ES2292204T3 - Receptor de tipo tirosina cinasa humano, kdr. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una forma biológicamente activa de la proteína KDR humana en la que la posición 848 es Val, la posición 498 es Glu, la posición 772 es Ala, la posición 787 es Arg, la posición 835 es Lys y la posición 1.347 es Ser.
Description
Receptor de tipo tirosina cinasa humano,
KDR.
La presente invención se refiere a una molécula
de ácido nucleico aislada (polinucleótido) que codifica un receptor
de tipo tirosina cinasa humano, KDR, que se expresa en células
endoteliales humanas. Este receptor se activa por VEGF y media una
señal mitogénica. La presente invención también se refiere a
vectores recombinantes y a huéspedes recombinantes que contienen
un fragmento de ADN que codifica el KDR humano, un fragmento de ADN
que codifica la porción intracelular del KDR, un fragmento de ADN
que codifica la porción extracelular del KDR con o sin una
secuencia de anclaje a la membrana, formas sustancialmente
purificadas del KDR humano asociado y formas de KDR humanas
mutantes.
Las células endoteliales vasculares forman una
monocapa luminal no trombogénica a lo largo del sistema vascular.
Los mitógenos promueven el desarrollo vascular embrionario, el
crecimiento, reparación y angiogénesis en estas células. La
angiogénesis supone la degradación proteolítica de la membrana basal
en la que residen las células endoteliales, seguida de la posterior
migración quimiotáctica y mitosis de estas células para mantener el
crecimiento sostenido de un nuevo brote capilar. Una clase de
mitógenos selectivos para las células endoteliales vasculares
incluye el factor de crecimiento endotelial vascular (denominado
VEGF o VEGF-A) y homólogos al factor de crecimiento
placentario (PIGF), VEGF-B y
VEGF-C.
El VEGF humano se presenta como un homodímero
glucosilado en una de las cuatro formas maduras procesadas que
contienen 206, 189 (véase la patente de EE.UU. Nº 5.240.848), 165
(véase la patente de EE.UU. Nº 5.332.671) y 121 (patente de EE.UU.
Nº 5.332.671) aminoácidos, siendo la forma más frecuente la de 165
aminoácidos. Las formas de 206 aminoácidos y de 189 aminoácidos del
VEGF humano contienen todas ellas una inserción de 24 aminoácidos
muy básicos que promueve una unión estrecha con la heparina y,
presumiblemente, con los proteoglicanos de heparina de las
superficies celulares y de las matrices extracelulares (Ferrara y
col., 1991, J. Cell. Biochem, 47: 211-
218).
218).
El PIGF humano también es un homodímero
glucosilado que comparte una homología del 46% con VEGF a nivel de
proteína. Un ayuste diferencial del ARNm del PIGF humano produce
precursores de 170 ó 149 restos de aminoácidos, que se procesan
mediante proteolisis en sus formas maduras de 152 ó 131 restos de
aminoácidos de longitud, respectivamente (Maglione y col., 1993,
Oncogene 8: 925-931; Bayne y Thomas, 1992,
Publicación EPO Nº 0 506 477 A1; Hauser y Weich, 1993, Growth
Factors 9: 259-268).
VEGF-B ha sido aislado y
caracterizado (Grimmond y col., 1996, Genoma Research
6:124-131; Olofsson y col., 1996, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93:2576-2581). Los ADNc humanos de
longitud completa codifican precursores de 188 y 207 restos de
aminoácidos en los que las porciones terminales NH_{2} se procesan
mediante proteolisis para producir las formas maduras de 167 y 186
restos de aminoácidos de longitud. La expresión del
VEGF-B humano se encontró predominantemente en
corazón y en músculo esquelético como un homodímero unido por
enlaces disulfuro. Sin embargo, el VEGF-B humano
también puede formar un heterodímero con VEGF (id a
2580).
VEGF-C también se ha aislado y
caracterizado (Joukov y col., 1996, EMBO J. 15:
290-298). Se obtuvo un ADNc que codifica
VEGF-C a partir de una línea celular de
adenocarcinoma prostático humano. La proteína precursora de 32 kDa
se procesa mediante proteolisis para generar la forma madura de 23
kDa, que se une al receptor tirosina cinasa
Flt-4.
El VEGF y su homólogo transmiten su actividad
uniéndose a receptores de tipo tirosina cinasa que atraviesan la
membrana plasmática de las células del endotelio vascular que, a
continuación, activa una señal mitogénica intracelular. La familia
del receptor KDR es el principal receptor de tipo tirosina cinasa
que transduce la señal mitogénica iniciada por VEGF.
Shibuya y col. (1990, Oncogene 5:
519-524) describen un gen flt de un receptor
de tipo tirosina cinasa humano, que comprende una fase de lectura
abierta de 4,2 Kb codificante de una proteína de 1.338 aminoácidos
que comprende un dominio extracelular glucosilado, una región que
atraviesa la membrana y un dominio predicho con actividad tirosina
cinasa.
Pajusola y col. (1992, Cancer Res. 52:
5738-5743) describen un gen de un receptor humano de
tipo tirosina cinasa que, como se apuntó anteriormente, se une al
VEGF-C humano.
El factor de crecimiento del endotelio vascular
(VEGF) se une a los receptores de tipo tirosina cinasa de alta
afinidad que atraviesan la membrana KDR y Flt-1. El
cultivo celular y los experimentos de silenciamiento de genes
indican que cada receptor contribuye a diferentes aspectos de la
angiogénesis. KDR media la función mitogénica de VEGF mientras que
parece que Flt-1 modula funciones no mitogénicas,
tales como aquellas asociadas con la adhesión celular. Por tanto,
la inhibición de KDR disminuye significativamente el nivel de
actividad mitogénica de
VEGF.
VEGF.
El crecimiento vascular en la retina lleva a la
degeneración visual que termina en ceguera. El VEGF es responsable
de la mayor parte de la actividad angiogénica producida en la retina
o próxima a ella en la retinopatía diabética. El ARNm y la proteína
VEGF ocular se elevan en condiciones tales como la oclusión de la
vena de la retina en primates y disminuyen los niveles de pO_{2}
en ratones, lo que lleva a la neovascularización. Las inyecciones
intraoculares de anticuerpos monoclonales anti-VEGF
o de inmunofusiones del receptor de VEGF inhiben la
neovascularización ocular en modelos de neovascularización en
roedores y primates. Independientemente de la causa de inducción
del VEGF en retinopatía diabética humana, la inhibición del VEGF
ocular es útil para el tratamiento de la
enfermedad.
enfermedad.
La expresión de VEGF también aumenta de forma
significativa en regiones hipóxicas de tumores animales y humanos
adyacentes a áreas de necrosis. Los anticuerpos monoclonales y
policlonales anti-VEGF inhiben el crecimiento de
tumores humanos en ratones desnudos. Aunque estas mismas células
tumorales siguen expresando VEGF en cultivo, los anticuerpos no
disminuyen la tasa de mitosis de la mayoría, si no de todas, las
células tumorales derivadas de células distintas a las células
endoteliales vasculares en si. Por tanto, el VEGF derivado de
tumores no funciona como un factor mitogénico autocrino para la
mayoría de los tumores. Por tanto, el VEGF contribuye al
crecimiento tumoral in vivo, promoviendo la angiogénesis a
través de sus actividades paracrina quimiotácticas y mitogénicas
sobre la célula endotelial vascular. Estos anticuerpos monoclonales
también inhiben el crecimiento de los cánceres de colon humano
normalmente menos vascularizados en ratones atímicos y disminuyen el
número de tumores que surgen a partir de las células inoculadas. La
expresión viral de una construcción de unión a VEGF de
Flk-1, el homólogo al receptor KDR en ratón,
truncado para eliminar los dominios tirosina cinasa citoplásmicos,
pero que retienen el anclaje a la membrana, prácticamente suprime el
crecimiento de un glioblastoma que puede trasplantarse a ratones,
presumiblemente mediante el mecanismo dominante negativo de
formación de heterodímeros con los receptores de VEGF que
atraviesan la membrana de la célula endotelial. Las células
troncales embrionarias, que normalmente crecen como tumores sólidos
en ratones desnudos, no producen tumores detectables si se
silencian ambos alelos de VEGF. En conjunto estos datos indican la
función del VEGF en el crecimiento de tumores sólidos. KDR y
Flt-1 están implicados en la neoangiogénesis
patológica y los inhibidores de estos receptores son útiles para el
tratamiento de enfermedades en las que la neoangiogénesis es parte
de la patología general, por ejemplo, vascularización diabética
retinal, diversas formas de cáncer así como formas de inflamación,
tales como la artritis reumatoide, soriasis, dermatitis de contacto
y reacción de hipersensibilidad
Terman y col. (1991, Oncogene 6:
1677-1683; 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:
1579-1586) describen un ADNc de longitud completa
que codifica una forma de KDR. Sin embargo, la descripción de Terman
y col., no identifica un nuevo fragmento de ácido nucleico óptimo
que codifica la forma humana del gen del receptor de tipo tirosina
cinasa, KDR. Será ventajoso identificar y aislar una secuencia de
ADNc humano que codifique una forma optimizada del KDR humano. Una
molécula de ácido nucleico que exprese la proteína KDR humana será
útil para seleccionar compuestos que actúen como moduladores del
dominio proteína cinasa de esta proteína. Este compuesto o
compuestos serán útiles para modular la señal mitogénica de VEGF y
de proteínas relacionadas con VEGF en las células endoteliales
vasculares. La secuencia del ácido nucleico de KDR también puede ser
útil para terapia génica codificando una porción de la proteína KDR
que podría contener restos de unión al ligando funcional y de
anclaje a la membrana pero no actividad tirosina cinasa. También son
útiles para la selección de antagonistas de VEGF la proteína KDR
completa o una porción de la misma. La secuencia de ácido nucleico
de KDR puede transfectarse en células para el análisis de la función
en ausencia de Flt-1. La proteína KDR también es
útil para el análisis de la estructura por rayos X en presencia o
ausencia de ligandos y/o inhibidores. La presente invención aborda
y cubre estas necesidades describiendo un fragmento de ácido
nucleico aislado que expresa una forma de KDR humano, que mediante
modelado por ordenador se muestra como una predicción de mayor
actividad y funcionalidad que el KDR descrito
previamente.
previamente.
La presente invención se refiere a una molécula
de ácido nucleico aislada (polinucleótido) que codifica un nuevo
gen de un receptor de tipo tirosina cinasa humano, KDR como se
muestra en la reivindicación 1. Esta memoria descriptiva describe
una nueva molécula de ADN optimizada que tiene la secuencia mostrada
en la ID SEC Nº 1 que codifica KDR, un receptor de tipo tirosina
cinasa expresado en células endoteliales humanas.
La presente invención también se refiere a
fragmentos o mutantes biológicamente activas de la ID SEC Nº 1 que
codifican un ARNm que expresa un nuevo gen del receptor del tipo
tirosina cinasa humano, KDR. Cualquiera de estos fragmentos y/o
mutantes biológicamente activos codificarán una proteína o un
fragmento de la proteína que comprende al menos un dominio cinasa
intracelular de la proteína KDR humana como se muestra en la ID SEC
Nº 2. Cualquiera de estos polinucleótidos incluye, pero no está
necesariamente limitado a sustituciones, deleciones o adiciones de
nucleótidos, truncamientos del extremo amino terminal y
truncamientos del extremo carboxilo terminal, de modo que estas
mutaciones codifican un ARNm que expresa dicha proteína o fragmento
de la proteína de uso diagnóstico, terapéutico o profiláctico, y
útil par la selección de agonistas y/o antagonistas de la función
de
KDR.
KDR.
\newpage
La molécula de ácido nucleico aislado de la
presente invención puede incluir una molécula de ácido
desoxirribonucleico (ADN), tal como ADN genómico y ADN
complementario (ADNc), que puede ser de cadena sencilla (cadena
codificante o no codificante) o doble, así como ADN sintético, tal
como un polinucleótido de cadena sencilla sintetizada. La molécula
de ácido nucleico aislado de la presente invención también puede
incluir una molécula de ácido ribonucleico (ARN).
La presente invención también se refiere a
vectores recombinantes y a huéspedes recombinantes, tanto
procariotas como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido
nucleico sustancialmente purificadas descritas a lo largo de esta
memoria descriptiva.
La presente invención también se refiere a
fracciones subcelulares de membrana de las células huésped
recombinantes (tanto procariotas como eucariotas así como tanto
células transformadas de forma estable como transitoria) que
comprenden los ácidos nucleicos de la presente invención. Estas
fracciones subcelulares de membrana comprenderán formas mutante o
humana de tipo silvestre de KDR a niveles sustancialmente por encima
de los niveles de tipo silvestre y, por tanto, serán útiles para
diversos ensayos descritos a lo largo de esta memoria
descrip-
tiva.
tiva.
En la Figura 1 A, en la Figura 1 B y en la ID
SEC Nº 1 se describe un aspecto preferido de la presente invención,
un ADNc humano que codifica un nuevo gen de un receptor de tipo
tirosina cinasa, KDR.
La presente invención también se refiere a una
forma sustancialmente purificada del gen del receptor de tipo
tirosina cinasa, KDR, que se describe en la Figura 2 y se muestra en
la ID SEC Nº 2.
La presente invención también se refiere a
fragmentos definidos biológicamente activos de la proteína KDR,
como se muestra inicialmente en la ID SEC Nº 2, de uso diagnóstico,
terapéutico o profiláctico y útiles para la selección de agonistas
y/o antagonistas de la función KDR.
En la Figura 2 y en la ID SEC Nº 1 se describe
un aspecto preferido de la presente invención, la secuencia de
aminoácidos de un nuevo gen de un receptor de tipo tirosina cinasa,
KDR.
La presente invención también se refiere a
moléculas de ácido nucleico aisladas que son construcciones de
fusión que expresan proteínas de fusión útiles en ensayos para
identificar compuestos que modulan la actividad KDR humana de tipo
silvestre. Un aspecto preferido de esta porción de la invención
incluye, pero sin limitaciones, construcciones de fusión glutatión
S-transferasa (GST)-KDR. Estas
construcciones de fusión incluyen, pero sin limitaciones, el
dominio tirosina cinasa intracelular del KDR humano como una fusión
en fase en el extremo carboxilo terminal del gen GST mediante
procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Pueden
expresarse proteínas de fusión recombinantes solubles de
GST-dominio cinasa en diversos sistemas de
expresión, incluyendo células del insecto Spodoptera
frugiperda (Sf21) (Invitrogen), usando un vector de expresión de
baculovirus (pAcG2T,
Pharmingen).
Pharmingen).
La presente invención también se refiere a
moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican fragmentos de la
proteína KDR humana que comprenden una porción del dominio KDR
intracelular. Los fragmentos de la proteína son útiles en los
ensayos para identificar compuestos que modulen la actividad KDR
humana de tipo silvestre. En este aspecto, la invención proporciona
una construcción de ácido nucleico que codifica la porción
intracelular de KDR humano, del aminoácido 790 al aminoácido
1.356.
Por tanto, la presente invención se refiere a
procedimientos para expresar el gen del receptor de tipo tirosina
cinasa, KDR, y equivalentes biológicos descritos en este documento,
ensayos que emplean estos genes del receptor de tipo tirosina
cinasa, células que expresan estos genes del receptor de tipo
tirosina cinasa y compuestos identificados mediante el uso de estos
genes del receptor de tipo tirosina cinasa y de la proteína KDR
humana expresada, incluyendo uno o más moduladores de la cinasa
dependiente de KDR humano a través del contacto directo con el
dominio cinasa del KDR humano o un compuesto que previene la unión
de VEGF al KDR humano, o la dimerización apropiada del receptor KDR
que antagoniza la transducción de las señales intracelulares
normales asociadas con la angiogénesis inducida por VEGF.
También es un objeto de presente invención
proporcionar construcciones de fusión en fase basadas en KDR,
procedimientos para la expresión del gen del receptor de tipo
tirosina cinasa, KDR y equivalentes biológicos descritos en este
documento, ensayos relacionados, células recombinantes que expresan
estos genes del receptor de tipo tirosina cinasa y compuestos
agonistas y/o antagonistas identificados mediante el uso de estos
genes del receptor de tipo tirosina cinasa y la proteína KDR humana
expresada.
Según se usa en este documento, "VEGF" o
"VEGF-A" se refiere a un factor de crecimiento
del endotelio vascular.
Según se usa en este documento, "KDR" o
"FLK-1" se refiere a un receptor que contiene
un dominio cinasa insertado.
\newpage
Según se usa en este documento,
"FLT-1" se refiere a un receptor de tipo
tirosina cinasa similar a aletas.
Según se usa en este documento, la expresión "
huésped mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo al
ser humano.
la Figura 1A y la Figura 1B muestran la
secuencia de nucleótidos que codifica el KDR humano, como se muestra
en la ID SEC Nº 1.
la Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
del KDR humano, como también se muestra en la ID SEC Nº 2. Los
restos de aminoácidos subrayados representan diferencias en
comparación con una forma del KDR humano previamente descrita.
la Figura 3A muestra el dominio de unión a ATP
del modelo de homología del mutante V848E de KDR unido a
AMP-PCP. La cadena lateral de E848 está en contacto
con la adenina de AMP-PCP. No es visible el fosfato
gamma de AMP-PCP. El trazado del carbono alfa de la
proteína se muestra entre líneas, el AMP-PCP en
modelo de varillas y la cadena lateral de E848 en modelo de bolas.
El lóbulo N-terminal aparece coloreado de azul (o,
alternativamente, marcado con círculos vacíos) con la excepción de
la estructura modificada rica en glicina que está coloreada de
verde (o, alternativamente, marcada como una región rayada). El
lóbulo C-terminal está coloreado en rojo (o,
alternativamente, se señala con círculos negros).
la Figura 3B muestra el dominio de unión a ATP
del modelo de homología de KDR unido a AMP-PCP. La
cadena lateral de las formas hidrófobas V848 está en contacto con
la adenina de AMP-PCP. No es visible el fosfato
gamma de AMP-PCP. El trazado de carbono alfa de la
proteína se muestra entre líneas, el AMP-PCP en
modelo de varillas y la cadena lateral de V848 en modelo de bolas.
El lóbulo N-terminal aparece coloreado de azul (o,
alternativamente, marcado con círculos vacíos) con la excepción de
la estructura modificada rica en glicina que está coloreado de
verde (o, alternativamente, marcado como una región rayada). El
lóbulo C-terminal está coloreado en rojo (o
alternativamente, marcado con círculos negros).
las Figuras 4A y 4B muestran que
GST-KDR_{cyt}E848 purificada no podía
autofosforilarse en presencia de ATP 1 mM, en donde 12 ng de
GST-KDR_{cyt}V848 en presencia de ATP 1 mM daba
lugar a la autofosforilación (Figura 4A) y que tanto 120 ng de
GST-KDR_{cyt}E848 como 12 ng de
GST-KDR_{cyt}V848 reaccionan con un anticuerpo
anti-KDR (Figura 4B).
La presente invención se refiere a formas de
ácido nucleico y de proteína aisladas que representan al KDR
humano. Esta memoria descriptiva describe una molécula de ADN que
codifica el KDR humano, un receptor de tipo tirosina cinasa
expresado en células endoteliales humanas. El receptor se activa
mediante el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y
media una señal mitogénica. Esta activación y la mitogénesis
posterior conduce a una respuesta angiogénica in vivo. La
molécula de ácido nucleico descrita en la memoria descriptiva como
ID SEC Nº 1, codifica una proteína KDR humana (ID SEC Nº 2) que
presenta diferencias en seis aminoácidos de la secuencia publicada
(Terman y col., 1992, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:
1579-1586, Terman y col., solicitud PCT
internacional Nº WO 92/14748, solicitud internacional número
PCT/US92/01300). Estos cambios están en las posiciones 498 (Ala a
Glu), 772 (Thr a Ala), 787 (Gly a Arg), 835 (Asn a Lys), 848 (Glu a
Val) y 1.347 (Thr a Ser). Estos seis cambios de aminoácidos afectan
a la actividad del receptor. La Val 848 está conservada en la
mayoría de la familia de tirosina cinasas y parece ser importante
para la unión del ATP y, presumiblemente, de inhibidores
competitivos de ATP, al receptor de tipo cinasa KDR según se deduce
del modelado por ordenador. El cambio a Glu en esta posición da
lugar a una cinasa no funcional como consecuencia de la unión a ATP
alterada. Los demás cambios también pueden causar diferencias en la
actividad.
La presente invención también se refiere a
fragmentos o mutantes biológicamente activos de la ID SEC Nº 1, que
codifica ARN_{m} que expresa un nuevo gen de un receptor del tipo
tirosina cinasa humano, KDR. Cualquiera de estos fragmentos
biológicamente activos codificará una proteína o fragmento de la
proteína que comprende al menos un dominio cinasa intracelular de
la proteína KDR humana, como se muestra en la ID SEC Nº 2 y retiene
la Val en la posición 848. También se prevé que otros dominios
basados en el fragmento intracelular de KDR darán lugar a un
fragmento de la proteína soluble que mimetiza la estructura y
función del dominio intracelular de tipo silvestre. Cualquiera de
estos fragmentos de la proteína puede ser una proteína de fusión,
tal como la fusión GST-KDR utilizada como ejemplo, o
puede comprender únicamente el dominio intracelular de KDR, con
aumento de deleciones en la región del extremo COOH terminal. Es
especialmente preferible que se mantengan los siguientes
aminoácidos, si este dominio abarca la proteína o fragmento de la
proteína respectiva: Val en la posición 848, Glu en la posición
498, Ala en la posición 772, Arg en la posición 787, Lys en la
posición 835 y Ser en la posición 1.347. Por tanto, cualquiera de
estos polinucleótidos incluye, pero no está necesariamente
limitado, sustituciones, deleciones, adiciones de nucleótidos,
truncamientos del extremo amino terminal y truncamientos del
extremo carboxílico, de modo que estas mutaciones codifican ARNm que
expresan una proteína o fragmento de la proteína para uso
diagnóstico, terapéutico o profiláctico y es útil para la
identificación de moduladores de la actividad del receptor KDR.
La molécula de ácido nucleico aislado de la
presente invención puede incluir una molécula de ácido
desoxirribonucleico (ADN), tal como ADN genómico y ADN
complementario (ADNc), que puede ser de cadena sencilla (cadena
codificante o no codificante) o doble, así como ADN sintético, tal
como un polinucleótido de cadena sencilla sintetizada. La molécula
de ácido nucleico aislado de la presente invención también puede
incluir una molécula de ácido ribonucleico (ARN).
Es sabido que las secuencias de ADN que
codifican un péptido pueden alterarse de modo que codifiquen un
péptido que tiene propiedades diferentes a aquellas de un péptido
que aparece de forma natural. Los procedimientos para alterar las
secuencias de ADN incluyen, pero sin limitaciones, la mutagénesis
dirigida a sitio. Ejemplos de propiedades alteradas incluyen, pero
sin limitaciones, cambios en la afinidad de una enzima por un
sustrato o de un receptor por un ligando.
Según se usa en este documento,
"purificado" y "aislado" se utilizan indistintamente para
mantener la proposición de que el ácido nucleico, la proteína o el
fragmento respectivo de estos en cuestión, se retira sustancialmente
de su ambiente in vivo, de modo que pueda ser manipulada por
el experto tal como, pero sin limitaciones, mediante secuenciación
de nucleótidos, digestión con enzimas de restricción, mutagénesis
dirigida a sitio y subclonado en vectores de expresión para un
fragmento de ácido nucleico así como la obtención de la proteína o
el fragmento de la proteína en cantidades puras de modo que ofrezca
la oportunidad de generar anticuerpos policlonales, anticuerpos
monoclonales, secuenciación de aminoácidos y digestión de péptidos.
Por tanto, los ácidos nucleicos reivindicados en este documento
pueden estar presentes en células completas o en lisados celulares,
o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente purificada.
Se considera que un ácido nucleico está sustancialmente purificado
cuando se purifica de los contaminantes ambientales. De este modo,
se considera que una secuencia de ácido nucleico aislada de las
células está sustancialmente purificada cuando se purifica de los
componentes celulares mediante procedimientos convencionales,
mientras que una secuencia de ácido nucleico sintetizado
químicamente se considera que está sustancialmente purificada cuando
se purifica de sus precursores químicos.
La presente invención también se refiere a
vectores recombinantes y a huéspedes recombinantes, tanto
procariotas como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido
nucleico sustancialmente purificadas descritas a lo largo de esta
memoria descriptiva.
La presente invención también se refiere a
fracciones subcelulares de la membrana de células huésped
recombinantes (tanto procariotas como eucariotas, así como tanto
células transformadas de forma estable como transitoria) que
comprenden los ácidos nucleicos de la presente invención. Estas
fracciones subcelulares de membrana comprenderán formas mutante o
humana de tipo silvestre de KDR a niveles sustancialmente por encima
de los niveles de tipo silvestre y, por tanto, serán útiles para
diversos ensayos descritos a lo largo de esta memoria
descriptiva.
descriptiva.
En la Figura 1 A, en la Figura 1 B y en la ID
SEC Nº 1 se describe un aspecto preferido de la presente invención,
que es un ADNc humano que codifica un nuevo gen de un receptor de
tipo tirosina cinasa, KDR, descrita como
sigue:
sigue:
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(Secuencia pasa a página
siguiente)
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La presente invención también se refiere a una
forma sustancialmente purificada del gen del receptor de tipo
tirosina cinasa que comprende la secuencia de aminoácidos KDR
descrita en la Figura 2 y mostrada en la ID SEC Nº 2, que incluye
Glu en la posición 498, Ala en la posición 772, Arg en la posición
787, Lys en la posición 835, Val en la posición 848 y Ser en la
posición 1.347, descrita como sigue:
La presente invención se refiere a moléculas de
ácido nucleico aisladas que codifican porciones solubles del
dominio intracelular de KDR. Son especialmente preferidas las
moléculas de ácido nucleico que codifican un fragmento de la
proteína KDR con deleción del extremo COOH-terminal
útil en los ensayos para identificar compuestos que modulen la
actividad KDR humana de tipo silvestre. Cualquiera de estos ácidos
nucleicos codificará un fragmento de la proteína KDR que mimetiza
la actividad KDR de tipo silvestre dentro del dominio respectivo,
tal como el dominio cinasa del KDR humano. Estos fragmentos de
proteína solubles expresados pueden contener o no una porción de la
región amino terminal del KDR humano o de una secuencia heteróloga.
Estos ácidos nucleicos pueden expresarse en cualquiera de los
diversos sistemas de expresión disponibles para el experto. Puede
utilizar cualquiera de estas construcciones basadas en la región
intracelular de KDR de la presente invención en aplicaciones de
terapia génica, de modo que actúe como agonista o antagonista
soluble de la actividad cinasa asociada normalmente con la
actividad cinasa de tipo silvestre asociada a membrana.
Por tanto, la presente invención se refiere a
moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican fragmentos de
una proteína KDR humana que comprenden una porción del dominio
intracelular de KDR. Los fragmentos de proteína son útiles en
ensayos para identificar compuestos que modulan la actividad KDR
humana de tipo silvestre. Este aspecto de la invención proporciona
una construcción de ácido nucleico que codifica la porción
intracelular del KDR humano, del aminoácido 790 al aminoácido
1.356. Los datos ilustrados en la sección de ejemplos 3 muestran
que las deleciones del extremo COOH terminal de la porción
intracelular soluble de KDR muestran actividad cinasa.
Por tanto, la presente invención se refiere a
procedimientos de expresión del gen del receptor de tipo tirosina
cinasa, KDR, y equivalentes biológicos descritos en este documento,
ensayos que emplean estos genes del receptor de tipo tirosina
cinasa, células que expresan estos genes del receptor de tipo
tirosina cinasa y compuestos agonistas y/o antagonistas
identificados mediante el uso de estos genes del receptor de tipo de
tirosina cinasa y la proteína de KDR humana expresada, incluyendo,
pero sin limitaciones, uno o más moduladores de la cinasa
dependiente de KDR humano mediante contacto directo con el dominio
cinasa de KDR humano o un compuesto que previene la unión de VEGF
al KDR humano, o previene o promueve la dimerización y/o activación
del receptor induciendo o antagonizando así la transducción de las
señales intracelulares normales asociadas con la angiogénesis
inducida por VEGF.
Según se usa en este documento, un
"equivalente biológicamente activo" o "derivado funcional"
de un KDR humano de tipo silvestre posee actividad biológica que es
sustancialmente similar a la actividad biológica del KDR humano de
tipo silvestre. La expresión "derivado funcional" pretende
incluir los "fragmentos", "mutantes", "variantes",
"variantes degeneradas", "análogos" y "homólogos" o
los "derivados químicos" de la proteína KDR humana de tipo
silvestre. El término "fragmento" pretende referirse a
cualquier subgrupo de polipéptidos del KDR humano de tipo
silvestre. El término "mutante" pretende referirse a una
molécula que puede ser sustancialmente similar a la forma de tipo
silvestre, pero posee características biológicas diferenciadas.
Estas características alteradas incluyen, pero no como limitación,
alterar la unión al sustrato, alterar la afinidad por el sustrato y
alterar la sensibilidad a los compuestos químicos que afectan a la
actividad biológica del KDR humano o un derivado funcional de KDR
humano. El término "variante" pretende referirse a una molécula
sustancialmente similar en estructura y función a la proteína
completa de tipo silvestre o a un fragmento de la misma. Una
molécula es "sustancialmente similar" a una proteína similar a
KDR humana de tipo silvestre si ambas moléculas tienen estructuras
sustancialmente similares o si ambas moléculas poseen una actividad
biológica similar. Por tanto, si las dos moléculas poseen actividad
sustancialmente similar, se consideran variantes incluso si la
estructura de una de las moléculas no se encuentra en la otra o
incluso si las dos secuencias de aminoácidos no son idénticas. El
término "análogo" se refiere a una molécula sustancialmente
similar en función a la proteína KDR humana de longitud completa o
a un fragmento biológicamente activo de la misma.
Puede usarse cualquiera de los distintos
procedimientos para clonar el KDR humano. Estos procedimientos
incluyen, pero sin limitaciones, (1) una técnica de clonación de
PCR RACE (Frohman, y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:
8998-9002). El RACE 5' y/o 3' pueden realizarse para
generar una secuencia de ADNc de longitud completa. Esta estrategia
implica el uso de cebadores oligonucleotídicos específicos del gen
para la amplificación por PCR del ADNc del KDR humano. Estos
cebadores específicos del gen se diseñan por medio de la
identificación de una etiqueta de secuencia expresada (EST),
secuencia de nucleótidos que se ha identificado mediante búsqueda
en cualquier base de datos de ácidos nucleicos y proteínas
públicamente disponibles; (2) expresión funcional directa del ADNc
del KDR humano seguido de la construcción de una biblioteca de ADNc
que contiene KDR humano en un sistema de vector de expresión
adecuado; (3) selección de una biblioteca de ADNc que contiene el
KDR humano, construida en un vector lanzadera de plásmido o
bacteriófago con una sonda oligonucleotídica degenerada, marcada y
diseñada a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína KDR
humana y (4) selección de una biblioteca de ADNc que contiene el
KDR humano, construida en un vector lanzadera de plásmido o
bacteriófago con un ADNc parcial que codifica la proteína KDR
humana. Este ADNc parcial se obtiene mediante la amplificación por
PCR específica de fragmentos de ADN del KDR humano a través del
diseño de cebadores oligonucleotídicos degenerados a partir de la
secuencia de aminoácidos conocida de otras cinasas que están
relacionadas con la proteína KDR humana; (5) selección de una
biblioteca de ADNc que contiene el KDR humano, construida en un
vector lanzadera de plásmido o bacteriófago con un ADNc parcial que
codifica la proteína KDR humana. Esta estrategia también puede
implicar el uso de cebadores oligonucleotídicos específicos de gen
para amplificación por PCR del ADNc del KDR humano identificado
como una EST como se describe anteriormente o (6) diseñar
oligonucleótidos 5' y 3' específicos del gen, usando la ID SEC Nº 1
como molde de modo que pueda generarse el ADNc de longitud completa
mediante técnicas RACE conocidas, o pueda generarse una porción de
la región codificante mediante estas mismas técnicas RACE conocidas
para generar y aislar una porción de la región codificante usada
como sonda para seleccionar uno de los diversos tipos de
bibliotecas de ADNc y/o genómicas para aislar una versión de
longitud completa de la secuencia nucleotídica que codifica el KDR
humano.
Es fácilmente evidente para los expertos en la
materia que pueden ser útiles otros tipos de bibliotecas, así como
bibliotecas construidas a partir de otros tipos de células o tipos
de especies, para aislar un ADN que codifica el KDR humano o un
homólogo del KDR humano. Otros tipos de bibliotecas incluyen, peo
sin limitaciones, bibliotecas de ADNc derivadas de otras células o
líneas celulares diferentes a células o tejidos humanos, tales como
células murinas, células de roedores o cualquier otro huésped
vertebrado que puede contener el ADN que codifica el KDR humano.
Adicionalmente, puede aislarse un gen de KDR humano y homólogos
mediante selección por hibridación en base a oligonucleótidos o
polinucleótidos de una biblioteca genómica de vertebrado, incluyendo
pero sin limitación, una biblioteca genómica murina, una biblioteca
genómica de roedor así como bibliotecas concomitantes de ADN
genómico humano.
Es fácilmente evidente para los expertos en la
materia que pueden prepararse bibliotecas de ADNc adecuadas a
partir de células o líneas celulares que tienen actividad KDR. La
selección de células o líneas celulares para su uso en la
preparación de una biblioteca de ADNc para aislar un ADNc que
codifica el KDR humano puede hacerse midiendo en primer lugar la
actividad KDR asociada a la células usando cualquier ensayo conocido
disponible para este fin.
La preparación de bibliotecas de ADNc puede
realizarse mediante técnicas convencionales bien conocidas en la
técnica. Pueden encontrarse técnicas de construcción de una
biblioteca de ADNc bien conocidas, por ejemplo, en Sambrook y col.,
1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. También pueden
obtenerse bibliotecas de ADN complementario a partir de numerosas
fuentes comerciales incluyendo, pero sin limitaciones, Clonetech
Laboratorios, Inc. y Stratagene.
También es fácilmente evidente para los expertos
en la materia que el ADN que codificada el KDR humano también puede
aislarse a partir de una biblioteca de ADN genómico adecuada. La
construcción de bibliotecas de ADN genómicas puede realizarse
mediante técnicas convencionales bien conocidas en la técnica.
Pueden encontrarse técnicas de construcción de bibliotecas de ADN
bien conocidas en Sambrook y col. anteriormente.
Para clonar el gen del KDR humano mediante uno
cualquiera de los procedimientos preferidos, puede ser necesaria la
secuencia de aminoácidos o de ADN del KDR humano o una proteína
homóloga. Para conseguir esto, puede purificarse la proteína KDR o
una proteína homóloga y determinarse la secuencia parcial de
aminoácidos mediante secuenciadores automáticos. No es necesario
determinar la secuencia de aminoácidos completa, pero puede
determinarse la secuencia lineal de dos regiones de 6 a 8
aminoácidos para la amplificación por PCR de un fragmento parcial
del ADN del KDR humano. Una vez que se hayan identificado las
secuencias de aminoácidos adecuadas, pueden sintetizarse las
secuencias de ADN capaces de codificarlas. Debido a que el código
genético está degenerado, puede usarse más de un codón para
codificar un aminoácido en particular y, por tanto, la secuencia de
aminoácidos puede estar codificada por cualquiera de un grupo de
oligonucleótidos de ADN similares de un grupo. Sólo un miembro del
grupo será idéntico a la secuencia del KDR humano, pero los otros
del grupo serán capaces de hibridar con el ADN del KDR humano
incluso en presencia de oligonucleótidos de ADN con faltas de
coincidencia. Los oligonucleótidos de ADN desapareados pueden
seguir hibridando suficientemente con el ADN del KDR humano para
permitir la identificación y el aislamiento del ADN que codifica el
KDR humano. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos de una
región de una secuencia expresada puede identificarse mediante la
búsqueda en una o más bases de datos genómicas disponibles. Pueden
usarse cebadores específicos del gen para realizar amplificación
por PCR de un ADNc de interés a partir de una biblioteca de ADNc o
de una población de ADNc. Como se apunta anteriormente, la
secuencia de nucleótidos apropiados para su uso en un procedimiento
basado en PCR puede obtenerse a partir de la ID SEC Nº 1, con el
fin del aislamiento de productos de RACE 5' y 3' solapantes para la
generación de una secuencia de longitud completa que codifica el KDR
humano o para aislar una porción de la secuencia de nucleótidos que
codifica el KDR humano para su uso como sonda para seleccionar una o
más bibliotecas basadas en ADNc o genómicas para aislar una
secuencia de longitud completa que codifica el KDR humano o
proteínas similares al KDR humano.
En un procedimiento ilustrativo, el ADNc de
longitud completa del KDR humano de la presente invención se generó
mediante selección de una biblioteca de ADNc en fago lambda de las
células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) con una
sonda de ADN específica de KDR de 576 pares de bases usando los
cebadores KDR-A:
5'-GGAATTCCATCCAAGCGGCAAATGTGTC-3'
(ID SEC Nº 3) y KDR-B:
5'-GGAATTCCGAGTCTTCTA
CAAGGGTCTC-3' (ID SEC Nº 4). Se aislaron clones del fago lambda que contenían inserciones únicas a través de tres rondas de siembra en placa repetida y, a continuación, se caracterizaron. Los 110 pares de bases del extremo 3' no representados en ninguno de los clones aislados se clonaron mediante PCR a partir de la misma biblioteca como anteriormente, usando los cebadores KDR-C: 5'-TTATGACAACACAGCAGG-3' (ID SEC Nº 5) y KDR-D: 5'-TTGGATCCTCGAGTTGGGGTGTGGATGC-3' (ID SEC Nº 6). Se usaron clones solapantes para generar un gen de KDR de longitud completa dentro del vector plasmídico pGEM7Z. El gen contenía un sitio XhoI en el extremo 5' terminal que se cambió por un sitio BamHI cortando primero con XhoI y formando a continuación un extremo romo con la ADN polimerasa y ligando un enlazador oligonucleotídico BamHI y, finalmente, clonándolo como un fragmento BamHI/BamHI en pGEm7Z. El gen se secuenció en un secuenciador automático ABI Prism modelo número 377. Además, el dominio citoplásmico de KDR que contiene actividad tirosina cinasa se clonó independientemente como una fusión del gen de GST en un vector de expresión de baculovirus para caracterizar la actividad tirosina cinasa.
CAAGGGTCTC-3' (ID SEC Nº 4). Se aislaron clones del fago lambda que contenían inserciones únicas a través de tres rondas de siembra en placa repetida y, a continuación, se caracterizaron. Los 110 pares de bases del extremo 3' no representados en ninguno de los clones aislados se clonaron mediante PCR a partir de la misma biblioteca como anteriormente, usando los cebadores KDR-C: 5'-TTATGACAACACAGCAGG-3' (ID SEC Nº 5) y KDR-D: 5'-TTGGATCCTCGAGTTGGGGTGTGGATGC-3' (ID SEC Nº 6). Se usaron clones solapantes para generar un gen de KDR de longitud completa dentro del vector plasmídico pGEM7Z. El gen contenía un sitio XhoI en el extremo 5' terminal que se cambió por un sitio BamHI cortando primero con XhoI y formando a continuación un extremo romo con la ADN polimerasa y ligando un enlazador oligonucleotídico BamHI y, finalmente, clonándolo como un fragmento BamHI/BamHI en pGEm7Z. El gen se secuenció en un secuenciador automático ABI Prism modelo número 377. Además, el dominio citoplásmico de KDR que contiene actividad tirosina cinasa se clonó independientemente como una fusión del gen de GST en un vector de expresión de baculovirus para caracterizar la actividad tirosina cinasa.
Pueden usarse diversos vectores de expresión de
mamíferos para expresar el KDR humano recombinante en células de
mamífero. En este documento, los vectores de expresión se definen
como secuencias de ADN que son necesarias para la transcripción de
ADN clonado y la traducción de sus ARNm en un huésped apropiado.
Estos vectores pueden usarse para expresar ADN eucariótico en una
diversidad de huéspedes, tales como bacterias, algas verdeazuladas,
células vegetales, células de insecto y células animales. Los
vectores diseñados específicamente permiten la transferencia de ADN
entre huéspedes, tales como entre células de bacterias y levaduras
o de bacterias y animales. Un vector de expresión construido
apropiadamente debería contener: un origen de replicación para la
replicación autónoma en células huésped, marcadores susceptibles de
selección, un número limitado de sitios para enzimas de restricción
útiles, la posibilidad de un número elevado de copias y promotores
activos. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige
la unión del ADN con la ARN polimerasa e inicia la síntesis de ARN.
Un promotor potente es aquel que hace que se inicie la síntesis del
ARNm a una frecuencia elevada. Los vectores de expresión pueden
incluir, pero sin limitaciones, vectores de clonación, vectores de
clonación modificados, plásmidos o virus especialmente
diseñados.
Los vectores de expresión de mamíferos
disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la expresión
del KDR humano recombinante incluye, pero sin limitaciones,
pcDNA3.1 (Invitrogen), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 y pLITMUS39
(New England Bioloabs), pcDNAI, pcDNAlamp (Invitrogen), pcDNA3
(Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5
(Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC
37593), pBPV-1(8-2) (ATCC
37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC
37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198),
pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) y
\lambdaZD35 (ATCC 37565).
Pueden usarse diversos vectores de expresión
bacterianos para expresar el KDR humano recombinante en células
bacterianas. Los vectores de expresión bacterianos disponibles en el
mercado que pueden ser adecuados para la expresión del KDR humano
recombinante incluyen, pero sin limitaciones, pCR2.1 (Invitrogen),
pET11a (Novagen), lambda gt11 (Invitrogen) y
pKK223-3 (Pharmacia).
Pueden usarse diversos vectores de expresión en
células fúngicas para expresar el KDR humano recombinante en
células fúngicas. Los vectores de expresión en células fúngicas
disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la
expresión del KDR humano recombinante incluyen, pero sin
limitaciones, pYES2 (Invitrogen) y vector de expresión de
Pichia (Invitrogen).
Pueden usarse diversos vectores de expresión en
células de insecto para expresar el receptor recombinante en
células de insecto. Los vectores de expresión en células de insecto
disponibles en el mercado, que pueden ser adecuados para la
expresión recombinantes del KDR humano incluyen, pero sin
limitaciones, pBlueBacIII y pBlueBacHis2 (Invitrogen) y pAcG2T
(Pharmingen).
Un vector de expresión que contiene el ADN que
codifica una proteína similar al KDR humano puede usarse para la
expresión del KDR humano en una célula huésped recombinante. Las
células huésped recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas
incluyendo, pero sin limitaciones, bacterias tales como E.
coli, células fúngicas, tales como levaduras, células de
mamífero incluyendo, pero sin limitaciones, líneas celulares de
origen humano, bovino, porcino, de mono y de roedores y células de
insecto incluyendo, pero sin limitaciones, líneas celulares
derivadas de Drosophila y del gusano de la seda. Las líneas
celulares derivadas de especies de mamíferos que pueden ser
adecuadas y que están disponibles en el mercado incluyen, pero sin
limitaciones, células L-M(TK-) (ATCC CCL
1.3), células L-M (ATCC CCL 1.2),
Saos-2 (ATCC HTB-85), 293 (ATCC CRL
1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70),
COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC
CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92),
NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616),
BS-C-1 (ATCC CCL 26),
MRC-5 (ATCC CCL 171) y CPAE (ATCC CCL 209).
El vector de expresión puede introducirse en
células huésped a través de cualquiera de las numerosas técnicas
incluyendo, sin limitaciones, la transformación, transfección,
fusión de protoplastos y electroporación. Las células que contienen
el vector de expresión se analizan individualmente para determinar
si producen la proteína KDR humana. La identificación de las
células que expresan el KDR humano puede realizarse mediante varios
medios incluyendo, pero sin limitaciones, reactividad inmunológica
con anticuerpos anti KDR humano, unión al ligando marcado y la
presencia de actividad KDR humana asociada a la célula huésped.
El ADNc del KDR humano clonado obtenido a través
de los procedimientos descritos anteriormente puede expresarse
recombinantemente mediante clonación molecular en un vector de
expresión (tal como pcDNA3.1, pCR2.1, pBlueBacHis2 y pLITMUS28) que
contiene un promotor adecuado y otros elementos reguladores de la
transcripción apropiados y transferirse a células huésped
procariotas o eucariotas para producir KDR humana recombinante. Las
técnicas para estas manipulaciones pueden encontrarse descritas en
Sambrook y col., anteriormente, se describen completamente
en la sección de Ejemplos y son bien conocidas y fácilmente
disponibles para el experto en la materia.
La expresión del ADN del KDR humano también
puede realizarse usando ARNm sintético producido in vitro.
El ARNm sintético puede traducirse de forma eficaz en diversos
sistemas libres de células incluyendo pero sin limitaciones
extractos de germen de trigo y extractos de reticulocitos, así como
traducidos de forma eficaz en sistemas basados en células que
incluyen, pero sin limitaciones, la microinyección de oocitos de
rana, prefiriéndose la microinyección de oocitos de rana.
Para determinar la secuencia o secuencias del
ADNc del KDR humano que produce niveles óptimos de KDR humano,
pueden construirse moléculas de ADNc que incluyen, pero sin
limitaciones: un fragmento de ADNc que contiene la fase de lectura
abierta de longitud completa del KDR humano así como diversas
construcciones que contienen porciones del ADNc que codifica sólo
dominios específicos de la proteína o de los dominios reorganizados
de la proteína. Todas las construcciones pueden diseñarse para que
contengan ninguna, todas o porciones de las regiones 5' y/o 3' no
traducidas de un ADNc del KDR humano. Los niveles de expresión y
actividad del KDR humano pueden determinarse tras la introducción,
ambos individualmente y en combinación, de estas construcciones en
las células huésped apropiadas. Tras la determinación del casete de
ADNc del KDR humano que produce la expresión óptima en ensayos
transitorios, esta construcción de ADNc del KDR se transfiera a una
diversidad de vectores de expresión (incluyendo virus recombinante)
incluyendo, sin limitaciones, células de mamíferos, células
vegetales, células de insectos, ovocitos, bacterias y células de
levadura.
Los niveles de KDR humano en las células
huéspedes se cuantifican mediante diversas técnicas incluyendo,
pero sin limitaciones, técnicas de inmunoafinidad y/o afinidad por
ligando. Se usan perlas de afinidad específicas de KDR o
anticuerpos específicos de KDR para aislar KDR marcada o no con
^{35}S-metionina. La proteína KDR marcada se
analiza mediante PAGE-SDS. La proteína KDR no
marcada se detecta mediante ensayos de transferencia Western,
ELISA o RIA empleando anticuerpos específicos de la proteína KDR y/o
anticuerpos antifosfotirosina.
Siguiendo la expresión de KDR en una célula
huésped, puede recuperarse la proteína KDR para proporcionar una
proteína KDR en forma activa. Se dispone de varios procedimientos
para la purificación de la proteína KDR que son adecuados para su
uso. La proteína KDR recombinante puede purificarse a partir de
lisados y extractos celulares o, a partir del medio de cultivo
condicionado, mediante diversas combinaciones, o la aplicación
individual del fraccionamiento salino, cromatografía de intercambio
iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de
adsorción en hidroxilapatita y cromatografía de interacción
hidrófoba.
Además, la proteína KDR recombinante puede
separarse a partir de otras proteínas celulares mediante el uso de
una columna de inmunoafinidad fabricada con anticuerpos monoclonales
o policlonales específicos para la proteína KDR de longitud
completa, o fragmentos polipeptídicos de la proteína KDR.
Adicionalmente, pueden obtenerse anticuerpos policlonales o
monoclonales frente a un péptido sintético (normalmente de
aproximadamente 9 a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud) a
partir de una porción de la proteína descrita en la ID SEC Nº 2.
Los anticuerpos monoespecíficos frente al KDR humano se purifican a
partir de antisueros de mamíferos que contienen anticuerpos
reactivos frente a KDR humano o se prepara como anticuerpos
monoclonales reactivos con KDR humano usando la técnica de Kohler y
Milstein (1975, Nature 256:495-497). Un anticuerpo
monoespecífico, según se usa en este documento, se define como una
especie única de anticuerpo o especies múltiples de anticuerpos con
características de unión homogéneas para KDR humano. La unión
homogénea según se usa en este documento se refiere a la capacidad
de la especie de anticuerpo para unirse a un antígeno o epítopo
específico, tal como aquellos asociados con el KDR humano, como se
describe anteriormente. Los anticuerpos específicos de KDR humano
se obtienen inmunizando animales, tales como ratones, ratas,
cobayas, conejos, cabras, caballos y similares, con una
concentración apropiada de la proteína KDR humana o un péptido
sintético generado a partir de una porción de KDR humana con o sin
un adyuvante inmune.
El suero preinmune se recoge antes de la primera
inmunización. Cada animal recibe entre aproximadamente 0,1 \mug y
aproximadamente 1.000 \mug de proteína KDR humana asociada con un
adyuvante inmune aceptable. Estos adyuvantes aceptables incluyen,
pero sin limitaciones, completo de Freund, incompleto de Freund,
precipitado de alumbre, emulsión de agua en aceite que contiene
Corynebacterium parvum y ARNt. La inmunización inicial
consisten en la proteína KDR humana o un fragmento peptídico de la
misma preferiblemente en adyuvante completo de Freund en múltiples
sitios por vía subcutánea (SC), intraperitoneal (IP) o ambas. A cada
animal se le extrae sangre a intervalos regulares, preferiblemente
cada semana, para determinar la titulación del anticuerpo. Los
animales pueden o no recibir inyecciones de refuerzo tras la
inmunización inicial. Generalmente, a los animales que reciben
inyecciones de refuerzo se les administra una cantidad igual de KDR
humana en adyuvante incompleto de Freund por la misma vía. La
inyecciones de refuerzo se administrar a intervalos de
aproximadamente tres semanas hasta que se obtienen las titulaciones
máximas. Aproximadamente 7 días después de cada inmunización de
refuerzo o aproximadamente semanalmente después de una inmunización
única, se extrae sangre a los animales, se recoge el suero y se
distribuye en alícuotas que se conservan a aproximadamente
-20ºC.
Los anticuerpos monoclonales (Acm) reactivos con
KDR humano se preparan mediante inmunización de ratones endogámicos,
preferiblemente Balb/c, con la proteína KDR humana. Los ratones se
inmunizaron por vía IP o SC con de aproximadamente 1 \mug a
aproximadamente 100 \mug, preferiblemente aproximadamente 10
\mug de proteína KDR humana en aproximadamente 0,5 ml de tampón o
solución salina incorporada en un volumen igual de un adyuvante
aceptable, como se discute anteriormente. Se prefiere el adyuvante
completo de Freund. Los ratones reciben una inmunización inicial el
día 0 y se les deja descansar de aproximadamente 3 a aproximadamente
30 semanas. Los ratones inmunizados reciben una o más
inmunizaciones de refuerzo de aproximadamente 1 a aproximadamente
100 \mug de KDR humano en una solución tampón, tal como una
solución salina tamponada con fosfato por vía intravenosa (IV). Los
linfocitos de los ratones positivos para anticuerpo,
preferiblemente linfocitos esplénicos, se obtuvieron extrayendo los
bazos de los ratones inmunizados mediante procedimientos
convencionales conocidos en la técnica. Las células de hibridoma se
producen mezclado los linfocitos esplénicos con un compañero
apropiado de fusión, preferiblemente con células de mieloma, en
condiciones que permitirán la formación de hibridomas estables.
Estos compañeros de fusión pueden incluir, pero sin limitaciones:
mielomas de ratón P3/NS1/Ag 4-1;
MPC-11; S-194 y Sp 2/0,
prefiriéndose Sp 2/0. Las células que producen anticuerpos y las
células de mieloma se fusionan en polietilénglicol, con un peso
molecular de aproximadamente 1.000 a concentraciones de
aproximadamente el 30% a aproximadamente el 50%. Las células de
hibridoma fusionadas se seleccionan mediante el crecimiento en medio
de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con
hipoxantina, timidina y aminopterina mediante procedimientos
conocidos en la técnica. Se recoge el líquido del sobrenadante de
los pocillos con crecimiento positivo en aproximadamente los días
14, 18 y 21 y se analiza la producción de anticuerpo mediante un
inmunoensayo, tal como un inmunorradioensayo en fase sólida (SPIRA)
usando KDR humano como antígeno. Los líquidos del cultivo también se
ensayan en el ensayo de precipitación de Ouchterlony para
determinar el isotipo del Acm. Las células de los hibridomas de los
pocillos positivos para la producción de anticuerpo se clonan por
técnicas tales como técnicas en agar blando de MacPherson, 1973,
Soft Agar-Techniques, en Tissue Culture Methods and
Applications, Kruse y Paterson, Editores, Academic
Press.
Press.
Los anticuerpos monoclonales se producen in
vivo mediante la inyección de ratones Balb/c estimulados con
aproximadamente 0,5 ml de pristano por ratón, con de aproximadamente
2x10^{6} a aproximadamente 6x10^{6} células de hibridoma
después de unos 4 días tras la estimulación. El líquido ascítico se
recoge aproximadamente de 8 a 12 días después de la transferencia
celular y los anticuerpos monoclonales se purifican mediante
técnicas conocidas en la técnica.
La producción in vitro de Acm
anti-KDR humano se realiza cultivando el hibridoma
en DMEM que contiene aproximadamente el 2% de suero fetal de
ternera para obtener cantidades suficientes del Acm específico. Los
Acm se purifican mediante técnicas conocidas en la materia.
Los títulos de anticuerpo en los líquidos
ascíticos o de cultivo del hibridoma se determinan mediante diversos
ensayos serológicos o inmunológicos que incluyen, pero sin
limitaciones, precipitación, aglutinación pasiva, técnica de
inmunoabsorción del anticuerpo ligado a enzima (ELISA) y técnicas de
radioinmunoensayo (RIA). Se utilizan ensayos similares para
detectar la presencia del KDR humano en fluidos corporales o en
extractos de tejidos y extractos celulares.
Será fácilmente evidente para los expertos en la
materia que los procedimientos descritos anteriormente para la
producción de anticuerpos monoespecíficos pueden utilizarse para
producir anticuerpos específicos de fragmentos peptídicos del KDR
humano o del KDR humano de longitud completa.
Se hacen columnas de afinidad con el anticuerpo
frente a KDR humano, por ejemplo, uniendo los anticuerpos a
Affigel-10 (Biorad), un gel soporte que se activa
previamente con ésteres de N-hidroxisuccinimida, de
modo que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte
de perlas del gel de agarosa. A continuación, los anticuerpos se
acoplan con el gel a través de enlaces amida con el brazo
espaciador. Los ésteres activados que quedan se inactivan a
continuación con etanolamina HCl 1M (pH 8). La columna se lava con
agua seguido de glicina HCl 0,23 M (pH 2,6) para eliminar cualquier
anticuerpo no conjugado o proteínas extrañas. A continuación, la
columna se equilibra en solución salina tamponada con fosfato (pH
7,3) y se pasa lentamente a través de la columna los sobrenadantes
de los cultivos celulares o los extractos celulares que contenían el
KDR humano de longitud completa o fragmentos de la proteína KDR
humana. Después, la columna se lava con solución salina tamponada
con fosfato hasta que la densidad óptica (A_{280}) desciende hasta
el valor de fondo y luego se eluye la proteína con glicina HCl 0,23
M (pH 2,6). A continuación, la proteína KDR humana purificada se
dializa frente a una solución salina tamponada con
fosfato.
fosfato.
La proteína KDR humana de la presente invención
es adecuada para su uso en un procedimiento de ensayo para la
identificación de compuestos que modulan la actividad KDR. Para
medir la actividad KDR se utiliza una construcción de fusión que
contiene KDR, tal como la fusión GST-KDR como se
discute en esta memoria de descripción. La actividad cinasa se
mide, por ejemplo, mediante la incorporación de fosfato marcado
radiactivamente en el sustrato ácido poliglutámico, tirosina, 4:1
(pEY). El producto pEY fosforilado queda atrapado en una membrana
de filtración y la incorporación del fosfato marcado radiactivamente
se cuantifica mediante recuento de centelleo. Las proteínas de
fusión recombinantes GST-dominio cinasa solubles se
expresan en células de insectos Sf21 (Invitrogen) usando un vector
de expresión de baculovirus (pAcG2T; Pharmingen). El tampón de lisis
es Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 0,5 M, DTT 5 mM, EDTA 1 mM, Tritón
X-100 al 0,5%, glicerol al 10%, leupeptina,
pepstatina y aprotinina a 10 \mug/ml cada uno y fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 1mM (todos de Sigma). El tampón de lavado es
Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 0,5 M, DTT 5 mM, EDTA 1 mM, Tritón
X-100 al 0,05%, glicerol al 10%, leupeptina,
pepstatina y aprotinina a 10 \mug/ml cada uno y fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 1mM. El tampón de diálisis es Tris 50 mM, pH
7,4, NaCl 0,5 M, DTT 5 mM, EDTA 1 mM, Tritón X-100
al 0,05%, glicerol al 50%, leupeptina, pepstatina y aprotinina a 10
\mug/ml cada uno y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1mM. El tampón
de reacción 10x es Tris 200 mM, pH 7,4, NaCl 1,0 M, MnCl_{2} 50
mM, DTT 10 mM y albúmina de suero bovino a 5 mg/ml (Sigma). El
tampón de dilución de la enzima es Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 0,1 M,
DTT 1 mM, glicerol al 10% y BSA a 100 mg/ml. La solución del
sustrato 10x podría ser poli(ácido glutámico, tirosina, 4:1) (Sigma)
a 750 \mug/ml; la solución de parada es ácido tricloroacético al
30%, pirofosfato sódico 0,2 M (ambos Fisher) y la solución de
lavado es ácido tricloroacético al 15%, pirofosfato sódico 0,2 M.
Las placas de filtración son placas de 96 pocillos con fibra de
vidrio GF/C, Millipore MAFC NOB.
En primer lugar, las células Sf21 se infectan
con virus recombinantes con una multiplicidad de infección de 5
partículas de virus/célula y se cultivan a 27ºC durante 48 horas.
Todas las etapas posteriores se realizaron a 4ºC, las células
infectadas se recogen mediante centrifugación a 1.000xg y se lisan a
4ºC durante 30 minutos con 1/10 de volumen de tampón de lisis
seguido de la centrifugación a 100.000xg durante 1 hora. A
continuación, el sobrenadante se pasa a través de una columna de
glutatión-Sepharosa (Pharmacia) equilibrada en
tampón de lisis y se lava con 5 volúmenes del mismo tampón seguido
de 5 volúmenes de tampón de lavado. La proteína
GST-KDR recombinante se eluye con tampón de
lavado/glutatión reducido 10 mM (Sigma) y se dializa frente al
tampón de diálisis.
El ensayo de KDR comprende las siguientes
etapas:
1. Añadir 5 \mul de inhibidor o control al
ensayo en DMSO al 50%;
2. Añadir 35 \mul de la mezcla de reacción que
contiene 5 \mul de tampón de reacción 10x, 5 \mul de ATP 25 mM
/10 \muCi de [^{32}P]ATP (Amersham) y 5 \mul de
sustrato 10x;
3. Iniciar la reacción mediante la adición de 10
\mul de KDR (25 mM) en tampón de dilución de la enzima.
4. Mezclar e incubar a temperatura ambiente
(\sim22ºC) durante 15 minutos;
5. Parar mediante la adición de 50 \mul de la
solución de parada;
6. Incubar durante 15 minutos a 4ºC;
7. Transferir una alícuota de 90 \mul a la
placa de filtración;
8. Aspirar y lavar 3 veces con 100 \mul de
solución de lavado;
9. Añadir 30 \mul de mezcla de centelleo,
sellar la placa y contar en un contador de centelleo Microbeta de
Wallac.
La modulación de KDR incluye la inhibición o
activación de la cinasa que afecta la función mitogénica de VEGF.
Los compuestos que modulan a KDR incluyen agonistas y
antagonistas.
Por tanto, la proteína KDR humana de la presente
invención puede obtenerse a partir de fuentes tanto nativas como
recombinantes (como una proteína de longitud completa, fragmento de
la proteína biológicamente activo o construcción de fusión) para su
uso en un procedimiento de ensayo para identificar moduladores del
KDR humano. En general, un procedimiento de ensayo para identificar
moduladores del KDR humano contendrá el dominio intracelular de KDR
humano y un compuesto o muestra de ensayo que contiene un posible
agonista o antagonista de la cinasa de KDR. Los compuestos o
muestras de ensayo pueden probarse directamente sobre, por ejemplo,
KDR purificada, cinasa KDR o una fusión GST- cinasa KDR, fracciones
subcelulares de células que producen KDR nativo o recombinante,
células completas que expresan KDR humano nativo o recombinante,
fragmentos de la proteína KDR intracelular y los respectivos
fragmentos de deleción y/o fragmentos extracelulares o
intracelulares de la proteína KDR y sus fragmentos de deleción
respectivos. Pueden añadirse el compuesto o muestra del ensayo a KDR
en presencia o ausencia de un sustrato del KDR humano conocido. La
actividad moduladora del compuesto o muestra de ensayo puede
determinarse, por ejemplo, analizando la capacidad del compuesto o
muestra de ensayo para unirse al dominio intracelular de KDR,
activar la proteína, inhibir la proteína, inhibir o potenciar la
unión de otros compuestos al KDR humano, modificar la regulación
del receptor VEGF o modificar la actividad cinasa.
Por tanto, la presente invención también se
refiere a las fracciones subcelulares de membrana de las células
huésped recombinantes (tanto procariotas como eucariotas así como
tanto células transformadas tanto de forma estable como
transitoria) que comprenden los ácidos nucleicos de la presente
invención. Estas fracciones subcelulares de membrana comprenderán
el KDR humano a niveles sustancialmente por encima de los niveles de
tipo silvestre y, por tanto, serán útiles para diversos ensayos
descritos a lo largo de esta memoria descriptiva.
La identificación de moduladores del KDR humano
será útil para el tratamiento de diversas enfermedades. Por
ejemplo, el crecimiento vascular en la retina o próximo a ella lleva
a la degeneración visual que termina en ceguera. El VEGF es
responsable de la mayor parte de la actividad angiogénica producida
en la retina o próxima a ella en la retinopatía diabética. El ARNm
y la proteína VEGF ocular se elevan en condiciones tales como la
oclusión de la vena de la retina en primates y disminuyen los
niveles de pO_{2} en ratones lo que lleva a la
neovascularización. La expresión de VEGF también aumenta de forma
significativa en regiones hipóxicas de tumores animales y humanos
adyacentes a áreas de necrosis. El VEGF contribuye al crecimiento
tumoral in vivo, promoviendo la angiogénesis a través de sus
actividades paracrina quimiotácticas y mitogénicas de la célula
endotelial vascular. La inhibición de KDR está implicada en la
neoangiogénesis patológica y los compuestos que inhiben la
actividad mitogénica de VEGF mediante la inhibición del KDR, serán
útiles en el tratamiento de enfermedades en las que la
neoangiogénesis es parte de la patología general, tal como
vascularización de la retina diabética, diversas formas de cáncer e
inflamación, lo que demuestra niveles elevados de expresión del gen
y de la proteína. Ejemplos de estos cánceres incluyen cánceres de
encéfalo, de mama, del tracto genitourinario, del sistema
linfático, de estomago, intestinales incluyendo de colon, páncreas,
próstata, laringe y pulmón. Estos incluyen linfoma histiocítico,
adenocarcinoma de pulmón, glioblastoma y cánceres de pulmón de
células pequeñas. Ejemplos de inflamación incluyen artritis
reumatoide, soriasis, dermatitis de contacto y reacciones de
hipersensibilidad.
La presente invención también se dirige a
procedimientos para seleccionar compuestos que modulen la expresión
del ADN o ARN que codifica una proteína KDR humana. Los compuestos
que modulan estas actividades pueden ser ADN, ARN, péptidos,
proteínas o moléculas orgánicas no proteicas. Los compuestos pueden
modular mediante el aumento o atenuación de la expresión del ADN o
ARN que codifica el KDR humano o de la función del KDR humano. Los
compuestos que modulan la expresión del ADN o ARN que codifican el
KDR humano o la función biológica del mismo pueden detectarse
mediante diversos ensayos. El ensayo puede ser un simple ensayo de
"si/no" para determinar si hay cambios en la expresión o en la
función. El ensayo puede hacerse cuantitativo mediante la
comparación de la expresión o función de una muestra de prueba con
los niveles de expresión o función de una muestra convencional.
Pueden prepararse kits que contengan el KDR humano, anticuerpos
frente a KDR humano o KDR humano modificado mediante procedimientos
conocidos para tales usos.
Las moléculas de ADN, moléculas de ARN, proteína
recombinante y anticuerpos de la presente invención pueden usarse
para la selección y medida de los niveles de KDR humano. Las
proteínas recombinantes, moléculas de ADN, moléculas de ARN y
anticuerpos llevan por si solas a la formulación de kits adecuados
para la detección y tipado del KDR humano. Este kit podría
comprender un vehículo compartimentalizado adecuado para mantener
confinado en al menos un recipiente cerrado. El vehículo además
podría comprender reactivos tales como KDR recombinante o
anticuerpos anti-KDR adecuados para la detección del
KDR humano. El vehículo también puede contener un medio para la
detección tal como antígeno marcado o sustratos enzimáticos o
similares.
Las composiciones farmacéuticamente útiles que
comprenden moduladores del KDR humano podrían formularse según
procedimientos conocidos, tales como mediante la mezcla de un
vehículo farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de estos vehículos y
procedimientos de formulación pueden encontrarse en Remington's
Pharmaceutical Sciences. Para formar una composición
farmacéuticamente aceptable adecuada para una administración eficaz,
estas composiciones contendrán una cantidad eficaz de la proteína,
ADN, ARN, KDR humano modificado u agonistas o antagonistas de KDR,
incluyendo activadores o inhibidores de la tirosina cinasa.
Las composiciones terapéuticas o diagnósticas de
la invención se administran a un individuo en cantidades
suficientes para tratar o diagnosticar trastornos. La cantidad
eficaz puede variar según diversos factores, tales como estado,
peso, sexo y edad del individuo. Otros factores incluyen el modo de
administración.
Las composiciones farmacéuticas pueden
proporcionarse al individuo mediante diversas vías, tales como
subcutánea, tópica, oral e intramuscular.
La expresión "derivado químico" describe
una molécula que contiene restos químicos adicionales que
normalmente no forman parte de la molécula base. Estos restos
pueden mejorar la solubilidad, semivida, absorción, etc., de la
molécula base. Alternativamente, los restos pueden atenuar efectos
adversos no deseados de la molécula base o disminuir la toxicidad
de la molécula base. Ejemplos de estos restos se describen en
diversos libros de texto, tales como Remington's Pharmaceutical
Sciences.
Los compuestos identificados según los
procedimientos descritos en este documento pueden utilizarse de
forma independiente a dosis apropiadas. Alternativamente, puede ser
deseable la administración conjunta o secuencial de otros
agentes.
Las composiciones que contienen compuestos
identificados según esta invención como el principio activo pueden
administrarse en una amplia variedad de formas de dosificación
terapéutica en vehículos convencionales para la administración. Por
ejemplo, los compuestos pueden administrarse en formas de
dosificación oral; tales como comprimidos, cápsulas (incluyendo
cada una formulaciones de liberación programada y liberación
mantenida), píldoras, polvos, granulados, elixires, tinciones,
soluciones, suspensiones, jarabes y emulsiones, o mediante
inyección. Así mismo, también pueden administrarse de forma
intravenosa (tanto en bolo como en infusión), intraperitoneal,
subcutánea, tópica con o sin oclusión o intramuscular, siendo todas
las formas bien conocidas por los expertos en la materia
farmacéutica.
De forma ventajosa, los compuestos pueden
administrarse en una dosis única diaria, o la dosis total diaria
puede administrase dividida en dos, tres o cuatro dosis al día.
Además, los compuestos de la presente invención pueden
administrarse de forma intranasal a través del uso tópico de
vehículos intranasales adecuados, o a través de vías transdérmicas,
usando las formas de parches cutáneos transdérmicos bien conocidos
por los expertos en la materia. Para su administración en forma de
un sistema de administración transdérmico, la administración de la
dosis será, por supuesto, continua en lugar de manera intermitente a
lo largo del régimen de dosificación.
Para una politerapia con más de un agente
activo, cuando los agentes activos están en formulaciones de
dosificación independientes, los agentes activos pueden
administrarse de forma concomitante o pueden administrarse separados
a tiempos escalonados.
El régimen de dosificación que utiliza los
compuestos de la presente invención, se selecciona de acuerdo con
una diversidad de factores que incluyen tipo, especie, edad, peso,
sexo y condición médica del paciente, la gravedad de la enfermedad
que se va a tratar; la vía de administración, las funciones renal,
hepática y cardiovascular del paciente y el compuesto en especial
del mismo empleado. Un medico o veterinario experto puede determinar
fácilmente y prescribir la cantidad eficaz del fármaco para
prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la enfermedad. La
precisión óptima para alcanzar las concentraciones del fármaco
dentro del intervalo que produce eficacia sin toxicidad requiere un
régimen basado en los parámetros cinéticos de la disponibilidad del
fármaco en los sitios diana. Esto supone una consideración de la
distribución, equilibrio y eliminación de un fármaco.
Los ejemplos siguientes se proporcionan para
ilustrar la presente invención sin limitar, sin embargo, a la
misma.
Ejemplo
1
Materiales: Se obtuvo una biblioteca de
ADNc de fago lambda de células endoteliales de la vena umbilical
humana de Clonetech (Nº de Cat. HL1070b). La modificación del ADN y
las enzimas de restricción se obtuvieron de Promega. El plásmido
pGEM7Z se obtuvo de Promega (Nº de Cat. P2251), la polimerasa Taq
era de Perkin Elmer Cetus (número de parte
N801-0055). Los enlazadores BamHI se obtuvieron de
New England Bilolabs (Nº de Cat. 1071). El
[\alpha-^{32}P]dATP se obtuvo de Amersham
(Nº de Cat. PB 10204). Rediprime también se obtuvo de Amersham (Nº
de Cat. RPN 1633). El vector de expresión de baculovirus pAcG2T se
obtuvo de Pharmingen (Nº de Cat. 21414P).
Los cebadores para PCR son los siguientes:
KDR-A
5'-GGAATTCCATCCAAGCGGCAAATGTGTC-3'
(ID SEC Nº 3);
KDR-B
5'-GGAATTCCGAGTCTTCTACAAGGGTCTC-3'
(ID SEC Nº 4);
KDR-C
5'-TTATGACAACACAGCAGG-3' (ID SEC Nº
5) y
KDR-D
5'-TTGGATCCTCGAGTTGGGGTGTGGATGC-3'
(ID SEC Nº 6).
Procedimientos: Clonación del gen: El
ADNc del KDR se aisló sometiendo una biblioteca de ADNc de fago
lambda de células endoteliales de la vena umbilical humana de
Clonetech a una sonda de ADN específica de KDR de 576 pares de
bases. La sonda se preparó mediante PCR usando los cebadores
KDR-A/KDR-B y la polimerasa Taq,
marcándose a continuación hasta una actividad específica de
1x10^{7} cpm/ng mediante cebado aleatorio. El fago se dispuso en
placas a aproximadamente 50.000 placas de fago/placa y la
hibridación se realizó mediante protocolos convencionales. Se
analizaron un total de 1x10^{6} fagos. Se aislaron clones del fago
lambda que contenían inserciones únicas a través de tres rondas de
cultivo en placa repetido y, a continuación, se caracterizaron. Los
110 pares de bases del extremo 3' no representados en ninguno de los
clones aislados se clonaron por PCR a partir de la misma biblioteca
que anteriormente usando los cebadores KDR-C y
KDR-D. Se usaron clones superpuestos para generar
un gen KDR de longitud completa mediante digestión por enzimas de
restricción, aislamiento de los fragmentos individuales del gen y
ligamiento (las enzimas de restricción y la ligasa se obtuvieron de
Promega) en pGEM7Z. El gen contenía un sitio XhoI en el extremo 5'
terminal que se cambió por un sitio BamHI cortando primero con XhoI
y formando a continuación un extremo romo con la ADN polimerasa y
ligando un enlazador oligonucleotídico BamHI y, finalmente,
clonándolo como un fragmento BamHI/BamHT en pGEm7Z. El gen se
secuenció en un secuenciador automático ABI Prism modelo número 377.
La secuencia de ADNc del KDR humano se muestra en las Figuras 1A y
1B. En la Figura 2 se muestra la secuencia de aminoácidos deducida
del KDR humano.
Ejemplo
2
El dominio citoplásmico de KDR que contiene la
actividad tirosina cinasa se clonó independientemente como una
fusión génica con la glutatión S-transferasa (GST)
en un vector de expresión de baculovirus para caracterizar la
actividad tirosina cinasa. Para construir esta fusión con GST, se
introdujo un sitio de clonación Kpn I en el gen KDR cambiando los
codones que codifican los restos Gly 800 (GGG a GGC) y Leu 802 (TTG
a CTG), y el sitio BamHI existente se eliminó cambiando el codón
que codifica Asp 807 (GAT a GAC); estos cambios son silenciosos y
no cambian la secuencia de aminoácidos del receptor.
Se introdujo un nuevo sitio BamHI para formar
una fusión en fase con el extremo carboxílico terminal de GST y KDR
en la Ala 792. La GST y los fragmentos digeridos con BamHI de KDR se
ligaron para generar la fusión en fase GST/KDR. La proteína
tirosina cinasa GST/KDR activa se produce en células de
insectos.
Ejemplo
3
El dominio cinasa de KDR se clonó usando el
sitio BamHI preexistente en el extremo 5' del dominio cinasa e
introduciendo un codón de parada seguido por un sitio Sall en el
extremo 3' del dominio cinasa (Tyr 1.175, TAC se cambió por TAA).
El ADN de KDR se usó como molde en una reacción de PCR con los
cebadores KDR-E (5'-GGATC
CAGATGAACTCCCATTG-3' [ID SEC Nº 7]) y KDR-F (5'-GTCGACTTAGTCTTTGCCATCCTGCTGAGC-3' [ID SEC Nº 8]). El fragmento BamHI/SaII del núcleo cinasa de KDR resultante se clonó en pBlueBacHis2B, esto crea una fusión en fase del codón de iniciación de metionina y la secuencia de poli histidina del vector con el dominio cinasa de KDR. Este vector, pBBH-KDR-1, también proporciona un sitio de reconocimiento para la enterocinasa para eliminar la etiqueta polipeptídica de His mediante proteolisis. El núcleo de la proteína cinasa KDR se expresó en células de insecto y se purificó en una columna quelante de níquel. El núcleo cinasa de la KDR purificada se activó en el ensayo cinasa descrito en este documento.
CAGATGAACTCCCATTG-3' [ID SEC Nº 7]) y KDR-F (5'-GTCGACTTAGTCTTTGCCATCCTGCTGAGC-3' [ID SEC Nº 8]). El fragmento BamHI/SaII del núcleo cinasa de KDR resultante se clonó en pBlueBacHis2B, esto crea una fusión en fase del codón de iniciación de metionina y la secuencia de poli histidina del vector con el dominio cinasa de KDR. Este vector, pBBH-KDR-1, también proporciona un sitio de reconocimiento para la enterocinasa para eliminar la etiqueta polipeptídica de His mediante proteolisis. El núcleo de la proteína cinasa KDR se expresó en células de insecto y se purificó en una columna quelante de níquel. El núcleo cinasa de la KDR purificada se activó en el ensayo cinasa descrito en este documento.
Ejemplo
4
El dominio citoplásmico del receptor de VEGF se
alineó a mano con la secuencia de FGFR1 tomada de la estructura
cristalina publicada (Mohammadi, M., Schlessinger, J. y Hubbard,
S.R., 1996, Cell 86:577). Las secuencias eran \sim60% idénticas
en este alineamiento. A continuación, se construyó un modelo de
homología de la cinasa de KDR en Quanta (versión 4.1p) copiando las
coordenadas de la estructura cristalina de
FGFR1/AMP-PCP. La región cinasa insertada (restos
933-1.006 de KDR) no se incluyó en el modelo ya que
no había una conformación única para esta región en la estructura
cristalina. A continuación, el modelo de homología se minimizó
usando CHARMM en Quanta limitando el esqueleto de la proteína y
permitiendo que las cadenas laterales se muevan libremente.
El cambio del resto de aminoácido 848 de la Glu
publicada por Val en la ID SEC Nº 2 se encuentra en la estructura
modificada rica en glicina, que forma parte del bolsillo de unión a
ATP. Se encuentra que la Val altamente conservada establecía
contactos hidrófobos con el ATP en otras cinasas y parece estar
posicionada para formar estos mismos contactos en KDR.
Probablemente, la Glu cargada en esta posición no permite un
contacto adecuado con el ATP. Esto se muestra mediante el modelado
por ordenador en la Figura 3A y 3B. La Figura 3A muestra el dominio
de unión a ATP del modelo de homología del mutante V848E de KDR con
AMP-PCP unido. La cadena lateral de E848 está en
contacto con la adenina de AMP-PCP. No es visible el
fosfato gamma de AMP-PCP. El trazado del carbono
alfa de la proteína se muestra entre líneas, el
AMP-PCP en modelo de varillas y la cadena lateral
de E848 en modelo de bolas. El lóbulo N-terminal
aparece coloreado de azul (o, alternativamente, marcado con
círculos vacíos) con la excepción de la estructura modificada rica
en glicina que está coloreado de verde (o alternativamente marcada
como una región rayada). El lóbulo C-terminal está
coloreado en rojo (o alternativamente, marcado con círculos
negros). La Figura 3B muestra el dominio de unión a ATP del modelo
de homología de KDR con AMP-PCP unido. La cadena
lateral de V848 forma contactos hidrófobos con la adenina de
AMP-PCP. No es visible el fosfato gamma de
AMP-PCP. El trazado de carbono alfa de la proteína
se muestra entre líneas, el AMP-PCP en modelo de
varillas y la cadena lateral de V848 en modelo de bolas. El lóbulo
N-terminal aparece coloreado de azul (o,
alternativamente, marcado con círculos vacíos) con la excepción de
la estructura modificada rica en glicina que está coloreado de
verde (o alternativamente marcada como una región rayada). El lóbulo
C-terminal está coloreado en rojo (o
alternativamente, marcado con círculos negros).
Ejemplo
5
KDRcytE848 y KDR_{cyt}V848 purificados se
incubaron a concentraciones de 12 ng o 120 ng, respectivamente, con
o sin ATP 1 mM a 37ºC durante 10 min. La reacción se detuvo mediante
la adición de un volumen igual de tampón de muestra de
PAGE-SDS 2x y se hirvió durante 5 min. Los productos
de reacción se separaron mediante PAGE SDS al 7,5% y se analizaron
mediante transferencia Western incubados con el anticuerpo
antifosfotirosina PY20 (Transduction Laboratories; Figura 4A) o un
anticuerpo anti-KDR (Santa Cruz Biotechnology;
Figura 4B), se visualizaron usando el kit de detección ECL y se
cuantificó mediante barrido con un densitómetro (Molecular
Dynamics). La Figura 4A muestra como
GST-KDR_{cyt}E848 purificado no era capaz de
autofosforilarse en presencia de ATP 1 mM, en el que 12 ng de
GST-KDR_{cyt}V848 en presencia de ATP 1 mM daba
lugar a la autofosforilación. La Figura 4B muestra una señal frente
al anticuerpo anti-KDR para 120 ng de
GST-KDR_{cyt}E848 y 12 ng de
GST-KDR_{cyt}V848.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTES: Merck & Co., Inc.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: RECEPTOR DE TIPO TIROSINA CINASA HUMANO, KDR
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Merck & Co., Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: P.O. Box 2000
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Rahway
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NJ
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 07065-0907
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible con PC
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1,30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Hand, J. Mark
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36.545
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 19963PV
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 732/594-3905
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 732/594-4720
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4.071 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1.356 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAATTCCAT CCAAGCGGCA AATGTGTC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAATTCCGA GTCTTCTACA AGGGTCTC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTATGACAAC ACAGCAGG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc= "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEQ Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGATCCTC GAGTTGGGGT GTGGGATGC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATCCAGAT GAACTCCCAT TG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGACTTAG TCTTTGCCAT CCTGCTGAGC
\hfill30
Claims (20)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica una forma biológicamente activa de la proteína KDR humana
en la que la posición 848 es Val, la posición 498 es Glu, la
posición 772 es Ala, la posición 787 es Arg, la posición 835 es Lys
y la posición 1.347 es Ser.
2. Una molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 1 que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en
la ID SEC Nº 1.
3. Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica una porción intracelular de una proteína KDR humana que
comprende del aminoácido 790 al aminoácido 1.356 de la secuencia
mostrada en la ID SEC Nº 2.
4. Un ácido nucleico según la reivindicación 3
en el que se inserta un codón de terminación, de modo que la fase
de lectura abierta de KDR termina en la Tyr 1.175.
5. Un ácido nucleico según la reivindicación 3
que codifica una proteína de fusión KDR soluble que comprende del
aminoácido 790 al aminoácido 1.356 de la secuencia mostrada en la ID
SEC Nº 2.
6. Un ácido nucleico según la reivindicación 5
que codifica GST-KDR.
7. Un ácido nucleico según la reivindicación 4
que está contenido en un vector de ADN, pBlucBacHis2B.
8. Un vector de expresión para la expresión de
una proteína KDR humana en una célula huésped recombinante en el
que dicho vector de expresión comprende un ácido nucleico según se
define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
9. Una célula huésped que expresa una proteína
KDR humana recombinante en la que dicha célula huésped contiene un
vector de expresión según la reivindicación 8.
10. Una célula huésped según la reivindicación 9
que es una célula eucariota.
11. Una célula huésped según la reivindicación 9
que es una célula procariota.
12. Una fracción subcelular de membrana obtenida
a partir de una célula huésped según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11 que contiene la proteína KDR humana
recombinante.
13. Un procedimiento para la expresión de una
proteína KDR humana en una célula huésped recombinante que
comprende:
(a) transfectar un vector de expresión según la
reivindicación 8 en una célula huésped adecuada, y
(b) cultivar la célula huésped de la etapa (a)
en condiciones que permiten la expresión de la proteína KDR humana
a partir del vector de expresión.
14. Una proteína KDR humana aislada que consiste
en la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID SEC Nº 2.
15. Un fragmento de una proteína aislado que es
una porción intracelular de una proteína KDR humana y que comprende
del aminoácido 790 al aminoácido 1.356 de la secuencia mostrada en
la ID SEC Nº 2.
16. Una proteína según la reivindicación 15 que
es una proteína de fusión de KDR soluble.
17. La proteína según la reivindicación 16 que
es GST-KDR.
18. Un procedimiento para identificar un
compuesto que es un modulador del KDR humano que comprende:
(a) combinar una proteína como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, un sustrato y un
compuesto de ensayo y
(b) medir la actividad tirosina cinasa de dicha
proteína.
19. Un procedimiento según la reivindicación 18
en el que el sustrato es pEY.
20. Un procedimiento según la reivindicación 18
ó 19 en el que la proteína es GST-KDR.
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