ES2297286T3 - Uso de productos proteicos del factor de crecimiento de queratinocitos-2. - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro de estimulación de la producción de células epiteliales seleccionadas entre células de páncreas, hígado y tracto gastrointestinal, que comprende poner en contacto tales células con una cantidad eficaz de la proteína o las proteínas KGF-2.
Description
Uso de productos proteicos del factor de
crecimiento de queratinocitos-2.
La presente invención se refiere al uso de
productos proteicos del factor de crecimiento de queratinocitos 2
(KGF-2) para estimular la proliferación, el
crecimiento y la diferenciación de una variedad de células
epiteliales.
El procedimiento complejo de la generación y
regeneración de tejidos está mediado por numerosos factores
proteicos referidos a veces como factores de crecimiento de tejidos
blandos. Estas moléculas son liberadas generalmente por un tipo de
célula y actúan influyendo en la proliferación de otros tipos de
células (Rubin et al. (1989), Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA,
86:802-806). También existen algunos factores de
crecimiento liberados de células que tienen por sí mismas la
capacidad de responder a tales factores de crecimiento. Algunos
factores de crecimiento de tejidos blandos son secretados por tipos
concretos de células e influyen en la proliferación, diferenciación,
y/o maduración de células sensibles en el desarrollo de organismos
multicelulares (Finch et al. (1989), Science,
245:757-755). Además de sus papeles en los
organismos en desarrollo, algunos factores de crecimiento de tejidos
blandos son significativos en la conservación de la salud y el
mantenimiento de sistemas más maduros. Por ejemplo, en mamíferos
existen muchos sistemas en los que se produce un rápido recambio de
células. Tales sistemas incluyen la piel y el tracto
gastrointestinal, ambos los cuales están compuestos de células
epiteliales. En este grupo de factores de crecimiento de tejidos
blandos está incluida la familia de proteínas de los factores de
crecimiento de fibroblastos (FGF).
Se sabe ahora que la familia del factor de
crecimiento de fibroblastos (FGF) está compuesta por al menos
catorce miembros, a saber FGF-1 a
FGF-10 y los factores homólogos
FHF-1 a FHF-4, que comparten
afinidad entre sus estructuras primarias: el factor de crecimiento
de fibroblastos básico, bFGF (Abraham et al. (1986), EMBO
J., 5:2523-2528); el factor de crecimiento de
fibroblastos ácido, aFGF (Jaye et al. (1986), Science,
233:541-545); el producto del gen
int-2, int-2 (Dickson y Peters
(1987), Nature, 326:833); hst/kFGF (Delli-Bovi et
al. (1987), Cell, 50:729-737 y Yoshida et
al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
84:7305-7309); FGF-5 (Zhan et
al. (1988), Mol. Cell. Biol., 8:3487-3495);
FGF-6 (Marics et al. (1989), Oncogene,
4:335-340); el factor de crecimiento de
queratinocitos, KGF (Finch et al. (1989), Science,
24:752-755); la hisactofilina (Habazzettl et
al. (1992), Nature, 359:855-858); el
FGF-9 (Miyamoto et al. (1993), Mol. Cell
Biol., 13(7):4251-4259); y el factor de
crecimiento de fibroblastos 10, también conocido como factor de
crecimiento de queratinocitos 2, KGF-2 (solicitud
de patente PCT WO 96/25422), cuyas descripciones se incorporan en la
presente como referencia. Más recientemente, se identificaron
cuatro factores homólogos (o FHF'') a partir de la retina humana por
medio de una combinación de secuenciación de ADNc al azar,
búsquedas de las bases de datos existentes y reacciones en cadena de
la polimerasa basadas en la homología (Smallwood et al.
(1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:9850-9857).
Se ha propuesto que FHF-1, FHF-2,
FHF-3 y FHF-4 deberían ser
denominadas FGF-11, FGF-12,
FGF-13 y FGF-14, respectivamente,
de acuerdo con la recomendación del Comité de Nomenclatura (Coulier
et al. (1997), Journal of Molecular Evolution,
44:43-56).
En la publicación WO 96/25422 se describe la
clonación, expresión y purificación del KGF-2
completo (con la secuencia señal, los restos Met^{1} a Thr^{36}
del SEQ ID NO:2) y maduro (sin secuencia señal, restos Cys^{37} a
Ser^{208} del SEQ ID NO:2) en un sistema de expresión bacteriano
(p. ej., E. coli) y sistemas de expresión eucarióticos (p.
ej., baculovirus y células COS). Esta referencia ilustra
adicionalmente que el KGF-2 podría ser útil para
estimular el crecimiento y la proliferación celular para el
crecimiento o la angiogénesis de nuevos vasos sanguíneos, la
prevención de la pérdida del cabello, la curación de heridas
dérmicas y la diferenciación de células musculares, el tejido
nervioso, las células de la próstata y las células del pulmón.
Aunque el KGF-2 es un miembro de
la familia de FGF, los efectos físicos e in vivo entre los
miembros de la familia no son los mismos. Por ejemplo, es bien
sabido que aFGF, bFGF y KGF responden a heparina de diferentes
maneras. La actividad mitogénica de aFGF aumenta sustancialmente en
presencia de heparina, pero la actividad mitogénica de bFGF en
presencia de heparina solamente aumenta mínimamente, a pesar del
hecho de que la heparina se une íntimamente a bFGF. En contraste,
la incorporación de timidina por las células BALB/MK es inhibida
cuando se incluye heparina con KGF en el medio de cultivo (Ron et
al. (1993), J. Biol. Chem., 268:2984-2988). Por
otra parte, se sabe que aFGF y bFGF se unen al mismo receptor, pero
KGF también tiene diferentes receptores en los fibroblastos NIH/3T3
de los receptores de aFGF y bFGF en los fibroblastos NIH/3T3, que no
logran interaccionar con KGF (Bottaro, et al. (1990), J.
Biol. Chem., 265, 12767-12770). Adicionalmente, KGF
es distinto de aFGF y bFGF ya que no es mitogénico para los
fibroblastos o las células endoteliales (Rubin et al. (1989),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:802-806).
De hecho, el perfil de expresión del
KGF-2 es bastante diferente de los de otros miembros
de la familia FGF (Yamasaki et al. (1996), J. Biol Chem.,
271:15918-15921). Presumiblemente el
KGF-2 tiene un único papel fisiológico, no
habiéndose dilucidado su actividad biológica (Emoto et al.
(1997), J. Biol. Chem.,
272(37):23191-23194).
Por lo tanto, queda mucho por aprender referente
al KGF-2 como factor de crecimiento, incluyendo las
células epiteliales en tipos de órganos y tejidos adicionales a los
cuales puede ser dirigido el KGF-2 y el efecto in
vivo del KGF-2 sobre tales células.
Esta invención se refiere al uso in vivo
o in vitro del producto o los productos proteicos de
KGF-2, como se define en las reivindicaciones para
estimular la producción de células epiteliales del páncreas
(exocrino y endocrino), el hígado y/o el tracto gastrointestinal
incluyendo las células de la cavidad oral, el estómago glandular y
el intestino delgado, el colon y otras células de la mucosa
intestinal.
Numerosos aspectos y ventajas de la presente
invención serán evidentes tras la revisión de las Figuras, en las
que:
La Figura 1 representa una secuencia de ADNc
(SEQ ID NO:1) que codifica el KGF-2 humano
recombinante, completo. Asimismo se representa la secuencia de
aminoácidos (SEQ ID NO:2)- del KGF-2 humano
recombinante, completo. Los 36 restos aminoácido iniciales
(Met^{1} a Thr^{36}) representan la supuesta secuencia líder del
KGF-2 completo y los restos Cys^{37} a Ser^{208}
del SEQ ID NO:2 representan el KGF-2 maduro. Las
formas completa y madura son referidas en conjunto como
"KGF-2".
La Figura 2 representa una secuencia de ADNc
(SEQ ID NO:3) que codifica His rFGF10. Asimismo se representa la
secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:4) de His rFGF10.
La Figura 3 representa una secuencia de ADNc
(SEQ ID NO:5) que codifica hFGF10. Asimismo se representa la
secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:6) de hFGF10.
De acuerdo con la presente invención y como se
define en las reivindicaciones, el producto o los productos
proteicos de KGF-2, como se describe más
detalladamente más abajo, se pueden utilizar in vivo o in
vitro para estimular la producción de las células epiteliales
del páncreas (endocrino y exocrino), el hígado y el tracto
gastrointestinal incluyendo las células de la cavidad oral, el
estómago glandular y el intestino delgado, el colon y otras células
de la mucosa intestinal.
Esta invención tiene por tanto implicaciones en
términos de la habilitación de la aplicación del producto o el
producto o los productos proteicos de KGF-2 para
reducir, retardar y/o bloquear el comienzo de la lesión o las
deficiencias en estos tipos concretos de células. La siguiente es
una descripción de las enfermedades y afecciones médicas que pueden
ser tratadas con El producto o los productos proteicos de
KGF-2 de acuerdo con la invención.
El producto o los productos proteicos de
KGF-2 son útiles para incrementar la citoprotección,
proliferación y/o diferenciación de los hepatocitos con el fin de
incrementar la función del hígado. El producto o los productos
proteicos de KGF-2 son útiles para tratar y/o
prevenir la cirrosis hepática, la insuficiencia hepática fulminante,
la lesión causada por la hepatitis viral aguda, los ataques tóxicos
al hígado y/o los trastornos de los conductos biliares.
La cirrosis hepática, secundaria a la hepatitis
viral y a la ingestión crónica de alcohol, es una causa
significativa de morbididad y mortalidad. El producto o los
productos proteicos de KGF-2 son útiles para tratar
y/o prevenir el desarrollo de la cirrosis. Se conoce un modelo
in vivo normalizado de cirrosis hepática (Tomaszewski et
al. (1991), J. Appl. Toxicol., 11:229-231).
La insuficiencia hepática fulminante es una
afección amenazadora de la vida que se produce con la cirrosis en
fase terminal y que en la actualidad es tratable solamente con el
transplante de hígado. El producto o los productos proteicos de
KGF-2 son útiles para tratar y/o prevenir la
insuficiencia hepática fulminante. Se conocen modelos in
vivo normalizados de insuficiencia hepática normalizada
(Mitchell et al. (1973), J. Pharmacol. Exp. Ther.,
187:185-194; Thakore y Mehendale (1991), Toxicologic
Pathol., 19:47-58; y Havill et al. (1994),
FASEB Journal, 8(4-5):A930, Abstract
5387).
La hepatitis viral aguda es frecuentemente
subclínica y auto-limitante. No obstante, en una
minoría de pacientes se puede producir una lesión grave del hígado
a lo largo de varias semanas. Los productos proteicos de
KGF-2 son útiles para tratar y/o prevenir la
hepatitis viral. Se conocen modelos in vivo normalizados de
proliferación de hepatocitos (Housley et al. (1994), Journal
of Clinical Investigation, 94(5):1764-1777; y
Havill et al. (1994), supra).
Los ataques tóxicos para el hígado causados por
acetaminofeno, halotano, tetracloruro de carbono y otras toxinas
pueden ser evitados o tratados por medio del producto o el producto
o los productos proteicos de KGF-2. Se conocen
modelos in vivo normalizados de toxicidad hepática (Mitchell
et al. (1973), supra; Thakore y Mehendale (1991),
supra; y Havill et al. (1994), supra).
El producto o los productos proteicos de
KGF-2 son útiles para incrementar la citoprotección,
proliferación y/o diferenciación de células epiteliales en el
tracto gastrointestinal (p. ej., la cavidad oral, el esófago, el
estómago, el intestino delgado, el colon, el recto y el canal anal).
Los términos "tracto gastrointestinal", según se definen en la
presente memoria, e "intestino" son términos reconocidos en la
técnica y se utilizan en la presente memoria indistintamente.
Específicamente, el producto o los productos proteicos de
KGF-2 son útiles para tratar y/o prevenir las
úlceras gástricas, las úlceras duodenales, la enfermedad
inflamatoria del intestino, la toxicidad del intestino y las
erosiones del tracto gastrointestinal.
Las úlceras gástricas ocasionan una morbididad
significativa, tienen una tasa de recurrencia relativamente
elevada, y curan por formación de cicatrices sobre el recubrimiento
mucoso. El producto o los productos proteicos de
KGF-2 son útiles para prevenir la degeneración de la
mucosa glandular y para regenerar la mucosa glandular más
rápidamente, p. ej., ofreciendo una mejora terapéutica significativa
en el tratamiento de las úlceras gástricas. Se conocen modelos
in vivo normalizados de úlceras gástricas (Tarnawski et
al. (1991), "Indomethacin Impairs Quality of Experimental
Gastric Ulcer Healing: A Quantitative Histological y Ultrastructural
Analysis", en: Mechanisms of Injury, Protection y Repair of the
Upper Gastrointestinal Tract, (eds) Garner y O'Brien, Wiley and
Sons; Brodie (1968), Gastroenterology, 55:25; y Ohning et al.
(1994), Gastroenterology, 106(4 Suppl.):A624).
Las úlceras duodenales, como las úlceras
gástricas, ocasionan una morbididad significativa y tienen una tasa
de recurrencia relativamente elevada. El producto o los productos
proteicos de KGF-2 son útiles para prevenir la
degeneración del recubrimiento mucoso del duodeno y para regenerar
rápidamente el recubrimiento mucoso del duodeno para curar aquellas
úlceras y disminuir su recurrencia. Se conocen modelos in
vivo normalizados de úlceras duodenales (Berg et al.
(1949), Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 7:374-376; Szabo
y Pihan, Chronobiol. Int. (1987), 6:31-42; y Robert
et al. (1970), Gastroenterology,
59:95-102).
La toxicidad del intestino es un factor
limitante principal asociado con el tratamiento del cáncer, tanto
en la radiación (abdominal, cuerpo entero o local, p. ej., cabeza y
cuello) como en la quimioterapia. Son de primer interés aquellos
pacientes que experimentan: quimioterapia para el cáncer tal como
leucemia, cáncer de mama, o como coadyuvante para la eliminación de
tumores; radioterapia para el cáncer de cabeza y cuello; y
quimioterapia y radioterapia combinadas para transplantes de médula
ósea. La gravedad de la lesión está relacionada con el tipo y la
dosis de agentes quimioterapéuticos y terapia concomitante tal como
radioterapia.
La mucositis en porciones del tracto
gastrointestinal puede ser responsable de un dolor y malestar
significativos para estos pacientes, y oscila en gravedad de
enrojecimiento e hinchazón a claras lesiones ulcerativas. Las
lesiones a menudo se infectan secundariamente y se hacen mucho más
difíciles de curar. Se conocen modelos in vivo normalizados
de toxicidad del intestino inducida por radiación (Withers y Elkind
(1970), Int. J. Radiat., 17(3):261-267). Se
conocen modelos in vivo normalizados de toxicidad del
intestino inducida por quimioterapia (Farrell et al., The
American Society of Hematology, 38º Annual Meeting (Orlando, FL),
6-8 Diciembre, 1996; Sonis et al. (1990),
Oral Surg. Oral Med & Oral Pathol.,
69(4):437-443; y Moore (1985), Cancer
Chemotherapy Pharmacol., 15:11-15).
Los agentes quimioterapéuticos ilustrativos
incluyen, pero no están limitados a, BCNU, busulfan, carboplatino,
ciclofosfamida, cisplatino, citosinarabinósido, daunorrubicina,
doxorrubicina, etoposido, 5-fluorouracilo,
gemcitabina, ifosfamida, irinotecan, melfalan, metotrexato,
navelbina, topotecan, taxol y taxótero, y los regímenes de
tratamiento ilustrativos incluyen, pero no están limitados a, BEAM
(busulfan, etoposido, citosinarabinósido, metotrexato);
ciclofosfamida e irradiación de todo el cuerpo; ciclofosfamida,
irradiación de todo el cuerpo y etoposido; ciclofosfamida y
busulfan; y 5-fluorouracilo con leucovorin o
levamisol.
El tratamiento, pre-tratamiento
y/o post-tratamiento, con El producto o los
productos proteicos de KGF-2 son útiles para
generar un efecto citoprotector o regeneración o ambos, por ejemplo,
sobre la mucosa del intestino delgado, permitiendo aumentar las
dosificaciones de tales terapias a la vez que se reducen los
potenciales efectos secundarios fatales de la toxicidad para el
intestino.
El producto o los productos proteicos de
KGF-2 se pueden administrar preferentemente en los
siguientes marcos. A los pacientes colorrectales se les administra
rutinariamente 5-fluorouracilo con leucovorin los
días 1 a 5; El producto o los productos proteicos de
KGF-2 se puede administrar los días -2, -1 y 0. A
los pacientes con cánceres de cabeza y cuello se les administra
rutinariamente una terapia de radiación hipofraccionada, más
5-fluorouracilo y cisplatino a lo largo de un
período de una semana; El producto o los productos proteicos de
KGF-2 se pueden administrar los días -2, -1 y 0 y
después de eso una vez por semana hasta el final de la terapia con
radiación. En los pacientes con transplantes por linfoma se les
administra frecuentemente la terapia BEAM durante 6 días (días 1 a
6); El producto o los productos proteicos de KGF-2
se pueden administrar los días -2, -1 y 0 y como un
post-tratamiento de tres días (días 7 a 9).
En las realizaciones específicas, el producto o
los productos proteicos de KGF-2 pueden ser
administrados profilácticamente y/o terapéuticamente para reducir,
retardar y/o bloquear el comienzo de la mucositis (debida a
quimioterapia y/o radioterapia), combinados con una o más citoquinas
para retardar y/o bloquear el comienzo de la citopenia.
Típicamente, la médula ósea, las células
progenitoras de la sangre periférica o las células troncales
(McNiece et al. (1989), Blood, 74:609-612 y
Moore et al. (1979), Blood Cells, 5:297-311)
son retiradas de un paciente antes de la terapia citorreductiva
mielosupresora (quimioterapia sola o con terapia por radiación) y
después son re-administradas al paciente junto con
la terapia citorreductiva o después de ella con el fin de
contrarrestar los efectos mielosupresores de semejante terapia.
Se han acometido muchos enfoques diferentes para
proteger a un organismo de los efectos secundarios de la radiación
o los productos químicos tóxicos. Un enfoque consiste en remplazar
las células de la médula ósea antes de que se desarrolle toxicidad.
Otro enfoque consiste en utilizar células progenitoras de la sangre
periférica (PBPC). Estas PBPC se pueden recoger mediante aféresis o
flebotomía tras la terapia con citoquinas sola
(G-CSF o GM-CSF), o con
quimioterapia o citoquinas. Se pueden devolver frescas o
crioconservadas. Si se desea, las células pueden seleccionarse para
que sean CD34+, tengan mermadas las células T, mermadas las células
tumorales, o se pueden expandir las células progenitoras (hacer que
se multipliquen) mediante métodos conocidos en la técnica, antes de
su administración. Las ventajas de la re-infusión de
progenitores autólogos o alogénicos tras la terapia mielosupresora
han sido descritas en la literatura (Morse et al. (1992),
Ann. Clin. Lab. Sci., 22:221-225; Kessinger y
Armitage (1991), Blood, 77:211-213; Kessinger et
al. (1989), Blood, 74:1260-1265; Takam et
al. (1989), Blood, 74:1245-1251 y Kessinger
et al. (1988), Blood, 171:723-727).
Según se utiliza en la presente memoria, el
término "citoquina" es un término genérico para las proteínas
liberadas por una población de células que actúan sobre otra célula
como mediadores intercelulares. Los ejemplos de tales citoquinas
son las linfoquinas, monoquinas, y hormonas polipeptídicas
tradicionales. Entre las citoquinas están incluidos los factores de
crecimiento de tipo insulina; la hormona del crecimiento humana; la
hormona del crecimiento humana N-metionilada; la
hormona del crecimiento bovina; la hormona paratiriodea; la
tiroxina; la insulina; la proinsulina; la relaxina; la
pro-relaxina; las hormonas glicoproteicas tales como
la hormona estimuladora del folículo (FSH), la hormona estimuladora
del tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); el factor de
crecimiento hematopoyético; el factor de crecimiento hepático; el
factor de crecimiento de fibroblastos; la prolactina; el lactógeno
placentario; el factor de necrosis tumoral alfa y beta; el péptido
asociado con la gonadotropina de ratón; la inhibina; la activina;
el factor de crecimiento endotelial vascular; la integrina; la
trombopoyetina; los factores de crecimiento nerviosos tales como el
NGF-beta; los factores de crecimiento de plaquetas
tales como TPO y MGDF; los factores de crecimiento transformante
(TGF) tales como TGF-alfa y
TGF-beta; el factor de crecimiento de tipo insulina
I y II; la eritropoyetina; los factores osteoinductores; los
interferones tales como el interferón alfa, beta y gamma; los
factores estimuladores de colonias (CSF) tales como CSF de
macrófagos (M-CSF), CSF de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF) y
CSF de granulocitos (G-CSF); las interleuquinas
(IL) tales como IL-1, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9, IL-10, IL-11,
IL-12, IL-13,
IL-14, IL-15 y
IL-16; y otros factores polipeptídicos. Las
citoquinas se pueden utilizar solas o combinadas para proteger de,
mitigar y/o revertir la toxicidad mieloide o hematopoyética asociada
con agentes citotóxicos.
La administración del producto o los productos
proteicos de KGF-2, así como de citoquinas, debe ser
coordinada y optimizada. Dependiendo de las circunstancias, se
puede administrar una dosis apropiada de proteína
KGF-2 antes o después de la administración de los
agentes terapéuticos. Por ejemplo, un parámetro a considerar es si
la citoquina es administrada en una sola dosis o en múltiples dosis
durante el transcurso de la terapia. Ciertas citoquinas son
rápidamente aclaradas del organismo y requerirán una administración
periódica o continua con el fin de maximizar su eficacia. La forma
de administración puede diferir, dependiendo de si se administra un
pre-tratamiento o un
post-tratamiento de citoquina. Por ejemplo, si la
citoquina se administra antes del agente citotóxico, es preferible
administrar la citoquina mediante inyección de bolo intravenoso
durante varias horas, y opcionalmente, repetir tal administración
uno o más días durante y una vez completada la terapia
citotóxica.
En una realización específica, el producto o los
productos proteicos de KGF-2 se van a administrar
(p. ej., intravenosamente) de 0,1 a 500 microgramos/kg/dosis,
preferiblemente hasta aproximadamente 200 microgramos/kg/dosis,
antes de (p. ej., 1 a 3 días) y/o después de la quimioterapia o la
terapia con radiación, y el G-CSF (Neupogen® o
Lenograstim®) o el GM-CSF (Sargramostim®) se va a
administrar (p. ej., subcutáneamente) a 5 microgramos/kg/dosis
durante 1 a 10 días (preferiblemente 7 a 10 días) después de la
quimioterapia.
Las erosiones del tracto gastrointestinal (p.
ej., esófago, estómago, e intestino) incluyen la gastritis erosiva,
la esofagitis, el reflujo esofágico y las enfermedades inflamatorias
del intestino. Las enfermedades inflamatorias del intestino, tales
como la enfermedad de Crohn (que afecta principalmente al intestino
delgado) y la colitis ulcerativa (que afecta principalmente al
intestino grueso), son enfermedades crónicas de etiología
desconocida que dan como resultado la destrucción de la superficie
mucosa, inflamación, formación de cicatrices y adherencias durante
la reparación, y una morbididad significativa para los individuos
afectados. El producto o los productos proteicos de
KGF-2 son útiles para regenerar el revestimiento
mucoso y disminuir la recurrencia de estas erosiones, dando como
resultado una curación más rápida, y pueden resultar beneficiosos
para controlar el progreso de la enfermedad. Se conocen modelos
in vivo normalizados de erosión del tracto gastrointestinal
(Geisinger et al. (1990), Mod-Pathol.,
3(5):619-629; Carlborg et al. (1983),
Laryngoscope, 93(2):184-187; Carlborg et
al. (1980), Eur-Surg-Res.,
12(4):270-282; Keshavarzian et al.
(1991),
Alcohol-Clin-Exp-Res.,
15(1):116-121; Katz et al. (1988),
Dig-Dis-Sci., 33 (2)
:217-224; y Zeeh et. al. (1996),
Gastroenterology, 110(4):1077-1083). También
se conocen modelos in vivo normalizados de enfermedad
inflamatoria del intestino (Morris et al. (1989),
Gastroenterology, 96:795-803; Rachmilewitz et
al. (1989), Gastroenterology, 97:326-327;
Allgayer et al. (1989), Gastroenterology,
96:1290-1300; y Kim y Borstad (1992), Scand. J.
Gastroenterol, 27(7):529-537).
Los estudios con animales han establecido la
relación entre la nutrición parenteral total (TPN) y la atrofia de
la mucosa intestinal (Buchman et al. (1995), Journal of
Parenteral and Enteral Nutrition, 19:453-460). La
disminución de la altura del villus intestinal se atribuye a la
carencia de estímulo de crecimiento proporcionado a través de la
ingesta oral de los nutrientes. Esto se refleja en una reducción en
el índice de marcaje, una medida del crecimiento. Las disminuciones
en la altura del villus también se corresponden con disminuciones
en las actividades específicas de las enzimas implicadas en la
absorción de los nutrientes. El producto o los productos proteicos
de KGF-2 son útiles para proteger frente a la
atrofia durante el ayuno y/o facilitar el recrecimiento tras la
reintroducción de nutrientes
orales.
orales.
Los trastornos del páncreas pueden estar
relacionados con el sistema endocrino tales como la diabetes de Tipo
I o de Tipo II, o pueden estar relacionados con el sistema exocrino
tales como la pancreatitis y las insuficiencias pancreáticas o la
fibrosis quística. Los pacientes diagnosticados de diabetes de Tipo
I requieren la constante administración exógena de insulina. Los
pacientes diagnosticados de diabetes de tipo II progresan a través
diversas etapas de resistencia/insuficiencia de insulina para
requerir por último también administración exógena de insulina. El
producto o los productos proteicos de KGF-2 son
útiles para aliviar, retardar y/o evitar la manifestación
permanente de la diabetes melitus o como accesorio en el entorno del
transplante de células de los islotes induciendo la función de las
células beta pancreáticas con el fin de normalizar los niveles de
glucosa en sangre durante las demandas metabólicas variables, sin
embargo evitan la hipoglucemia frecuente o profunda. Se conocen
modelos normalizados de diabetes (Junod et al. (1967), Proc.
Soc. Exp. Bio. Med. 126(1):201-205; Rerup
(1970), Pharm. Rev., 22:485-518; Rossini et
al. (1977), P.N.A.S., 74:2485-2489; y Ar' Rajab
y Ahren (1993), Pancreas, 8:50-57). Se conoce un
modelo normalizado de proliferación de células pancreáticas (Yi
et al. (1994), American Journal of Pathology,
145(1):80-85).
De acuerdo con los términos de esta invención,
por el término "la proteína o las proteínas
KGF-2" se quiere significar la proteína definida
por los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} del SEQ ID NO: 2
(KGF-2 maduro) y proteínas variantes de la misma.
De este modo el término "la proteína o las proteínas
KGF-2" incluye una proteína en la cual uno o más
restos aminoácido ha sido suprimido ("variante o variantes por
deleción", insertado ("variante o variantes por adición"),
y/o sustituido ("variante o variantes por sustitución") en la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2 y que conserva actividad
biológica. De este modo, si bien las descripciones de más abajo de
las modificaciones de la proteína hacen referencia al
KGF-2 maduro, esto no excluye modificaciones
adicionales.
El término "actividad biológica" según se
utiliza en la presente memoria significa que la proteína o las
proteínas KGF-2 poseen alguna pero no
necesariamente todas las mismas propiedades (y no necesariamente en
el mismo grado) que el KGF-2 maduro. La selección
de las propiedades de interés concretas depende del uso deseado de
la proteína o las proteínas KGF-2 deseadas.
Los expertos en la técnica apreciarán que se
pueden realizar muchas combinaciones de deleciones, inserciones, y
sustituciones, siempre que la proteína final sea biológicamente
activa. Existen dos variables principales en la construcción de la
variante o las variantes de la secuencia de aminoácidos: la
localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación.
En el diseño de la variante o las variantes, la localización del
sitio de mutación dependerá de la característica o las
características bioquímicas que se vayan a modificar. Los sitios de
mutación pueden ser modificados individualmente o en serie, p.
ej.,
(1) suprimiendo el resto aminoácido diana,
(2) insertando restos aminoácido adyacentes al
sitio localizado o (3) sustituyendo primero elecciones de
aminoácidos conservativos y, dependiendo de los resultados
obtenidos, después con selecciones más radicales.
Las deleciones en la secuencia de aminoácidos
generalmente oscilan entre aproximadamente 40 restos aminoácido, de
aproximadamente 30 restos aminoácido, de aproximadamente 20 restos
aminoácido, y típicamente de aproximadamente 1 a 10 restos
aminoácido. Las deleciones en la secuencia de aminoácidos del
KGF-2 maduro se pueden realizar, por ejemplo, en
regiones de baja homología con las secuencias de otros miembros de
la familia de FGF. Será más probable que las deleciones en la
secuencia de aminoácidos del KGF-2 maduro en áreas
de homología sustancial con las secuencias de otros miembros de la
familia de FGF modifiquen significativamente la actividad biológica.
El número total de deleciones y/o deleciones consecutivas se
seleccionará preferiblemente de manera que conserve la estructura
terciaria del KGF-2 maduro en el dominio afectado,
p. ej., entrecruzamiento de cisteína.
Las adiciones en la secuencia de aminoácidos
pueden incluir fusiones amino y/o carboxilo terminales con una
longitud que oscila de un resto a cien restos o más, así como
inserciones intrasecuencia internas de restos aminoácido únicos o
múltiples. Las adiciones internas pueden oscilar preferiblemente
entre aproximadamente 1 y 10 restos aminoácido, más preferiblemente
de aproximadamente 1 a 5 restos aminoácido, y muy preferiblemente
de aproximadamente 1 a 3 restos aminoácido. Las adiciones en la
secuencia de aminoácidos del KGF-2 maduro se pueden
realizar en regiones de baja homología con las secuencias de otros
miembros de la familia de FGF. Será más probable que las adiciones
en la secuencia de aminoácidos del KGF-2 maduro en
áreas de homología sustancial con las secuencias de otros miembros
de la familia modifiquen significativamente la actividad biológica.
Las inserciones o adiciones incluyen preferiblemente secuencias de
aminoácidos derivadas de las secuencias de otros miembros de la
familia de FGF.
Se contempla una adición en el extremo amino
para incluir la adición de una metionina (por ejemplo, como un
artefacto de la expresión directa en un cultivo de células
recombinantes bacterianas) o un resto aminoácido o secuencia de
KGF-2 maduro. Un ejemplo adicional de adición
N-terminal incluye la fusión de una secuencia señal
en el extremo N del KGF-2 maduro con el fin de
facilitar la secreción de proteína a partir de células anfitrionas
recombinantes. Tales secuencias señal se obtendrán generalmente a
partir de, y de este modo serán homólogas, a la especie de célula
anfitriona pretendida. La secuencia señal nativa está incluida en el
alcance de esta invención, por ejemplo, la señal nativa de la
proteína definida por los aminoácidos Met^{1} a Thr^{36} del
SEQ ID NO:2 o una secuencia señal heteróloga. La secuencia señal
heteróloga seleccionada debe ser una que sea procesada y reconocida
(esto es, escindida por una peptidasa señal) por la célula
anfitriona. Para las células anfitrionas procarióticas que no
reconocen y procesan la secuencia señal nativa, se puede sustituir
la secuencia señal por una secuencia señal procariótica
seleccionada, por ejemplo, del grupo de los líderes de la fosfatasa
alcalina, la penicilinasa o la enterotoxina II estable al calor.
Para la secreción en levadura, la secuencia señal se puede
seleccionar, por ejemplo, del grupo de las secuencias líder de la
invertasa de levadura, el factor alfa o la fosfatasa ácida. En la
expresión en células de mamífero específicamente, pueden ser
adecuadas secuencias señal del KGF-2 completo o de
otros miembros de la familia del FGF (p. ej., KGF).
Un ejemplo de una adición en el extremo carboxi
incluye proteínas quiméricas que comprenden la fusión del
KGF-2 con todo o parte del dominio constante de la
cadena pesada o ligera de la inmunoglobulina humana. Se prefieren
tales polipéptidos quiméricos en los que la porción inmunoglobulina
comprende todos los dominios excepto el primer dominio de la región
constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana tal como
IgG, IgA, IgM o IgE, especialmente IgG, p. ej., IgG1 o IgG3. Un
experto apreciará que se puede suprimir o sustituir cualquier
aminoácido de la porción inmunoglobulina por uno o más aminoácidos,
o se pueden añadir uno o más aminoácidos con tal que la porción de
KGF-2 todavía estimule las células epiteliales y la
porción inmunoglobulina muestre una o más de sus propiedades
características.
Otro grupo de la variante o las variantes son la
variante o las variantes por sustitución de aminoácidos de la
secuencia de aminoácidos del KGF-2 maduro. Esta
variante o variantes tienen al menos un resto aminoácido en la
secuencia Cys^{37} a Ser^{208} del SEQ ID NO:2 eliminado y un
resto diferente insertado en su lugar. La variante o las variantes
por sustitución incluyen la variante o las variantes alélicas que se
caracterizan por cambios en la secuencia de nucleótidos de origen
natural en la población de la especie que pueden dar como resultado
o no un cambio de aminoácidos. Un experto en la técnica puede
utilizar cualquier información conocida a cerca de la unión o el
sitio activo del polipéptido en la selección de los posibles sitios
de mutación.
Un método para identificar los restos aminoácido
o las regiones para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de
barrido con alanina", como describen Cunningham y Wells (1989),
Science, 244:1081-1085. En este
método, se identifica un resto aminoácido o un grupo de restos
diana (p. ej., restos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys, y
Glu) y se remplaza por un aminoácido neutro o cargado negativamente
(muy preferiblemente alanina o polialanina) para efectuar la
interacción de los aminoácidos con el entorno acuoso circundante
dentro o fuera de la célula. Aquellos dominios que demuestran
sensibilidad funcional para las sustituciones se refinan después
introduciendo restos adicionales o alternativos en los sitios de la
sustitución. De este modo, se pre-determina el
sitio para introducir una modificación de la secuencia de
aminoácidos y, para optimizar el funcionamiento de una mutación en
un sitio dado, se puede llevar a cabo la mutagénesis de barrido con
alanina o al azar y se pueden escrutar la variante o las variantes
en cuanto a la combinación óptima de actividad deseada y grado de
actividad.
Los sitios de mayor interés para la mutagénesis
sustitutiva incluyen los sitios en los que los restos concretos
dentro de los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} del SEQ ID NO:2
son sustancialmente diferentes de diversas especies u otros
miembros de la familia de FGF en términos de volumen de la cadena
lateral, la carga, y/o el carácter hidrófobo. Otros sitios de
interés incluyen aquellos en los que restos concretos dentro de los
aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} del SEQ ID NO:2, son idénticos
entre diversas especies u otros miembros de la familia de FGF.
Tales posiciones son generalmente importantes para la actividad
biológica de una proteína. Por consiguiente, un experto apreciaría
que inicialmente estos sitios deben ser modificados mediante
sustitución de una manera relativamente conservativa.
Tales sustituciones conservativas se muestran en
la Tabla 1 en el encabezamiento de "Sustituciones Preferidas".
Si tales sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad
biológica, se pueden introducir más cambios sustanciales
(Sustituciones Ilustrativas) y/o se pueden añadir otras
adiciones/deleciones y se pueden escrutar los productos
resultantes.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Al realizar tales cambios de una naturaleza
equivalente, se puede considerar el índice hidropático de los
aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los
aminoácidos al conferir una función biológica interactiva a una
proteína es generalmente conocido en la técnica (Kyte y Doolittle
(1982), J. Mol. Biol., 157:105-131). Se sabe que
ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que
tienen un índice hidropático o puntuación similar y todavía
conservan una actividad biológica similar.
También es sabido en la técnica que la
sustitución de aminoácidos similares se puede realizar eficazmente
basándose en el carácter hidrófilo, concretamente cuando la proteína
o péptido equivalente funcional biológico creado de ese modo está
destinado al uso en realizaciones inmunológicas, como en el presente
caso. En la Patente de los Estados Unidos 4.554.101, cuya
descripción se incorpora en la presente memoria como referencia,
establece que el mayor carácter hidrófilo medio local de una
proteína, regido por el carácter hidrófilo de sus aminoácidos
adyacentes, se corresponde con su inmunogenicidad y antigenicidad,
esto es, con una propiedad biológica de la proteína.
En la Patente de los Estados Unidos 4.554.101
también se ilustra la identificación y preparación de epítopos a
partir de la secuencia primaria de aminoácidos basándose en el
carácter hidrófilo. Por medio de los métodos descritos en la
Patente de los Estados Unidos 4.554.101 un artesano experto sería
capaz de identificar epítopos, por ejemplo, en la secuencia de
aminoácidos del KGF-2. Estas regiones también son
referidas como "regiones núcleo epitópicas". Numerosas
publicaciones científicas han sido dedicadas a la predicción de la
estructura secundaria, y a la identificación de epítopos, a partir
de los análisis de las secuencias de aminoácidos (Chou y Fasman
(1974), Biochemistry, 13(2):222-245; Chou y
Fasman (1974), Biochemistry, 13(2):211-222;
Chou y Fasman (1978), Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol.,
47:45-148; Chou y Fasman (1978), Ann. Rev. Biochem.,
47:251-276 y Chou y Fasman (1979), Biophys. J.,
26:367-384). Por otra parte, en la actualidad se
encuentran disponibles programas de ordenador para ayudar en la
predicción de porciones antigénicas y regiones núcleo epitópicas de
proteínas. Los ejemplos incluyen aquellos programas basados en el
análisis de Jameson-Wolf (Jameson y Wolf (1988),
Comput. Appl. Biosci., 4(1):181-186 y Wolf
et al. (1988), Comput. Appl. Biosci.,
4(1):187-191, cuyas descripciones se
incorporan en la presente memoria como referencia); el programa
PepPlot® (Brutlag et al. (1990), CABS,
6:237-245 y Weinberger et al. (1985),
Science, 228: 740-742); y otros nuevos programas
para la predicción de la estructura terciaria de las proteínas
(Fetrow y Bryant (1993), BIOTECHNOLOGY,
11:479-4-83).
En contraste, las modificaciones sustanciales en
las características funcionales y/o químicas de los aminoácidos
Cys^{37} a Ser^{208} del SEQ ID NO:2 se pueden lograr
seleccionado sustituciones que difieran significativamente en su
efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto
polipeptídico en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una
conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga relativa o el
carácter hidrófobo de la proteína en el sitio diana o (c) el
volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se
dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena
lateral:
- 1)
- hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
- 2)
- hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr;
- 3)
- ácidos: Asp, Glu;
- 4)
- alcalinos: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
- 5)
- restos que influyen en la orientación de la cadena lateral: Gly, Pro; y
- 6)
- aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservativas pueden
implicar el intercambio de un miembro de uno de estos grupos por
otro. Tales restos sustituidos pueden ser introducidos en las
regiones de los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} del SEQ ID
NO:2 que, por ejemplo, son homólogas a las regiones de otros
miembros de la familia de FGF o a regiones no homólogas de la
proteína.
En una realización específica, un polipéptido
variante será preferiblemente sustancialmente homólogo a los
aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} del SEQ ID NO:2. El término
"sustancialmente homólogo", según se utiliza en la presente
memoria, significa que tiene un grado de homología (esto es,
identidad de restos aminoácido; con los aminoácidos Cys^{37} a
Ser^{208} del SEQ ID NO:2 de más del ochenta por ciento (80%);
preferiblemente, más del noventa por ciento (90%); more
preferiblemente, más del noventa y cinco por ciento (95%); y muy
preferiblemente, más de noventa y nueve por ciento (99%). El
porcentaje de homología descrito en la presente memoria se calcula
como el porcentaje de restos aminoácido encontrados en la menor de
las dos secuencias que se alinean con restos aminoácido idénticos
en las secuencias que están siendo comparadas cuando se pueden
introducir cuatro espacios en una longitud de 100 aminoácidos para
ayudar al alineamiento, como muestra Dayhoff (1972), en Atlas of
Protein Sequence and Structure, 5:124, National Biochemical
Research Foundation, Washington, D.C., cuya descripción se
incorpora aquí como referencia. También están incluidas como
sustancialmente homólogas la variante o las variantes de los
aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} del SEQ ID NO:2 que pueden ser
aisladas en virtud de la reactividad cruzada con anticuerpos para
los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} del SEQ ID NO: 2, o cuyos
genes pueden ser aislados por medio de la hibridación con el ADN del
SEQ ID NO: 1 o con segmentos del mismo.
Los expertos en la técnica apreciarán que se
pueden realizar muchas combinaciones de deleciones, inserciones y
sustituciones, siempre que la proteína o las proteínas
KGF-2 finales sean biológicamente activas. La
proteína o las proteínas KGF-2 pueden ser
rápidamente escrutadas para evaluar sus propiedades físicas. Por
ejemplo, el nivel de actividad biológica (p. ej., unión y/o
afinidad hacia el receptor, actividad mitogénica, proliferativa
celular y/o in vivo) se puede someter a ensayo utilizando una
variedad de análisis. Uno de tales análisis incluye un análisis
mitogénico para someter a ensayo la capacidad de una proteína para
estimular la síntesis de ADN (Rubin et al. (1989),
supra). Otro análisis incluye un análisis proliferativo
celular para someter a ensayo la capacidad de una proteína para
estimular la proliferación celular (Falco et al. (1988),
Oncogene, 2:573-578).
Los derivados modificados químicamente de la
proteína o las proteínas KGF-2 en los que el
polipéptido está unido a un polímero con el fin de modificar las
propiedades (referidos en la presente memoria como
"derivados"), están incluidos en el alcance de la presente
invención. Los derivados modificados químicamente de la proteína o
las proteínas KGF-2 pueden ser preparados por un
experto en la técnica dadas las descripciones de la presente
memoria. Los productos conjugados pueden ser preparados utilizando
la proteína o las proteínas KGF-2 glicosiladas, no
glicosiladas o des-glicosiladas. Típicamente, se
utilizarán la proteína o las proteínas KGF-2 no
glicosiladas.
Los radicales químicos adecuados para la
transformación incluyen polímeros solubles en agua. Los polímeros
solubles en agua son deseables porque la proteína a la cual está
anclado cada uno no precipitará en un entorno acuoso, tal como un
entorno fisiológico. Preferiblemente, el polímero será
farmacéuticamente aceptable para la preparación de un producto o
composición terapéuticos. Un experto en la técnica será capaz de
seleccionar el polímero deseado basándose en consideraciones tales
como si el producto conjugado de polímero/proteína se utilizará
terapéuticamente y, si es así, el perfil terapéutico (p. ej., la
duración de la liberación sostenida; la resistencia a la
proteolisis, los efectos, si los hubiera, de la dosificación sobre
la actividad biológica; la facilidad de manipulación; el grado o
carencia de antigenicidad y otros efectos conocidos de un polímero
soluble en agua sobre una proteína terapéutica).
Los polímeros solubles en agua, clínicamente
aceptables, adecuados incluyen, pero no están limitados a,
polietilenglicol (PEG), polietilenglicol propionaldehído,
copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, polietilenglicol
monometoxilado, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol
vinílico) (PVA), polivinilpirrolidona,
poli-1,3-dioxolano,
poli-1,3,6-trioxano, copolímero de
etileno/anhídrido maleico,
poli(\beta-aminoácidos) (ya sean
homopolímeros o copolímeros al azar),
poli(n-vinil
pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de
polipropilenglicol (PPG) y otros poli(óxidos de alquileno),
copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles
polioxietilados (POG) (p. ej., glicerol) y otros polioles
polioxietilados, sorbitol polioxietilado, o glucosa polioxietilada,
ácidos colónicos u otros polímeros de carbohidratos, Ficoll o
dextrano y mezclas de los mismos. Según se utiliza en la presente
memoria, se pretende que el polietilenglicol abarque cualquiera de
las formas que han sido utilizadas para transformar otras
proteínas, tales como mono-(alcoxi C1-C10)- o
ariloxi-polietilenglicol. El polietilenglicol
propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su
estabilidad en agua.
Los polímeros solubles en agua pueden tener cada
uno un peso molecular y pueden ser ramificados o no ramificados.
Generalmente, a mayor peso molecular o más ramas, mayor razón
polímero:proteína. Los polímeros solubles en agua tienen cada uno
típicamente un peso molecular medio entre aproximadamente 2kDa y
aproximadamente 100kDa (indicando el término "aproximadamente"
que en las preparaciones de un polímero soluble en agua, algunas
moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular
establecido). El peso molecular medio de cada polímero soluble en
agua está preferiblemente entre aproximadamente 5kDa y
aproximadamente 40kDa, más preferiblemente entre aproximadamente
10kDa y aproximadamente 35kDa y muy preferiblemente entre
aproximadamente 15kDa y aproximadamente 30kDa.
Existen numerosos métodos de anclaje disponibles
para los expertos en la técnica, incluyendo las reacciones de
acilación o las reacciones de alquilación (preferiblemente para
generar una proteína químicamente modificada en el extremo N) con
una molécula soluble en agua reactiva. Véase, por ejemplo, EP 0 401
384, cuya descripción se incorpora aquí como referencia; véase
también, Malik et al. (1992), Exp. Hematol.,
20.:1028-1035; Francis (1992), Focus on Growth
Factors, 3(2) :4-10, publicado por
Mediscript, Mountain Court, Friern Barnet Lane, Londres N20 OLD,
UK; EP 0 154 316; EP 0 401 384; WO 92/16221; WO 95/34326; WO
95/13312; WO 96/11953; Solicitud Internacional PCT Núm. US96/19459;
y las otras publicaciones citadas aquí que hacen referencia a la
pegilación.
Una realización específica de presente invención
es una molécula de aldehído de polietilenglicol monometoxilada no
ramificada que tiene un peso molecular medio de aproximadamente
20kDa conjugado por medio de alquilación reductiva con el extremo N
de la proteína o las proteínas KGF-2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden construir formas polivalentes, esto
es, moléculas que comprenden más de un radical activo. En una
realización, la molécula puede poseer múltiples proteínas
KGF-2. Adicionalmente, la molécula puede poseer al
menos una de la proteína o las proteínas KGF-2 y,
dependiendo de la característica deseada de la forma polivalente, al
menos otra molécula.
En una realización, la proteína o las proteínas
KGF-2 pueden estar acopladas químicamente. Por
ejemplo, la proteína o las proteínas KGF-2 pueden
estar acopladas químicamente con un polímero divalente soluble en
agua por medio de la tecnología de la pegilación descrita antes.
Adicionalmente, la proteína o las proteínas KGF-2
pueden estar acopladas químicamente a una biotina, y después se deja
que la biotina/proteína o proteínas KGF-2 que están
conjugadas se unan a avidina, dando como resultado
avidina/biotina/proteína o proteínas KGF-2
tetravalentes. La proteína o las proteínas KGF-2
también pueden estar acopladas covalentemente a dinitrofenol (DNP) o
trinitrofenol (TNP) y los productos conjugados resultantes
precipitados con anti-DNP o
anti-TNP-IgM para formar productos
conjugados decaméricos.
En otra realización más, también se puede
producir una proteína de fusión recombinante que tiene la proteína
o las proteínas KGF-2 donde cada molécula quimérica
recombinante tiene la secuencia de la proteína o las proteínas
KGF-2, como se ha descrito antes, sustituida para
los dominios variables de cualquiera o de ambas cadenas pesada y
ligera de la molécula de inmunoglobulina y que tiene todos o parte
de los dominios constantes, pero al menos un dominio constante, de
la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina humana. Por ejemplo,
cada una de tales proteínas de fusión de la proteína o las
proteínas KGF-2/IgG1 quiméricas pueden ser
producidas a partir de dos genes quiméricos: una quimera de la
proteína o las proteínas KGF-2/cadena ligera kappa
humana (proteína o proteínas KGF-2/Ck) y una
quimera de la proteína o las proteínas KGF-2/cadena
pesada gamma-1 humana (proteína o proteínas
KGF-2/Cg-1). Después de la
transcripción y la traducción de los dos genes quiméricos, como se
describe más abajo, se pueden emsamblar los productos génicos en una
única molécula quimérica que tiene la proteína o las proteínas
KGF-2 presentadas bivalentemente. Los detalles
adicionales referentes a la construcción de tales moléculas
quiméricas se describen en la Patente de los Estados Unidos
5.116.964, Publicación PCT Núm. WO 89/09622, Publicación PCT Núm. WO
91/16437 y EP 315062.
En otra realización más, también se pueden
producir proteínas de fusión recombinantes en las que la molécula
quimérica recombinante tiene al menos una proteína
KGF-2, como se ha descrito antes, y al menos una
porción de la región 186-401 de la osteoprotegerina
(OPG), como se describe en la Solicitud de Patente Europea Núm.
96309363.8.
La producción de la proteína o las proteínas
KGF-2 se describe con más detalle más abajo. Tales
proteínas pueden ser preparadas, por ejemplo, mediante técnicas
recombinantes o mediante síntesis química de la proteína o las
proteínas KGF-2 deseadas.
Basándose en la presente descripción y
utilizando la tabla de codones universal, un experto en la técnica
puede determinar fácilmente todas las secuencias de ácido nucleico
que codifican una secuencia de aminoácidos de la proteína o las
proteínas KGF-2.
Se pueden seguir las técnicas de expresión
recombinante llevadas a cabo de acuerdo con las descripciones
mostradas más abajo para producir estos polinucleótidos y para
expresar las proteínas codificadas. Por ejemplo, insertando una
secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína o las proteínas
KGF-2 en un vector apropiado, un experto en la
técnica puede producir fácilmente grandes cantidades de la secuencia
de nucleótidos deseada. Las secuencias se pueden utilizar después
para generar sondas de detección o cebadores de amplificación.
Alternativamente, se puede insertar un polinucleótido que codifica
la proteína o las proteínas KGF-2 en un vector de
expresión. Introduciendo el vector de expresión en un anfitrión
apropiado, se pueden producir la proteína o las proteínas
KGF-2 deseadas en grandes cantidades.
Como se describe adicionalmente en la presente
memoria, existen numerosos sistemas anfitrión/vector disponibles
para la propagación de las secuencias de ácido nucleico deseadas y/o
la producción de la proteína o las proteínas KGF-2.
Estas incluyen, pero no están limitadas a, vectores plasmídicos,
virales e insercionales, y anfitriones procarióticos y
eucarióticos. Un experto en la técnica puede adaptar un sistema
anfitrión/vector que sea capaz de propagar o expresar ADN heterólogo
para producir o expresar las secuencias de la presente
invención.
Además, los expertos en la técnica apreciarán
que, a la vista de la presente descripción, las secuencias de ácido
nucleico incluyen los ácidos nucleicos 109 a 624 del SEQ ID NO:1,
así como degenerar las secuencias de ácido nucleico de los mismos,
las secuencias de ácido nucleico que codifican la variante o las
variantes del KGF-2 maduro y aquellas secuencias de
ácido nucleico que hibridan (en condiciones de hibridación descritas
en la sección de escrutinio de la genoteca de ADNc más abajo, o
condiciones equivalentes o condiciones más restrictivas) con los
complementos de los ácidos nucleicos 109 a 624 del SEQ ID NO:1.
La presente invención también proporciona
constructos de ADN recombinantes que implican un ADN vector junto
con las secuencias de ADN que codifican la proteína o las proteínas
KGF-2. En cada uno de tales constructos de ADN, la
secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína o las proteínas
KGF-2 (con o sin péptidos señal) está asociado
operativamente con una secuencia de control de la expresión o
reguladora apropiada capaz de dirigir la replicación y/o expresión
de la proteína o las proteínas KGF-2 en un anfitrión
seleccionado.
Se puede obtener fácilmente una secuencia de
ácido nucleico que codifica la proteína o las proteínas
KGF-2 de diferentes maneras incluyendo, sin
limitación, la síntesis química, el escrutinio de genotecas de ADNc
o genómicas, el escrutinio de genotecas de expresión, y/o la
amplificación mediante PCR del ADNc. Estos y otros métodos que son
útiles para aislar tales secuencias de ácido nucleico las muestran
Sambrook et al. (1989), en Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY;
by Ausubel et al. (1994), eds Current Protocols in Molecular
Biology, Current Protocols Press; y Berger y Kimmel (1987), en
Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol.
152, Academic Press, Inc., San Diego, CA.
La síntesis química de secuencias de ácido
nucleico que codifican las proteínas deseadas se puede completar
utilizando métodos bien conocidos en la técnica, tales como los
mostrados por Engels et al. (1989), en Angew. Chem. Intl.
Ed., 28:716-734 y Wells et al. (1985), en
Gene, 34:315. Estos métodos incluyen, entre otros, los métodos del
fosfotriéster, de la fosforamidita y del H-fosfonato
de síntesis de ácidos nucleicos. Las secuencias grandes de ácido
nucleico, por ejemplo, aquellas mayores de aproximadamente 100
nucleótidos de longitud, se pueden sintetizar en forma de varios
fragmentos. Los fragmentos se pueden ligar entre sí para formar una
secuencia de ácido nucleico adecuada. Un método preferido es la
síntesis sobre un soporte polimérico utilizando la química de la
fosforamidita normalizada.
Alternativamente, se puede obtener una secuencia
de ácido nucleico adecuada escrutando una genoteca de ADNc
apropiada (esto es, una genoteca preparada a partir de una o más
fuentes de tejido que se cree que expresan la proteína) o una
genoteca genómica (una genoteca preparada a partir del ADN genómico
total). La fuente de la genoteca de ADNc es típicamente un tejido
de cualquier especie que se cree que expresa una proteína deseada
en cantidades razonables. La fuente de la genoteca genómica puede
ser cualquier tejido o tejidos de cualquier mamífero u otra especie
que se cree que alberga un gen que codifica la proteína o las
proteínas KGF-2.
Los medios de hibridación pueden ser escrutados
en cuanto a la presencia de un ADN que codifique la proteína o las
proteínas KGF-2 utilizando una o más sondas de ácido
nucleico (oligonucleótidos, ADNc o fragmentos de ADN genómico que
poseen un nivel aceptable de homología con el ADNc o el gen que se
va a clonar) que hibridará selectivamente con el ADNc o los ADNc o
el gen o los genes presentes en la genoteca. Las sondas utilizadas
típicamente para semejante escrutinio codifican una pequeña región
de la secuencia de ADN de la misma especie o una similar a la
especie de la cual se prepara la genoteca. Alternativamente, las
sondas pueden degenerar, como se comenta en la presente memoria.
La hibridación se completa típicamente
recociendo la sonda oligonucleotídica o el ADNc con los clones en
condiciones restrictivas que eviten la unión no específica pero
permitan la unión de esos clones que tienen un nivel significativo
de homología con la sonda o el cebador. Las condiciones de
hibridación y lavado restrictivo típicas dependen en parte del
tamaño esto es, del número de nucleótidos de longitud) del ADNc o la
sonda de oligonucleótidos y de si la sonda es degenerada. Al
diseñar el medio de hibridación, también se considera la
probabilidad de identificar un clon (p. ej., si se está escrutando
una genoteca de ADNc o genómica).
Cuando se utiliza un fragmento de ADN (tal como
ADNc) como sonda, las condiciones de hibridación típicas incluyen
aquellas mostradas por Ausubel et al. (1994), eds.,
supra. Tras la hibridación, el medio de hibridación se lava en
condiciones restrictivas adecuadas, dependiendo de numerosos
factores tales como el tamaño de la sonda, la homología esperada de
la sonda con el clon, el medio de hibridación que se esté
rastreando, el número de clones que se estén rastreando, y
similares. Las condiciones de hibridación restrictivas ilustrativas
son hibridación en 4 x SSC a 62-67ºC, seguido de
lavado en 0,1 x SSC a 62-67ºC durante
aproximadamente una hora. Alternativamente, las condiciones de
hibridación restrictiva ilustrativas son hibridación en formamida al
45-55%, 4 x SSC a 40-45ºC. También
están incluidas las secuencias de ADN que hibridan con las
secuencias de ácido nucleico mostradas en la Figura 1 en
condiciones de hibridación relajadas y que codifican la proteína o
las proteínas KGF-2. Los ejemplos de tales
condiciones de hibridación restrictivas relajadas son 4 x SSC a
45-55ºC o hibridación con formamida al
30-40% a 40-45ºC. Véase Maniatis
et al. (1982), Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold
Spring Harbor Laboratory, páginas 387 a 389.
También existen protocolos ilustrativos para las
condiciones de lavado restrictivas en las que se utilizan sondas de
oligonucleótidos para escrutar medios de hibridación. Por ejemplo,
en un primer protocolo se utiliza 6 X SSC con pirofosfato de sodio
al 0,05% a una temperatura entre aproximadamente 35ºC y 63ºC,
dependiendo de la longitud de la sonda. Por ejemplo, las sondas de
14 bases se lavan a 35-40ºC, las sondas de 17 bases
a 45-50ºC, las sondas de 20 bases a
52-57ºC, y las sondas de 23 bases a
57-63ºC. La temperatura se puede incrementar
2-3ºC cuando la unión no específica de fondo
aparezca elevada. En un segundo protocolo se utiliza cloruro de
tetrametilamonio (TMAC) para el lavado. Una de tales soluciones de
lavado restrictivo es TMAC 3M, Tris-HCl 50 mM, pH
8,0 y SDS al 0,2%.
Otro método para obtener una secuencia de ácido
nucleico adecuada es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En este método, se prepara ADNc a partir de ARN poli(A)+ o
ARN total utilizando la enzima transcriptasa inversa. Dos
cebadores, típicamente complementarios a dos regiones separadas del
ADNc (oligonucleótidos) que codifican la proteína o las proteínas
KGF-2, se añaden después al ADNc junto con una
polimerasa tal como la polimerasa Taq, y la polimerasa amplifica la
región de ADNc entre los dos cebadores.
Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas
como sondas o cebadores deben ser de la longitud adecuada y
suficientemente inequívoca con el fin de minimizar la cantidad de
unión no específica que se puede producir durante el escrutinio la
amplificación por PCR. La secuencia real de las sondas o cebadores
se basa normalmente en secuencias o regiones conservadas o
altamente homólogas. Opcionalmente, las sondas o cebadores pueden
ser totalmente o parcialmente degenerados, esto es, pueden contener
una mezcla de sondas/cebadores, codificando todos la misma
secuencia de aminoácidos pero utilizando diferentes codones para
hacerlo. Una alternativa para preparar sondas degeneradas consiste
con colocar una inosina en algunas o todas aquellas posiciones del
codón que varía por especies. Las sondas de oligonucleótidos o los
cebadores se pueden preparar mediante métodos de síntesis química
para ADN, como se ha descrito antes.
El ADN que codifica la proteína o las proteínas
KGF-2 puede ser insertado en vectores para su
clonación adicional (amplificación del ADN) o para su expresión.
Los vectores adecuados están disponibles en el mercado, o el vector
puede ser construido específicamente. La selección o construcción de
un vector apropiado dependerá de (1) si se va a utilizar para la
amplificación de ADN o para la expresión de ADN, (2) el tamaño del
ADN que se va a insertar en el vector, y (3) la célula anfitriona
que se pretende transformar con el vector.
Los vectores implican cada uno una secuencia de
ácido nucleico que codifica una proteína deseada conectada
operablemente a una o más de las siguientes secuencias de control de
la expresión o reguladoras capaces de dirigir, controlar o afectar
de otro modo a la expresión de una proteína deseada por una célula
anfitriona seleccionada. Cada vector contiene diversos componentes,
dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN)
y de su compatibilidad con la célula anfitriona pretendida. Los
componentes del vector incluyen generalmente, pero no están
limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un
origen de replicación, uno o más genes marcadores de selección,
elementos intensificadores, una secuencia de terminación de la
transcripción y similares. Estos componentes
se pueden obtener a partir de fuentes naturales o se pueden sintetizar mediante procedimientos conocidos.
se pueden obtener a partir de fuentes naturales o se pueden sintetizar mediante procedimientos conocidos.
Los ejemplos de los vectores de clonación
procarióticos adecuados incluyen bacteriófagos, tales como los
derivados de lambda, o los plásmidos de E. coli (p. ej.
pBR322, col E1, pUC, el F-factor y los derivados del
plásmido Bluescript® (Stratagene, LaJolla, CA)). Otros vectores de
expresión apropiados, de los cuales se conocen numerosos tipos en
la técnica para las células anfitrionas descritas más abajo, también
se pueden utilizar para este fin.
El ácido nucleico que codifica una secuencia
señal puede ser insertado 5' de la secuencia que codifica la
proteína o las proteínas KGF-2, p. ej., puede ser un
componente de un vector o puede ser una parte de un ácido nucleico
que codifica la proteína o las proteínas KGF-2. El
ácido nucleico que codifica la proteína o las proteínas
KGF-2 es conocido (Publicación WO 96/25422).
Los vectores de expresión y clonación incluyen
cada uno generalmente una secuencia de ácido nucleico que permite
al vector replicar en una o más células anfitrionas seleccionadas.
En un vector de clonación, esta secuencia es típicamente aquella
que permite al vector replicar independientemente del ADN
cromosómico del anfitrión e incluye orígenes de replicación o
secuencias autónomamente replicantes. Tales secuencias son bien
conocidas. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado
para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, y
diversos orígenes (p. ej., SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son
útiles para clonar vectores en células de mamíferos. Generalmente,
no es necesario el origen de replicación para los vectores de
expresión de mamíferos (por ejemplo, a menudo se utiliza solamente
el origen de SV40 debido a que contiene el promotor temprano).
Los vectores de expresión y clonación contienen
cada uno típicamente un gen de selección. Este gen codifica una
proteína "marcadora" necesaria para la supervivencia o el
crecimiento de las células anfitrionas transformadas cuando crecen
en un medio de cultivo selectivo. Las células anfitrionas que no son
transformadas con el vector no contendrán el gen de selección y,
por lo tanto, no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de
selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia
a antibióticos u otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina,
metotrexato o tetraciclina; (b) complementan las deficiencias
auxotróficas; o (c) proporcionan nutrientes críticos no disponibles
en el medio de cultivo.
Otros genes de selección se pueden utilizar para
amplificar los genes que se van a expresar. La amplificación es un
proceso en el que los genes que tienen una mayor demanda para la
producción de una proteína crítica para el crecimiento son
reiterados en tándem en los cromosomas de generaciones sucesivas de
células recombinantes. Los ejemplos de marcadores seleccionables
adecuados para las células de mamíferos incluyen la dihidrofolato
reductasa (DHFR) y la timidina quinasa. Los transformantes celulares
se colocan bajo una presión de selección a las que solamente
sobrevivirán los transformantes que están adaptados en virtud del
marcador presente en el vector. La presión de selección se impone
cultivando las células transformadas en condiciones en las que la
concentración del agente de selección del medio se cambia
sucesivamente, conduciendo de ese modo a la amplificación tanto del
gen de selección como del ADN que codifica la proteína deseada. Como
resultado, se sintetizan cantidades incrementadas de las proteínas
deseada a partir del ADN amplificado.
Por ejemplo, las células transformadas con el
gen de selección DHFR se identifican primero cultivando todos los
transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato, un
antagonista competitivo de la DHFR. Una célula anfitriona apropiada
cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea celular de ovario
de hámster Chino con una actividad DHFR deficiente (Urlaub y Chasin
(1980), Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
77(7):4216-4220). Las células transformadas
se exponen después a niveles incrementados de metotrexato. Esto
conduce a la síntesis de múltiples copias del gen DHFR y,
concomitantemente, múltiples copias del otro ADN presente en el
vector de expresión, tal como el ADN que codifica la proteína
deseada.
Los vectores de expresión y clonación contendrán
cada uno típicamente un promotor que sea reconocido por el
organismo anfitrión y esté conectado operablemente a una secuencia
de ácido nucleico no traducida localizada aguas arriba (5') con
respecto al codón de iniciación de un gen estructural (generalmente
en aproximadamente 100 a 1000 pb) que controla la transcripción y
la traducción de una secuencia de ácido nucleico concreta. Un
promotor puede estar agrupado convencionalmente en una de dos
clases, promotores inducibles y promotores constitutivos. Un
promotor inducible inicia incrementos de los niveles de
transcripción a partir de ADN bajo su control en respuesta a algún
cambio en las condiciones de cultivo, tales como la presencia o
ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Son bien
conocidos un gran número de promotores, reconocidos por una
variedad de células anfitrionas potenciales. Un promotor puede estar
conectado operablemente al ADN que codifica la proteína deseada
separando el promotor del ADN de origen por medio de la digestión
con enzimas de restricción e insertando la secuencia promotora
deseada. La secuencia promotora de KGF-2 nativa se
puede utilizar para dirigir la amplificación y/o la expresión del
ADN que codifica una proteína deseada. Se prefiere un promotor
heterólogo, no obstante, si éste permite una mayor transcripción y
rendimientos más elevados de la proteína expresada en comparación
con el promotor nativo y si éste es compatible con el sistema de la
célula anfitriona que ha sido seleccionada para su uso. Por
ejemplo, se puede utilizar cualquiera de las secuencias promotoras
nativas de otros miembros de la familia del FGF para dirigir la
amplificación y/o expresión del ADN que codifica una proteína
deseada.
Los promotores adecuados para su uso con
anfitriones procarióticos incluyen los sistemas promotores de la
beta-lactamasa y de la lactosa; el sistema promotor
de la fosfatasa alcalina, del triptófano (trp); un sistema del gen
de la luminiscencia bacteriana (luxR); y promotores híbridos tales
como el promotor tac. También son adecuados otros promotores
bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótidos han sido
publicadas, permitiendo de ese modo al experto en la técnica
ligarlos a la secuencia o las secuencias de ADN deseadas utilizando
enlazadores o adaptadores según sea necesario para proporcionar
cualquiera de los sitios de restricción deseados.
Las secuencias promotoras adecuadas para su uso
con levaduras también son bien conocidas en la técnica. Los
promotores adecuados para su uso con células anfitrionas de mamífero
son bien conocidos e incluyen aquellos obtenidos de los genomas de
los virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela
aviar, los adenovirus (tales como el Adenovirus 2), el virus del
papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un
retrovirus, el virus de la hepatitis B y, muy preferiblemente, el
Virus de Simios 40 (SV40). Otros promotores de mamíferos adecuados
incluyen promotores de mamíferos heterólogos, p. ej., los promotores
del choque térmico y el promotor de la actina.
Los vectores de expresión y clonación contendrán
cada uno típicamente una secuencia potenciadora para incrementar la
transcripción por eucariotas superiores de una secuencia de ADN que
codifica la proteína deseada. Los potenciadores son elementos de
ADN que actúan en cis, normalmente de aproximadamente
10-300 pb de longitud, que actúan sobre el promotor
para incrementar su transcripción.
Los potenciadores son relativamente dependientes
de la orientación y la posición. Se han encontrado en 5' y 3' con
respecto a la unidad de transcripción. Los potenciadores de levadura
se utilizan ventajosamente con promotores de levadura. Se conocen
numerosas secuencias potenciadoras asequibles de genes de mamíferos
(p. ej., globina, elastasa, albúmina,
alfa-feto-proteína e insulina).
Adicionalmente, los potenciadores virales tales como el potenciador
de SV40, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el
potenciador del polioma y los potenciadores de adenovirus son
elementos potenciadores ilustrativos para la activación de
promotores eucarióticos. Si bien un potenciador puede estar
empalmado en un vector en posición 5' o 3' con respecto a un ADN
que codifica una proteína deseada, típicamente está localizado en un
sitio 5' con respecto al promotor.
Los vectores de expresión utilizados en las
células anfitrionas eucarióticas contendrán cada uno típicamente
una secuencia necesaria para la terminación de la transcripción y
para estabilizar el ARNm. Tales secuencias son asequibles
comúnmente de las regiones no traducidas 5' y ocasionalmente 3' de
los ADN o ADNc eucarióticos. Estas regiones contienen segmentos de
nucleótidos transcritos en forma de fragmentos poliadenilados en la
porción no traducida del ARNm que codifica una proteína deseada.
La construcción de un vector adecuado que
contiene uno o más de los componentes enumerados antes (junto con
la secuencia codificadora deseada) se completa mediante técnicas de
ligación normalizadas. Los plásmidos aislados o los fragmentos de
ADN se escinden, se adaptan y se religan en el orden deseado para
generar el vector requerido. Para confirmar que se ha construido la
secuencia correcta, se puede utilizar la mezcla de ligación
utilizada para transformar E. coli, y se pueden seleccionar
los transformantes acertados mediante técnicas conocidas como se ha
descrito antes. Después se preparan cantidades del vector a partir
de los transformantes, se analizan mediante digestión con enzimas
de restricción, y/o se secuencian para confirmar la presencia del
constructo deseado.
También se puede utilizar un vector que
proporciona la expresión transitoria del ADN que codifica una
proteína deseada en células de mamífero. En general, la expresión
transitoria implica el uso de un vector de expresión que sea capaz
de replicar eficazmente en una célula anfitriona, de manera que la
célula anfitriona acumula muchas copias del vector de expresión y,
a su vez, sintetiza elevados niveles de la proteína deseada
codificada por el vector de expresión. Cada sistema de expresión
transitoria, que comprende un vector de expresión adecuado y una
célula anfitriona, permite la identificación positiva conveniente de
las proteínas codificadas por los ADNc clonados, así como el rápido
escrutinio de tales proteínas en cuanto a las propiedades biológicas
o fisiológicas deseadas.
La presente invención también proporciona
cualquiera de una variedad de células anfitrionas recombinantes,
cada una de las cuales contiene una secuencia de ácido nucleico para
su uso en la expresión de la proteína deseada. Las células
anfitrionas procarióticas y eucarióticas ilustrativas incluyen
células bacterianas, de mamífero, fúngicas, de insecto, de levadura
o vegetales.
Las células anfitrionas procarióticas incluyen
pero no están limitadas a eubacterias tales como organismos Gram
negativos o Gram positivos (p. ej., E. coli (HB101, DH5a,
DH10 y MC1061); Bacilli tales como B. subtilis;
especies de Pseudomonas, tales como P. aeruginosa;
especies de Streptomyces; Salmonella typhimurium; o
Serratia marcescens. Como realización específica, se pueden
expresar la proteína o las proteínas KGF-2 en E.
coli.
Además de las células anfitrionas procarióticas,
la proteína o las proteínas KGF-2 se pueden expresar
en una forma glicosilada por cualquiera de las numerosas células
anfitrionas adecuadas derivadas de organismos multicelulares. Tales
células anfitrionas son susceptibles de actividades de procesamiento
y glicosilación complejas. En principio, se podría utilizar
cualquier cultivo de células eucarióticas superiores, ya implique
dicho cultivo células de vertebrados o de invertebrados, incluyendo
células vegetales y de insecto.
Los microbios eucarióticos tales como los hongos
filamentosos o las levaduras pueden ser anfitriones adecuados para
la expresión de la proteína o las proteínas KGF-2.
Saccharomyces cerevisiae, o levadura panadera común, es la
más comúnmente utilizada entre los microorganismos anfitriones
eucarióticos inferiores, pero son bien conocidos y se encuentran
disponibles comúnmente otros numerosos géneros, especies y
cepas.
Se pueden utilizar células de vertebrados, ya
que la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de
tejidos) es un procedimiento bien conocido. Los ejemplos de las
líneas celulares anfitriones de mamífero útiles incluyen pero no
están limitados a la línea de riñón de mono CV1 transformada por
SV40 (COS-7), la línea de riñón embrionario humano
(células 293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en
cultivo en suspensión), células de riñón de cría de hámster y
células de ovario de hámster Chino. Otras líneas celulares de
mamífero adecuadas incluyen pero no están limitadas a HeLa, células
L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de ratones
Swiss, Balb-c o NIH, y líneas de células de hámster
BHK o HaK. Como una realización específica, se pueden expresar una
o más proteínas KGF-2 en células COS o en células de
baculovirus.
Se puede transfectar una célula anfitriona y
preferiblemente transformar con un ácido nucleico deseado en
condiciones apropiadas que permiten la expresión del ácido nucleico.
La selección de las células anfitrionas y los métodos adecuados
para la transformación, el cultivo, la amplificación, el escrutinio
y la producción y purificación del producto son bien conocidos en
la técnica (Gething y Sambrook (1981), Nature,
293:620-625 o, alternativamente, Kaufman et
al. (1985), Mol. Cell. Biol.,
5(7):1750-1759, o Patente de los Estados
Unidos Núm. 4.419.446, cuyas descripciones se incorporan aquí como
referencia). Por ejemplo, para las células de mamífero sin paredes
celulares, se puede utilizar el método de precipitación con fosfato
de calcio. También se pueden utilizar la electroporación, la
microinyección y otras técnicas conocidas.
También es posible que una proteína deseada
pueda ser producida mediante recombinación homóloga o con métodos
de producción recombinante utilizando elementos de control
introducidos en las células que ya contienen ADN que codifica la
proteína o las proteínas KGF-2. La recombinación
homóloga es una técnica desarrollada originalmente para dirigir a
los genes a inducir o corregir mutaciones en los genes
transcripcionalmente activos (Kucherlapati (1989), Prog. in Nucl.
Acid Res. and Mol. Biol., 36:301). La técnica básica fue
desarrollada como un método para introducir mutaciones específicas
en regiones específicas del genoma de mamíferos (Thomas et
al. (1986), Cell, 44:419-428; Thomas y Capecchi
(1987), Cell, 51:503-512 y Doetschman et al.
(1988), Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8583-8587) o
para corregir mutaciones específicas en genes defectuosos
(Doetschrnan et al. (1987), Nature,
330:576-578). Las técnicas ilustrativas se describen
en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.272.071; en las
publicaciones WO 92/01069; WO 93/03183; WO 94/12650 y WO
94/31560.
El método para cultivar cada una de las una o
más células anfitrionas recombinantes para la producción de una
proteína deseada variará dependiendo de muchos factores y
consideraciones; el procedimiento de producción óptimo para una
situación dada será evidente para los expertos en la técnica por
medio de una experimentación mínima. Tales células anfitrionas
recombinantes se cultivan en un medio adecuado y la proteína
expresada es recuperada, aislada y purificada después opcionalmente
a partir del medio de cultivo (o a partir de la célula, si es
expresada intracelularmente) mediante métodos apropiados conocidos
por los expertos en la técnica.
Específicamente, cada una de las células
recombinantes utilizadas para producir una proteína deseada puede
ser cultivada en medios adecuados para inducir promotores,
seleccionar células anfitrionas recombinantes adecuadas o
amplificar el gen que codifica la proteína deseada. Los medios
pueden ser suplementados según sea necesario con hormonas y/o
factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor
de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio,
calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES),
nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales
como gentamicina), elementos vestigiales (definidos como compuestos
inorgánicos normalmente presentes a concentraciones finales en el
intervalo micromolar), y glucosa u otra fuente de energía. También
se pueden incluir otros suplementos, a concentraciones apropiadas,
como apreciarán los expertos en la técnica. Las condiciones de
cultivo adecuadas, tales como la temperatura, el pH y similares,
también son bien conocidos por los expertos en la técnica para su
uso con las células anfitrionas seleccionadas.
El producto de expresión resultante se puede
purificar después casi hasta la homogeneidad utilizando
procedimientos conocidos en la técnica. Las técnicas de
purificación ilustrativas se ilustran las Solicitudes PCR publicadas
Núms. WO 90/08771 y WO 96/11952, cuyas descripciones se incorporan
aquí como referencia.
La proteína o las proteínas
KGF-2 y los derivados modificados químicamente de
las mismas que tienen actividad biológica (en conjunto, "producto
o productos proteicos de KGF-2") se pueden
utilizar como reactivos de búsqueda y como agentes terapéuticos y
de diagnóstico. De este modo, se puede utilizar un producto o
productos proteicos de KGF-2 en análisis de
diagnóstico in vitro y/o in vivo para cuantificar la
cantidad de KGF-2 en una muestra de tejido u
órgano.
Por ejemplo, se pueden utilizar el producto o el
producto o los productos proteicos de KGF-2 para la
identificación del receptor o los receptores para las proteínas
KGF-2 en diversas muestras de fluidos y tejidos
corporales utilizando mecanismos conocidos en la técnica
(publicación WO 90/08771).
Esta invención también contempla el uso del
producto o el producto o los productos proteicos de
KGF-2 en la generación de anticuerpos elaborados
contra el producto o el producto o los productos proteicos de
KGF-2, incluyendo el KGF-2 nativo.
Un experto normal en la técnica puede utilizar procedimientos
publicados bien conocidos para obtener anticuerpos monoclonales y
policlonales o anticuerpos recombinantes. Tales anticuerpos se
pueden utilizar después para purificar y caracterizar el producto o
el producto o los productos proteicos de KGF-2,
incluyendo el KGF-2 nativo.
La presente invención abarca preparaciones
farmacéuticas que contienen cada una cantidades terapéuticamente o
profilácticamente eficaces del producto o el producto o los
productos proteicos de KGF-2.
Las composiciones farmacéuticas incluirán cada
una generalmente una cantidad terapéuticamente eficaz o
profilácticamente eficaz del producto o el producto o los productos
proteicos de KGF-2 mezclada con un vehículo. El
vehículo incluye preferiblemente uno o más materiales de
formulación farmacéuticamente y fisiológicamente aceptables
mezclados con el producto o el producto o los productos proteicos de
KGF-2.
El disolvente principal del vehículo puede ser
de naturaleza acuosa o no acuosa. Además, el vehículo puede
contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables para
modificar o mantener el pH (p. ej., tampones tales como citratos,
fosfatos, y aminoácidos tales glicina); la osmolaridad (p. ej.,
manitol y cloruro de sodio); la viscosidad; la claridad; el color;
la esterilidad; la estabilidad (p. ej., sacarosa y sorbitol); el
olor de la formulación; la tasa de disolución (p. ej.,
solubilizadores o agentes de solubilización tales como alcoholes,
polietilenglicoles y cloruro de sodio); la tasa de liberación; así
como agentes para aumentar el volumen de la formulación liofilizada
(p. ej., manitol y glicina); tensioactivos (p. ej., polisorbato 20,
polisorbato 80, tritón, y pluronics); antioxidantes (p. ej., sulfito
de sodio e hidrogenosulfito de sodio); conservantes (p. ej., ácido
benzoico y ácido salicílico); agentes aromatizantes y diluyentes;
agentes emulsionantes; agentes suspensores; disolventes; cargas;
vehículos de liberación; diluyentes y/o coadyuvantes farmacéuticos.
También se conciben otras formas de administración eficaces tales
como formulaciones de liberación lenta parenteral, nieblas para
inhaladores, formulaciones oralmente activas, o supositorios.
La composición también puede implicar
preparaciones particuladas de compuestos poliméricos tales como
polímeros de erosión en masa (p. ej., copolímeros de poli(ácido
láctico-co-glicólico) (PLGA),
mezclas poliméricas con PLGA, copolímeros de bloques de PEG, y
ácido láctico y glicólico, poli(cianoacrilatos)); polímeros
de erosión superficial (p. ej., poli(anhídridos) y
poli(ortoésteres)); ésteres de hidrogeles (p. ej., polioles
de pluronic, poli(alcohol vinílico),
poli(vinilpirrolidona), copolímeros de anhídrido
maleico-alquilviniléter, celulosa, derivados de
ácido hialurónico, alginato, colágeno, gelatina, albúmina, y
almidones y dextranos) y sistemas de composición de los mismos; o
preparaciones de liposomas o microesferas. Tales composiciones
pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la tasa
deliberación in vivo, y la tasa de aclaramiento in
vivo de las presentes proteínas y derivados. La formulación
farmacéutica óptima para una proteína deseada será determinada por
un experto en la técnica dependiendo de la ruta de administración y
de la dosificación deseada. Las composiciones farmacéuticas
ilustrativas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences,
18ª Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, páginas
1435-1712; Gombotz y Pettit (1995), Bioconjugate
Chem., 6:332-351; Leone-Bay, et
al. (1995), Journal of Medicinal Chemistry,
38:4263-9269; Haas, et al. (1995), Clinical
Immunology and Immunopathology, 76 (1):93; publicaciones WO
94/06457; WO 94/21275; FR 2706772 y WO 94/21235.
Las composiciones de liberación sostenida
específicas son asequibles de una variedad de proveedores incluyendo
Depotech Corp. (Depofoam®, un liposoma multivesicular); Alkermes,
Inc. (ProLease®, una microesfera de PLGA). Según se utiliza en la
presente memoria, se pretende que hialuronano incluya hialuronano,
ácido hialurónico, sales de los mismos (tales como hialuronato de
sodio), ésteres, éteres, derivados enzimáticos y geles entrecruzados
de ácido hialurónico, y derivados modificados químicamente de ácido
hialurónico (tales como hilano). Las formas ilustrativas de
hialuronano se describen en las Patentes de los Estados Unidos Núms.
4.582.865, 4.605.691, 4.636.529, 4.713.448, 4.716.154, 4.716.224,
4.772.419, 4.851.521, 4.957.774, 4.863.907, 5.128.326, 5.202.431,
5.336.767, 5.356.883; las Solicitudes de Patente Europea Núms. 0 507
604 A2 y 0 718 312 A2; y la publicación WO 96/05845, cuyas
descripciones se incorporan aquí como referencia. Los proveedores de
hialuronano incluyen BioMatrix, Inc., Ridgefield, NJ; Fidia S.p.A.,
Abano Terme, Italia; Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japón;
Pharmacia AB, Stockholm, Suecia; Genzyme Corporation, Cambridge, MA;
Pronova Biopolimer, Inc. Portsmouth, NH;
Calbiochem-Novabiochem AB, Lautelfingen, Suiza;
Intergen Company, Purchase, NY y Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo,
Japón.
Para el tratamiento y/o la prevención de las
indicaciones orales, se puede utilizar una solución o suspensión
líquida de una manera similar a un enjuage bucal, donde el líquido
se agita en la boca con el fin de maximizar el tratamiento de las
lesiones (Patente de los Estados Unidos 5.102.870, cuyas enseñanzas
se incorporan aquí como referencia). Se puede lograr un contacto
más prolongado con la superficie mucosa seleccionando un vehículo
adecuado que sea capaz de recubrir la mucosa. Los ejemplos típicos
son las formulaciones que contienen pectina tales como Orabase
Registrada® (Colgate-Hoyt Laboratories, Norwood,
MA), suspensiones de sucralfato, Kaopectate y Milk of Magnesia. La
formulación también puede ser una crema, gel, loción o pomada
untable que tenga un vehículo o portador no tóxico
farmacéuticamente aceptable. El producto o el producto o los
productos proteicos de KGF-2 también se pueden
incorporar a una gragea o trocisco de disolución lenta, una base
para chicle, o una prótesis bucal o de liberación lenta enganchada
a un molar posterior, por ejemplo. Se pueden administrar agentes
terapéuticos tales como analgésicos y anestésicos para aliviar el
dolor y se pueden administrar anti-infectivos,
anti-bacterianos, anti-fúngicos y
antisépticos para prevenir y/o tratar infecciones secundarias de las
lesiones.
Una vez que la composición farmacéutica ha sido
formulada, ésta se puede almacenar en viales estériles en forma de
solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o polvo deshidratado o
liofilizado. Tales formulaciones se pueden almacenar o bien en una
forma lista para su uso o bien en una forma (p. ej., liofilizada)
que requiere reconstitución antes de la administración.
En una realización específica, la presente
invención está dirigida a kits para producir una unidad de
administración de una sola dosis. Los kits pueden contener cada uno
un primer recipiente que tiene la proteína seca y un segundo
recipiente que tiene una formulación acuosa. Los kits incluidos en
el alcance de esta invención son jeringas
pre-cargadas de una sola y de múltiples cámaras; las
jeringas pre-cargadas ilustrativas (p. ej.,
jeringas con líquido, y lio-jeringas tales como
Lyo-Ject®, una lio-jeringa
pre-cargada de doble cámara) son asequibles de
Vetter GmbH, Ravensburg, Alemania.
El producto o el producto o los productos
proteicos de KGF-2 pueden ser aplicados en
cantidades terapéuticamente y profilácticamente eficaces a órganos
o tejidos caracterizados específicamente por tener lesiones o un
número clínicamente insuficiente de células epiteliales. Se debe
observar que las formulaciones del producto o el producto o los
productos proteicos de KGF-2 descritas en la
presente memoria pueden ser utilizadas para aplicaciones
veterinarias así como humanas y que el término "paciente" no
debe ser considerado de una manera limitante.
La frecuencia de dosificación del producto o el
producto o los productos proteicos de KGF-2 a un
paciente dependerán de la enfermedad y el estado del paciente, así
como de los parámetros farmacodinámicos del producto o el producto
o los productos proteicos de KGF-2 formulados, y de
la ruta de administración. El producto o los productos proteicos de
KGF-2 pueden ser administrados de una vez,
administrados diariamente, o administrados con una dosis de bolo
inicial seguido de dosificación continua o liberación sostenida. Se
contempla que también se pueden poner en práctica otros modos de
dosificación continua o casi continua. Por ejemplo, la
transformación química puede dar como resultado formas de
liberación sostenida de la proteína que tienen el efecto de una
presencia continua en la corriente sanguínea, en cantidades
predecibles, basándose en un régimen de dosificación
predeterminado.
Se puede administrar a un paciente que necesite
estimulación (incluyendo citoprotección, proliferación y/o
diferenciación) de células epiteliales una cantidad eficaz del
producto o los productos proteicos de KGF-2 para
lograr la respuesta deseada en el paciente. El régimen de
dosificación implicado en un método de prevención o tratamiento de
una afección específica se determinará generalmente por el médico
que atienda, considerando los diversos factores que modifican la
acción de los fármacos, p. ej., la edad, el estado, el peso
corporal, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de cualquier
infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos.
Las dosificaciones apropiadas se pueden averiguar por medio del uso
de análisis establecidos para determinar las dosificaciones
utilizadas junto con los datos dosis-respuesta
apropiados. Las dosificaciones típicas oscilarán entre 0,001 mg/kg
de peso corporal a 500 mg/kg peso corporal, preferiblemente hasta
200 mg/kg peso corporal, más preferiblemente 100 mg/kg peso
corporal.
El producto o los productos proteicos de
KGF-2 pueden ser administrados por medio de
administración tópica, entérica o parenteral incluyendo, sin
limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular,
intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital,
intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal,
subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular,
subaracnoidea, intraespinal, e intraesternal. El producto o los
productos proteicos de KGF-2 se pueden administrar
por medio de administración oral o administrar a través de
membranas mucosas, esto es, intranasalmente, sublingualmente,
bucalmente o rectalmente para la liberación generalizada. El
producto o los productos proteicos de KGF-2 se
pueden utilizar una vez o se pueden administrar repetidamente,
dependiendo de la enfermedad y el estado del paciente. En algunos
casos, el producto o los productos proteicos de
KGF-2 se pueden administrar como un accesorio para
otra terapia y también con otras preparaciones farmacéuticas.
También se puede contemplar la terapia celular
(p. ej., el implante de células que producen la proteína o las
proteínas KGF-2. Esta puede incluir el implante en
pacientes de células que son capaces de sintetizar y secretar una
forma biológicamente activa de la proteína o las proteínas
KGF-2. Tales células que producen la proteína o las
proteínas KGF-2 pueden ser células que normalmente
no producen la proteína o las proteínas KGF-2 pero
que han sido modificadas para producir la proteína o las proteínas
KGF-2, o que pueden ser células cuya habilidad para
producir la proteína o las proteínas KGF-2 ha sido
aumentada mediante transformación con un polinucleótido adecuado
para la expresión y secreción de la proteína o las proteínas
KGF-2. Con el fin de minimizar una reacción
inmunológica potencial en pacientes a los que se han administrado la
proteína o las proteínas KGF-2 de una especie
foránea, se prefiere que las células sean de la misma especie que el
paciente (p. ej., un ser humano), o que las células puedan ser
encapsuladas con material que proporcione una barrera contra el
reconocimiento inmunitario, o que las células se coloquen en una
localización inmunológicamente privilegiada, tal como un testículo,
un ojo y el sistema nervioso central.
Se pueden implantar células animales humanas o
no humanas en pacientes en compartimentos o membranas poliméricos
biocompatibles, semi-permeables para permitir la
liberación de la proteína o las proteínas KGF-2 pero
evitar la destrucción de las células por el sistema inmunitario del
paciente o por otros factores perjudiciales del tejido circundante.
Alternativamente, las propias células del paciente, transformadas
ex vivo para producir la proteína o las proteínas
KGF-2, podrían ser implantadas directamente en el
paciente sin encapsulación. La metodología para la encapsulación en
membranas de células vivas es familiar para los expertos en la
técnica, y la preparación de las células encapsuladas y su
implantación en pacientes se pueden completar mediante técnicas
conocidas (Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.892.538;
5.011.472; y 5.106.627).
También se puede contemplar la terapia génica
in vivo, donde una secuencia de ácido nucleico que codifica
la proteína o las proteínas KGF-2 es introducida
directamente en un paciente. Se requiere una transferencia génica
eficaz y de larga duración a hepatocitos para la expresión local de
la proteína para evitar y/o tratar enfermedades del hígado y/o para
la secreción de la proteína para evitar y/o tratar enfermedades en
otros órganos o tejidos.
El constructo de ADN puede ser inyectado
directamente en el tejido del órgano que se vaya a tratar, donde
puede ser recogido in vivo y expresado, siempre que el ADN
esté conectado operablemente a un promotor que sea activo en
semejante tejido. El constructo de ADN también puede incluir
adicionalmente la secuencia vectora de vectores tales como un
vector de adenovirus, un vector retroviral, un virus de papiloma y/o
un vector de virus del herpes, para ayudar a la absorción en las
células. Se puede lograr la transferencia física in vivo
mediante inyección local del constructo de ácido nucleico deseado u
otro vector de liberación apropiado que contenga la secuencia de
ácido nucleico deseada, tal como transferencia mediada por
liposomas, inyección directa (ADN desnudo), transferencia mediada
por receptores (complejo ligando-ADN), o bombardeo
con micropartículas (pistola génica). Para la regeneración in
vivo de hepatocitos en el hígado, puede ser especialmente
eficaz el uso de vectores retrovirales de Moloney (Bosch, et
al. (1996), Cold Spring Harbor, Gene Therapy Meeting,
25-29 Septiembre, 1996; y Bosch, et al.
(1996), Journal of Clinical Investigation,
98(12):2683-2687).
Se incluyen los siguientes ejemplos para
ilustrar más completamente la presente invención. Se entiende que
se pueden realizar modificaciones en los procedimientos mostrados
sin apartarse de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los métodos para muchos de los procedimientos
descritos en los siguientes ejemplos, o los procedimientos
alternativos, se proporcionan en manuales ampliamente reconocidos
de la biología molecular tales como, por ejemplo, Sambrook et
al. (1989), supra y Ausubel et al.. (1990),
supra. Todos los productos químicos son de calidad analítica
o de calidad USP.
El siguiente ejemplo ilustra la producción de
His rFGF10 y HFGF10.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pAMG21 His rFGF10 contiene ADN que
codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 2. pAMG21
His rFGF10 fue construido como sigue.
Primero, se construyó el plásmido pAMG21 dN6
rFGF10. Para esta construcción, se realizó la PCR utilizando ADNc
de FGF10 de rata madura (Yamasaki et al. (1996), J. Biol.
Chem., 271(27):15918-15921, rFGF) en el
vector pGEM-T (Promega, Madison, WI), denominado
pGEM-T rFGF10, como molde con el siguiente cebador
oligonucleotídico 5' (OLIGO núm. 1), que incorpora un sitio NdeI, y
cebador oligonucleotídico 3' (OLIGO núm. 2) que incorpora un sitio
BamHI:
\vskip1.000000\baselineskip
El producto de la PCR generado en esta reacción
se purificó y se sometió a digestión con las endonucleasas de
restricción NdeI y BamHI. El producto de la PCR sometido digestión
con las enzimas de restricción de 525 pares de bases (pb) se
purificó en gel de agarosa y se ligó con un fragmento de ADN vector
pAMG21 BamHI a NdeI de 6 kilobases (Kb) purificado de un modo
similar. [El vector de expresión pAMG21 (número de acceso ATCC
98113) contiene sitios de restricción apropiados para la inserción
de genes aguas abajo del promotor luxPR (véase la Patente de
los Estados Unidos Núm. 5.169.318 para la descripción del sistema de
expresión lux)]. La proteína rFGF10 codificada resultante
difiere de rFGF10 por la deleción de los primeros 6 restos
aminoácido amino terminales con respecto a un resto metionina de
origen natural, teniendo la proteína la siguiente secuencia de
aminoácidos amino terminal (N-terminal): MVSPEAT....
(comenzando en el resto núm. 43, Figura 2, Yamasaki et al.
(1996), supra).
A continuación, se construyó el plásmido pAMG21
His rFGF10 utilizando un vector pAMG21 His. El vector pAMG21 His
difiere de pAMG21 en lo siguiente: entre el codón metionina de
iniciación de pAMG21 (ATG) y la secuencia que le sigue
(GTTAACG...), se inserta la siguiente secuencia "AAA CAT CAT CAC
CAT CAC CAT CAT GCT AGC" que codifica "KHHHHHHHAS". La
adición de los codones para Ala y Ser después de la etiqueta 7xHis
proporciona un sitio de restricción conveniente, NheI, para la
clonación.
El fragmento BstXI-NheI de 4,7
Kb del vector plasmídico pAMG21 His se ligó después con el fragmento
BspEI-BstXI de 1,8 Kb de pAMG21 dN6 rFGF10 y los
siguientes enlazadores oligonucleotídicos OLIGO núm. 3 y OLIGO núm.
4 (NheI a BspEI).
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína codificada resultante difiere de dN6
rFGF10 por tener una etiqueta de histidina (7x His) seguida de un
sitio de escisión de enteroquinasa con la secuencia
N-terminal completa (madura) (comenzando en el resto
núm. 37, Figura 1, Yamasaki et al. (1996), supra). Se
añadieron veintidós aminoácidos al extremo amino de dN6 rFGF10 como
sigue: MKHHHHHHHASDDDDKQALGQD [MVSPKAT....].
La cepa anfitriona GM120 de E. coli (núm.
de acceso ATCC 55764) tiene el promotor laqIQ y el gen lacI
integrados en un segundo sitio en el cromosoma del anfitrión de un
anfitrión E. coli K12. La transformación del anfitrión GM120
de E. coli con esta mezcla de ligación y el cultivo en placa
sobre placas de agar Luria que contenían 40 \mug/ml de kanamicina
rindieron colonias bacterianas recombinantes. Se identificó un clon
bacteriano que contenía el plásmido recombinante correcto mediante
escrutinio por PCR. El ADN plasmídico se purificó y se secuenció
para confirmar la secuencia del inserto. El crecimiento de los
cultivos bacterianos recombinantes para expresar el producto génico
se describe más abajo.
El plásmido pAMG21 hFGF10 contiene ADN que
codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3
(hFGF10). De este modo hFGF10 tiene la secuencia de Leu^{40} a
Ser^{208} del SEQ ID NO:2, mostrada antes. pAMG21 hFGF10 se
construyó como sigue.
\newpage
\global\parskip0.870000\baselineskip
El plásmido pAMG21 dN20 hFGF10 contiene una
deleción del ADN que codifica los primeros 28 aminoácidos de la
secuencia de rFGF10 maduro dando como resultado la siguiente
secuencia de aminoácidos N-terminal: MSSPSSA.....
(comenzando en el resto núm. 65, Figura 2, Yamasaki et al.
(1996), supra). pAMG21 dN20 hFGF10 se construyó como
sigue.
Se ligó el fragmento vector pAMG21
BamHI-NdeI de 6 Kb al producto de la PCR dN20 hFGF10
NdeI-BamHI generado como sigue: se llevó a cabo la
PCR utilizando pGEM-T rFGF10 como molde y el
siguiente cebador oligonucleotídico 5' (OLIGO núm. 5) que incorpora
un sitio NdeI en el extremo 5' del gen rFGF10 y suprime los codones
de los 28 primeros aminoácidos, y el cebador oligonucleotídico 3'
(OLIGO núm. 6) que incorpora un sitio BamHI en el extremo 3' del gen
rFGF10:
\vskip1.000000\baselineskip
Este producto de la PCR se purificó, se sometió
a digestión con las endonucleasas de restricción NdeI y BamHI y,
como se ha descrito antes, se ligó al fragmento vector pAMG21
BamHI-NdeI de 6 Kb.
El plásmido pAMG21 rFGF10 se creó mediante
ligación del fragmento BspEI-NdeI de 6,5 Kb de
pAMG21 His rFGF10 con los siguientes enlazadores oligonucleotídicos
OLIGO núm. 11 y OLIGO núm. 8 (NdeI a BspEI).
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína codificada resultante difiere de His
rFGF10 por la deleción de la etiqueta 7x Histidina y la restauración
de la secuencia de la proteína amino terminal madura original
(MLGQDM....).
Se ligó un fragmento BstXI-BspEI
de 4,8 Kb de pAMG21 rFGF10 con el fragmento de 1,8 Kb de pAMG21 dN20
hFGF10 PstI (introducido)-BstXI y los siguientes
enlazadores oligonucleotídicos OLIGO NÚM. 13 y OLIGO NÚM. 14 (PstI a
BspEI) para suprimir ocho codones de serina de la secuencia de
rata.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transformaron células anfitrionas de E.
coli GM120 con este producto de ligación pAMG21 hFGF10, y el
cultivo en placa sobre placas de agar Luria que contenían 40
\mug/ml de kanamicina produjo colonias bacterianas recombinantes.
Se identificó un clon bacteriano que contenía el plásmido
recombinante correcto mediante escrutinio por PCR. El ADN
plasmídico se purificó y se secuenció para confirmar la secuencia
del inserto. El crecimiento de los cultivos bacterianos para
expresar el producto génico se describe más abajo.
Los cultivos de células de E. coli GM120
recombinante que contenían el plásmido con la secuencia de ADN
confirmada de interés (pAMG21 His rFGF10 y pAMG21 hFGF10,
respectivamente) se hacen crecer cada uno para optimizar la
expresión del gen introducido, como sigue:
Se sembraron matraces de 500 ml de caldo Luria
más Kanamicina con las células y se hicieron crecer a 30ºC de 10 a
16 horas. Se añadieron los 500 ml a 9 litros - 11 litros de medio
basado en NZ amina en un fermentador de 15 litros. Todos los lotes
se hicieron crecer a pH 7 y a un nivel de oxígeno disuelto >50%.
Cada uno los lotes de células que contenían pAMG21 His rFGF10 y que
contenían pAMG21 hFGF10 se hicieron crecer y se indujeron a 30ºC.
Los lotes se hicieron crecer a un pH de 7 y un nivel de oxígeno
disuelto >50%. Cuando la densidad celular óptica alcanzó 10
\pm 2, se añadió auto-inductor al fermentador y
las células se dejaron crecer durante 12 horas. Al cabo de 12
horas, el caldo se enfrió a menos de 15ºC, el fermentador se drenó y
las células se recogieron mediante centrifugación. La pasta de
células se congeló.
Se purificó His rFGF10 a partir de la pasta
celular de E. coli utilizando tres etapas de cromatografía:
S-Sepharose a pH 7,5, S-Sepharose a
pH 8,5, y (Ni)-Sepharose quelante. Se homogeneizaron
80 g de pasta celular de E. coli en 10 volúmenes de
H_{2}O, después las células se desorganizaron en un
microfluidificador. La suspensión de células desorganizada se
centrifugó durante 3 horas a 15.300 x g. El sobrenadante que
contenía His rFGF10 soluble se ajustó a Tris-HCl 40
mM, pH 7,5 mediante la adición de Tris-HCl 1 M, pH
7,5, después se aplicó a una columna de 300 mL de
S-Sepharose FF equilibrada en
Tris-HCl 40 mM, pH 7,5. Después de lavar la columna
intensamente con tampón de equilibrado para separar la proteína no
unida, se hizo eluir la columna con un gradiente en volumen de 40,
NaCl de 0 a 2 M en Tris-HCl 40 mM, pH 7,5. Las
fracciones que eluían entre NaCl 0,8 M y 1,0 M contenían His
rFGF10, que fue detectado en forma de una banda de 24 kDa en
SDS-PAGE. La identidad de esta banda fue confirmada
mediante secuenciación N-terminal. Estas fracciones
se reunieron, se diluyeron con H_{2}O para reducir la
concentración de NaCl a 0,4 M, y se ajustaron a pH 8,5 mediante la
adición Tris-HCl 1M, pH 9,2. Esta muestra fue
aplicada a una columna S-Sepharose HP de 75 ml
equilibrada en Tris-HCl 40 mM, pH 8,5. La columna
se lavó con Tris-HCl 40 mM, pH 8,5 para separar
eliminar la proteína no unida, después se hizo eluir con un
gradiente en volumen de 40 de NaCl 0 a 2 M en el mismo tampón. Las
fracciones que eluían entre NaCl 0,9 M y 1,1 M se reunieron. Las
fracciones reunidas se aplicaron a una columna
(Ni)-Sepharose quelante de 200 ml equilibrada en
NaCl 1 M, Tris-HCl 40 mM, pH 8,5, imidazol 1 mM. La
columna se lavó con tampón de equilibrado para separar la proteína
no unida, después se hizo eluir con un gradiente del volumen de 20
de imidazol de 0 a 100 mM en NaCl 1 M, Tris-HCl 40
mM, pH 8,5, seguido de un gradiente en volumen de 20 de imidazol de
100 a 500 mM en el mismo tampón. His rFGF10 eluyó con imidazol entre
100 y 200 mM. Las fracciones que contenían His rFGF10 se reunieron,
se concentraron y se cambió el tampón a solución salina tamponada
con fosfato (PBS). Se estimó que la pureza de la muestra, analizada
mediante geles SDS sometidos a tinción con plata o a tinción con
Azul de Coomassie, era mayor del 97%. El rendimiento global fue de
459 mg de His rFGF10 purificado a partir de 80 g de pasta
celular.
Se purificó hFGF10 utilizando tres etapas de
cromatografía: S-Sepharose a pH 7,5,
Heparina-Sepharose a pH 7,5, e hidroxiapatita. Se
homogeneizaron cien gramos de pasta celular de E. coli que
contenía hFGF10 y se desorganizó exactamente como se ha descrito
antes. Tras centrifugar a 15.300 x g durante 3 horas, el
sobrenadante que contenía hFGF10 soluble se ajustó con
Tris-HCl 40 mM, pH 7,5, mediante la adición de
Tris-HCl 1 M, pH 7,5, después se aplicó a una
columna S-Sepharose FF de 300 mL equilibrada en
Tris-HCl 40 mM, pH 7,5. Después de lavar la columna
con tampón de equilibrado para separar la proteína no unida, se hizo
eluir la columna con un gradiente en volumen de 40 de NaCl de 0 a 2
M en Tris-HCl 40 mM, pH 7,5. Las fracciones que
eluían entre NaCl 0,9 M y 1,1 M contenían hFGF10, que fue detectado
en SDS-PAGE. La identidad de esta banda se confirmó
mediante secuenciación N-terminal. Estas fracciones
se reunieron, se diluyeron con Tris-HCl 40 mM, pH
7,5 para reducir la concentración de NaCl a 0,4 M, y se aplicaron a
una columna de Heparina-Sepharose de 60 ml
equilibrada en Tris-HCl 40 mM, pH 7,5. La columna se
lavó con tampón de equilibrado para separar la proteína no unida,
se hizo eluir después con un gradiente en volumen de 80 de NaCl de 0
a 3 M en el mismo tampón. El hFGF10 eluyó entre NaCl 1,0 M y 1,35
M. Estas fracciones se reunieron y se sometieron a diálisis frente a
Tris-HCl 40 mM, pH 7,5. La muestra sometida a
diálisis se aplicó a una columna de 50 ml de hidroxiapatita
equilibrada en Tris-HCl 40 mM, pH 7,5. Después de la
aplicación de la muestra la columna se lavó con tampón de
equilibrado para separar la proteína no unida, después se hizo eluir
con un gradiente en volumen de 40 de NaCl 0 a 0,5 M. Las fracciones
que eluían entre NaCl 0,24 M y 0,44 M contenían hFGF10. Estas
fracciones fueron reunidas, concentradas, y cambiadas de tampón a
PBS. Se estimó que la pureza de la muestra era mayor del 97% por
medio de geles de SDS sometidos a tinción con Azul de Coomassie. El
rendimiento del hFGF10 purificado fue de 90 mg a partir de 100 g de
pasta celular.
Se acometió un estudio de hibridación in
situ para determinar los sitios de expresión del
KGF-2 en tejidos de rata adultos y embrionarios
normales.
Se amplificó un segmento de secuencia de
KGF-2 de rata, incluyendo los primeros 128
nucleótidos de la región codificadora publicada (número de acceso
Genebank: D79215) más 100 nucleótidos aguas arriba del sitio de
inicio de la traducción, a partir de ADNc de pulmón de rata y se
clonó en pGEM-T (Promega). El molde linealizado se
utilizó para sintetizar ribosondas marcadas con P^{33} de elevada
actividad específica.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se fijó un panel de tejidos embrionarios y
adultos normales de rata en paraformaldehído al 4%, se embebió en
parafina y se seccionó a 5 \mum. Antes de la hibridación in
situ, los tejidos fueron permeabilizados con HCl 0,2 M, seguido
de digestión con Proteinasa K, y acetilación con trietanolamina y
anhídrido acético. Las secciones fueron hibridadas con las
ribosondas marcadas con P^{33} durante la noche a 55ºC, después
sometidas a un lavado altamente restrictivo en 0,1X SSC a 60ºC. Los
portas se sumergieron en emulsión de película NTB2 (Eastman Kodak,
Rochester, NY), se expusieron a 4ºC durante 2-3
semanas, se revelaron y se contratiñeron. Las secciones se
examinaron con iluminación de campo oscuro y normalizada para
permitir la evaluación simultánea de la morfología del tejido y la
señal de hibridación.
En conjunto, la sonda de KGF-2
producía una clara distribución de señal en las secciones de tejido
de embrión y adulto, con una señal de fondo pequeña o sin ella. En
el embrión en fase tardía, la mayoría de la señal de
KGF-2 se observaba en células con un apariencia
mesenquimática, observándose poca expresión epitelial (Tabla 2). En
el adulto, a diferencia del embrión, se detectó expresión en los
tejidos tanto epiteliales como mesenquimáticos (Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Se dividieron 18 ratones BDF1 hembra en 6 grupos
de 3 ratones cada uno (1 grupo tratado y 1 grupo de control en cada
uno de los tres momentos puntuales). Los dos primeros grupos
recibieron 5 mg/kg de His rFGF10 o el tampón de control IV durante
1 día; los dos segundos grupos recibieron 5 mg/kg de His rFGF10 o el
tampón de control IV diariamente durante 3 días; y los dos terceros
grupos recibieron 5 mg/kg de His rFGF10 o el tampón de control IV
diariamente durante 7 días. A todos los ratones se les inyectaron 50
mg/kg de BrdU una hora antes de recogerlos, hacerles radiografías y
sacrificarlos. Se tomaron los pesos corporales y de los órganos
seleccionados (incluyendo todos los segmentos del intestino
delgado), se recogió sangre para la química hematológica y del
suero, y se recogieron los órganos para el análisis histológico y el
marcaje con BrdU.
Se realizó un estudio adicional utilizando
ratones atímicos carentes de sistema inmunitario. En este estudio,
se inyectaron subcutáneamente 5 mg/kg/día de His rFGF10 en el flanco
de cinco ratones hembra atímicos carentes de sistema inmunitario
durante 8 días. Otros cinco ratones hembra carentes de sistema
inmunitario recibieron el tampón de control. Se inyectaron 50 mg/kg
de BrdU a todos los ratones una hora antes de la recogida y se
sacrificaron. Se tomaron los pesos corporales y de los órganos
seleccionados, se recogió sangre para la química hematológica y del
suero, y se recogieron los órganos para su análisis histológico y
marcaje con BrdU.
Se realizó el análisis inmunohistoquímico de
BrdU sobre secciones de 4 \mum de grosor de tejido embebido en
parafina, fijado con formalina de cinc. Se detectó BrdU con un
anticuerpo monoclonal de rata (MAb) para BrdU (Accurate Chemical,
Westbury, NY), seguido de un cóctel secundario
anti-conejo/anti-ratón biotinilado
(BioTek Solutions, Inc., Santa Bárbara, CA) y un ABC terciario
acoplado a fosfatasa alcalina (BioTek). La reacción de tinción se
visualizó con cromógeno rojo (BioTek).
Se examinaron secciones teñidas con H y E y
BrdU. Los descubrimientos histológicos significativos se resumen en
la Tabla 3. Además de los descubrimientos enumerados más abajo, los
ratones atímicos a los que se había inyectado subcutáneamente His
rFGF10 tenían hiperplasia localizada de las glándulas epidérmicas y
sebáceas en el sitio de la inyección, así como normalización de la
morfología folicular con tallos pilosos evidentes por encima de la
superficie epidérmica.
Se inyectó intraperitonealmente (IP) His rFGF10
(5 mg/kg) o solución salina durante tres días consecutivos a
ratones BDF1 hembra. Veintitrés horas después de la última
inyección, se sacrificaron cada uno de los ratones, se separaron
los intestinos y se lavaron con solución salina fría, se colgaron
bajo una tensión uniforme y se dividieron en duodeno, yeyuno e
íleo. Se tomaron los pesos húmedos de estos tejidos y se expresaron
como porcentaje del peso corporal, y se utilizó un test de la t no
emparejado para comparar los tratados con His rFGF10 con los
tratados con solución salina. Hubo un incremento del 26% en el peso
húmedo del intestino delgado.
Para este estudio se realizó una resección
quirúrgica del 80% del intestino delgado (de 5 cm en posición distal
con respecto al ligamento de Treitz a 5 cm en posición proximal con
respecto a la válvula íleocecal) y se dejó que los animales se
recuperaran durante 4 semanas. Después los animales fueron tratados
durante 7 días con solución salina o con His rFGF10 a 5 mg/kg
subcutáneamente. Los animales fueron sacrificados y el resto del
intestino se separó, se lavó con solución salina fría y se colgó con
una tensión uniforme de 10 g. Se determinó la longitud total y se
seccionó el intestino como sigue: primero 1/3 del denominado
duodeno, segundo 1/3 del yeyuno y por último 1/3 del íleo. Se tomó
una porción de cada uno para la histología y para el análisis
bioquímico. La porción para la histología se trató en parafina, se
cortó en sección transversal y se tiñó con hematoxilina y eosina.
Se utilizó el análisis de imágenes para medir el grosor de la mucosa
y la profundidad de las criptas en el íleo y el yeyuno, y estos
datos se utilizaron para calcular la altura de los villi donde
grosor de la mucosa - profundidad de las criptas = altura de los
villi. Hubo un incremento significativo (p<0,01) en el grosor de
la mucosa debido a un incremento en la altura del villus.
Se administraron dosis de 5 mg/(kg/día de His
rFGF10 o vehículo a ratones BDF1 hembra durante 3 días y con
posterioridad se irradiaron con 12 Gy de una fuente de cesio. Cuatro
días más tarde se inyectaron a los ratones 50 mg/kg de BrdU IP a
los ratones una hora antes de la eutanasia. Se separaron los
intestinos, se lavaron con solución salina fría, se colgaron bajo
una tensión uniforme utilizando un peso de 5 g y se dividieron en
duodeno, yeyuno e íleo. Estos segmentos se pesaron, se fijaron en
formalina y se bloquearon en parafina para seccionarlos
transversalmente. Las secciones se tiñeron con anticuerpos para BrdU
y se contaron las criptas marcadas utilizando la microscopía
óptica. Se identificaron las criptas positivas por tener 3 o más
núcleos marcados/cripta. El pre-tratamiento
incrementó la supervivencia de las criptas en un 45%, si bien el
post-tratamiento fue significativamente eficaz.
Se inyectó IP His rFGF10 a 5 mg/kg/día o PBS en
cinco camadas de ratas recién nacidas (aproximadamente
10-15 crías por grupo) a los 5, 6, y/o 7 días de
edad (días experimentales -3, -2, y/o -1). Los días experimentales
0-5 (8-12 días de edad), se
inyectaron IP 30 mg/kg de citosin-arabinósido
(ARA-C) a todas las crías.
Se puntuaron las crías de 0-4 en
cuanto a la cobertura de pelo y a la densidad de pelo por medio de
tres observadores independientes ciegos para los grupos de
tratamiento los días experimentales 6, 8, 11, 13 y 15. Las
puntuaciones para la densidad y cobertura se calcularon para cada
cría de rata diariamente, las puntuaciones se sumaron, y las sumas
medias para cada grupo de tratamiento se calcularon y se sometieron
e ensayo en cuanto a la significación estadística en cada momento
puntual utilizando el test de la suma de rangos no paramétrico de
Kruskal-Wallis.
En todos los regímenes de dosificación el His
rFGF10 solamente inducía un grado de protección significativo
frente a la alopecia inducida por (ARA-C) el día
experimental 8, aunque había una tendencia inducida por His rFGF10 a
la protección frente a ARA-C en todos los demás
momentos puntuales.
Se administró vehículo solo (solución salina), e
His rFGF10 a ratones (15/grupo) tratados con
5-fluorouracilo.
- \quad
- Grupo de Control: Los días -2 a 0, se inyectó solución salina a un grupo de ratones los días -2 a 0, y se les inyectó intraperitonealmente 5-fluorouracilo (5-FU, 60 mg/kg/día) los días 1 a 4.
- \quad
- Pre-tratamiento con His rFGF10: Los días -2 a 0, se inyectó subcutáneamente His rFGF10 (5 mg/kg) a un grupo de ratones. Los días 1 a 4; se inyectó intraperitonealmente 5-fluorouracilo (5-FU, 60 mg/kg/día) a los ratones.
Se analizaron los efectos sobre los pesos
corporales y la supervivencia de los diversos grupos. Se tomaron
diariamente los pesos corporales desde el día 0 a la terminación el
día 30. Los ratones se examinaron visualmente dos veces al día en
cuanto a signos de morbididad durante 30 días y a todos los animales
moribundos se les aplicó eutanasia. El cambio de porcentaje en el
peso corporal el día 6 nadir se muestra en la Tabla 4.
El pre-tratamiento con His
rFGF10 también demostró un incremento de la supervivencia.
El pre-tratamiento con
KGF-2 humano recombinante (que tenía la secuencia de
Cys^{37} a Ser^{208} del SEQ ID NO. 2 y que se prepara
generalmente de acuerdo con las enseñanzas de la publicación WO
96/25422, rhuKGF-2), combinado con
G-CSF o solución salina post-BMT,
mejoraba significativamente la supervivencia cuando se comparaba
con controles de G-CSF solo o de solución salina. El
número de criptas en proliferación en el intestino delgado aumentó
los 4 días siguientes de los 12 Gy en ratones
pre-tratados con rhuKGF-2 y el
procedimiento BMT no alteró la magnitud de esta respuesta inducida
por rhuKGF-2. Adicionalmente, el
rhuKGF-2 no alteró la cinética de recuperación
hematopoyética de los ratones tratados con BMT después de TBI no
letal (9 Gy). Los tratamientos con rhuKGF-2
evitaron la mortalidad en ratones irradiados letalmente (12 Gy)
transplantados con células progenitoras de sangre periférica (1 x
10^{7} PBPC) cuando se utilizaba solo o combinado con
G-CSF (100 \mug/kg/día, SC, días 1 a 10). De un
modo similar a los experimentos con BMT, los ratones transplantados
con PBPC no de control sobrevivieron y los ratones tratados con
G-CSF solo tuvieron una mejora. Los
pre-tratamientos con rhuKGF-2
tampoco alteraron la cinética de recuperación hematopoyética después
del transplante con PBPC, en presencia o ausencia de
G-CSF, después de TBI no letal (8,5 Gy). Cuando se
administraba rhuKGF-2 tanto antes como después de
la irradiación letal de PBPC, éste no menoscababa la supervivencia
mejorada observada en ratones tratados con
pre-tratamiento de rhuKGF-2 solo, ni
alteraba la cinética de reconstitución hematopoyética tras la
irradiación no letal.
Se induce mucositis en ratones con 12 Gy de
radiación a todo el organismo. Los ratones se tratan diariamente
con 5 mg/kg/día de KGF-2 humano recombinante
(preparado de acuerdo con las enseñanzas de la publicación WO
96/25422, rhuKGF-2) comenzando el día antes de la
radiación y continuando el día tres después de la radiación. Cuatro
días después de la radiación, se toma una necropsia de los ratones y
se cuenta el número de criptas en proliferación (que contienen
células BUdR positivas).
El tratamiento con rhuKGF-2
aumenta el número de criptas en proliferación en el duodeno, el
yeyuno proximal y distal del intestino delgado en relación con los
animales no tratados con rhuKGF-2. El
rhuKGF-2 también es capaz de disminuir la pérdida de
peso corporal en los ratones irradiados.
Se induce mucositis en ratones una única dosis
intraperitoneal de Adriamicina a 24 mg/kg. Los ratones se tratan
diariamente con 1 mg/kg/día de rhuKGF-2 comenzando
el día antes de la radiación y continuando hasta el día tres
después de la radiación. Cuatro días después de la radiación, se
toma una necropsia de los ratones y se cuenta el número de criptas
en proliferación (que contienen células BUdR positivas).
El tratamiento con rhuKGF-2
aumenta el número de criptas en proliferación en el duodeno, el
yeyuno y el íleo en relación con los animales no tratados con
rhuKGF-2.
En dos grupos de 10 animales cada uno, se indujo
colitis mediante instilación colónica de ácido
2,4,6-trinitrobencenesulfónico en etanol a una
dosis de 50 mg/kg de peso corporal. Para determinar si el
rhuKGF-2 actúa por medio de un mecanismo protector,
se trata previamente un grupo de ratas (grupo A) con
rhuKGF-2 o vehículo 24 horas y 1 hora antes de la
inducción de la colitis a una dosis de 5 mg/kg (i.p.) y los animales
se sacrifican 8 horas después de la lesión. Para evaluar los
potenciales efectos de curación, se inyecta rhuKGF-2
o vehículo (la misma dosis, i.p.) en un segundo grupo (grupo B) 24
horas después de la inducción de la colitis y se continúa el
tratamiento diariamente durante 1 semana. Se examina la lesión
tisular microscópicamente y se expresa como el porcentaje de
ulceraciones o erosiones.
Los animales que están tratados con
rhuKGF-2 tras la inducción de la colitis (grupo B)
muestran significativamente menos ulceraciones en comparación en el
grupo de control (grupo A). En los animales tratados antes de la
inducción de la colitis, hay erosiones, pero no se observan úlceras
debido al corto período de estudio de 8 horas, y las erosiones no
son significativamente diferentes de las observadas en el grupo de
control (grupo A).
Estudio 1: Se alimentaron ratas con DSS al 4% y
al 6% en agua durante 1 semana. Al final de la segunda semana se
conservan los 4 cm distales del colon. Se preparan ocho secciones a
intervalos de 0,5 cm y se tiñen con H y E. Se evalúa el porcentaje
de cada sección de colon con necrosis (destrucción de la estructura
glandular) de una manera al azar y codificada.
Estudio 2: Se administra a las ratas vehículo o
rhuKGF-2 (1 mg/kg/día) IP y se alimentan con agua o
sal de sodio de sulfato de dextrano durante 14 días. Las secciones
del colon se tiñen con PAS.
La sal de sodio de sulfato de dextrano parece
inducir un incremento de la necrosis de la mucosa colónica
relacionado con la dosis. El rhuKGF-2 administrado
a 1 mg/kg/día durante 14 días aumenta la producción de mucina
colónica en el grupo de control así como en las ratas tratadas con
sal de sodio de sulfato de dextrano.
Se utilizan ratas Sprague-Dawley
macho que pesan entre 150 y 175 g. Los animales se exponen a
fenobarbitol (0,35 mg/ml) en el agua de bebida durante el
transcurso del estudio. Se administra a los animales semanalmente
CC14 en un vehículo de aceite de maíz bajo una ligera anestesia con
isoflurano. La dosis inicial de CC14 es de 40 \mul por rata. La
dosis se ajusta semanalmente, al alza o a la baja en incrementos de
40 \mul basándose en la ganancia de peso. Se exponen diez
animales de control a fenobarbitol en el agua de bebida y se lavan
semanalmente con vehículo de aceite de maíz. La función del hígado
se evalúa mediante medición de aclaramiento de bromosulfoftaleina
(BSP), niveles de transaminasa en suero y niveles de seralbúmina. En
el momento del sacrificio, se separan los hígados, se pesan y se
tratan para la determinación de los niveles de hidroxiprolina como
indicador de depósito de colágeno y fibrosis.
Los animales se mantienen en el protocolo de
inducción de cirrosis anterior durante 11 semanas. En la
decimoprimera semana, los animales se distribuyen al azar en grupos
de control y de tratamiento con rhuKGF-2. El
rhuKGF-2 se administra una vez al día mediante
inyección subcutánea a una dosis de 1 mg/kg, durante un total de 15
días. Después de 15 días de tratamiento con
rhuKGF-2, se realiza la eutanasia de los
animales.
Las ratas en las que se ha inducido cirrosis con
CC14 muestran una elevación en suero de la concentración de BSP,
que refleja el aclaramiento deteriorado en el hígado de este agente.
Las ratas tratadas con rhuKGF-2 tienen un nivel en
suero de BSP más bajo que los animales no tratados, sugiriendo una
mejora de la función del hígado. Las ratas que se han vuelto
cirróticas por medio de CC14 muestran una elevación en SGPT que es
revertida mediante tratamiento con rhuKGF-2. El
tratamiento con rhuKGF-2 es capaz de elevar la
seralbúmina. El tratamiento con rhuKGF-2 da como
resultado un incremento de la razón en peso
hígado-cuerpo, reflejando un crecimiento
compensatorio del hígado.
Las ratas sometidas a una hepatectomía parcial
del 70% recuperan su masa de hígado original más rápidamente cuando
son tratadas con 1 mg/kg/d de rhuKGF-2 que cuando se
comparan con animales no tratados.
En los modelos de hepatotoxicidad aguda el
tratamiento con rhuKGF-2 (1 mg/kg antes o 3 horas
después del agente incitante) despunta los incrementos en los
niveles de transaminasas en ratas con insuficiencia hepática aguda
inducida con tetracloruro de carbono, acetaminofeno o galactosamina.
El pre-tratamiento con rhuKGF-2
también evita un descenso en las funciones de aclaramiento del
hígado después del acetaminofeno, medido mediante el aclaramiento de
sulfobromoftaleina (BSP).
Se administra intravenosamente
rhuKGF-2 (1-5 mg/kg) a ratones.
Cuarenta y ocho horas después de la inyección intravenosa de
rhuKGF-2, aumenta la proliferación de hepatocitos de
múridos, en comparación con los hígados no estimulados, y vuelve a
niveles proliferativos normales. No se observan módulos o anomalías
microscópicas agudamente o después de 5 meses.
Cuando el tratamiento con
rhuKGF-2 está seguido de inyección intravenosa de
vectores retrovirales de Moloney que expresan LacZ de E.
coli de elevado título (1 x 108 cfu.ml), la expresión de
\beta-galactosidasa aumenta siendo transducido un
porcentaje de hepatocitos. Varios meses más tarde, una porción de
los hepatocitos transducidos siguen siendo X-gal
positivos.
En este modelo se utilizan ratas macho que pesan
de 200 a 260 gramos al inicio del estudio (Publicación WO 9611950).
La diabetes es inducida por una única inyección intravenosa de
estreptozotocina a 50 mg de estreptozotocina en tampón citrato de
sodio por kg de peso corporal. Las ratas no diabéticas de control
reciben una única inyección intravenosa de tampón citrato de sodio
como control. El rhuKGF-2 se administra diariamente
en forma de una inyección subcutánea. La dosis de
rhuKGF-2 es de 3 o 5 mg/kg/día, dependiendo del
experimento.
En el primer experimento, la terapia con
rhuKGF-2 se inicia dos días antes de inducir la
diabetes y se continúa después de la inducción de la diabetes
durante un total de ocho inyecciones. Aquellas ratas diabéticas que
son tratadas con rhuKGF-2 antes de la inducción de
la diabetes, y para las cuales también se continúa con el
rhuKGF-2 después de la inducción, muestran síntomas
indicativos de una forma de diabetes más suave. De este modo, la
terapia con rhuKGF-2 evita parcialmente la inducción
de la enfermedad o restaura las células de los islotes productoras
de insulina después de la destrucción de las células beta inducida
por la estreptozotocina.
En el segundo y tercer experimentos, se inicia
la terapia con rhuKGF-2 administrado subcutáneamente
un día después de la inducción de la diabetes con estreptozotocina.
En el segundo estudio, el ayuno en la ingesta de agua y la
producción de orina son significativamente menores en las ratas
diabéticas tratadas con rhuKGF-2 cuando se compara
con ratas diabéticas el día 9, lo que es adicionalmente indicativo
de un alivio de las condiciones de la enfermedad. En el tercer
estudio, la terapia con rhuKGF-2 es capaz de
incrementar el contenido total de insulina y péptido C en el
páncreas de las ratas diabéticas cuando se compara con ratas
diabéticas tratadas con la solución de cloruro de sodio.
En el cuarto experimento, se inicia un ciclo de
7 días de terapia con rhuKGF-2 7 días después del
tratamiento con estreptozotocina y se hace un seguimiento de los
animales durante 12 semanas más. En todos los experimentos, excepto
para el cuarto experimento, se utilizan los niveles de glucosa en
sangre, los niveles de glucosa en orina y el volumen de orina como
criterios de valoración para el análisis. Adicionalmente, se miden
la ingesta de agua, los niveles de péptido C en orina, o la
insulina pancreática total y el contenido de péptido C medidos en
algunos experimentos. En el cuarto experimento, el único criterio de
valoración evaluado es la glucosa en sangre.
Debido a que una fracción grande de insulina es
separada de la circulación por el hígado, la medida de las
concentraciones de insulina periférica refleja eventos de
metabolismo post-hepático en lugar de secreción de
insulina a partir del páncreas. Por lo tanto, a menudo se realizar
medidas de péptido C y se utilizan como marcador periférico de la
secreción de insulina. El péptido C es producido a partir del
procesamiento de pro-insulina a insulina. La
insulina y el péptido C son secretados a partir de las células beta
en cantidades equimolares, y solamente una pequeña cantidad de
péptido C es extraída por el hígado.
Los animales tratados con STZ de ambos grupos
que reciben rhuKGF-2 tienen caídas significativas de
glucosa en sangre durante el período de dosificación con
rhuKGF-2.
Si bien la presente memoria ha sido descrita
antes tanto en general como en términos de las realizaciones
preferidas, se entiende que se producirán otras variaciones y
modificaciones por parte de los expertos en la técnica a la luz de
la descripción anterior.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Amgen Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> USOS DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DE
QUERATINOCITOS-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> A-422C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US97/18667
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1997-10-15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/028,495
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1996-10-15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/032,253
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1996-12-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/033,457
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1996-12-10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 627
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano Recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(624)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 208
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana Recombinante
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 588
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano Recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(585)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana Recombinante
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 513
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano Recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(510)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
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<211> 170
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskipaaacaacata tggtttctcc ggaggctacc aactcc
\hfill36
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<210> 8
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<400> 8
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\hskip-.1em\dddseqskipaaacaaggat cctttatgag tggaccacca tgggg
\hfill35
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskipctagcgatga cgatgataaa caggctctgg gtcaggacat ggtttct
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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\hfill47
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<400> 11
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\hfill53
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<400> 12
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\hfill35
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<213> Humano Recombinante
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<400> 14
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\hfill27
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskipgagctaggag aggagaagct gctggagcta gagttggtag cct
\hfill43
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Claims (15)
1. Un método in vitro de estimulación de
la producción de células epiteliales seleccionadas entre células de
páncreas, hígado y tracto gastrointestinal, que comprende poner en
contacto tales células con una cantidad eficaz de la proteína o las
proteínas KGF-2.
2. El método de acuerdo con la Reivindicación 1,
donde dicha proteína o proteínas KGF-2 tienen una
secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos Cys^{37} a
Ser^{208} del SEQ ID NO: 2 o una secuencia variante de la misma,
donde dicha variante comprende deleciones, inserciones,
sustituciones y/o adiciones y conserva la actividad biológica de la
proteínas KGF-2 madura.
3. El método de acuerdo con la Reivindicación 2,
donde dicha secuencia variante comprende una secuencia de
aminoácidos homóloga en más del ochenta por ciento (80%), noventa
por ciento (90%), noventa y cinco por ciento (95%) o noventa y nueve
por ciento (99%) a los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} del SEQ
ID NO: 2 y donde dicha variante comprende deleciones, inserciones,
sustituciones y/o adiciones y conserva la actividad biológica de la
proteína KGF-2 madura.
4. El método de acuerdo con la Reivindicación 2,
donde dicha proteína o proteínas KGF-2 están
fusionadas con todo o parte del dominio constante de la cadena
pesada o ligera de la inmunoglobulina humana.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de
las Reivindicaciones 1 a 4, donde dicha proteína o proteínas
KGF-2 están modificadas químicamente por unión a un
polímero.
6. El método de acuerdo con la Reivindicación 5,
donde dicha proteína o proteínas KGF-2 están
modificadas químicamente por conjugación con un polímero soluble en
agua.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de
las Reivindicaciones 1 a 6, donde antes de la administración dicha
proteína o proteínas KGF-2 son reconstituidas a
partir de un polvo deshidratado o liofilizado.
8. El uso de una cantidad eficaz de la proteína
o las proteínas KGF-2 para la producción de un
medicamento para la prevención o el tratamiento de un estado en un
paciente que padece una afección seleccionada entre úlceras
gástricas, úlceras duodenales, erosiones del estómago y esófago,
gastritis erosiva, esofagitis, o reflujo esofágico, enfermedad
inflamatoria del intestino, toxicidad gastrointestinal inducida por
radiación o quimioterapia, cirrosis hepática, insuficiencia hepática
fulminante, hepatitis viral aguda, ataque tóxico en el hígado, y
diabetes.
9. El uso de acuerdo con la Reivindicación 8,
donde dicha proteína o proteínas KGF-2 tienen una
secuencia de aminoácidos que comprende los aminoácidos Cys^{37} a
Ser^{208} del SEQ ID NO:2 o una secuencia variante de la misma,
donde dicha variante comprende deleciones, inserciones,
sustituciones y/o adiciones y conserva la actividad biológica de la
proteína KGF-2 madura.
10. El uso de acuerdo con la Reivindicación 11,
donde dicha secuencia variante comprende una secuencia de
aminoácidos homóloga en más del ochenta por ciento (80%), noventa
por ciento (90%), noventa y cinco por ciento (95%) o noventa y nueve
por ciento (99%) a los aminoácidos Cys^{37} a Ser^{208} del SEQ
ID NO: 2 y donde dicha variante comprende deleciones, inserciones,
sustituciones y/o adiciones y conserva la actividad biológica de la
proteína KGF-2 madura.
11. El uso de acuerdo con la Reivindicación 9,
donde dicha proteína o proteínas KGF-2 están
fusionadas con todo o parte del dominio constante de la cadena
pesada o ligera de la inmunoglobulina humana.
12. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
Reivindicaciones 8 a 11, donde dicha proteína o proteínas
KGF-2 están modificadas químicamente por unión con
un polímero.
13. El uso de acuerdo con la Reivindicación 12,
donde dicha proteína o proteínas KGF-2 están
modificadas químicamente por conjugación con un polímero soluble en
agua.
14. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
Reivindicaciones 8 a 13, donde antes de la administración de dicha
proteína o proteínas KGF-2 son reconstituidas a
partir de un polvo deshidratado o liofilizado.
15. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
Reivindicaciones 8 a 14, donde dicha proteína o proteínas
KGF-2 son administradas por la ruta tópica, entérica
o parenteral.
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