ES2305912T3 - Medio para detectar microbios objetivo en una muestra. - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar la presencia o ausencia de un microbio objetivo en una muestra líquida biológica o medioambiental que comprende la etapa de equilibración térmica de dicha muestra líquida con un medio de detección específico para un microbio objetivo que tiene un indicador de nutriente que puede alterar una característica detectable de la muestra si dicho microbio objetivo está presente en dicha muestra hasta una temperatura de incubación en un baño de agua antes de colocar dicha muestra líquida en un incubador seco y monitorizar la muestra para determinar si está alterada dicha característica detectable.
Description
Medio para detectar microbios objetivo en una
muestra.
Esta solicitud es una continuación en parte de
Ehrenfeld et al., documento U.S. número de serie 08/334.788,
presentada el 4 de noviembre de 1994, con título "Medio para
detectar microbios objetivo en una muestra".
Esta invención se encuentra en el campo de la
química, la biología y la microbiología y se refiere a medios
novedosos para detectar la presencia de microbios objetivo en una
muestra de un material posiblemente contaminado.
Los microorganismos están presentes de manera
ubicua en especímenes biológicos y medios ambientales adecuados para
su crecimiento. Sin embargo, algunos demuestran ser nocivos para los
organismos superiores y los medios para detectar su presencia son
importantes para preservar la salud pública. Están disponibles
muchos medios para detectar diversos tipos de microorganismos, que
ofrecen diversas ventajas con respecto a su velocidad y
especificidad.
Todos los microorganismos tienen ciertas
necesidades para su crecimiento y reproducción. En general, los
microorganismos requieren la presencia de lo siguiente para su
crecimiento: una fuente de energía tal como la luz o compuestos de
carbono; y una fuente de materias primas incluyendo carbono,
nitrógeno, azufre y fósforo así como cantidades traza de otros
minerales. Además, los microorganismos deben estar presentes en un
entorno adecuado en el que se mantengan una temperatura, un pH, una
salinidad y una concentración de oxígeno apropiados.
Un procedimiento común usado para detectar la
presencia de microorganismos supone añadir un espécimen a un medio
de cultivo que contiene todos los elementos necesarios para mantener
el crecimiento. La muestra puede ser natural o pretratarse, tal
como mediante filtración de membrana, antes de añadirse al medio de
cultivo. El medio puede contener o no productos químicos tales como
agentes antimicrobianos o antibióticos que suprimen el crecimiento
de microorganismos distintos al microorganismo objetivo.
Normalmente, se esterilizan estos medios de cultivo para garantizar
que no hay interferencia de microbios contaminantes y normalmente se
requiere un periodo de incubación bastante largo de desde
veinticuatro hasta cuarenta y ocho horas para que crezcan los
microbios hasta concentraciones detectables. Adicionalmente, una vez
que se detecta el crecimiento en estos procedimientos, debe
identificarse el microorganismo objetivo usando una o más pruebas
específicas para una variedad de características físicas o
bioquímicas únicas de los microbios objetivo. Por tanto, estos
procedimientos requieren mucha mano de obra y llevan mucho
tiempo.
Se han realizado esfuerzos para simplificar y
acelerar el procedimiento de detección. Entre estos esfuerzos, se
han hecho intentos para medir subproductos metabólicos específicos
de microorganismos individuales. Estos métodos incluyen: ensayos de
impedancia eléctrica, ensayos de ATP, ensayos basados en anticuerpos
y ensayos de sustratos marcados con carbono 14. También se han
usado indicadores del crecimiento microbiano para monitorizar el
crecimiento de microbios objetivo que cambian de color sólo después
de detectarse el crecimiento del microbio objetivo. Estos
indicadores normalmente reaccionan químicamente con un subproducto
metabólico producido por los microbios objetivo dando como
resultado un cambio de color en el medio. Los ejemplos de productos
químicos que cambian de color en presencia de cambios de pH
asociados con el crecimiento incluyen rojo de fenol, azul de
bromocresol y rojo neutro. Por ejemplo, Golber, patente
estadounidense número 3.206.317 usa rojo de fenol, un producto
químico que cambia de color en presencia de productos de desecho
ácidos producidos por el microbio objetivo. Berger et al.
patente estadounidense número 3.496.066 describe el uso de
compuestos que las bacterias convierten en colorantes, por ejemplo,
tropinonas y dioxanos, Bochner, patente estadounidense número
4.129.483 describe el uso de una sustancia no biodegradable
(tetrazolio) que se reduce químicamente para producir un cambio de
color. En todos estos ejemplos, el indicador es un compuesto que no
sirve como fuente de un nutriente requerido.
Edberg, patente estadounidense número 4.925.789
describe el uso de un indicador de nutriente que no sólo sirve como
fuente de nutrientes, sino que también cambia de color al
metabolizarse. La patente proporciona un medio que contiene un
indicador de nutriente que, cuando lo metaboliza una bacteria
objetivo, libera un resto que confiere un color u otro cambio
detectable al medio. El procedimiento se aprovecha de una
especificidad enzimática única para una especie o grupos de
bacterias particulares. Sugiere el uso de antibióticos para
seleccionar el crecimiento de los microorganismos seleccionados
como objetivo y proporciona ejemplos específicos de ensayos basados
en líquidos. Otros métodos usados previamente tales como Kilian
et al., Acta. Path. Microbiol. Scand. Secc. B \NAK7
271-276 (1979) y Damare et al., J. Food
Science 50:1736 (1985) informan sobre el uso de medios basados en
agar sin antibióticos.
En particular se conoció a partir de los
documentos
- D1 WO 94/20638 A, Berg, James, D.
- D2 EP A 0 574 977, Berg, James D.
- D3 WO 91/18111 A, los miembros del consejo rector de la Universidad de California
- D4 WO 89/101940 A, Biogen Inc
- D5 EP A 0 058 428, Eisai Co., Ltd.
- D6 US A 5 354 663, Charm Stanley e. et al.
- D7 US A 4.315.907, Fridlender et al.
- D8 UA A 4.088.746, Blakemore Judith I. et al.
el uso de un baño de agua para
llevar muestras y medios al equilibrio
térmico.
En particular, el documento WO 94/20638 se
refiere a un sistema rápido de detección de bacterias coliformes,
el documento EP 0 574 977 se refiere a un método directo para
detectar niveles muy bajos de contaminación por bacterias
coliformes, el documento WO 91/18111 se refiere a un método mejorado
y novedoso para la determinación de E. coli en agua, el
documento WO 89/01940 da a conocer secuencias de ADN, moléculas de
ADN recombinante y procedimientos para producir proteínas T4
solubles, el documento EP 0 058 428 da a conocer un método para
medir sustancias mediante inmunoensayo enzimático en recipientes de
prueba para llevar a cabo este método, el documento US 5.354.663
sugiere un kit de prueba y método para la detección de fármacos
antimicrobianos a bajas concentraciones en una muestra y un envase
de prueba, el documento US 4.315.907 se refiere a ensayos de unión
específicos heterogéneos combinados y el documento US 4.088.746
proporciona un método para el radioinmunoensayo de la hormona
estimulante de la tiroides que utiliza una versión rápida y
conveniente de un procedimiento de anticuerpo doble.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se caracteriza por un
método con un medio que permite la detección de la presencia o
ausencia de un microbio objetivo en una muestra líquida biológica o
medioambiental en el plazo de tan sólo 18 a 24 horas. Por ejemplo,
pueden detectarse Escherichia coli y otras bacterias
coliformes en el plazo de aproximadamente 18 horas desde el inicio
del periodo de incubación con gran especificidad. Por tanto, el
presente medio se diferencia de los medios anteriores en que se
requieren aproximadamente 24 horas para obtener un resultado de la
prueba para E. coli. Puede prepararse un medio de este tipo
usando cantidades variables tanto de los nutrientes como de los
indicadores de crecimiento. En particular, la invención proporciona
un método para detectar la presencia o ausencia de un microbio
objetivo en una muestra líquida biológica o medioambiental que
comprende la etapa de equilibración térmica de dicha muestra líquida
con un medio de detección específico para un microbio objetivo que
tiene un indicador de nutriente que puede alterar una característica
detectable de la muestra si dicho microbio objetivo está presente
en dicha muestra hasta una temperatura de incubación en un baño de
agua antes de colocar dicha muestra líquida en un incubador seco y
monitorizar la muestra para determinar si está alterada dicha
característica detectable.
Otras características de los medios incluyen el
uso de piruvato de sodio para ayudar en la recuperación de bacterias
dañadas metabólicamente, el uso de menos cloruro de sodio y la
provisión de otros metabolitos en cantidades adecuadas.
El medio contiene una cantidad eficaz de
vitaminas, aminoácidos, oligoelementos y sales que pueden mantener
la viabilidad y la reproducción del microbio objetivo en presencia
de un indicador de nutriente. Los medios que han demostrado ser
óptimos en esta invención para la detección de E. coli y las
bacterias coliformes totales en una muestra incluyen una fuente de
iones amonio (por ejemplo, a una concentración final de la muestra
de sulfato de amonio de aproximadamente 4,5 a 5,5 g/litro), un
tampón (por ejemplo, ácido libre de HEPES de aproximadamente 6,0 a
7,5 g/litro y sal sódica de HEPES de 4,7 a 5,8 g/litro), ácido
D-glucónico de aproximadamente 0,13 a 0,16 g/litro,
una fuente de sulfito (por ejemplo, sulfito de sodio de
aproximadamente 0,036 a 0,044 g/litro), un agente antifúngico (por
ejemplo, anfotericina B de aproximadamente 0,0009 a 0,0011 g/litro),
una fuente de iones magnesio (por ejemplo, sulfato de magnesio de
aproximadamente 0,09 a 0,11 g/litro), un indicador de nutriente
(por ejemplo,
orto-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido
(ONPG) de aproximadamente 0,450 a 0,550 g/litro y
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido
(MUG) de aproximadamente 0,067 a 0,085 g/litro), una fuente de iones
zinc (por ejemplo, sulfato de zinc de aproximadamente 0,00045 a
0,00055 g/litro) y una fuente de iones manganeso (por ejemplo,
sulfato de manganeso de aproximadamente 0,00045 a 0,00055
g/litro).
Además, se proporcionan los siguientes
componentes en las siguientes cantidades mínimas. Las cantidades
máximas u óptimas de cada componente pueden ser varias veces (por
ejemplo, 3-10 o incluso 20 veces) superiores a las
proporcionadas a continuación. Específicamente, un medio de este
tipo tendrá un contenido de nitrógeno total de al menos
aproximadamente 1,1 a 1,7 g/litro. Se proporcionan los aminoácidos
requeridos para el crecimiento del microbio objetivo. No deben
proporcionarse todos los aminoácidos y puede variar la cantidad
relativa de cada uno. Los expertos en la técnica reconocerán que
pueden usarse fuentes naturales de tales aminoácidos en vez de
fuentes puras. Los aminoácidos pueden proporcionarse a partir de una
variedad de fuentes. Normalmente, sólo deben proporcionarse los
aminoácidos esenciales que no pueden sintetizarse de forma endógena
por los microbios objetivo. Éstos pueden proporcionarse a partir de
fuentes naturales (por ejemplo, extractos de microorganismos
completos) como mezclas o en forma purificada. Las mezclas naturales
pueden contener cantidades variables de tales aminoácidos y
vitaminas (véase a continuación). Para orientación general, se
indican a continuación cantidades específicas de tales aminoácidos
y vitaminas. Estas cantidades son sólo para orientación y no son
limitativas en esta invención. Los expertos en la técnica
reconocerán que pueden usarse muchas combinaciones diferentes de
aminoácidos y vitaminas en los medios de esta invención. Las listas
proporcionadas a continuación ponen como ejemplo sólo un ejemplo de
este tipo. Los contenidos en aminoácidos incluyen preferiblemente al
menos lo siguiente en cantidades de al menos aproximadamente las
cantidades indicadas: alanina (0,025 g/litro), arginina (0,03
g/litro), ácido aspártico (0,056 g/litro), ácido glutámico
(0,1 g/litro), glicina (0,015 g/litro), prolina (0,09 g/litro), cistina (0,002 g/litro), histidina (0,006 g/litro), isoleucina (0,01 g/litro), leucina (0,03 g/litro), lisina (0,03 g/litro), metionina (0,01 g/litro), fenilalanina (0,018 g/litro), serina (0,029 g/litro), treonina (0,018 g/litro), triptófano (0,003 g/litro), tirosina (0,0064 g/litro) y valina (0,023 g/litro).
(0,1 g/litro), glicina (0,015 g/litro), prolina (0,09 g/litro), cistina (0,002 g/litro), histidina (0,006 g/litro), isoleucina (0,01 g/litro), leucina (0,03 g/litro), lisina (0,03 g/litro), metionina (0,01 g/litro), fenilalanina (0,018 g/litro), serina (0,029 g/litro), treonina (0,018 g/litro), triptófano (0,003 g/litro), tirosina (0,0064 g/litro) y valina (0,023 g/litro).
Se incluyen otros compuestos inorgánicos para
ayudar en el crecimiento del microbio objetivo. Éstos incluyen los
siguientes (hasta el grado aún no proporcionado en las fuentes
anteriores de diversas entidades químicas): hierro (por ejemplo, al
menos aproximadamente 0,00165 \mug/l), calcio (por ejemplo, al
menos aproximadamente
0,0003 g/litro), fosfato (por ejemplo, al menos aproximadamente 0,1 g/litro), potasio (por ejemplo, al menos aproximadamente 0,007 g/litro, de manera preferible aproximadamente 0,05 g/litro), sodio (por ejemplo, al menos aproximadamente 0,03 g/litro) y cantidades traza de cobalto, cobre, plomo, magnesio, manganeso, cloruro, estaño y zinc.
0,0003 g/litro), fosfato (por ejemplo, al menos aproximadamente 0,1 g/litro), potasio (por ejemplo, al menos aproximadamente 0,007 g/litro, de manera preferible aproximadamente 0,05 g/litro), sodio (por ejemplo, al menos aproximadamente 0,03 g/litro) y cantidades traza de cobalto, cobre, plomo, magnesio, manganeso, cloruro, estaño y zinc.
También se proporcionan las vitaminas requeridas
por el microbio objetivo para el crecimiento. Éstas pueden
proporcionarse en una forma pura o como parte de un medio más
complejo. Tales vitaminas pueden estar presentes en al menos las
siguientes cantidades: biotina (0,00005 mg/l), cianocobalamina
(trazas), colina (0,05 mg/l), inositol
(0,060 mg/l), ácido nicotínico (0,014 mg/l), niacina (0,00385 mg/l), PABA (0,02 mg/l), ácido fólico (0,000075 mg/l), ácido pantoténico (0,01095 mg/l), piridoxina (0,0015 mg/l), riboflavina (0,0028 mg/l), tiamina (0,0037 mg/l) y timidina (0,010 mg/l).
(0,060 mg/l), ácido nicotínico (0,014 mg/l), niacina (0,00385 mg/l), PABA (0,02 mg/l), ácido fólico (0,000075 mg/l), ácido pantoténico (0,01095 mg/l), piridoxina (0,0015 mg/l), riboflavina (0,0028 mg/l), tiamina (0,0037 mg/l) y timidina (0,010 mg/l).
Los expertos en la técnica reconocerán que
pueden proporcionarse carbono orgánico, nitrógeno, oligoelementos,
vitaminas y aminoácidos en muchas formas. Generalmente, se prefiere
tener una cantidad de vitaminas y aminoácidos al menos tan grande
como las cantidades específicas proporcionadas anteriormente, pero
los expertos en la técnica reconocerán que puede variarse la
concentración real de cada componente de modo que pueda compensarse
la reducción en la cantidad de un componente mediante un aumento en
la cantidad de otro. Esto es particularmente relevante cuando se
conocen las necesidades para el crecimiento de un microbio objetivo
particular. Pueden proporcionarse algunos componentes en cantidades
reducidas o eliminarse si se sintetizan de forma endógena por el
microorganismo objetivo. Lo más preferiblemente, la cantidad total
de tales componentes es muy superior a la cantidad total
proporcionada en el ejemplo anterior. Las cantidades del orden de
cinco a diez veces las descritas anteriormente son particularmente
eficaces para permitir la detección de microorganismos en un plazo
de un corto periodo de tiempo (18 horas) mientras se mantiene la
especificidad de detección.
Otros componentes de un medio de este tipo
incluyen antibióticos activos frente a microbios
gram-positivos que no son objetivo, antibióticos
activos frente a microbios gram-negativos que no son
objetivo, inductores de la(s) enzima(s) que
cataliza(n) el metabolismo del/de los indicador(es) de
nutriente, precursores de ADN, precursores de aminoácidos y fuentes
complementarias de potasio y fósforo.
El indicador de nutriente está presente en el
medio en una cantidad que es suficiente para mantener el crecimiento
del microbio objetivo hasta que se produce una señal característica
detectable en el medio durante el crecimiento. Juntos, los
componentes de vitamina, aminoácido, oligoelemento, sal e indicador
de nutriente permiten un crecimiento suficiente del microbio
objetivo de modo que puede observarse un cambio detectable en la
muestra en menos de aproximadamente 24 horas. El indicador de
nutriente altera una característica detectable de la muestra sólo
cuando se metaboliza por el microbio objetivo. Por lo tanto, puede
usarse para confirmar la presencia o ausencia de un microbio en la
muestra. El indicador de nutriente sólo debe metabolizarse por el
microbio objetivo en el medio. Si están presentes otros microbios
en la muestra que podrían metabolizar el indicador de nutriente,
entonces debe suprimirse su crecimiento mediante el uso de
antibióticos específicos. Además, aunque se prefiere que el
indicador de nutriente sea la única fuente del tipo específico de
nutriente para el microbio objetivo, el medio puede contener otras
fuentes de este tipo, pero en cantidades que no reducirán la
especificidad del medio. Por ejemplo, el indicador de nutriente
puede ser la única fuente de carbono para el microbio objetivo.
Alternativamente, pueden estar presentes otras fuentes de carbono
(por ejemplo, aminoácidos) que no se usan de manera preferente por
el microbio objetivo. Si se desea, puede estar presente cierta
pequeña cantidad de otra fuente de carbono que podría usarse de
manera preferente por el microbio objetivo, pero la cantidad
proporcionada es tal que no se reduce la especificidad del medio con
respecto a uno sin tal fuente de carbono.
La expresión "microbio objetivo" significa
uno o más microbios cuya presencia o ausencia va a determinarse. La
expresión puede referirse a un solo microbio (por ejemplo,
Escherichia coli, Enterococcus faecalis,
Staphylococcus aureus, Mycobacterium fortuitum y
Klebsiella pneumonia), un género de microbios, varias
especies relacionadas de microbios (por ejemplo, bacterias
coliformes), o un grupo de microbios incluso mayor que tienen una
característica común (por ejemplo, todas las bacterias
gram-negativas). La invención contempla diseñar el
medio y método aprovechándose de especificidades enzimáticas únicas
u otras características únicas para diferentes grupos, familias o
especies de microbios. Por tanto, el indicador de nutriente puede
variar dependiendo de qué microbio se selecciona como objetivo. Sin
embargo, no se pretende que la expresión "microbio objetivo"
incluya todos los microbios.
La expresión "18 horas" significa el tiempo
requerido para que aproximadamente el 95% de las muestras líquidas
que contienen sólo de aproximadamente una a diez bacterias
coliformes por 100 ml presenten un cambio característico
detectable. La temperatura, la cantidad y el tipo de inductor
enzimático presente, la cantidad de nutrientes proporcionados en el
medio y la salud relativa de las bacterias afectan todos al tiempo
de detección. La cantidad de nutrientes tales como aminoácidos,
vitaminas y oligoelementos proporcionados puede afectar a la tasa de
crecimiento del microbio objetivo, y por tanto, al tiempo de
detección. La equilibración térmica de la muestra hasta una
temperatura de incubación de aproximadamente 35ºC tras añadir el
medio puede disminuir el tiempo requerido para la detección. La
cantidad de inductor enzimático puede disminuir también el tiempo
para la detección. Los inductores enzimáticos que se encuentran en
el medio son agentes que actúan para inducir la actividad o
expresión de la enzima que metaboliza el indicador de nutriente.
Tales inductores incluyen
isopropil-\beta-D-tiogalactósido
(IPTG) que induce actividad
\beta-D-galactosidasa y
etil-\beta-D-tioglucósido
que induce actividad \beta-glucosidasa. La salud
relativa del microbio también afecta al tiempo requerido para la
detección. Por lo tanto, la adición de agentes tales como piruvato
que pueden ayudar en la recuperación de microorganismos dañados,
puede acelerar la detección. Si están presentes un gran número de
microbios objetivo en la muestra (es decir, más de 10 microbios/100
ml de muestra), también es posible una detección más rápida. En esta
invención, los medios proporcionados permiten la detección de
cantidades bajas de microbios objetivo (es decir menos de 10/100 ml)
en el periodo de tiempo de 18 a 24 horas, al menos con el 95% del
tiempo. Pueden usarse métodos convencionales para determinar tal
capacidad.
El término "medio" significa una mezcla
sólida, en polvo o líquida que contiene todos o sustancialmente
todos los nutrientes necesarios para mantener el crecimiento y la
reproducción de los microbios objetivo. Esta invención incluye tanto
medios que están esterilizados (es decir, en los que no resulta
crecimiento con la incubación del medio solo, o con un diluyente
estéril) así como medios que no son estériles.
El término "licuado" significa
sustancialmente en forma líquida, aunque también pretende incluir
muestras pulverizadas u homogeneizadas de sustancias sólidas que
tienen al menos un contenido líquido del 10%. La frase pretende
excluir un medio gelificado, tal como se forma con agar.
Los términos "medioambiental" y
"biológico" significan que se toman de o provienen de una
sustancia que puede mantener una o más formas de vida, incluyendo
algas, hongos y bacterias. Los ejemplos incluyen pero no se limitan
a aguas de recreo, aguas de mar, aguas potables, efluentes cloacales
y sustancias alimenticias.
El término "inoculación" significa en o
cerca del momento en que se mezcla la muestra biológica o
medioambiental licuada con el medio de esta invención. Pretende ser
el momento en que se mezclan juntas sustancialmente las dos
sustancias.
La expresión "cantidad eficaz" es una
cantidad dentro del intervalo que permite o fomenta el crecimiento y
la reproducción de un microorganismo objetivo en el plazo de tiempo
especificado. Es decir, una cantidad que permite que los microbios
se adapten al medio, sinteticen los constituyentes necesarios para
la reproducción y posteriormente se reproduzcan. No pretende ser
específica y puede variar dependiendo de factores tales como el
tamaño de la muestra y la concentración de los microbios objetivo.
Generalmente, la expresión indica la cantidad requerida para
detectar menos de 100 microbios objetivo por 1 ml de muestra, lo más
preferible menos de 100 microbios por 100 ml de muestra, o incluso 1
microbio por 100 ml de muestra.
Los términos "vitaminas",
"aminoácidos", "oligoelementos" y "sales" pretenden
incluir todas las moléculas, compuestos y sustancias clasificados en
cada categoría por los expertos en la técnica, ya sean orgánicos o
inorgánicos, y las categorías no pretenden excluir ninguna sustancia
que pueda ser necesaria o propicia para mantener la vida.
El término "antibiótico" significa una
molécula o péptido que evita o inhibe el crecimiento y la
reproducción de una o más especies o grupos de microbios que no son
objetivo. Los ejemplos se conocen bien en la técnica, sin embargo,
el término no pretende excluir detergentes que pueden inhibir o
evitar de manera específica o de manera no específica el crecimiento
bacteriano. Los ejemplos de antibióticos específicos que pueden ser
útiles en la invención incluyen colistina, ácido nalidíxico y
ansiomicina.
La expresión "indicador de nutriente"
significa una molécula o sustancia que contiene un resto que es una
fuente de un nutriente esencial para el microbio objetivo y un resto
que provoca o produce un cambio característico observable en el
medio o muestra. Un indicador de nutriente incluye fuentes de
nutrientes unidas a o conjugadas con cromógenos. Las fuentes de
nutrientes pueden proporcionar vitaminas, minerales (por ejemplo,
fosfato), oligoelementos, aminoácidos esenciales, o una fuente de
energía de hidratos de carbono (por ejemplo, lactosa). Las
necesidades nutricionales de un microorganismo aumentan a medida que
el microorganismo avanza desde la fase en la que los nutrientes se
acumulan para la reproducción (fase de latencia) hacia la fase
durante la cual se produce realmente la reproducción a una
velocidad relativamente rápida (fase logarítmica). En consecuencia,
los indicadores de nutriente se metabolizan de forma óptima durante
sus periodos de crecimiento, en los que producen un cambio
característico y detectable en la muestra. Preferiblemente, el
indicador de nutriente incluye un resto de nutriente y un
cromógeno. Los cromógenos incluyen cualquier resto que produce un
cambio de color observable en la región del visible o fluorescencia
cuando se excita apropiadamente mediante la fuente de energía
apropiada. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, restos
ortonitrofenilo, fenolftaleína y
4-metilumbeliferona. Aunque el indicador de
nutriente puede proporcionar la única fuente de un nutriente
esencial, pueden proporcionarse otras fuentes de tales nutrientes,
siempre que se mantenga una selectividad y sensibilidad adecuadas
del medio.
La expresión "señal característica
detectable" incluye cualquier cambio en una muestra que puede
detectarse mediante uno o más de los sentidos humanos. La expresión
incluye ejemplos tales como un cambio de color en las regiones de
longitudes de onda del visible o fuera del visible, un cambio en el
estado tal como entre sólido, líquido y gas, una emisión de gas o un
cambio de olor.
En una realización preferida, el medio incluye
suficiente piruvato de sodio para ayudar en el crecimiento de
células dañadas metabólicamente. La expresión "dañado
metabólicamente" incluye casos en los que se altera el
metabolismo celular con respecto al estado homeostático u óptimo por
una agresión externa. Los ejemplos de "daño metabólico"
incluyen casos de exposición celular a condiciones de calor, frío,
cloración o secado excesivos.
En otra realización preferida, el indicador de
nutriente altera el color del medio específico para el microbio. El
cambio de color puede ser evidente en la región de longitudes de
onda del visible, o puede ser fluorescencia que es evidente en la
región de longitudes de onda del visible tras la exposición a una
fuente externa de UV. El color generalmente resulta de la liberación
enzimática de un resto cromogénico del indicador de nutriente. Este
resto está coloreado cuando está conjugado con la parte de nutriente
del indicador de nutriente y es incoloro cuando está en forma no
conjugada (es decir, cuando ya no está conjugado con, o unido a, el
resto de nutriente). Los ejemplos de restos cromogénicos que pueden
conjugarse con un resto de nutriente incluyen, pero no se limitan a
restos de ortonitrofenilo que producen un color amarillo cuando se
liberan del indicador de nutriente, restos de fenolftaleína que
producen un color rojo cuando se liberan del indicador de nutriente,
restos de 4-metilumbeliferona que se vuelven
fluorescentes cuando se excitan a aproximadamente 366 nm cuando se
liberan del indicador de nutriente y restos de
bromo-cloro-indol que se vuelven
azules cuando se liberan del indicador de nutriente.
La expresión "medio específico para el
microbio" significa un medio que permite el crecimiento
sustancial sólo del microbio objetivo. Esto incluye medios que
contienen uno o más antibióticos específicos para inhibir el
crecimiento de microorganismos distintos al microbio objetivo e
incluye medios que contienen alternativa o adicionalmente uno o más
indicadores de nutriente que preferiblemente no los metabolizan los
microorganismos distintos al microbio objetivo en ningún grado
sustancial. El término "sustancial" tal como se usa en este
contexto, significa que el medio todavía permite la detección
específica (es decir, precisa en al menos un 95% o incluso un 98%) y
sensible (es decir, niveles de detección de al menos el 95% o
incluso el 98%) del microbio objetivo, tal como se mide mediante
procedimientos convencionales.
Aún en otra realización preferida, el microbio
es una bacteria coliforme o más específicamente el microbio
objetivo es Escherichia coli. Otras realizaciones preferidas
suponen la elección del indicador de nutriente. En una realización
preferida, el indicador de nutriente es un sustrato de
\beta-D-glucuronidasa, cuyos
ejemplos incluyen
ortonitrofenil-\beta-D-glucurónido,
\beta-naftalamida-\beta-D-glucurónido,
\alpha-naftol-\beta-D-glucurónido
y
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido.
Alternativamente, el indicador de nutriente es un sustrato de
\beta-D-galactosidasa, cuyos
ejemplos incluyen
ortonitrofenil-\beta-D-galactopiranósido
y
4-metilumbeliferil-\beta-D-galactopiranósido.
El indicador de nutriente puede ser un sustrato de
\beta-D-glucosidasa, cuyos
ejemplos incluyen
ortonitrofenil-\beta-D-glucosa.
Aún en otra realización, el indicador de nutriente puede ser un
sustrato de L-pironidonil aminopeptidasa, tal como
ortonitrofenil-\beta-L-pironidonilo,
\beta-naftalamida-\beta-L-pironidonilo,
\alpha-naftol-\beta-L-pironidonilo
y
metilumbeliferil-3-L-pironidonilo,
o el indicador de nutriente puede ser un sustrato de
L-alanina aminopeptidasa, tal como
L-alanina-\beta-L-ortonitrofenilo,
\beta-naftalamida-\beta-L-alanina,
\alpha-naftol-\beta-L-alanina
y
4-metilumbeliferil-\beta-L-alanina.
La expresión "bacteria coliforme" significa
cualquiera de un grupo de bacterias con forma de bacilo,
oxidasa-negativas, gram-negativas no
formadoras de esporas que presentan actividad
\beta-galactosidasa y normalmente habitan en el
tracto gastrointestinal de los seres humanos. El grupo incluye
Klebsiella pneumonia y Escherichia coli, cuya
presencia en el agua la entienden los expertos en la técnica como
una presunta prueba de contaminación fecal, así como Enterobacter
cloacae, Citrobacter freundii y Serratia
plymuthica.
Preferiblemente, el medio también contiene uno o
más antibióticos que evitan que microbios distintos al microbio
objetivo metabolicen el indicador de nutriente. Es decir, el medio
contiene antibióticos que son inhibidores específicos del
crecimiento de microbios distintos al microbio objetivo y evitan
eficazmente el crecimiento de al menos algunos de esos microbios. Lo
más preferiblemente, estos antibióticos actúan frente a una o más
bacterias no coliformes gram-positivas y
gram-negativas. Los ejemplos de tales agentes
antimicrobianos que pueden ser útiles frente a otras bacterias y
levaduras incluyen colistina, ácido nalidíxico, ansiomicina y
anfotericina B.
La invención se refiere a un método para
detectar la presencia o ausencia de un microbio objetivo en una
muestra líquida biológica o medioambiental, preferiblemente que
incluye la etapa de calentar la muestra hasta la temperatura de
incubación en un incubador de líquido tras añadir el medio
específico para el microbio. Lo más preferiblemente, la temperatura
de incubación es de aproximadamente 35ºC. La expresión "incubador
de líquido" significa un líquido calentado hasta una temperatura
o intervalo de temperatura especificados. Esto puede incluir
cualquier forma de baño de agua, por ejemplo. Un incubador de este
tipo es ventajoso con respecto a los incubadores de aire usados
previamente, puesto que el medio puede alcanzar una temperatura de
incubación óptima más rápido en un incubador de líquido que en un
incubador de aire.
También se describe un método para detectar la
presencia o ausencia de un microbio objetivo en una muestra líquida
biológica o medioambiental en un plazo de 24 horas. Pueden
detectarse Escherichia coli y otras bacterias coliformes
usando este método en un plazo de sólo aproximadamente 18 horas.
Este método se caracteriza en primer lugar por mezclar la muestra
con el medio de la invención, calentar la mezcla de muestra y medio
hasta una temperatura de incubación, preferiblemente de 35ºC,
durante aproximadamente 20 minutos. La muestra se transfiere
entonces a un incubador de aire, preferiblemente a 35ºC, durante
aproximadamente 18 horas. El medio incluye una cantidad eficaz de
vitaminas, aminoácidos, elementos y sales de modo que pueden crecer
y reproducirse los microbios coliformes. Además, el medio incluye
una cantidad eficaz de un indicador de nutriente para mantener el
crecimiento de las bacterias coliformes y que produce una señal
característica detectable si lo metaboliza el microbio objetivo. A
continuación, se monitoriza la muestra para determinar si se ha
alterado la característica detectable. Preferiblemente, el medio
también contiene uno o más antibióticos en una cantidad suficiente
para inhibir o evitar el crecimiento de bacterias no coliformes que
están presentes potencialmente en la muestra de prueba.
En otras realizaciones, la invención usa el
aparato descrito por Naqui et al. en el documento U.S. número
de serie 08/201.110 (documento US 5.518.892). La etapa de
cuantificación supone proporcionar una muestra biológica o
medioambiental en forma líquida. La muestra se sitúa o dispensa a la
bolsa que contiene la muestra descrita por Naqui et al., y se
mezcla con un medio para permitir y fomentar el crecimiento de
bacterias objetivo. Se incuba la mezcla y se detecta la cantidad y
calidad del cambio de color. Se comparan la cantidad y calidad
obtenidas con una serie de muestras para las que se conocía la
concentración de bacterias.
Se describe un medio optimizado para determinar
la presencia de microbios objetivo. Los microbios, por ejemplo,
bacterias, crecen mucho más rápido en este medio que en los
disponibles actualmente como resultado del aumento de las
cantidades de vitaminas y aminoácidos proporcionadas. Por lo tanto,
se dispone más rápidamente de los resultados de las pruebas. Los
rápidos resultados ahorran tiempo y dinero en el laboratorio. La
velocidad también disminuye la amenaza para la salud pública
permitiendo alertas y medidas de saneamiento tempranas para tratar
la presencia de algunos microorganismos en lugares como suministros
de agua potable y aguas de recreo. Además, el método de esta
invención generalmente no requiere pruebas de conformación puesto
que pueden usarse indicadores de nutriente específicos para el
microorganismo. Adicionalmente, la invención no requiere el uso de
un medio estéril.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las
realizaciones preferidas de la misma y a partir de las
reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
En la siguiente descripción, se hará referencia
a diversas metodologías conocidas por los expertos en las técnicas
química, biológica y microbiológica. Las composiciones, métodos y
productos de esta invención son aplicables a especímenes biológicos
y medioambientales y son útiles en las técnicas química, biológica y
microbiológica para la detección de microorganismos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los microorganismos específicos obtienen sus
nutrientes de una serie de fuentes. Sin embargo, la capacidad para
metabolizar ciertas fuentes puede ser única para un microorganismo o
grupo de microorganismos particular. Las familias, grupos o especies
de microorganismos pueden compartir la especificidad enzimática para
ciertos nutrientes que están ausentes en otros microorganismos.
Aprovechando las características metabólicas de microorganismos
específicos, es posible someter a prueba la presencia de estos
sistemas enzimáticos, y por tanto, de los microorganismos que
presentan ellos mismos estos sistemas enzimáticos. Véase Edberg,
citado anteriormente. Se han identificado muchas enzimas que son
específicas para grupos particulares de microorganismos y
probablemente se identificarán otras en el futuro.
\vskip1.000000\baselineskip
Las bacterias gram-negativas
contienen una endotoxina como parte de su membrana celular externa.
Pueden contaminar muestras medioambientales o biológicas así como
productos farmacéuticos y otras preparaciones médicas. Por tanto, es
importante tener disponibles métodos de detección eficaces para
determinar si están presentes bacterias
gram-negativas.
Algunas bacterias gram-negativas
como grupo tienen actividad de la enzima L-alanina
aminopeptidasa. Pueden usarse indicadores de nutriente tales como
L-alanina-\beta-ortonitrofenilo,
\beta-naftalamida-\beta-L-alanina,
\alpha-naftol-\beta-L-alanina
y
4-metilumbeliferil-\beta-L-alanina
en el medio como indicadores de nutriente para someter a prueba la
presencia o ausencia de bacterias gram-negativas. Se
conocen bien en la técnica antibióticos útiles para eliminar todas
las bacterias gram-positivas del medio. Por tanto,
es posible detectar la presencia de cualquier bacteria
gram-negativa usando indicadores de nutriente de
actividad L-alanina aminopeptidasa en un medio que
contiene un antibiótico que elimina bacterias
gram-positivas.
\newpage
La enzima
\beta-D-glucosidasa se encuentra
en el grupo de bacterias Enterococcus. La enzima puede
catalizar la hidrólisis de indicadores de nutriente apropiados que
contienen restos cromogénicos o fluorogénicos unidos a un
\beta-glucósido. Puede usarse esta propiedad para
indicar la presencia o ausencia de enterococos en una muestra.
Pueden usarse indicadores de nutriente tales como
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucopiranósido
para indicar la presencia de enterococos. Puede inhibirse el
crecimiento de otros microorganismos que expresan actividad
\beta-D-glucosidasa proporcionando
un medio que contiene antibióticos que mantienen el crecimiento de
aquellos microorganismos que no son objetivo pero que no inhiben
sustancialmente el crecimiento de Enterococcus. El sulfato
de amicacina, bacitracina y anfotericina B son ejemplos de tales
antibióticos. Adicionalmente, puede inhibirse el crecimiento de
otros microorganismos proporcionando un entorno de crecimiento que
tenga un pH alto de aproximadamente 9,6 o una temperatura elevada de
aproximadamente 45ºC. Los enterococos pueden crecer a estos pH alto
y temperatura elevada permitiendo la detección específica de
enterococos en esas condiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta especie puede metabolizar el fosfato de
ortonitro-fenilo. Por tanto, si el medio de
crecimiento contiene este indicador de nutriente como la única
fuente de fosfato, Staphylococcus aureus crecerá mientras que
no lo harán otros microorganismos que no pueden metabolizar el
fosfato de ortonitrofenilo. Se producirá un cambio de color por la
liberación del resto ortonitrofenilo.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta especie requiere SO_{4} como su fuente de
azufre y esta especie puede metabolizar el sulfato de fenolftaleína.
Por tanto, en un medio selectivo cuya única fuente de azufre es
sulfato de fenolftaleína, esta especie crecerá y producirá un cambio
de color característico por la liberación del resto coloreado.
\vskip1.000000\baselineskip
La enzima
\beta-D-glucuronidasa está
presente en E. coli. Los indicadores de nutriente tales como
ortonitrofenil-\beta-D-glucurónido,
\beta-naftalamida-\beta-D-glucurónido,
\alpha-naftol-\beta-D-glucurónido
o
metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido
son los ejemplos de indicadores de nutriente que pueden usarse en
un medio para la detección de E. coli. Pueden añadirse los
antibióticos vancomicina y ansiomicina para seleccionar E.
coli de las bacterias gram-positivas y levaduras
en cantidades en peso de aproximadamente el 0,0001% al 0,01%.
Edberg, patente estadounidense número 4.925.789
informa sobre un medio de crecimiento bacteriano de base líquida
que permite la detección específica de E. coli en una muestra
tras aproximadamente 24 horas de incubación. Tiene una
especificidad notificada para detectar la presencia de una UFC
(unidad formadora de colonias) en 100 ml de volumen. Sin embargo, a
diferencia de los ejemplos específicos de Edberg, la detección de
bacterias coliformes totales incluyendo bacterias tales como E.
coli puede obtenerse en aproximadamente 18 horas si se usan
otros medios o métodos descritos en esta invención y
sorprendentemente todavía puede obtenerse una especificidad para
detectar una UFC por 100 ml de volumen. Específicamente, esta
invención se caracteriza por medios que aumentan la cantidad de
vitaminas y aminoácidos presentes para facilitar el crecimiento
celular. Por ejemplo, se obtienen tiempos de detección más cortos
si se aumenta la cantidad de vitaminas y aminoácidos con respecto a
las cantidades mostradas en el medio descrito por Edberg. Un medio
que incluye los siguientes compuestos es especialmente útil para
detectar Escherichia coli permitiendo la detección en un
plazo de 24 horas debido a la tasa de crecimiento más rápida y una
especificidad excelente. Proporcionar cantidades de componente I a
niveles de 5 a 10 veces los indicados permite la detección de
Escherichia coli en un plazo de 18 horas.
Aunque se indican aminoácidos y vitaminas, así
como algunos elementos, específicos, los expertos en la técnica
reconocerán, tal como se describió anteriormente, que pueden variar
significativamente las cantidades relativas de cada componente, sin
pérdida de especificidad.
En un ejemplo más específico de un medio de esta
invención, se proporciona el componente I a diez veces la cantidad
indicada en la tabla I (+/- 10%) con el componente II. Esto se
denomina en el presente documento medio 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Un sistema de detección con indicador de
nutriente basado en enzimas tiene la especificidad para detectar
una bacteria coliforme en un volumen de 100 ml en 18 horas. Pueden
detectarse las bacterias coliformes totales monitorizando el medio
para determinar la aparición de un intenso color amarillo en el
medio de prueba tras 18 horas cuando se usa
ortonitrofenil-\beta-D-galactopiranósido
(ONPG) en el medio como fuente primaria de hidratos de carbono. La
enzima \beta-D-galactosidasa se
encuentra en todas las bacterias coliformes y actúa para catalizar
la hidrólisis de
ortonitrofenil-\beta-D-galactopiranósido.
Esta reacción es tanto irreversible como extremadamente sensible a
la presencia de bacterias coliformes. Si está presente E.
coli entre las bacterias coliformes totales, el medio se vuelve
azul fluorescente cuando se coloca una lámpara ultravioleta en la
región de 366 nm cerca de la muestra de prueba. Esta fluorescencia
se debe a la hidrólisis de
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido
(MUG) para producir el compuesto fluorescente
4-metilumbeliferona (MU) y la reacción está
catalizada por la enzima
\beta-D-glucuronidasa que se
encuentra en más del 97% de cepas de E. coli.
Puede lograrse la detección con la mayor
velocidad y el menor coste cuando se optimiza el medio para producir
la tasa de crecimiento bacteriano y la actividad enzimática más
rápidas. Adicionalmente, puede añadirse piruvato de sodio al medio
para ayudar en la recuperación y el crecimiento de bacterias dañadas
metabólicamente. Normalmente es suficiente una cantidad de
aproximadamente el 0,0005% en peso. También, la equilibración
térmica de la mezcla de muestra y medio hasta aproximadamente 35ºC
poniendo la muestra en un baño de agua a aproximadamente 35ºC
durante 20 minutos antes de colocarla en un incubador seco disminuye
significativamente el tiempo requerido para la detección.
Es importante detectar la presencia de bacterias
coliformes en el agua potable y en aguas de recreo. Si están
presentes agentes antibacterianos en el agua, puede ser útil añadir
agentes neutralizantes, tales como tiosulfato de sodio o EDTA
sódico. De otro modo, puede detectarse la presencia de bacterias
coliformes preparando la muestra según técnicas convencionales. Se
recoge una muestra de agua de 100 ml, se añade el medio de
crecimiento a la muestra, se incuba la muestra a una temperatura
propicia para el crecimiento bacteriano (que normalmente se produce
a 35ºC) y la presencia de bacterias coliformes está indicada por un
cambio en el color de la muestra tras aproximadamente 18 horas.
Puede producirse un resultado positivo en cualquier momento hasta 22
horas tras la mezcla de la muestra y el medio. Puede producirse
mucho más rápidamente en presencia de una concentración
relativamente elevada de bacterias coliformes. Puede determinarse la
presencia de una bacteria coliforme en un volumen de 100 ml usando
el medio y el procedimiento descritos en esta invención.
Se ha demostrado que numerosos sustratos que
incluyen un resto cromogénico presentan un cambio de color
característico en muestras que contienen microorganismos objetivo
que muestran actividad enzimática específica. Por ejemplo, en
presencia de
\beta-D-glucuronidasa,
ortonitrofenil-\beta-D-glucurónido
produce un cambio de color a amarillo,
4-metilumbeliferil-glucurónido
produce fluorescencia tras excitación a 366 nm y
bromo-cloro-indol-\beta-D-glucurónido
produce un cambio de color a azul cuando está presente E.
coli. En presencia de
\beta-D-galactosidasa,
ortonitrofenil-\beta-D-galactopiranósido
produce un cambio de color a amarillo y
4-metilumbeliferil-\beta-D-galactopiranósido
produce fluorescencia tras excitación a 366 nm.
Algunas combinaciones han demostrado ser
eficaces para detectar la presencia de E. coli así como
bacterias coliformes totales. Puede usarse
4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido
junto con
ortonitrofenil-\beta-D-galactopiranósido.
Si está presente cualquier bacteria coliforme, la disolución cambia
de color a amarillo en la región de longitudes de onda del visible.
Si están presentes tanto E. coli así como otras bacterias
coliformes, la disolución de muestra tanto cambia de color a
amarillo como fluoresce tras excitación a 366 nm.
Pueden producirse indicadores de nutriente
mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los
métodos generalmente se caracterizan por el acoplamiento o la
conjugación de un resto de nutriente a un resto cromogénico,
produciendo de ese modo un indicador de nutriente. Se describen
ejemplos de métodos de este tipo por Edberg en la patente
estadounidense número 4.925.789.
Los dos procedimientos convencionales y
aceptados ampliamente para evaluar la presencia de microorganismos
en el agua potable incluyen la prueba de la fermentación en tubos
múltiples acoplada con el análisis del número más probable (NMP) y
la prueba de filtración con membrana (FM). El protocolo para estos
métodos para detectar bacterias coliformes supone pruebas de
presunción acopladas con pruebas de confirmación que suelen llevar
unas 48 a 96 horas para completarse. Además, los resultados de estas
pruebas se complican por la presencia de bacterias no coliformes que
pueden producir, si están presentes en más de 500 microorganismos
por mililitro, lecturas de falso positivo o falso negativo.
La invención de la prueba COLILERT®, descrita en
Edberg, patente estadounidense número 4.925.789, constituyó un
tremendo avance con respecto a los métodos disponibles previamente.
Usando ese método, es posible detectar bacterias coliformes en
muestras en concentraciones de tan sólo un microorganismo por 100
mililitros de muestra. Se caracteriza por una combinación de la
etapa de presunción y la etapa de confirmación para la
identificación microbiana. Por lo tanto, la velocidad de detección
es mucho más rápida y se reducen mucho las posibilidades de obtener
lecturas de falso negativo o falso positivo puesto que están
presentes diversos agentes selectivos en el medio que limitan
enormemente el crecimiento de bacterias no coliformes. Sin embargo,
los medios de la presente invención contemplan el uso de al menos un
aumento de dos veces en la concentración de aminoácidos, vitaminas,
oligoelementos y sales con respecto a los medios usados previamente.
Sorprendentemente, este cambio en el medio produce una detección
mucho más rápida sin pérdida de especificidad.
La presente invención se comparó con los métodos
existentes para detectar bacterias coliformes y E. coli en
muestras.
Puede cuantificarse el número de microbios
objetivo presentes en una muestra líquida mezclando una muestra
líquida con el medio descrito anteriormente, poniendo la muestra
líquida que incluye el medio en recipientes adecuados para la
incubación, incubando la mezcla de muestra líquida y medio,
observando la cantidad y calidad de una señal característica
detectable y comparando la cantidad y calidad de una señal
característica detectable con los valores numéricos más probables.
Este procedimiento de cuantificación se caracteriza por comparar la
cantidad y calidad de la característica que se ha alterado,
preferiblemente un cambio de color, con los valores numéricos más
probables obtenidos a partir de muestras en las que se ha
correlacionado la concentración y el cambio característico con
muestras para las que se conoce la concentración bacteriana. Véase
por ejemplo, Compendium of Methods for the Microbiologic Examination
of Foods 3ª ed., editado por Vanderzant y Splittstoesser, 1992. La
técnica del número más probable permite obtener estimaciones de
concentraciones bacterianas que son inferiores a los límites
detectables de otros métodos. Se estima el número más probable a
partir de respuestas en las que se notifican los resultados como
positivos o negativos en una o más diluciones de la muestra. El
método requiere que no todas las muestras proporcionen un resultado
positivo y normalmente se requieren al menos tres muestras de cada
dilución. Se dispone de muchas tablas del número más probable. Una
serie de este tipo es la proporcionada por de Man, Eur. J. Appl.
Microbiol. 1:67 (1975). Pueden realizarse estimaciones del número
más probable usando la fórmula general notificada por Thomas, J. Am.
Water Works Assoc. 34:572 (1942) tal como sigue:
NMP/g = P/
(NT)
en la que P es el número de tubos
positivos, N es la cantidad total de muestra en todos los tubos
negativos y T es la cantidad total de muestra en todos los tubos.
Las cantidades se notifican en cuanto a
gramos.
Naqui et al. (en la solicitud de patente
pendiente, documento U.S. número de serie 08/201.110), documento
5.518.892, describe un método preciso para cuantificar el número de
bacterias en una muestra líquida. La invención emplea un aparato
novedoso para contener una muestra líquida. El aparato se
caracteriza por una bolsa que está diseñada para alojar una muestra
líquida y posteriormente distribuye la muestra líquida en
compartimentos separados dentro de la bolsa, de modo que pueden
someterse a prueba diferentes alícuotas de uno o más tamaños. La
invención descrita en esa solicitud permite además cuantificar los
microorganismos presentes en la muestra añadiendo un medio para
fomentar el crecimiento de microorganismos, termosellar la bolsa de
la invención durante aproximadamente cinco segundos a una
temperatura de aproximadamente 121ºC a 176ºC (de aproximadamente
250ºF a 350ºF), incubar la muestra a una temperatura apropiada
durante un periodo de tiempo apropiado para permitir el crecimiento
de microorganismos y registrar y analizar los resultados. La etapa
de cuantificación supone detectar la cantidad y calidad del cambio
de color y comparar esa cantidad y calidad con los resultados
obtenidos para una serie de muestras para las que se conocía la
concentración de bacterias viables totales.
Experimento
1
El siguiente protocolo sigue los procedimientos
de la EPA de los EE.UU. Se siguió el procedimiento para la recogida
de muestras de microorganismos dañados. Se proporciona como medio
para garantizar que se usan la toma de muestras y el cuidado de las
muestras apropiados en comparaciones de la especificidad y el tiempo
requerido para obtener un resultado para los medios de esta
invención y los medios de la técnica anterior.
- 1.
- Se obtienen 2 litros de efluente cloacal primario fresco de una fuente externa (por ejemplo, una planta de tratamiento de aguas residuales).
- 2.
- Se hace pasar el efluente a través de un filtro Whatman-40 (diámetro de 150 mm).
- 3.
- Se deja que el filtrado alcance la temperatura ambiente antes del daño con cloro.
- 4.
- Se comprueban el pH y la temperatura del efluente, luego se dispensan alícuotas de 49,5 ml a 21 vasos de poliestireno que no contienen tiosulfato de sodio.
- 5.
- Se agitan las muestras sobre una plataforma Roto-Mix 50800 (posición 2) a temperatura ambiente.
- 6.
- Se añade una alícuota de una disolución (a del 5 al 6%) de NaOCl (hipoclorito de sodio) a cada muestra a una concentración final de 5 ppm. Se comprueban inmediatamente los niveles de cloro libre y total de una muestra.
- 7.
- Se añaden 25 \mul de una disolución al 10% de tiosulfato de sodio a la primera muestra tras 2 minutos. Se añade la misma cantidad de tiosulfato de sodio a las muestras restantes a intervalos de 2 minutos tras la primera adición.
- 8.
- Se mide la concentración de cloro libre y total en el punto medio del daño y en la última muestra, justo antes de la adición de tiosulfato de sodio.
- 9.
- Se determina el número de bacterias coliformes supervivientes en cada muestra mediante filtración con membrana sobre placas mEndo y se determina la concentración original de bacterias coliformes en el efluente sin tratar mediante filtración con membrana (diluciones requeridas) sobre placas mEndo.
- 10.
- Se cuenta el número de bacterias coliformes sobre cada placa mEndo (un medio selectivo para E. coli) después de 22 a 24 horas de incubación. Se elige la muestra apropiada que ha experimentado una reducción de 2 Log 10 a 4 Log 10 en la concentración de bacterias coliformes totales y se prepara una serie de diluciones de dos veces de esta muestra. El número de diluciones realizadas depende del número de bacterias coliformes supervivientes presentes y debe permitir que haya al menos dos diluciones que no contengan bacterias coliformes.
Se diseñó este experimento para comparar el
rendimiento relativo del medio 2 y el medio de Colilert® en la
detección de la presencia de bacterias coliformes y E. coli
dañadas a partir de un efluente cloacal primario clorado. El
procedimiento seguido para comparar los dos medios incluyó inocular
en primer lugar cada muestra de efluente clorado diluido en el medio
de prueba con 1 ml de cada dilución en 3 pruebas Colilert® y 1 ml de
cada dilución en 3 pruebas con medio 2.
A continuación, se equilibraron térmicamente las
pruebas con medio 2 durante 20 minutos en un baño de agua a 35ºC +/-
0,5ºC y se pusieron las otras pruebas en un incubador seco a 35ºC
+/- 0,5ºC. Tras 20 minutos, se pusieron las pruebas con medio 2 en
el incubador seco a 35ºC. Entonces se monitorizaron el color y la
fluorescencia y se registraron los resultados a las 18 horas para el
medio 2 y a las 24 horas para el medio de Colilert®. Se cultivaron
en línea muestras con medio 2 positivas aleatorias sobre agar EMB
para el aislamiento y la identificación adicional usando API
20E.
En estos estudios se usaron siete efluentes
procedentes de cuatro sitios diferentes geográficamente, separados
en Georgia, Maine, Connecticut y California. Se inocularon un total
de 201 vasos de medio 2 y 201 de Colilert® con las diluciones del
efluente tratado. Se obtuvieron los siguientes resultados:
Un análisis mediante la prueba de
Chi-cuadrado indicó que estos valores no eran
significativamente diferentes con un índice de confianza del 95%. Se
realizó un análisis de especiación de un total de 43 muestras con
medio 2 positivas usando el kit API 20E y las 43 muestras contenían
bacterias coliformes. Estos datos muestran que el medio 2, tras 18
horas de incubación, detectó un número similar de bacterias
coliformes y E. coli dañadas que el medio de Colilert® tras
24 horas de incubación. Por lo tanto, el medio de esta invención es
tan específico como el medio de Colilert® y permite la detección de
microorganismos en 18 horas mientras que el medio de Colilert®
permite la detección en 24 horas.
Experimento
2
Se diseñó este experimento para comparar el
rendimiento del medio 2 con respecto al método del caldo de
lauril-triptosa (CLT) (referencia de la EPA) en la
detección de la presencia de bacterias coliformes y E. coli
dañadas a partir de un efluente cloacal primario clorado. Se
obtuvieron los resultados de las pruebas mediante la inoculación en
primer lugar de cada muestra diluida en el medio de prueba añadiendo
100 \mul de cada dilución en 10 tubos de medio 2 (de 10 ml cada
uno) y 100 \mul de cada dilución en 10 tubos de CLT (concentración
1x). A continuación, se equilibraron térmicamente las pruebas con
medio 2 durante 20 minutos en un baño de agua a 35ºC. Se pusieron
directamente los tubos con CLT en un incubador seco a 35ºC. Tras 20
minutos, se pusieron las pruebas con medio 2 en el incubador seco a
35ºC. Entonces se monitorizaron el color y la fluorescencia y se
registraron los resultados a las 18 horas para el medio 2. Se
cultivaron en línea muestras con medio 2 positivas aleatorias sobre
agar EMB para el aislamiento y la identificación adicional usando
API 20E. Entonces se comprobaron las muestras con CLT para
determinar la presencia de gas tras 24 y 48 horas de incubación. Si
había gas presente, se inocularon las muestras en 10 ml de CLVB
(caldo lactosado verde brillante) y 10 ml de caldo de E. coli
y 4-metilumbeliferona-glucurónido
(EC-MUG). Se incubaron los tubos con CLVB en un
incubador seco a 35ºC durante entre 24 y 48 horas. Se incubaron los
tubos con EC-MUG en un baño de agua a 44,5ºC durante
24 horas. La presencia de gas en los tubos con CLVB indica la
presencia de bacterias coliformes. La presencia de gas y
fluorescencia en los tubos con EC-MUG indica la
presencia de E. coli. El experimento se completa tras haber
finalizado la incubación de los tubos con CLVB y
EC-MUG.
En este estudio se usaron dos efluentes
procedentes de dos sitios con efluentes cloacales primarios en Maine
y California. Se compararon un total de 240 tubos de NMP con medio 2
frente a 240 tubos con CLT. Los resultados son tal como sigue:
Un análisis mediante la prueba de
Chi-cuadrado indicó que estos valores eran
significativamente diferentes con un índice de confianza del 95%. Se
realizó un análisis de especiación de un total de 46 muestras con
medio 2 positivas usando el kit API 20E y las 46 muestras contenían
bacterias coliformes. Por lo tanto, el medio 2 es mejor que el
método de CLT en la recuperación de bacterias coliformes y E.
coli dañadas a partir de un efluente cloacal primario.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento
3
Se diseñó este experimento para someter a prueba
el rendimiento del medio 2 y el medio de Colilert® en la detección
de bacterias coliformes y E. coli no dañadas en presencia de
una alta concentración de bacterias heterótrofas. Se siguió el
siguiente procedimiento. En primer lugar, se inocularon cada vaso de
prueba de 100 ml con medio 2 y Colilert® con de 1 a 10 UFC de las
siguientes bacterias: Escherichia coli ATCC 25922,
Citrobacter freundii ATCC 8090, Klebsiella pneumoniae
ATCC 13883 y Enterobacter cloacae ATCC 33457. Entonces se
repitió esta etapa con un segundo conjunto de muestras. Se inoculó
Aeromonas hydrophilia ATCC 35654, Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 10145) o Pseudomonas putrefaciens (un
aislado natural) en el segundo conjunto de vasos a un intervalo de
concentración de 16.000 a 10.000 UFC/ml. Se inocularon los vasos de
prueba con medio 2 y Colilert® con A. hydrophilia,
Pseudomonas aeruginosa o P. putrefaciens solos para
someter a prueba los resultados falsos positivos. Las pruebas con
medio 2 se equilibraron térmicamente durante 20 minutos en un baño
de agua a 35ºC y las pruebas con Colilert® se pusieron en un
incubador seco a 35ºC. Tras 20 minutos, se pusieron las pruebas con
medio 2 en el incubador seco a 35ºC. Entonces se monitorizaron el
color y la fluorescencia y se registraron los resultados a las 18
horas para el medio 2 y a las 24 horas para Colilert®.
Se obtuvieron los siguientes resultados:
Bacterias coliformes con y sin
bacterias
heterótrofas
En este estudio se realizaron un total de 36
pruebas con medio 2 y 36 de Colilert. Nueve de cada conjunto de 36
pruebas contenían E. coli.
\newpage
Bacterias heterótrofas
únicamente
En este estudio se realizaron un total de 24
pruebas con medio 2 y 24 de Colilert.
Otras realizaciones se encuentran dentro de las
siguientes reivindicaciones.
Claims (2)
1. Un método para detectar la presencia o
ausencia de un microbio objetivo en una muestra líquida biológica o
medioambiental que comprende la etapa de equilibración térmica de
dicha muestra líquida con un medio de detección específico para un
microbio objetivo que tiene un indicador de nutriente que puede
alterar una característica detectable de la muestra si dicho
microbio objetivo está presente en dicha muestra hasta una
temperatura de incubación en un baño de agua antes de colocar dicha
muestra líquida en un incubador seco y monitorizar la muestra para
determinar si está alterada dicha característica detectable.
2. El método según la reivindicación 1, en el
que dicha temperatura de incubación es de 30 a 41ºC y se mantiene
durante más de 10 minutos.
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