ES2299433T3 - Acido nucleico a partir de tetrahymena que codifica para una delta-6 desaturasa, su produccion y su uso. - Google Patents
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Abstract
Ácido nucleico que codifica para delta-6 desaturasa de Tetrahymena con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2 y partes del mismo con al menos 8 nucleótidos, que codifican para un polipéptido que presenta actividad delta-6 desaturasa.
Description
Ácido nucleico a partir de Tetrahymena
que codifica para una delta-6 desaturasa, su
producción y su uso.
La presente invención se refiere a una
delta-6 desaturasa de Tetrahymena, a su ácido
nucleico codificante así como a su producción y a su uso.
La invención se refiere a un ácido nucleico a
partir de Tetrahymena que codifica para una
delta-6 desaturasa específica para ciliado, que
participa en eucariotas en la biosíntesis de ácidos grasos
poliinsaturados (denominados PUFA en inglés: polyunsatturated fatty
acids) de valor comercial. A este respecto los ácidos nucleicos
según la invención y los polipéptidos que pueden obtenerse a partir
de ellos muestran una identidad de secuencia sorprendentemente
reducida con respecto a otras desaturasas naturales conocidas. La
invención se refiere además al uso de los ácidos nucleicos para la
sobreexpresión en eucariotas especialmente ciliados, preferiblemente
Tetrahymena, especialmente preferible Tetrahymena
thermophila, con el objetivo de la modificación dirigida del
espectro de ácidos grasos, especialmente del aumento de la formación
de PUFA.
Los ácidos nucleicos según la invención pueden
obtenerse a partir de ciliados, preferiblemente a partir de
Tetrahymena, especialmente preferible a partir de
Tetrahymena thermophila, un organismo productor de GLA con
muy alto contenido en GLA.
En la figura 1 se representa un esquema general
de la biosíntesis de PUFA y las enzimas participantes en eucariotas
(modificado según Gill & Valivety, Trends Biotechnol. 1997,
15:401-409). La conversión de ácido esteárico
(18:0) en ácido oleico (18:1 \Delta9) se cataliza mediante una
delta-9 desaturasa. El ácido oleico se convierte en
ácido linoleico (18:2 \Delta9,12; abreviatura: LA) mediante una
delta-12 desaturasa, que se convierte a su vez en
ácido \gamma-linolénico (18:3, \Delta6,9,12;
abreviatura: GLA) mediante una delta-6 desaturasa o
en ácido \alpha-linolénico (18:3, \Delta9,12,15;
abreviatura: ALA) mediante una delta-15 desaturasa).
El alargamiento de los ácidos nucleicos se cataliza mediante
elongasas, mediante lo cual se forma por ejemplo a partir del ácido
\gamma-linolénico ácido
dihomo-\gamma-linolénico (20:3
\Delta8,11,15; abreviatura: DGLA), que a su vez se convierte en
ácido araquidónico (20:4 \Delta5,8,11,15; abreviatura: ARA)
mediante una delta-5 desaturasa, un precursor
directo de eicosanoides fisiológicamente eficaces, tales como por
ejemplo prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos, leucotrienos.
En el caso de la formación de PUFA, que se derivan de GLA (a
continuación denominados ácidos grasos delta-6
insaturados) se ha mostrado la conversión de LA en GLA mediante la
delta-6 desaturasa como etapa limitante (Huang YS
& Mills DE (1996) \gamma-linolenic acid.
Metabolism and its role in nutrition and medicin. AOCS Press,
Champaign, Illinois, 1996).
Se conoce la existencia de una enzima con
actividad delta-6 desaturasa en Tetrahymena
setosa y T. pyriformis (Peng, Y. M. y Elson, C.E. (1971)
J. Nutr. 101, 1177-1184), pero hasta ahora no se ha
proporcionado una proteína homogénea con una actividad de este tipo
a partir de un ciliado (por ejemplo Koll, M. y Erwin, J.A. (1990)
J. Protozool. 37 (3), 229-237).
Puesto que los vertebrados no pueden insertar
dobles enlaces detrás de la posición 9 en ácidos grasos, los ácidos
grasos insaturados tales como LA y ALA son nutrientes esenciales que
los vertebrados no pueden sintetizar (véase la figura 1) y en la
alimentación proceden principalmente de fuentes vegetales. Los
mamíferos pueden convertir LA en GLA (un precursor de ARA) mediante
una delta-6 desaturasa, que es un precursor esencial
de la mayoría de las prostaglandinas. La formación de ácido
estearidónico (18:4 \Delta6,9,12,15) (un precursor de EPA) a
partir de ALA se cataliza igualmente por medio de
delta-6 desaturasa. Con ello la
delta-6 desaturasa es la primera etapa esencial en
la biosíntesis de los eicosanoides (véase la figura 1).
Se ha mostrado que la actividad de la
delta-6 desaturasa puede verse afectada en el caso
de mamíferos por factores tales como por ejemplo el consumo de
alcohol, estrés, malnutrición y procesos de envejecimiento (Huang
& Mills, 1996; Horrobin (1990) Rev. Contemp. Pharmacother.
1:1-45; Bolton-Smith C et al.
(1997) Eur. J. Clin. Nutr. 51:619-624; Leventhal LJ
et al. (1993) Ann. Intern. Med. 119:867-873).
Esto conduce a una escasez de GLA y con ello finalmente a una
deficiencia de las moléculas derivadas de GLA tales como ARA y los
eicosanoides fisiológicamente importantes formados a partir de
ellas, puesto que tal como ya se menciona en la formación de GLA a
partir de LA mediante la delta-6 desaturasa se trata
de una etapa limitante de la síntesis de PUFA (Brenner RR (1976)
Adv. Exp. Med. Biol. 83:85-101; Nakahara T et
al. (1993) J. Jpn. Oil Chem. Soc. 42:242-253;
Chapkin, RS (1998) Reappraisal of the essential fatty acids. En:
Fatty acids in food and their health implications, 2ª Ed. (Chow CK,
ed) Marcel Dekker, Nueva York, NY). El suministro de GLA puede
tanto compensar un nivel endógeno reducido de ácidos grasos
delta-6 insaturados, como cubrir un aumento de la
necesidad de estos ácidos grasos (Horrobin (1990)). Para la
biosíntesis de moléculas derivadas de GLA es ventajoso por tanto la
absorción de GLA mediante el alimento (Fan, YY & Chapkin, RS
(1998) J. Nutr. 128:1411-1414).
El hallazgo de que GLA ejerce múltiples
influencias positivas sobre el cuerpo humano se ha corroborado desde
entonces mediante un gran número de estudios científicos. Así se ha
demostrado mediante estudios clínicos la acción positiva del GLA
por ejemplo sobre eccema atópico (Shimasaki, H: PUFA content and
effect of dietary intake of \gamma-linolenic
acid-rich oil on profiles of n-6,
n-3 metabolites in plasma of children with atopic
eczema. J. Clin. Biochem. Nutr. (1995), 19(3),
183-192.), artritis reumatoide (Zurier RB, Rossetti
RG, Jacobson EW, DeMarco DM, Liu NY, Temming JE, White BM, Laposata
M (1996) \gamma-linolenic acid treatment of
rheumatoid arthritis: A randomized,
placebo-controlled trial. Arthritis Rheum. 39 (11)
1808-1817), ateroesclerosis (Leng GC, Lee AJ,
Fowkes FGR, Jepson RG, Lowe GDO, Skinner ER, Mowat BF, Randomized
controlled trial of \gamma-linolenic acid and
eicosapentaenoic acid in peripheral arterial disease, Clinical
Nutrition, (1998) 17/6 265-271.), neuropatía
diabética (Pfeifer MA, Schumer MP (1995) Clinical trials of diabetic
neuropathy: past, present, and future. Diabetis 44(12)
1355-61), migraña (Wagner W,
Nootbaar-Wagner U (1997) Prophylactic treatment of
migraine with \gamma-linolenic and
alpha-linolenic acids, Cephalalgia 17/2
127-130), esquizofrenia (Vaddadi, KS (1982) Some
observations on the use of prostaglandin E1 precursor in the
treatment of schizophrenia. Biol. Aspects Schizophr. Addict.
183-91. Editorial: Wiley, Chichester, RU) y cáncer
(Kairemo KJA, Jekunen AP, Korppi-Tommola ET,
Pyrhonen SO (1997) Effects of lithium
\gamma-linolenate on the perfusion of liver and
pancreatic tissues in pancreatic cancer. Anticancer Research 17/5 B
3729-3736.). En estos estudios se ha obtenido tanto
una mejora estadística como clínicamente significativa del cuadro
clínico. A este respecto la acción de GLA se basa sobre todo en la
formación de eicosinoides (prostaglandinas, prostaciclinas,
tromboxanos, leucotrienos), para los que GLA representa una
molécula precursora en la biosíntesis (figura 1).
Debido a estas propiedades positivas existe un
amplio espectro de aplicación para GLA en la industria farmacéutica,
cosmética, de piensos y alimentaria (Horrobin (1990), Horrobin
(1992) Prog. Lipid Res. 31:163-194; Chapkin (1998),
Fan & Chapkin (1998).
La mayor parte de los PUFA de los seres humanos
o animales proceden o bien directamente a partir de la alimentación
o bien se producen mediante la transformación de los ácidos grasos
esenciales suministrados mediante la alimentación, mediante
desaturasas y elongasas. Por tanto son de gran interés comercial los
genes de la biosíntesis de PUFA de organismos en los que se
producen de manera natural estos PUFA. Mediante la expresión
funcional dirigida de estos genes en los organismos o células,
pueden conseguirse una producción comercial de PUFA en estos
sistemas. Por este motivo existe una necesidad de genes para
desaturasas y elongasas de la biosíntesis de PUFA, así como para la
obtención comercial de PUFA y aceites de PUFA mediante métodos
económicos fiables con ayuda de estos genes.
Ninguna de las semillas oleaginosas utilizadas
comercialmente produce GLA. En cambio, GLA aparece sólo en el
aceite de las semillas de diferentes plantas tales como la onagra
(Oenothera biennis, aproximadamente el 10% de GLA), la
borraja (Borago officinalis, aproximadamente el 23%) y la
grosella negra (Ribes nigrum, aproximadamente el 18%).
Además se conocen también diferentes microorganismos como fuentes
para GLA, tales como por ejemplo los hongos Mucor y
Mortierella (hasta aproximadamente el 25%), el alga azul
Spirulina (aproximadamente el 12-18%) y
otros. Como fuentes especiales ricas en GLA se describieron ciliados
tales como por ejemplo Tetrahymena (hasta el 47%; Hill, DL
(1972) The biochemistry and physiology of Tetrahymena.
Capítulo 3, 46-73. Academic press, Nueva York,
Londres; Erwin, J & Bloch, K (1963) J. Biol. Chem.
238:1618-1624). Una buena visión sobre las fuentes
naturales de GLA la ofrecen Phillips & Huang (Phillips JC, Huang
YS (1996) Natural sources and biosynthesis of
\gamma-linolenic acid: an overview.
1-13 En: \gamma-linolenic acid.
Metabolism and its role in Nutrition and medicin. Huang YS, Mills DE
(Ed.) AOCS Press, Champaign, Illinois, 1996).
La obtención comercial de GLA a partir de estas
fuentes naturales está asociada sin embargo con algunos
inconvenientes. Tanto la calidad como la cantidad de los aceites
obtenidos a partir de estos organismos varían, y los aceites
presentan parcialmente una composición muy heterogénea, lo que hace
que se necesiten etapas de purificación costosas y caras para
enriquecer en GLA. El cultivo de plantas que contienen GLA tampoco
es muy rentable (Hansen CE et al. (1991) J. Sci. Food Agric.
54:309-312). Para la obtención de aceite que
contiene GLA se ha mostrado que el rendimiento de espacio/tiempo en
el caso de algunos microorganismos que producen GLA es claramente
mejor en comparación con plantas superiores. Por este motivo, la
producción fermentativa de GLA mediante microorganismos ofrece una
alternativa prometedora con respecto a otras fuentes de GLA. El
espectro de ácidos grasos de muchos microorganismos es con
frecuencia muy simple en comparación con organismos superiores, lo
que ofrece grandes ventajas en el caso de la purificación. Además,
la producción fermentativa no depende de factores externos tales
como el tiempo, oferta de alimentos etc. Además, los PUFA producidos
de este modo están en gran medida libres de contaminaciones que se
deben por ejemplo a la contaminación ambiental. Otra ventaja es que
el GLA obtenido mediante procesos fer-
mentativos al contrario de GLA a partir de fuentes naturales no está sometido a ninguna variación en la disponibilidad.
mentativos al contrario de GLA a partir de fuentes naturales no está sometido a ninguna variación en la disponibilidad.
Ya había ensayos para establecer la obtención
fermentativa de GLA (Ratledge C (1993) Trends Biochem.
11:278-284; Ratledge C (1989) Biochem. Soc. Trans.
17:1139-1141; Gosselin Y et al. (1989)
Biotechnol. Lett. 11:423-426; documento
W086/03518). Sin embargo para una producción de GLA fermentativa,
comercial mediante microorganismos es deseable un aumento del
contenido en GLA, puesto que la fermentación de microorganismos
productores de PUFA se considera como relativamente costosa y cara
y con ello como no muy rentable (Ratledge 1993, citado
anteriormente). Debido a su contenido en GLA relativamente alto
(citado anteriormente) es especialmente adecuada Tetrahymena
thermophila para una obtención fermentativa de GLA.
Tetrahymena puede cultivarse bien en el fermentador y pueden
conseguirse altas densidades celulares (Kiy, T. & Tiedtke (1992)
Appl. Microbiol. Biotechnol. 37, 576-579; Kiy, T.
& Tiedtke, A. (1992) Appl. Microbiol. Biotechnol. 38,
141-146).
Por tanto, es objetivo de la presente invención
proporcionar ácidos nucleicos a partir de Tetrahymena, que
codifican para un polipéptido con la actividad de una
delta-6 desaturasa y su expresión y sobreexpresión
funcional en un huésped, preferiblemente en Tetrahymena, con
el objeto de enriquecer en GLA y/o ácidos grasos
delta-6 insaturados.
Por tanto, es objeto de la presente invención un
ácido nucleico según la SEQ ID NO: 1 que codifica para una
delta-6 desaturasa con una secuencia de aminoácidos
según la SEQ ID NO: 2 y partes del mismo con al menos 8
nucleótidos, preferiblemente con al menos 15 ó 20 nucleótidos,
especialmente con al menos 100 nucleótidos, sobre todo con al menos
300 nucleótidos (a continuación denominados "ácido(s)
nucleico(s) según la invención"). Igualmente otro objeto
de la invención es un ácido nucleico según la SEQ ID NO: 3, que
contiene la secuencia genómica y que comprende además de las
secuencia codificante para una delta-6 desaturasa
también secuencias de ácido nucleico no codificantes tales como
intrones, promotores y secuencias flanqueantes.
El ácido nucleico completo según la SEQ ID NO: 1
codifica para una proteína con 352 aminoácidos y una masa molecular
teórica de 41,8 kDa. Los análisis secuenciales según la presente
invención confirman que en el caso del ácido nucleico se trata se
un ácido nucleico que codifica para una delta-6
desaturasa de Tetrahymena.
Mediante una comparación de homología pudo
identificarse la secuencia proteica según la SEQ ID NO: 2 derivada
de la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 1) como una
delta-6 desaturasa. Para la comparación de homología
se utilizó la función BLASTP (Altschul et al. (1997) Nucleic
Acids Res. 25:3389-3402). Como proteínas homólogas
se identificaron desaturasas, especialmente delta-6
desaturasas (E.C. 1.14.99.25; linoleoil-CoA
desaturasa) a partir de los bancos de datos (véase la figura 2). A
este respecto, las delta-6 desaturasas conocidas
presentan como máximo una identidad del 25% con respecto a la
secuencia polipeptídica según la invención (véanse las figuras
3A-3E). En la figura 4 se muestra una alineación
múltiple de diferentes delta-6 desaturasas
conocidas con la secuencia polipeptídica según la invención. Las
homologías se encuentran especialmente en los dominios conservados,
tales como las cajas de histidina (Los & Murata, 1998. Biochem.
Biophys. Acta 1394:3-15; Shanklin, J et al.
1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6743-6747).
Además pudo identificarse, como en el caso de otras
delta-6 desaturasas eucariotas, un dominio de
citocromo b5 (Lederer, F. (1994) Biochimie 76,
674-692; Cho et al. J. Biol. Chem. 1999, 274
(1):471-477). Aunque la secuencia polipeptídica
según la invención puede identificarse como delta-6
desaturasa, se distinguen esencialmente de otras
delta-6 desaturasas. Es llamativo sobre todo que la
secuencia con 352 aminoácidos sea aproximadamente un 20% más corta
que otras delta-6 desaturasas eucariotas. Además,
la secuencia presenta, en regiones muy conservadas, un gran número
de divergencias únicas. Así, el motivo de HHLFP conservado al 100%
en el caso de otras delta-6 desaturasas está
modificado en HHFFP (véase la figura 4). La identidad de la
secuencia polipeptídica según la invención con respecto a las
desaturasas conocidas es sorprendentemente baja por estos
motivos.
Mediante la sobreexpresión dirigida de la
desaturasa por ejemplo en Tetrahymena puede modificarse de
manera significativa el espectro de ácidos grasos (véanse las
tablas 1 y 2). A este respecto se llega a un desplazamiento de la
razón de los ácidos grasos saturados con respecto a los insaturados
hasta claramente más ácidos grasos insaturados. A este respecto es
de especial interés el aumento de la productividad de GLA que puede
conseguirse de ese modo.
En una forma de realización preferida, el ácido
nucleico según la invención es un ADN o ARN, preferiblemente un ADN
bicatenario y especialmente un ADN con una secuencia de ácido
nucleico según la SEQ ID NO: 1 desde la posición 33 hasta la
posición 1091. Las dos posiciones determinan según la presente
invención el inicio y el final de la región codificante.
Las partes o fragmentos de los ácidos nucleicos
según la invención pueden usarse por ejemplo para la producción de
epítopos individuales, como sondas para la identificación de
variantes funcionales o como ácidos nucleicos antisentido. Es
adecuado por ejemplo un ácido nucleico de al menos aproximadamente 8
nucleótidos como ácido nucleico antisentido, un ácido nucleico de
al menos aproximadamente 15 nucleótidos como cebador en el
procedimiento de PCR, un ácido nucleico de al menos aproximadamente
20 nucleótidos para la identificación de otras variantes y un ácido
nucleico de al menos aproximadamente 100 nucleótidos como sonda.
En otra forma de realización preferida, el ácido
nucleico según la invención contiene una o varias secuencias no
codificantes (UTR entre otras). Las secuencias no codificantes son
por ejemplo secuencias de intrón o secuencias reguladoras, tales
como secuencias de promotor o de potenciador, para la expresión
controlada del gen que codifica para delta-6
desaturasa. Por tanto, un objeto de la invención es un ácido
nucleico según la invención según la SEQ ID NO: 3, que puede
aislarse a partir de Tetrahymena thermophila y representa la
secuencia genómica de la delta-6 desaturasa con
intrones, promotores y UTR.
Por tanto, en otra forma de realización, el
ácido nucleico según la invención está contenido en un vector,
preferiblemente en un vector de expresión.
Los vectores de expresión pueden ser por ejemplo
vectores de expresión procariotas o eucariotas. Ejemplos de
vectores de expresión procariotas son para la expresión en E.
coli por ejemplo el vector de expresión T7 pGM10 (Martin,
1996), que codifica para una etiqueta de
Met-Ala-His6
N-terminal, que permite una purificación ventajosa
de la proteína expresada a través de una columna de Ni2+-NTA. Como
vectores de expresión eucariotas para la expresión en
Saccharomyces cerevisiae son adecuados por ejemplo los
vectores p426Met25 o p426GAL1 (Mumberg et al. (1994) Nucl.
Acids Res., 22, 5767), para la expresión en células de insecto, por
ejemplo, los vectores de baculovirus tales como se dan a conocer en
el documento EP-B1-0127839 o el
documento EP-B1-0549721, y para la
expresión en células de mamífero, por ejemplo, vectores del SV40,
que en general pueden obtenerse.
En general, los vectores de expresión contienen
también para las células huésped secuencias reguladoras adecuadas,
tales como por ejemplo el promotor de trp para la expresión en E.
coli (véase por ejemplo el documento
EP-B1-0154133), el promotor de
ADH-2 para la expresión en levaduras (Russel et
al. (1983), J. Biol. Chem. 258, 2674), el promotor de
polihedrina de baculovirus para la expresión en células de insecto
(véase por ejemplo el documento
EP-B1-0127839) o el anterior
promotor del SV40 o promotores de LTR por ejemplo del VTMR (virus
del tumor mamario del ratón; Lee et al. (1981) Nature, 214,
228).
Para la transformación de y la expresión en
Tetrahymena son adecuados por ejemplo los vectores descritos
por Gaertig et al. ((1999) Nature Biotech.
17:462-465) o Gaertig & Kapler ((1999) Methods
in Cell Biol. 62:485-500).
Los ácidos nucleicos según la invención pueden
sintetizarse por ejemplo químicamente mediante las secuencias dadas
a conocer en la SEQ ID NO: 1 y 3 o mediante la secuencia peptídica
dada a conocer en la SEQ ID NO: 2 recurriendo al código genético,
por ejemplo, según el método de fosfotriéster (véase por ejemplo
Uhlman, E. & Peyman, A. (1990) Chemical Reviews, 90, 543, nº
4). Otra posibilidad para conseguir los ácidos nucleicos según la
invención es el asilamiento a partir de un banco de genes adecuado,
de un organismo que tiene actividad delta-6
desaturasa, mediante una sonda adecuada (véase por ejemplo Sambrook,
J. et al. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual. 2ª
Edición, Cold Spring Harbor, Nueva York). Como sonda son adecuados
por ejemplo fragmentos de ADN monocatenario con una longitud desde
aproximadamente 100 hasta 1000 nucleótidos, preferiblemente con una
longitud desde aproximadamente 200 hasta 500 nucleótidos,
especialmente con una longitud desde aproximadamente 300 hasta 400
nucleótidos, cuya secuencia puede derivarse a partir de la secuencia
de ácido nucleico según la SEQ ID NO: 1 ó 3.
Por tanto, la invención se refiere igualmente a
un procedimiento para la producción de un ácido nucleico según la
invención, sintetizándose químicamente el ácido nucleico o
aislándose mediante una sonda a partir de un banco de genes.
Otro objeto de la presente invención es también
el propio polipéptido con una secuencia de aminoácidos según la SEQ
ID NO: 2 y partes del mismo con al menos 12 aminoácidos,
especialmente con al menos 65 aminoácidos y sobre todo con al menos
150 aminoácidos (a continuación denominado "polipéptido según la
invención"). Un polipéptido de aproximadamente 12 aminoácidos de
longitud puede contener por ejemplo un epítopo, que tras el
acoplamiento a un soporte sirve para la producción de anticuerpos
poli o monoclonales específicos (véase para esto por ejemplo el
documento US 5.656.435). Los polipéptidos con un longitud de al
menos aproximadamente 65 aminoácidos también pueden servir
directamente sin soporte para la producción de anticuerpos poli o
monoclonales.
Además se prefieren los polipéptidos que
presentan regiones conservadas de cajas de histidina y un dominio
de citocromo b5. Se prefieren especialmente los polipéptidos según
la invención que contienen un motivo de HHFFP.
Además, a esto pertenecen también las deleciones
del polipéptido en el intervalo de aproximadamente
1-60, preferiblemente de aproximadamente
1-30, especialmente de aproximadamente
1-15, sobre todo de aproximadamente
1-5 aminoácidos. Por ejemplo, puede faltar el primer
aminoácido metionina, sin que se modifique esencialmente la función
del polipéptido. Además, a esto pertenecen también las proteínas de
fusión que contienen los polipéptidos según la invención descritos
anteriormente, pudiendo tener las propias proteínas de fusión ya la
función de una delta-6 desaturasa o no pudiendo
conseguir la función específica hasta la separación de la parte de
fusión. Sobre todo, a esto pertenecen proteínas de fusión con una
parte de secuencias especialmente de no ciliados de aproximadamente
1-200, preferiblemente de aproximadamente
1-150, especialmente de aproximadamente
1-100, sobre todo de aproximadamente
1-50 aminoácidos. Ejemplos de secuencias peptídicas
de no ciliados son secuencias peptídicas procariotas, por ejemplo a
partir de la galactosidasa de E. coli o una denominada
etiqueta de histidina, por ejemplo una etiqueta de
Met-Ala-His6. Una proteína de fusión
con una denominada etiqueta de histidina es adecuada de manera
especialmente ventajosa para la purificación de la proteína
expresada a través de columnas que contienen iones metálicos, por
ejemplo a través de una columna de Ni2+-NTA. "NTA" significa
el agente quelante "ácido nitrilotriacético" (Qiagen GmbH,
Hilden).
Las partes del polipéptido según la invención
representan por ejemplo epítopos que pueden reconocerse
específicamente por anticuerpos.
El polipéptido según la invención puede
producirse por ejemplo mediante la expresión del ácido nucleico
según la invención en un sistema de expresión adecuado, tal como ya
se describió anteriormente, según métodos conocidos en general por
el experto. Como células huésped son adecuadas por ejemplo las cepas
DH5, HB101 o BL21 de E. coli, la cepa de levadura
Saccharomyces cerevisiae, la línea de células de insecto
lepidóptera, por ejemplo de Spodoptera frugiperda, o células
animales tales como COS, Vero, 293 y HeLa, que en general pueden
obtenerse todas.
Especialmente las partes mencionadas del
polipéptido también pueden sintetizarse con ayuda de la síntesis de
péptidos clásica (técnica de Merrifield). Son especialmente
adecuadas para la obtención de antisueros, que con su ayuda pueden
buscarse bancos de expresión génica adecuados, para acceder de ese
modo a las variantes funcionales del polipéptido según la
invención.
Por tanto, otro objeto de la presente invención
se refiere a un procedimiento para la producción de un polipéptido
según la invención, expresándose y dado el caso aislándose un ácido
nucleico según la invención en una célula huésped adecuada.
Otro objeto de la presente invención se refiere
también a anticuerpos que reaccionan de manera específica con el
polipéptido según la invención, siendo las partes mencionadas
anteriormente del polipéptido o bien inmunógenas por sí mismas o
bien pueden convertirse en inmunógenas mediante el acoplamiento a un
soporte adecuado, tal como por ejemplo albúmina sérica bovina, o
puede aumentarse su inmunogenicidad.
\newpage
Los anticuerpos son o bien policlonales o bien
monoclonales. La producción, que igualmente representa un objeto de
la presente invención, tiene lugar por ejemplo según métodos
conocidos en general mediante la inmunización de un animal
mamífero, por ejemplo un conejo, con el polipéptido según la
invención o las partes mencionadas del mismo, dado el caso en
presencia de, por ejemplo, adyuvante de Freund y/o geles de
hidróxido de aluminio (véase por ejemplo Diamond, B.A. et
al. (1981) The New England Journal of Medicine, 1344). A
continuación, los anticuerpos policlonales que se producen en
animales debido a una reacción inmunológica pueden aislarse
fácilmente de la sangre según métodos conocidos en general y
purificarse por ejemplo a través de cromatografía en columna. Se
prefiere una purificación por afinidad de los anticuerpos, en la que
por ejemplo se acopló el fragmento de desaturasa
C-terminal a una columna HiTrap
NHS-activada.
Los anticuerpos monoclonales pueden producirse
por ejemplo según los métodos conocidos de Winter & Milstein
(Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349,293).
Aunque ya se han descrito
delta-6 desaturasas de otros organismos,
Tetrahymena, debido al rendimiento de espacio/tiempo
especialmente alto en la producción de GLA, se ofrece tanto como
punto de partida para la generación de cepas comercialmente
significativas, sumamente productivas mediante métodos genéticos,
como como fuente para los genes de la biosíntesis de PUFA. En la
presente invención se describe de manera correspondiente la
delta-6 desaturasa y su uso a partir de
Tetrahymena thermophila, ciliados productores de GLA.
La modificación dirigida de la composición del
espectro de ácidos grasos mediante métodos de ingeniería genética
se describe en Napier J et al. (Curr. Opin. Plant Biol.
(1999) 123-127), Murphy & Piffanelli (Soc. Exp.
Biol. Semin. Ser. 67 (Plant Lipid Biosynthesis), (1998)
95-130) y Facciotti & Knauf (En: Adv.
Photosynth. 6: Lipids in Photosynthesis: Structure, Function and
Genetics. Siegenthaler & Murata (Ed.) Kluwer Academia
Publishers. Países Bajos. (1998) 225-248).
En los documentos W098/46763, W098/46764 y
W098/46765 se describen desaturasas del hongo Mortierella y
el uso de los genes para la producción de PUFA, así como algunas
secuencias parcialmente parciales de desaturasas. En los documentos
W093/06712 y W096/21022 se describen \Delta6 desaturasas de una
cianobacteria y de Borago así como el uso de estas
secuencias para la producción de PUFA en cianobacterias y plantas.
En el documento W099/27111 se describe una desaturasa de nemátodos
y el uso para la producción de PUFA. También se conocen a partir de
la bibliografía delta-6 desaturasas. Sin embargo, a
este respecto se trata sobre todo de delta-6
desaturasas de plantas (Borago (Sayanova et al. (1997)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94:4211-4216),
Psycomitrella (Girke et al. (1998)
Plant-J. 1998 15 (1):39-48), girasol
(Sperling et al. (1995) Eur. J. Biochem. 1995,
232:798-805)), hongos (Mortierella), animales
(ratón, rata, Caenorhabditis (Napier et al. (1998)
Biochem. J. 330 (2), 611-614)), cianobacteria (Reddy
et al. (1993) Plant Mol. Biol. 1993,
293-300).
En general se tiene como objetivo la expresión
heteróloga, funcional de estos genes en plantas de cultivo,
especialmente semillas oleaginosas tales como por ejemplo colza,
girasol y otras. Sin embargo los rendimientos de GLA son en casi
todos los casos publicados o bien muy bajos y/o bien los organismos
productores de GLA generados mediante ingeniería genética con
actividad delta-6 desaturasa no tienen significado
comercial (Knutzon & Knauf (1998) Soc. Exp. Biol. Semin. Ser.
67:287-304). Los problemas y dificultades para
modificar de manera dirigida el espectro de ácidos grasos en
plantas transgénicas se describen por ejemplo por Murphy (Current
Opinion in Biotechnology (1999) 10:175-180) y
Knutzon & Knauf (1998).
Debido al alto contenido en GLA de
Tetrahymena descrito, es ventajoso utilizar los genes de la
biosíntesis de PUFA de este organismo para el desarrollo de cepas
comercialmente significativas, sumamente productivas mediante
métodos de ingeniería genética. Mediante la posibilidad de cultivar
bien Tetrahymena en cultivo en masa con una alta densidad
celular, es además ventajoso utilizar la propia Tetrahymena
para la generación de tales cepas comercialmente interesantes,
sumamente productivas mediante métodos de ingeniería genética.
Además pueden utilizarse además de Tetrahymena también otros
organismos con ayuda del ácido nucleico según la invención para la
producción de GLA u otros ácidos grasos delta-6
insaturados.
La producción de GLA mediante fermentación de
Tetrahymena es especialmente ventajosa debido al espectro de
ácidos grasos muy simple en comparación con los organismos
superiores. Además una producción fermentativa no se ve influida
por factores externos tales como el tiempo, oferta de alimentos,
etc. Además, un producto obtenido de esta manera está libre en gran
medida de impurezas, tales como por ejemplo las que pueden
producirse en los productos obtenidos de la naturaleza mediante la
contaminación ambiental.
Con ayuda de los ácidos nucleicos según la
invención, que codifican para una delta-6 desaturasa
específica de ciliados de Tetrahymena, pueden generarse
organismos transgénicos que producen GLA y ácidos grasos
delta-6 insaturados, o cuyo contenido en tales
ácidos grasos con respecto a las células de tipo natural (en este
caso: Tetrahymena thermophila) es claramente elevado (véanse
las tablas 1 y 2). A este respecto se trata preferiblemente de
ciliados, especialmente preferible Tetrahymena, que contienen
la secuencia de ácido nucleico según la invención o la expresan de
manera funcional. La expresión de la desaturasa de esta manera
conduce a un aumento relativo de ácidos grasos
delta-6 insaturados o productos sucesivos derivados
de los mismos, basado en una concentración modificada de enzimas y
sustratos de la síntesis de PUFA. La invención se emplea en la
producción comercial de PUFA, especialmente de GLA y PUFA derivados
del mismo u otros productos sucesivos que pueden derivarse de GLA,
o ácidos grasos \Delta6-insaturados (véase la
figura 1: biosíntesis de PUFA). Además de GLA también puede
producirse así por ejemplo mediante la desaturación del ALA el ácido
estearidónico (18:4 \Delta6,9,12,15), una materia prima utilizada
con frecuencia industrialmente.
En una forma de realización especial, puede
aumentarse, mediante el uso de los ácidos nucleicos según la
invención que codifican para la delta-6 desaturasa
en combinación funcional con secuencias reguladoras adecuadas y una
expresión reforzada de la enzima, el contenido en GLA en organismos
productores de GLA, o GLA en organismos productores de LA. A este
respecto son de especial interés por ejemplo organismos que producen
aceite tales como girasol, colza, soja pero también otros. Además
pueden producirse mediante el uso simultáneo de por ejemplo una
delta-12 desaturasa (por ejemplo, Sakuradani E et
al. (1999) Eur. J. Biochem. 261:812-820, Okuley
et al. Plant Cell (1994) 6(1) 147-58)
los PUFA mencionados en organismos o células que no contienen o
sólo contienen poco LA. Igualmente es posible una combinación de las
tres desaturasas \Delta6, \Delta9 y \Delta12 que participan
en la formación de GLA para la producción de GLA y ácidos grasos
delta-6 insaturados. Además, la combinación con
otros genes de la biosíntesis de PUFA (véase la figura 1) es otra
realización preferida de la invención, transformándose el GLA y los
ácidos grasos delta-6 insaturados por medio de otras
enzimas, para las que GLA sirve como sustrato, mediante lo cual
pueden producirse por ejemplo ARA (20:4) y otras moléculas que se
derivan de GLA.
Además puede utilizarse la invención para la
producción de nuevas fuentes de alimentos que contienen GLA o de
fuentes de alimentos que son ricas en moléculas (especialmente PUFA,
por ejemplo ARA), que pueden derivarse de GLA u otros ácidos grasos
\Delta6 insaturados.
La presente invención describe además
constructos de expresión que contienen el gen de
delta-6 desaturasa o partes del mismo, así como la
combinación funcional de la secuencia que codifica para
delta-6 desaturasa con secuencias reguladoras
heterólogas.
Otro objeto de la invención es la producción de
organismos transgénicos con contenido en GLA aumentado (véanse las
tablas 1 y 2), mediante el uso de la secuencia de ADN que codifica
para delta-6 desaturasa descrita y de los
constructos funcionales descritos del gen de delta-6
desaturasa.
Para el aislamiento de ADN genómico y de ARNm,
así como la producción de bancos de ADNc y genómico se conocen un
gran número de métodos bien establecidos (por ejemplo, en Sambrook
et al. (1989) en Molecular Clonning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor, NY). La producción de vectores adecuados, que
contienen la desaturasa descrita en la invención o partes de la
misma, puede llevarse a cabo con los métodos conocidos por el
experto, tales como se describen por ejemplo en Ausubel et
al. (Ausubel et al. (1995), Current Protocols in
Molecular Biology, Green Publishing Associates, Nueva York) y
Sambrook et al. (1989).
Los vectores que contienen la secuencia que
codifica para delta-6 desaturasa pueden introducirse
en las células mediante infección, transfección, electroporación,
bombardeo de partículas y otros métodos. Por transformación se
quiere decir en este caso en general la introducción de ADN foráneo
en una célula. Los métodos para esto está bien establecidos y
pueden realizarse de manera conocida para el experto (por ejemplo,
Sambrook et al. (1989), Potrykus I (1991) Annu. Rev. Plant
Biol. Plant Mol. Biol. 42:205-225, Christou P (1993)
Curr. Opp. Biotech. 4:135-141).
Igualmente se describen vectores que contienen
la secuencia de ADN de la presente invención o partes de la
secuencia en combinación funcional con promotores, u otros elementos
reguladores que son activos en una célula huésped. En una
realización preferida, en el caso de estos elementos reguladores, se
trata de secuencias de ácido nucleico que son funcionalmente
activas en ciliados, especialmente Tetrahymena, tales como
por ejemplo los promotores para histona H4, \alpha- y
\beta-tubulina y otros.
Además, en la presente invención se describen
organismos que expresan de manera recombinante la secuencia que
codifica para delta-6 desaturasa descrita. Debido a
esto, además de la posibilidad de la producción de PUFA \Delta6
en estos organismos, también existe por ejemplo la posibilidad de
aislar la delta-6 desaturasa recombinante o partes
de la misma mediante métodos convencionales de la purificación de
proteínas (por ejemplo, Ausubel et al. (1995)). Pueden
producirse vectores para una expresión de la secuencia que codifica
para delta-6 desaturasa en diferentes organismos
según modos conocidos por el experto. Información detallada sobre
vectores adecuados se encuentra en, por ejemplo, Sambrook et
al. (1989), Goeddel, Ed. (1990) Methods in Enzymology 185
Academic Press, y Perbal (1988) A Practical Guide to Molecular
Cloning, John Wiley and Sons, Inc. Tales vectores contienen
preferiblemente elementos de secuencia que influyen en la expresión,
tales como promotores, elementos potenciadores, secuencias que
activan "en el sentido de 5'" etc. Para la expresión son
adecuados promotores tanto constitutivos como inducibles, o por
ejemplo promotores específicos de tejido. Para la expresión en
células vegetales es adecuado por ejemplo el promotor 35S del
"virus del mosaico de la coliflor" (VMC) (Restrepo et
al. (1990) Plant Cell 2 987) o por ejemplo promotores que se
activan en el desarrollo de las semillas.
Preferiblemente, en el caso de los vectores
utilizados se trata de vectores lanzadera (Wolk et al. (1984)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1561-1565, Bustos et
al. (1991) J. Bacteriol. 174:7525-7533).
En una forma de realización preferida se expresa
el ácido nucleico según la invención bajo el control de un promotor
fuerte (tal como por ejemplo el promotor de
\beta-tubulina de Tetrahymena, Gaertig
et al. (1999) Nature Biotech.) en Tetrahymena. La
transformación puede tener lugar preferiblemente según métodos
descritos por Gaertig et al. (1999) Nature Biotech.
17:462-465 (o por ejemplo según Gaertig &
Gorovsky (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:9196-9200). Como elementos reguladores para la
expresión pueden utilizarse por ejemplo los promotores de \alpha-
y \beta-tubulina de Tetrahymena
thermophila. Las Tetrahymena transformadas se
identifican, se acumulan y se cultivan en medios selectivos. A
partir de las células pueden aislarse los lípidos/lipoides según
métodos convencionales (por ejemplo, Dahmer et al., (1989)
Journal of American Oil Chemical Society 66,543). Los ésteres
metílicos de los ácidos grasos pueden analizarse mediante
cromatografía de gases.
Los ácidos nucleicos aislados descritos en la
presente invención o partes de los mismos pueden utilizarse también
para el aislamiento de los genes semejantes a partir de otros
organismos, especialmente por ejemplo a partir de otros protistas,
especialmente ciliados. Para el aislamiento de genes homólogos puede
utilizarse el ácido nucleico según la invención o partes del mismo
como sonda marcada. Mediante la hibridación de la sonda con los
ácidos nucleicos aislados a partir de otros organismos pueden
identificarse y aislarse secuencias ácido nucleico homólogas. El
marcaje de la sonda puede realizarse de una manera conocida por el
experto (Ausubel, Sambrook (citado anteriormente)). Para el marcaje
de la sonda son adecuados por ejemplo nucleótidos radioactivos o
nucleótidos que están enlazados con moléculas detectables tales como
por ejemplo moléculas fluorescentes, digoxigenina, biotina, enzimas
o moléculas magnéticas. La identificación y el aislamiento de
secuencias de ADN homólogas tiene lugar mediante la detección del
marcaje después de una hibridación de la sonda con ADN heterólogo.
Para la búsqueda de secuencias homólogas son apropiados los bancos
de ADNc o bancos genómicos. Además, para la detección de secuencias
homólogas son adecuadas las transferencias de tipo Southern y de
tipo Northern. Alternativamente, puede aislarse ADN homólogo que se
hibrida con la sonda marcada también mediante la retención
selectiva de la sonda marcada (por ejemplo con ayuda de un
imán).
El aislamiento y la clonación de los genes
homólogos mediante hibridación cruzada puede tener lugar mediante
métodos conocidos por el experto, tales como se describen por
ejemplo en Ausubel et al. (1995, Current Protocols in
Molecular Biology, Green Publishing Associates, Nueva York) o
Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning).
Basándose en la secuencia de ADN aislada y la
secuencia proteica codificada por ésta pueden diseñarse además
oligonucleótidos, con la ayuda de los cuales pueden amplificarse
secuencias de ácido nucleico homólogas por medio de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR).
Otra posibilidad para el aislamiento de
proteínas homólogas consiste en la detección con anticuerpos
específicos frente a la proteína codificada por la secuencia de la
presente invención o partes de la misma (por ejemplo anticuerpos
antipéptidos).
- SEQ ID NO: 1:
- Secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica para delta-6 desaturasa de la delta-6 desaturasa de Tetrahymena thermophila. Están subrayados el codón de iniciación y el codón de terminación.
- SEQ ID NO: 2:
- Secuencia proteica derivada de la SEQ ID NO: 1 de la delta-6 desaturasa de Tetrahymena, teniendo en cuenta el uso de codones de ciliados especiales (Wuitschick JD, Karrer KM (1999), o CUTG (Codon usage tabulated from Genbank, uso de codones tabulados de Genbank): http:// www.dna.affrc.go.jp/\simnakamura/CUTG.html).
- SEQ ID NO: 3:
- Secuencia de nucleótidos genómica de la delta-6 desaturasa de Tetrahymena thermophila.
- Figura 1:
- Representación esquemática de la biosíntesis de PUFA.
- Figura 2:
- Resultado de una comparación de banco de datos mediante BLASTP de la secuencia proteica según la SEQ ID NO: 2 con bancos de datos de proteínas.
- Figura 3:
- Alineación de la secuencia proteica según la SEQ ID NO: 2 con desaturasas conocidas.
- Figura 4:
- Alineación múltiple de la secuencia polipeptídica según la SEQ ID NO: 2 a partir de Tetrahymena con desaturasas conocidas. Las cajas de histidina así como el motivo de HPGG conservado a partir del dominio de citocromo b5 están subrayados.
- Figura 5:
- Representación esquemática de la estructura génica de la delta-6 desaturasa de Tetrahymena según las SEQ ID NO: 1 y 3.
- Figura 6:
- Producción del constructo de expresión de delta-6 desaturasa pBDES6.
- Figura 7:
- Producción del constructo de desactivación pgDES6::neo.
- Figura 8:
- Comparación del espectro de ácidos grasos (ácidos grasos principales) de los transformantes de pBDES6 de Tetrahymena (AX601 y AX604) en comparación con la cepa de tipo natural de Tetrahymena (CU522).
Los siguientes ejemplos sirven para aclarar la
invención sin limitar la invención a estos ejemplos.
Se cultivaron Tetrahymena thermophila
(cepas B1868 VII, B2086 II, B*VI, CU427, CU428, CU522, facilitadas
por el Dr. J. Gaertig, Universidad de Georgia, Atenas, GA, EE.UU.)
en medio SPP modificado (proteosa-peptona al 2%,
extracto de levadura al 0,1%, glucosa al 0,2%,
Fe-EDTA al 0,003% (Gaertig et al. (1994) PNAS
91:4549-4553)) o medio de leche desnatada (leche
desnatada en polvo al 2%, extracto de levadura al 0,5%, glucosa al
1%, Fe-EDTA al 0,003%) o medio MYG (leche desnatada
en polvo al 2%, extracto de levadura al 0,1%, glucosa al 0,2%,
Fe-EDTA al 0,003%) con la adición de disolución de
antibióticos (penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mug/ml y
anfotericina B 0,25 \mug/ml (medio SPPA)) a 30ºC en un volumen de
50 ml en un matraz Erlenmeyer de 250 ml con agitación (150
r.p.m).
Se reprodujeron y se seleccionaron plásmidos y
fagos en XL1-Blue MRF', TOP10F' o JM109 de E.
coli. El cultivo de las bacterias tuvo lugar en condiciones
convencionales en medio LB o NZY, con antibióticos en
concentraciones convencionales (Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring, Nueva York).
Se aisló ARN completo a partir de Tetrahymena
thermophila según el método de tiocianato de
guanidina/fenol/clo-
roformo (Chomzynski & Sacchi (1987) Anal. Biochem. 161:156-159). A partir del ARN completo se aisló el ARNm con ayuda de perlas Oligotex-dT (Qiagen). La síntesis de ADNc tuvo lugar según el kit de síntesis y clonación de ADNc ZAP Express de Stratagene. Después de la ligación del adaptador EcoR I y la digestión con Xho I se separó y se fraccionó según el tamaño el ADN a través de un gel de agarosa (S: 500-1500 pb, B: más de 1500 pb). Se aisló el ADN a partir del gel (Qiaquick Gel Extraktion Kit, (kit de extracción en gel), QIAGEN) y se ligó en el vector de ZAP Express cortado con Eco RI y Xho I. Se empaquetó in vitro el ADN ligado en fagos (Stratagene Gigapack III Gold) y se reprodujeron los fagos en XL1-Blue MRF' de E. coli. El banco de S-ADNc contenía aproximadamente 5 x 10^{5} clones con un tamaño de inserto promedio de 1,1 kb, el banco de B-ADNc contenía aproximadamente 6 x 10^{4} clones con un tamaño de inserto promedio de 2 kb.
roformo (Chomzynski & Sacchi (1987) Anal. Biochem. 161:156-159). A partir del ARN completo se aisló el ARNm con ayuda de perlas Oligotex-dT (Qiagen). La síntesis de ADNc tuvo lugar según el kit de síntesis y clonación de ADNc ZAP Express de Stratagene. Después de la ligación del adaptador EcoR I y la digestión con Xho I se separó y se fraccionó según el tamaño el ADN a través de un gel de agarosa (S: 500-1500 pb, B: más de 1500 pb). Se aisló el ADN a partir del gel (Qiaquick Gel Extraktion Kit, (kit de extracción en gel), QIAGEN) y se ligó en el vector de ZAP Express cortado con Eco RI y Xho I. Se empaquetó in vitro el ADN ligado en fagos (Stratagene Gigapack III Gold) y se reprodujeron los fagos en XL1-Blue MRF' de E. coli. El banco de S-ADNc contenía aproximadamente 5 x 10^{5} clones con un tamaño de inserto promedio de 1,1 kb, el banco de B-ADNc contenía aproximadamente 6 x 10^{4} clones con un tamaño de inserto promedio de 2 kb.
Mediante la comparación de secuencias de las
desaturasas conocidas pudieron identificarse las regiones
conservadas. Para las zonas de aminoácidos especialmente muy
conservadas WWKWNHNAHH (SEQ ID NO: 4) y GGLQFQIEHHLFP (SEQ ID NO: 5)
se diseñaron cebadores para PCR teniendo en cuenta el uso especial
de codones de ciliados o codones de Tetrahymena (Wuitschick
JD, Karrer KM (1999) Analysis of genomic G + C content, codon usage,
initiator codon context and translation termination sites in
Tetrahymena thermophila. J. Eukaryot. Microbiol. 46
(3):239-47; Martindale (1989) J. Protozool. 36,
1:29-34, CUTG, (Codon Usage Tabulated from Genbank):
http://www.
dna.affrc.go.jp/\simnakamura/CUTG.html).
dna.affrc.go.jp/\simnakamura/CUTG.html).
| Cebador 1 (sentido): | 5'-TGGTGGAARTGGAMNCAYAA-3', | (SEQ ID NO: 6) |
| Cebador 2 (antisentido): | 5'-CGDGGRAANARRTGRTGTTC-3' | (SEQ ID NO: 7). |
Se utilizaron 100 ng de ARNm aislado para la
síntesis de cadena primaria con la transcriptasa inversa del VMA
(Boehringer Mannheim). La reacción tuvo lugar según el protocolo del
fabricante en un volumen de 20 \mul: Tris-HCl 50
mM (pH 8,5), MgCl_{2} 8 mM, KCl 30 mM, DTT 1 mM, dNTPs 1 mM, 2
pmol de cebador de anclaje de Oligo-dT
(5'-GACCACGCGTATCGATGTCGACT(16)V-3';
SEQ ID NO: 8), 2 unidades de transcriptasa inversa del VMA, 60 min.
a 55ºC, a continuación 10 min. 65ºC. Se utilizó para la PCR 1/10 de
esta reacción de cadena primaria. La PCR tuvo lugar en un volumen
de 25 \mul con: 1 x tampón para PCR de Qiagen HotStarTaq (QIAGEN),
pH 8,7 (20ºC), 10 pmol de cada uno de los cebadores específicos
para delta-6 desaturasa, 200 \muM de cada dNTP,
MgCl_{2} 1,5 mM, 1 unidad de polimerasa de HotStarTaq (Qiagen). Se
realizó la PCR en las siguientes condiciones: desnaturalización
inicial a 95ºC durante 15 min., seguido a continuación por 35 ciclos
con en cada caso 94ºC durante 30 s, 45ºC durante 30 s y 72ºC
durante 1 min. Finalmente 10 min. 72ºC. Se ligaron los fragmentos de
PCR mediante clonación T/A (Invitrogen) en el vector pCR 2.1 y se
reprodujeron en TOP10F' de E. coli (Invitrogen). Se aisló
ADN de plásmido de clones positivos (Qiaprep Spin, QIAGEN) y se
secuenció.
Basándose en la secuencia así identificada se
diseñaron nuevos oligonucleótidos para la PCR:
| Cebador d6/1-F (sentido): | 5'-GGAATCACAATCAACATCATATGTTCAC-3' | (SEQ ID NO: 9) y |
| Cebador d6/1-R (antisentido): | 5'-CTTCGTCCTTTAGAATGTTGTTTGTGAAC-3' | (SEQ ID NO: 10). |
El aislamiento del ADNc completo que codifica
para delta-6 desaturasa tuvo lugar mediante PCR con
estos cebadores en combinación con cebadores (T3 y T7) específicos
de vectores del banco de ADNc. Del banco de ADNc se utilizaron 2
\mul (10^{5} ufp/\mul) para una PCR (véase anteriormente). La
PCR tuvo lugar de manera diferente a las condiciones indicadas
anteriormente según el siguiente protocolo: desnaturalización 15
min. 95ºC, a continuación 35 ciclos con 20 s 94ºC, 20 s 57ºC, 1
min. 72ºC. Finalmente 10 min. 72ºC. Se secuenciaron los productos de
PCR con los cebadores utilizados también para la PCR. Basándose en
la información de secuencia así obtenida se diseñó un nuevo cebador
que se encontraba en el extremo 5' de la secuencia de ADNc:
| Cebador d6-5'-F: | AGTAAGCAAACTAAATTTAAAAAACAAGC | (SEQ ID NO: 11) |
Con ayuda de este cebador en unión con un
cebador específico de vector pudo amplificarse y aislarse la
secuencia de ADN completa mediante PCR (condiciones de PCR, véase
anteriormente). Mediante la clonación de este producto de PCR en el
vector pCR 2.1 se obtuvo el plásmido pDES6.
Se aisló ADN genómico con ayuda del método de la
urea (Gaertig et al. 1994) a partir de Tetrahymena y
se cortó con Eco RI. El ADN cortado se ligó en un vector lambda
igualmente cortado con Eco RI (Zap Express, Stratagene). La
realización posterior correspondió al modo de proceder en el caso de
la biblioteca de ADNc.
Se identificó la secuencia genómica de
delta-6 desaturasa con ayuda de la PCR. Por un lado
se generó un producto de PCR de aproximadamente 2200 pb de tamaño a
partir del ADN genómico con cebadores de los extremos 5' y 3' del
ADNc: d6-5'-F:
AGTAAGCAAACTAAATTTAAAAAACAAGC (SEQ ID NO: 12)
d6-3'-R: GGTCCTTCAT
GAATCTTAAGGTTCCACTTC (SEQ ID NO: 13), que contenía la secuencia codificante completa e intrones. Para aislar las secuencias flanqueantes del gen de delta-6 desaturasa se utilizó el sistema Genome Walker (Clonetech). Con ayuda de los cebadores universales de este sistema y los cebadores específicos basándose en la secuencia de delta-6 desaturasa identificada d6-5'-R: CTTAAGTCTTATCAACTCCCATAATGC (SEQ ID NO: 14) d6-3'-F: GAAGTG
GAACCTTAAGATTCATGAAGGACC (SEQ ID NO: 15) pudieron aislarse las regiones flanqueantes del gen de delta-6 desaturasa de Tetrahymena. En la figura 5 se representa la estructura completa de la secuencia genómica.
GAATCTTAAGGTTCCACTTC (SEQ ID NO: 13), que contenía la secuencia codificante completa e intrones. Para aislar las secuencias flanqueantes del gen de delta-6 desaturasa se utilizó el sistema Genome Walker (Clonetech). Con ayuda de los cebadores universales de este sistema y los cebadores específicos basándose en la secuencia de delta-6 desaturasa identificada d6-5'-R: CTTAAGTCTTATCAACTCCCATAATGC (SEQ ID NO: 14) d6-3'-F: GAAGTG
GAACCTTAAGATTCATGAAGGACC (SEQ ID NO: 15) pudieron aislarse las regiones flanqueantes del gen de delta-6 desaturasa de Tetrahymena. En la figura 5 se representa la estructura completa de la secuencia genómica.
El vector pBICH3 (Gaertig et al. 1999
Nature Biotech. 17:462-465) contiene la secuencia
codificante de la preproteína de antígeno I (G1) de
Ichthyophthirius, flanqueada por las secuencias reguladoras
no codificantes del gen BTU-1 de Tetrahymena
thermophila. Se utilizó un plásmido (pBICH3-Nsi)
modificado con un sitio de corte Nsi I al inicio (facilitadas por
J. Gaertig, Universidad de Georgia, Atenas, GA, EE.UU.) para
producir el constructo de expresión pBDES6 de
delta-6 desaturasa. Para esto se insertaron sitios
de corte Nsi I y Bam HI por medio de PCR al inicio y al final de
las secuencias codificantes de delta-6 desaturasa de
Tetrahymena. Para la PCR se utilizaron como moldes plásmidos
(pDES6) aislados que contienen las secuencias de ADNc completas de
delta-6 desaturasa. Los cebadores
D6-Nsi-F:
5'-GCATTATGCATGTTGATAAGACTTAAGAAG-3'
(SEQ ID NO: 16) D6-Bam-R:
5'-TATG
GATCCTCAAAGGTGAGATTTTTCAAAAATAG-3' (SEQ ID NO: 17) generaron productos de PCR que contenían la secuencia codificante completa de la delta-6 desaturasa, flanqueada por los sitios de corte Nsi I y Bam HI. Se cortaron los productos de PCR y el plásmido pBICH3-Nsi con las enzimas de restricción Nsi I y Bam HI, se purificaron a través de un gel de agarosa y se ligaron (véase la figura de construcción de plásmido). Los constructos de expresión pBDES6 así producidos contenían la secuencia completa que codifica para delta-6 desaturasa insertada en un marco de lectura correcto en las secuencias reguladoras del gen BTU1 (véase la figura 6). Para la transformación de Tetrahymena se linealizaron los constructos mediante una digestión con las enzimas de restricción Xba I y SaI I. En el caso de una transformación eficaz se sustituyó el gen BTU1 por este constructo mediante recombinación homóloga, mediante lo cual se proporcionó una resistencia de las células frente a paclitaxel.
GATCCTCAAAGGTGAGATTTTTCAAAAATAG-3' (SEQ ID NO: 17) generaron productos de PCR que contenían la secuencia codificante completa de la delta-6 desaturasa, flanqueada por los sitios de corte Nsi I y Bam HI. Se cortaron los productos de PCR y el plásmido pBICH3-Nsi con las enzimas de restricción Nsi I y Bam HI, se purificaron a través de un gel de agarosa y se ligaron (véase la figura de construcción de plásmido). Los constructos de expresión pBDES6 así producidos contenían la secuencia completa que codifica para delta-6 desaturasa insertada en un marco de lectura correcto en las secuencias reguladoras del gen BTU1 (véase la figura 6). Para la transformación de Tetrahymena se linealizaron los constructos mediante una digestión con las enzimas de restricción Xba I y SaI I. En el caso de una transformación eficaz se sustituyó el gen BTU1 por este constructo mediante recombinación homóloga, mediante lo cual se proporcionó una resistencia de las células frente a paclitaxel.
La determinación del espectro de ácidos grasos
tuvo lugar por medio de cromatógrafos de gases (HP GC 6890) con
detector de ionización de llama (Hewlett-Packard
Company, Wilmington, EE.UU.). Como columna sirvió una FFAP (Free
Fatty Acid Phase, fase de ácido graso libre) Permbond (Macherey
& Nagel GmbH, Düren). La identificación de los ácidos grasos
tuvo lugar mediante la comparación de tiempos de retención de
patrones de ésteres metílicos de ácidos grasos. Basándose en la
concentración conocida del patrón pudo determinarse la concentración
de los ácidos grasos en la muestra.
Para la determinación del espectro de ácidos
grasos se cultivaron los transformantes aislados en medio MYG a
30ºC, 150 r.p.m. durante 24-96 h. Se centrifugaron
50 ml del cultivo a 1500 g durante 15 min., se descartó el
sobrenadante, se congeló el sedimento a -80ºC y a continuación se
liofilizó. Se pesaron 50 mg de la muestra liofilizada y se
mezclaron con 1 ml de HCl metanólico al 20% y 1 ml de disolución de
patrón metabólico (1 mg/ml). Para la liberación de los ácidos
grasos y su esterificación para dar ésteres metílicos de ácidos
grasos se agitaron las muestras en tubos de ensayo cerrados durante
dos horas a 60ºC en un baño de agua y se enfriaron hasta
temperatura ambiente. Para neutralizar la muestra se añadió a
continuación 1 ml de disolución acuosa, saturada de
hidrogenocarbonato de sodio y se mezcló con cuidado. Mediante la
adición de n-hexano se extrajeron los ésteres
metílicos de ácidos grasos. A continuación se mezcló vigorosamente
la mezcla básica y mediante centrifugación durante 2 min. a 4300
r.p.m. se consiguió una separación de fases. Se eliminó
aproximadamente 2/3 de la fase orgánica superior y se inyectó 1
\mul de la muestra en la columna de CG y se analizó.
Los transformantes muestran en estas condiciones
un aumento de la proporción de GLA en de aproximadamente un
22-32% en el espectro total de ácidos grasos en
comparación con la cepa CU522 no transformada (tabla 1). Además del
desplazamiento de la proporción de GLA es obvio un claro
desplazamiento del espectro de ácidos grasos hacia un contenido más
alto en ácidos grasos insaturados. La razón de los ácidos grasos
(principales) insaturados con respecto a los saturados se duplica
en el caso de los transformantes (tabla 2).
Para la producción del constructo de
desactivación se insertó en la secuencia genómica de
delta-6 desaturasa un casete neo del plásmido
p4T2-1\DeltaH3 (Gaertig et al. (1994) Nucl.
Acids Res. 22:5391-5398). A este respecto se trata
del gen resistente a neomicina bajo el control del promotor de
histona H4 de Tetrahymena y la secuencia flanqueante en el
sentido de 3' del gen BTU2. Este constructo proporciona en
Tetrahymena una resistencia frente a paromomicina. Se cortó
el plásmido p4T2-1\DeltaH3 con Eco RV/Sma I y el
fragmento de aproximadamente 1,4 kb de tamaño del casete neo se
ligó en el plásmido pgDES6 cortado con Eco RV en la secuencia
genómica de la delta-6 desaturasa de
Tetrahymena (véase la figura 8). Mediante esto se generó el
plásmido pgDES6::neo. En una transformación eficaz se sustituyó el
gen para la delta-6 desaturasa por este constructo
mediante recombinación homóloga, mediante lo cual se proporcionó a
las células una resistencia frente a paromomicina.
Para una transformación se utilizaron 5 x
10^{6} células (CU522) de Tetrahymena thermophila. El
cultivo de las células tuvo lugar en 50 ml de medio SPPA a 30ºC en
un matraz Erlenmeyer de 250 ml en un agitador a 150 r.p.m. hasta
que se obtuvo una densidad celular de aproximadamente
3-5 x 10^{5} células/ml. Se sedimentaron las
células mediante centrifugación (1200 g) durante 5 min. y se
resuspendió el sedimento celular en 50 ml de
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) y se centrifugó como
anteriormente. Se repitió esta etapa de lavado y se resuspendieron
las células en Tris-HCl 10 mM (pH 7,5, más
antibióticos) a una densidad celular de 3 x 10^{5} células/ml, se
trasfirieron a un matraz Erlenmeyer de 250 ml y se incubaron durante
16-20 h sin agitación a 30ºC (fase de inanición).
Después de la fase de inanición se determinó de nuevo el número de
células, se centrifugó tal como anteriormente y se ajustaron las
células con Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) hasta una
concentración de 5 x 10^{6} células/ml. Se utilizó un ml de las
células para la transformación. La transformación tuvo lugar por
medio de un bombardeo de micropartículas (véase a continuación).
Para la regeneración se absorbieron las células en medio SSPA y se
incubaron a 30ºC sin agitación en el matraz Erlenmeyer. Después de 3
h se añadió Paclitaxel® en una concentración final de 20 \muM y
se transfirieron las células en alícuotas de 100 \mul a placas de
microtitulación de 96 pocillos. Se incubaron las células en una caja
húmeda, sin luz a 30ºC. Después de 2-3 días
pudieron identificarse clones resistentes a paclitaxel. Se
inocularon clones positivos en medio nuevo con 25 \mul de
paclitaxel. Mediante el cultivo de las células en concentración
creciente de Paclitaxel (hasta 80 \muM) se consiguió una
"colección fenotípica" completa (Gaertig & Kapler
(1999)).
Para el análisis de los clones se pusieron
aproximadamente 4 ml de cultivos en SPPA con paclitaxel, se aisló
el ADN (Jacek Gaertig et al. (1994) PNAS
91:4549-4553) y se amplificó mediante PCR el ADN
integrado en el locus BTU1. Como cebadores sirvieron los cebadores
específicos de BTU1 BTU1-5'F
(AAAAATAAAAAAGTTT
GAAAAAAAACCTTC, aproximadamente 50 pb antes del codón de iniciación, SEQ ID NO: 18) y BTU1-3'R (GTT
TAGCTGACCGATTCAGTTC, 3 pb después del codón de terminación, SEQ ID NO: 19). Se analizaron los productos de PCR sin cortar y cortados con Hind III o Eco RV (pBDES6) o Eco RI (pBDES9) en un gel de agarosa al 1%. Se verificó la "colección fenotípica" completa a través de RT-PCR con los cebadores específicos de BTU1 (Gaertig & Kapler (1999)).
GAAAAAAAACCTTC, aproximadamente 50 pb antes del codón de iniciación, SEQ ID NO: 18) y BTU1-3'R (GTT
TAGCTGACCGATTCAGTTC, 3 pb después del codón de terminación, SEQ ID NO: 19). Se analizaron los productos de PCR sin cortar y cortados con Hind III o Eco RV (pBDES6) o Eco RI (pBDES9) en un gel de agarosa al 1%. Se verificó la "colección fenotípica" completa a través de RT-PCR con los cebadores específicos de BTU1 (Gaertig & Kapler (1999)).
Se cultivaron cepas de Tetrahymena de
distintos tipos de apareamiento (CU428 VII y B2086 II) por separado
en medio SPPA a 30ºC con agitación (150 r.p.m.) en un matraz
Erlenmeyer. A una densidad celular de 3-5 x 10^{5}
células/ml se centrifugaron (1200 g) las células durante 5 min. a
temperatura ambiente. Se lavaron las células tres veces con 50 ml
de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) y posteriormente se
resuspendieron en 50 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5)
y se mezclaron con disolución de antibióticos. Se incubaron las
células en un matraz Erlenmeyer a 30ºC sin agitación. Después de
aproximadamente 4 h se contaron de nuevo ambos cultivos y se
diluyeron con Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) hasta 3 x
10^{5} células/ml, se incubaron durante 16-20 h
adicionales a 30ºC. Después de esta fase de inanición se mezcló de
ambos cultivos el mismo número de células (absoluto) en un matraz
Erlenmeyer de 2 l. Se incubaron las células a 30ºC (inicio de la
conjugación) y después de 2 h se determinó la eficacia de la
conjugación. Para una transformación eficaz debían encontrarse en
este momento aproximadamente el 30% de las células como
parejas.
Para la transformación del micronúcleo se
centrifugaron 3 h, 3,5 h, 4 h y 4,5 h después del inicio de la
conjugación en cada caso 1 x 10^{7} células conjugadas (5 x
10^{6} pares) durante 5 min. a 1200 g y se resuspendió el
sedimento celular en 1 ml de Tris-HCl 10 mM (pH
7,5).
Para la transformación de la nueva disposición
del macronúcleo se centrifugaron las células 11 h después del
inicio de la conjugación tal como anteriormente y se resuspendieron
en Tris-HCl. La transformación tuvo lugar por medio
de un bombardeo de micropartículas (véase a continuación).
Para el cultivo de mutantes de desactivación de
delta-6 desaturasa se añadieron al medio aceite de
borraja 200 \mug/ml (GLA al 20-25%; SIGMA).
Mediante la selección para la resistencia a
paramomicina pudieron identificarse las células transformadas. En
la transformación del micronúcleo se añadió paromomicina
(concentración final 100 \mug/ml) 11 h después del inicio de la
conjugación y se distribuyeron las células en alícuotas de 100
\mul en placas de microtitulación de 96 pocillos. Se incubaron
las células en una caja húmeda a 30ºC. Después 2-3
días pudieron identificarse los clones resistentes. Ciertos
transformantes del micronúcleo pudieron distinguirse de los
transformantes del macronúcleo debido a la resistencia frente a
6-metilpurina. En la transformación del macronúcleo
se añadió paromomicina (concentración final 100 \mug/ml)
aproximadamente 4 h después de la transformación y se distribuyeron
las células en alícuotas de 100 \mul en placas de microtitulación
de 96 pocillos. Se incubaron las células en una caja húmeda a 30ºC.
Después 2-3 días pudieron identificarse los clones
resistentes. Se inocularon clones positivos en medio nuevo con
paromomicina 120 \mug/ml. Mediante el cultivo de las células en
esta alta concentración de paromomicina se consiguió después de
algunas generaciones una "colección fenotípica" completa
(Gaertig & Kapler (1999)).
Mediante el cruzamiento de los transformantes
del micronúcleo con una cepa B*VI pudieron producirse mutantes de
desactivación homocigóticos (Bruns &
Cassidy-Hanley, Methods in Cell Biology, volumen 62
(1999) 229-240).
La transformación de Tetrahymena
thermophila tuvo lugar por medio de la transformación
biolística, tal como se describe en Bruns &
Cassidy-Hanley (Methods in Cell Biology, volumen 62
(1999) 501-512); Gaertig et al. (1999)
Nature Biotech. 17:462-465) o
Cassidy-Hanley et al. ((1997) Genetics
146:135-147). El manejo del sistema de
administración de partículas Biolistic® PDS-1000/He
(BIO-RAD) está descrito detalladamente en el manual
correspondiente.
Para la transformación se cargan 6 mg de
partículas de oro (0,6 \mum; BIO-RAD) con 10
\mug de ADN de plásmido linealizado (Sanford et al. (1991)
Biotechniques 3:3-16; Bruns &
Cassidy-Hanley (1999) Methods in Cell Biology,
volumen 62: 501-512).
Preparación de las partículas de oro: se
resuspendieron 60 mg de las partículas de oro de 0,6 \mum (Biorad)
en 1 ml de etanol. Para esto se mezclaron vigorosamente las
partículas 3 veces cada una durante 1-2 min. en un
vórtex. A continuación se centrifugaron las partículas durante 1
min. y se eliminó el sobrenadante con cuidado con una pipeta. Se
resuspendieron las partículas de oro en 1 ml de agua estéril y se
centrifugaron tal como anteriormente. Se repitió esta etapa de
lavado una vez más, se resuspendieron las partículas en 1 ml de
glicerol al 50% y se almacenaron en alícuotas de 100 \mul a
-20ºC.
Preparación de la transformación: se almacenaron
el soporte de macroportador, el macroportador y las pantallas de
parada durante varias horas en etanol al 100%, los discos de ruptura
en isopropanol. A continuación se puso un macroportador en el
soporte del macroportador y se secó al aire.
Carga de las partículas de oro con ADN: todos
los trabajos tuvieron lugar a 4ºC. Se enfriaron en hielo las
partículas de oro, el vector preparado, CaCl_{2} 2,5 M,
espermidina 1 M, etanol al 70% y al 100%. Se añadieron 10 \mul de
ADN de vector linealizado (1 \mug/ml) a 100 \mul de partículas
preparadas y se agitaron en vórtex con cuidado durante 10 s. A
continuación se añadieron en primer lugar 100 \mul de CaCl_{2}
2,5 M, se agitaron en vórtex durante 10 s y después se añadieron 40
\mul de espermidina 1 M y se agitó en vórtex con cuidado durante
10 min. Después de la adición de 200 \mul de etanol al 70% se
agitaron en vórtex las partículas durante 1 min. y después se
centrifugaron durante 1 min. a 10000 g. Se resuspendió el sedimento
en 20 \mul de etanol al 100%, se centrifugó y después se
resuspendió en 35 \mul de etanol al 100%.
Las partículas así preparadas se añadieron con
cuidado con una pipeta al centro de un macroportador. A continuación
se almacenó el macroportador hasta la transformación en una caja
con gel de sílice higroscópico.
Transformación: se añadió un ml de las células
preparadas (véase anteriormente) en el medio de un filtro circular
humedecido con Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) en una placa
petri y se puso en el soporte lateral más bajo de la cámara de
transformación del sistema de administración de partículas
Biolistic®. La transformación tuvo lugar con las partículas de oro
preparadas a una presión de 900 psi (dos discos de ruptura de 450
psi) y un vacío de 27 pulgadas de Hg en la cámara de
transformación. A continuación se transfirieron inmediatamente las
células a un matraz Erlenmeyer con 50 ml de medio SPPA y se
incubaron a 30ºC sin agitación.
<110> Aventis Research & Technologies
GmbH & Co KG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevo ácido nucleico a partir de
Tetrahymena que codifica para una delta-6
desaturasa, su producción y su uso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ax99046wo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 19943270.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
10-09-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 1219
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Tetrahymena thermophila
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<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 352
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Tetrahymena thermophila
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 2492
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<212> ADN
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<213> Tetrahymena thermophila
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Tetrahymena thermophila
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<400> 4
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\sa{Trp Trp Lys Trp Asn His Asn Ala His
His}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Tetrahymena thermophila
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Leu Gln Phe Gln Ile Glu His His Leu
Phe Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtggaart ggamncayaa
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgdggraana rrtgrtgttc
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaccacgcgt atcgatgtcg actttttttt tttttttttv
\hfill40
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipggaatcacaa tcaacatcat atgttcac
\hfill28
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<210> 10
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskipcttcgtcctt tagaatgttg tttgtgaac
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipagtaagcaaa ctaaatttaa aaaacaagc
\hfill29
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<210> 12
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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artificial: cebador
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<400> 12
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\hfill29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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artificial: cebador
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipggtccttcat gaatcttaag gttccacttc
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<212> ADN
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artificial: cebador
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<400> 14
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artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskipgaagtggaac cttaagattc atgaaggacc
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artificial: cebador
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<212> ADN
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artificial: cebador
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\hfill35
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artificial: cebador
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<400> 19
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\hskip-.1em\dddseqskipgtttagctga ccgattcagt tc
\hfill22
Claims (18)
1. Ácido nucleico que codifica para
delta-6 desaturasa de Tetrahymena con una
secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2 y partes del mismo
con al menos 8 nucleótidos, que codifican para un polipéptido que
presenta actividad delta-6 desaturasa.
2. Ácido nucleico según la reivindicación 1,
caracterizado porque el ácido nucleico se obtiene a partir
de un ciliado.
3. Ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el ácido nucleico se obtiene a partir de
Tetrahymena thermophila.
4. Ácido nucleico según la reivindicación
1-3, caracterizado porque el ácido nucleico
es un ADN o ARN, preferiblemente un ADN bicatenario.
5. Ácido nucleico según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el ácido
nucleico es un ADN con una secuencia de ácido nucleico según la SEQ
ID NO: 1 desde la posición 33 hasta la posición 1091.
6. Ácido nucleico según una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el ácido
nucleico contiene una o varias secuencias no codificantes.
7. Ácido nucleico aislado según una de las
reivindicaciones 1 a 6 según la SEQ ID NO: 3 y partes del mismo con
al menos 8 nucleótidos, que codifican para un polipéptido que
presenta actividad delta-6 desaturasa.
8. Ácidos nucleicos según una de las
reivindicaciones 1-7, caracterizados porque
el ácido nucleico está contenido en un vector, preferiblemente en un
vector de expresión.
9. Vectores de expresión según la reivindicación
8, caracterizados porque el ácido nucleico se encuentra en
combinación funcional con un promotor constitutivo y/o inducible y
opcionalmente una señal de terminación.
10. Procedimiento para la producción de un ácido
nucleico según una de las reivindicaciones 1-7,
caracterizado porque el ácido nucleico se sintetiza
químicamente o se aísla a partir de un banco de genes mediante una
sonda.
11. Polipéptido con una secuencia de aminoácidos
según la SEQ ID NO: 2 y partes del mismo con al menos 12
aminoácidos, que presentan actividad delta-6
desaturasa.
12. Procedimiento para la producción de un
polipéptido según la reivindicación 11, caracterizado porque
un ácido nucleico según una de las reivindicaciones
1-7 se expresa en un huésped o sistema de expresión
adecuado.
13. Anticuerpo específico frente a un
polipéptido con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:
2.
14. Organismo no humano transgénico que contiene
un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 10.
15. Ácido nucleico según la reivindicación 1,
caracterizado porque el ácido nucleico comprende la SEQ ID
NO: 1.
16. Ácido nucleico según la reivindicación 7,
caracterizado porque el ácido nucleico comprende la SEQ ID
NO: 3.
17. Ácido nucleico según la reivindicación 1 ó
7, caracterizado porque las partes comprenden al menos 15,
preferiblemente 20 nucleótidos.
18. Ácido nucleico según la reivindicación 1 ó
7, caracterizado porque las partes comprenden al menos 100
nucleótidos.
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