ES2303833T3

ES2303833T3 - Polipeptidos que contienen polimorfismos de las regiones repetidas de pertactina en bordetella pertussis, bordetella parapertussis y bordetella bronchiseptica, su uso en diagnostico y en composiciones inmunogenicas.

Info

Publication number: ES2303833T3
Application number: ES01945261T
Authority: ES
Inventors: Nicole Guiso-Maclouf; Caroline Boursaux-Eude
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 2000-05-25
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2008-09-01
Anticipated expiration: 2021-05-23
Also published as: US6964767B2; PT1284993E; US7070779B2; DE60133734T2; US20030180307A1; DK1284993T3; US7314910B2; US20020192237A1; US20060008474A1; AU2001267527A1; DE60133734D1; CY1110430T1; WO2001090143A3; US20040166116A9; WO2001090143A2; ATE393166T1; EP1284993A2; EP1284993B1; JP2003533990A

Abstract

Composición inmunogénica que comprende una mezcla de al menos dos pertactinas o fragmentos de pertactina de Bordetella bronchiseptica, en la que dichas pertactinas o fragmentos contienen al menos la región II, o tanto la región I como la región II y en la que dichas pertactinas o fragmentos difieren entre sí, en sus respectivas secuencias de aminoácidos, en al menos la región II o las regiones I y II.

Description

Polipéptidos que contienen polimorfismos de las regiones repetidas de pertactina en Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis y Bordetella bronchiseptica, su uso en diagnóstico y en composiciones inmunogénicas.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a proteínas y polipéptidos de la proteína de la membrana externa de Bordetella denominada pertactina y a los polinucleótidos que codifican para ellos. Esta invención también se refiere al uso de estas proteínas y polipéptidos en composiciones inmunogénicas, métodos de diagnóstico y kits de diagnóstico.

El género Bordetella incluye siete especies. Las especies más estudiadas son B. pertussis, B. parapertussis y B. bronchiseptica. La B. pertussis es responsable de infecciones respiratorias sólo en seres humanos. La B. parapertussis produce infecciones en seres humanos y ovejas y la B. bronchiseptica infecta muchas especies de animales, incluyendo seres humanos.

Estos patógenos producen una serie de factores de virulencia, cuya síntesis está regulada por el sistema de dos componentes, bvg AS (2, 21). Estos factores incluyen toxinas, tales como toxina de la tos ferina, que es la única toxina específica de B. pertussis, citotoxina traqueal, adenilato ciclasa-hemolisina, y adhesinas, tales como hemaglutinina filamentosa, fimbrias y pertactina (PRN).

La PRN es una proteína de la membrana externa con un peso molecular aparente de 69 kDa en B. pertussis, 70 kDa en B. parapertussis y 68 kDa en B. bronchiseptica (5, 14, 15). Los precursores de PRN tienen 91,5 kDa, 93 kDa y 92,5 kDa de tamaño, respectivamente. En B. pertussis, se ha demostrado que la PRN es un aglutinógeno (4), promoviendo la unión a ciertas células eucariotas por medio de un motivo Arg-Gly-Asp (RGD) (13).

Los anticuerpos específicos para la PRN de B. bronchiseptica se detectan con alto título en lechones inmunizados, mientras que se detectan pocos, si alguno, de estos anticuerpos en animales no protegidos (19). La síntesis de la PRN por B. bronchiseptica se correlaciona con protección (16). La inmunización de ratones o lechones con preparaciones de la PRN induce inmunidad protectora frente a la infección por B. bronchiseptica (12, 19) y anticuerpos monoclonales administrados pasivamente previenen la muerte de los animales expuestos a B. bronchiseptica (16). También se ha demostrado que la PRN de B. pertussis induce inmunidad protectora frente a exposiciones intracerebral, en aerosol e intranasal a B. pertussis en ratones (11, 18, 20).

Por consiguiente, la PRN se incluye ahora en algunas vacunas acelulares contra la tos ferina (es decir, vacunas compuestas por proteínas bacterianas purificadas) (9). Sin embargo, las proteínas PRN de estas tres especies, aunque estén claramente relacionadas, tienen diferentes propiedades inmunogénicas. Por ejemplo, las preparaciones de PRN de B. pertussis protegen a los ratones frente a la exposición intranasal a B. pertussis pero no frente a la exposición intranasal a B. parapertussis (11). También protegen a los ratones frente a la exposición intracerebral a B. pertussis, mientras que la proteína PRN de B. bronchiseptica no lo hace (18).

La comparación de los aminoácidos deducidos de las tres proteínas, PRN de B. pertussis, PRN de B. parapertussis y PRN de B. bronchiseptica, revela un alto grado de similitud, siendo las proteínas de B. bronchiseptica y B. parapertussis más similares entre sí que la proteína PRN de B. pertussis (5, 14, 15). La referencia 14 enseña que las principales diferencias entre las pertactinas de las tres especies se producen en el número de repeticiones de las dos familias (GGXXP)_{n} y (PQP)_{n} de motivos de secuencia reiterados.

Las secuencias de las tres proteínas difieren en el número de repeticiones en las regiones I y II (figura 1a). Usando anticuerpos monoclonales, Charles et al., identificaron y caracterizaron un epítopo inmunodominante protector de la proteína PRN P.69 (6). Este epítopo abarca las secuencias de repetición (Pro-Gln-Pro)5 situadas en la región II. Las diferencias en esta región pueden explicar la observación de que los sueros de lechones que reconocen PRN de B. bronchiseptica no reaccionan con PRN de B. pertussis a pesar del alto grado de similitud entre estas proteínas (12) y la falta de protección cruzada proporcionada por las tres proteínas (11, 18, 20).

Se ha mostrado recientemente que la PRN producida por aislados clínicos de B. pertussis varía. Las secuencias del gen prn de diversos aislados clínicos revelaron tres tipos principales de variante de PRN (17). Se ha sugerido que las epidemias en los Países Bajos resultan de cambios en las secuencias de los genes que codifican para PRN y PT porque las proteínas presentes en los aislados clínicos actualmente en circulación difieren en la secuencia de aquellas observadas en las cepas vacunales usadas en este país (17).

Para PRN de B. pertussis, las diferencias de aminoácido observadas se sitúan en la región I. Los tipos de prn alélicos A=1 y C=3 son muy similares, difiriendo sólo en dos aminoácidos, mientras que el tipo B=2 es bastante diferente, teniendo una inserción de cinco aminoácidos en la misma región (17).

Se encontró que sólo un tipo difería en la región II. Este tipo (A*=6) lo produce la cepa de referencia de la OMS 18323 de B. pertussis y un aislado clínico francés (3). Sin embargo, no parece ser común porque se ha detectado en sólo un aislado clínico (3). La producción por esta cepa de B. pertussis de este tipo inusual de PRN refleja las muchas propiedades comunes compartidas con las especies B. parapertussis y B. bronchiseptica. No se encontraron diferencias en el fenotipo y comportamiento en el modelo animal de aislados clínicos de B. pertussis con diferentes PRN (3).

Existe una necesidad en la técnica de composiciones que contienen proteínas y polipéptidos de pertactinas de Bordetella que puedan usarse en composiciones inmunogénicas para proteger frente a la infección por Bordetella y para tratar sujetos infectados con Bordetella. Idealmente, las proteínas, polipéptidos y los polinucleótidos que codifican para ellos podrían ser útiles también en el diagnóstico de infección por Bordetella y en kits para el diagnóstico de tal infección.

Sumario de la invención

Esta invención ayuda en satisfacer estas necesidades en la técnica. En una realización, esta invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una mezcla de al menos dos pertactinas o fragmentos de pertactina de Bordetella bronchiseptica, en la que dichas pertactinas o fragmentos contienen al menos la región 11, o tanto la región I como la región II y en la que dichas pertactinas o fragmentos difieren entre sí, en sus respectivas secuencias de aminoácidos, en al menos la región II o las regiones I y II. La composición inmunogénica también puede comprender pertactina de Bordetella pertussis en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria celular o humoral frente a Bordetella pertussis en un animal al que se le administra la composición inmunogénica. La solicitud también describe una composición inmunogénica que comprende una mezcla de pertactinas de especies de Bordetella, en la que dicha composición comprende: (a) pertactina de Bordetella parapertussis y (b) pertactina de Bordetella bronchiseptica, en cantidades suficientes para inducir una respuesta inmunitaria celular o humoral frente a Bordetella parapertussis y Bordetella bronchiseptica en un animal al que se le administra la composición inmunogénica, así como una composición inmunogénica de la invención que comprende una mezcla de pertactinas de especies de Bordetella o fragmentos de las mismas. Específicamente, en la mezcla de la invención, cada variante de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende 6, 7, 8 ó 9 secuencias de aminoácidos PQP de repetición en la región II de las mismas. Las variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica están presentes en cantidades suficiente para inducir una respuesta inmunitaria celular o humoral frente a Bordetella bronchiseptica en un animal al que se le administra la composición inmunogénica. Esta composición inmunogénica también puede comprender pertactinas de Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, o mezclas de las mismas, en cantidades suficiente para inducir una respuesta inmunitaria celular o humoral frente a Bordetella parapertussis o Bordetella pertussis en un animal al que se le administra la composición inmunogénica.

En una realización adicional de la invención en la composición inmunogénica de la invención, cada variante de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende 1, 2 ó 3 secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición en la región I de las mismas. Las variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica están presentes en cantidades suficientes para inducir una respuesta inmunitaria celular o humoral frente a Bordetella bronchiseptica en un animal al que se le administra la composición inmunogénica. Esta composición inmunogénica también puede comprender pertactinas de Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, o mezclas de las mismas, en cantidades suficientes para inducir una respuesta inmunitaria celular o humoral frente a Bordetella parapertussis o Bordetella pertussis en un animal al que se le administra la composición inmunogénica.

Las composiciones tal como se describen en la solicitud pueden comprender una mezcla de fragmentos de las pertactinas de especies de Bordetella. Las composiciones inmunogénicas también pueden comprender al menos un polipéptido de la invención en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunogénica o protectora in vivo, y un excipiente farmacéuticamente aceptable para el mismo. Además, la composición inmunogénica puede comprender una cantidad neutralizante de al menos un polipéptido de la invención.

Una composición inmunogénica dada a conocer en la solicitud comprende una mezcla de pertactinas de especies de Bordetella bronchiseptica o fragmentos de las mismas, en la que las pertactinas o fragmentos de las mismas comprenden una mezcla de variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica en la que al menos una de las variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende la región II de pertactina de Bordetella bronchiseptica que tiene 6, 7, 8 ó 9 secuencias de aminoácidos PQP de repetición en la región II de las mismas, y al menos otra de las variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende la región I de pertactina de Bordetella bronchiseptica que tiene 1, 2 ó 3 secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición en la región I de la misma.

Una composición inmunogénica descrita en la solicitud consiste esencialmente en (A) un polipéptido que comprende la región I y la región II, o un polipéptido que comprende la región I y un polipéptido que comprende la región II, de una pertactina de Bordetella pertussis; (B) un polipéptido que comprende la región I y la región II, o un polipéptido que comprende la región I y un polipéptido que comprende la región II, de una pertactina de Bordetella parapertussis; (C) un polipéptido que comprende la región I y la región II, o un polipéptido que comprende la región I y un polipéptido que comprende la región II, de una pertactina de Bordetella bronchiseptica cepa 9.73 y un polipéptido que comprende la región I y la región II, o un polipéptido que comprende la región I y un polipéptido que comprende la región II, de una pertactina de Bordetella bronchiseptica de la cepa SEI.

La solicitud da a conocer polinucleótidos que codifican para las proteínas y polipéptidos, así como los anticuerpos que reconocen las proteínas y polipéptidos. También se da a conocer un chip de ADN, en el que dicho chip comprende al menos un polinucleótido tal como se da a conocer en el presente documento o fragmento del mismo o un microalineamiento que comprende microcuentas, en los que las microcuentas soporta cada una múltiples copias de un polinucleótido tal como se da a conocer en el presente documento o un fragmento del mismo y en los que el polinucleótido o fragmento del mismo es diferente de una cuenta a otra.

Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales. Los anticuerpos monoclonales pueden usarse para tratar infecciones por Bordetella. También se proporcionan complejos inmunológicos que comprenden una proteína o polipéptido de la invención y un anticuerpo que reconoce específicamente la proteína o polipéptido.

Además, la solicitud da a conocer un método para detectar la infección por Bordetella. El método comprende proporcionar una composición que comprende un material biológico que se sospecha que está infectado con Bordetella y someterlo a ensayo para determinar la presencia de una proteína o polipéptido, tal como se da a conocer en el presente documento. Puede someterse a ensayo el polipéptido, por ejemplo, mediante electroforesis o mediante inmunoensayo con anticuerpos que son inmunológicamente reactivos con el polipéptido.

El método también puede comprender poner en contacto el antígeno con un líquido biológico durante un tiempo y en condiciones suficientes para que el antígeno y los anticuerpos en el líquido biológico formen un complejo antígeno-anticuerpo, y detectar la formación del complejo. El método puede incluir opcionalmente medir la formación del complejo antígeno-anticuerpo. En realizaciones preferidas, se detecta la formación del complejo antígeno-anticuerpo mediante inmunoensayo basado en la técnica de inmunotransferencia de tipo Western, ELISA, ensayo de inmunofluorescencia indirecta o ensayo de inmunoprecipitación.

Además, la solicitud describe un kit de diagnóstico para la detección de la presencia o la ausencia de anticuerpos, que se unen a una proteína o polipéptido de la invención o mezclas de los mismos. El kit puede comprender un antígeno que comprende la proteína o polipéptido, o mezclas de las proteínas y polipéptidos, y medios para detectar la formación de complejos inmunitarios entre el antígeno y los anticuerpos. Los medios están presentes en una cantidad suficiente para realizar la detección.

Otro método para detectar la presencia o la ausencia de Bordetella comprende (1) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene material genético de Bordetella con al menos una sonda nucleotídica, y (2) detectar la hibridación entre la sonda nucleotídica y el material genético en la muestra. La sonda nucleotídica es complementaria a una secuencia de polinucleótido tal como se describe en el presente documento.

Descripción breve de los dibujos

Se describirá esta invención con mayor detalle con referencia a los dibujos, en los que:

La figura 1a es un mapa de las dos regiones de repeticiones, la región I y la región II, en la proteína de la membrana externa pertactina de Bordetella bronchiseptica.

La figura 1b es una alineación de la región I de la proteína de la membrana externa pertactina de diferentes cepas de B. bronchiseptica.

La figura 1c es una alineación de la región II de la proteína de la membrana externa pertactina de diferentes cepas de B. bronchiseptica.

Descripción detallada de la invención

Se ha demostrado anteriormente que miembros específicos de la especie de la familia de la pertactina son proteínas de la membrana externa (PME). En B. bronchiseptica, la pertactina es el producto del gen prn y se representa como una proteína con un M_{r} de 68 kDa (P.68), en B. pertussis como una proteína con un M_{r} de 69 kDa (P.69), y en B. parapertussis como una proteína con un M_{r} de 70 kDa (P.70). Las secuencias de nucleótidos de las pertactinas de estas tres especies se incluyen en la lista de secuencias adjunta como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos correspondientes codificadas por estas secuencias de nucleótidos se incluyen en la lista de secuencias como SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6, respectivamente.

Una comparación de las secuencias de proteína deducidas para las proteínas P.68, P.69. y P.70 demuestra el alto grado de homología entre las proteínas. Una comparación entre las proteínas P.68 y P.70 muestra sólo 17 diferencias de aminoácido, mientras que una comparación similar entre P.68 y P.69 muestra 80 diferencias, y 79 diferencias entre P. 69 y P.70. La mayoría de las diferencias de aminoácido entre las tres secuencias de proteína deducidas se producen en el número de unidades de repetición en las dos familias de secuencias de repetición presentes en las tres proteínas. P.68 tiene tres copias de la repetición Gly-Gly-Xaa-Xaa-Pro (es decir, GGXXP en la figura 1b), mientras que P.70 tiene cuatro y P.69 cinco. De manera similar, P.68 tiene siete repeticiones Pro-Gln-Pro (es decir, PQP en la figura 1c), P.70 tiene nueve y P.69 tiene cinco.

Se ha mostrado recientemente que la PRN producida por aislados clínicos de B. pertussis varía. Las secuencias del gen prn de diversos aislados clínicos revelaron tres tipos principales de variante de PRN. Se ha sugerido que las epidemias en los Países Bajos resultan de cambios en las secuencias de los genes que codifican para PRN y PT porque las proteínas presentes en los aislados clínicos actualmente en circulación difieren en la secuencia de aquellas observadas en las cepas vacunales usadas en este país.

Un objetivo de las investigaciones, que condujeron a la presente invención, fue analizar si el polimorfismo en PRN observado en la especie B. pertussis también se produce en B. parapertussis y en B. bronchiseptica. Se secuenciaron y se compararon las dos regiones repetidas de los genes prn de 10 aislados de B. parapertussis de origen humano y de 40 aislados de B. bronchiseptica de origen humano o animal. (Figura 1a).

La tabla I contiene una lista de los aislados y tipos de pertactina correspondientes usados en esta invención.

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TABLA I

1

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Al llevar a cabo esta invención, se extrajo ADN, se amplificó mediante PCR y se secuenció, tal como se describió anteriormente (3). Se purificaron y se secuenciaron los productos de PCR amplificados por la empresa ESGS (ESGS, Cybergene group, Evry, Francia). Se analizaron las secuencias de aminoácidos deducidas con software GCG (paquete Wisconsin Versión 9.1, Genetics Computer Group, Madison, WI, EE.UU.). Se compararon las secuencias de aminoácidos deducidas de las regiones I y II y se crearon múltiples alineaciones de las secuencias de aminoácidos con el programa CLUSTAL W de GCG (10), para cada región (figuras 1b, c).

No se encontró ninguna diferencia entre las secuencias de las regiones I y II de la PRN producida por los 10 aislados de B. parapertussis y la secuencia publicada (15). Sin embargo, se encontraron tres tipos diferentes entre los 40 genes prn de B. bronchiseptica analizados con diferencias en el número de repeticiones (1 a 3) en la región I (figura 1b). El grupo más grande correspondió a secuencias con tres copias de la secuencia repetida, idéntica a la secuencia anteriormente notificada (14). No se encontró ninguna correlación entre el patrón de variación y el origen del aislado.

Se observó un mayor grado de variabilidad en la segunda región repetida de la PRN de B. bronchiseptica (figura 1c). Se observaron nueve variantes. Entre estas nueve variantes el número de repeticiones es de desde 6 hasta 9.

Ninguna de las variantes de B. bronchiseptica presentó el mismo patrón que las variantes de B. pertussis. Además, no se observó ninguna asociación especial entre un tipo de región I y un tipo de región II. No se hizo una observación en ninguna de las tres especies de un patrón similar a aquellos de la cepa 18323 y el aislado CZ (3), que se considerase intermedia entre B. pertussis, B. bronchiseptica y parapertussis. Estos datos concuerdan con los genes prn de B. parapertussis y de B. bronchiseptica que son más similares entre sí que al gen prn de B. pertussis (1). No se observó especificidad del huésped con respecto al tipo de PRN.

Se ha mostrado que la región II desempeña un papel importante en la inducción de inmunidad protectora (6). La falta de protección cruzada entre PRN de B. pertussis, B. parapertussis y PRN de B. bronchiseptica concuerda con esto, porque las principales diferencias entre estas proteínas se producen en esta región. No se observó ninguna variación en esta región para la PRN producida por los aislados de B. pertussis. Estos datos sugieren que treinta años de vacunación pueden haber inducido una variación en una región de repetición inmunodominante, pero no en la región más implicada en la inducción de inmunidad protectora. La variación en la región II de PRN de B. pertussis puede indicar una disminución en la eficacia de la vacuna contra B. pertussis.

Por el contrario, el análisis de la PRN de B. bronchiseptica mostró polimorfismo en ambas regiones. Esto puede explicar la incapacidad de vacunas contra B. bronchiseptica para inducir protección de larga duración. Este polimorfismo puede relacionarse también con la capacidad de B. bronchiseptica para inducir infecciones crónicas (7, 8, 22). Puede proporcionar medios para que esta bacteria escape de las respuestas inmunitarias del huésped.

Esta invención, que resultó de estos experimentos y observaciones, implica así composiciones que contienes ciertas pertactinas de Bordetella y fragmentos de las mismas. Estas pertactinas y fragmentos de pertactina, así como los polinucleótidos que codifican para los mismos, son útiles en composiciones inmunogénicas y en aplicaciones de diagnóstico.

En particular, esta invención es el resultado del descubrimiento de que existen diferentes especies de la pertactina de longitud completa de Bordetella bronchiseptica, concretamente, especies que contienen 6, 7, 8 ó 9 secuencias de aminoácidos PQP de repetición en la región II de las mismas, y especies de pertactina de longitud completa de B. bronchiseptica que contienen 1, 2 ó 3 secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición en la región I de las mismas, en las que XX puede ser FD, FG o AV. Se proporcionan así mediante esta invención, estas pertactinas de longitud completa y mezclas de estas pertactinas en cualquier combinación de las secuencias de repetición.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "pertactina de Bordetella bronchiseptica" significa una proteína de la membrana externa de Bordetella bronchiseptica, que es un factor de virulencia, y que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 68 kDa, y que contiene las dos regiones de pertactina de Bordetella bronchiseptica conocidas como región I y región II. Se identifican la región I y la región II de las pertactinas de diferentes cepas de Bordetella entre corchetes en SEQ ID NOS: 1 a 6. Se entenderá que las pertactinas de diferentes aislados de Bordetella bronchiseptica pueden tener secuencias de aminoácidos que difieren entre sí, por ejemplo, en la región I, la región II, o tanto en la región I como en la región II, así como en otras regiones.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica" significa pertactinas de Bordetella bronchiseptica, o fragmentos de pertactinas de Bordetella bronchiseptica que contienen al menos la región I, la región II, o tanto la región I como la región II, en las que las pertactinas de Bordetella bronchiseptica o los fragmentos de las mismas difieren entre sí en al menos la región I, la región II, o tanto en la región I como en la región II, en sus respectivas secuencias de aminoácidos. Se han descubierto las siguientes variantes de pertactina especiales de Bordetella bronchiseptica.

Tal como se usa en el presente documento las expresiones "fragmentos de pertactina de Bordetella bronchiseptica", "fragmentos de pertactina de Bordetella parapertussis" y "fragmentos de pertactina de Bordetella pertussis" se refieren a polipéptidos que son partes de proteínas pertactinas de longitud completa y que pueden inducir una respuesta inmunitaria celular o humoral frente a infecciones por Bordetella.

2

3

En realizaciones específicas, el polipéptido contenido en la composición inmunogénica de la invención comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO: 22. El polipéptido puede consistir en los aminoácidos en SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:22 o fragmentos de las mismas. La solicitud da a conocer polinucleótidos que codifican para uno de estos polipéptidos y una secuencia purificada de ADN o ARN que hibrida en condiciones de rigurosidad moderada o alta con los polinucleótidos o al menos con 15 nucleótidos de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "mezcla de variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica" significa dos o más variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica en mezcla en forma de suspensión, emulsión, líquida o sólida. Al menos dos de las variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica en la mezcla, por supuesto, diferirán entre sí en al menos la región I, la región II, o tanto en la región I como en la región II, en sus respectivas secuencias de aminoácidos.

Resultará evidente de inmediato que la solicitud da a conocer fragmentos de polipéptido de la pertactina de B. bronchiseptica, en los que los fragmentos comprenden 6, 7, 8 ó 9 secuencias de aminoácidos PQP de repetición en la región II de los mismos o 1,2 ó 3 secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición en la región I de los mismos. Las mezclas de estos fragmentos de polipéptido en cualquier combinación de las secuencias de repetición están también dentro del alcance de esta invención.

Cuando un fragmento de polipéptido comprende sólo la región I de una pertactina de B. bronchiseptica, el fragmento de polipéptido contiene normalmente al menos de aproximadamente 46 a aproximadamente 56 aminoácidos, lo que incluye las secuencias de repetición de la región I. Cuando el fragmento de polipéptido de la invención comprende sólo la región II, el fragmento de polipéptido contiene normalmente al menos de aproximadamente 48 a aproximadamente 60 aminoácidos, lo que incluye las secuencias de repetición de la región II. Cuando el fragmento de polipéptido de la invención comprende tanto la región I como la región II de B. bronchiseptica, el fragmento contiene normalmente al menos de aproximadamente 906 a aproximadamente 928 aminoácidos, lo que incluye las secuencias de repetición de las regiones I y II.

Así, en una realización ilustrativa, esta invención proporciona una composición que comprende una mezcla de variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica, en la que cada variante de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende la región II de pertactina de Bordetella bronchiseptica, y además en la que cada variante de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende 6, 7, 8 ó 9 secuencias de aminoácidos PQP de repetición en la región II de las mismas y las variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica difieren en el número de las secuencias de aminoácidos PQP de repetición contenidas en las mismas. La composición también puede comprender pertactinas de Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, o mezclas de las mismas. El polipéptido puede ser una pertactina de longitud completa o un fragmento de la misma.

En otra realización, esta solicitud da a conocer una composición que comprende una mezcla de variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica, en la que cada variante de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende la región I de una pertactina de Bordetella bronchiseptica, y además en la que cada variante de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende 1, 2 ó 3 secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición en la región I de las mismas, y las al menos dos de las variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica difieren en el número de las secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición contenidas en las mismas. Esta composición también puede comprender pertactinas de Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, o mezclas de las mismas. Las variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica pueden ser de longitud completa o un fragmento.

En una realización adicional, la solicitud da a conocer una composición que comprende una mezcla de variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica, en la que una de las variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende la región II de pertactina de Bordetella bronchiseptica que tiene 6, 7, 8 ó 9 secuencias de aminoácidos PQP de repetición en la región II de la misma, y otra de las variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende la región I de pertactina de Bordetella bronchiseptica que tiene 1, 2 ó 3 secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición en la región I de la misma. Esta composición también puede comprender pertactinas de Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, o mezclas de las mismas. Las variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica pueden ser de longitud completa o un fragmento.

En una realización preferida, el polipéptido contenido en la composición de la invención comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO:9.

En otra realización preferida, el polipéptido contenido en la composición de la invención comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 22.

Las composiciones según la invención producen una respuesta inmunitaria humoral y una respuesta inmunitaria celular. Tras la infección por B. bronchiseptica, hay inducción de una inmunidad humoral y de una inmunidad celular, tal como en el caso de una infección por B. pertussis y B. parapertussis. Además, tras la vacunación con composiciones de esta invención, hay inducción de una inmunidad tipo humoral y celular similar a la que se induce tras la infección o reinfección.

En una realización de la invención, se proporciona una composición para vacunación que comprende como principio activo una composición inmunogénica de la invención, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y, cuando sea apropiado, con un adyuvante.

Como las vacunas contra la tos ferina disponibles actualmente en el mercado, la composición inmunogénica según la invención puede combinarse con otros principios activos de vacunación, por ejemplo, aquellos de la vacuna contra la difteria, poliomielitis, o enfermedades producidas por Haemophilus o, en términos generales, con cualquier constituyente inmunogénico, por ejemplo, una toxina o agente patógeno inactivado particular.

Una composición para vacunación según la invención puede ser específica de la especie y, en consecuencia, puede inducir protección frente a B. pertussis o B. parapertussis o B. bronchiseptica. Alternativamente, puede ser una mezcla que comprende como principio activo una composición inmunogénica frente a B. bronchiseptica, tal como se definió anteriormente, y una composición inmunogénica frente a B. parapertussis y/o B. pertussis.

Como un resultado de técnicas recientes en biología molecular, se han caracterizado varios factores involucrados en la virulencia de B. pertussis y se ha comprendido la regulación de su expresión. Estos factores pueden clasificarse en dos categorías, los que participan en el síndrome infeccioso (adhesinas) y los que desempeñan un papel en el síndrome inducido por toxina (toxinas). Las adhesinas y toxinas relacionadas con Bordetella pueden incluirse en las composiciones de esta invención. Ejemplos de las adhesinas son:

hemaglutinina filamentosa o FHA, que se considera que desempeña un papel importante en la adhesión de la bacteria al epitelio ciliado;

los dos aglutinógenos o AGG de B. pertussis, que permiten que se clasifiquen las cepas en serotipos; y

toxina de la tos ferina o PTX, una toxina A-B de tipo secretada que, además de sus efectos citopatógenos, participa en la adhesión a través de su subunidad B.

Ejemplos de las toxinas para su uso en la invención son:

toxina de la tos ferina o PTX, que se secreta;

toxina dermonecrótica o DNT, cuya función aún no se ha caracterizado bien, y citotoxina traqueal o TCT, una glucoproteína pequeña secretada de la familia del muramil-péptido, derivado del peptidoglucano de la bacteria, que parecen actuar en conjunto para destruir la células ciliadas del aparato respiratorio del huésped;

adenilato ciclasa-hemolisina o Ac-Hly, una proteína bifuncional que tiene actividad adenilato ciclasa y actividad hemolítica, que ha descubierto que pertenece a la familia de toxinas denominadas ``RTX para "repeticiones en toxinas".

De manera similar, se han identificado los factores involucrados en la virulencia de B. parapertussis y B. bronchiseptica y pueden incluirse en las composiciones de la invención.

Los resultados publicados muestran que las vacunas acelulares sometidas a prueba, monovalente (PTX), bivalente (PTX, FHA), trivalente (PTX, FHA, PRN), o pentavalente (PTX, FHA, PRN, AGG2, AGG3) inducen muy pocos efectos secundarios, todas son inmunogénicas y todas tienen una eficacia frente a la enfermedad (según la definición de la OMS) que es superior o igual al 70%. Las composiciones de la invención pueden incluirse en estas vacunas y otras vacunas acelulares. Por ejemplo, la composición inmunogénica puede comprender además al menos una adhesina de Bordetella seleccionada del grupo que consiste en FHA, AGG2, AGG3, y/o al menos una toxina de Bordetella seleccionada del grupo que consiste en PTX, DNT, TCT y Ac-Hly.

Las proteínas y polipéptidos de las composiciones de esta invención pueden estar en forma purificada. El término "purificado(a)" tal como se usa en el presente documento, significa que las pertactinas y fragmentos de las mismas están esencialmente libres de asociación con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo, como un producto de purificación de cultivo de células huésped recombinantes o como un producto purificado de una fuente no recombinante. El término "sustancialmente purificado(a)" tal como se usa en el presente documento, se refiere a una mezcla que contiene pertactinas o fragmentos de las mismas y está esencialmente libre de asociación con otras proteínas o polipéptidos, excepto por la presencia de proteínas conocidas que pueden eliminarse usando un anticuerpo específico, y cuyos polipéptidos de pertactina sustancialmente purificados pueden usarse como antígenos.

Dentro de un aspecto de la solicitud, pueden utilizarse la pertactina y fragmentos de la misma para preparar anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos de pertactina. El término "anticuerpos" pretende incluir anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de los mismos, tales como fragmentos F(ab')2 y Fab, así como parejas de unión producidos de modo recombinante. Se define que los anticuerpos se unen específicamente si se unen a pertactinas y fragmentos de las mismas con un K_{a} superior o igual a aproximadamente 10^{7} M^{-1}. Pueden determinarse fácilmente las afinidades de las parejas de unión o anticuerpos usando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas por Scatchard et al., Ann. N.Y Acad Sci., 51:660 (1949). Los anticuerpos policlonales puede generarse fácilmente a partir de una variedad de fuentes, por ejemplo, caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones o ratas, usando procedimientos que se conocen bien en la técnica.

La solicitud da a conocer además fragmentos y oligonucleótidos aislados derivados de la secuencia de nucleótidos de las pertactinas dadas a conocer en la solicitud. B. bronchiseptica, B. pertussis y B. parapertussis (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, y SEQ ID NO:3) que codifican para 6, 7, 8 ó 9 secuencias de aminoácidos PQP de repetición en la región II de las mismas y/o 1, 2 ó 3 secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición en la región I de las mismas. La solicitud también da a conocer polipéptidos codificados por estos fragmentos y oligonucleótidos. Las mezclas pueden comprender secuencias de nucleótidos que contienen secuencias de repetición en las que cada entidad en la mezcla se selecciona independientemente de los polinucleótidos dados a conocer en la solicitud.

Las secuencias de ácidos nucleicos incluyen secuencias aisladas de ADN y ARN que hibridan con los ácidos nucleicos de pertactina nativa dados a conocer en el presente documento en condiciones de rigurosidad moderada o intensa, y que codifican para polipéptidos de pertactina. Tal como se usa en el presente documento, las condiciones de rigurosidad moderada, tal como conocen los expertos en la técnica, y tal como se define por Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, págs. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989), incluyen el uso de una disolución de prelavado para los filtros de nitrocelulosa 5X SSC, SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), condiciones de hibridación de formamida al 50%, 6X SSC a 42ºC (o otra disolución de hibridación similar, tal como disolución de Stark, en formamida al 50% a 42ºC), y condiciones de lavado de aproximadamente 60ºC, 0,5X SSC, SDS al 0,1%. Las condiciones de rigurosidad alta se definen como condiciones hibridación como anteriormente, y con lavado a 68ºC, 0,2X SSC, SDS al 0,1%. El experto en la técnica reconocerá que la temperatura y la concentración de sal de la disolución de lavado pueden ajustarse según sea necesario de acuerdo con factores tales como la longitud de la sonda.

Debido a la conocida degeneración del código genético, en la que más de un codón puede codificar para el mismo aminoácido, una secuencia de ADN puede variar y aún codificar para un polipéptido de pertactina que tiene la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO:24. Tales secuencias de ADN variantes pueden resultar de mutaciones silenciosas (por ejemplo, que se producen durante la amplificación por PCR), o puede ser el producto de mutagénesis deliberada de una secuencia nativa.

La solicitud describe secuencias de ADN aisladas equivalentes, que codifican para polipéptidos de pertactina, seleccionadas de: (a) ADN derivado de la región codificante de un gen de pertactina nativa; (b) ADNc que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:7 a SEQ ID NO:24; (c) ADN que puede hibridar con un ADN de (a) en condiciones de rigurosidad moderada y que codifica para polipéptidos de pertactina; y (d) ADN que es degenerado como resultado del código genético de un ADN definido en (a), (b) o (c) y que codifica para polipéptidos de pertactina. También se dan a conocer los polipéptidos de pertactina codificados por tales secuencias equivalentes de ADN.

Se entenderá que la presente solicitud da a conocer las proteínas y polipéptidos descritos anteriormente en forma aislada o purificada, ya se obtengan usando las técnicas descritas en el presente documento u otros métodos. En una realización preferida, los polipéptidos de pertactina están sustancialmente libres de tejido humano o de otro animal y de componentes de tejido humano o de otro animal, ácidos nucleicos, proteínas y lípidos extraños y microorganismos adventicios, tales como bacterias y virus. También se entenderá que se describen también proteínas equivalentes que tienen sustancialmente las mismas propiedades biológicas e inmunogénicas. Por tanto, esta solicitud describe variantes serotípicas de los polipéptidos tal como se dan a conocer en el presente documento.

Dependiendo del uso que vaya a hacerse de los polipéptidos de pertactina, puede ser deseable marcarlos. Ejemplos de marcadores adecuados son marcadores radiactivos, marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes y cromóforos. Los métodos para el marcaje no difieren en esencia de los usados ampliamente para marcar inmunoglobulina. Puede evitarse la necesidad de marcar usando un anticuerpo marcado frente al antígeno o anti-inmunoglobulina frente a los anticuerpos frente al antígeno como marcador indirecto.

Una vez que se han obtenido los polipéptidos de pertactina, pueden usarse para producir anticuerpos policlonales y monoclonales reactivos con los mismos. Por tanto, puede usarse una proteína o polipéptido para inmunizar un huésped animal mediante técnicas conocidas en la técnica. Tales técnicas normalmente implican la inoculación, pero puede implicar otros modos de administración. Se administra una cantidad suficiente de la proteína o del polipéptido para producir una respuesta inmunogénica en el huésped animal. Puede usarse cualquier huésped que produzca anticuerpos frente al antígeno de la invención. Una vez que se ha inmunizado el animal y ha pasado tiempo suficiente para que empiece a producir anticuerpos frente al antígeno, pueden recuperarse los anticuerpos policlonales. El método general comprende extraer sangre del animal y separar el suero de la sangre. El suero, que contiene anticuerpos frente al antígeno, puede usarse como un antisuero frente al antígeno. Alternativamente, pueden recuperarse los anticuerpos del suero. La purificación por afinidad es una técnica preferida para recuperar los anticuerpos policlonales purificados frente al antígeno, del suero.

Pueden prepararse también los anticuerpos monoclonales frente a los antígenos dados a conocer anteriormente. Un método para producir anticuerpos monoclonales reactivos con los antígenos comprende las etapas de inmunizar un huésped con el antígeno; recuperar las células productoras de anticuerpo del bazo del huésped; fusionar las células productoras de anticuerpo con células de mieloma deficientes en la enzima hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa para formar hibridomas; seleccionar al menos uno de los hibridomas mediante crecimiento en un medio que comprende hipoxantina, aminopterina y timidina; identificar al menos uno de los hibridomas que produce un anticuerpo frente al antígeno, cultivar el hibridoma identificado para producir anticuerpo en una cantidad recuperable; y recuperar los anticuerpos producidos por hibridoma en cultivo.

Pueden usarse estos anticuerpos policlonales o monoclonales en una variedad de aplicaciones. Entre éstas se encuentra la neutralización de proteínas correspondientes. Pueden usarse también para detectar antígenos de Bordetella en preparaciones biológicas o en la purificación de proteínas, glucoproteínas correspondientes o mezclas de las mismas, por ejemplo cuando se usa en columnas de cromatografía por afinidad.

Pueden usarse los polipéptidos de pertactina tal como se definen en el presente documento como antígenos para identificar anticuerpos frente a Bordetella en materiales y para determinar la concentración de los anticuerpos en esos materiales. Por tanto, pueden usarse los antígenos para la determinación cualitativa o cuantitativa de Bordetella en un material. Tales materiales, por supuesto, incluyen tejido humano o de otro animal y células humanas o de otro animal, así como líquidos biológicos, tales como líquidos corporales humanos o de otro animal, incluyendo sueros humanos. Cuando se usa como reactivo en un inmunoensayo para determinar la presencia o la concentración de los anticuerpos frente a Bordetella, los antígenos tal como se definieron anteriormente proporcionan un ensayo que es conveniente, rápido, sensible y específico.

Más particularmente, pueden emplearse los antígenos tal como se definieron anteriormente para la detección de Bordetella por medio de inmunoensayos que se conocen bien para su uso en la detección o cuantificación de componentes humorales en líquidos. Por tanto, pueden observarse directamente interacciones antígeno-anticuerpo o determinarse mediante reacciones secundarias, tales como precipitación o aglutinación. Además, pueden emplearse también técnicas de inmunoelectroforesis. Por ejemplo, puede utilizarse la combinación clásica de electroforesis en agar seguida por reacción con antisuero, así como electroforesis bidimensional, electroforesis de Rocket e inmunomarcaje de patrones en gel de poliacrilamida (inmunotransferencia o transferencia de tipo Western) Otros inmunoensayos en los que pueden emplearse los antígenos tal como se definieron anteriormente incluyen, pero no se limitan a, radioinmunoensayo, ensayo de inmunoprecipitación competitiva, inmunoensayo enzimático y ensayo de inmunofluorescencia. Se entenderá que pueden emplearse técnicas turbidimétricas, colorimétricas y nefelométricas. Se prefiere un inmunoensayo basado en una técnica de inmunotransferencia de tipo Western.

Pueden llevarse a cabo los inmunoensayos mediante la inmovilización de uno de los inmunorreactivos, o bien un antígeno tal como se definió anteriormente o bien un anticuerpo frente al antígeno, sobre una superficie portadora mientras se retiene la inmunorreactividad del reactivo. El inmunorreactivo recíproco puede estar sin marcar o marcarse de tal manera que se retiene también la inmunorreactividad. Estas técnicas son especialmente adecuadas para su uso en inmunoensayos enzimáticos, tales como ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) e inmunoensayo enzimático de inhibición competitiva (CIEIA).

Cuando o bien el antígeno tal como se definió anteriormente o bien el anticuerpo frente al antígeno se une a un soporte sólido, el soporte es normalmente material de vidrio o de plástico. Se prefieren materiales de plástico moldeados en forma de placas, tubos, perlas o discos. Ejemplos de materiales de plástico adecuados son poliestireno y poli(cloruro de vinilo). Si el inmunorreactivo no se une fácilmente al soporte sólido, puede interponerse un material portador entre el reactivo y el soporte. Ejemplos de materiales portadores adecuados son proteínas, tales como albúmina de suero bovino, o reactivos químicos, tales como glutaraldehído o urea. Puede llevarse a cabo el recubrimiento de la fase sólida usando técnicas convencionales.

La invención proporciona polipéptidos de pertactina inmunogénicos, y más particularmente, polipéptidos protectores para su uso en la preparación de composiciones de vacuna contra Bordetella. Por tanto, pueden emplearse estos polipéptidos como vacunas administrando los polipéptidos a un mamífero propenso a infección por Bordetella. Pueden emplearse modos de administración convencionales. Por ejemplo, la administración puede llevarse a cabo por las vías oral, respiratoria o parenteral. Se prefieren las vías de administración intradérmica, subcutánea e intramuscular cuando se administra la vacuna por vía parenteral.

El fin principal de la respuesta inmunitaria en un mamífero infectado por Bordetella es inactivar Bordetella y eliminar las células infectadas por Bordetella. La rama de células B de la respuesta inmunitaria tiene la responsabilidad principal para la inactivación de Bordetella. La manera principal en la que se logra esto es mediante neutralización de la infectividad. Otro mecanismo principal para la destrucción de las células infectadas por Bordetella se proporciona mediante linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen antígenos de pertactina expresados en combinación con antígenos de histocompatibilidad de clase I en la superficie celular. Los CTL reconocen polipéptidos de pertactina procesados dentro de las células de una proteína pertactina que se produce, por ejemplo, por la célula infectada o que se internaliza por una célula fagocítica. Por tanto, pueden emplearse las composiciones inmunogénicas de la invención para estimular una respuesta de células B frente a polipéptidos de pertactina, así como inmunidad mediada por una respuesta de CTL tras la infección. La respuesta de CTL puede desempeñar un papel importante en mediar la recuperación de infección primaria por Bordetella y en acelerar la recuperación durante infecciones posteriores.

La capacidad de los polipéptidos de pertactina tal como se definieron en las composiciones de la invención y vacunas de la invención para inducir niveles protectores de anticuerpos neutralizantes en un huésped puede potenciarse mediante emulsionamiento con un adyuvante, incorporación en un liposoma, acoplamiento con un portador adecuado, o mediante combinaciones de estas técnicas. Por ejemplo, pueden administrarse los polipéptidos de pertactina tal como se definieron en las composiciones de la invención con un adyuvante convencional, tal como gel de hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, en una cantidad suficiente para potenciar la respuesta inmunitaria humoral o mediada por célula en el huésped. De manera similar, los polipéptidos de pertactina pueden unirse a membranas lipídicas o incorporarse en membranas lipídicas para formar liposomas. El uso de lípidos no pirogénicos libres de ácidos nucleicos y otras materias extrañas puede emplearse para este fin.

El programa de inmunización dependerá de varios factores, tales como la propensión del huésped a la infección y la edad del huésped. Puede administrarse una dosis única de la vacuna de la invención al huésped o puede seguirse un ciclo primario de inmunización en el que se administran varias dosis a intervalos de tiempo. Pueden administrarse dosis posteriores usadas como refuerzos cuando sea necesario tras el ciclo primario.

Pueden administrarse las proteínas, polipéptidos y vacunas de pertactina al huésped en una cantidad suficiente para prevenir o inhibir la infección por Bordetella o la replicación in vivo. En cualquier caso, la cantidad administrada debe ser al menos suficiente para proteger al huésped frente a una inmunosupresión sustancial, aunque la infección por Bordetella pueda no prevenirse totalmente. Puede obtenerse una respuesta inmunogénica administrando las proteínas o polipéptidos de la invención al huésped en una cantidad de, por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 50 microgramos de antígeno por kilogramo de peso corporal, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 microgramos de antígeno por kilogramo de peso corporal. Pueden administrarse las proteínas, polipéptidos y vacunas de la invención junto con un vehículo fisiológicamente aceptable. Puede emplearse por ejemplo, un diluyente, tal como agua o una solución salina.

Otro aspecto dado a conocer en la solicitud incluye administrar cualquier combinación de los ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos de pertactina, las proteínas y polipéptidos per se, con o sin moléculas portadoras, a un individuo. El individuo puede ser un animal. Tal como se usa en el presente documento, el término "animal" significa un mamífero, y preferiblemente, el mamífero se selecciona del grupo que consiste en un ser humano, un conejo, un ratón, un perro, un gato, un bovino, un cerdo y un caballo. En una realización especialmente preferida, el mamífero es un ser humano.

Los métodos de tratamiento incluyen administrar composiciones inmunogénicas que comprenden polipéptidos o proteínas pertactina, y composiciones que comprenden ácidos nucleicos que codifican también para polipéptidos o proteínas pertactina. Los expertos en la técnica tienen conocimiento del concepto, de la aplicación y de la eficacia de las vacunas de ácido nucleico (por ejemplo, vacunas de ADN) y la tecnología de vacunas de ácido nucleico así como tecnologías basadas en proteínas y polipéptidos. La tecnología basada en ácidos nucleicos permite la administración de ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos de pertactina, desnudos o encapsulados, directamente a tejidos y células sin la necesidad de producción de las proteínas codificadas antes de la administración. La tecnología se basa en la capacidad de estos ácidos nucleicos para que los capten las células del organismo receptor y se expresen para producir un determinante inmunogénico frente al que responde el sistema inmunitario del receptor. Normalmente, los antígenos expresados se presentan en la superficie de las células que los han captado y expresan los ácidos nucleicos, pero la expresión y exportación, de los antígenos codificados hacia el sistema circulatorio del individuo receptor están también dentro del alcance de la presente invención. Tal tecnología de vacunas de ácido nucleico incluye, pero no se limita a, inserción de ADN y ARN desnudos e inserción de vectores expresión que codifican para polipéptidos de pertactina. Aunque la tecnología se denomina "vacuna", es igualmente aplicable a composiciones inmunogénicas que no dan como resultado una respuesta protectora. Tales composiciones inductoras no de protección se dan a conocer en la presente solicitud y métodos.

Aunque la presente solicitud da a conocer la inserción de ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos de pertactina y moléculas portadoras como ácido nucleico desnudo, la presente solicitud también da a conocer la inserción de ácidos nucleicos como parte de composiciones mayores o más complejas. Están incluidos entre estos sistemas de inserción virus, partículas similares a virus, o bacterias que contienen el ácido nucleico que codifica para polipéptidos de pertactina. También, los complejos de los ácidos nucleicos de la invención y moléculas portadoras con compuestos de permeabilización celular, tales como liposomas, están incluidos dentro del alcance de la invención. Otros compuestos, tales como vectores moleculares (documento EP 696.191, Samain et al.) y sistemas de inserción para vacunas de ácido nucleico se conocen por el experto en la técnica y se ejemplifican, por ejemplo, en los documentos WO 93 06223 y WO 90 11092, U.S. 5.580.859 y U.S. 5.589.466 (patentes de Vical), que se incorporan como referencia al presente documento, y pueden prepararse o usarse sin demasiada o excesiva experimentación.

Para lograr además los objetos y según los fines de la presente invención, se describe un kit que puede diagnosticar una infección por Bordetella. Este kit, en una realización, contiene las secuencias de ADN tal como se definieron anteriormente que pueden hibridar con secuencias de ARN bacteriano o ADN análogo para indicar la presencia de una infección por Bordetella. Pueden usarse diferentes técnicas de diagnóstico que incluyen, pero no se limitan a: (1) procedimientos de transferencia de tipo Southern para identificar ADN celular que puede digerirse o no con enzimas de restricción; (2) técnicas de transferencia de tipo Northern para identificar ARN extraído de células; y (3) técnicas de transferencia puntual, es decir, filtración directa de la muestra a través de una membrana, tal como de nitrocelulosa o nailon, sin separación previa en gel de agarosa. Podría obtenerse un material adecuado para la técnica de transferencia puntual de líquidos corporales incluyendo, pero sin limitarse a, suero y plasma, sobrenadantes de células en cultivo, o extractos citoplasmáticos obtenidos tras la lisis celular y eliminación de las membranas y los núcleos de las células mediante centrifugación.

A continuación, se encuentran las referencias de las cepas usadas en la búsqueda con respecto a la presente invención:

- 9.73H+5, DEL, SEI: Infect Immun.-(1993) 61''4072-4078. Gueirard, P. y Guiso, N., presentada con CNCM el 12 de mayo de 1989, nº 858.

- CVGEO idéntico a la cepa CVHAI 286, 335: Microbiol. (1997) 143:1433-1441. Le Blay, K. et al.

- 63.2: CIP - Lab. Ident., Inst. Pasteur, París, Francia - J. Clin. Microbiol., 1993, 31, 2745

- TI: CIP81.32 - Lab. Ident., Inst. Pasteur, París, Francia - J. Clin. Microbiol., 1993, 31, 2746

- Fr287: Vaccine (1999) 17:2651:2660. Boursaux-Eude, C. et al.

- 18232: ref. OMS: ATCC97.97 (CIP63.1).

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Referencias

Se han citado las referencias siguientes en esta solicitud. La descripción completa de cada una de estas referencias se basa en y se incorpora al presente documento como referencia.

1. Arico, B., R. Gross, J. Smida, y R. Rappuoli. 1987. Evolutionary relationships in the genus Bordetella. Mol. Microbiol. 1: 301-308.

2. Arico, B., J. F. Miller, C. Roy, S. Stibitz, D. Monack, S. Falkow, R. Gross, y R. Rappuoli. 1989. Sequences required-for expression of Bordetella pertussis virulence factors share homology with prokaryotic signal transduction proteins. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 86:6671-6675.

3. Boursaux-Eude, C., G. Thiberge, G. Carletti, y N. Guiso. 1999. Intranasal murine model of Bordetella pertussis infection: II. Sequence variation and protection induced by a tricomponent acellular vaccine. Vaccine. Infect. Immum. 56:3189-3195.

4. Brennan, M. J., Z. M. Li, J. L. Cowell, M. E. Bisher, A. C. Steven, P. Novotny, y C. R. Manclark. 1988. Identification of a 69-kilodalton nonfimbrial protein as an agglutinogen of Bordetella pertussis. Infect. Immun. 56:3189-3195.

5. Charles, I. G., G. Dougan, D. Pickard, S. Chatfield, M. Smith, P. Novotny, P. Morrissey, y N. F. Fairweather. 1989. Molecular cloning and characterization of protective outer membrane protein P.69 from Bordetella pertussis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:3554-3558.

6. Charles, I. G., J. L. Li, M. Roberts, K. Beesley, M. Romanos, D. J. Pickard, M. Francis, D. Campbell, G. Dougan, M. J. Brennan, C. R. Manclarck, M. A. Jensen, I. Heron, A. Chubb, P. Novotny, y N. F. Fairweather. 1991. Identification and characterization of a protective immunodominant B cell epitope of pertactin (P.69) from Bordetella pertussis. Eur. J. Immunol. 21:1147-1153.

7. Goodnow, RA. 1980. Biology of Bordetella bronchiseptica. Microbiol. Rev. 44:722-738.

8. Gueirard, P., C. Weber, A. Le Coustumier, y N. Guiso. 1995. Human Bordetella bronchiseptica infection related to contact with infected animals: persistence of bacteria in host. J. Clin. Microbiol. 33:2002-2006.

9. Hewlett, E. L., y J. D. Cherry. 1997. New and improved vaccines against pertussis, vol. 2º. Coordinating eds., M. M. Levine, G. C. Woodrow, J. B. Kaper, y G. S. Cobon. Marcel Dekker, Nueva York.

10. Higgins, D. G., y P. M. Sharp. 1988. CLUSTAL: a package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer. Gene. 73:237-244.

11. Khelef, N., B. Danve, M. J. Quentin-Millet, y N. Guiso. 1993. Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis: - two immunologically distinct species. Infect. Immun. 61:486-490.

12. Kobisch, M., y P. Novotny. 1990. Identification of a 68-kilodalton outer membrane protein as the major protective antigen of Bordetella bronchiseptica by using specific-pathogen-free piglets. Infect. Immun. 58:352-357.

13. Leininger, E., M. Roberts, J. G. Kenimer, I. G. Charles, N. Fairweather, P. Novotny, y M. J. Brennan. 1991. Pertactin, an Arg-Gly-Asp-containing Bordetella pertussis surface protein that promotes adherence of mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:345-349.

14. Li, J., N. F. Fairweather, P. Novotny, G. Dougan, e I. G. Charles. 1992. Cloning, nucleotide sequence and heterologous expression of the protective outer-membrane protein P.68 pertactin from Bordetella bronchiseptica. J. Gen. Microbiol. 138:1697-1705.

15. Li, L. J., G. Dougan, P. Novotny, e I. G. Charles. 1991. P.70 pertactin, an outer-membrane protein from Bordetella parapertussis: cloning, nucleotide sequence and surface expression in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 5:409-417.

16. Montaraz, J. A., P. Novotny, y J. Ivanyi. 1985. Identification of a 68-kilodalton protective protein antigen from Bordetella bronchiseptica. Infect. Immun. 47:744-751.

17. Mooi, F. R., H. van Oirschot, K. Heuvelman, H. G. J. van der Heide, W. Gaastra, y R. J. L. Willems. 1998. Polymorphism in the Bordetella pertussis virulence factors P.69/pertactin and pertussis roxin in the Netherlands: Temporal trends and evidence doe vaccine-driven evolution. Infect. Immun. 66:670-675.

18. Novotny, P., A. P. Chubb, K. Cownley, J. A. Montaraz, y J. E. Beesley. 1985. Bordetella adenylate cyclase: a genus specific protective antigen and virulence factor. Develp. Biol. Standard. 61:27-41.

19. Novotny, P., M. Kobisch, K. Cownley, A. P. Chubb, y J. A. Montaraz. 1985. Evaluation of Bordetella bronchiseptica vaccines in specific-pathogen-free piglets with bacterial cell surface antigens in enzyme-linked immunosorbent assay. Infect. Immun. 50:190-198.

20. Shahin, R. D., M. J. Brennan, Z. M. Li, B. D. Meade, y C. R. Manclark. 1990. Characterization of the protective capacity and immunogenicity of the 69-kD outer membrane protein of Bordetella pertussis. J. Exp. Med. 171:63-73.

21. Stibitz, S., W. Aaronson, D. Monack, y S. Falkow. 1989. Phase variation in Bordetella pertussis by frameshift mutation in a gene for a novel two-component system. Nature. 338:266-269.

22. Woolfrey, B. F., y J. A. Moody. 1991. Human infections associated with Bordetella bronchiseptica. Clin. Microbiol. Rev. 4:243-255.

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<120> POLIPÉPTIDOS QUE CONTIENEN POLIMORFISMOS DE LAS REGIONES REPETIDAS DE PERTACTINA EN BORDETELLA PERTUSSIS, BORDETELLA PARAPERTUSSIS Y BORDETELLA BRONCHISEPTICA, SU USO EN DIAGNÓSTICO Y EN COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS

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<130> B4888 - AD/VMA/CAL

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<140> documento PCT/EP 01/06457

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<141> 23-05-2001

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<150> documento US 60/206.969

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<151> 25-01-2002

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<160> 25

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 3000

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<212> ADN

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 1

14

15

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<210> 2

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<211> 2733

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<212> ADN

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<213> Bordetella pertussis

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<400> 2

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16

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<210> 3

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<211> 3116

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<212> ADN

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<213> Bordetella parapertussis

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<400> 3

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17

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<210> 4

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<211> 911

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 4

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18

19

20

21

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<210> 5

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<211> 910

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<212> PRT

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<213> Bordetella pertussis

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<400> 5

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22

23

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25

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<210> 6

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<211> 922

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<212> PRT

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<213> Bordetella parapertussis

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<400> 6

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<210> 7

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<211> 51

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 7

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30

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<210> 8

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<211> 46

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 8

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31

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<210> 9

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<211> 56

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 9

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32

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<210> 10

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<211> 56

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 10

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33

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<210> 11

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<211> 61

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 11

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34

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<210> 12

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<211> 56

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 12

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<210> 13

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<211> 51

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 13

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<210> 14

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<211> 49

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 14

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<210> 15

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<211> 52

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 15

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<210> 16

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<211> 60

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 16

39

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<210> 17

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<211> 53

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 17

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40

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<210> 18

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<211> 56

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 18

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41

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<210> 19

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<211> 58

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 19

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42

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<210> 20

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<211> 48

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 20

43

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<210> 21

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<211> 52

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 21

44

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<210> 22

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<211> 54

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 22

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<210> 23

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<211> 42

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 23

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46

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<210> 24

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<211> 39

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 24

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<210> 25

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Bordetella bronchiseptica

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<400> 25

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\sa{Gly Gly Xaa Xaa Pro}

Claims

1. Composición inmunogénica que comprende una mezcla de al menos dos pertactinas o fragmentos de pertactina de Bordetella bronchiseptica, en la que dichas pertactinas o fragmentos contienen al menos la región II, o tanto la región I como la región II y en la que dichas pertactinas o fragmentos difieren entre sí, en sus respectivas secuencias de aminoácidos, en al menos la región II o las regiones I y II.

2. Composición inmunogénica según la reivindicación 1, en la que al menos dos de las pertactinas o fragmentos de pertactina de Bordetella bronchiseptica difieren al menos en el número de secuencias de aminoácidos PQP de repetición en su región II.

3. Composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que cada pertactina o fragmento de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende 6, 7, 8 ó 9 secuencias de aminoácidos PQP de repetición en la región II de los mismos.

4. Composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que los fragmentos de pertactina contienen desde aproximadamente 48 hasta aproximadamente 60 aminoácidos.

5. Composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que al menos una pertactina o fragmento de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:22.

6. Composición inmunogénica según la reivindicación 1, en la que cada pertactina o fragmento de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende la región I.

7. Composición inmunogénica según la reivindicación 6, en la que al menos dos de las variantes de pertactina de Bordetella bronchiseptica difieren al menos en el número de secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición en su región I.

8. Composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, en la que cada variante de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende 1, 2 ó 3 secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición en la región I de las mismas.

9. Composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en la que XX del motivo GGXXP se selecciona de FD, FG o AV.

10. Composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la que los fragmentos de pertactina contienen desde aproximadamente 46 hasta aproximadamente 56 aminoácidos.

11. Composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en la que al menos una pertactina o fragmento de pertactina de Bordetella bronchiseptica comprende la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9.

12. Composición inmunogénica según la reivindicación 1, que comprende una mezcla de pertactinas o fragmentos de pertactina de Bordetella bronchiseptica, en la que al menos uno de dicha pertactina o fragmento de Bordetella bronchiseptica comprende la región II de pertactina de Bordetella bronchiseptica que tiene 6, 7, 8 ó 9 secuencias de aminoácidos PQP de repetición en la región II de los mismos, y al menos otro de dicha pertactina o fragmento de Bordetella bronchiseptica comprende la región I de pertactina de Bordetella bronchiseptica que tiene 1, 2 ó 3 secuencias de aminoácidos GGXXP de repetición en la región I del mismo.

13. Composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicha composición comprende al menos un polipéptido que comprende una secuencia o un fragmento de dicha secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:22.

14. Composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que consiste esencialmente en:

a): un polipéptido que comprende la región I y la región II, o un polipéptido que comprende la región I y un polipéptido que comprende la región II de una pertactina de Bordetella bronchiseptica cepa 9.73, consistiendo dichas región I y región II respectivamente en SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO: 16.

b): un polipéptido que comprende la región I y la región II, o un polipéptido que comprende la región I y un polipéptido que comprende la región II, de una pertactina de Bordetella bronchiseptica de la cepa SEI, consistiendo dichas región I y región II respectivamente en SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:22.

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15. Composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que consiste esencialmente en:

a): un polipéptido que comprende la región I y la región II, o un polipéptido que comprende la región I y un polipéptido que comprende la región II de una pertactina de Bordetella bronchiseptica cepa 9.73 depositada en la Colección Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM, Collection Nationale de Culture de Microorganismes) el 12 de mayo de 1989 con el número I-858, y

16. Composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende también pertactinas de Bordetella parapertussis o un fragmento de las mismas que pueden inducir una respuesta inmunitaria celular o humoral frente a infecciones por Bordetella, o de Bordetella pertussis o un fragmento de las mismas que pueden inducir una respuesta inmunitaria celular o humoral frente a infecciones por Bordetella, o mezclas de las mismas.

17. Vacuna que comprende una composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. Kit de vacunación que comprende al menos una composición inmunogénica según las reivindicaciones 1 a 16, y medios para administrar la composición a un animal.

19. Composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que la composición comprende además al menos una adhesina de Bordetella seleccionada del grupo que consiste en FHA, AGG2, AGG3 y/o al menos una toxina de Bordetella seleccionada del grupo que consiste en PTX, DNT, TCT, Ac-Hly.