba por vía i.m., aunque resultaba menos eficaz
que cuando la inmunización se realizaba por vía i.n.
Las células que secretaban Ig específica contra
el PIV3 en los ganglios linfáticos de ratones fueron medidas con el
ensayo ELISPOT de linfocitos B. Brevemente, se incubaron
suspensiones de células únicas procedentes de ganglios linfáticos
de ratones inmunizados en placas Immulon II de 96 pocillos
(Millipore, Bedford, Mass.) que habían sido recubiertas con 100 ng
de virus PIV3 alterado con detergente durante toda la noche a 37ºC
en CO_{2} al 5%. Después, se eliminaron las células por lavado y
se detectó la Ig total o la IgA específicas para el PIV3 unidas a
las placas se detectaron utilizando una mezcla de anticuerpo
caprino, conjugado con fosfatasa alcalina, contra las
inmunoglobulinas de ratón IgM + IgG +IgA, o sólo contra la IgA,
respectivamente. A continuación las manchas se pusieron de
manifiesto utilizando un kit con sustrato de fosfatasa alcalina
(Bio-Rad) y se cuantificaron mediante recuento con
un microscopio de disección Olympus (Leeds Precision Instruments,
Inc., Minneapolis, Minn.). Los resultados se notifican en forma de
células formadoras de manchas (SFC) por 1x10^{6} células.
La capacidad de los sueros de hámster para
neutralizar las partículas del virus del PIV3 se midió mediante el
ensayo de inhibición de la hemaglutinación (IH). Brevemente, se
trataron sueros termoinactivados con la enzima destructora de
receptores (RDE) (Denka Seiken Co. Ltd., Tokio, Japón) durante
18-20 horas a 37ºC para eliminar los inhibidores no
específicos antes de la eliminación adicional de la aglutinina no
específica por incubación con RBC de cobayas al 0,4% (gpRBC) a 4ºC
durante 1 hora. A continuación se determinó el punto final de las
diluciones en serie del suero tratado para inhibir 4 unidades de HA
del virus PIV3 para aglutinar gpRBC al 0,5%.
La eficacia protectora demostrada de
VRP-F/HN dio lugar a una investigación de sus
efectos protectores. La protección contra patógenos respiratorios
está generalmente asociada a la inducción de la inmunidad de las
mucosas. Por consiguiente, se evaluó la inducción de células que
producían IgA en los ganglios linfáticos mediastínicos (MLN) y en
los ganglios linfáticos cervicales (CLN), que drenan los pulmones o
la nariz. En este caso se empleó un modelo en ratones debido a que
no se disponía de un reactivo de detección adecuado para hámsteres.
Se inmunizaron ratones BALB/c con VRP-HN, o con
VRP-F/HN (i.n.) con arreglo a la misma pauta de
inmunización utilizada con hámsteres. Se recogieron CLN individuales
y los MLN se mezclaron. Se prepararon suspensiones de células
únicas a partir de los ganglios linfáticos, y las células secretoras
de Ig total o células secretoras de IgA se analizaron con el ensayo
ELISPOT de linfocitos B.
La inmunización con VRP-F/HN
generó elevados niveles de IgA específicas de antígenos, en
comparación con la inmunización con otras VRP. Por ejemplo, la
inmunización con VRP-HN generó aproximadamente 800
SFC por 1x10^{6} células secretoras de Ig específicas de
PIV-3 en los CLN. De entre ellas, sólo
aproximadamente el 10% de las células secretoras de Ig eran células
secretoras de IgA específicas para PIV-3 (menos de
100 SFC por 1x10^{6} células). En contraposición, la inmunización
con VRPF/HN generó aproximadamente 400 SFC por 1x10^{6} células
de SFC con Ig específicas para PIV3 en los CLN. Es importante
señalar que el número de SFC con Ig específicas para el antígeno
fue muy superior en porcentaje al obtenido con
VRP-HN (aproximadamente 250 SFC por 1x10^{6}
células). En este caso, más del 60% de las células secretoras de Ig
en los grupos inmunizados con VRP-F/HN
correspondían a IgA. Por consiguiente, VRP-F/HN
inducía preferentemente la producción de IgA específicas de
antígenos en las URT, y este valor correlacionaba con una mayor
eficacia en la protección (Tabla 2).
En los MLN, las cantidades de células secretoras
totales específicas para PIV3 o de células secretoras de IgA eran
similares tanto en la inmunización con VRP-HN como
en la inmunización con VRP-F/HN, lo que concuerda
con el hecho de que ambas inmunizaciones hacían desaparecer
completamente la replicación vírica en las LRT de los hámsteres
(Tabla 2).
Se investigó el papel de los anticuerpos
neutralizantes en la inmunidad protectora tras la exposición al
virus. Se recogieron muestras de suero dos días antes de la
exposición al PIV3 y se midió el título de neutralización de PIV3.
La Tabla 2 demuestra que no se detectaron títulos neutralizantes en
un grupo testigo con PBS, y que la replicación vírica en las LRT y
las URT alcanzaba un nivel de 5,8 \pm 0,4 y 5,2 \pm 0,2,
respectivamente. Entre todos los grupos experimentales, la
inmunización con VRP-HN, VRP-F/HN, o
con una combinación de VRP-HN y
VRP-F (VRP-HN+VRP-F)
generó niveles significativos de títulos HI, alcanzando niveles de
6,3, 7,1 y 7,5, respectivamente, comparables a los del grupo
inmunizado con cp45 (datos no representados), y demostraban una
protección completa en las LRT.
Se evaluó la dosis mínima para la inmunización
con VRP-F/HN necesaria para obtener una protección
eficaz. Cuando se administraba VRP-F/HN a una dosis
de 2x10^{4} UI por vía i.n. era capaz de proteger las LRT de la
infección y proporcionaba protección parcial contra la infección de
las URT mediante la reducción de la replicación vírica en 100 veces
(Tabla 3, Expt. 1). Es más, la tercera inyección parecía ser
innecesaria, y dos inyecciones de una dosis de 1x10^{4} UI eran
suficientes para prevenir la infección de las LRT. Una dosis de
VRP-F/HN de 1x10^{4} UI no fue suficiente (Tabla
3, Expt. 2). Por consiguiente, en el modelo con hámsteres,
VRP-F/HN constituía la pauta más eficaz para
prevenir la replicación del PIV3 en las vías respiratorias
inferiores y superiores. La dosis de VRP-F/HN eficaz
para combatir la infección de las LRT podía ser tan baja como dos
inmunizaciones con 1x10^{4} UI.
Los datos indicaban que la inmunización con dos
dosis de 1x10^{4} UI de VRP-F/HN era suficiente
para reducir la replicación del virus hasta niveles no detectables
en las LRT, y reducía el nivel de la replicación del virus en
aproximadamente 100 veces en las URT (Tabla 3). Este dato constituye
un logro significativo, debido que apunta a un procedimiento para
preparar una composición con subunidades capaz de prevenir ciertas
complicaciones patológicas tales como la neumonía asociada a la
infección por PIV y RSV. Los datos demuestran que HN y F son dos
antígenos críticos necesarios para el diseño de vacunas con
subunidades del PIV3.
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La potente eficacia de VRP-F/HN
como composición inmunógena en comparación con
VRP-HN, VRP-F o
VRP-HN+VRP-F dio lugar a la
investigación de su mecanismo de acción. Se observó que la infección
con VRP-F/HN provocaba un CPE único, en comparación
con otras infecciones de VRP en cultivo. Se investigó la capacidad
de dichas VRP de provocar apoptosis cuando se propagaban en
cultivo. Se infectaron monocapas de BHK21 con
VRP-F/HN o VRP-HN a una MDI=0,5, o
se dejaron sin infectar (como testigos). Véase la Tabla 4. Se
observó la morfología de las monocapas con el microscopio de
contraste de fases utilizando aumentos de 100x a las 24, 48 y 72
horas tras la infección. Véase la Tabla 4. Los datos del CPE se
caracterizaron atendiendo a si las monocapas de células BHK estaban
desorganizadas mostrando CPE leves (+), o a si las monocapas de
células estaban considerablemente destruidas y a si se habían
formado vesículas de membranas (++), o a si las monocapas estaban
completamente eliminadas, dejando sólo vesículas y restos (+++) en
el sobrenadante. Véase la Tabla 4.
Como se muestra en la Tabla 4, cuando se
infectaban células BHK con VRP-F/HN, las monocapas
de células BHK aparecían, 24 horas después, desorganizadas en
comparación con la infección con VRP-HN u otras VRP
(datos no mostrados). Después de 48 horas, la infección con
VRP-F/HN provocaba la destrucción de las monocapas,
y se formaban sincicios obvios y vesículas de membranas. A las 72
horas, las monocapas habían sido totalmente eliminadas, dejando
vesículas y restos en el sobrenadante, mientras que un grupo
infectado con VRP-HN presentaba monocapas intactas
con células redondeadas debido a fenómenos de apoptosis. Véase la
Tabla 4.
Los estudios previos han demostrado que las
propiedades de fusión de la proteína F requieren la presencia de la
proteína HN (Ebata, S. N. et al. Virology 183:
437-441 (1991)), mientras que ni HN ni F son
capaces, por sí mismas, de provocar la formación de sincicios. A
continuación se investigó la posibilidad de que el CPE único debido
a la infección con VRP-F/HN fuera debido a la
formación de sincicios.
Se infectaron monocapas de células BHK21 con
diferentes VRP, por ejemplo, VRP-HN,
VRP-F, VRP-HN+VRP-F
o VRP-F/HN, durante 15-18 horas, y
después se fijaron las monocapas y se tiñeron con Ab policlonal de
caballo contra el PIV3 y después con anticuerpos contra la
inmunoglobulina de caballo conjugados con peroxidasa de rábano, como
anticuerpo secundario, junto con aminoetilcarbazol como sustrato de
la peroxidasa; o con anticuerpo policlonal de conejo Ab r835 contra
la NSP1 del VEE junto con anticuerpo caprino, conjugado con cyTM3,
contra la inmunoglobulina de ratón. Se tomaron micrografías con el
microscopio de campo claro o de fluorescencia, con aumentos de
100x.
Como era de esperar, las VRP-HN
o VRP-F por sí mismas demostraban claramente placas
que expresaban HN o F formadas por la infección de las VRP
individuales. Sin embargo, las "placas" en el grupo infectado
con VRP-F/HN eran de un tamaño mucho mayor y eran
fácilmente identificables. Estas "placas" mayores representaban
en realidad la formación de sincicios, ya que podían verse
claramente células multinucleadas en el interior de dichas
"placas" [la titulación basada en la formación de sincicios se
denominó unidad formadora de sincicios (UFS) en vez de unidad
infecciosa (UI) dado que estaba basada en replicones individuales y
múltiples células]. Cuando se coninfectaban las células de forma
simultánea con VRP-HN y VRP-F había
menos "placas" (menos del 1%) que presentaban morfología de
sincicios. Sin embargo, las placas eran similares a las formadas por
la infección con VRP-HN o VRP-F por
separado. Este mismo perfil de placas se observó cuando se tiñeron
las placas con Ab contra la NSP1 del VEE. La formación de sincicios
confirmaba adicionalmente la coexpresión de las proteínas HN y F a
partir de VRP-F/HN. Se concluyó que la infección con
VRPF/HN daba lugar en realidad a dos procesos de CPE distintos:
apoptosis y formación de sincicios.
Se observó que el CPE provocado por
VRP-F/HN era muy "contagioso", debido a que las
monocapas de células ("monocapas") se destruían a muy bajas
multiplicidades de infección (MDI) (<0,001, datos no
representados). Por consiguiente, se dedujo que se generaba algún
tipo de replicones secundarios o partículas infecciosas a partir del
CPE único. Estos replicones secundarios o partículas infecciosas
parecían ser autopropagantes e infectaban otras células utilizando
los procesos de fusión provocados por las glucoproteínas HN y F
asociadas a las membranas.
Con el fin de evaluar si se producían agentes
infecciosos que no eran replicones se diseñaron experimentos en los
que se infectaban monocapas de células BHK con
VRP-F/HN u otras VRP a una MDI de 0,5 durante 30
minutos. Después se lavaban las monocapas tres veces para eliminar
cualquier VRP residual, recibían de nuevo medio y se cultivaban
durante 48 horas. A continuación, las monocapas se tiñeron con suero
de caballo contra el PIV3 para valorar la expresión de HN y F, o
con anticuerpos de conejo contra la NSP1 del VEE para determinar la
presencia de la proteína NSP1 del replicón. Al final del período de
48 horas se extrajeron partes alícuotas de los sobrenadantes de las
células de las monocapas y se utilizaron para "infectar" nuevas
monocapas de células BHK durante 30 minutos. Después de 30 minutos
se lavaron las células, se les añadió nuevo medio, y se incubaron
durante 48 horas. Después se evaluaron las monocapas para detectar
CPE y se tiñeron con suero de caballo contra el PIV3 para detectar
la expresión de HN y F, o con anticuerpo de conejo contra la NSP1
del VEE para determinar la presencia de proteínas del replicón. El
procedimiento se realizó en una primera transferencia (1.ª
transferencia), otra transferencia (2.ª transferencia), y otra
transferencia (3.ª transferencia). Todas las células se tiñeron
bien con anticuerpos contra el PIV3 para detectar la expresión de HN
y F, o con anticuerpos contra la NSP1 del VEE para detectar la
expresión la NSP1 del VEE. Se tomaron fotografías con un aumento de
100x con el microscopio de campo claro para el caso de los
anticuerpos contra el PIV, o con el microscopio de fluorescencia
para los anticuerpos contra la NSP1 del VEE. La magnitud de la
expresión medida por la inmunotinción se identifica con (-) o (+)
hasta (+++++). Los resultados se representan en la Tabla 5.
En la primera ronda de infección con replicones
de VRP, las placas eran visibles después de 48 horas en células
infectadas con los siguientes replicones: VRP-HN,
VRP-F, y VRP-HN +
VRP-F. Véase la Tabla 5. En esta ronda de
infección, las glucoproteínas del VEE que procedían de los plásmidos
auxiliares facilitaron la entrada a las células.
Haciendo referencia al CPE en la infección
inicial con replicones, las células infectadas con
VRP-HN +VRP-F presentaron indicios
ocasionales de formación de sincicios debido a la coexpresión
oportunista de HN y F. En contraposición, la infección con
VRP-F/HN después de 48 horas provocó la destrucción
de las monocapas de células y la formación de sincicios obvios.
Véase la Tabla 5. Todos estos grupos expresaban asimismo las
proteínas NSP1 del VEE, lo que era indicativo de actividades de
replicones activos. Véase la Tabla 5.
En la segunda ronda de infección, cuando los
sobrenadantes mencionados anteriormente fueron transferidos a
nuevas monocapas, no se produjeron nuevas actividades de infección
en los grupos tratados con VRP-HN y
VRP-F. Véase la Tabla 5. De manera similar, no hubo
expresión adicional de HN y F del PIV3, ni hubo producción alguna
de NSP1 del VEE. Véase la Tabla 5. En estos grupos, la ausencia de
proteínas auxiliares del VEE resultó fatal para el proceso
infección, como cabría esperar antes de la presente invención.
Sorprendentemente, sin embargo, se produjeron
partículas infecciosas en los sobrenadantes de células tratadas con
VRP-F/HN en ausencia de proteínas del VEE en los
plásmidos auxiliares. Por ejemplo, se observó la producción de
grandes cantidades de glucoproteínas HN y F del PIV3 después de la
transferencia del sobrenadante de células tratadas con
VRP-F/HN a monocapas de células no infectadas. Véase
la Tabla 5. En esta etapa del proceso se pensó que el proceso de
infección estaba dirigido por la actividad de fusión expresada en la
superficie de proteínas HN y F del PIV en la superficie de las
vesículas derivadas de células.
Además, se detectó la producción de proteínas
NSP1 en el grupo tratado con VRP-F/HN después de la
transferencia, lo que indicaba la presencia de actividades
infecciosas potentes en los sobrenadantes de células infectadas con
VRPF/HN. Véase la Tabla 5. La expresión de glucoproteínas
superficiales del VEE fue indetectable por tinción con suero
policlonal contra el VEE, lo que indicaba que no se habían generado
virus VEE debido a un posible caso de recombinación. Por
consiguiente, el agente infeccioso está constituido por el replicón
de ARN original del VEE, que porta la replicasa del VEE que
comprende NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, y los genes HN y F del PIV3.
Además, demostramos en la presente memoria que estas mismas
proteínas se expresan.
La actividad infecciosa en transferencias
posteriores parecía estar dirigida por la coexpresión de HN y F del
PIV3. Hubo una cantidad limitada de tinción de antígenos de
glucoproteína HN y F del PIV3 y no hubo expresión detectable de
NSP1 en el grupo con VRP-HN+VRP-F.
Véase la Tabla 5. El motivo puede ser el arrastre de algunos
replicones con actividad formadora de sincicios procedentes de la
infección inicial con VRP. Véase la Tabla 5. En apoyo de esta
hipótesis cabe señalar que hemos comprobado que esta actividad
residual no era capaz de transmitirse con la segunda transferencia,
y no se detectó más antígeno del PIV3. Véase la Tabla 5.
En contraposición con la falta de actividad
infecciosa observada con las células tratadas con
VRP-HN+VRP-F, los sobrenadantes de
células que habían recibido la primera transferencia de la infección
con VRP-F/HN eran capaces de provocar, cuando se
aplicaban a células no infectadas, otra ronda de fenómenos
"infecciosos", incluidas la formación de sincicios, la
alteración de las monocapas, la tinción de antígenos HN y F del
PIV3, y la tinción de antígenos NSP1 del VEE. Una vez más, no hubo
expresión detectable del glucoproteínas superficiales del VEE a
consecuencia de estas actividades infecciosas, con lo que se
descarta de modo adicional la contaminación con virus VEE.
Se produjeron rondas adicionales de fenómenos
"infecciosos" cuando los sobrenadantes de células infectadas
con VRP-F/HN se transfirieron a otras monocapas de
células BHK. Véase la Tabla 5. Las monocapas de células BHK se
tiñeron asimismo con suero policlonal contra el VEE y no mostraron
expresión de proteínas superficiales del VEE, lo que indica que no
hubo generación de virus VEE.
Las observaciones anteriores confirmaron de
manera adicional la hipótesis de que había actividades fusogénicas
"infecciosas", dirigidas por proteínas, generadas a partir de
las células infectadas con VRP-F/HN, y que estas
actividades podían transferirse de modo continuo.
Se examinaron las características morfológicas
de las partículas infecciosas con un microscopio electrónico con el
objeto de aclarar su naturaleza. El examen detallado descartó que
las partículas infecciosas fueran replicones de
VRP-F/HN, y, en su lugar, identificó a los agentes
infecciosos como vesículas procedentes de células infectadas que
coexpresaban HN y F del PIV3.
Las vesículas de VRP-F/HN se
prepararon para microscopía electrónica diluyéndolas primero 1:20 en
PBS. Se realizaron pruebas inmunocitoquímicas de tinción negativa
de vesículas enteras con partículas de oro utilizando una
modificación de un procedimiento desarrollado por Slot y Geuze 1984.
Véase: Immunolabeling for Electron Microscopy, de Slot y Geuze,
Pollack y Varndell eds., Elsevier Science Publishers, BV, Ámsterdam.
Se colocaron gotitas de vesículas en Parafilm y se instalaron
rejillas de oro recubiertas de Formvar-carbono boca
abajo en cada gotita. El exceso de líquido se eliminó y el bloqueo
se llevó a cabo en dos etapas utilizando PBS y BSA al 1% (5 ml), y
después PBS con gelatina de pescado de agua fría al 1% (10 ml). La
rejillas con las vesículas se colocaron de forma invertida sobre un
mAb contra F, clon B-102, o un mAb contra HN, clon
68/2, diluidos 1:50 en PBS con BSA (1 h) en una cámara húmeda. Las
rejillas se lavaron 5 x 1 ml en PBS con BSA. El antígeno se detectó
por incubación con anticuerpos caprinos contra la IgG + M de ratón,
conjugados con perlas de oro coloidal de 6 nm (Jackson
ImmunoResearch Labs, W. Grove, PA). El lavado se llevó a cabo en PBS
(4 x 1 ml). Las rejillas con células se estabilizaron con
glutaraldehído al 1% en PBS (3 ml). Cada muestra se lavó después en
agua destilada (5 x 1 ml). Finalmente, las rejillas con vesículas se
sometieron a tinción negativa (30 s) utilizando PTA al 1%, pH 6,5.
Las muestras testigo se incubaron en ausencia de anticuerpo
primario. La visualización se llevó a cabo con un microscopio
electrónico de transmisión Zeiss 10C que funcionaba a 80 kV.
Los estudios de microscopía electrónica de una
muestra de partículas infecciosas procedentes de sobrenadantes
indicaban que las partículas infecciosas no eran replicones de
VRP-F/HN. Los replicones del VEE son partículas
víricas de un tamaño de 70 nm, cercano al del virus VEE. Véase
Paredes et al., J. Virol. 75: 9532 (2001). La tinción
negativa puso de manifiesto una cantidad significativa de
heterogeneidad en los tamaños. En contraposición, se sabe que los
replicones del VEE son de tamaño homogéneo.
Las partículas infecciosas mostraban expresión
superficial de las glucoproteínas HN y F del PIV3, lo que no
concordaba con la idea de que el material infeccioso estaba
compuesto por replicones de VRP-F/HN. Las partículas
infecciosas purificadas se sometieron a la técnica
inmunohistoquímica de marcaje con oro utilizando el anticuerpo
monoclonal "clon 68/2" contra la-HN y el
anticuerpo monoclonal "clon B-102" contra la F.
Los resultados demostraron que las partículas infecciosas se teñían
predominantemente con anti-HN y
anti-F, en comparación con el testigo teñido con la
Ig de isotipo murino. Este resultado confirmaba adicionalmente que
el material infeccioso no estaba compuesto de replicones, debido a
que en la superficie de un replicón sólo se expresarían
glucoproteínas del VEE. Teniendo en cuenta las propiedades de
empaquetamiento de los replicones del VEE, las glucoproteínas HN y
F del PIV3 estarían excluidas de las partículas con replicón. Véase
Straus, J. H. & Strauss E. G., The Alphaviruses: Gene
Expression, Replication and Evolution. Microbiological Reviews
58(3): 491-562 (1994).
Se evaluó la identidad de las proteínas
superficiales que participaban en la entrada en la célula de dichas
vesículas infecciosas investigando si los anticuerpos contra
proteínas específicas podían inhibir la infectividad. En primer
lugar se preincubaron vesículas infecciosas o replicones del VEE que
codificaban GFP con varios anticuerpos tales como suero contra el
PIV3; mAb contra HN; mAb contra F; mAb contra HN + mAb contra F;
suero normal, y testigo con Ig de isotipo murino durante horas.
Después se infectaron las monocapas de células BHK durante 1 hora
con dichas vesículas infecciosas o replicones del VEE preincubados.
A continuación se lavaron las monocapas y se sustituyó el medio de
cultivo. La infección por vesículas se determinó fijando las células
y tiñéndolas durante toda la noche con anticuerpos de conejo contra
la NSP1 del VEE y anticuerpos caprinos, conjugados con cyTM3,
contra la inmunoglobulina de conejo. La infección con replicones del
VEE se visualizó mediante la expresión de la proteína verde
fluorescente después de 5 horas en cultivo. Se hicieron micrografías
con el microscopio de fluorescencia utilizando aumentos de 100X. La
magnitud de los indicios de la infección se puntuó en la Tabla 6
con (+) o (++). La falta de indicios de infección se puntuó con
(-).
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Los datos representados en la Tabla 6 indican
que la incubación de las vesículas infecciosas con antisuero
policlonal contra el PIV3 o con anticuerpos monoclonales contra la
HN del PIV3 bloqueaba completamente la capacidad de las vesículas
para autopropagarse o para infectar nuevas células. Cuando se
incubaron las vesículas con un único anticuerpo monoclonal contra
la proteína de fusión del PIV3, la infectividad aparecía algo
reducida, pero no totalmente inhibida. La preincubación de las
vesículas con un anticuerpo monoclonal contra las proteínas del VEE
no afectaba a la infectividad de las vesículas.
El efecto de la preincubación con anticuerpos en
la infectividad posterior fue muy diferente cuando se utilizaban
replicones en vez de vesículas. Por ejemplo, ni el antisuero
policlonal contra el PIV3 ni los anticuerpos monoclonales contra
las glucoproteínas HN y F del PIV3 pudieron inhibir la infectividad
de VRP-HN/P. Véase la Tabla 6. En contraposición,
sólo la preincubación con un anticuerpo monoclonal contra las
glucoproteínas superficiales del VEE fue capaz de inhibir la
infectividad de VRP-F/HN.
Cabe deducir varias conclusiones importantes a
partir de estos estudios de la inhibición de la infectividad con
anticuerpos. En primer lugar, los resultados de la inhibición de la
infectividad indicaban que las proteínas HN y F estaban localizadas
en la superficie de las vesículas autopropagantes. Los resultados
indicaban asimismo que la actividad autopropagante que parecía ser
infectividad estaba dirigida por las glucoproteínas fusogénicas HN
y F del PIV3 localizadas en la superficie de las vesículas
autopropagantes. En contraposición, estos resultados confirmaron
que las proteínas estructurales E1 y E2 del VEE son las que se unen
a los receptores y dirigen la primera ronda de infección cuando se
utilizan replicones para infectar células.
A continuación se investigó si dichas vesículas
autopropagantes infecciosas podrían amplificarse como un virus, y
hasta qué punto podía compararse dicha amplificación con las
características de proliferación de los replicones originales. Con
este fin se amplificaron primero los replicones
VRP-F/HN de la siguiente manera: (i) se infectaron
matraces T-175 de células BHK subconfluentes con
aproximadamente 1x10^{5} UI (UFS) de VRP-F/HN
durante 1 hora; (ii) después se lavaron las células y se les añadió
nuevo medio; y (iii) se midió la actividad de formación de
sincicios con el tiempo utilizando el mismo protocolo utilizado para
la titulación de VRP-F/HN. Se comprobó que en las
primeras 16 horas había un título bajo de actividad infecciosa (-
300 UFS). Se formaron sincicios durante el procedimiento de
titulación, que mostraban unas características morfológicas
similares a las de VRP-F/HN. Aproximadamente
cuarenta horas después, la actividad formadora de sincicios aumentó
de forma extraordinaria en 2500 veces y permaneció invariable
durante otras 72 horas. Por consiguiente, se calculó que el tamaño
del estallido de las partículas con replicón era aproximadamente
0,1.
Como comparación, se investigó la capacidad de
las "partículas de vesículas infecciosas" producidas a partir
de células infectadas con VRPF/HN para amplificarse como replicones.
Se utilizaron de nuevo matraces T-175 de células
BHK, a aproximadamente 80% de confluencia, que se infectaron con
aproximadamente 1x10^{4} UFS de vesículas autopropagantes en
forma de sobrenadante del cultivo de células infectadas con
VRP-F/HN durante 1 hora. A continuación se lavaron
las células y se les añadió nuevo medio, y se midió la actividad de
formación de sincicios con el tiempo. La amplificación de vesículas
autopropagantes medida como actividad de formación de sincicios fue
superior a la amplificación de replicones VRP-F/HN.
La curva de proliferación de las vesículas autopropagantes
presentaba títulos bajos (-500 UFS) en las primeras 16 horas,
seguido por un aumento súbito en la actividad de formación de
sincicios en 560 veces en las primeras 40 horas. Posteriormente,
aproximadamente 112 horas después de la infección inicial, el
título de la actividad de formación de sincicios había aumentado
hasta aproximadamente 15.000 veces. Estos datos apoyaban la idea de
que la infección con VRP-F/HN produce partículas
infecciosas, denominadas vesículas autopropagantes, capaces de
seguir propagándose de forma autónoma. Estas partículas secundarias
de "vesículas infecciosas" sólo podían generarse a partir de la
infección con VRP-F/HN, pero no con
VRP-HN, VRP-F, o
VRP-HN+VRP-F. Este fenómeno puede
explicar además la sensibilización eficaz de la inmunidad
protectora adecuada y la potencia de VRP-F/HN como
candidatos para composiciones inmunógenas contra la infección por
el PIV3.
Se investigó la posible fragilidad de las
vesículas autopropagantes en respuesta a fenómenos físicos típicos
tales como congelación-descongelación, agitación
vorticial, congelación a -80ºC durante 7 días, centrifugación a
2500 rpm durante 20 minutos, y filtración a través de filtros de 0,2
\mum, 0,45 \mum y 0,8 \mum. Las vesículas se titularon antes
y después de someterlas a cada uno de los ensayos físicos, y los
resultados se presentan a continuación en la Tabla 7.
Estos resultados indicaban que la infectividad
de las vesículas era robusta desde el punto de vista físico, cuando
se sometían a fenómenos cotidianos tales como congelación, agitación
vorticial y centrifugación. Es interesante señalar que la
infectividad aumenta considerablemente tras la agitación vorticial,
debido quizás a que esta forma de agitación rompe algún tipo de
adherencia o aglomeración de las vesículas. La filtrabilidad de la
infectividad apoya la idea de que hay alguna tendencia de las
vesículas a aglomerarse.
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\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 8 presenta los resultados de un
experimento en el que se vacunaron hámsteres con
VRP-F/HN o con sobrenadantes de células BHK
infectadas con VRP-F/HN (vesículas). Las
VRP-F/HN se administraron en 1, 2 o 3 inoculaciones.
Ver la Tabla 8. Las vesículas se administraron 1, 2 o 3 veces por
vía intranasal. Estas dosis se indican en la Tabla 8 como 1.ª dosis
a 2,8x10^{4}, 2.ª dosis a 2,6x10^{3}, y 3.ª dosis a 1x10^{5}
UFS. Todos los animales fueron sometidos a exposición con
1x10^{6} LogTCID_{50} del virus PIV3 a las 7 semanas después de
la inmunización inicial, y se analizó la replicación vírica en las
vías respiratorias. Los datos se notificaron como promedio \pm
ETM (n=4-6).
Los resultados de la Tabla 8 demostraron que los
hámsteres inmunizados con replicones de VRP-F/HN
necesitaban tres dosis para generar el mismo título de IH en
comparación con los hámsteres inmunizados con células BHK
infectadas con VRP-F/HN (vesículas), que sólo
necesitaban dos dosis. Es más, dos dosis de vesículas eran
suficientes para eliminar el virus de las LRT y las URT, mientras
que los hámsteres inmunizados con dos dosis de replicones de
VRP-F/HN sólo presentaban eliminación en las LRT.
(Véase la Tabla 8).
Dado que dos dosis parecían constituir la dosis
óptima para la protección de los animales cuando se utilizaban
VRP-F/HN (vesículas), se investigó la vía óptima de
administración para la protección total en hámsteres. En este grupo
de estudios, que se muestran en la Tabla 9, se inmunizaron hámsteres
con dos dosis de vesículas que contenían la misma concentración de
proteína HN (0,58 ng) (para sobrenadantes de células infectadas con
VRP-HN, o VRP-F/HN) y/o la misma
concentración de proteína F (0,21 ng) (para sobrenadantes de células
infectadas con VRP-F, o VRP-F/HN)
por vía intranasal (IN) o por vía intramuscular (IM). Todos los
medios de inoculación contenían 0 UFS, excepto los sobrenadantes
del cultivo infectado con VRP-F/HN, que contenía
actividades de vesículas infecciosas equivalentes a 7000 UFS por
dosis. Véase la Tabla 9. A continuación los animales fueron
sometidos a exposición por vía intranasal con 1x10^{5}
LogTCID_{50} del virus PIV3 a las 7 semanas después de la última
inmunización, y se analizaron la replicación vírica en las vías
respiratorias y los títulos de neutralización. Los datos se
notificaron como promedio \pm ETM (n=4-6).
Los resultados demostraron que las células BHK
infectadas con VRP-F/HN (vesículas) administradas
por vía intranasal eliminaban el virus tanto de las vías
respiratorias superiores como de las vías respiratorias inferiores,
pero que cuando se administraban solamente por vía intramuscular
eliminaban solamente el virus de las vías respiratorias inferiores
(LRT). Los animales inmunizados con sobrenadantes procedentes de
células infectadas con replicones que contenían
VRP-HN, o VRP-F, o
VRP-HN+VRP-F no eliminaron el virus
de las LRT ni de las URT.
Los expertos en la materia apreciarán, o podrán
determinar utilizando simplemente los procedimientos experimentales
habituales, muchos equivalentes a las formas de realización
específicas de la invención descritas en la presente memoria. Las
reivindicaciones adjuntas tienen por objeto comprender dichos
equivalentes.
<110> WYETH
\hskip1cm Kovacs, Gerald R._
\hskip1cm Mo, Xiaoyan "Annie"
\hskip1cm vasilakis, Nikolaos
\hskip1cm Bhargava, Sangeeta
\hskip1cm Zamb, Timothy Joseph
\hskip1cm udem, Stephen Alexander
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Composiciones inmunógenas del virus
paragripal humano de tipo 3 (PIV3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> AM101287L1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Se debe asignar
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-06-05
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13453
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Esta secuencia es una secuencia
quimérica de las secuencias del virus de la encefalitis equina
venezolana y las secuencias del virus paragripal de tipo 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2492
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteínas no estructurales del virus
de la encefalitis equina venezolana 1 a 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 539
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia de la proteína de fusión
(F) del virus paragripal de tipo 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 572
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> <213> Secuencia de la
proteína HN del virus paragripal de tipo 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (51)
1. Molécula aislada de ácido nucleico
recombinante que codifica una replicasa del virus de la encefalitis
equina venezolana, una glucoproteína F del virus paragripal de tipo
3, y una glucoproteína HN del virus paragripal de tipo 3.
2. Molécula aislada de ácido nucleico
recombinante según la reivindicación 1, que presenta la secuencia de
ácido nucleico representada en la SEC. ID nº 1.
3. Composición inmunógena que comprende una
población de partículas con replicón del virus (VRP) de la
encefalitis equina venezolana que comprenden genes de la replicasa
del virus de la encefalitis equina venezolana, proteínas de la
replicasa del virus de la encefalitis equina venezolana,
glucoproteína E1 del virus de la encefalitis equina venezolana,
glucoproteína E2 del virus de la encefalitis equina venezolana, gen
de la glucoproteína F del virus paragripal de tipo 3, y gen de la
glucoproteína HN del virus paragripal de tipo 3.
4. Composición inmunógena según la
reivindicación 3, en la que dichas partículas con replicón del virus
de la encefalitis equina venezolana provocan efectos citopáticos
cuando se utilizan para infectar las monocapas de las células
cultivadas BHK.
5. Composición inmunógena según la
reivindicación 4, en la que los sobrenadantes de las células
infectadas con dichas partículas con replicón provocan, cuando se
transfieren a las monocapas de células no infectadas, dichos
efectos citopáticos en ausencia de dichas partículas con
replicón.
6. Composición inmunógena según la
reivindicación 5, en la que dicha población no contiene el virus de
la encefalitis equina venezolana detectable que puede
replicarse.
7. Composición inmunógena según la
reivindicación 3, en la que la parte de ácido nucleico del replicón
presenta la secuencia de ácido nucleico representada en la SEC. ID
nº 1;
en la que dicha población no contiene el virus
de la encefalitis equina venezolana detectable que puede
replicarse;
y en la que los sobrenadantes de las células
infectadas con dichas partículas con replicón provocan, cuando se
transfieren a las monocapas de las células no infectadas, dichos
efectos citopáticos en ausencia de dichas partículas con
replicón.
8. Composición inmunógena según la
reivindicación 6 ó 7, en la que dichas partículas con replicón del
virus de la encefalitis equina venezolana generan una respuesta
inmunitaria protectora en un hospedador mamífero.
9. Composición inmunógena según la
reivindicación 8, en la que dichas partículas con replicón provocan
un efecto citopático cuando se utilizan para infectar las monocapas
de las células BHK cultivadas.
10. Composición inmunógena según la
reivindicación 3,
en la que dicha población no contiene el virus
de la encefalitis equina venezolana detectable que puede
replicarse;
en la que los sobrenadantes de células
infectadas con dichas partículas con replicón provocan, cuando se
transfieren a las monocapas de las células no infectadas, efectos
citopáticos en ausencia de dichas partículas con replicón;
y en la que dichas partículas con replicón del
virus de la encefalitis equina venezolana generan una respuesta
inmunitaria protectora en un hospedador mamífero.
11. Composición inmunógena según la
reivindicación 10, en la que dicha respuesta inmunitaria protectora
previene la infección del tracto respiratorio inferior por el virus
paragripal de tipo 3 en un hospedador mamífero.
12. Composición inmunógena según la
reivindicación 10, en la que dicha respuesta inmunitaria protectora
reduce la gravedad de la infección del tracto respiratorio superior
por el virus paragripal de tipo 3 en un hospedador mamífero.
13. Composición inmunógena según la
reivindicación 10, en la que dicha replicasa del virus de la
encefalitis equina venezolana, dicha glucoproteína F del virus
paragripal de tipo 3, y dicha glucoproteína HN del virus paragripal
de tipo 3 están codificadas por el ácido nucleico representado en la
SEC. ID nº 1.
14. Composición inmunógena según la
reivindicación 10, en la que dicha replicasa del virus de la
encefalitis equina venezolana, dicha glucoproteína F del virus
paragripal de tipo 3, y dicha glucoproteína HN del virus paragripal
de tipo 3 comprenden las secuencias de aminoácidos presentadas en la
SEC. ID nº 2; la SEC. ID nº 3, y la SEC. ID nº 4.
15. Composición inmunógena que comprende una
población de partículas con replicón del virus (VRP) de la
encefalitis equina venezolana que comprenden genes de la replicasa
del virus de la encefalitis equina venezolana, proteínas de la
replicasa del virus de la encefalitis equina venezolana,
glucoproteína E1 del virus de la encefalitis equina venezolana,
glucoproteína E2 del virus de la encefalitis equina venezolana, y
por lo menos un gen de glucoproteína de paramixovirus;
en la que dicha población no contiene el virus
de la encefalitis equina venezolana detectable que puede
replicarse;
y en la que los sobrenadantes de células
infectadas con dichas partículas con replicón provocan, cuando se
transfieren a las monocapas de las células no infectadas, los
efectos citopáticos en ausencia de dichas partículas con
replicón;
para su utilización en la inmunización de un
mamífero contra la infección del tracto respiratorio causada por un
paramixovirus.
16. Composición según la reivindicación 15, en
la que dicho paramixovirus es el virus paragripal de tipo 3.
17. Composición según la reivindicación 16, en
la que dicha glucoproteína es la glucoproteína de
hemaglutinina-neuraminidasa (HN) del virus
paragripal de tipo 3.
18. Composición según la reivindicación 16, en
la que dicha glucoproteína es la glucoproteína de fusión (F) del
virus paragripal de tipo 3.
19. Composición según la reivindicación 15, en
la que dicha glucoproteína incluye ambas glucoproteínas HN y F del
virus paragripal de tipo 3.
20. Composición según la reivindicación 15, en
la que dicho paramixovirus es el virus respiratorio sincicial.
21. Composición según la reivindicación 15, en
la que dicha glucoproteína es la glucoproteína de adhesión (G) del
virus respiratorio sincicial.
22. Composición según la reivindicación 15, en
la que dicha glucoproteína es la glucoproteína de fusión (F) del
virus respiratorio sincicial.
23. Composición según la reivindicación 15, en
la que dicha glucoproteína incluye tanto la glucoproteína G como la
glucoproteína F del virus respiratorio sincicial.
24. Composición inmunógena según la
reivindicación 3,
en la que dicha población no contiene el virus
de la encefalitis equina venezolana que puede replicarse;
y en la que los sobrenadantes de las células
infectadas con dichas partículas con replicón provocan, cuando se
transfieren a las monocapas de células no infectadas, los efectos
citopáticos en ausencia de dichas partículas con replicón;
para su utilización en la inmunización de un
mamífero contra la infección causada por el virus paragripal de
tipo 3.
25. Composición inmunógena que comprende una
población de vesículas autopropagantes que comprenden los genes de
la replicasa del virus de la encefalitis equina venezolana,
proteínas de la replicasa del virus de la encefalitis equina
venezolana, gen de la glucoproteína F del virus paragripal de tipo
3, glucoproteína F del virus paragripal de tipo 3, gen de la
glucoproteína HN del virus paragripal de tipo 3 y glucoproteína HN
del virus paragripal de tipo 3.
26. Composición inmunógena según la
reivindicación 25, en la que dichas vesículas autopropagantes
provocan efectos citopáticos cuando se utilizan para infectar las
monocapas de las células BHK cultivadas.
27. Composición inmunógena según la
reivindicación 26, en la que los sobrenadantes de las células
infectadas con dichas vesículas autopropagantes provocan, cuando se
transfieren a las monocapas de las células no infectadas, dichos
efectos citopáticos en ausencia de dichas partículas con
replicón.
28. Composición inmunógena según la
reivindicación 4 ó 26, en la que dicho efecto citopático en las
células BHK cultivadas es la formación de sincicios.
29. Composición inmunógena según la
reivindicación 4 ó 26, en la que dicho efecto citopático en las
células BHK cultivadas es la alteración de la monocapa.
30. Composición inmunógena según la
reivindicación 4 ó 26, en la que dicha población no contiene el
virus de la encefalitis equina venezolana detectable que puede
replicarse.
31. Composición inmunógena según la
reivindicación 26, en la que dichas vesículas autopropagantes se
obtienen a partir del sobrenadante de las células infectadas con
una población de partículas con replicón del virus (VRP) de la
encefalitis equina venezolana, en la que dichas partículas con
replicón comprenden genes de la replicasa del virus de la
encefalitis equina venezolana, proteínas de la replicasa del virus
de la encefalitis equina venezolana, glucoproteína E1 del virus de
la encefalitis equina venezolana, glucoproteína E2 del virus de la
encefalitis equina venezolana, gen de la glucoproteína F del virus
paragripal de tipo 3, gen de la glucoproteína HN del virus
paragripal de tipo 3.
32. Composición inmunógena según la
reivindicación 25, en la que dichas vesículas autopropagantes se
obtienen a partir del sobrenadante de las células infectadas con
una población de partículas con replicón del virus (VRP) de la
encefalitis equina venezolana, comprendiendo dichas partículas con
replicón los genes de la replicasa del virus de la encefalitis
equina venezolana, proteínas de la replicasa del virus de la
encefalitis equina venezolana, glucoproteína E1 del virus de la
encefalitis equina venezolana, glucoproteína E2 del virus de la
encefalitis equina venezolana, un gen de la glucoproteína F del
virus paragripal, y un gen de la glucoproteína HN del virus
paragripal;
y en la que dicha población de vesículas
autopropagantes no contiene el virus de la encefalitis equina
venezolana que puede replicarse.
33. Composición inmunógena según la
reivindicación 32, en la que dicha población de vesículas
autopropagantes provoca un efecto citopático cuando se utiliza para
infectar las monocapas de las células BHK cultivadas.
34. Composición inmunógena según la
reivindicación 33, en la que los sobrenadantes de las células
infectadas con dicha población de vesículas autopropagantes
provocan, cuando se transfieren a las monocapas de las células no
infectadas, dichos efectos citopáticos en ausencia de dichas
partículas con replicón.
35. Composición inmunógena según la
reivindicación 34, en la que dichas vesículas autopropagantes
generan una respuesta inmunitaria protectora en un hospedador
mamífero.
36. Composición inmunógena según la
reivindicación 35, en la que dicha respuesta inmunitaria protectora
previene la infección del tracto respiratorio inferior por el virus
paragripal de tipo 3 en un hospedador mamífero.
37. Composición inmunógena según la
reivindicación 35, en la que dicha respuesta inmunitaria protectora
reduce la gravedad de la infección del tracto respiratorio superior
por el virus paragripal de tipo 3 en un hospedador mamífero.
38. Composición inmunógena según la
reivindicación 10 ó 35, que comprende además un portador
farmacéuticamente aceptable.
39. Composición inmunógena según la
reivindicación 10 ó 35, que comprende además un adyuvante.
40. Composición inmunógena según la
reivindicación 35, en la que dichas proteínas de la replicasa del
virus de la encefalitis equina venezolana, glucoproteína F del
virus paragripal de tipo 3, y glucoproteína HN del virus paragripal
de tipo 3 presentan las secuencias de aminoácidos representadas en
la SEC. ID nº 2, la SEC. ID nº 3 y la SEC. ID
nº 4.
nº 4.
41. Composición inmunógena que comprende una
población de vesículas autopropagantes que comprenden genes de la
replicasa del virus de la encefalitis equina venezolana, proteínas
de la replicasa del virus de la encefalitis equina venezolana, un
gen de la glucoproteína F del virus paragripal, una glucoproteína F
del virus paragripal, un gen de la glucoproteína HN del virus
paragripal y una glucoproteína HN del virus paragripal;
en la que dichas vesículas autopropagantes se
obtienen a partir del sobrenadante de células infectadas con una
población de partículas con replicón del virus (VRP) de la
encefalitis equina venezolana, comprendiendo dichas partículas con
replicón los genes de la replicasa del virus de la encefalitis
equina venezolana, proteínas de la replicasa del virus de la
encefalitis equina venezolana, glucoproteína E1 del virus de la
encefalitis equina venezolana, glucoproteína E2 del virus de la
encefalitis equina venezolana, un gen de la glucoproteína F del
virus paragripal, un gen de la glucoproteína HN del virus
paragripal;
en la que dicha población no contiene el virus
de la encefalitis equina venezolana que puede replicarse;
y en la que los sobrenadantes de las células
infectadas con dichas vesículas autopropagantes provocan, cuando se
transfieren a las monocapas de las células no infectadas, los
efectos citopáticos en ausencia de dichas partículas con
replicón;
para su utilización en la inmunización de un
mamífero contra la infección del tracto respiratorio causado por un
paramixovirus.
42. Composición según la reivindicación 41, en
la que dicho virus paragripal se selecciona de entre el grupo
constituido por virus paragripal de tipo 1, virus paragripal de tipo
2, virus paragripal de tipo 3, y virus paragripal de tipo 4.
43. Composición según la reivindicación 42, en
la que dicha glucoproteína HN es la glucoproteína de
hemaglutinina-neuraminidasa (HN) del virus
paragripal de tipo 3.
44. Composición según la reivindicación 42, en
la que dicha glucoproteína F es la glucoproteína de fusión (F) del
virus paragripal de tipo 3.
45. Composición según la reivindicación 41, en
la que dicha glucoproteína incluye ambas glucoproteínas HN y F del
virus paragripal de tipo 3.
46. Composición inmunógena según la
reivindicación 32, en la que los sobrenadantes de las células
infectadas con dichas vesículas autopropagantes provocan, cuando se
transfieren a las monocapas de las células no infectadas, los
efectos citopáticos en ausencia de dichas partículas con replicón,
para su utilización en la inmunización de un mamífero contra la
infección del tracto respiratorio causada por un paramixovirus.
47. Composición según la reivindicación 15, 24,
41 ó 46, en la que dicha infección está en el tracto respiratorio
inferior.
48. Composición según la reivindicación 15, 24,
41 ó 46, en la que dicha infección está en el tracto respiratorio
superior.
49. Composición según la reivindicación 24 ó 46,
en la que dicha composición inmunógena se administra dos veces.
50. Composición según la reivindicación 24 ó 46,
en la que dicha composición inmunógena se administra tres
veces.
51. Composición inmunógena según la
reivindicación 32, en la que dichas proteínas de la replicasa del
virus de la encefalitis equina venezolana, glucoproteína F del
virus paragripal de tipo 3, y glucoproteína HN del virus paragripal
de tipo 3 presentan las secuencias de aminoácidos representadas en
la SEC. ID nº 2, la SEC. ID nº 3 y la SEC. ID nº 4;
y en la que los sobrenadantes de las células
infectadas con dichas vesículas autopropagantes provocan, cuando se
transfieren a las monocapas de las células no infectadas, efectos
citopáticos en ausencia de dichas partículas con replicón; para su
utilización en la inmunización de un mamífero contra la infección
por el virus paragripal de tipo 3.
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