ES2303513T3 - Genoma del intersubtipo (c/b') de vih-1 y sus aplicaciones. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido con la secuencia de ácido nucleico según la SEC ID NO:1, 2 ó 3 o una secuencia de los números de nucleótido de 167 a 1654, de 1447 a 4458, de 5589 a 8168, de 4403 a 4984, de 4924 a 5214, de 5426 a 5671,de 8170 a 8790, de 5195 a 5409, de 7730 a 7821, de 5334 a 5409 o de 7730 a 7821, o una secuencia relacionada con un polinucleótido desde 5195 hasta 5409 y de 7730 a 7821 o de 5334 a 5409 y de 7730 a 7821, en cada caso con respecto a la SEC ID NO:1.

Description

Genoma del intersubtipo (C/B') de VIH-1 y sus aplicaciones.

La presente invención se refiere a un polinucleótido, tal como se define en la reivindicación 1 adjunta. La presente invención se refiere además a polipéptidos, tal como se definen en la reivindicación 8 adjunta. Los polinucleótidos y polipéptidos pueden usarse como fármacos, vacunas o medios diagnósticos, especialmente para el tratamiento, la prevención y el establecimiento de diagnóstico de infecciones por VIH.

En vista de la dimensión y de la propagación global de la pandemia provocada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) con un número estimado, hasta el final de este siglo, de más de 40 millones de individuos infectados en todo el mundo (de ellos más del 90% en países en vías de desarrollo) el desarrollo de una vacuna contra el VIH eficaz representa uno de los mayores desafíos para el mundo moderno industrializado. Hasta la fecha, el desarrollo de una vacuna contra el VIH satisfactoria está limitado sin embargo todavía por la complicada biología del virus así como su compleja interacción con el sistema inmunitario del huésped. Los pocos candidatos de vacuna, que hasta el día de hoy se han sometido a prueba en estudios de fase 3 en países en vías de desarrollo, se basan principalmente en las glicoproteínas externas gp120 o gp160 del VIH de tipo 1. Sin embargo, el resultado de los estudios fue más bien decepcionante: las vacunas no sólo no estaban en condiciones de provocar ampliamente reacciones de células T y anticuerpos de neutralización cruzada. Ni siquiera podían impedir la aparición de infección, que se ha observado en el caso algunos sujetos recién vacunados. Uno de los motivos para este fracaso se encuentra seguramente en las variaciones de secuencias extensas entre los antígenos usados, que provienen de cepas de virus adaptadas en el laboratorio, y en los virus genéticamente divergentes, que circulan en las regiones sometidas a prueba (por ejemplo Tailandia).

Los análisis filogenéticos de las cepas de VIH que circulan en todo el mundo tienen un grupo principal (M) con 10 subtipos (A-J) de secuencias distintos (Kostrikis et al. 1995; Leitner y Albert, 1995; Gaywee et al. 1996; World Health Organisation Network for VIH Isolation and Characterization, 1994), que presentan en la proteína de la envuelta variaciones de secuencia de hasta el 24%, y además los virus del grupo O identificados, que se diferencian en algunos marcos de lectura en más del 40% de los virus del grupo M (Loussert Ajaka et al. 1995; Myers et al. 1996; Sharp et al. 1995; Sharp et al. 1999). Además el VIH se desarrolla mediante la rápida aglomeración de mutaciones y recombinaciones de intersubtipos cada vez más. Los subtipos diferentes, que circulan conjuntamente dentro de la población de una región geográfica, representan la base molecular para la generación y la expansión de virus del mosaico de intersubtipos en todos sus grupos. Aunque se han examinado de manera intensiva las variantes de VIH-1 propagadas en todo el mundo mediante pruebas serológicas y análisis de ADN heterodúplex, la mayoría de los análisis filogenéticos se basan en las secuencias de la proteína de la envuelta, dado que para muchos de los subtipos prevalentes y un gran número de formas recombinantes no existe un genoma secuenciado completamente.

Los virus del subtipo no-B (o sea, variantes no-B) son los responsables de la principal mayoría de las nuevas infecciones por VIH-1 en todo el mundo. A los virus del subtipo C les corresponde a este respecto en cuanto al número total de individuos infectados así como a la amplia propagación de nuevas infecciones, especialmente en Sudamérica y Asia, un papel destacado. Debido a esto, la caracterización de virus del subtipo C tiene una prioridad destacada para fines diagnósticos, terapéuticos o preventivos.

A excepción de Tailandia, hasta hace poco existía sólo información limitada sobre la distribución y la característica molecular de las cepas de VIH-1 presentes en Asia. Según estimaciones de la OMS, el VIH se extiende lo más rápidamente en el sur y el sudeste de Asia, que pronto será la mayor región de todo el mundo con epidemia de VIH. China está sujeta a estructuras sociales y económicas similares y mantiene con estas regiones relaciones económicas y étnicas directas. En muchas provincias de China pudo observarse desde el comienzo de 1995 un aumento rapidísimo de infecciones por VIH. En comparación con los 1774 casos documentados desde 1985 hasta 1994 de VIH y SIDA, ya sólo en el año 1995 se demostraron 1421 casos y en el año 1997 más de 4000 casos. La OMS parte de más de 400.000 infecciones por VIH en China hasta el final de 1997, con hasta entonces 6400 defunciones y un número estimado de 4000 defunciones sólo en el año 1997. En el informe nacional de epidemiología molecular del VIH publicado recientemente se encontró que las cepas de Tailandia del prototipo-subtipo B y del subtipo B' en Yunnan, una provincia del sudoeste de China, que limita con el triángulo de la droga de Myanmar, Laos y Tailandia (Graf et al. 1998), se han propagado por los consumidores de drogas y por puntos de recogida de plasma y sangre contaminada hasta el centro y el este de China. En los primeros años de la década de 1990 se introdujo luego en la misma región una segunda epidemia, muy probablemente por los UDI (usuarios de drogas intravenosas) indios infectados con cepas del subtipo C, o sea personas de la India, que usan drogas por vía intravenosa (Luo et al. 1995; Shao et al. 1999). En el plazo de pocos años se propagaron los virus del subtipo C por el contrabando de drogas rápidamente al sur, al centro e incluso al noroeste de China y provocaron una propagación adicional de la epidemia en China. De acuerdo con un informe de investigación nacional de epidemiología molecular del VIH publicado recientemente, casi todas las personas infectadas por virus del subtipo C son UDI y constituyen con esto aproximadamente el 40% de todos los UDI infectados por VIH en China. Esto sugiere que los virus del subtipo C figuran entre los subtipos de VIH-1 más importantes, que prevalecen entre los UDI en China (Shao et al. 1998, Shao et al. 1994).

Esto sugiere que la epidemia de VIH entre los UDI en China se ha intensificado en el plazo de pocos años desde un único subtipo (B) dominante hasta al menos 2 subtipos dominantes, B-Thai y C, lo que aumenta la posibilidad de la recombinación intersubtipos. Según nuestro nivel de conocimiento hasta el momento sobre la variabilidad y la antigenicidad de las diferentes cepas de virus, los medios diagnósticos, los agentes terapéuticos y las vacunas deben adaptarse a las cepas de virus regionales. Sin embargo el número de reactivos moleculares para los virus del subtipo no-B está todavía extremadamente limitado. A parte de para los virus del subtipo B o C hasta ahora están disponibles sólo pocos clones moleculares no recombinantes y pocos genomas del mosaico. En lo que se refiere a los virus de la IH-1 del subtipo C, hasta ahora están publicados sólo representantes no recombinantes y cuatro recombinantes A/C, que proceden todos de África, Sudamérica o la India (Luo et al. 1995; Gao et al. 1998; Lole et al. 1999). Además los datos recogidos hasta ahora sobre virus del subtipo C en China se limitan a subtipificaciones genéticas del gen de env (Luo et al. 1995; Yu et al. 1997; Salminen et al. 1995).

Varios estudios clínicos para combatir infecciones por VIH se realizaron hasta ahora con vacunas. Los resultados decepcionantes, que se observaron en los estudios clínicos, contienen apariciones de infección notificadas repetidamente en el caso de los sujetos recién vacunados. Esto se debía sobre todo a las extensas variaciones de secuencia entre las proteínas de la envuelta administradas y el virus de entrada infeccioso, lo que en realidad se debe principalmente a una caracterización insuficiente de la población de virus que circula en una región geográfica determinada. Esto dio como resultado la generación de respuestas inmunitarias humorales y (en escasa medida) de respuestas inmunitarias mediadas por células contra antígenos virales, que no eran relevantes para los virus que circulaban en la población del territorio sometido a prueba. Además pudo demostrarse que los anticuerpos poco afines, dirigidos específicamente contra la proteína de la envuelta no sólo no presentan propiedades de neutralización, sino que además contribuyen incluso a un refuerzo de la infección por medio del receptor de complemento o de Fc. Además, los antígenos seleccionados y los sistemas de administración demostraron ser extremadamente débiles para la inducción de la respuesta inmunitaria mediada por células.

Ante una falta de conocimiento preciso sobre las respuestas inmunitarias protectoras en todos los subtipos así como sobre la compleja situación en los países en vías de desarrollo, en los que de manera conocida circulan conjuntamente muchos subtipos de VIH-1, las preparaciones de vacuna deben contener mezclas de antígenos representativos. Por tanto existe así una necesidad del aislamiento y de la caracterización de virus del subtipo C, especialmente para la clonación de la región codificante.

El objetivo de la presente invención se soluciona mediante el objeto definido en las reivindicaciones.

Las siguientes figuras explican la presente invención.

La figura 1 muestra una representación de la relación filogenética de la región que codifica la C2V3 del gen de env del clon 97cn54 con respecto a los representantes de los subtipos importantes de VIH-1 (grupo M). "cn-con-c" representa la secuencia consenso de env de las cepas de VIH-1 del subtipo C, que prevalecen en China. El linaje filogenético se preparó por medio del procedimiento del vecino más próximo ("neighbour joining"). Los valores en las intersecciones indican los remuestreos ("bootstraps") en %, que favorecen la agrupación a la derecha. Sólo se indican los valores de remuestreo que alcanzan o superan el 70%. Los corchetes a la derecha representan las secuencias de los subtipos más importantes de VIH-1, grupo M.

La figura 2 muestra una representación del análisis RIP (Recombinant Identification Program (programa de identificación recombinante)), Versión 1.3, de toda la zona que codifica gagpol de 97cn54 (tamaño de ventana: 200, valor umbral para la significación estadística: 90%, tratamiento de huecos: STRIP). Las posiciones de los marcos de lectura abiertos de gag y pol están representadas por flechas en la parte de arriba en el diagrama. El análisis RIP se basaba en las comparaciones de fondo con el uso de secuencias de referencia, que se derivan de cepas de virus seleccionadas que representan los subtipos más importantes de VIH-1. Los representantes patrón están marcados con distintos colores, tal como se señala. El eje x indica las posiciones de nucleótido a lo largo de la comparación de secuencia. El eje y indica la similitud de 97cn54 con los subtipos de referencia enumerados.

La figura 3 muestra una representación de la relación filogenética de distintas regiones dentro de marcos de lectura derivados de 97cn54 de gagpol con representantes patrón de los subtipos más importantes de VIH-1 (grupo M). Con el uso del procedimiento del vecino más próximo que se basa en los siguientes tramos de secuencia: (A) nucleótidos 1-478, (B) 479-620, (C) 621-1290, (D) 1291-1830, (E) 1831-2220, (F) 2221-2520 y (G) 2521-2971 se prepararon linajes filogenéticos. Las posiciones indicadas se refieren al primer nucleótido del marco de lectura abierto de gag. Las zonas grises caracterizan las agrupaciones de las secuencias analizadas con cepas de referencia derivadas del subtipo C (A, C, E, G) o bien del subtipo B (B, D, F). Los valores en las intersecciones indican los valores de remuestreo en porcentaje, mediante los que se confirmó la

\hbox{agrupación
a la derecha.  Se muestran sólo valores de remuestreo del 70% o
más.}

La figura 4 muestra una representación del análisis RIP, Versión 1.3, de distintas regiones de 97cn54 (tamaño de ventana: 200, valor umbral para la significación estadística: 90%, tratamiento de huecos: STRIP). El análisis comprendía (A) una zona de secuencia de 1500 pb de longitud desde el codón de iniciación del gen de vif hasta el extremo 5' de env inclusive vif, vpr, el primer exón de tat y rev, vpu y los primeros 200 pb del gen de env y (B) un fragmento de aproximadamente 700 pb de longitud, que solapa 300 pb desde el extremo 3' de env, que comprenden el gen nef completo y partes de la región LTR en 3'. Las posiciones de los codones de iniciación de vpr, tat, vpu, env, nef y el extremo 5' de la región LTR en 3' están señaladas en cada caso en la parte de arriba de los diagramas mediante flechas. El análisis RIP se basaba en las comparaciones de fondo con el uso de secuencias que se derivaban de cepas de virus seleccionadas, que representaban los subtipos más importantes de VIH-1. Los representantes patrón indicados están caracterizados por distintos colores. El eje x indica las posiciones de nucleótido a lo largo de la comparación de secuencia. El eje y indica la similitud de 97cn54 con los subtipos de referencia enumerados. (C) y (D) muestran análisis RIP de secuencias de dos aislados de C independientes (xj24 y xj158) de China, que solapan el gen de vpr y de vpu inclusive el primer exón de tat.

La figura 5 muestra el análisis de un linaje filogenético. Los linajes filogenéticos se prepararon con el uso del procedimiento del vecino más cercano basándose en (A) un fragmento de 380 pb de longitud, que solapa 150 pb desde el extremo 3' del gen de vpr hasta el extremo del marco de lectura de vpu, (B) los primeros 290 pb de la región codificante de nef y (C) en los 320 pb en el extremo 3' del gen nef. Los valores en las intersecciones indican los valores de remuestreo en porcentaje, mediante los que se confirmó la agrupación a la derecha. Se muestran sólo valores de remuestreo del 70% o más. Los corchetes a la derecha representan las secuencias de subtipos más importantes de VIH-1, grupo M.

La figura 6 es una representación esquemática de la organización de tipo mosaico del genoma de 97cn54.

La figura 7 es una representación de la comparación entre epítopos de CTL identificados experimentalmente y conocidos del prototipo B (VIH-1_{LAI}) y de las secuencias de aminoácidos correspondientes de los polipéptidos de gag, pol y env de la cepa 97cn54 del subtipo C. Los dominios funcionales en GAG (matriz p17, cápsida p24, nucleocápsida p15 y proteína de unión), POL (PR proteasa, RT transcriptasa inversa, IN integrasa) y ENV (gp 120 glicoproteína externa, gp41 proteína transmembrana) se denominan de manera correspondiente. Los números debajo de los marcos de lectura abiertos indican la posición de aminoácido con respecto a los extremos aminoterminales de los polipéptidos. Las restricciones de haplotipo de los epítopos de CTL conocidos de VIH-1_{LAI} están indicados en el margen izquierdo o derecho. Las barras verdes caracterizan la identidad de secuencia entre el epítopo conocido y la secuencia correspondiente del subtipo C, las barras azules significan 2 o menos apareamientos erróneos conservativos. Las barras rojas representan zonas de secuencia derivadas del subtipo C con más de 2 apareamientos erróneos conservativos o sustituciones no conservativas en comparación con el epítopo derivado de LAI correspondiente.

La figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos codificante completa de 97cn54 de VIH-1, subtipo C (SEC ID Nº:1), con los aminoácidos correspondientes en el código de una letra. Se indican los 3 marcos de lectura. Los asteriscos representan codones de terminación.

La figura 9 muestra en una representación el resultado de las actividades de células T citotóxicas en células de bazo de ratones BALB/c tras inmunización intramuscular con los plásmidos de ADN señalados. Las células linfoides, obtenidas 3 semanas tras la inmunización primaria a partir de en cada caso 5 ratones por grupo, se cultivaron conjuntamente con células (irradiadas con 20.000 rad) de mastocitoma P815 singénicas cargadas con péptido Gag, AMQMLKETI (código de una letra). Los controles incluían células de bazo de ratones no inmunizados, estimuladas con células P815 cargadas con péptido. Las poblaciones de células efectoras citotóxicas se recogieron in vivo tras un cultivo de 5 días. Las respuestas citotóxicas se seleccionaron frente a células A20, cargadas con el péptido nonamérico representado en la parte de arriba o frente a células A20 no cargadas, en una prueba convencional de liberación de ^{51}Cr. Los datos mostrados representan los valores medios de, en cada caso, ensayos por triplicado. Las desviaciones estándar halladas se encontraban en cada caso por debajo del 15% medidas en el valor medio.

Los términos "epítopo" o "determinante antigénico", tal como se usan a continuación significan un grupo determinante inmunológicamente de un antígeno, que se reconoce específicamente por un anticuerpo. Un epítopo puede comprender anticuerpos en una conformación tridimensional o discontinua y comprende al menos 3, preferiblemente al menos 5, aminoácidos. Un epítopo puede comprender también un único segmento de una cadena polipeptídica que comprende una secuencia de aminoácidos continua.

El término "polinucleótido", tal como se usa a continuación, se refiere a un heteropolímero de cadena sencilla o doble de unidades nucleotídicas de cualquier longitud, pudiendo ser éstas ribo- o bien desoxirribonucleótidos. El concepto comprende también nucleótidos modificados.

El término "derivado", tal como se usa a continuación, designa un ácido nucleico, que también codifica el o los polipéptidos, que se codifican por otra secuencia de nucleótidos, aunque su secuencia de nucleótidos se diferencia de la otra secuencia de nucleótidos. En este sentido el término "derivado" designa también equivalentes de la otra secuencia de nucleótidos, que existen debido a la degeneración del código genético. Bajo el término derivado se encuentran por ejemplo ácidos nucleicos, que codifican los mismos polipéptidos que la secuencia de nucleótidos según la SEC ID Nº:1, 2 ó 3, pero presentan otra secuencia de nucleótidos, o se encuentran también bajo el término fragmentos de ácido nucleico, que codifican el mismo polipéptido que los fragmentos de ácido nucleico de la secuencia de nucleótidos según la SEC ID Nº:1, 2 ó 3.

El término "polipéptido", tal como se usa a continuación, se refiere a una cadena de al menos 2 restos de aminoácido, que están unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. El término comprende por tanto todas las cadenas de aminoácidos, por ejemplo oligopéptidos y proteínas. El término se refiere también a aquellas cadenas de aminoácidos, en las que uno o varios aminoácido(s) está(n) modificado(s), por ejemplo mediante acetilación, glicosilación o fosforilación.

La expresión "secuencia continua" y "fragmentos", tal como se usa a continuación, se refiere a un tramo lineal de nucleótidos o aminoácidos, que proviene de una secuencia de referencia, por ejemplo de las secuencias de la presente invención, tal como se reproducen en el protocolo de secuencias.

La expresión "hibridación selectiva" o "que puede hibridarse de manera selectiva", tal como se usa a continuación, se refiere a las condiciones de hibridación en las que dos polinucleótidos en condiciones de hibridación rigurosas forman moléculas nucleotídicas dúplex. Estas condiciones se conocen en el estado de la técnica y se describen por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory (1989), ISBN 0-87969-309-6. Los ejemplos de condiciones de hibridación rigurosas son: (1) hibridación en 4 x SSC a 65ºC o (2) hibridación en formamida al 50% en 4 x SSC a 42ºC, en cada caso seguida de varias etapas de lavado en 0,1 x SSC a 65ºC (1 hora de duración).

La expresión "vector viral" o "vector bacteriano", tal como se usa a continuación, se refiere a virus o bacterias modificados mediante ingeniería genética, con los que pueden producirse las secuencias de ADN expuestas en las SEC ID Nº:1, 2 ó 3, derivados, fragmentos, secuencias que se derivan de las mismas que codifican epítopos o series de epítopos en células diferentes, preferiblemente en células presentadoras de antígeno tales como por ejemplo células dendríticas. Un vector bacteriano puede ser adecuado además para expresar directamente un polipéptido codificado por la SEC ID Nº:1, 2 ó 3, epítopos o series de epítopos derivados de las mismas.

Un aspecto de la presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos, tal como se describe en la SEC ID Nº:1, SEC ID Nº:2 o SEC ID Nº:3. En primer lugar se realizó un estudio de epidemiología molecular entre más de 100 UDI de China, que eran seropositivos con respecto al subtipo C de VIH-1, para recoger la información necesaria sobre los genomas virales representativos de longitud fundamentalmente completa. La genotipificación a base de la región 2 constante y de la región 3 variable (C2V3) dentro del gen para la glicoproteína de la envuelta viral dio a conocer la mayor homología de las cepas de virus más prevalentes, que circulan en toda China, con respecto a secuencias del subtipo C de origen indio. Basándose en estos resultados se amplificó y subclonó directamente un genoma de longitud fundamentalmente completa a partir de células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) de un UDI infectado con VIH seleccionado, que representa la clase más prevalente de las cepas C que circulan en toda China. El análisis de secuencias identificó una estructura de mosaico, lo que señala procesos de recombinación intersubtipos extensos entre los genomas de las cepas de virus Thai de subtipo C y (B') de esa región geográfica. Un análisis RIP (análisis de programa de identificación recombinante) y remuestreo filogenético sugerían en total 10 puntos de ruptura (i) en la región codificante de gagpol, (ii) en vpr y en el extremo 3' del gen de vpu y (iii) en el marco de lectura abierto de nef. Las secuencias de (B') de Thai comprenden por tanto (i) varias inserciones en la región codificante de gagpol (nucleótidos 478-620, 1290-1830, 2221-2520, en cada caso con respecto al primer nucleótido dentro del codón de iniciación del marco de lectura de Gag o de GagPol), (ii) 3'-vpr, el vpu completo, los primeros exones de tat y rev (aproximadamente 1000 nucleótidos que comienzan aproximadamente en el nucleótido 138 con respecto al codón de iniciación del marco de lectura de Vpr) y (iii) la mitad en el sentido de 5' del gen nef (nucleótidos 1-300). Las zonas restantes dentro de la secuencia que comprende 9078 nucleótidos (SEC ID Nº:1; tabla 3) presentan las homologías más altas con respecto a aislados del subtipo C conocidos. Los puntos de ruptura de 97cn54, que están localizados en la región codificante de vpr/vpu o en el gen nef, se encontraron en posiciones similares en el caso de muchas cepas del subtipo C, que se aislaron a partir de UDI, que viven en distintas zonas de China. Esto sugiere una procedencia común para las cepas recombinantes de C/B'. En más del 50% de los epítopos de CTL bien definidos, que proceden del subtipo B, dentro de Gag y Pol y en el 10% de los epítopos conocidos en Env, se encontró que las secuencias dentro de estas cepas de referencia quiméricas de C/B' coincidían exactamente. Estos resultados pueden facilitar claramente los esfuerzos con respecto a las vacunas en China, preparándose matrices extraordinariamente importantes para la concepción de vacunas y desarrollándose reactivos para los procedimientos de selección inmunológicos/virológicos más adecuados.

El uso de la secuencia descrita según la presente invención, de una secuencia de VIH-1, que representa la cepa de virus de tipo C más prevalente dentro de China, como base y material de partida es ventajoso para el desarrollo de vacunas que pueden utilizarse de manera preventiva o terapéutica. Las consecuencias necesarias para el desarrollo de un candidato de vacuna contra el VIH satisfactorio son (i) conocimientos detallados sobre la situación epidemiológica respectiva y (ii) la disponibilidad de una secuencia codificante clonada, que dentro de una región geográfica o de una población determinada representa la cepa de virus más prevalente. Tales secuencias representan la base (i) para la concepción racional de candidatos de vacuna contra VIH que pueden utilizarse de manera preventiva y terapéutica, (ii) para el desarrollo de agentes terapéuticos específicos, tales como por ejemplo oligonucleótidos señuelo (Decoy) terapéuticamente activos y proteínas, constructos antisentido, ribozimas y mutantes transdominantes negativamente activos (iii) para el desarrollo de vectores lentivirales para la terapia génica y (iv) la producción de reactivos que pueden utilizarse para el diagnóstico y el control de la evolución de la infección por VIH así como la vigilancia inmunológica/viral del proceso de vacunación.

Esto es especialmente acertado para los candidatos de vacuna que se basan en proteínas de la envuelta del VIH, de los que se demostró que, entre todas las proteínas del VIH, presentaban la mayor variabilidad. Además, una vacuna satisfactoria deberá inducir muy probablemente ambos brazos del sistema inmunitario: anticuerpos neutralizantes, respuestas inmunitarias dirigidas de manera ideal contra epítopos conformacionales en la proteína de la envuelta así como respuestas inmunitarias mediadas por células (células T cooperadoras CD4-positivas, células T citolíticas CD8 positivas, citocinas del tipo Th-1, \beta-quimiocinas), generadas contra epítopos de distintas proteínas virales. El epítopo conformacional según la presente invención consiste en al menos 3 aminoácidos, preferiblemente en 5 o más aminoácidos, que están implicados en la unión a anticuerpos. Los epítopos conformacionales pueden componerse también de varios tramos de una única proteína o bien, en el caso de complejos oligoméricos tales como por ejemplo del complejo de glicoproteína de la envuelta trimérica, de varios tramos de diferentes subunidades. La longitud de un epítopo lineal de la presente invención varía normalmente y comprende al menos de 8 aminoácidos a aproximadamente 15 aminoácidos o más, prefiriéndose una longitud desde 9 aminoácidos hasta 11 aminoácidos especialmente en el caso de epítopos de CTL restringidos por CMH de clase I.

La presente invención se refiere por tanto también a polipéptidos, codificados por la secuencia de nucleótidos o fragmento o derivado de la secuencia de nucleótidos según la SEC ID Nº:1, 2 ó 3, tal como se define en la reivindicación 8. También se dan a conocer polipéptidos, que comprenden una secuencia continua de al menos 8 aminoácidos, que se codifican por la secuencia de nucleótidos o fragmentos o derivados de la secuencia de nucleótidos según la SEC ID Nº:1, 2 ó 3. Preferiblemente, el polipéptido según la invención comprende un determinante antigénico, que produce de manera natural una reacción inmunitaria en individuos infectados. Se prefieren especialmente polipéptidos, que comprenden una secuencia de aminoácidos, codificada por la secuencia de nucleótidos según la SEC ID Nº:2 ó 3 o sus derivados y fragmentos. Se prefieren especialmente epítopos que comprenden una zona continua desde 9 aminoácidos hasta 11 aminoácidos, que son idénticos entre los polipéptidos codificados por la SEC ID Nº:1 y un aislado de referencia de VIH-1_{LAI}, o presentan las 2 o menos sustituciones de aminoácido conservadas dentro de la secuencia que comprende de 9 aminoácidos a 11 aminoácidos. Los ejemplos de epítopos de este tipo están representados en el ejemplo 11. Los polipéptidos según la invención pueden usarse por ejemplo como vacunas y agentes terapéuticos o para diagnóstico.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un polinucleótido según la SEC ID Nº:1, 2 ó 3. También se da a conocer un fragmento de polinucleótido de la secuencia de nucleótidos según la SEC ID Nº:1, 2 ó 3, o un polinucleótido, que presenta al menos una secuencia continua de nucleótidos, que puede hibridarse de manera selectiva con la secuencia de nucleótidos, tal como se representa en la SEC ID Nº:1, 2 ó 3. También se dan a conocer derivados de los polinucleótidos o fragmentos de polinucleótido según la invención. El polinucleótido o el fragmento de polinucleótido comprende preferiblemente una secuencia continua de al menos 9 nucleótidos, de manera más preferida de al menos 15 nucleótidos, de manera todavía más preferida de al menos 27 nucleótidos, o una secuencia más larga. El polinucleótido o el fragmento de polinucleótido puede comprender también la región codificante de los genes de VIH individuales, tal como por ejemplo de gag, pol, env. Los ejemplos están indicados en la SEC ID Nº:2 y SEC ID Nº:3. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un polinucleótido, que comprende al menos 2 fragmentos de polinucleótido según la invención, pudiendo estar solapadas también las secuencias de los fragmentos de polinucleótido o pudiendo estar separadas entre sí por un espaciador nucleotídico. Las secuencias de los fragmentos de polinucleótido pueden ser idénticas o distintas. Los polinucleótidos o fragmentos de polinucleótido según la invención pueden usarse como vacunas o agentes terapéuticos o para el diagnóstico.

La secuencia codificante del clon 97cn54 y derivados del mismo, expuesta en forma de la SEC ID Nº:1, como representante del VIH-1 del subtipo C puede usarse como base para las siguientes aplicaciones:

Desarrollo de vacunas contra el VIH-1 específicas del subtipo-C para fines profilácticos y terapéuticos. Estas vacunas específicas de subtipo pueden usarse en todo el mundo en todas las regiones geográficas, en las que el virus del subtipo C desempeña un papel esencial para la epidemia del VIH, o sea, por ejemplo en Latinoamérica, en África y en Asia. Especialmente, las vacunas contra el VIH, que deben someterse a prueba en y deben desarrollarse para el sudeste de Asia y China deben basarse en la secuencia codificante descrita de 97cn54, para inducir respuestas inmunitarias mediadas por células y humorales específicas de subtipo. Además, tales vacunas específicas del subtipo C de VIH-1 pueden utilizarse como un componente en una vacuna cóctel, que tienen en cuenta todos o una selección definida de los subtipos de VIH relevantes en todo el mundo.

Para inducir buenas respuestas inmunitarias mediadas por células y humorales en los sujetos recién vacunados, los antígenos o las secuencias codificantes que deben añadirse al sistema inmunitario contienen preferiblemente (i) tramos continuos cortos de al menos de 3 a aproximadamente 5 aminoácidos de longitud o tramos más largos, derivados de uno de los marcos de lectura abiertos, tal como se reproducen en la tabla 3, (ii) zonas de preferiblemente 9 aminoácidos a 11 aminoácidos, (iii) combinaciones de estas zonas, que se administran por separado o bien como cadena polipeptídica (series de epítopos), pudiendo estar solapadas las series de epítopos o sus secuencias de aminoácidos o también pudiendo estar separadas por aminoácidos u otros espaciadores y de manera especialmente más preferida proteínas completas o las secuencias codificantes correspondientes o sus variantes, que pueden comprender también deleciones extensas. Por tanto, otro objetivo de la presente invención se refiere a polipéptidos, que se codifican por las secuencias de nucleótidos o fragmentos de las secuencias de nucleótidos, tal como están representadas en la SEC ID Nº:1, SEC ID Nº:2 y SEC ID Nº:3. Preferiblemente, el polipéptido comprende una secuencia continua de al menos 8 aminoácidos, preferiblemente al menos desde 9 aminoácidos hasta 11 aminoácidos, de manera especialmente más preferida de al menos 15 aminoácidos o secuencias más largas o epítopos discontinuos, que se componen preferiblemente de como mínimo tres aminoácidos de una única cadena polipeptídica o, en el caso de complejos de proteína oligoméricos, también de cadenas polipeptídicas diferentes. Los constructos de vacuna a base de la secuencia codificante de 97cn54 incluyen todas las formas de antígeno conocidas en el estado de la técnica y recurren a sistemas de administración correspondientes.

Los epítopos cortos, codificados por fragmentos de las secuencias de ácido nucleico según la SEC ID Nº:1 a 3, y que comprenden en cada caso de tres aminoácidos a cinco aminoácidos, preferiblemente desde 9 hasta 11 o más aminoácidos, pueden producirse preferiblemente de manera sintética. Los péptidos de este tipo contienen un epítopo de células B, un epítopo de células T cooperadoras restringido por CMH de clase II, un epítopo de células T citotóxico restringido por CMH de clase I o bien combinaciones de las variantes mencionadas. A este respecto pueden solaparse epítopos individuales o también estar separados entre sí por espaciadores, preferiblemente compuestos por restos de glicina y/o serina. Los péptidos de cadena ramificada pueden generarse de manera correspondiente al estado de la técnica durante la síntesis o bien con la ayuda de los agentes de reticulación químicos homo- y heterobifuncionales habituales que pueden adquirirse comercialmente y habituales a continuación de la síntesis y la purificación de los péptidos correspondientes. Como alternativa, los péptidos poco inmunógenos pueden conjugarse per se mediante reticulación también con proteínas portadoras tales como por ejemplo ovoalbúmina, insertarse mediante ingeniería genética en proteínas portadoras o fusionarse a su extremo N o C terminal. Preferiblemente las proteínas portadoras de este tipo pueden (i) en el caso de la expresión en sistemas de cultivo celular adecuados (véase a continuación) o (ii) tras el replegamiento adecuado de la proteína desnaturalizada, purificada, formar estructuras particulares, en las que los epítopos de células B se encuentran preferiblemente sobre la superficie del soporte particular. Entre tanto se conocen numerosos ejemplos de tales polipéptidos que tienden a la formación de estructuras particulares tales como por ejemplo el antígeno del núcleo (HBcAg) del virus de la hepatitis B, la proteína de superficie (HBsAg) del VHB, el antígeno específico de grupo del VIH, la proteína VP1 del poliomavirus, la proteína L1 del papilomavirus o la proteína TyA de la levadura. Debido al hecho de que la mayoría de las proteínas que forman partículas descritas hasta ahora, se componen de las proteínas estructurales o de la cápsida de los virus más diversos, se habla en este caso también de partículas similares a virus (VLP, virus-like particles; resumen: edición especial de Vaccine. (1999) Volumen 18. Advances in Peptide, Protein and Nucleic Acid Vaccine Strategies, editado por Pof. P.T.P. Kauyama)

Las series de epítopos y polipéptidos, codificados por fragmentos de las secuencias de ácido nucleico según la SEC ID Nº:1 a 3, con una longitud superior a 30, preferiblemente superior a 50 aminoácidos así como polipéptidos con una tendencia a la formación de estructuras particulares (VLP) pueden producirse y purificarse según el estado de la técnica en procariotas. Los plásmidos de este tipo contienen en consecuencia un origen de replicación bacteriano tal como por ejemplo ColE1, por regla general un marcador de selección tal como por ejemplo una resistencia frente a kanamicina o ampicilina, una unidad de control de la transcripción inducible o activa de manera constitutiva tal como por ejemplo el promotor de LacZ o de Tac, así como las señales para la iniciación de la traducción y la terminación de la traducción. Para la expresión simplificada y la purificación por afinidad pueden usarse también partes de fusión que pueden separarse opcionalmente y agentes auxiliares de purificación tales como por ejemplo la glutatión-S-transferasa o agentes auxiliares de purificación tales como por ejemplo etiquetas de oligohistidina (captadores).

Las secuencias de ADN o ARN que (i) se usan para la producción de las series de epítopos, proteínas completas o estructuras similares a virus en cultivos de células eucariotas tales como por ejemplo células de levadura, hongos, células de insecto o células de mamífero o que (ii) se utilizan para la administración directa de ADN para fines de inmunización, pueden confiar en un uso de los codones, tal como se usan por el propio virus. Como alternativa, el uso de los codones, siempre que sea técnicamente posible, puede adaptarse a los codones usados con más frecuencia o los segundos más frecuentes en genes que se expresan mucho en el respectivo sistema de producción. Los ejemplos de la optimización del uso de codones en un poligén optimizado bajo aspectos de seguridad, que incluye los genes Gag, Pol y Nef, así como el gen en la proteína de la envuelta se facilitan en la SEC ID Nº:2 y SEC ID Nº:3. Las SEC ID Nº:2 y 3 se especifican en detalle en el ejemplo 15.

El establecimiento de líneas celulares para la producción de las series de epítopos, polipéptidos o estructuras similares a virus en los sistemas de cultivo celular mencionados puede, de manera correspondiente al estado de la técnica, basarse en vectores, que a su vez además de un origen de replicación bacteriano, pueden incluir un marcador de selección positivo o negativo principalmente las regiones de control correspondientes para la transcripción y la traducción conforme a las normas de la proteína foránea. Los componentes descritos a continuación de los constructos de vacuna de ADN significan también a modo de ejemplo las moléculas que se encuentran también en vectores para la expresión de las series de epítopos, polipéptidos o proteínas completas en diferentes cultivos de células de mamífero.

En el caso de la forma más fácil de inmunización se trata de la administración directa de una vacuna de ADN pura. Ésta contiene fundamentalmente en el lado de 5' respecto a la zona codificante una región de control de la transcripción, también denominada región de promotor/potenciador, que puede seguir alternativamente un intrón funcional para el aumento de la expresión génica, (ii) una secuencia de Kozak inclusive un codón de iniciación de la traducción así como en el extremo 3' del gen foráneo un codón de terminación de la traducción seguido por una secuencia señal de poliadenilación. La región de promotor/potenciador puede favorecer preferiblemente una expresión constitutiva del producto génico deseado y se deriva por ejemplo de la región de control de la transcripción de un gen de citomegalovirus (CMV-IE) inmediato temprano (IE) o de la LTR (long terminal repeat, repetición terminal larga)) del virus del sarcoma de Rous (VSR). Como alternativa puede usarse una forma inducible de una región de control de la transcripción tal como por ejemplo un promotor Tet on/Tet off, en el que la transcripción se regula por ejemplo mediante la administración de tetraciclina o análogos correspondientes. Además en este caso es apropiado el uso de regiones de control de la transcripción reguladas de manera específica por tipos de células tales como por ejemplo las regiones de promotor/potenciador situadas aguas arriba del gen de la creatina-quinasa muscular (gen de MCK; expresión específica del músculo), del gen del receptor de CD4 o de los genes de CMH de clase II (preferiblemente la expresión en células presentadoras de antígeno). En algunos casos se usan también combinaciones quiméricas de (i) promotores específicos de tipo celular y (ii) regiones de potenciador virales, para unir las ventajas de una expresión específica de tejido con las de la actividad de transcripción fuerte de los potenciadores virales. El refuerzo de la expresión génica mediante la inclusión de un intrón funcional situado por regla general en el lado de 5' del marco de lectura abierto tiene su origen en una tasa de exportación del núcleo aumentada de transcritos empalmados en comparación con no empalmados y se consigue por ejemplo mediante la inserción de un intrón situado en el gen de \beta-globina.

Una forma preferida de una vacuna de ADN que se basa en la SEC ID Nº:1, 2 ó 3 contiene adicionalmente un replicón derivado de alfa-virus tales como por ejemplo de virus Semliki-Forest o de la encefalitis de Venezuela (VSF, VEV). En este caso, a la unidad de control de la transcripción nuclear descrita anteriormente y al intrón considerado opcionalmente le sigue en primer lugar la zona que codifica las proteínas no estructurales (NS) del VEV o del VSF. No le sigue el propio gen foráneo hasta el lado de 3' de la misma, cuya transcripción citoplasmática se regula por su parte mediante un promotor sensible a NS. De manera correspondiente a esto se genera un transcrito largo a través de varios marcos de lectura abiertos, partiendo de la unidad de control de la transcripción nuclear, que posteriormente se traslada hacia el citoplasma. Entonces, las proteínas NS allí sintetizadas activan mediante la unión a la región de control correspondiente la transcripción citoplasmática de los genes foráneos. Este efecto de amplificación conduce por regla general a una síntesis de ARN abundante y en consecuencia a tasas de síntesis de proteína foránea elevadas. Lo último permite, en comparación directa con plásmidos convencionales que renuncian al efecto descrito mediante la amplificación de ARN citoplasmático, por regla general una clara reducción de la cantidad de plásmido que ha de administrarse en caso de inmunogenicidad como mínimo comparable.

Los péptidos, las proteínas, las partículas similares a virus y los constructos de ADN descritos anteriormente pueden administrarse mediante inyección intramuscular, subcutánea, intradérmica, intravenosa, empleándose en cada caso el estado de la técnica para la administración de los antígenos proteicos. Para la inmunización de ADN pueden usarse jeringas convencionales con agujas de inyección o bien en cambio utensilios que pasan sin agujas y por regla general pueden introducir el ADN a través del aire comprimido directamente en el tejido deseado. A esto pertenece especialmente también la aplicación intranasal y oral de las formulaciones de vacuna que contienen ADN mediante dispositivos de tipo pulverizador. Como alternativa a esto puede conjugarse el ADN también a un soporte sólido tal como bolitas de oro y administrarse por ejemplo a presión atmosférica en el correspondiente
tejido.

Para el refuerzo o la modulación de la respuesta inmunitaria también pueden combinarse los constructos de ADN y los antígenos proteicos mencionados con los denominados adyuvantes, por regla general estimuladores de la respuesta inmunitaria, o administrarse en una progresión secuencial con los adyuvantes. Los adyuvantes convencionales tales como por ejemplo hidróxido de aluminio o hidroxifosfato de aluminio dan como resultado una estimulación de la respuesta inmunitaria humoral, que también se caracteriza por los títulos de anticuerpos elevados del subtipo IgG1. Los adyuvantes modernos, tales como por ejemplo oligonucleótidos CpG (motivo consenso: purina-purina-CpG-pirimidina-pirimidina) o derivados modificados químicamente de los mismos (oligonucleótidos de fosfotioato; oligonucleótidos con cadena principal del péptido) refuerzan normalmente el brazo celular de la respuesta inmunitaria y favorecen principalmente el tipo Th1 de la inmunidad mediada por células, caracterizada por los títulos de anticuerpos elevados del subtipo IgG2a y la inducción de citocinas Th1 tales como por ejemplo \gamma- IFN, IL-2 y
IL-12.

También puede mejorarse especialmente la administración y la absorción de péptidos, proteínas y constructos de vacuna de ADN mediante la unión a o incorporación en estructuras de alto peso molecular, tales como por ejemplo partículas biodegradables, liposomas idealmente catiónicos, multilaminares, complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), virosomas o partículas de virus ensambladas in vitro. A las partículas biodegradables pertenecen por ejemplo microesferas de PLA (ácido L-láctico), de PGA (poliglicólico) o de PLGA [poli(D,L-lactido-co-glicólido)] o derivados de los mismos, micropartículas catiónicas o sustancias de soporte derivadas de polisacáridos de cápsula bacterianos. El término ISCOMS representa complejos inmunoestimulantes que procedían de extractos solubles en agua de la corteza de Quillaja saponaria y se purificaron adicionalmente por medio de procedimientos cromatográficos. Una visión general detallada correspondiente al estado de la técnica con respecto a los más diversos adyuvantes y agentes auxiliares de administración se encuentra en http: //www.niaid.nih.gov/aidsvaccine/pdf/compendium.pdf [Vogel, F. R., Powell, M. F. y Alving, C. R. "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients" (2ª edición)].

Además pueden utilizarse vectores virales y, como alternativa, bacterianos para la presentación favorable de series de epítopos, polipéptidos y partículas similares a virus.

Según el estado de la técnica actual son adecuadas de modo especial para esto por ejemplo las listerias y salmonellas modificadas mediante ingeniería genética debido a su tropismo celular natural, para introducir constructos de vacuna de ADN en células presentadoras de antígeno tales como monocitos, macrófagos y sobre todo en células dendríticas. Las modificaciones mediante ingeniería genética pueden contribuir además de a una obtención de especificidad de tipo celular entre otras cosas, a que el ADN alcance el citoplasma de las células presentadoras de antígeno sin sufrir daño. En este caso, un constructo de vacuna de ADN alcanza el núcleo celular, en el que se transcribe a través de un promotor eucariota, preferiblemente viral o específico del tipo celular de los correspondientes marcos de lectura con el uso de las proteínas o fuentes celulares. Tras el transporte del ARN hacia el citoplasma se traduce el correspondiente producto génico y, según la naturaleza, se modifica postraduccionalmente y se asigna al compartimento celular correspondiente.

También pueden usarse vectores bacterianos (salmonellas, listerias, yersinias etc.) para la inducción de una inmunidad de la mucosa, preferiblemente tras la administración oral. A este respecto, los correspondientes antígenos se producen mediante maquinaria de transcripción y traducción bacteriana y no están sujetos según esto a las modificaciones postraduccionales por lo demás habituales en células de mamífero (ninguna glicosilación correspondiente; ninguna ruta secretora).

Además existe entretanto un gran número de vectores virales atenuados, con cuya ayuda pueden ser eficaces los antígenos deseados y pueden expresarse en alto rendimiento. Además de su capacidad para la producción de antígenos puros, tales vectores virales pueden utilizarse también directamente para la inmunización. Ésta puede realizarse en un principio ex vivo, por ejemplo para la infección de células presentadoras de antígeno, que se administran posteriormente al sujeto recién vacunado, o bien directamente in vivo mediante la inmunización subcutánea, intradérmica, intracutánea, intramuscular o intranasal con el virus recombinante, que puede conseguir una presentación de antígeno favorable con la eficacia de inmunización correspondiente. Así pueden inducirse por ejemplo respuestas inmunitarias mediadas por células y humorales adecuadas en las personas vacunadas mediante la inmunización con virus vaccinia recombinantes tales como por ejemplo el virus vaccinia modificado de Ankara (VMA) atenuado mediante pasajeros a través de células de gallina, la cepa del virus vaccinia de Nueva York (VACNY) atenuada mediante ingeniería genética o los virus vaccinia aviar endémicos en pájaros (viruela de las aves de corral, viruela del canario). Como alternativa son adecuados para esto de igual manera también una serie de otros virus tales como por ejemplo alfa-virus recombinantes, entre ellos el virus Semliki-Forest o el virus de la encefalitis de Venezuela, adenovirus recombinantes, virus del herpes simple recombinantes, virus de influenza y otros.

Por último pueden generarse y utilizarse para fines de inmunización también virus del VIH atenuados a base de la SEC ID Nº:1, 2 ó 3, siempre que se complementen por medio de procedimientos de clonación según el estado de la técnica las secuencias de regulación (LTR, repetición terminal larga), que flanquean la zona codificante. Una atenuación suficiente del virus puede conseguirse entonces de manera correspondiente al estado de la técnica mediante una o varias deleciones por ejemplo en el gen Nef.

Las secuencias de ácido nucleico expuestas en los ejemplos SEC ID Nº:1 y SEC ID Nº:3 así como los péptidos, proteínas o partículas similares a virus derivados de éstas, también pueden utilizarse como componentes de vectores virales para la transformación del gen.

Los polipéptidos codificados por el gen GagPol (SEC ID Nº:1; nucleótidos 167-4458; tabla 3) pueden proporcionar por ejemplo las funciones de receptor y de empaquetamiento de por ejemplo vectores lenti- o retrovirales. Así pueden generarse partículas de virus por ejemplo tras la transfección transitoria de células de mamífero mediante vectores de plásmido adecuados, que favorecen la expresión simultánea del gen GagPol y VSV-G (proteína G de la envuelta del virus de la estomatitis vesicular) y asegura el empaquetamiento de un transgén terapéutico, que también pueden transducir células terminalmente diferenciadas, postmitóticas o inactivas. Este procedimiento para la generación de las partículas de virus competentes para la transducción puede simplificarse fundamentalmente y configurarse de manera más eficiente, por ejemplo estableciendo líneas celulares estables, por ejemplo basadas en células de riñón embrionario humano (HEK293), que expresan la poliproteína GagPol de manera constitutiva o bajo el control de un promotor inducible. Como alternativa pueden generarse también adenovirus recombinantes, que codifican las funciones de empaquetamiento, las funciones de receptor y las funciones de transgén o combinaciones de las mismas y así sirven como herramienta para el suministro ex vivo, in situ e in vivo de vectores retro- o
lentivirales.

Las proteínas de la envuelta codificadas por la SEC ID Nº:3 o derivados de las mismas pueden proporcionar la función de receptor para vectores lenti-, espuma- o retrovirales u otros, vectores a base de virus envueltos mediante la incorporación en la bicapa lipídica. Para esto pueden generarse por ejemplo también líneas de empaquetamiento, en las que tanto las proteínas GagPol de retro-, espuma y preferiblemente lentivirus, como las proteínas de la envuelta derivadas de la SEC ID Nº:1 y 3 se expresan de manera constitutiva o bien bajo el control de un promotor inducible, opcionalmente de un promotor cuya actividad puede regularse. Como alternativa a esto pueden generarse por ejemplo retrovirus a base del genoma de tipo C o tipo D u otros virus envueltos de membrana tales como por ejemplos virus del herpes o influenza, virus quiméricos, que además de la proteína de la envuelta natural o en lugar de la proteína de la envuelta natural portan sobre la superficie una proteína de la envuelta derivada de la SEC ID Nº:1 o SEC ID
Nº:3.

Frente a los péptidos, las proteínas o las partículas similares a virus derivados de las SEC ID Nº:1 a 3 pueden generarse también (i) antisueros policlonales, (ii) anticuerpos monoclonales (ratón, ser humano, camello), (iii) derivados de anticuerpos tales como por ejemplo anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos humanizados, anticuerpos biespecíficos, bancos de anticuerpos de fagos u (iv) otros polipéptidos de unión de manera sumamente afín tales como por ejemplo derivados del hPSTI (inhibidor de la tripsina secretora pancreática humana). Estos reactivos pueden usarse para fines terapéuticos, por ejemplo para el tratamiento de infecciones por VIH o para fines diagnósticos, por ejemplo para la producción de kits de pruebas.

De manera similar pueden usarse los péptidos, las proteínas o las secuencias de ácido nucleico derivados de la SEC ID Nº:1, 2 ó 3 para fines diagnósticos, por ejemplo para el diagnóstico serológico y para la aplicación de técnicas de hibridación de ácido nucleico o sistemas de amplificación de ácido nucleico o combinaciones de los mismos. Preferiblemente pueden utilizarse los fragmentos de polinucleótido según la invención de la secuencia de nucleótidos según la SEC ID Nº:1 en una reacción en cadena de la polimerasa. Con especial preferencia se utilizan los fragmentos de polinucleótido según la invención de la secuencia de nucleótidos según la SEC ID Nº:1 para el diagnóstico por medio de la tecnología de chip de ADN.

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La invención se explica mediante los siguientes ejemplos, pero no se limita a éstos:

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Ejemplo 1

Muestras de sangre

Todas las muestras de sangre, que se usaron para este estudio, se extrajeron en el curso de los estudios nacionales epidemiológicos moleculares, de 1996/1997 de los UDI seropositivos para el VIH-1, subtipo C, de varias zonas epidémicas de VIH en China. Se separaron células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) por medio de los gradientes de Ficoll. Se aislaron los virus mediante el cultivo conjunto de las PBMC de UDI seropositivos con PBMC de donante estimuladas con fitohemaglutinina (PHA). Se verificaron los cultivos de virus positivos a partir de los sobrenadantes del cultivo celular por medio del kit para ELISA p24 Core Profile para VIH-1 (DuPont Inc., Boston, MA).

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Ejemplo 2

Reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación del ADN

Se extrajo ADN proviral a partir de PBMC infectadas de modo productivo de más de cien UDI positivos para el VIH-1 seleccionados de las provincias noroccidentales de China (Qiagen Inc., Valencia, CA). Se usó la PCR anidada para amplificar la región que codifica C2V3 de env. Se secuenciaron directamente los productos de PCR por medio del procedimiento de ciclos por Taq con el uso de terminadores marcados con colorantes fluorescentes (Applied Biosystems, 373A, Foster City, CA) tal como se describe brevemente (Bai et al. 1997; Yu et al. 1997). Se realizaron las comparaciones de secuencias múltiples con el uso de Wisconsin software package Genetics Computer Group con los procedimientos de corrección según Kimura (GCG, 1997, versión 9).

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Ejemplo 3

Se realizaron análisis del linaje filogenético de todas las secuencias obtenidas con el uso del paquete de software PHYLIP. Se calcularon las distancias evolucionistas por medio del procedimiento de máxima parsimonia y se indicaron mediante la longitud horizontal acumulativa de las ramas. Se sometió a prueba la robustez estadística del linaje del procedimiento del vecino más próximo tal como se describe brevemente mediante el procedimiento de remuestreo (Graf et al. 1998).

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Ejemplo 4

Selección de un aislado del VIH-1 representativo del subtipo C de UDI chinos

Dentro de los grupos, las distancias promedias calculadas dentro de la región que codifica C2V3 ascendieron a nivel de ADN a 2,26 \pm 1,43, lo que indica que la epidemia en esta zona aún es muy joven. Las diferencias entre los grupos entre las secuencias del subtipo C chinas y las de India, África y Sudamérica ascendieron a 9,67 \pm 2,31 (India), 15,02 \pm 4,13 (África) y 8,78 \pm 3,41 (Sudamérica). Esto indica una estrecha relación filogenética entre las secuencias del subtipo C indias y chinas (Lole et. al. 1999) y una distancia genética apreciable con respecto a los grupos relativamente heterogéneos per se de cepas del VIH-1 africanas del subtipo C.

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Ejemplo 5

Identificación de un aislado de virus, que mejor representa la cepa del virus prevalente que circula en China del subtipo C

A partir de las muestras analizadas se identificó un aislado representativo designado 97cn54, que presenta la homología más alta (99,6%) con respecto a la secuencia consenso (cnconV3) calculada, que se ha producido en base a las secuencias del VIH locales características (tabla 1). Las comparaciones de secuencias de aminoácidos múltiples incluyendo las secuencias primarias del bucle V3 de representantes del subtipo C primarios de las más diversas regiones epidémicas y también las secuencias consenso de otros subtipos (A-H, O, CPZ) destacaron el carácter del subtipo C del aislado primario seleccionado 97cn54 (tabla 1). En comparación con una secuencia consenso total de V3 (consenso), tanto 97cn54 como cn-con-c muestran divergencias de aminoácidos en las posiciones 13 (H\rightarrowR) y 19 (A\rightarrowT), que son ambas características de aislados del subtipo C (C_consenso).

TABLA 1 Comparación de secuencias de aminoácidos del bucle V3

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Tabla 1: La comparación de secuencias de aminoácidos de los bucles V3 de secuencias consenso de distintos subtipos de VIH-1 (A-O) y aislados seleccionados del subtipo-C de diversos países. Se determinó la secuencia consenso total de V3 mediante la comparación de las secuencias consenso de distintos subtipos (A-O). cn-con-V3 representa la secuencia consenso de las cepas de VIH-1 del subtipo C, que son prevalentes en China. Se seleccionó 97cn54 como aislado patrón representativo de las cepas de VIH-1 prevalentes existentes en China del subtipo C. "-" significa ningún intercambio en comparación con la secuencia consenso de V3, las letras en minúsculas significan una sustitución de aminoácidos y "." Significa huecos. Se obtuvieron todas las secuencias consenso y de aislado para comparaciones múltiples del banco de datos Los Alamos.

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Ejemplo 6

La secuencia que codifica la proteína de la envuelta 97cn54 está relacionada del modo más próximo con las cepas de virus del tipo C de India.

Los análisis del linaje filogenético, basados originalmente en las secuencias de C2V3 del gen env, dieron como resultado que tanto 97cn54 como la secuencia consenso de los aislados chinos del subtipo C se disponen en grupos (se agrupan) con las cepas del subtipo C de India (ind8, d1024, c-93in905, c-93in999, c-93in11246), de África (c-eth2220, cug286a2) y de Sudamérica (92br025, nof, cam20 y sm145). Esto indica que las cepas del virus indias del subtipo C podrían ser el origen de la epidemia del VIH-1, subtipo C, en China (figura 1). Esta hipótesis coincide también con el conocimiento epidemiológico anterior, que confirma que los seres humanos infectados por el VIH-1, subtipo C, en Yunnan deben haber compartido cánulas de inyección con comerciantes de joyas indios en la zona fronteriza (Shao et al. 1999).

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Ejemplo 7

Clonación del genoma del VIH-1 de longitud fundamentalmente completa

Se amplificó el genoma del VIH-1 de longitud fundamentalmente completa por medio del sistema de PCR con moldes de gran expansión (Expand Long Template) (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Alemania), tal como se describe por Graf et al. (1998) y Salminen et al. (1995). Se colocaron las moléculas de partida (cebadores) en las regiones conservadas dentro de las repeticiones terminales largas (LTR) del VIH-1: TBS-A1 (5'-ATC TCT AGC AGT GGC GGC CGA A) y NP-6(5'-GCA CTC AAG GCA AGC TTT ATT G). Se ligaron los fragmentos de PCR purificados con extremos lisos en un vector pCRScript digerido con SrfI (Stratagene, Heidelberg, Alemania) y se transformaron en la cepa DH5\alpha de E. coli. Se identificaron distintos clones recombinantes, que contenían fundamentalmente el genoma del VIH-1 de longitud completa, por medio del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y la secuenciación de la secuencia que codifica el bucle V3. Según el análisis de RFLP con el uso de distintas combinaciones de endonucleasas de restricción y secuenciación posterior de la secuencia que codifica el bucle V3, el 77% de los constructos positivos de longitud completa eran casi idénticos. Se seleccionó un constructo de provirus que representa la mayoría de los clones positivos y según se describió anteriormente se secuenció con el uso de la estrategia del paseo con cebadores ("primer-walking") (se clonaron las moléculas de partida aproximadamente cada 300 pb a lo largo del genoma para ambas cadenas).

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Ejemplo 8

Se acoplaron las secuencias de ADN con el uso del programa Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI) en ordenadores Macintosh. Todas las secuencias de referencia de los subtipos de este estudio son del banco de datos del VIH de Los Alamos. Se calcularon las semejanzas en la secuencia de nucleótidos por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman. Se realizaron comparaciones de secuencias múltiples con datos de secuencias disponibles de otros subtipos con el uso del paquete del programa de Wisconsin Genetics Computer Group (GCG, 1997, versión 9).

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Ejemplo 9

Estructura total de la secuencia codificante de 97cn54

La secuencia genómica de 9078 pb de longitud del aislado 97cn54 contenía todos los genes reguladores y estructurales conocidos del genoma del VIH-1. Fundamentalmente no se han encontrado deleciones, inserciones o transposiciones. Se examinaron las similitudes en la secuencia de nucleótidos por medio de la comparación de todas las secuencias codificantes (CDS) de 97cn54 con secuencias consenso de distintos genotipos y de aislados de subtipos seleccionados (tabla 2). Las homologías más altas de los marcos de lectura de gag, pol, env y vif con respecto a las correspondientes secuencias consenso del subtipo C se encontraban en el intervalo desde el 93,93% hasta el 95,06%. Esta observación amplió la comparación de secuencia descrita anteriormente y el análisis del linaje filogenético debido a C2V3 considerablemente (véanse la tabla 1 y la figura 1). Por tanto, ésta confirma de manera univoca que el aislado de virus seleccionado pertenece al grupo de las cepas de virus del subtipo C publicadas recientemente. Sin embargo, los valores de homología determinados mediante este tipo de análisis para los genes tat, vpu, vpr y nef no eran suficientes para permitir una clara asignación de estos marcos de lectura a las cepas de virus del subtipo B o C (tabla 2). Para el gen de vpu se registraron las homologías más altas con respecto a los subtipos B (94,24%), mientras que la homología con respecto a la secuencia consenso del subtipo C ascendía sólo al 78,23%. Se hicieron observaciones similares para el gen tat: la homología más alta con respecto al aislado B'-r142 (>91%), en comparación con el 87,9% (C-92br025) y el 85,5% (C-eth2220) para los representantes primarios seleccionados del subtipo C o el 89,01% para la secuencia consenso del subtipo C. Estos datos sugieren junto con la presencia de los genotipos B, C y E por todas las zonas epidémicas de Yunnan que el aislado de virus analizado podría representar una cepa de virus de mosaico, que es una consecuencia de un proceso de recombinación entre el subtipo B' y el
subtipo C.

TABLA 2 Comparación de las secuencias codificantes de 97cn54 con los correspondientes genes de cepas de referencia y secuencias consenso específicas de subtipo. Identidad en porcentaje con 97cn54

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Tabla 2: Comparación de secuencias de nucleótidos de todas las secuencias codificantes (CDS) entre secuencias de ADN y 97cn54, que representan (1) secuencias consenso de subtipos del VIH-1 determinados (obtenidos del banco de datos de Los Alamos) o bien (2) aislados del subtipo B (mn y r142) y C (92br025 y eth2220) patrón. Los datos indican la identidad de una secuencia determinada con 97cn54 en porcentaje. Se valoraron como idénticos las posiciones de nucleótidos no unívocas dentro de las secuencias consenso. Las homologías más altas están resaltadas en negrita. "/" significa que del banco de datos de Los Alamos no estaba disponible ninguna secuencia consenso.

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Ejemplo 10

Determinación de las recombinaciones entre los subtipos

Se usó el programa de identificación recombinante (RIP, versión 1.3; http://hiv-wew.lanl.gov/tools), para identificar estructuras de mosaico potenciales dentro de la secuencia total de este clon (tamaño de ventana: 200; valor umbral para la significación estadística: 90%; tratamiento de huecos: STRIP; modo informativo: OFF). Se introdujeron huecos para permitir la comparación. Las secuencias de fondo de los subtipos en este análisis fueron: u455 (subtipo A), RL42 (subtipo B-Thai(B') chino), eth2220 (subtipo C), z2d2 (subtipo D), 93th2 (subtipo A/E).

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Ejemplo 11

Recombinación entre los subtipos en la región que codifica Gag-Pol de 97cn54

También cuando se observaron homologías esenciales con respecto a las cepas de virus del subtipo C dentro de los marcos de lectura altamente conservados de gag y pol, el análisis RIP identificó 3 zonas de la recombinación entre subtipos dentro de gagpol en las posiciones 478-620, 1290-1830 y 2221-2520 más allá del codón de iniciación de gag. Estos tramos dispersos se encuentran dentro de los marcos de lectura de gag y pol y presentan las homologías más altas con respecto al prototipo B (no se muestran los datos) y especialmente para un aislado del subtipo B(B'), que proviene de Yunnan (figura 2). Esta observación recalca de manera unívoca la importancia de los análisis RIP, dado que las comparaciones de homología sencillas basadas en genes completos no podían identificar estos fragmentos dispersos pequeños de otro subtipo. Para comprobar los datos obtenidos por medio del análisis RIP se crearon diversos linajes filogenéticos con el uso de las regiones que flanquean o bien separan las zonas de la recombinación propuesta (figura 3). Con el uso de varios representantes patrón de distintos subtipos y de algunos aislados primarios seleccionados del subtipo C pudieron comprobarse todas las zonas propuestas de la recombinación mediante agrupaciones diferenciales de 97cn54 con los respectivos aislados de referencia de los subtipos C (figuras 3 A, C, E, G) o B (Figuras 3 B,
D, F).

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Ejemplo 12

Recombinación de intersubtipos en la región que codifica env de 97cn54

Tal como pudo esperarse de las comparaciones de secuencias resumidas en la tabla 2, el análisis RIP confirmó la recombinación de intersubtipos entre el subtipo (B')-Thai y C (figura 4) de manera unívoca. Un fragmento de aproximadamente 1000 pb de longitud, que se extendía desde las 150 pb terminales en 3' de vpr a través del primer exón de tat y rev hasta vpu, mostró la magnitud más alta de homología con el representante del subtipo (B') (r142) local (figura 4 A). Además, una zona de secuencia de aproximadamente 300 pb de longitud, que solapa con la mitad en 5' del gen nef, mostró la homología más alta con el subtipo (B')-Thai, mientras que la parte restante inclusive de un fragmento de 300 pb de longitud, que se extiende en la región LTR en 3' se dispone en grupo (se agrupa) con el subtipo C (figura 4 B).

Con la ampliación del análisis RIP, los linajes filogenéticos mostraron la relación más estrecha de vpr/vpu y la zona en 5' del gen nef con respecto a aislados del subtipo B (figura 5 A, B), mientras que el fragmento de nef en 3' se dispone en grupo de manera unívoca con representantes del subtipo C (figura 5 C). Otros análisis confirmaron que la secuencia del subtipo B dentro de este mosaico está relacionado del modo más próximo con una cepa de Thai-(B') brevemente descrita (r142), que se aisló de un UDI (Graf et al. 1998), que con respecto a los aislados de prototipo del subtipo B (mn y sf2) (tabla 2).

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Ejemplo 13

Carácter representativo de 97cn54

Se encontraron puntos de ruptura presentes en 97cn54 en las regiones codificantes de vpr/vpu y el gen nef en posiciones casi idénticas en todas las cepas del subtipo C, que se aislaron de UDI que vivían en las provincias noroccidentales de China. En las figuras 4C y D están representados 2 análisis RIP que se aislaron de manera representativa para 8 cepas del VIH-1 aisladas y analizadas independientemente entre sí de diversas personas infectadas con el VIH-1 en la región autónoma de Xinjiang. En lo que se refiere al origen de 97cn54 (sudoeste de China) y xj24 y xj15 (zona noroccidental), estos datos sugieren para las cepas C/B'-recombinantes que circulan por China un precursor común. Los resultados también muestran que 97cn54 representa un virus de mosaico de intersubtipos C/(B') con 10 puntos de ruptura de la recombinación de intersubtipos, que prevalece de la manera más considerable en los UDI dentro de las provincias noroccidentales de China. En la figura 6 está representado un diagrama esquemático del genoma de mosaico de (B'/C) del aislado 97cn545.

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Ejemplo 14

Predicción de los epítopos específicos reactivos de manera cruzada más allá de los subtipos, para células T citolíticas específicas para el VIH

Las secuencias genómicas presentan la posibilidad de determinar la conservabilidad de epítopos de CTL conocidos que pueden influir sobre la efectividad de candidatos de vacuna contra el VIH-1. La mayor parte de los reactivos y datos con respecto a epítopos de CTL proceden de secuencias de VIH-1_{LAI} del subtipo B. Para evaluar la conservabilidad de epítopos de CTL reactivos de manera cruzada más allá de los subtipos, se compararon las secuencias proteicas predichas de 97cn54 con los epítopos de CTL específicos para LAI mapeados de la mejor manera y conocidos. De los 194 epítopos de CTL descritos del VIH-1, 75, 55, 40 y 24 se encuentran en Gag, (p17, p24, p15), en la transcriptasa inversa (RT), en gp120 o en gp41. Aunque casi el 50% o más de los epítopos en Gag y RT son completamente idénticos, sólo el 5% y el 17% de los epítopos de CTL derivados de VIH-1_{LAI} de gp120 y gp41 coinciden de manera exacta con la secuencia de aminoácidos predicha para 97cn54. Sin embargo, si se permiten dos apareamientos erróneos conservativos en un epítopo de CTL determinado, se relaciona una zona adicional del 48% (p17), el 33% (p24), el 40% (RT), el 57% (gp120) y el 33% (gp41) de los epítopos de CTL conocidos de VIH-1_{LAI} con las secuencias en los correspondientes polipéptidos derivados de 97cn54. Naturalmente, esta última consideración debe tomarse con algo de cuidado, dado que incluso los intercambios no conservativos pueden suprimir la unión a HLA o el reconocimiento de los receptores de las células T de un péptido antigénico. Sin embargo, estas observaciones predicen en total de manera unívoca una reactividad de CTL reactiva de manera cruzada más allá de los subtipos considerable, especialmente de las proteínas funcionales e inmunológicamente conservadas del VIH-1. Además, estos datos sugieren que una proporción considerable de los reactivos (péptidos, constructos del virus vaccinia), que se han sintetizado y establecido para el mapeo y caracterización de los epítopos de CTL del subtipo B, también pueden ser útiles para la determinación de las reactividades de CTL basándose en las secuencias del VIH del
subtipo C.

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TABLA 3 Marcos de lectura de la secuencia codificante de 97cn54

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3

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Los números se refieren al extremo en 5' de la secuencia de ADN reproducida en la SEC ID Nº: 1.

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Ejemplo 15

(A) Descripción de la región sintética que codifica C54gp160:C-gp160

Se clonó el gen C-gp120 en los únicos puntos de corte de restricción KpnI/SacI del vector de clonación pCR-Script amp(+) (Stratagene, nº de acceso de Genbank: U46017). La región sintética codificante, adaptada a genes de mamífero muy expresados en el uso de codones de C54gp160 está representada en la SEC ID Nº: 3. La secuencia señal sintética codifica una señal de transporte para la importación del polipéptido codificado al retículo endoplasmático.

Las posiciones de las diversas regiones codificantes son las siguientes:

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4

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(B) Descripción de la secuencia sintética de C54gagpolnef:C-gpnef

Se clonó el gen C-gpnef en los únicos puntos de corte de restricción KpnI/SacI del vector de clonación pCR-Script amp(+) (Stratagene). La secuencia sintética, adaptada a genes de mamífero muy expresados en el uso de codones de C54gagpolnef está representada en la SEC ID Nº: 2. En el presente constructo se intercambió la glicina N-terminal por alanina (secuencia de nucleótidos GGC) para evitar un transporte dirigido del polipéptido a la membrana citoplasmática y la secreción posterior de partículas similares al virus reunidas mediante gemación. Simultáneamente, se introdujo un salto en el cuadro de lectura (-1) a la secuencia del marco de lectura natural, que garantiza un repaso obligatorio de los ribosomas de Gag en los marcos de lectura de Pol y asegura de ese modo la síntesis de una poliproteína
GagPolNef.

Las posiciones de las diversas regiones codificantes son las siguientes:

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5

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Ejemplo 16

Se insertó el poligen GagPolNef codificado por la SEC ID Nº: 1 mediante KpnI/XhoI en el vector pcDNA3.1 y se transformó en la cepa XL1blue de E. coli. Se analizó la capacidad del vector de expresión de GagPolNef para inducir una respuesta de anticuerpos específica para Gag en ratones BALB/c hembra (figura 9). Dos grupos de 5 animales en cada caso obtuvieron una inmunización primaria intramuscular (i.m.) en cada caso de 100 \mug de ADN por inmunización seguida de 2 inmunizaciones secundarias i.m. 3 y 6 semanas después (grupo 1: pcDNA-GagPolNef; grupo 2: pcDNA). Se inmunizó un grupo control (grupo 3) sólo con PBS. Se determinó el título total de IgG específica para Gag frente a una proteína Gag purificada en ELISA. La inoculación con pcDNA-GagPolNef dio como resultado una inducción rápida del título superior de anticuerpos específicos para Gag (1:4.000), que se caracterizó por un perfil Th1 típico de isotipos de anticuerpos (IgG2a » IgG1). Los dos grupos de control 2 y 3 no produjeron ninguna indicación sobre la generación de anticuerpos específicos para Gag. Los títulos de anticuerpos aumentaron casi cien veces (1:20.000) 1 semana después de la primera inmunización secundaria y se obtuvieron títulos finales específicos para Gag de 1:80.000 una semana después de la segunda inmunización de recuerdo. En ningún momento pudo determinarse en el caso de los dos grupos de control una respuesta de anticuerpos específica para Gag
significativa.

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Ejemplo 17

Se analizó la secreción de citocinas específicas para antígeno como indicación sobre la inducción de una respuesta de memoria de células T auxiliares a partir de células de bazo, que se extrajeron en cada caso 5 días después de la segunda inmunización secundaria. Las células de bazo de los ratones, que habían obtenido tres inmunizaciones i.m. con pcDNA-GagPolNef, reaccionaron con una clara secreción de gIFN frente al estimulo de antígeno específico para Gag (tabla 3). Se observó una producción de gIFN reducida a modo de comparación de células de bazo, que se obtuvieron a partir de ratones después de la tercera inmunización subcutánea (s.c.) o intradérmica (i.d.) con pcDNA-GagPolNef según el mismo esquema tal como anteriormente. En ninguno de los grupos de inmunización, independientemente de la vía de inmunización, se encontró secreción de IL4 ni IL5 apreciable a partir de las células de bazo estimuladas de nuevo in vitro de manera específica. No se observó una secreción de citocinas a partir de células de bazo no estimuladas.

Por consiguiente, la inmunización i.m. con pcDNA-GagPolNef condujo a un perfil de citocinas Th1 fuerte, mientras que la administración subcutánea indujo más bien una respuesta Th1 débil.

TABLA 4 Perfil de citocinas de células de bazo estimuladas con Gag in vitro de ratones, inmunización I (inyección por aguja) o inmunización i.d. o s.c. por una parte con los constructos de ADN indicados

6

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Ejemplo 18

Para someter a prueba la capacidad de pcDNA-GagPolNef para la inducción de CTL específicos para Gag, se volvieron a estimular de manera específica células de bazo 3 semanas después de una inmunización primaria con pcDNA-GagPolNef (grupo 1), pcDNA (grupo 2) y PBS (grupo 3) in vitro en un cultivo de células tumorales de linfocitos mixtos durante 6 días y posteriormente se examinaron en cuanto a su actividad citotóxica. En el caso de nonámeros, el péptido AMQMLKETI (código de una letra) derivado de la proteína Gag de los virus de subtipo B (aislado IIIB), que se utilizó en este estudio para la nueva estimulación in vitro igual que para la determinación de la actividad citotóxica específica, representa de manera conocida un epítopo de CTL restringido en D^{d} en el ratón BALB/c. Sin embargo, no pudieron encontrarse las células T citotóxicas específicas para Gag después de una única inyección i.m. con el pcDNA-GagPolNef, en ninguno de los dos grupos de control 2 y 3. El tratamiento de células de bazo con el péptido mencionado anteriormente no dio como resultado un cebado in vitro de células T citotóxicas específicas para Gag. Estos resultados confirman (i) la capacidad de pcDNA-GagPolNef para la inducción de células T citotóxicas específicas, (ii) que son activas en todos los subtipos (figura 9).

Bibliografía

Bai, X., Su, L., Zhang, Y., y et al (1997). Subtype and sequence analysis of the C2V3 region of gp120 gene among HIV-1 strains in Xinjiang. Chin. J. Virology 13.

Carr, J. K., Salminen, M. O., Koch, C., Gotte, D., Artenstein, A. W., Hegerich, P. A., St Louis, D., Burke, D. S., y McCutchan, F. E. (1996). Full-length sequence and mosaic structure of a human immunodeficiency virus type 1 isolate from Thailand. J. Virol. 70, 5935-5943.

Carr, J. K., Salminen, M. O., Albert, J., Sanders Buell, E., Gotte, D., Birx, D. L., y McCutchan, F. E. (1998). Full genome sequences of human immunodeficiency virus type 1 subtypes G and A/G intersubtype recombinants. Virology 247, 22-31.

Esparza, J., Osmanov, S., y Heyward, W. L. (1995). HIV preventive vaccines. Progress to date. Drugs 50, 792-804. Expert group of joint United Nations programme on HIV/AIDS (1999). Implications of HIV variability for transmission: scientific and policy issues. AIDS 11, UNAIDS 1-UNAIDS 15.

Gao, F., Robertson, D. L., Morrison, S. G., Hui, H., Craig, S., Decker, J., Fultz, P. N., Girard, M., Shaw, G. M., Hahn, B. H., y Sharp, P. M. (1996). The heterosexual human immunodeficiency virus type 1 epidemic in Thailand is caused by an intersubtype (A/E) recombinant of African origin. J. Virol. 70, 7013-7029.

Gao, F., Robertson, D. L., Carruthers, C. D., Morrison, S. G., Jian, B., Chen, Y., Barre Sinoussi, F., Girard, M., Srinivasan, A., Abimiku, A. G., Shaw, G. M., Sharp, P. M., y Hahn, B. H. (1998). A comprehensive panel of nearfull-length clones and reference sequences for nonsubtype B isolates of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 72, 5680-5698.

Gaywee, J., Artenstein, A. W., VanCott, T. C., Trichavaroj, R., Sukchamnong, A., Amlee, P., de Souza, M., Mc-Cutchan, F. E., Carr, J. K., Markowitz, L. E., Michael, R., y Nittayaphan, S. (1996). Correlation of genetic and serologic approaches to HIV-1 subtyping in Thailand. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 13, 392-396.

Graf, M., Shao, Y., Zhao, Q., Seidl, T., Kostler, J., Wolf, H., y Wagner, R. (1998). Cloning and characterization of a virtually full-length HIV type 1 genome from a subtype B'-Thai strain representing the most prevalent B-clade isolate in China. AIDS Res. Hum. Retroviruses 14, 285-288.

Graham, B. S. y Wright, P. F. (1995). Candidate AIDS vaccines. N. Engl. J. Med. 333, 1331-1339.

Kostrikis, L. G., Bagdades, E., Cao, Y., Zhang, L., Dimitriou, D., y Ho, D. D. (1995). Genetic analysis of human immunodeficiency virus type 1 strains from patients in Cyprus: identification of a new subtype designated subtype I. J. Virol. 69, 6122-6130.

Leitner, T. y Albert, J. (1995). Human Retroviruses and AIDS 1995: a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences. (Myers, G., Korber, B., Wain-Hobson, S., Jeang, K., Mellors, J., McCutchan, F., Henderson, L., y Pavlakis, G. Eds.) Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, N. Mex. III147- III150.

Lole, K. S., Bollinger, R. C., Paranjape, R. S., Gadkari, D., Kulkarni, S. S., Novak, N. G., Ingersoll, R., Sheppard, H. W., y Ray, S. C. (1999). Full-length human immunodeficiency virus type 1 genomes from subtype C-infected seroconverters in India, with evidence of intersubtype recombination. J. Virol. 73, 152-160.

Loussert Ajaka, I., Chaix, M. L., Korber, B., Letourneur, F., Gomas, E., Allen, E., Ly, T. D., Brun Vezinet, F., Simon, F., y Saragosti, S. (1995). Variability of human immunodeficiency virus type 1 group O strains isolated from Cameroonian patients living in France. J. Virol. 69, 5640-5649.

Luo, C. C., Tian, C., Hu, D. J., Kai, M., Dondero, T., y Zheng, X. (1995). VIH-1 subtype C in China [letter]. Lancet 345, 1051-1052.

Myers, G., Korber, B., Foley, B., Jeang, K. T., Mellors, J. W., y Wain Hobson, S. (1996). Human retroviruses and AIDS: a compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences. (Anonymous Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos, N. Mex. Salminen, M. O., Koch, C., Sanders Buell, E., Ehrenberg, P. K., Michael, N. L., Carr, J. K., Burke, D. S., y McCutchan, F. E. (1995). Recovery of virtually full-length HIV-1 provirus of diverse subtypes from primary virus cultures using the polymerase chain reaction. Virology 213, 80-86.

Shao, Y., Zhao, Q., Wang B., y et al (1994). Sequence analysis of HIV env gene among HIV infected IDUs in Yunnan epidemic area of China. Chin. J. Virology 10, 291-299.

Shao, Y., Su, L., Sun, X., y et al (1998). Molecular Epidemiology of HIV infection in China. 12th world AIDS conference, Geneva 13132, (Abstract).

Shao, Y., Guan, Y., Zhao, Q., y et al (1999). Genetic variation and molecular epidemiology of the Ruily VIH-1 strains of Yunnan in 1995. Chin. J. Virol. 12, 9.

Sharp, P. M., Robertson, D. L., y Hahn, B. H. (1995). Cross-species transmission and recombination of 'AIDS' viruses. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 349, 41-47.

Sharp, P. M., Bailes, E., Robertson, D. L., Gao, F., y Hahn, B. H. (1999). Origins and evolution of AIDS viruses. Biol. Bull. 196, 338-342.

World Health Organisation Network for HIV Isolation and Characterization (1994). HIV-1 variation in WHO-sponsored vaccine-evaluation sites: genetic screening, sequence analysis and preliminary biological characterization of selected viral strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses 10, 1327-1344.

Yu, H., Su, L., y Shao, Y. (1997). Identification of the VIH-1 subtypes by HMA and sequencing. Chin. J. Epidemiol. 18, 201-204.

<110> Geneart GmbH

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<120> Genoma del intersubtipo (C/B') de VIH-1 y sus aplicaciones

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<130> WAG-001 PCT

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<140> xx

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<141> 16-11-2000

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<150> DE 199 55 089.1

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<151> 16-11-1999

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<160> 3

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 9078

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<212> ADN

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<213> virus de la inmunodeficiencia humana

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<400> 1

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7

8

9

10

11

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<210> 2

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<211> 4288

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<212> ADN

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<213> virus de la inmunodeficiencia humana

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<400> 2

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12

13

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<210> 3

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<211> 2605

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<212> ADN

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<213> virus de la inmunodeficiencia humana

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<400> 3

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14

15

Claims (19)

1. Un polinucleótido con la secuencia de ácido nucleico según la SEC ID Nº:1, 2 ó 3 o una secuencia de los números de nucleótido de 167 a 1654, de 1447 a 4458, de 5589 a 8168, de 4403 a 4984, de 4924 a 5214, de 5426 a 5671,de 8170 a 8790, de 5195 a 5409, de 7730 a 7821, de 5334 a 5409 o de 7730 a 7821, o una secuencia relacionada con un polinucleótido desde 5195 hasta 5409 y de 7730 a 7821 o de 5334 a 5409 y de 7730 a 7821, en cada caso con respecto a la SEC ID Nº:1.

2. Polinucleótido con más de una secuencia de ácido nucleico continua según la reivindicación 1.

3. Polinucleótido según la reivindicación 2, en el que al menos dos de las secuencias de ácido nucleico continuas están separadas por un espaciador nucleotídico ("spacer").

4. Polinucleótido de codón optimizado que codifica un polipéptido Gag, tal como se codifica mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 167 a 1654, un polipéptido Pol, tal como se codifica mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 1447 a 4458, un polipéptido de env, tal como se codifica mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 5589 a 8168, un polipéptido de vif, tal como se codifica mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 4403 a 4984, un polipéptido de vpr, tal como se codifica mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 4924 a 5214, un polipéptido de vpu, tal como se codifica mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 5426 a 5671, un polipéptido de nef, tal como se codifica mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 8170 a 8790, un polipéptido de rev, tal como se codifica mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 5334 a 5409 y número de nucleótido de 7730 a 7821, refiriéndose los números de nucleótido en cada caso a la SEC ID Nº:1,

un polipéptido de gag, tal como se codifica mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 13 a 1500, un polipéptido 5'pol, tal como se codifica mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 1501 a 2460, un polipéptido de nef con organización al azar (scrambeled), tal como se codifica mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 2461 a 3090, un polipéptido 3'pol, tal como se codifica mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 3091 a 4155 y/o un polipéptido con centro activo de RT, tal como se codifica mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 4156 a 4266, refiriéndose los números de nucleótido en cada caso a la SEC ID Nº:2.

5. Vectores virales o bacterianos de ADN, que comprenden el polinucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Polinucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 4, como fármaco, vacuna o medio diagnóstico, o un polinucleótido con uno o varios fragmentos de al menos 27 nucleótidos de longitud de uno o varios polinucleótidos según una de las reivindicaciones 1 a 4, como fármaco, vacuna o medio diagnóstico, o un polinucleótido con dos o más fragmentos de al menos 27 nucleótidos de longitud separados por espaciadores nucleotídicos ("spacer") de uno o varios polinucleótidos según una de las reivindicaciones 1 a 4, como fármaco, vacuna o medio diagnóstico.

7. Uso del polinucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 4, o de un polinucleótido con uno o varios fragmentos de al menos 27 nucleótidos de longitud de uno o varios polinucleótidos según una de las reivindicaciones 1 a 4, o de un polinucleótido con dos o más fragmentos de al menos 27 nucleótidos de longitud separados por espaciadores nucleotídicos ("spacer") de uno o varios polinucleótidos según una de las reivindicaciones 1 a 4, para la producción de un fármaco o de una vacuna para el tratamiento o la prevención o de un medio diagnóstico para el establecimiento de diagnóstico de infecciones por VIH.

8. Polipéptido Gag, codificado mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 167 a 1654, polipéptido Pol, codificado mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 1447 a 4458, polipéptido de env, codificado mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 5589 a 8168, polipéptido de vif, codificado mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 4403 a 4984, polipéptido de vpr, codificado mediante la secuencia de ácido nucleico de números de nucleótido de 4924 a 5214, polipéptido de vpu, codificado mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 5426 a 5671, polipéptido de nef, codificado mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 8170 a 8790, polipéptido de rev, codificado mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 5334 a 5409 y número de nucleótido de 7730 a 7821, en cada caso con respecto a la SEC ID Nº:1,

polipéptido de gag, codificado mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 13 a 1500, polipéptido 5'pol, codificado mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 1501 a 2460, polipéptido de nef con organización al azar, codificado mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 2461 a 3090, polipéptido 3'pol, codificado mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 3091 a 4155 o polipéptido con centro activo de RT, codificado mediante la secuencia de ácido nucleico de número de nucleótido de 4156 a 4266, en cada caso con respecto a la SEC ID Nº:2, o un fragmento de los polipéptidos, que tiene al menos 9 aminoácidos de longitud.

9. Polipéptido según la reivindicación 8, con más de un fragmento continuo de al menos 9 aminoácidos de longitud.

10. Polipéptido según la reivindicación 9, en el que al menos dos de los fragmentos están separados por un espaciador de aminoácido.

11. Polipéptido según una de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la secuencia de aminoácidos corresponde a la proteína de la envuelta de VIH o a un fragmento de la proteína de la envuelta de VIH.

12. Polipéptido según una de las reivindicaciones 8 a 11, que comprende además un epítopo de células B, un epítopo de células T cooperadoras restringido por CMH de clase II, un epítopo de células T citotóxico restringido por CMH de clase I o una combinación de los mismos.

13. Polipéptido según la reivindicación 12, en el que el epítopo de células B es un epítopo conformacional o un epítopo lineal y el epítopo de células T cooperadoras restringido por CMH de clase II o el epítopo de células citotóxico restringido por CMH de clase I es un epítopo lineal.

14. El polipéptido según una de las reivindicaciones 8 a 13, como fármaco, vacuna o medio diagnóstico.

15. Uso del polipéptido según una de las reivindicaciones 8 a 13, para la producción de un fármaco o de una vacuna para el tratamiento o la prevención o de un medio diagnóstico para el establecimiento de diagnóstico de infecciones por VIH.

16. Polipéptido aislado, que se une de manera específica un polipéptido según una de las reivindicaciones 8 a 13, siendo el polipéptido aislado un anticuerpo, derivado de anticuerpo o un derivado del inhibidor de tripsina secretor pancreático humano (hPSTI).

17. Polipéptido aislado según la reivindicación 16, como fármaco o medio diagnóstico.

18. Uso del polipéptido aislado según la reivindicación 16 ó 17, para la producción de un fármaco para el tratamiento o la prevención o de un medio diagnóstico para el establecimiento de diagnóstico de infecciones por VIH.

19. Célula de mamífero, transformada con un polinucleótido con una secuencia de ácido nucleico según la SEC ID Nº:1 y/o 3 o un polinucleótido de codón optimizado, tal como se define en la reivindicación 4.