ES2293900T3 - Identificacion y caracterizacion molecular de proteinas, expresadas en las glandulas salivales de la garrapata. - Google Patents
Identificacion y caracterizacion molecular de proteinas, expresadas en las glandulas salivales de la garrapata. Download PDFInfo
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Abstract
Polinucleótido obtenido de una glándula salival de garrapata y que presenta más del 75% de identidad con la secuencia nucleotídica SEC. ID. nº: 24 o una secuencia complementaria a la misma.
Description
Identificación y caracterización molecular de
proteínas, expresadas en las glándulas salivales de la
garrapata.
La invención se refiere a la caracterización
molecular de secuencias de ADN que codifican proteínas expresadas
en las glándulas salivales de garrapatas, más específicamente del
artrópodo garrapata Ixodes ricinus. Estas proteínas están
implicadas en el mecanismo complejo de interacción entre este
artrópodo y su mamífero hospedador. La invención se refiere a
polinucleótidos recién identificados, a los polipéptidos codificados
por los mismos y a la utilización de dichos polinucleótidos y
polipéptidos, y a su producción.
Las garrapatas son ectoparásitos que infestan un
gran número de animales tales como mamíferos, aves, reptiles y
anfibios. Están presentes en prácticamente cada zona del mundo. El
propio proceso de alimentación de la garrapata es con frecuencia
perjudicial para el hospedador. Además, muchas de estas garrapatas
son vectores de virus, bacterias y protozoos que originan la
morbilidad del hospedador y, en algunos casos, mortalidad,
particularmente en seres humanos y ganado. Existen tres familias de
garrapatas: las Ixodidae o garrapatas duras, las
Argasidae o garrapatas blandas y las Nuttalliellidae.
El ciclo vital de todas las garrapatas implica cuatro etapas (huevo
- larva - ninfa - adulto). En la mayoría de las especies, como
Ixodes ricinus, las garrapatas permanecen en el animal
hospedador después de cada alimentación de sangre. Las larvas
incuban los huevos y trepan a la vegetación en la que se introducen
con facilidad para alcanzar a los animales que pasan. Una vez en el
hospedador, le atacan y se alimentan de sangre. Las ninfas y adultos
se alimentan en otros hospedadores y utilizan los mismos métodos de
búsqueda del hospedador. La copulación de los adultos tiene lugar
con frecuencia en el hospedador mientras están unidos y se
alimentan. La puesta de huevos se produce después de cada
separación.
La glándula salival de la garrapata desempeña
una función importante en la realización de la alimentación de
sangre y en la transmisión de patógenos. Durante la alimentación de
sangre, las garrapatas Ixodidae concentran la sangre
utilizando mecanismos especiales que eliminan el exceso de agua y de
iones a través de las glándulas salivales. Una modificación
sorprendente de la morfología y de la fisiología de las glándulas
salivales se produce durante esta alimentación de sangre. El
citoplasma y el núcleo de varias células de las glándulas salivales
aumentan de volumen lo que conduce a un aumento importante en el
tamaño y el peso de las glándulas salivales. Se produce también la
síntesis del ARN mensajero (ARNm), dando como resultado la expresión
de nuevas proteínas. Al final de la alimentación, la degeneración
de las glándulas salivales es producida probablemente por la
20-hidroxiecdisona, denominada también "factor de
degeneración salival".
La glándula salival es rica en factores
bioactivos: cemento, enzimas, inhibidores enzimáticos, agonistas y
antagonistas de histamina, factores anticoagulantes, factores de
modulación de la respuesta inmunitaria del hospedador,
prostaglandina. Algunos de estos factores interactivos están ya
presentes en las glándulas salivales de las garrapatas no
alimentadas; pero otros, principalmente las proteínas, se producen
durante la fase de alimentación del alimento sanguíneo. Estos
factores proteínicos inducidos parece que desempeñan una función
importante en la modulación de la respuesta inmunitaria del
hospedador. Uno de estos factores, una proteína de 65 kDa, fue
aislado por Brossard y colaboradores (Ganapamo et al., 1997).
Esta proteína provoca, in vitro, una proliferación de
linfocitos CD4^{+} T específicos de las células de los ganglios
linfáticos de los ratones infestados con garrapatas I.
ricinus (Ganapamo et al., 1997). Estas células producen
concentraciones elevadas de interleucina-4
(IL-4) y bajas concentraciones de
interferón-\gamma (IFN-\gamma)
cuando se estimulan con concanavalina-A (Con A).
Esto sugiere una polarización T_{H}2 del modelo de citocina
(Ganapamo et al., 1995). La producción de
IL-5 e IL-10 confirma este fenómeno
(Ganapamo et al., 1996). Esta respuesta polarizada podría
constituir condiciones favorables para la transmisión de algunos
patógenos.
La inhibición de la serie de reacciones
alternativa de activación del complemento, la disminución de la
síntesis de anticuerpos provocada por antígenos dependientes del
timo en animales infestados, y la disminución de la actividad
proliferante de los linfocitos T estimulados con mitógenos,
contribuyen al establecimiento de estos procesos (Wikel et
al., 1996; Brossard y Wikel, 1997). Además, las prostaglandinas
(PGE_{2}) y las proteínas salivales están implicadas en la
supresión de la respuesta inmunitaria. Además, es sabido que algunos
factores proteicos expresados por las glándulas salivales estimulan
el crecimiento de Borrelia burgdorferi, agente etiológico de
la enfermedad de Lyme, que es el principal patógeno humano
transmitido por las garrapatas Ixodidae (De Silva et
al., 1995).
NEEDHAM G. et al. (Experimental and
Applied Acarology nº 7, pág. 21 a 32, 1989) describen la
caracterización de los productos génicos de las glándulas salivales
de garrapatas Ixode obtenidas de un banco de ADNc.
BIOR et al. Abdel (Faseb Journal, vol.
13, nº 7, 1999) describen un proyecto para identificar y
caracterizar genes de garrapata expresados en las glándulas
salivales.
LUO C. et al. (Insect Molecular Biology,
vol. 6 (3), pág. 267-271, 1997) describen la
clonación y el secuenciado de un gen para el homólogo de una enzima
desaturasa y obtenida de las glándulas salivales de una
garrapata.
\newpage
El documento WO 95/04750 describe el polipéptido
inhibidor de la proteasa procedente de la garrapata y las
secuencias polinucleotídicas, un procedimiento para producir estos
polipéptidos y una célula hospedadora y una composición farmacéutica
que comprende dicho polipéptido.
La presente invención se refiere a un
polinucleótido obtenido de una glándula salival de garrapata y que
presenta más del 75%, 80%, 90%, 95%, 98 a 99% o 100% de identidad
con la secuencia nucleotídica SEC. ID. nº: 24 o una secuencia
complementaria a ésta así como la secuencia polipeptídica
correspondiente.
La presente invención se refiere asimismo a un
vector que comprende el polinucleótido o las secuencias
polipeptídicas según la invención, a la estirpe celular
transfectada por este vector, a los anticuerpos producidos contra
estos polipéptidos, a las estirpes celulares de hibridoma que
expresan estos anticuerpos y a una composición farmacéutica que
comprende estos diversos elementos según la invención.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
también a la utilización de los polipéptidos según la invención
para la preparación de un medicamento, destinados a producir
anticuerpos o a la respuesta inmunitaria de linfocitos T para
proteger un mamífero de las bacterias o a los virus transmitidos
durante la alimentación de sangre de Ixodes ricinus y las
especies relacionadas en el tratamiento y/o a la prevención de la
enfermedad de Lyme o de las enfermedades por virus de encefalitis de
garrapata.
La presente invención se refiere asimismo a un
kit para diagnóstico destinado a detectar una enfermedad o a la
propensión a una enfermedad producida o transmitida por garrapatas,
especialmente Ixodes ricinus que comprende las secuencias
polinucleotídicas o polipeptídicas de la invención o a un fago que
presenta los anticuerpos según la invención.
Figura
1
Análisis RACE (Frohman et al., 1995)
específico para las SEC. ID. nº 16 y 24. La etapa de transcripción
inversa se llevó a cabo utilizando 10 ng de los ARNm extraídos de la
glándula salival de garrapatas saciadas. Las bandas más brillantes
representan los fragmentos de ADNc correspondientes al extremo 3'
del ARNm diana. Los productos ampliados se sometieron a
electroforesis en gel de agarosa seguido de tinción de los
fragmentos de ADN con bromuro de etidio. Los marcadores de peso
molecular (M) fueron el Smart ladder (Life technologies, Rockville,
Maryland, UEA). Las flechas indican la posición de los productos
ampliados esperados.
Figura
2
Análisis de la expresión diferencial de los 5
ADNc completos seleccionado y de 9 fragmentos de ADNc aislados en
el banco sustractivo. Se llevaron a cabo análisis por PCR utilizando
como plantilla de ADN los ADNc obtenidos a partir de un
procedimiento de transcripción inversa en los ARNm extraídos de las
glándulas salivales, ya sea de garrapatas saciadas (E) o de
garrapatas sin alimentación (UF). Estos ARN mensajeros se
utilizaron también como plantilla en análisis de transcriptasa
inversa. Diez microlitros de una mezcla tanto de PCR como de
RT-PCR se sometieron a electroforesis en gel de
agarosa y tinción con bromuro de etidio para la detección de
productos ampliados de ADN. [++] muy positivo; [+] positivo; [-]
negativo.
Los autores han caracterizado genes que se
producen en las glándulas salivales de Ixodes ricinus durante
la fase de alimentación lenta de la alimentación con sangre. La
clonación de estos genes se llevó a cabo creando dos bancos de ADN
complementario (ADNc). El primero es un banco sustractivo basado en
la metodología descrita por Lisitsyn et al. (Science 259,
946-951, 1993) y mejorada por Diatchenko et al.
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6025-6030,
1996). Este banco clonó el ARNm producido selectivamente durante la
fase de alimentación de la garrapata. El segundo banco es un banco
de ADNc completo que se ha construido utilizando la propiedad
básica de los ARNm (presencia de una cola poliA en su extremo 3' y
de la estructura capsular en su extremo 5'). El banco de ADNc
permitió la clonación de los ADNc completos, correspondiente a
algunas secuencias de ADNc incompletas estimadas de interés e
identificadas en el banco sustractivo de ADNc.
El banco sustractivo se creó sustrayendo los
ADNc no producidos (sintetizados a partir de los ARNm expresados en
las glándulas salivales de las garrapatas no alimentadas) a partir
de los ADNc producidos (sintetizados a partir de los ARNm
expresados en las glándulas salivales al final de la fase de
alimentación lenta. Los ADNc fueron digeridos por una enzima de
restricción, se dividieron en dos alícuotas y se modificaron de
manera diferenciada mediante la adición de adaptadores específicos.
Por lo que respecta a los ADNc producidos, los ADNc no producidos
fueron digeridos también por la misma enzima de restricción y a
continuación se mezclaron en exceso con cada alícuota del ADNc
producido modificado. Cada mezcla de los ADNc no
producidos/producidos se sometió a una etapa de desnaturalización,
seguida inmediatamente de una etapa de hibridación, lo que conduce
a una captura de los ADNc homólogos producidos por el ADNc no
producido. Cada mezcla se mezcló a continuación y se sometió de
nuevo a un nuevo ciclo de desnaturalización/hibridación. Entre las
moléculas de ADNc hibridadas, esta mezcla final comprende los ADN
producidos con diferentes adaptadores en sus extremos 5' y 3'. Estos
ADNc relevantes fueron ampliados por la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), utilizando cebadores específicos para cada
adaptador situado en cada extremo de las moléculas de ADNc. Los
productos de PCR se ligaron a continuación en un vector
pCRII^{TM} mediante clonación A-T y se clonaron en
una cepa TOP-10 de E. coli. La heterogeneidad
de este banco sustractivo se evaluó secuenciando los clones
recombinantes. La propiedad "inducida" de estas secuencias de
ADNc se comprobó por PCR de transcripción inversa
(RT-PCR) en el ARNm extraído de las glándulas
salivales de garrapatas saciadas y no alimentadas. Por último, el
ADNc completo producido se obtuvo mediante el cribado del banco de
expresión utilizado, como sonda, algunos ADNc incompletos producidos
procedentes del banco sustractivo. Estas moléculas de ADN completas
producidas se secuenciaron y se compararon con las secuencias
polipeptídicas y polinucleotídicas conocidas.
El banco de ADNc completo se creó utilizando la
estrategia desarrollada en el "CapFinder PCR cDNA Library
Construction Kit" (Clontech). Este kit para la construcción del
banco utiliza el oligonucleótido CapSwitch^{TM} exclusivo
(patente en trámite) en la síntesis de la primera cadena, seguido de
una ampliación de PCR de larga distancia para generar altos
rendimientos de los ADNc completos, de doble cadena. Todos los
procedimientos de síntesis de ADNc normalmente utilizados se basan
en la capacidad de la transcriptasa inversa para transcribir el
ARNm en ADN monocatenario en la reacción de la primera cadena. Sin
embargo, debido a que la transcriptasa inversa no puede transcribir
siempre la secuencia completa de ARNm, los extremos 5' de los genes
tienden a estar infrarrepresentados en la población de ADNc. Esto
es particularmente cierto para los ARNm largos, especialmente si la
síntesis de la primera está cebada con cebadores oligo(dT)
solamente, o si el ARNm presenta una estructura secundaria
persistente. Además, la utilización de la T4 ADN polimerasa para
generar extremos truncados de ADNc después de la síntesis de la
segunda cadena produce generalmente extremos 5' heterogéneos que son
5 a 30 nucleótidos más cortos que el ARNm original (D'Alessio,
1988). En el método de síntesis de ADNc CapFinder, se utiliza un
cebador oligo(dT) modificado para cebar la reacción de la
primera cadena, y el oligonucleótido CapSwitch actúa como una
plantilla corta y ampliada en el extremo 5' para la transcriptasa
inversa. Cuando la transcriptasa inversa alcanza el extremo 5' del
ARNm, la enzima conecta las plantillas y continúa replicando el
extremo del oligonucleótido CapSwitch. Esta conexión en la mayoría
de los casos tiene lugar en la estructura capsular de
7-metilguanosina, que está presente en el extremo 5'
de todos los ARNm eucarióticos (Furuichi & Miura, 1975). El
ADNc monocatenario completo resultante contiene el extremo 5'
completo del ARNm así como la secuencia complementaria al
oligonucleótido CapSwitch, que sirve a continuación como secuencia
universal de cebado de PCR (anclaje CapSwitch) en la ampliación
ulterior. El ADNc monocatenario anclado por CapSwitch se utiliza
directamente (sin intervención de la etapa de purificación) para
PCR. Únicamente aquellos ADNc monocatenarios cebados con
oligo(dT) que presentan una secuencia de anclaje CapSwitch en
el extremo 5' pueden servir como plantillas y ampliarse
exponencialmente utilizando los cebadores de PCR 3' y 5'. En la
mayoría de los casos, los ADNc incompletos y el ADNc transcrito a
partir de poliA-ARN no será reconocido por el
anclaje CapSwitch y por consiguiente no se ampliará.
Al final de estas reacciones, los productos de
PCR ADNc completo se ligaron en el vector de clonación pCRII
(Invitrogen) y se utilizaron para la transformación de la cepa XL2
de E. coli. El banco de ADNc completo fue cribado a
continuación utilizando, como sonda, los ADNc incompletos producidos
aislados del banco sustractivo.
Ochenta y nueve clones del banco sustractivo se
secuenciaron al azar, y su ADN y sus secuencias traducidas del ADN
y de aminoácidos se compararon con las bases de datos del ADN y
proteínas. Entre éstas, se identificaron 27 secuencias de familia
distintas, y 3 de ellas se seleccionaron para la caracterización
posterior de su correspondiente secuencia de ARNm completo. Estas 3
secuencias eran iguales a la secuencia de i) el inhibidor de la
serie de reacciones del factor tisular humano (TFPI), ii) el gen
inhibidor de la trombina humana, e iii) una proteína
metalopeptidasa dependiente del cinc del veneno de serpiente. Estos
genes codifican proteínas que podrían estar implicadas en la
inhibición de la coagulación sanguínea. Las otras 24 secuencias
familiares presentaban pocas o ninguna homología con las secuencias
polinucleotídicas y polipeptídicas existentes en las bases de
datos. El cribado del banco de ADNc completo que utiliza sondas
oligonucleotídicas específicas para los 3 clones sustractivos
seleccionados anteriormente conduce a la recuperación de los ADNc
completos correspondientes. El cribado al azar de este banco
conduce a la selección de otros dos clones. Uno es íntimamente
homólogo a una proteína similar al interferón mientras que el otro
presenta homologías con la proteína relacionada con el antígeno
común del leucocito de Rattus norvegicus.
Polipéptidos "anticoagulantes,
anticomplementarios e inmunomoduladores supuestos" se refieren a
los polipéptidos que presentan la secuencia de aminoácidos
codificada por los genes definidos en la tabla. Éstos presentan
homologías con polipéptidos anticoagulantes, anticomplementarios e
inmunomoduladores ya existentes en las bases de datos. Estos
polipéptidos pertenecen a las secuencias de Clase I y Clase II
(véase la tabla).
ADN "anticoagulantes, anticomplementarios e
inmunomoduladores supuestos" se refieren a los polinucleótidos
que presentan la secuencia nucleotídica definida en la tabla o a las
variantes alélicas de misma y/o a sus complementos. Éstos presentan
homologías con polinucleótidos anticoagulantes, anticomplementarios
e inmunomoduladores ya existentes en las bases de datos. Estos ADNc
pertenecen a las secuencias de Clase I y Clase II (véase la
tabla).
\newpage
Algunas secuencias polipeptídicas o
polinucleotídicas presentan pocas o ninguna homología con los
polipéptidos o polinucleótidos ya existentes en las bases de datos.
Estos pertenecen a la Clase III (véase la tabla).
"Polipéptido" se refiere a cualquier
péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre
sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es
decir, isoésteres peptídicos. "Polipéptido" se refiere tanto a
las cadenas cortas, normalmente denominadas péptidos, oligopéptidos
u oligómeros, como a las cadenas largas, generalmente denominadas
proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos
de los 20 aminoácidos codificados por genes. "Polipéptidos"
incluyen las secuencias de aminoácidos modificadas ya sea por
procesos naturales, tales como el tratamiento tras la traducción o
mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en
la técnica. Dichas modificaciones están bien descritas en los textos
básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa
bibliografía de investigación. Pueden producirse modificaciones en
cualquier parte en un polipéptido, incluyendo el eje central
peptídico, las cadenas laterales de aminoácidos y los terminales
amino o carboxilo. Se valorará que el mismo tipo de modificación
pueda estar presente en los mismos o variables grados en diferentes
puntos en un polipéptido dado. Asimismo, un polipéptido dado puede
contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden
estar ramificados como resultado de la ubicuidad, y pueden ser
cíclicos con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos,
ramificados y cíclicos ramificados pueden proceder de los procesos
naturales tras la traducción o pueden realizarse por procedimientos
de síntesis. Las modificaciones incluyen la acetilación, acilación,
ribosilación de ADP, amidación, enlace covalente de flavina, enlace
covalente de un resto hem, enlace covalente de un nucleótido o de un
derivado nucleotídico, enlace covalente de un lípido o derivado
lipídico, enlace covalente de fosfotidilinositol, reticulación,
ciclación, formación del enlace disulfuro, desmetilación, formación
de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de
piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación,
glucosilación, formación del anclaje GPI, hidroxilación, yodación,
metilación, miristoilación, oxidación, tratamiento proteolítico,
fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación,
sulfonación, adición mediada por ARN de transferencia de amino de
aminoácidos a proteínas tal como arginilación, y ubiquitinación.
Véase, por ejemplo, PROTEINS-STRUCTURE AND
MOLECULAR PROPERTIES, 2ª Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman y
Comany, Nueva York, 1993 y Wolf, F., Posttranslational Protein
Modifications: Perspectives and Prospects, págs.
1-12 en POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF
PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, 1983;
Seifter et al., "Analysis for protein modifications and
nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182:
626-646 y Rattan et al., "Protein
Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann.
NY. Acad. Sci. (1992) 663: 48-62.
"Polinucleótido" se refiere generalmente a
cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que
puede ser ARN o ADN no modificados o ARN o ADN modificados. Los
"polinucleótidos" incluyen, sin limitación ADN mono y
bicatenario, ADN que es una mezcla de zonas mono y bicatenarias, ARN
mono y bicatenario y ARN que es una mezcla de zonas mono y
bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden
ser monocatenarios o, más típicamente, bicatenarios o una mezcla de
zonas mono y bicatenarias. Además, "polinucleótido" se refiere
a zonas tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto a ARN como a
ADN. El término Polinucleótido también incluye los ADN o los ARN
que contienen una o más bases modificadas y los ADN o los ARN con
ejes centrales modificados por estabilidad o por otras razones. Las
bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y
bases no habituales tal como inosina. Se ha introducido una variedad
de modificaciones en el ADN y ARN; de este modo,
"Polinucleótido" comprende formas modificadas química,
enzimática o metabólicamente de polinucleótidos tal como se
encuentran por regla general en la naturaleza, así como las formas
químicas de ADN y ARN características de virus y células.
"Polinucleótido" también comprende polinucleótidos
relativamente cortos, con frecuencia denominados
oligonucleótidos.
"Variante", como se utiliza el término en
la presente memoria, es un Polinucleótido o polipéptido que se
diferencia de un polinucleótido o polipéptido de referencia
respectivamente, pero que conserva propiedades esenciales. Una
variante típica de un polinucleótido se diferencia en la secuencia
nucleotídica de otro, polinucleótido de referencia. Los cambios en
la secuencia nucleotídica de la variante pueden o no alterar la
secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el
polinucleótido de referencia. Los cambios nucleotídicos pueden
producirse en sustituciones, adiciones, eliminaciones, fusiones y
truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la
secuencia de referencia, como se expone a continuación. Una variante
típica de un polipéptido se diferencia en la secuencia de
aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las
diferencias están limitadas de modo que las secuencias del
polipéptido de referencia y de la variante son muy similares en
general y, en muchas zonas idénticas. Una variante y un polipéptido
de referencia pueden diferenciarse en la secuencia de aminoácidos
en una o más sustituciones (preferentemente conservadoras),
adiciones, eliminaciones en cualquier combinación. Un resto de
aminoácido sustituido o insertado puede o no ser codificado por el
código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido
puede ser el que se produce en la naturaleza tal como una variante
alélica, o puede ser una variante que no se conoce que se produzca
en la naturaleza. Las variantes no naturales de polinucleótidos y
polipéptidos pueden prepararse por técnicas de mutagénesis o por
síntesis directa. Las variantes deberían conservar una o más de las
actividades biológicas del polipéptido de referencia. Por ejemplo,
deberían tener actividades antigénicas o inmunogénicas similares
como el polipéptido de referencia. La antigenicidad puede probarse
utilizando experimentos de inmunotransferencia habituales,
preferentemente utilizando sueros policlonales contra el polipéptido
de referencia. La inmunogenicidad puede probarse midiendo las
respuestas del anticuerpo (utilizando sueros policlonales generados
contra el polipéptido variante) contra el polipéptido de referencia
purificado en un ensayo ELISA normalizado. Preferentemente, una
variante conservaría todas las actividades biológicas
anteriores.
"Identidad" es una medida de la identidad
de las secuencias nucleotídicas o de las secuencias de aminoácidos.
En general, las secuencias se alinean de modo que se obtiene la
igualdad de orden superior. "Identidad" tiene un significado
por sí mismo reconocido en la técnica y puede calcularse utilizando
las técnicas publicadas. Véase, p. ej.: (COMPUTATIONAL MOLECULAR
BIOLOGY, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988;
BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D.W., ed.,
Academic Press, Nueva York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE
DATA, PART I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press,
Nueva Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von
Heijne, G., Academic Press, 1987; y SEQUENCE ANALYSIS PRIMER,
Gribskov, M. y Devereux, J. eds., M. Stockton Press, Nueva York,
1991). Aunque existen numerosos procedimientos para medir la
identidad entre dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas,
el término "identidad" es bien conocido por los expertos en
lamateria (Carillo, H. y Lipton, D., SIAM J. Applied Math.
(1998) 48: 1073). Los procedimientos utilizados normalmente para
determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen,
pero no se limitan a, los descritos en Guide to Huge Computers,
Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo,
H., y Lipton, D., SIAM J. Applied Math. (1988) 48: 1073. Los
procedimientos para determinar la identidad y similitud están
codificados en programas informáticos. Los procedimientos de
programas informáticos preferidos para determinar la identidad y
similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan al
paquete del programa GCG (Devereux, J., et al., J. Molec.
Biol. (1990) 215: 403). Todavía más preferentemente, el
programa utilizado para determinar los niveles de identidad fue el
programa GAP, tal como se utilizó en los Ejemplos siguientes.
A título ilustrativo, mediante un polinucleótido
que presenta una secuencia nucleotídica que tiene por lo menos, por
ejemplo, el 95% de "identidad" con una secuencia nucleotídica
de referencia se pretende que la secuencia nucleotídica del
polinucleótido sea idéntica a la secuencia de referencia con la
excepción de que la secuencia polinucleotídica puede incluir un
promedio de hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100
nucleótidos de la secuencia nucleotídica de referencia. Es decir,
para obtener un polinucleótido que presenta una secuencia
nucleotídica de por lo menos el 95% idéntica a una secuencia
nucleotídica de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la
secuencia de referencia puede eliminarse o sustituirse por otro
nucleótido, o un número de nucleótidos hasta el 5%, de los
nucleótidos totales en la secuencia de referencia puede insertarse
en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de
referencia pueden producirse en las posiciones terminales 5' o 3'
de la secuencia nucleotídica de referencia o en cualquier parte
entre las posiciones terminales, interdispersadas individualmente
entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más
grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
La presente invención se refiere a proteínas (o
polipéptidos) segregadas por las glándulas salivales de I.
ricinus. Estos polipéptidos incluyen los polipéptidos
codificados por los ADNc definidos en la tabla; así como los
polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos codificada
por los ADNc definidos en la tabla; y a los polipéptidos que
comprenden la secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos el
75% de identidad con la codificada por los ADNc definidos en la
tabla por encima de su longitud completa, y preferentemente por lo
menos 80% de identidad, y más preferentemente por lo menos 90% de
identidad. Los que presentan del 95 al 99% son muy preferidos.
Los polipéptidos de la glándulas salivales de
I. ricinus pueden estar en forma de proteínas "madura" o
pueden formar parte de una proteína mayor tal como una proteína de
fusión. Puede presentar ventajas incluir una secuencia de
aminoácidos adicional que contenga secuencias secretoras o líderes,
prosecuencias, secuencias que ayudan a la purificación tales como
restos múltiples de histidina o una secuencia adicional para la
estabilidad durante la producción recombinante.
Los fragmentos de los polipéptidos de la
glándula salival de I. ricinus están también comprendidos en
la presente invención. Un fragmento es un polipéptido que presenta
una secuencia de aminoácidos que es la misma como parte, pero no
toda, de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de las
glándulas salivales de I. ricinus mencionados anteriormente.
Como en los polipéptidos de las glándulas salivales de I.
ricinus, el fragmento puede estar
"libre-estático" o comprimido dentro de un
polipéptido mayor del que forman una parte o zona, aún más
preferentemente como una zona continua individual. Ejemplos
representativos de fragmentos de polipéptido de la invención,
incluyen, por ejemplo, fragmentos de aproximadamente el aminoácido
número 1-20, 21-40,
41-60, 61-80, 81-100
y 101 hasta el final del polipéptido. En este contexto
"aproximadamente" comprende los intervalos descritos
particularmente o más pequeños por varios aminoácidos 5, 4, 3, 2 ó 1
en uno de los extremos o en ambos extremos.
Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo,
polipéptidos de truncamiento que presentan la secuencia de
aminoácidos de los polipéptidos de las glándulas salivales de I.
ricinus, excepto para la eliminación de una serie continua de
restos que incluye el terminal amino, o una serie continua de restos
que incluye el terminal carboxilo y/o la zona transmembranaria o la
eliminación de dos series continuas de restos, una que incluye el
terminal amino y la otra que incluye el terminal carboxilo. Asimismo
se prefieren los fragmentos caracterizados por atributos
estructurales o funcionales tales como los fragmentos que comprenden
la hélice alfa y las zonas que forman la hélice alfa, lámina beta y
las zonas que forman la lámina beta, las zonas curvas y que forman
curva, las zonas de enrollamiento y que forman enrollamiento, zonas
hidrófilas, zonas hidrófobas, zonas alfa anfipáticas, zonas beta
anfipáticas, zonas flexibles, zonas que forman superficie, zona de
enlace al sustrato y zonas de índice antigénico elevado. Otros
fragmentos preferidos son los fragmentos biológicamente activos.
Los fragmentos biológicamente activos son los que median la
actividad de la proteína de la glándula salival de I.
ricinus, incluyendo los que tienen una actividad similar o una
actividad mejorada, o con una actividad disminuida indeseable.
También están incluidos los que son antigénicos o inmunógenos en el
animal o en una persona.
Preferentemente, todos estos fragmentos de
polipéptido conservan partes de la actividad biológica (por ejemplo
antigénica o inmunógena) de los polipéptidos de las glándulas
salivales de I. ricinus, incluyendo la actividad antigénica.
Las variantes de la secuencia definida y de los fragmentos también
forman parte de la presente invención. Las variantes preferidas son
las que varían procedentes de las referencias mediante sustituciones
de aminoácido conservadoras, es decir, las que sustituyen un resto
por otro de características similares. Dichas sustituciones típicas
están entre Ala, Val, Leu e Ile, entre Ser y Thr; entre los restos
ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln, y entre los restos básicos Lys y
Arg; o los restos aromáticos Phe y Tyr. Son particularmente
preferidas las variantes en las que se sustituyen varios aminoácidos
5-10, 1-5 o 1-2, se
eliminan o se añaden en cualquier combinación. La mayoría de las
variantes preferidas son las variantes alélicas naturales del
polipéptido de las glándulas salivales de I. ricinus
presentes en las glándulas salivales de I. ricinus.
Los polinucleótidos de las glándulas salivales
de I. ricinus de la invención pueden prepararse de cualquier
manera adecuada. Dichos polipéptidos incluyen los polipéptidos
naturales aislados, los polipéptidos producidos de manera
recombinante, los polipéptidos producidos por síntesis o los
polipéptidos producidos por una combinación de estos procedimientos.
Los medios para preparar dichos polipéptidos son bien comprendidos
en la técnica.
Otro aspecto de la invención se refiere a los
ADNc (polinucleótidos) de las glándulas salivales de I.
ricinus. Éstos incluyen los polinucleótidos aislados que
codifican los polipéptidos y fragmentos de las glándulas salivales
de I. ricinus respectivamente, y los polinucleótidos
estrechamente relacionados con éstos. Más específicamente, los ADNc
de las glándulas salivales de I. ricinus de la invención
incluyen un polinucleótido que comprende la secuencia nucleotídica
de los ADNc definida en la tabla, que codifica un polipéptido de las
glándulas salivales de I. ricinus. Los ADNc de las glándulas
salivales de I. ricinus incluyen además una secuencia
polinucleotídica que presenta por lo menos el 75% de identidad
sobre su longitud completa con una secuencia nucleotídica que
codifica el polipéptido de las glándulas salivales de I.
ricinus codificado por los ADNc definidos en la tabla, y un
polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que es por
lo menos 75% idéntica a la de los ADNc definidos en la tabla. A
este respecto, los polinucleótidos por lo menos 80% idénticos son
particularmente preferidos, y los que presenta por lo menos el 90%
son especialmente preferidos. Además, los que presentan por lo
menos el 95% son muy preferidos y los que presentan por lo menos del
98 al 99% son los más preferidos, siendo por lo menos el 99% los
más preferidos. Asimismo están incluidos en los ADNc de las
glándulas salivales de I. ricinus una secuencia nucleotídica
que tiene suficiente identidad con una secuencia nucleotídica del
ADNc definido en la tabla para hibridarse en condiciones útiles para
la ampliación o para su utilización como sonda o marcador. La
invención proporciona también polinucleótidos que son
complementarios con dichos ADNc de las glándulas salivales de I.
ricinus.
La secuencia nucleotídica que codifica el
polipéptido de la glándula salival de I. ricinus codificado
por los ADNc definidos en tabla puede ser idéntica a la secuencia
que codifica el polipéptido contenida en los genes definidos en la
tabla, o puede ser una secuencia, que como resultado de la
redundancia (degeneración) del código genético, codifica asimismo
el polipéptido codificado por los genes definidos en la tabla
respectivamente.
Cuando se utilizan los polinucleótidos de la
invención para la producción recombinante de un polipéptido de las
glándulas salivales de I. ricinus, el polinucleótido puede
incluir la secuencia de codificación del polipéptido maduro o de un
fragmento de la misma, por sí mismo; la secuencia de codificación
del polipéptido maduro o fragmento en el marco de lectura con otras
secuencias de codificación, tales como las que codifican una
secuencia principal o secretora, una secuencia de pre-, pro- o de
preproproteína, u otras partes del péptido de fusión. Por ejemplo,
puede codificarse una secuencia marcadora que facilita la
purificación de este polipéptido fusionado. En determinadas formas
de realización preferidas de este aspecto de la invención, la
secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina
como el proporcionado en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y descrita en
Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989)
86:821-824, o en una etiqueta HA, o es la
glutatión-s-transferasa. El
polinucleótido puede contener también secuencias no codificadoras 5'
y 3', tales como las secuencias transcritas y no traducidas,
señales de corte y empalme y de poliadenilación, secuencias de
fijación del ribosoma y secuencias que estabilizan el ARNm.
Las formas de realización más preferidas son las
variantes de la proteína de glándulas salivales de I. ricinus
que codifican polinucleótidos que comprenden las secuencias de
aminoácidos del polipéptido de las glándulas salivales de I.
ricinus codificado por los ADNc definidos por la tabla
respectivamente en las que varios restos de aminoácidos
10-25, 5-10, 1-5,
1-3, 1-2 ó 1 están sustituidos,
eliminados o añadidos, en cualquier combinación. Los
polinucleótidos variantes más preferidos son las secuencias de I.
ricinus naturales que codifican variantes alélicas de las
proteínas de las glándulas salivales de I. ricinus en
I. ricinus.
La presente invención se refiere además a
polinucleótidos que se hibridan a las secuencias descritas
anteriormente en la presente memoria. A este respecto, la presente
invención se refiere especialmente a polinucleótidos que se
hibridan en condiciones severas con los polinucleótidos descritos
anteriormente en la presente memoria. Tal como se utiliza en la
presente memoria, la expresión "condiciones severas" significa
que la hibridación se producirá solamente si existe por lo menos el
80%, y preferentemente por lo menos el 90%, y más preferentemente
por lo menos el 95%, incluso aún más preferentemente del 97 al 99%
de identidad entre las secuencias.
Los polinucleótidos de la invención que son
idénticos o suficientemente idénticos a una secuencia nucleotídica
de cualquier gen definida en la tabla o a un fragmento de la misma,
pueden utilizarse como sondas de hibridación para los clones de
ADNc que codifican los polipéptidos de la glándula salival de I.
ricinus respectivamente y para aislar los clones del ADNc de
otros genes (incluyendo los homólogos y ortólogos que codifican los
ADNc de otras especies aparte de I. ricinus) que presentan
una gran similitud de secuencia con los ADNc de la glándula salival
de I. ricinus. Dichas técnicas de hibridación son conocidas
por los expertos en la materia. Por regla general estas secuencias
nucleotídica son 80% idénticas, preferentemente 90% idénticas, más
preferentemente 95% idénticas a las de la referencia. Las sondas
generalmente comprenderán por lo menos 15 nucleótidos
preferentemente, dichas sondas tendrán por lo menos 30 nucleótidos y
podrán tener por lo menos 50 nucleótidos. Particularmente las
sondas preferidas estarán comprendidas entre 30 y 50 nucleótidos. En
una forma de realización, para obtener un polinucleótido que
codifica el polipéptido de las glándulas salivales de I.
ricinus, incluyendo los homólogos y ortólogos de otras especies
aparte de I. ricinus, comprende las etapas de cribado de un
banco apropiado en condiciones de hibridación severas con una sonda
marcada que presenta una secuencia nucleotídica contenida en una de
las secuencias génicas definidas por la tabla, o un fragmento de la
misma; y aislar los clones del ADNc completo que contienen dicha
secuencia polinucleotídica. Por lo tanto en otro aspecto, los
polinucleótidos de las glándulas salivales de I. ricinus de
la presente invención incluyen además una secuencia nucleotídica
que comprende una secuencia nucleotídica que se hibrida en
condiciones severas a una secuencia nucleotídica que presenta una
secuencia nucleotídica contenida en los ADNc definidos en la tabla,
o un fragmento de la misma. Asimismo están incluidos con los
polipéptidos de las glándulas salivales de I. ricinus los
polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos codificadas
por las secuencias nucleotídicas obtenidas en las condiciones de
hibridación anteriores. Dichas técnicas de hibridación son bien
conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de
hibridación severas son tales como las definidas anteriormente o,
alternativamente, en condiciones de incubación durante la noche a
42ºC en una solución que comprende: formamida al 50%, 5\times SSC
(NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH
7,6), 5\times solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y
20 microgramos/ml desnaturalizado, ADN de esperma de salmón
despojado, seguido del lavado de los filtros en 0,1\timesSSC a
aproximadamente 65ºC.
Los polinucleótidos y polipéptidos de la
presente invención pueden utilizarse como reactivos de investigación
y materiales para el descubrimiento de los tratamientos y
diagnósticos para enfermedades animales y humanas.
La presente invención se refiere también a la
utilización de los polipéptidos de las glándulas salivales de I.
ricinus o a los polinucleótidos de las glándulas salivales de
I. ricinus, para su utilización como reactivos de
diagnóstico.
Los materiales para diagnóstico pueden obtenerse
a partir de las células del paciente, tales como de la sangre,
orina, saliva, biopsia tisular.
Por lo tanto en otro aspecto, la presente
invención se refiere a un kit para diagnóstico para una enfermedad o
propensión a una enfermedad que comprende:
(a) un polinucleótido de las glándulas salivales
de I. ricinus, preferentemente la secuencia nucleotídica de
una de las secuencias génicas definidas en la tabla o un fragmento
de las mismas;
(b) una secuencia nucleotídica complementaria
con la de (a);
(c) un polipéptido de las glándulas salivales de
I. ricinus, preferentemente el polipéptido codificado por una
de las secuencias génicas definidas en la tabla o un fragmento de
las mismas;
(d) un anticuerpo contra un polipéptido de las
glándulas salivales de I. ricinus, preferentemente el
polipéptido codificado por una de las secuencias génicas definidas
en la tabla; o
(e) un fago que presenta un anticuerpo contra un
polipéptido de las glándulas salivales de I. ricinus,
preferentemente el polipéptido codificado por una de las secuencias
de los ADNc definidas en la tabla.
Se valorará que en cualquiera de dichos kits,
(a), (b), (c), (d) o (e) puede comprender un componente básico.
Los anticuerpos del polipéptido de las glándulas
salivales anti-I. ricinus pueden comprender anticuerpos
policlonales. Los métodos de preparación de anticuerpos policlonales
son conocidos por los expertos en la materia. Los anticuerpos
policlonales pueden producirse en un mamífero por ejemplo, mediante
una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un
adyuvante. Por regla general, el agente inmunizante y/o el adyuvante
se inyectarán en el mamífero mediante múltiples inyecciones
subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede
incluir el polipéptido de las glándulas salivales de I.
ricinus o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil
conjugar el agente inmunizante con una proteína conocida que es
inmunógena en el mamífero que se está inmunizando. Ejemplos de
dichas proteínas inmunógenas incluyen pero no se limitan a la
hemocianina de la lapa californiana, la albúmina del suero, la
tiroglobulina y el inhibidor de tripsina de la soja. Ejemplos de
adyuvantes que pueden emplearse incluyen el adyuvante completo de
Freund y el adyuvante MPL TDM. El protocolo de inmunización puede
ser seleccionado por un experto en la materia sin excesiva
experimentación.
Los anticuerpos contra el polipéptido de las
glándulas salivales anti-I. ricinus pueden ser,
alternativamente, anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos
monoclonales pueden prepararse utilizando procedimientos de
hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein,
Nature, 256:495 (1975). En un procedimiento de hibridoma, un
ratón, hámster u otro animal hospedador apropiado, se inmuniza por
regla general con un agente inmunizante para producir linfocitos
que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán
específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los
linfocitos pueden ser inmunizados in vitro.
El agente inmunizante incluirá por regla general
el polipéptido de las glándulas salivales de I. ricinus o
una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se utilizan
linfocitos de la sangre periférica ("PBL") si se desean
células de origen humano o se utilizan células de bazo o células de
ganglio linfático si se desean fuentes de mamífero no humano. Los
linfocitos se fusionan a continuación con una estirpe celular
inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como
polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice Academia Press,
(1986) págs. 59-103). Las estirpes celulares
inmortalizadas son habitualmente células de mamífero transformadas,
específicamente células de mieloma de roedor, bovino y de origen
humano. Normalmente, se emplean estirpes celulares de mieloma de
rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un
medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más
sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las
células inmortalizadas, no fusionadas. Por ejemplo, si las células
precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil
transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas
por regla general incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina
("medio HAT"), cuyas sustancias impiden el crecimiento de
células insuficientes en HGPRT.
Las estirpes celulares inmortalizadas preferidas
son las que se fusionan de manera eficaz, soportan la expresión de
alto nivel estable del anticuerpo por las células productoras de
anticuerpo seleccionado y son sensibles a un medio tal como el
medio HAT. Las estirpes celulares inmortalizadas más preferidas son
las estirpes de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo,
en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego,
California y la American Type Culture Collection, Rockville,
Maryland. Las estirpes celulares de mieloma humano y de
heteromieloma de ratón-humano han sido descritas
también para la producción de anticuerpos monoclonales humanos
(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al.,
Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications Marcel
Dekker, Inc., Nueva York, (1987) págs. 51-63).
En el medio de cultivo en el que se cultivan las
células de hibridoma puede analizarse a continuación la presencia
de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido de las
glándulas salivales de I. ricinus. Preferentemente, la
especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos
por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o
por un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoanálisis
(RIA) o el ensayo inmunoabsorbente con enzima ligada (ELISA).
Dichas técnicas y análisis son conocidos en la técnica. La afinidad
de unión o del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por
ejemplo, por el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal.
Biochem., 107:220 (1980).
Una vez las células de hibridoma deseadas están
identificadas, pueden subclonarse limitando los procedimientos de
dilución y crecimiento por procedimientos normalizados (Goding,
anteriormente). Los medios de cultivo adecuados para este fin
incluyen, por ejemplo, Medio de Eagle Modificado por Dulbecco y
medio RPMI-1640. Alternativamente las células de
hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un
mamífero.
Los anticuerpos monoclonales segregados por los
subclones pueden aislarse o purificarse del medio de cultivo o del
fluido de ascitis por procedimientos convencionales de purificación
de inmunoglobulina tal como, por ejemplo, proteína
A-Sepharose, cromatografía con hidroxiapatito,
electroforesis en gel, diálisis o cromatografía por
afinidad.
afinidad.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse
asimismo por procedimientos de ADN recombinante, tales como los
descritos en la patente U.S. nº 4.816.567. El ADN que codifica los
anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse fácilmente
y secuenciarse utilizando procedimientos convencionales (p. ej.,
utilizando sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse
específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera
de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención
sirven como fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN
puede colocarse en vectores de expresión, que se transfieren a
continuación a células hospedadoras tales como las células COS de
simio, las células de ovario de hámster chino (CHO) o células de
mieloma que no producen de otro modo la proteína inmunoglobulina,
para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células
hospedadoras recombinantes. El ADN puede modificarse también, por
ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación por los dominios
constantes de las cadenas pesada y ligera en lugar de las secuencias
murinas homólogas (patente U.S. nº 4.816.567; Morrison et
al., anteriormente) o por enlace covalente con la secuencia de
codificación de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de
codificación para un polipéptido distinto de inmunoglobulina. Dicho
polipéptido distinto de inmunoglobulina puede ser sustituido por
los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede
ser sustituido por los dominios variables de una secuencia de
combinación con el antígeno de un anticuerpo de la invención para
crear un anticuerpo bivalente híbrido.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos
monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un
procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera
de inmunoglobulina y de la cadena pesada modificada. La cadena
pesada está truncada generalmente en cualquier punto en la zona Fc
de modo que impide la reticulacion de la cadena pesada.
Alternativamente, los restos de cisteína pertinentes se sustituyen
con otros restos de aminoácidos o se eliminan con el fin de impedir
la reticulación.
Los procedimientos in vitro son también
adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de
anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente,
fragmentos Fab, puede llevarse a cabo utilizando técnicas de rutina
conocidas en la técnica.
Como alternativa o suplemento para inmunizar un
mamífero con un péptido, puede obtenerse un anticuerpo específico
para una proteína obtenida a partir de un banco producido de manera
recombinante de los dominios variables de la inmunoglobulina
expresada, p. ej. utilizando el bacteriófago lambda o el
bacteriófago filamentoso que presentan dominios de uniones de
inmunoglobulina funcional en sus superficies; por ejemplo, véase el
documento WO 92/01047. El banco puede ser natural, es decir
construido de las secuencias obtenidas a partir de un organismo que
no ha sido inmunizado con ninguna de las proteínas (o fragmentos) o
puede ser el construido utilizando secuencias obtenidas a partir de
un organismo que ha sido expuesto al antígeno de interés.
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Otro aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento para provocar una respuesta inmunológica en un
mamífero que comprende inocular al mamífero con el polipéptido de
las glándulas salivales de I. ricinus o fragmentos
portadores del epítopo, análogos, vesículas de la membrana externa o
células (atenuadas o de otro modo), adecuados para producir el
anticuerpo y/o la respuesta inmunitaria a los linfocitos T para
proteger dicho animal de las bacterias y virus que podrían
transmitirse durante la alimentación de sangre de I. ricinus
y especies relacionadas. En particular la invención se refiere a la
utilización de los polipéptidos de las glándulas salivales de I.
ricinus codificados por los ADNc definidos en la tabla. Aún otro
aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de producción
de la respuesta inmunológica en un mamífero que comprende,
administrar el polipéptido de las glándulas salivales de I.
ricinus mediante un vector que dirige la expresión del
polinucleótido de las glándulas salivales de I. ricinus in
vivo con objeto de producir dicha respuesta inmunológica para
producir el anticuerpo que proteja a dicho animal de las
enfermedades (enfermedad de Lyme, enfermedad del virus de la
encefalitis de la garrapata,....).
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición inmunológica o formulación de vacuna que, cuando se
introduce en un hospedador animal, produce una respuesta
inmunológica en este mamífero contra un polipéptido de las
glándulas salivales de I. ricinus en el que la composición
comprende un ADNc de la glándula salival de I. ricinus o u
polipéptido de la glándula salival de I. ricinus o fragmentos
que llevan el epítopo, análogos, vesículas de la membrana externa o
células (atenuadas o de otro modo), la formulación de la vacuna
puede comprender además un vehículo adecuado. La composición de la
vacuna con polipéptido de las glándulas salivales de I.
ricinus se administra preferentemente por vía oral o parenteral
(incluyendo la inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa,
intradérmica, etc.). Las formulaciones adecuadas para la
administración parenteral incluyen las soluciones de inyección
esterilizada acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes,
tampones, bacterioestáticos y solutos que hacen la formulación
resulte iotónica con la sangre del receptor; y suspensiones
esterilizadas acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de
suspensión o agentes de espesamiento. Las formulaciones pueden
presentarse en recipientes para dosis unitaria o multidosis, por
ejemplo, ampollas y viales sellados y pueden almacenarse en un
estado liofilizado que requiere solamente la adición del vehículo
líquido esterilizado inmediatamente antes de su uso. La formulación
de la vacuna puede incluir también sistemas adyuvantes para
potenciar la inmunogenicidad para la formulación, tales como los
sistemas aceite en agua y otros sistemas conocidos en la técnica.
La dosis dependerá de la actividad específica de la vacuna y puede
ser determinada fácilmente por experimentación de rutina.
Todavía otro aspecto se refiere a una
formulación inmunológica de vacuna que comprende el polinucleótido
de la invención. Dichas técnicas son conocidas en la técnica, véase
por ejemplo Wolff et al., Sciences, (1990) 247:
1465-8.
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Otro aspecto de la invención se refiere a la
utilización de estos polipéptidos de las glándulas salivales de
I. ricinus como agente terapéutico. Al considerar las áreas
terapéuticas potenciales específicas para los probables productos,
las disciplinas hospitalarias cubiertas por estos productos son:
hematología (particularmente estudios clínicos de coagulación),
trasplante (para control de la inmunodepresión), reumatología (para
antiinflamatorios) y tratamiento general (para anestésicos
específicos o mejorados).
\newpage
Las secuencias completas de los clones S
seleccionados se compararon con las bases de datos de EMBL/GenBank
utilizando los algoritmos tFasta y Blastp. En estas secuencias se
analizó la presencia de una secuencia de consenso Kozak indicada en
la columna titulada "nucleótido en posición -3". Aplicando el
algoritmo del programa GCG* se analizó la presencia de las unidades
de proteína específica o motivos (motivo de algoritmo) y la
presencia de una secuencia peptídica señal (análisis de von Heijne y
McGeoch) en las secuencias amino deducidas.
Las glándulas salivales de garrapatas Ixodes
ricinus adultas hembra patógenas de 5 días saciadas o no
alimentadas exentas de patógenos se utilizaron en este trabajo. Al
extirparlas, estas glándulas se congelaron inmediatamente en
nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC. Para extraer los ARN
mensajeros (ARNm), se machacaron las glándulas salivales en
nitrógeno líquido utilizando un mortero y una mano de mortero. Los
ARNm se purificaron utilizando una oligo-dT
celulosa (kit Fast Track 2.0, Invitrogen, Groningen, Holanda). Se
extrajeron dos microgramos de los ARNm procedentes de 200 glándulas
salivales de garrapatas alimentadas; y 1,5 \mug de los ARNm se
extrajeron también de 1.000 glándulas salivales de garrapatas sin
alimentar.
Se realizaron todos los procedimientos descritos
por Hubank y Schatz (1994). Se sintetizaron los ADNc de doble
cadena utilizando el Superscript Choice System (Life Technologies,
Rockville, Maryland, EUA). Los ADNc se digirieron con enzima de
restricción DpnII, se ligaron a enlazadores R, se ampliaron con
cebadores R-24 (Hubank y Schatz, 1994) y por último
se digirieron de nuevo con la misma enzima para generar un grupo
"probador" de los ADNc procedente de las glándulas salivales
de las garrapatas alimentadas y un grupo "conductor"
constituido por los ADNc de las glándulas salivales de las
garrapatas sin alimentar. La primera ronda del procedimiento de
hibridación sustractivo utilizó una relación probador/conductor de
1:100. Las segunda y tercera rondas utilizaron unas relaciones de
1:400 y 1:200.000, respectivamente. Después de tres ciclos de
sustracción y ampliación, se subdividieron los productos
diferenciados digeridos con Dpn-II según el
tamaño en 4 fracciones diferentes en un gel de agarosa de
electroforesis al 1,7% y se subclonaron en la secuencia BamHI del
vector de clonación pTZ19r. El producto ligado se utilizó para
transformar las células competentes TOP-10 de E.
coli (Invitrogen, Groningen, Holanda). Nueve mil seiscientos
clones de este banco sustractivo se seleccionaron al azar y se
colocaron individualmente en 100 microplacas y se almacenaron a
-80ºC. Este banco sustractivo se analizó secuenciando 89 clones
seleccionados al azar, utilizando cebadores M13 directos e inversos
específicos para una zona situada en el vector de clonación pTI9r.
Se compararon las secuencias de ADN de estos 89 clones y se
identificaron 27 secuencias familiares distintas. La homología de
estas secuencias con las secuencias existentes en las bases de
datos se presenta en la Tabla 1. Las secuencias sustractivas 1 a 27
se presentan en el archivo de listado de secuencias (excepto para
las secuencias 16 y 24 cuyas secuencias de ARNm completo se
presentan; véase también el Ejemplo 2). Se seleccionaron estas
secuencias (Sec. 7, 16 y 24) para la caracterización adicional de
su correspondiente secuencia del ARNm completo. Estas 3 secuencias
eran iguales a la secuencia de i) el inhibidor de la serie de
reacciones del factor tisular humano (TFPI), ii) una proteína
metalopeptidasa dependiente del cinc del veneno de serpiente y iii)
la proteína del inhibidor de trombina humana, correspondiente a las
Sec. 7, 16 y 24 respectivamente. Estos genes codifican las proteínas
que podrían estar implicadas en la inhibición de la coagulación
sanguínea.
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Este banco se creó utilizando los ARNm extraídos
de las glándulas salivales de garrapatas saciadas. Se sometieron
los ARNm (80 ng) a transcripción inversa utilizando un cebador
oligo-dT degenerado
(5'-A(T)30VN-3'), el
oligonucleótido SmartTM (Clontech, Palo Alto, EUA) y la
transcriptasa inversa Superscript II (Life Technologies, Rockville,
Maryland, EUA). Se utilizó la mezcla de ADNc monocatenario como
plantilla en un análisis de PCR con inicio en caliente incluyendo
la LA Taq polimerasa (Takara, Shiga, Japón), el cebador
oligo-dT modificado y un cebador 3'-"Smart"
específico para una zona situada en el extremo 5' del
oligonucleótido SmartTM. El protocolo de PCR aplicado fue: 1 min. a
95ºC, seguido de 25 s. a 95ºC/5 min. a 68ºC, 25 veces y 10 min. a
72ºC. La mezcla del ADNc ampliado de doble cadena se purificó con
un concentrador Centricon 30 (Millipore, Bedford, EUA). Los ADNc se
dividieron en 4 fracciones comprendidas entre 0,3 y 0,6 kb, 0,6 a 1
kb, 1 kb a 2 kb y 2 kb a 4 kb en un gel de electroforesis en
agarosa de alta calidad al 0,8% y se recuperaron por separado
utilizando el kit de extracción Qiaex II (Qiagen, Hilden,
Alemania). Las 4 fracciones se ligaron individualmente en el vector
de clonación pCRII incluido en el kit de clonación TOPO (Invitrogen,
Groningen, Holanda). Las fracciones ligadas se utilizaron a
continuación para transformar las células XL2-Blue
ultracompetentes de E. coli (Stratagene, Heidelburg,
Alemania). Los clones recombinantes resultantes se almacenaron
individualmente en microplacas a -80ºC. Se seleccionaron al azar
diez clones para secuenciado parcial o completo. Como resultado de
este procedimiento, se seleccionaron 2 secuencias de ADNc (Sec. 28 y
Sec. 29, véase la Tabla 1) por su homología con las bases de datos
de secuencias. Una es íntimamente homóloga con una proteína de tipo
interferón (Sec. 28), mientras que la otra presenta homologías con
la proteína relacionada con el antígeno común al leucocito de
Rattus norvegicus (Sec. 29).
Las 4 fracciones diferentes del banco de ADNc
completo se cribaron con sondas de oligonucleótido marcadas con
radio específicas para los clones seleccionados identificados en el
banco de ADNc sustractivo. El marcado de estas oligosondas se llevó
a cabo como se describe en Current Protocols in Molecular Biology
(Ausubel et al.,1995, J. Wiley and sons, eds.). Estas 4
fracciones diferentes se colocaron a continuación en membranas de
nitrocelulosa y se cultivaron toda la noche a 37ºC. Estas membranas
se desnaturalizaron en NaOH 0,2 M/NaCl 1,5 M, se neutralizaron en
Tris 0,5 M pH 7,5-NaCl 1,5 M y se fijaron en
2\times SSC (NaCl 0,3 M/ácido cítrico trisódico dihidratado 0,03
M). Las membranas se calentaron durante 90 min. a 80ºC, se incubaron
en una solución de prehibridación (SSC 6\times, 10\times
Denhardt, SDS al 0,1%) a 55ºC durante 90 min. y finalmente se
colocaron durante la noche en una solución de hibridación
precalentada que contenía una sonda oligonucleotídica marcada con
radio específica a 55ºC. Las membranas hibridadas se lavaron 3 veces
en solución SSC 6\times a 55ºC durante 10 min., se secaron y se
expusieron a una película Kodak X-OMAT durante la
noche a -80ºC. El banco de ADNc completo se analizó también
secuenciando una serie de clones. Las secuencias de ADN resultantes
se compararon con las bases de datos ENBL/Gene Bank y se utilizaron
para crear sondas oligonucleotídicas destinadas a recuperar otros
clones correspondientes. De esta manera, se confirmó la secuencia de
ARNm de consenso completa de las Sec. 28 y 29 mediante la
recuperación de otros dos clones correspondientes a estas
secuencias. Únicamente se aisló un clon de ADNc completo
correspondiente al clon 16 sustractivo. Por consiguiente, para
identificar la secuencia completa de las Sec. 16 y 24, se aplicó el
procedimiento de los extremos del ADNc (RACE).
Se llevó a cabo la metodología RACE como
describe Frohman et al. (1995). La etapa de transcripción
inversa se realizó utilizando 10 ng de los ARNm extraídos de las
glándulas salivales de garrapatas saciadas y la transcriptasa
inversa Thermoscript (Life technologies, Rockville, Maryland, EUA).
Todos los cebadores específicos para el gen (GSP) presentaron una
longitud de 18 bases con una relación G/C del 61%. Los productos
ampliados se sometieron a una electroforesis en gel de agarosa y se
recuperaron utilizando un procedimiento de isotacoforesis. Los ADNc
se clonaron en un vector de clonación pCRII-TOPO
(Invitrogen, Groningen, Holanda). Para identificar la secuencia de
ADNc de consenso, se secuenciaron diferentes clones y su secuencia
se comparó con su correspondiente secuencia conocida. Por
consiguiente, las secuencias del ADNc completo de los clones 16 y 24
aisladas en el banco sustractivo se obtuvieron por este
procedimiento RACE (figura 1).
Las secuencias de los clones seleccionados (Sec.
7, 16, 24, 28 y 29) permitieron la identificación de los marcos de
lectura abierta, a partir de los cuales se dedujeron las secuencias
amino. Estos productos de traducción potencial tienen un tamaño
comprendido entre 87 y 489 aminoácidos (véase la tabla 2). Con
objeto de evaluar, mediante simulación informática, sus propiedades
respectivas, las secuencias de aminoácidos y las secuencias
nucleotídicas de dichos 5 marcos abiertos se compararon con las
bases de datos utilizando los algoritmos tFasta y Blastp. Con estas
comparaciones se demuestra que la Sec. 7 es muy homóloga con el
inhibidor de la serie de reacciones del factor tisular humano
(TFPI). El TFPI es un inhibidor de las serina proteasas que presenta
3 dominios del tipo del inhibidor de proteasa de Kunitz (KPI). Cada
una de estas unidades o motivos presenta una afinidad específica
para diferentes tipos de proteasas. El primer y segundo dominios de
KPI son sensibles a la inhibición respectiva de los factores de
coagulación VIIa y Xa. El tercer dominio de KPI aparentemente no
presenta actividad inhibidora. Debe observarse que la secuencia
codificada por el clon de la Sec. 7 es homóloga con la región del
primer dominio KPI de TFPI y que el KPI se mantiene perfectamente en
éste. Esta similitud sugiere que la proteína de la Sec. 7 es un
inhibidor potencial del factor VIIa.
La secuencia amino deducida del clon de la Sec.
28 presenta una gran homología con 3 secuencias de la base de
datos, a saber: proteína TIS7 de ratón, proteína PC4 de rata y
proteína SKMc 15 humana. Estas 3 proteínas se describen como
factores supuestos de tipo interferón. Poseen zonas muy bien
conservadas de la proteína B2 del interferón. Por consiguiente, se
propone que la proteína de la Sec. 28 presenta actividad
inmunomoduladora.
Se compararon las secuencias 16 y 24 con las
bases de datos presentando de este modo su homología respectivamente
con la metalopeptidasa M12b de Gloydius halys (suborden de
ofidios) y el inhibidor de elastasa porcina que pertenece a la
superfamilia de los inhibidores de serina proteasa (Serpin). Las
secuencias amino de estos 2 clones también presentan unidades
específicas de dichas familias. Se propone que dichas proteínas
tengan propiedades anticoagulantes e inmunomoduladoras.
Por último, el clon de la Sec. 29 presenta una
homología débil con el antígeno común al leucocito de R.
norvegicus (LAR). Esta última es una molécula de adhesión. Por
lo tanto es posible que la proteína de la Sec. 29 presente
propiedades inmunomoduladoras relacionadas con las expresadas por la
proteína LAR.
Debido a sus propiedades potenciales, es de
esperar que la mayoría de las proteínas examinadas sean segregadas
en la saliva de garrapata durante la alimentación de sangre. Por
consiguiente, se hicieron pruebas para hallar la presencia de un
péptido señal al comienzo de las secuencia amino deducidas. Todos
los resultados por el procedimiento de análisis de von Heijne
fueron positivos. Las secuencias del péptido señal se detectaron por
el procedimiento de McGeoch para las secuencias amino deducidas de
las Sec. 7, 16, 24 y 29. Parece que dichas proteínas se segregan en
la glándula salival de la garrapata. Además, se observó la presencia
de una secuencia de consenso Kozak corriente arriba de las
secuencias de codificación de todos los clones examinados. Esto
indica que sus ARNm podrían traducirse potencialmente a
proteínas.
Se evaluó la expresión diferenciada de los ARNm
correspondiente a los 5 clones completos seleccionados (Sec. 7, 16,
24, 28 y 29) y de 9 clones sustractivos utilizando análisis de PCR y
de RT-PCR (figura 2).
Los análisis de PCR se realizaron utilizando
como plantilla de ADN los ADNc obtenidos de un procedimiento de
transcripción inversa en los ARNm extraídos de las glándulas
salivales de garrapatas saciadas o no alimentadas. Cada uno de los
análisis de PCR incluía un par de cebadores específicos para cada
diana sustractiva o la secuencia completa de los ADNc. Se
realizaron análisis de PCR en un volumen final de 50 \mul que
contenía cebadores 1 \muM, desoxinucleótido 0,2 mM (ATPd, GTPd,
GTPd y TTPd; Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Alemania), tampón
de PCR (Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM, MgCl_{2} 2,5
mM, pH 8,3) y 2,5 U de Taq ADN polimerasa (Boehringer Mannheim
GmbH, Mannheim, Alemania). Se ampliaron las muestras de ADN durante
35 ciclos en las condiciones siguientes: 94ºC durante 1 min.,
72ºC durante 1 min. y 64ºC durante 1 min., seguido de una etapa de
alargamiento final de 72ºC durante 7 min.
Se realizó el análisis RT-PCR en
los clones de ADNc completo seleccionados y en 5 clones sustractivos
de ADNc. Los ARNm utilizados como plantilla en el análisis de
transcripción inversa se extrajeron de las glándulas salivales de
garrapatas I. ricinus saciadas y no alimentadas. Los análisis
de transcripción inversa se realizaron utilizando un cebador
específico (esta diana uno las secuencias seleccionadas) y la
"Thermoscript Reverse transcriptase" (Life technologies,
Rockville, Maryland, EUA) a 60ºC durante 50 min. Cada análisis de
PCR utilizó el cebador específico de transcripción inversa y otro
cebador específico. Se realizaron análisis de PCR en un volumen
final de 50 \mul que contenía cebadores 1 \muM, desoxinucleótido
0,2 mM (ATPd, CTPd, GTPd y TTPd; Boehringer Mannheim GmbH,
Mannheim, Alemania), tampón de PCR (Tris-HCl 10 mM,
KCl 50 mM, MgCl_{2} 2,5 mM, pH 8,3) y 2,5 U de Expand High
Fidelity polymerase (Roche, Bruselas, Bélgica). Las muestras de ADN
monocatenario se ampliaron durante 30 ciclos en las siguientes
condiciones: 95ºC durante 1 min., 72ºC durante 30 s. y 60ºC durante
1 min., seguido de una etapa de alargamiento final de 72ºC
durante 7 min. La figura 2 demuestra que la expresión de las
secuencias seleccionadas se produce en las glándulas salivales de
garrapatas saciadas de 5 días, excepto para la secuencia 28 que se
expresa a nivel similar en las glándulas salivales de garrapatas
saciadas y no alimentadas. La expresión de los demás ARNm podría
producirse específicamente o aumentarse durante la alimentación de
sangre.
El estudio de las propiedades de las secuencias
aisladas implica la expresión de las mismas en sistemas de
expresión que permiten grandes cantidades de proteínas codificadas
por estas secuencias para ser producidas y purificadas. Estos
experimentos se describen a continuación así como en el ejemplo
6.
Las secuencias de ADN de los 5 clones
seleccionados (Sec. 7, 16, 24, 28 y 29) se transfirieron al vector
de expresión p CDNA3.1-His/V5. Dicho vector permite
la expresión de las proteínas heterólogas fusionadas a una cola de
6 histidinas así como al epítopo V5 en células eucarióticas. Se
produjeron diferentes ADN por RT-PCR utilizando
cebadores específicos para los clones correspondientes. Estos
cebadores se construyeron con el fin de eliminar el codón de
terminación de cada marco o fase de lectura abierto con objeto de
permitir que la proteína se fusione a la cola 6\timesHIS/epítopo
V5. Además, los cebadores contenían secuencias de restricción
adaptadas a la clonación en el vector de expresión. Se tuvo cuidado
en utilizar, al amplificar, una polimerasa Pfu de alta fidelidad
(Promega).
Se midió la expresión transitoria de las
proteínas recombinantes Sec. 16 y 24 después de la transfección de
las construcciones Sec. 16 y Sec.
24-pCDNA3-1-His/V5
en células COSI, utilizando Fugen 6 (Boehringer). Se analizaron los
extractos de proteína del medio de cultivo correspondientes a los
periodos de 24, 48 y 72 horas tras la transfección en gel de
acrilamida tiñendo con azul Coomassie o por transferencia Western
utilizando por una parte un anticuerpo
anti-6\times histidina o por otra parte lechos de
quelato de níquel acoplados a fosfatasa alcalina. Estos análisis
presentaban la expresión de dichas proteínas en el medio de cultivo
celular.
Se decidió también expresar varias proteínas en
bacterias utilizando el vector pMAL-C2E (NEB). Dicho
vector expresa varias proteínas fusionadas con la proteína de unión
a la maltosa (MBP). La proteína de interés podría separarse de la
MBP entonces gracias a una secuencia que separa la MBP de la
proteína, siendo dicha secuencia específica para la proteasa
enterocinasa.
Con objeto de expresar de manera óptima las 5
secuencias examinadas, que utilizan el vector
pMAL-C2E, se construyeron los pares de cebador de
PCR complementarios con las 20 bases situadas corriente arriba del
codón de terminación y con 20 bases situadas corriente abajo del
ATG del marco de lectura abierto o de la fase. De esta manera, los
fragmentos de CDNA ampliados comprendían solamente la secuencia de
codificación del ARNm diana con su codón de terminación. La
proteína de interés se fusionó a MBP por su extremo terminal N. Por
otra parte, ya que estos cebadores contenían secuencias de
restricción específicas para la expresión del vector fue posible
efectuar la clonación directa de los ADNc. La utilización de Pfu ADN
polimerasa (Promega) hizo posible ampliar los ADNc sin tener que
temer por los errores introducidos en las secuencias ampliadas.
Las secuencias de codificación de los clones
Sec. 7, 16, 24 y 29 se reconstruyeron de esta manera. Las células
TG1 competentes de E. coli se transfirieron utilizando estas
construcciones. Las digestiones enzimáticas de estas
minipreparaciones del ADN plasmídico hizo posible comprobar que la
mayoría de lo clones Sec. 7, 16, 24 y
29-p-MALC2-E
efectivamente fueron recombinantes.
Partiendo de varias construcciones clonadas en
TGI de E. coli, se inició el estudio de la expresión de
proteínas recombinantes fusionadas con MBP para todas las secuencias
de interés (es decir, las Sec. 7, 16, 24 y 29) excepto para la Sec.
28. Se emprendió el cultivo de clones representativos de las Sec. 7,
16, 24 y 29 así como de referencias negativa (plásmidos no
recombinantes) para producir la expresión de proteínas
recombinantes en éstas. Estos cultivos se centrifugaron y los
sedimentos (fondos) se separaron del medio para ser puestos en
suspensión en Tris 15 mM pH 7,5 y se pasaron a la prensa francesa.
Los análisis de estas muestras por gel de acrilamida (10%)
coloreado con azul de Coomassie o por transferencia Western
utilizando anticuerpos anti-MBP de conejo, presentó
la expresión de proteínas recombinantes Sec. 7 (\sim50 kDa), Sec.
16 (\sim92 kDa), Sec. 24 (\sim80 kDa) y Sec. 29 (\sim67
kDa).
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas de las Sec. 7, 16 y 24 se
inyectaron en grupos de 4 ratones con objeto de producir anticuerpos
dirigidos contra dichas proteínas. El primer antígeno inyectado se
realizó con el adyuvante completo de Freund. Dos semanas después,
se puso una inyección de recuerdo con adyuvante incompleto de
Freund. Los sueros de los ratones inyectados con Sec. 16
proporcionaron pruebas positivas para los anticuerpos
anti-MBP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ganapamo et al, 1997:
Identification of an Ixodes ricinus salivary gland fraction through
its ability to stimulate CD4 T cells present in BALB/c mice lymph
nodes draining the tick fixation site. Ganapamo-F;
Rutti-B; Brossard-M.
Parasitology; 1997 julio; 115 (Pt 1):
91-6.
Ganapamo et al, 1995: In
vitro production of interleukin-4 and
interferon-gamma by lymph node cells from BALB/c
mice infested with nymphal Ixodes ricinus ticks.
Ganapamo-F; Rutti-B;
Brossard-M. Immunology; 1995 mayo;
85(1):120-4.
Ganapamo et al, 1996:
Immunosuppression and cytokine production in mice infested with
Ixodes ricinus ticks: a possible role of laminin and
interleukin-10 on the in vitro responsiveness
of lymphocytes to mitogens. Ganapamo-F;
Rutti-B; Brossard-M.
Immunology; 1996 febrero; 87 (2): 259-63.
Wikel et al. 1996: Host
immunity to ticks. Wikel-SK.
Annu-Rev-Entomol.;. 1996; 41:
1-22
Wikel y Brossard, 1997:
Immunology of interactions between ticks and hosts.
Brossard-M; Wikel-SK.
Med-Vet-Entomol.; 1997 julio;
11(3): 270-6.
De Silva et al, 1995:
Growth and migration of Borrelia burgdorferi in Ixodes ticks during
blooed feeding. Aravinda M De Silva, Erol Fikrig. Am. J. Trop.
Med. Hyg.; 53(4), 1995 páginas
397-4043.
Hubank y Schatz, 1994:
Identifying differences in mRNA expression by representational
difference analysis of cDNA. Hubank-M;
Schatz-DG.
Nucleic-Acids-Res.; 1994
diciembre 25; 22(25): 5640-8.
Frohman, 1995: Rapid amplification
of cDNA Ends. In PCR Primer. A laboratory manual (Dieffenbach, C. W.
y Dveksler, G. S., eds), páginas 381-409, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
(1) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 194 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 607 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 259 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 170 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 168 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 247 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(7) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 261 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- POSICIÓN: 1...261
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(8) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 292 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(9) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 270 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(10) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 316 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(11) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 241 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(12) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 636 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
(13) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 432 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(14) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 466 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(15) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 377 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
(16) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 1670 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- POSICIÓN: 54...1520
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(17) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 158 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
(18) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 146 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(19) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 140 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(20) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 143 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(21) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 140 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(22) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 144 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(23) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 95 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(24) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 1414 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- POSICIÓN: 143...1276
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(25) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 200 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(26) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 241 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(27) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 313 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(28) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 2417 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- POSICIÓN: 218...1495
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(29) INFORMACIONES PARA LA SEC. ID. nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- LONGITUD: 933 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (c)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.500000\baselineskip
- (d)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (a)
- DENOMINACIÓN/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (b)
- POSICIÓN: 32...853
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 29:
Claims (23)
1. Polinucleótido obtenido de una glándula
salival de garrapata y que presenta más del 75% de identidad con la
secuencia nucleotídica SEC. ID. nº: 24 o una secuencia
complementaria a la misma.
2. Polinucleótido según la reivindicación 1, que
presenta por lo menos el 80% de identidad con la secuencia
nucleotídica SEC. ID. nº: 24 o una secuencia complementaria a la
misma.
3. Polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2,
que es por lo menos 90% idéntico a la secuencia nucleotídica SEC.
ID. nº: 24 o una secuencia complementaria a la misma.
4. Polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 3, que es por lo menos 95% idéntico
a la secuencia nucleotídica SEC. ID. nº: 24 o una secuencia
complementaria a la misma.
5. Polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 4, que es por lo menos 98 a 99%
idéntico a la secuencia nucleotídica SEC. ID. nº: 24 o una secuencia
complementaria a la misma.
6. Polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 5, que es por lo menos 99% idéntico
a la secuencia nucleotídica SEC. ID. nº: 24 o una secuencia
complementaria a la misma.
7. Polinucleótido que presenta la secuencia
nucleotídica SEC. ID. nº: 24 o una secuencia complementaria a la
misma.
8. Polipéptido de la glándula salival de
garrapata codificado por el polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 7.
9. Polipéptido según la reivindicación 8,
modificado por o ligado a por lo menos un grupo de sustitución,
seleccionado preferentemente de entre el grupo constituido por
grupos amida, acetilo, fosforilo y/o glucosilo.
10. Polopéptido según la reivindicación 8 ó 9,
en forma de proteína "madura".
11. Polopéptido según la reivindicación 8 ó 9,
como parte de una proteína mayor.
12. Polopéptido según la reivindicación 8 ó 9,
como parte de una proteína de fusión.
13. Polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12 anteriores, que comprende además por lo
menos una secuencia adicional de aminoácidos que contiene secuencias
secretoras o líderes, prosecuencias, secuencias que ayudan a la
purificación tales como los restos de histidina múltiples, o
secuencias adicionales para la estabilidad durante la protección de
recombinación.
14. Vector que comprende por lo menos un
elemento seleccionado de entre el grupo constituido por el
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1
a 7 o el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores 8 a 13.
15. Estirpe celular transfectada por el vector
según la reivindicación 14.
16. Anticuerpo producido contra el polipéptido
de Ixodes ricinus según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores 8 a 13.
17. Estirpe celular de hibridoma que expresa el
anticuerpo según la reivindicación 16.
18. Composición farmacéutica que comprende un
vehículo farmacéutico adecuado y un elemento seleccionado de entre
el grupo constituido por el polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 7 o el polipéptido según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores 8 a 13.
19. Composición farmacéutica según la
reivindicación 18, que presenta propiedades inmunomoduladoras.
20. Composición inmnológica o vacuna para
provocar una respuesta inmunológica en un mamífero hospedador a un
polipéptido de la glándula salival de garrapata que comprende por lo
menos un elemento de entre el grupo constituido por:
a) un ADN de glándula salival de garrapata según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 7,
b) un polipéptido de glándula salival de
garrapata según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 8 a
13,
c) fragmentos que llevan epítopo, vesículas de
membrana externa o células (atenuadas o de otro modo) de los
componentes a) o b); y
d) posiblemente un vehículo.
21. Utilización de la composición inmnológica,
una vacuna según la reivindicación 20 o el vector según la
reivindicación 14, para la preparación de un medicamento para
producir un anticuerpo y/o la respuesta inmunitaria por linfocitos T
para proteger a un mamífero de las bacterias y virus transmitidos
durante la alimentación con sangre de Ixodes ricinus y de
especies relacionadas y en el tratamiento o la prevención de
enfermedades de Lyme o de enfermedades por el virus de la
encefalitis de la garrapata.
22. Kit de diagnóstico para detectar una
enfermedad o propensión a una enfermedad producida o transmitida por
garrapatas, especialmente Ixodes ricinus, que comprende:
a) un polinucleótido de la glándula salival de
Ixodes ricinus, según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores 1 a 7,
b) una secuencia nucleotídica complementaria a
la de (a),
c) un polipéptido de la glándula salival de
Ixodes ricinus, según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores 8 a 13,
d) el anticuerpo según la reivindicación 16,
e) un fago que presenta el anticuerpo según la
reivindicación 16.
23. Polipéptido que es idéntico a la secuencia
nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a
7, para su utilización como sonda de hibridación para los clones de
ADNc que codifican un polipéptido de la glándula salival de
garrapatas, más específicamente de Ixodes ricinus o para
aislar clones u otros genes similares a los ADNc de la glándula
salival de garrapata.
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