ES2286818T3 - Funcion y actividad de vpr. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTAN COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE COMPRENDEN LA PROTEINA VPR DEL HIV O UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA LA VPR. TAMBIEN SE PRESENTAN METODOS PARA TRATAR PACIENTES QUE SUFRAN ENFERMEDADES CARACTERIZADAS POR LA HIPERPROLIFERACION DE CELULAS NO DIFERENCIADAS TALES COMO EL CANCER MEDIANTE LA ADMINISTRACION DE TALES COMPOSICIONES. SE PRESENTAN METODOS PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS QUE TENGAN ACTIVIDAD ANTI HIV, EN PARTICULAR METODOS PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS QUE MODULEN LA ACTIVIDAD DE LA VPR Y DE LOS COMPUESTOS DE IDENTIFICACION QUE INHIBEN LA UNION DE LA VPR AL GAG DE LA PROTEINA DEL HIV.

Description

Función y actividad de vpr.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para diferenciar células, compuestos farmacéuticos relacionados con las mismas, y métodos para identificar compuestos posiblemente útiles en el tratamiento del SIDA.

Antecedentes de la invención

Desde la demostración en 1987 que una pequeña fase de lectura abierta en VIH-1 denominada R codifica una proteína de 15 kD (Wong-Staal, F., et al., (1987) AIDS Res. Hum. Retroviruses 3: 33-39), se ha informado de muy poco acerca de la función de la proteína viral R (vpr). El documento WO 90/15875 describió una secuencia de ADN que codifica un gen que puede expresar el producto génico de vpr, la propia proteína y un anticuerpo que reacciona con la proteína. La fase de lectura abierta vpr está conservada en todos los genomas de VIH-1 y VIH-2 y en la mayoría, sino en todos, los genomas del virus de inmunodeficiencia de simios (SIV). VPR es inmunogénica in vivo porque un gran conjunto de individuos VIH^{+} fabrica anticuerpos que pueden reaccionar con un péptido vpr producido de forma bacteriana (Wong-Staal, F. et al., (1987) AIDS Res. Hum. Retroviruses 3: 33-39).

El progreso de la infección por VIH a SIDA está en gran parte determinado por los efectos de VIH sobre las células que infecta, incluyendo linfocitos T CD4^{+} y macrófagos. Por otro lado, la activación, diferenciación y proliferación celular se cree a su vez que están regulados por la infección de VIH y la replicación en células T y macrófagos. Gallo, R. C. et al. (1984) Science 24: 500; Levy, J. A. et al., (1984) Science 225: 840; Zack, J. A. et al., (1988) Science 240:1026; Griffin, G. E. et al., (1988) Nature 339: 70; Valentin, A. et al., (1991) J. AIDS 4: 751; Rich, E.A. et al., (1992) J. Clin. Invest. 89:176 y Schuitemaker, H. et al., (1992) J. Virol. 66:1354. La división celular per se puede no ser necesaria ya que VIH y otros lentivirus pueden proliferar en macrófagos no proliferantes, diferenciados de forma terminal y linfocitos T detenidos en el crecimiento. Rose, R. M. et al. (1986) Am. Rev. Respir. Dis. 143: 850; Salahuddin, S.Z. et al. (1986) Blood 68: 281; y Li, G. et al. (1993) J. Virol. 67: 3969. La capacidad de los lentivirus, incluyendo VIH, de replicarse en células no proliferantes, particularmente en macrófagos, se cree que es única entre los retrovirus y puede ser significativo que varios lentivirus contengan un gen tipo vpr. Myers, G. et al. (1992) AIDS Res. Hum. Retrovir. 8: 373. Una infección por VIH de las líneas celulares mieloides puede provocar un fenotipo más diferenciado y un aumento de la expresión de factores tales como NF-KB que son necesarios para la replicación de VIH. Roulston, A. et al., (1992) J. Exp. Med. 175: 751; y Chantal Petit, A. J. et al. (1987) J. Clin. Invest. 79:1883.

La mayor evidencia para la función de la proteína vpr proviene de varios estudios que informan de las actividades de las cepas de VIH que tienen mutaciones en el gen vpr. Se ha informado de que mutaciones en el gen vpr provoca una disminución en la replicación y citopatogenicidad de VIH-1, VIH-2 y SIV en linfocitos T CD4^{+} primarios y líneas de células T transformadas (Ogawa, K., et al., (1989) J. Virol. 63:4110-4114; Shibata, R., et al. (1990a), J. Med. Primatol. 19:217-225; Shibata, R., et al. (1990b) J. Virol. 64:742-747 y Westervelt, P. et al. (1992) J. Virol. 66:3925), aunque otros han informado de que el gen vpr mutado no tiene efectos sobre la replicación (Dedera, D., et al. (1989) Virol. 63:3205-3208). Es interesante observar que VIH-2 mutado para vpr se ha presentado como incapaz para infectar monocitos primarios/macrófagos (Hattori, N., et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8080-8084). La transactivación de la repetición terminal larga de VIH y promotores heterólogos por VIH está aumentada en aproximadamente 3 veces en VIH-1 de tipo silvestre frente a vpr-negativo, aunque el mecanismo a través del cual vpr puede transactivar la transcripción es desconocido y puede ser indirecto (Cohen, E. A., et al., (1990b) J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 3:11-18). La relación entre los efectos de vpr sobre la actividad del promotor y la infectividad viral no está clara. La proteínas vpr se incorpora en la partícula viral, y este descubrimiento ha conducido a la propuesta de que vpr funciona pronto en la infección, después de la penetración del virus y la pérdida de la envuelta, y que vpr puede interaccionar con mecanismos reguladores celulares importantes para establecer la infección (Cohen, E. A. et al. 1990a J. Virol. 64:3097-3099; Yu, X.F., et al. (1990) J. Virol. 64:5688-6593; y Yuan, X., et al., (1990) AIDS Res. Hum. Retroviruses 6:1265-1271).

El gen vpr de VIH-1 ha demostrado inducir la inhibición del crecimiento celular y la diferenciación en líneas tumorales de diferenciación intermedia in vitro. Levy, D. N. et al. (1993) Cell 72:541. Como la proteína vpr se origina en partículas virales, vpr puede jugar un papel en el establecimiento de una infección productiva.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a métodos in vitro para inducir células indiferenciadas a diferenciarse. La presente invención se refiere a un método para estimular las células indiferenciadas a que se diferencien, lo que comprende la etapa de poner en contacto células in vitro con una cantidad de proteína vpr suficiente para estimular la diferenciación. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, las células indiferenciadas se ponen en contacto con la proteína vpr o un fragmento funcional de la proteína vpr para inducir que las células se diferencien. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica la proteína vpr o un fragmento funcional de la proteína vpr se introduce en células indiferenciadas. La expresión de la secuencia que codifica la proteína vpr o el fragmento funcional de la proteína vpr provoca la producción de la proteína vpr o el fragmento el funcional de la proteína vpr en la célula, provocando que la célula se diferencie. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la secuencia que codifica la proteína vpr a un fragmento funcional de la misma está unida de forma operativa a elementos reguladores que son necesarios para la expresión de la secuencia en la célula. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la molécula de ácido nucleico es ADN.

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína vpr y vehículo farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con alguna realización de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un fragmento funcional de la proteína vpr y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica la proteína vpr y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un fragmento funcional de la proteína vpr y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la composición farmacéutica comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica la proteína vpr o un fragmento funcional de la misma que está unida de forma operativa a elementos reguladores que son necesarios para la expresión de la secuencia en la célula. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, una composición farmacéutica comprende una molécula de ácido nucleico que es ADN.

La presente invención se refiere al uso de una cantidad de proteína vpr suficiente para estimular la hiperproliferación de células indiferenciadas en la fabricación de un medicamento para tratar a individuos diagnosticados con o que se sospecha que padecen enfermedades caracterizadas por células indiferenciadas hiperproliferantes. De acuerdo con algunas realizaciones, el uso de la presente invención comprende las etapas de administrar a dichos individuos, una cantidad eficaz de proteína vpr o un fragmento funcional de la proteína vpr. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, el uso de la presente invención comprende las etapas de administrar a dichos individuos una cantidad eficaz de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica la proteína vpr o un fragmento funcional de la proteína vpr. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la secuencia que codifica la proteína vpr o un fragmento funcional de la proteína vpr está unida de forma operativa a elementos reguladores que son necesarios para la expresión de la secuencia en células. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la molécula de ácido nucleico es ADN. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la enfermedad caracterizada por células indiferenciadas hiperproliferantes es cáncer o psoriasis.

La presente invención se refiere a un método para identificar compuestos que inhiban que vpr estimule la diferenciación de células indiferenciadas que comprende las etapas de poner primero en contacto, en presencia de un compuesto de ensayo, dichas células con una cantidad de proteína vpr suficiente para estimular la diferenciación y después observar dichas células para determinar si sucede la diferenciación celular.

La presente invención se refiere a una proteína vpr producida en células eucariotas. La vpr se produce preferiblemente en células humanas, células CHO, células de insecto o células de levadura.

Descripción de las realizaciones preferidas de la invención

La presente invención surge del descubrimiento de actividades de la proteína vpr reguladora de VIH (mencionada en este documento como "proteína vpr"). Se ha descubierto que la proteína de VIH vpr induce que las células indiferenciadas se diferencien en individuos infectados con VIH ya que pueden producir anticuerpos que se unen específicamente a vpr eucariota. Estas actividades y funciones de vpr permiten que vpr sea útil en métodos in vitro para alterar células incluyendo células cancerosas y células asociadas con enfermedades autoinmunes, métodos para identificar compuestos que inhiban la infección por VIH y/o replicación, y composiciones farmacéuticas.

La invención se refiere a la capacidad de vpr de inducir que células indiferenciadas se diferencien. En algunas realizaciones, se usa vpr en una composición farmacéutica para tratar a individuos que padecen enfermedades asociadas con células indiferenciadas hiperproliferantes tales como cáncer o psoriasis. En algunas realizaciones, se usan vpr como un reactivo para inducir in vitro que células indiferenciadas se diferencien. En algunas realizaciones, las células tumorales indiferenciadas de origen de tipo celular específico se inducen para que se diferencien de nuevo a su tipo celular anterior. Se cree que la capacidad de vpr para estimular la diferenciación ayuda al virus en la replicación produciendo un entorno o condiciones deseables, particularmente para la producción de partículas virales. Por consiguiente, en un aspecto de la invención, pueden identificarse compuestos anti-VIH identificando compuestos que inhiban la actividad de vpr para inducir la diferenciación en células indiferenciadas.

La presente invención también se refiere al uso de fragmentos funcionales de vpr para inducir in vitro la diferenciación de células indiferenciadas y a reactivos y composiciones farmacéuticas que comprenden fragmentos funcionales de vpr y a usos de fragmentos funcionales de vpr. Como se usa en este documento, se entiende que la expresión "fragmento funcional de vpr" se refiere a un fragmento de vpr que retiene su capacidad de inducir la diferenciación de células indiferenciadas. El fragmento funcional de vpr es al menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud derivado de vpr y puede comprender secuencias aminoacídicas no vpr. Un especialista en la técnica puede determinar fácilmente si una proteína o péptido es un fragmento funcional de vpr examinando su secuencia y ensayando su capacidad de diferenciar células indiferenciadas sin experimentación excesiva. Las versiones truncadas de vpr pueden prepararse y ensayarse usando métodos rutinarios y material de partida fácilmente disponible. Como se usa en este documento, también se entiende que la expresión "fragmento funcional" hace referencia a péptidos, polipéptidos, secuencia de aminoácidos unida por enlaces no peptídicos, o proteínas que comprenden una secuencia de aminoácidos que es idéntica o sustancialmente homóloga a al menos una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína vpr y que son capaces de inducir que una célula indiferenciada hiperproliferante se diferencie. La expresión "sustancialmente homóloga" se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene sustituciones conservativas. Un especialista en la técnica puede producir fragmentos funcionales de la proteína vpr siguiendo la descripción proporciona en este documento y técnicas bien conocidas. Los fragmentos funcionales identificados de este modo pueden usarse y formularse en lugar de vpr de longitud completa sin experimentación excesiva.

Los aspectos terapéuticos incluyen el uso de vpr, un fragmento funcional de vpr, moléculas de ácido nucleico que codifican vpr o moléculas de ácido nucleico que codifican un fragmento funcional de vpr en la fabricación de composiciones farmacéuticas útiles para tratar a un individuo que padece enfermedades asociadas con células indiferenciadas hiperproliferantes tales como cáncer o psoriasis.

Un aspecto de la presente invención es usar vpr, fragmento funcional de vpr, moléculas de ácido nucleico que codifican vpr o moléculas de ácido nucleico que codifican vpr o moléculas de ácido nucleico que codifican un fragmento funcional de vpr en la fabricación de una composición farmacéutica para combatir enfermedades que se caracterizan por la hiperproliferación de células indiferenciadas tales como cáncer o psoriasis. De acuerdo con la invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína vpr o un fragmento funcional de la misma o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN o ARN que codifica la proteína vpr o un fragmento funcional de la misma.

Un aspecto de la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína vpr de VIH o un fragmento funcional de la misma y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína vpr o un fragmento funcional de la misma son útiles para tratar a un individuo que tiene una patología o afección caracterizada por células indiferenciadas hiperproliferantes. Como se describe en este documento, las composiciones farmacéuticas útiles para tratar enfermedades caracterizadas por células indiferenciadas hiperproliferantes puede incluir la proteína vpr o un fragmento funcional de la misma ya que la proteína vpro un fragmento funcional de la misma son por definición agentes que inducen que las células indiferenciadas se diferencien. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son particularmente útiles para tratar un cáncer caracterizado por tumores sólidos. La capacidad de estimular células indiferenciadas hiperproliferantes a diferenciarse proporciona un medio para alterar la hiperproliferación de las células. En enfermedades tales como cáncer y psoriasis que están caracterizadas por la hiperproliferación de células indiferenciadas, la composición farmacéutica es útil para estimular que las células indiferenciadas se diferencien. Cuando se induce a células indiferenciadas hiperproliferantes a diferenciarse, cesan de proliferar y finalmente mueren.

Por consiguiente, otro aspecto la presente invención es el uso de una cantidad de proteína vpr suficiente para estimular la diferenciación de células indiferenciadas hiperproliferantes en la fabricación de un medicamento para tratar a un individuo que padece una enfermedad asociada con células indiferenciadas hiperproliferantes.

Vpr puede producirse por un medio rutinario usando materiales de partida fácilmente disponibles como se ha descrito anteriormente. La secuencia de ácido nucleico que codifica vpr así como la secuencia de aminoácidos de la proteína son bien conocidas. El genoma completo de VIH está publicado. Las secuencias de las repeticiones terminales largas están presentadas en Stacich, B. et al., (1985) Science 227: 538-540. Las secuencias de nucleótidos completas están presentadas en Ratner, L. et al., (1985) Science 313:277-284 y Ratner, L. et al., (1987) AIDS Res. Hum. Retroviruses 3:57-69. La secuencia de ADN de HIV-1/3B está publicada en Fisher, A., 1985 Nature 316:262. La secuencia de nucleótidos de la cepa HXB2 de VIH-1 está disponible en línea con el número de acceso a Genbank K03455. La secuencia de ADN de VIH está publicada en Reiz, M.S., 1992 AIDS Res. Human Retro. 8:1549. La secuencia está accesible en Genbank Nº: M17449. Cada una de estas referencias que incluye la información de secuencia disponible al público se incorpora en este documento como referencia.

Las moléculas de ADN que codifican vpr están fácilmente disponibles al público. El plásmido pNL-43 que contiene una secuencia de ADN que codifica la cepa MN de VIH-1 que incluye la proteína vpr y el plásmido pHXB2 que contiene una secuencia de ADN que codifica la cepa HIV-1/3B de VIH están ambas disponibles en el AIDS Research Referente and Reagen Program (ARRRP), Division of AIDS, NIAID, NIH, Bethesda, MD.

Proporcionar una secuencia de ADN adecuada que codifique la proteína deseada permite la producción de la proteína usando técnicas recombinantes ahora conocidas en la técnica. La secuencia codificante puede obtenerse recuperando la secuencia de ADN de los plásmidos disponibles al público que comprende ADN que codifica la proteína vpr. La secuencia de ADN también puede obtenerse de otras fuentes de ADN de VIH o puede prepararse químicamente usando una secuencia de nucleótidos sintetizada. Cuando el ADN codificante se prepara de forma sintética, puede obtenerse la ventaja de preferencias de codones conocidas del hospedador pretendido donde tiene que expresarse el ADN.

Un especialista en la técnica puede, usando técnicas bien conocidas, obtener una molécula de ADN que codifique la proteína vpr e insertar esa molécula de ADN en un vector de expresión disponible en el mercado para su uso en sistemas de expresión bien conocidos. Por ejemplo, el plásmido disponible en el mercado pSE420 (Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse para la producción en E. coli. El plásmido disponible en el mercado pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse para producción en cepas de levadura de S. cerevisiae. El sistema de expresión de baculovirus completo MaxBac^{TM} (Invitrogen, San Diego, CA) disponible en el mercado puede usarse para la producción en células de insecto. El plásmido pcDNA I disponible en el mercado (Invitrogen, San Diego, CA) puede usarse para la producción en células de mamífero tales como células de Ovario de Hámster Chino.

Un especialista en la técnica puede usar estos sistemas de vectores de expresión comerciales y otros para producir la proteína vpr usando técnicas rutinarias y materiales de partida fácilmente disponibles.

Un especialista en la técnica puede usar otros vectores de expresión y sistemas disponibles en el mercado o producir vectores usando métodos bien conocidos y materiales de partida fácilmente disponibles. Los sistemas de expresión que contienen las secuencias de control necesarias, tales como promotores y señales de poliadenilación, y preferiblemente potenciadores, están fácilmente disponibles y son conocidos en la técnica para una diversidad de hospedadores. Véase, por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Segunda Ed. Col. Spring Harbor Press (1989). Por tanto, las proteínas deseadas pueden prepararse tanto en sistemas procariotas como eucariotas, produciendo un espectro de formas procesadas de la proteína.

El sistema procariota más comúnmente usado sigue siendo E. coli, aunque también son útiles otros sistemas tales como B. subtilis y Pseudomonas. Las secuencias de control adecuadas para sistemas procariotas incluyen promotores tanto constitutivos como inducibles que incluyen el promotor lac, el promotor trp, promotores híbridos tales como el promotor tac, el promotor P1 del fago lambda. En general, las proteínas extrañas pueden producirse en estos hospedadores como proteínas de fusión o maduras. Cuando las secuencias deseadas se producen como proteínas maduras, la secuencia producida puede estar precedida por una metionina que no se retira de forma eficaz necesariamente. Por consiguiente, los péptidos y proteínas reivindicados en este documento pueden estar precedidos por una Met N-terminal cuando se produce en bacterias. Además, las construcciones pueden hacerse donde la secuencia codificante para el péptido está precedida por un péptido señal operativo que provoca la secreción de la proteína. Cuando se producen en hospedadores procariotas a este respecto, la secuencia señal se retira después de la secreción.

También está ahora disponible una amplia diversidad de hospedadores eucariotas para la producción de proteínas extrañas recombinantes. Como bacterias, los hospedadores eucariotas pueden transformarse con sistemas de expresión que producen la proteína deseada directamente, pero más habitualmente se proporcionan secuencias de señal para realizar la secreción de la proteína. Los sistemas eucariotas tienen la ventaja adicional de que son capaces de procesar intrones que pueden existir en las secuencias genómicas que codifican proteínas de organismo superiores. Los sistemas eucariotas también proporcionan una diversidad de mecanismos de procesamiento que provocan, por ejemplo, la glicosilación, amidación carboxi-terminal, oxidación o derivatización de ciertos restos aminoacídicos, control conformacional y etc.

Los sistemas eucariotas habitualmente usados incluyen, aunque sin limitación, levaduras, células fúngicas, células de insecto, células de mamífero, células de ave, y células de plantas superiores. Están disponibles promotores adecuados que son compatibles y funcionales para su uso en cada uno de estos tipos de hospedador así como secuencias de terminación y potenciadores, como por ejemplo el promotor del poliedro de baculovirus. Como anteriormente, los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, en sistemas de mamífero, puede inducirse el promotor de la metalotioneína de ratón por la adición de iones de metales pesados.

Las particularidades para la construcción de sistemas de expresión adecuados para hospedadores deseados son conocidas para los especialistas en la técnica. Para la producción recombinante de la proteína, el ADN codificante se liga adecuadamente en el vector de expresión de elección y después se usa para transformar el hospedador compatible que después se cultiva y se mantiene en condiciones en las que tiene lugar la expresión del gen extraño. La proteína de la presente invención producida de este modo se recupera del cultivo, lisando las células o del medio de cultivo según sea apropiado y conocido por los especialistas en la técnica.

Un especialista en la técnica, puede, usando técnicas bien conocidas, aislar la proteína vpr producida usando dichos sistemas de expresión.

Además de producir estas proteínas por técnicas recombinantes, también pueden emplearse sintetizadores de aminoácidos automáticos para producir la proteína vpr. Debe observarse adicionalmente que si las proteínas de este documento se preparan sintéticamente, también puede hacerse sustitución de aminoácidos que no están codificados por el gen. Los restos alternativos incluyen, por ejemplo, los aminoácidos \omega de fórmula H_{2}H(CH_{2})_{n}COOH en la que n es 2-6. Estos son aminoácidos neutros, no polares, como la sarcosina (Sar), t-butilalanina (t-BuAla), t-butilglicina (t-BuGly), N-metil isoleucina (N-Melle) y norleucina (Nleu). La fenilglicina, por ejemplo, puede sustituirse por Trp, Tyr o Phe, un aminoácido neutro aromático; la citrulina (Cit) y sulfóxido de metionina (MSO) son polares pero neutros, la citohexil alanina (Cha) es neutra y no polar, el ácido cisteico (Cya) es ácido, y la ornitina (Om) es básica. Las propiedades que confieren conformación de los restos de prolina pueden obtenerse si se sustituye uno o más de estos por hidroxiprolina (Hyp).

La composición farmacéutica que comprende la proteína vpr y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable puede formularse por un especialista en la técnica con composiciones seleccionadas dependiendo del modo elegido de administración. Los vehículos farmacéuticos adecuados se describen en la edición más reciente de Remignton's Pharmaceutical Science, A. Osol, un texto de referencia convencional en este campo.

Para administración parenteral, la proteína vpr puede, por ejemplo, formularse como una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de dichos vehículos son agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina sérica humana al 5%. También pueden usarse liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijados. El vehículo o polvo liofilizado puede contener aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, cloruro sódico, manitol) y la estabilidad química (por ejemplo, tampones y conservantes). La formulación se esteriliza por técnicas habitualmente usadas. Por ejemplo, una composición parenteral adecuada para administración por inyección se prepara disolviendo un 1,5% en peso de ingrediente activo en un 0,9% de solución de cloruro sódico.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden administrarse como dosis sencillas o en múltiples dosis. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse como agentes terapéuticos individuales o en combinación con otros agentes terapéuticos. Los tratamientos de la presente invención pueden combinarse con terapias convencionales, que pueden administrarse secuencial o simultáneamente.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína vpr, o fragmentos o derivados pueden administrarse por cualquier medio que posibilite que el agente activo alcance el sitio de acción del agente en el cuerpo de un mamífero. Como las proteínas se someten a digestión cuando se administran por vía oral, se usaría de forma ordinaria administración parenteral, es decir, intravenosa, subcutánea, intramuscular, para optimizar la absorción. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden inyectarse en un sitio en o cerca del crecimiento hiperproliferativo. Por ejemplo, la administración puede ser por inyección directa en una masa de tumor sólido o en el tejido directamente adyacente a la misma. Si el individuo a tratar padece psoriasis, la proteína de vpr puede formularse con un vehículo tópico farmacéuticamente aceptable y la formulación puede administrarse de forma tópica en forma de una crema, loción o pomada, por ejemplo.

La dosificación administrada varía dependiendo de factores tales como: características farmacodinámicas; su modo y vía de administración; edad, salud y peso del destinatario; naturaleza y grado de los síntomas; tipo de tratamiento concurrente; y frecuencia de tratamiento. Habitualmente, una dosificación diaria de proteína vpr puede ser de aproximadamente 1 \mug a 100 miligramos por kilogramos de peso corporal. Habitualmente de 0,5 a 50, y preferiblemente de 1 a 10 miligramos por kilogramo por día dado en dosis divididas de 1 a 6 veces al día o en forma de liberación sostenida que es eficaz para obtener resultados deseados.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica vpr y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con la presente invención, el material genético que codifica la proteína vpr se suministra a un individuo en una forma expresable. El material genético, ADN o ARN, se capta por las células del individuo y se expresa. La proteína vpr que se produce de este modo puede estimular que las células indiferenciadas hiperproliferantes se diferencien. Por tanto, las composiciones farmacéuticas que comprenden material genético que codifica la proteína vpr son útiles del mismo modo que composiciones farmacéuticas que comprendan la proteína vpr: para tratar a un individuo que tenga una patología o afección caracterizada por células indiferenciadas hiperproliferantes. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son particularmente útiles para tratar cáncer caracterizado por tumores sólidos.

Por tanto, un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una cantidad de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína vpr unida de forma operativa a elementos reguladores necesarios para la expresión en la fabricación de un medicamento para tratar a un individuo que padece una enfermedad asociada con células indiferenciadas hiperproliferantes.

Las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína vpr unida de forma operativa a elementos reguladores necesarios para la expresión en la célula del individuo puede suministrarse como composiciones farmacéuticas usando estrategias de terapia génica que incluyen, aunque sin limitación, vectores virales tales como vectores adenovirales o retrovirales o transferencia directa de ácido nucleico. Los métodos de suministro de ácidos nucleicos que codifican proteínas de interés usando vectores virales están ampliamente presentados. Se prepara un vector viral recombinante tal como un vector retroviral o adenoviral usando métodos y materiales de partida rutinarios. El vector viral recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica vpr. Dicho vector se combina con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La preparación farmacéutica resultante puede administrarse a un individuo. Una vez que un individuo se ha infectado con el vector viral, la proteína vpr se producen en las células infec-
tadas.

Como alternativa, puede administrarse una molécula que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica vpr como una composición farmacéutica sin el uso de vectores infecciosos. La molécula de ácido nucleico puede ser ADN o ARN, preferiblemente ADN. La molécula de ADN puede ser lineal o circular, es preferiblemente un plásmido. La molécula de ácido nucleico se combina con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con la invención, la composición farmacéutica que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína vpr puede administrarse directamente al individuo o suministrarse ex vivo en células retiradas del individuo que se reimplantan después de la administración. Por cualquier vía, el material génico se introduce en las células que están presentes en el cuerpo del individuo. Las vías preferidas de administración incluyen inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica y subcutánea. Como alternativa, la composición farmacéutica puede introducirse por diversos medios en las células que se retiran del individuo. Dichos medios incluyen, por ejemplo transfección, electroporación y bombardeo de microproyectiles. Después de que la molécula de ácido nucleico se haya captado por las células, se reimplantan en el individuo.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con este aspecto de la presente invención comprenden de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1000 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente de 1 aproximadamente 500 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen de aproximadamente 25 a aproximadamente 250 microgramos de ADN. Más preferiblemente, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 100 microgramos de ADN:

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con este aspecto de la presente invención se formulan de acuerdo con el modo de administración a usar. Un especialista en la técnica puede formular fácilmente una molécula de ácido nucleico que codifique vpr. En casos en los que la inyección intramuscular es el modo elegido de administración, se usa una formulación isotónica. Generalmente, los aditivos para isotonicidad pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. Pueden usarse soluciones isotónicas tales como solución salina tamponada con fosfato. Los estabilizadores incluyen gelatina y albúmina.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para estimular que células indiferenciadas se diferencien, lo que comprende la etapa de poner en contacto dichas células in vitro con una cantidad de proteína vpr o una molécula de ácido nucleico que codifique vpr suficiente para estimular la diferenciación.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para identificar compuestos que inhiban que vpr estimule la diferenciación de células indiferenciadas, lo que comprende las etapas de poner primero en contacto, en presencia de un compuesto de ensayo, dichas células con una cantidad de proteína vpr suficiente para estimular la diferenciación y después observar dichas células para determinar si sucede la diferenciación celular. Se cree que la capacidad de vpr de estimular que células indiferenciadas se diferencien, es importante para la producción eficaz de partículas virales durante la infección de VIH. Identificar compuestos que impidan la estimulación por vpr de la diferenciación celular proporciona una diana de fármaco para combatir el virus.

De acuerdo con este aspecto de la invención, se identifican compuestos que modulan la estimulación por vpr de la diferenciación de células indiferenciadas. Se proporciona un ensayo que compara la estimulación de la diferenciación por vpr en presencia o ausencia de compuestos de ensayo. Usando este ensayo, pueden identificarse compuestos que modulan la actividad estimuladora de vpr. En particular, pueden identificarse compuestos que inhiben la acción estimuladora de vpr. Dichos compuestos pueden ser útiles como agentes terapéuticos anti-VIH.

El método de la presente invención comprende la etapa de poner en contacto células indiferenciadas con vpr en presencia de un compuesto de ensayo. Las células después pueden observarse para determinar si la vpr induce la diferenciación. Puede proporcionarse un control en el que se ponga en contacto vpr con células en ausencia de compuesto de ensayo. Puede proporcionarse un control adicional en el que el compuesto de ensayo se pone en contacto con células en ausencia de vpr. Si las células en contacto con vpr en presencia de compuesto de ensayo no se diferencian, entonces se indica actividad anti-vpr para el compuesto de ensayo. Esto puede confirmarse si las células en contacto con vpr en ausencia de compuesto de ensayo se diferencian y las células en contacto con el compuesto de ensayo en ausencia de vpr no se diferencian.

El ensayo puede realizarse usando muchos tipos diferentes de células indiferenciadas y el suministro de vpr a través de una diversidad de medios. Además, pueden usarse fragmentos funcionales de vpr en lugar de vpr. Un especialista en la técnica, siguiendo los contenidos de la memoria descriptiva, puede apreciar fácilmente los varios modos para practicar este aspecto de la presente invención.

Las células indiferenciadas incluyen células madre excepto células madre embrionarias humanas en el contexto de la presente invención, y células transformadas tales como células tumorales en cultivo. Se prefiere que el tipo celular elegido sea uno en el que las células diferenciadas se puedan distinguir fácilmente de las células indiferenciadas. En algunas realizaciones de la invención, los tipos celulares preferidos son los de rabdomiosarcoma alveolar de tumor muscular sólido tal como las líneas celulares RD, TE671 y D17. MG63 y HOS-TE86, que son ejemplos de líneas celulares de osteosarcoma, también pueden usarse. Las líneas celulares KG-1, THP-1, U937 HL60 y PLB973 son ejemplos de células de linaje mieloide que pueden usarse en el ensayo. Otras líneas celulares que pueden usarse en el ensayo incluyen la línea celular de glioblastoma humano U-138MG, la línea celular de glioblastoma/astrocitoma humano U373MG y la línea celular de glioblastoma/astrocitoma humano U87-MG.

El compuesto de ensayo se proporciona, preferiblemente en solución. Pueden usarse diluciones en serie de los compuestos de ensayo en una serie de ensayos. El compuesto de ensayo puede añadirse a concentraciones de 0,01 \muM a 1 M. Un intervalo preferido de concentraciones finales de un compuesto de ensayo es de 10 \muM a 100 \muM. Un compuesto de ensayo que sea eficaz para inhibir la actividad de vpr es un anticuerpo que se une específicamente a vpr y evite que induzca la diferenciación de células indiferenciadas.

Vpr puede suministrarse por una diversidad de medios. En algunas realizaciones de la invención, se combina con células como una proteína. La proteína vpr puede añadirse directamente al medio de cultivo celular. La proteína vpr puede producirse a partir de materiales de partida ampliamente disponibles usando técnicas bien conocidas, tales como las descritas anteriormente. Un intervalo de concentración preferido de la vpr usada es de aproximadamente 1 \mug/ml a un 1 mg/ml.

Como alternativa, puede ponerse en contacto vpr con células diferenciadas introduciendo en la célula una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica vpr. En dichas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico puede introducirse como parte de una partícula de VIH, parte de un sistema de expresión infeccioso recombinante o parte de un vector de expresión tal como un plásmido. Además, también puede introducirse ADN lineal o ARN en la célula en una forma expresable. Un especialista en la técnica puede construir cualquiera de varios vectores de expresión u otra molécula de ácido nucleico diseñada para producir vpr en células cultivadas. Dicho sistema de expresión puede incluir un sistema de vector para introducir el material genético o la molécula de ácido nucleico puede introducirse por otras técnicas convencionales tales como transfección, electroporación o bombardeo de microproyectiles.

Los especialistas en la técnica pueden distinguir las células indiferenciadas de células diferenciadas de forma rutinaria. Los métodos para distinguir células diferenciadas de células indiferenciadas incluyen observar diferencias morfológicas, metabólicas y bioquímicas entre fases celulares. Por ejemplo, diferencias en tamaño, forma y sobre todo el aspecto son a menudo profundas cuando se compara una célula indiferenciada de una célula diferenciada correspondiente. Asimismo, la diferenciación de las células provoca cambios en las proteínas de que se están produciendo por la célula.

Por ejemplo, las células de rabdomiosarcoma alveolar diferenciadas producen elevados niveles de miosina, una proteína muscular, con relación al nivel de miosina producida por células de rabdomiosarcoma alveolar indiferenciadas. Cuando las células alveolares indiferenciadas se inducen a diferenciarse, el aumento en la presencia de miosina puede detectarse usando técnicas rutinarias. El medio para detectar la presencia de un producto proteico es rutinario e incluye ensayos enzimáticos y ensayos ELISA. Un especialista en la técnica puede detectar la presencia o ausencia de una proteína usando métodos bien conocidos.

Específicamente, el conjunto inicial de líneas celulares que se estudió incluía RD, TE671 y D17 como representantes de líneas celulares de rabdomiosarcoma (músculo). Los marcadores de diferenciación para estas células incluyen alfa-actina esquelética, miosina, creatina quinasa específica de músculo, y troponina 1.

Los efectos de vpr en la expresión del fenotipo de los osteoblastos diferenciados en la líneas celulares de osteosarcoma MG63 y HOS-TE86 pueden observarse usando marcadores no específicos de alteración en la función celular tales como morfología y proliferación celular así como la expresión de marcadores osteoblásticos. Los marcadores de osteoblastos incluyen la expresión de ARNm de ostocalcina, fosfatasa alcalina y colágeno de tipo (I) (aI) (por análisis de Northern) y la síntesis de osteocalcina (por radioinmunoensayo) y fosfatasa alcalina (ensayo colorimétrico). La especificidad de los efectos de los compuestos de ensayo en vpr también se compara con los efectos de los compuestos sobre otros agentes de diferenciación de osteoblastos establecidos tales como ácido retinoide y 1,25 dihidroxivitamina D_{3}.

Los análisis de diferenciación en líneas celulares KG-1, THP-1, U937, HL60 y PLB973, que son de linaje mieloide, incluyen aumentos en la adherencia plástica, fagocitosis aumentada de perlas de látex, tinción positiva para alfa-naftil acetato esterasa y pérdida de expresión de elastasa y catepsina G, por ejemplo. Adicionalmente, puede correlacionarse la diferenciación de líneas celulares mieloides con cambios en la expresión de oncogenes específicos tales como disminuciones en la transcripción de c-myc.

Durante la diferenciación de líneas celulares de glioblastoma, tales como la línea celular de glioblastoma humano U-138MG, la línea celular de glioblastoma/astrocitoma humano U373MG y la línea celular de glioblastoma/astrocitoma humano U87-MG, hay un disminución en la proliferación celular, aumentos en la ornitina descarboxilasa, aumentos en GFAP, aumentos transitorios en fos, aumentos en colágeno específico, aumentos en las proporciones citoplasmática a nuclear, extensión de pseudópodos, crecimiento neuritas, bipolaridad y actividad citoesquelética activada. Además, se ha informado de que durante la diferenciación de astrocitos aumenta la expresión de fibro-
nectina.

Aunque las partes de la descripción de este documento que se refieren a composiciones terapéuticas se refieren principalmente a agentes terapéuticos útiles para tratar seres humanos, las composiciones de la presente invención pueden aplicarse también a usos médicos veterinarios.

Ejemplos

Ejemplo 1

Sumario

El gen vpr de VIH-1 es suficiente para la diferenciación de la línea celular de rabdomiosarcoma humano TE617, una línea celular de rabdomiosarcomas, que son tumores de origen muscular y que pueden inducirse a diferenciación in vitro. Las células diferencias se caracterizan por un gran aumento, morfología alterada, ausencia de replicación, y elevado nivel de expresión de la miosina proteica específica de músculo. También se ha observado la diferenciación morfológica e inhibición de la proliferación de otras dos líneas celulares transformadas. Las células transfectadas con vpr siguen siendo completamente viables en cultivo durante periodos prolongados.

El desarrollo de células musculares esqueléticas maduras implica un proceso ordenado de diferenciación celular a partir de miocitos destinados al músculo (supuestos mioblastos), en mioblastos post-mitóticos, para madurar los miotubos multinucleados que tienen un aparato contráctil muscular funcional. El rabdomiosarcoma embrionario es un cáncer de un células que se parecen a supuestos mioblastos y pueden originarse de células satélite musculares (Bruni, 1979). Las líneas celulares de rabdomiosarcoma se han usado en estudios de diferenciación muscular y tumorigénesis, y pueden inducirse a diferenciación a partir de una población de células de rápida división (tipo mioblastos) que expresan bajas cantidades de unas pocas proteínas musculares maduras en células post-mitóticas, enormemente agrandadas y alargadas, multinucleadas (tipo miotubo) que expresan elevadas cantidades de proteínas específicas de músculo maduro y un aparato contráctil muscular funcional (Aguanno, S., et al., (1990) Cancer Res. 50: 3377-3382; Hiti, A. L. et al., (1989) Ho. Cell. Biol. 9:4722-4730; Siegel, H. N., y Lukas, R. J. (1988) Dev. Brain Res. 44:269-280; y Stratton, M.R., et al., (1989) Carcinogenesis 10:899-905.)

La expresión de VIH en una línea de tumor celular muscular humano conduce a la inhibición de la proliferación y activación del programa de diferenciación celular endógeno suprimido. El gen vpr de VIH-1 es suficiente para los efectos observados y necesario para la diferenciación de esencialmente todas las células. Estos resultados establecen a vpr de VIH-1 como una proteína reguladora capaz de una profunda regulación de las funciones celulares, incluyendo la proliferación y diferenciación celular.

Procedimientos experimentales Líneas Celulares y Cultivo

La línea TE671 de rabdomiosarcoma embrionario humano TE671 (ATCC HTB 139) y la línea D17 de osteosarcoma canino (ATCC CLL 183) se obtuvieron de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. TE671 se clasificó originalmente como una línea de meduloblastoma. Las células RD se proporcionaron por el Dr. A. Srinivasan. Todas las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero de ternera fetal al 10%, penicilina-estreptomicina, y piruvato sódico y se mantuvo en una atmósfera del 5%-6% de CO_{2} a 37ºC.

Construcción de la Línea Celular TE671\Psi

Se infectaron las células TE671 con retrovirus murino deficiente en la replicación que contenía el vector de expresión retroviral de CD4 humano T4-pMV7 como se describe en Weiner, D.B., et al., (1991), Pathobiology 59:361-371. Las poblaciones clonales se analizaron para la expresión de CD4 por citometría de flujo como se describe en Weiner, D.B., et al., (1989) Oncogene 4:1175-1183. En resumen, las células se incubaron con Leu-3a, un anticuerpo monoclonal murino específico para la molécula de superficie celular CD4 humano, o Upc-21, un anticuerpo monoclonal murino de isotipo coincidente irrelevante. El anticuerpo secundario fue un anticuerpo de cabra anti-ratón marcado con fluoresceína. Se seleccionó un clon CD4^{+} estable para el análisis adicional y se denomino TE671\Psi.

Plásmidos y Estrategias de Clonación

El clon genómico pNL43 de VIH se obtuvo a través del National Institutes of Health (NIH) AIDS Research and Referente Reagen Program, Division of AIDS, National Institute of Allergy and Infections Diseases, NHI, (Adachi, A., et al., (1986) J. Virol. 59:284-291), y se usó como material de partida para la mayoría de las construcciones genéticas usadas en este estudio. El plásmido pNL43 consta de ADN proviral de VIH-1 más 3 kb de la secuencia del hospedador del sitio de integración clonado en pUC18.

Construcción de pNLpuro

Para simplificar etapas de clonación adicionales, el sitio StuI en el ADN humano flanqueante 5' no VIH de pNL43 se destruyó por digestión parcial con StuI seguido por digestión de los extremos libres con polimerasa de Escherichia coli. El plásmido lineal se rellenó, después se autoligó dejando un único sitio StuI en el genoma de VIH. Este plásmido, pNL\Deltastu, después se digirió con las enzimas StuI y BsaBl de extremos romos, que eliminaron una gran sección de la secuencia codificante de gp120. El promotor de SV40 y la región codificante de resistencia a puromicina (puromicina acetiltransferasa) se aisló de pBABE-puro (Morganstern, J. P., y Land, H. (1990) Nucl. Acids Res. 18:3587-3596; proporcionada amablemente por el Dr. Hartmut Land del Imperial Cancer Research Fund) usando EcoRI y ClaI. Este fragmento se cortó con extremos romos, después se clonó en el pNL\Deltastu digerido con StuI-BsaBI. Se seleccionó un clon con el fragmento SV40-puro en la orientación correcta de modo que la repetición terminal larga 3' de VIH pudiera proporcionar funciones poli(A) para el mensaje de puromicina acetiltransferasa. Este plásmido se denomino pNLpuro.

Genes Reguladores de VIH-1

Se amplificó el ADN que codifica la proteína vpr de VIH por PCR a partir del plásmido pLN43 genómico de VIH-1. Se realizó la PCR en condiciones que producen la amplificación de ADN con elevada fidelidad (Ling, L. L., et al., (1991) PCR Meth. Appl. 1: 63-69). Se usaron tres cebadores de PCR para amplificar el gen. Un cebador, llamado cebador de inicio/clonación universal (USP), codifica sitios de restricción apropiados para clonar el producto de PCR en un vector, una secuencia consenso determinada por Kozak, M. (1996) Cell, 44; 283-292, para promover el inicio fuerte de la traducción, y un sitio de inicio ATG. Este cebador se usó en la amplificación del gen. El USP se colocó en una PCR con un segundo cebador corto que consta de un complemento inverso del extremo 3' del USP más aproximadamente 15 pb del extremo 5' del gen vpr. El producto bicatenario de esta PCR se usó como cebador 5' en una segunda reacción con un cebador 3' apropiado específico para el gen de interés. El cebador 3' introdujo sitios de restricción para la clonación del producto de PCR. Las secuencias de los cebadores son las siguientes:

USP:

ggcggctcgaggatccgccgccaccatg

(SEC ID Nº 1)

Cebador vpr: cebador enlazador 5', complementario al USP y el extremo 5' de la fase de lectura abierta de vpr: ggggcttgttccatggtggc (SEC ID Nº 2)

Cebador vpr: cebador de clonación 3', complementario al extremo 3' de la fase de lectura abierta de vpr más en sitio de clonación BamHI: ccgcggatcctaggatctactggc (SEC ID Nº 3).

El producto de PCR resultante se clonó el vector retroviral pBABE-puro. El vector pbabe-puro, que se usa como material de partida para producir muchas de las construcciones enumeradas a continuación, se construyó originalmente y se presentó por Morgenstern, J. P. y H. Land, 1990 Nucl. Acids. Res. 18 (12): 3587-3596, que se incorpora en este documento como referencia. El plásmido pBabe-puro es particularmente útil para la expresión de genes exógenos en células de mamífero. Las secuencias de ADN a expresar se insertan en sitios de clonación bajo el control del promotor de la repetición terminal larga (LTR) del virus de la leucemia murina de Moloney (Mo MuLV). El plásmido contiene el marcador de selección para la resistencia a puromicina. El plásmido resultante se denomina pBabe-puro-vpr.

Los genes reguladores de VIH nef, vpu y vif se amplificaron por PCR a partir del plásmido pNL43 genómico de VIH-1. Los cebadores diseñados para amplificar los genes reguladores restantes (vif, vpu, nef) se construyeron por el mismo principio de diseño que el empleado en la amplificación de vpr. Cada gen después se clonó en pBabe-puro.

Estrategia de Clonación para la Deleción del Gen vpr del Genoma de VIH

Se amplificó una región justo cadena arriba del único sitio PfMI hasta justo después del codón de terminación de vif por PCR usando cebadores que introducían un cambio de aminoácido no conservativo (Glu\rightarrowVal) en el aminoácido 22 de vpr, un codón de parada en la fase de lectura de vpr inmediatamente después del aminoácido 22, y un sitio EcoRI inmediatamente después del nuevo codón de parada. Este fragmento de PCR se sustituyó por el fragmento PfMI-EcoRI de pNLpuro o pNL43. Esta sustitución provoco la deleción del nucleótido 122 de la fase de lectura abierta de vpr, eliminando de este modo la posibilidad de reversión. Los plásmidos resultantes, pNLpuro\Deltavpr y pNL\Deltavpr, codifican los primeros 21 aminoácidos naturales de vpr más una valina más todos los otros genes restantes de VIH-1 y uniones de corte y empalme en su forma nativa.

Plásmido env-rev de VIH-1

La región codificante de los dos exones de rev y las fases de lectura abierta de vpu y env de VIH-1 HXB2 se amplificó por PCR y se clonó en el vector de expresión pCDNAI/neo (Invitrogen). La expresión de las proteínas rev y env se demostró por análisis de transferencia de Western y por la capacidad de las células transfectadas con esta construcción de fusionarse con líneas celulares CD4^{+}.

tat

Se obtuvo el plásmido pCV1 de expresión de tat de VIH-1 a través del Aids Research and Referente Reagen Program. Se subclonó una región del vector pBABE-hygro (Morganstern, J.P. y Land, H (1990), Nucl. Acids. Res. 18:3587-3596) que expresa resistencia a higromicina en este plásmido para preparar pCV1-hygro. Como alternativa, se cotransfectó pCV1 con pBABE-puro a una proporción de 100:1. Se obtuvieron resultados idénticos con ambos métodos.

Determinación de la Expresión de Gen Regulador por PCR de Transcripción Inversa

Se transfectaron células TE671 (0,5 x 10^{6} a 1,0 x 10^{6}) usando DOTAP (Boehringer Mannheim) con vectores de expresión que codifican genes reguladores individuales. Se lisaron las células cuarenta y ocho horas después in situ usando RNA_{20L} B (Biotecs Laboratorios, Inc.) y se preparó ARN celular total de acuerdo con metodología convencional. Se preparó ADNc por transcripción inversa usando cebadores de 6 unidades aleatorios y la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney. Se usó una alícuota de ADNc como molde en la amplificación por PCR. Como control para la posible contaminación de ADN genómico, se usaron alícuotas de ARN no sometido a transcripción inversa como moldes en PCR.

Análisis de la Producción de Antígeno p24^{gag} de VIH-1

Para el análisis de la infectividad de TE671 y TE671\Psi, se cultivaron las células hasta una confluencia del 80% en matraces de cultivo tisular, después se incubaron con sobrenadantes filtrados (tamaño de poro de 0,2 \mum) a partir de células HUT-78 crónicamente infectadas con VIH-1 (cepa RF). Un día después se lavaron las células una vez con solución salina tamponada con fosfato que contenía tripsina (2,5 mg/ml), después dos veces con medio de cultivo para retirar el virus residual usado para infectar las células. Los sobrenadantes se recogieron a intervalos de 24 horas sucediendo la primera recogida inmediatamente después de la etapa de lavado. La detección del antígeno p24^{gag} se realizó usando un kit de ensayo de antígeno p24 de VIH1 (Coulter Immunology, Coulter Corporation) según las instrucciones del fabricante. Este método emplea un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de captura de antígeno. Los pocillos se analizaron para la absorbancia a 450 nm en un lector de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas Dynatech MR5000.

Transfecciones para Estudios de Diferenciación

Para experimentos de diferenciación se transfectaron células TE671 por electroporación o con el método mediado por lípidos usando DOTAP. Aunque DOTAP producía transfecciones más eficaces que la electroporación, se obtuvieron resultados idénticos con los dos métodos con respecto a la diferenciación. Se transfectaron células RD y D17 usando DOTAP. En resumen, se realizó la electroporación con un Bio-Rad GenePulser y Pulse Controller en 2 x 10^{4} a 5 x 10^{4} células recogidas en crecimiento en fase logarítmica. La transfección con DOTAP se realizó según las instrucciones del fabricante en matraces de cultivo tisular en 0,5 x 10^{4} a 1 x 10^{4} en crecimiento en fase logarítmica. En cualquier caso se añadió medio de selección 48-60 horas después de la transfección, y se mantuvieron las células en selección mientras duraron los experimentos. Las células transfectadas con plásmidos que contenían el gen de resistencia a puromicina (puromicina acetiltransferasa) se seleccionaron en 1 \mug/ml de puromicina. La selección con neomicina fue en mg/ml de G418.

Ensayo de Inmunofluorescencia Fotomicrográfica Anti-Miosina

Se transfectaron células TE671 con el vector de expresión de vpr, y 48 horas después se trataron con tripsina las células, se transfirieron a portaobjetos de vidrio, y se seleccionaron con puromicina durante 5 días antes de la tinción. Se cultivaron las células TE671 no transfectadas de rápida proliferación en portaobjetos de vidrio durante 2-4 días antes de la tinción. Se realizó la permeabilización y fijación con metanol al 100% a -20ºC durante 10 minutos. Las etapas restantes se realizaron en tampón PHEM, que consta de HEPES 25 mM, PIPES 60 mM, EGTA 10 mM, MgCl_{2} 2 mM (pH 6,9). Las células fijadas se lavaron tres veces con PHEM entre cada etapa. Las células se bloquearon primero con suero de cabra normal al 5% para reducir la tinción no específica. El anticuerpo monoclonal murino MY-32 que es específico para la cadena pesada de la miosina de músculo esquelético de contracción rápida (tipo II) (Sigma número M4276), después se incubó con las muestras. Como control negativo, se usó un anticuerpo de isotipo coincidente (SIM.4 anti-CD4, obtenido a través del AIDS Research and Referente Program del Dr. James Hildreth) como anticuerpo primario en algunas células. Se usó inmunoglobulina G de cabra anti-ratón conjugada con rodamina (TAGO), como anticuerpo secundario, o como alternativa se usó un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Boehringer Mannheim). Las células se lavaron con PHEM, después se examinaron en un microscopio de fluorescencia y se fotografiaron.

Ensayo de Infección

Se sembraron células CD4^{+} TE671\Psi o CD4^{-} TE671 en cultivo tisular a muy baja confluencia (<5%). Un día después, se añadió el sobrenadante y las células infectadas a partir de células de linfoma T HUT-78 CD4+ infectadas con VIH-1 (cepas RF o MN). El siguiente día se lavaron las células infectadas del cultivo, y se añadió medio reciente a las células. Las células se examinaron para la diferenciación comenzando en el segundo día después de la infección.

Resultados Diferenciación de TE671 después de la Transfección con la Construcción Genómica pNLpuro

Se construyó un plásmido genómico de VIH-1 mutante con deleción de env seleccionable por fármacos, pNLpuro, basado en clon pNL43 molecular infeccioso de VIH-1. pNL puro se introdujo por transfección en la línea celular de rabdomiosarcoma humano TE671 y se seleccionaron los transfectantes estables. Las células TE671 normalmente crecen como pequeñas células adherentes tipo fibroblasto redondeadas o policlonales mononucleadas de aproximadamente 3-7 \mum de longitud y desarrollan largas protuberancias, algunas veces ramificadas. Algunas células llegaron a ser grandes, planas y de forma irregular. Las células que se diferencian llegan a menudo a ser bi o multinucleadas, aunque las células con protuberancias largas que se parecen a miotubos carecen de la disposición lineal de muchos núcleos que se encuentran en los verdaderos miotubos. Las células grandes permanecieron completamente viables durante varias semanas.

La diferenciación de células TE671 por agentes químicos es un fenómeno bien descrito, ya que esta línea celular se ha usado como un modelo para la diferenciación de músculo esquelético. Algunos agentes, incluyendo ésteres de forbol que activan la proteína quinasa C, así como un medio sin suero, inducirá que las células TE671 experimenten alteraciones tanto en morfología como en las características de crecimiento que son paralelas en muchos aspectos a la diferenciación de los mioblastos en miotubos. Las células TE671 estimuladas con miristato acetato de forbol aumentarán el tamaño global y longitud, a menudo están multinucleadas, y presentan proliferación ralentizada. Por otro lado, no se observaron células transfectadas con pNLpuro diferenciadas morfológicamente que se dividieran después de hasta 10 días.

Determinación de Elementos de VIH-1 Suficientes para la Diferenciación

Para definir el gen o genes virales responsables de la inducción de la diferenciación celular en la línea celular de rabdomiosarcoma, se examinaron genes reguladores de VIH-1 individuales, ya que se ha informado de que algunos de sus productos proteicos influyen en los acontecimientos celulares. Se obtuvo un vector de expresión tat (Arya, S.K., et al., (1985) Science 229:69-73) y se modificó para permitir la selección de células transfectadas estables. La región env-rev de VIH-1 se amplificó por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de un clon molecular de VIH-1 y se subclonó directamente en el vector de expresión pCDNAI/neo. Para clonar los genes reguladores restantes en vectores de expresión, se amplificó la fase de lectura abierta única de cada gen usando PCR. Durante la amplificación por PCR se introdujo una secuencia de inicio del ribosoma consenso inmediatamente cadena arriba de cada codón de inicio. Los genes que codifican las proteínas reguladoras nef, vpr, vif y vpu se amplificaron por este método y se subclonaron el vector de expresión pBABE-puro.

Cada plásmido se transfectó en células TE671 y se seleccionó en el antibiótico apropiado. La expresión de rev se demostró indirectamente mostrando la expresión de la proteína de envuelta (env) en ensayos de transferencia de Western y fusión celular. Como la expresión de env depende del nivel umbral crítico de la expresión de rev, puede deducirse que se producían niveles fisiológicamente relevantes de rev. La proteína vpr expresada a partir del vector vpr mostró una única especie de 15 kD por análisis de transferencia de Western. La expresión celular de tat, vif, vpr, vpu y nef se demostró por análisis de PCR de transcripción inversa. Los productos de PCR se procesaron en genes de agarosa al 2% y se tiñeron con bromuro de etidio para fotografía. Como control contra posible cruce de ADN en las preparaciones de ARN, se usó el ARN que no se sometió a transcripción inversa como molde en PCR.

La expresión de vpu, vif, tat, nef, rev y env no logró inducir cambios morfológicos significativos en células TE671. La expresión de vpr, por otro lado indujo una diferenciación profunda en la mayoría de las células transfectadas.

Para verificar que la diferenciación de TE671 implica el desarrollo del fenotipo muscular bien definido y no un programa nuevo, las células TE671 transfectadas con vpr se tiñeron con un anticuerpo específico para la cadena pesada de miosina de músculo esquelético de contracción rápida, que se expresa a elevados niveles solamente en células de músculo esquelético maduro. El anticuerpo MY-32 reaccionó fuertemente con células TE671 transfectadas con vpr. La mayoría de las células TE671 no transfectadas expresaron bajos niveles de miosina, aunque, como se ha informado previamente para TE671, unas pocas células no transfectadas se tiñeron ligeramente para miosina. La tinción con un anticuerpo de control de isotipo coincidente fue negativa para células TE671 tanto transfectadas como no transfectadas.

La eficacia de transfección conseguida por el vector vpr fue igual a la eficacia de transfección de los otros vectores. La eficacia de transfección se determinó por la cantidad de células que permanecen después de la selección en puromicina durante 2 días, que es tiempo suficiente para eliminar todas las células no transfectadas. Después de varios días más, pareció haber muchas menos células en el cultivo vpr que en cultivo no vpr, debido a la replicación continuada de las células en los cultivos no vpr. Sin embargo, no todas las células transfectadas con el plásmido pNLpuro genómico o con vpr solo experimentaron diferenciación morfológica. Este resultado es coherente con la respuesta heterogénea observada en líneas de rabdomiosarcoma sometidas a condiciones inductoras de diferenciación. Muchas células permanecieron sin diferenciar en los cultivos transfectados con vpr (10%-20%) que en los cultivos de pNLpuro (<1%). La eficacia de transfección igual en el cultivo vpr indica que vpr no eliminaba células en replicación y dejaba vivas solamente las células diferenciadas espontáneamente de origen natural, que en teoría podría producir una falsa interpretación de que vpr puede inducir la diferenciación. La cantidad absoluta de células diferenciadas en los cultivos transfectados con vpr de VIH también fue mayor que la encontrada las otras transfecciones de genes reguladores o en células TE671 no transfectadas, indicando adicionalmente que vpr inducía diferenciación en lugar de "revelar" célula diferenciadas de otro modo. Además, las células del fenotipo radical observadas en cultivos transfectados con vpr de VIH nunca se observaron en los controles no transfectados o en las células transfectadas por otros genes reguladores.

Otras células están afectadas por vpr

El gen vpr se introdujo por transfección en la línea RD de rabdomiosarcoma relacionada con TE671 y la línea D17 de sarcoma osteogénico (osteosarcoma) para examinar la generalidad de los efectos observados en TE671. Después de la selección con fármaco de las células transfectadas, se observó una alteración radical en el tamaño y morfología en ambas líneas celulares. La inhibición de la proliferación se observó en ambas líneas. La video microscopia de intervalo de tiempo de células D17 mostró que eran muy activas. Las regiones centrales o perinucleares de muchas células rotaron con un periodo de aproximadamente 2 horas, provocando frecuentemente una forma creciente distinta. La mayoría de las células grandes en ambos cultivos permanecían viables durante al menos 2 semanas y no proliferaban, aunque algunas células proliferantes pequeñas permanecían tanto en transfectantes D17 como RD, como se observó en los cultivos TE671. Las células de osteosarcoma D17 no expresaron niveles aumentados de fosfatasa alcalina, sin embargo, que es un marcador de la maduración ósea.

Deleción de vpr del Genoma de VIH-1

A continuación se examinó si vpr es necesaria para la diferenciación inducida por VIH-1. Para este fin, se construyó un mutante con deleción de vpr del plásmido VIH^{-} env pNLpuro llamado pNLpuro\Deltavpr. Se introdujo un codón de parada después del aminoácido 22 de vpr, y se retiraron 122 nucleótidos de la región codificante de vpr desde el aminoácido 22 hasta el aminoácidos 62. En primer lugar, se ensayo si la deleción del gen vpr afectaba a la expresión de genes de VIH-1 ya que dicho efecto podría complicar la interpretación de los experimentos. La expresión de la proteína viral después de la transfección con pNLpuro\Deltavpr fue igual a la expresión de pNLpuro, medida por la proteína p24^{gag} liberada en el medio de cultivo. Como la expresión de genes estructurales por VIH depende de la expresión exitosa de las proteínas tanto tat como rev, es evidente que la mutación introducida en el genoma no provocaba una alteración general de la transcripción de VIH o corte y empalme del ARN. Como control adicional para examinar el efecto de la deleción de vpr en la expresión VIH-1, se construyó un mutante de deleción de vpr a partir de pNL43 de tipo silvestre, por el mismo método que el usado para el mutante de deleción de vpr de pNLpuro, para producir la construcción env^{+}, pNL\Deltavpr. Cuando se introducía por transfección en el transfectante TE671\Psi CD4^{+} de TE671, se produjeron de forma eficaz sincitios por las construcciones tanto vpr^{-} como vpr^{+}. A pesar de la producción de proteínas de VIH-1 casi equivalente entre pNLpuro y pNLpuro\Deltavpr, el resultado de la transfección con el mutante de deleción de vpr con respecto a la diferenciación, fue claramente diferente del de la transfección con el genoma de VIH-1 vpr^{+}. Aunque las células transfectadas con pNLpuro se diferenciaron, la mayoría de las células TE671 transfectadas con el mutante de deleción de vpr pNLpuro\Deltavpr no mostraron ningún cambio o un aumento pequeño y transitorio en el tamaño y la longitud. Aunque se produjeron unas pocas células diferenciadas morfológicamente con tinción de miosina en cada transfección, la eficacia de este efecto varío de un experimento a otro y nunca se observó que excediera en 10% de las células restantes después de la selección con fármaco. Tomados en conjunto estos resultados (resumidos en la Tabla 1) se demuestra que la diferenciación inducida por VIH-1 de células TE671 es una función principalmente del gen vpr.

La producción de p24^{gag} en pNLpuro\Deltavpr continuó durante 2-3 semanas después de la transfección y subcultivo, mientras que p24 liberada de células transfectadas con pNLpuro se eliminó después del subcultivo. El subcultivo elimino de forma eficaz las células diferenciadas grandes, dejando solamente las células indiferenciadas en replicación intactas. Por lo tanto, solamente las células diferenciadas liberaron virus en los experimentos de transfección con pNLpuro. La exposición de los transfectantes al miristato acetato de forbol de éster de forbol que activa la proteína quinasa C, que ha demostrado que simula la expresión de VIH-1 en células infectadas de forma crónica (Harada, S. et al., (1986) Virology 154 249-258), provoco un aumento de 3 veces en la liberación de 24 de las células transfectadas con pNLpuro\Deltavpr pero no una liberación p24 que se pueda medir a partir de las células transfectadas con pNLpuro indiferenciadas. Este resultado indica que, en presencia de vpr, la producción de VIH-1 en células TE671 es incompatible con su replicación, mientras que en ausencia de vpr, la expresión de VIH-1 puede continuar en células en replicación. Estas células retienen la capacidad de diferenciarse en respuesta a diversos agentes y por tanto permanecen relativamente sin afectar por la expresión de VIH-1.

Demostración de que la Infección con VIH-1 Induce la Diferenciación

Se examinó la capacidad de la infección por VIH de inducir la diferenciación de la línea celular de rabdomiosarcoma. Para estos experimentos, se usó la línea celular TE671\Psi. TE671\Psi expresa elevados niveles de CD4 en su superficie celular y puede infectarse con VIH a una eficacia muy elevada, produciendo un elevado nivel de producción viral. La infección de células TE671\Psi en o cerca de la confluencia provoca la fusión celular en sincitios multinucleados gigantes, debido a la fusión de las membranas celulares después de la coexpresión de las proteínas de envuelta de VIH y su receptor, CD4. Para permitir la infección y mantenimiento en cultivo de células no fusionadas durante varios días después de la infección, se sembró TE671\Psi a una baja densidad celular, típicamente confluencia del 5% o menos. Las células sembradas a baja densidad celular y dejadas no expuestas a VIH-1 no se diferenciaron y continuaron replicándose. Las células infectadas con VIH-1 (cepas RF o MN) se diferenciaron de un modo muy similar a lo observado después de la transfección con el genoma viral de pNLpuro. Estos resultados demuestran que la infección con VIH puede inducir directamente la diferenciación celular.

Análisis

En este documento se presenta la observación inesperada de que la introducción por transfección de ADN genómico de VIH-1 en la línea de rabdomiosarcoma embrionario TE671 inducía la inhibición del crecimiento celular y la diferenciación. La infección de TE671 por una molécula CD4 transfectada produjo el mismo resultado, indicando que los efectos no estaban producidos por artefactos de transfección y tenían relevancia para la infección natural por VIH. La transfección y expresión de cada gen regulador de VIH-1 en la línea celular reveló que el gen vpr puede producir la inhibición del crecimiento y diferenciación morfológica que el virus complejo induce. La activación del programa muscular endógeno se demostró mostrando que las células transfectadas con vpr expresaban elevados niveles de miosina de contracción rápida, mientras que la mayoría de las células no transfectadas no lo hacía. La introducción por transfección de un mutante con deleción de vpr en células TE671 provocó la producción de grandes cantidades de células indiferenciadas en replicación que continuaban produciendo elevados niveles de proteína viral. Estos resultados indican que vpr es el determinante principal para la inhibición de la diferenciación y el crecimiento en células TE671. La introducción por transfección de vpr en la línea RD de rabdomiosarcoma y la línea D17 de osteosarcoma provocó que cesara la proliferación, cambios morfológicos bastos, y agrandamiento profundo. Por tanto vpr puede ser un regulador de la función celular en células de origen diverso.

La diferenciación muscular se ha estudiado bien en rabdomiosarcomas y en células normales. La expresión de factores de transcripción hélice-bucle-hélice tales como MyoD en mioblastos normales conduce a la diferenciación en miotubos post-mitóticos maduros. En la mayoría de los rabdomiosarcomas embrionarios, a pesar de la expresión de MyoD, la detención del ciclo celular y la diferenciación están inhibidas. La transformación de los rabdomiosarcomas embrionarios está unida a la expresión de un oncogén ras activado, la pérdida de un supresor tumoral putativo en el cromosoma 11, y la expresión constitutiva del factor del crecimiento de fibroblastos autocrino y el factor de crecimiento transformante \beta. Además, se ha demostrado que RD (por lo tanto TE671) carece de un gen supresor tumoral p53 de tipo silvestre. La expresión de p53 recientemente se ha asociada con el control del ciclo celular y la regulación de los mecanismos de reparación del ADN, acontecimientos celulares unidos a la integración retroviral. Los osteosarcomas muestran características de osteoblastos de secreción de matriz ósea pero se cree que surgen de tejido mesequimático multipotencial y por lo tanto representan de forma similar una desregulación de las células primitivas. Estos tumores también presentan típicamente mutaciones de p53 de pérdida de función. Vpr puede al menos parcialmente superar el bloqueo en la diferenciación y restaurar completamente la inhibición de la proliferación celular; por lo tanto, vpr puede reemplazar una pérdida de función durante la transformación o activar una vía que esquive los defectos
genéticos.

Estos estudios demuestran directamente que el gen vpr de VIH codifica una proteína que puede funcionar en la regulación de los acontecimientos celulares básicos. El resultado de esta regulación se observa en este documento como una inhibición de la proliferación celular y la inducción de diferenciación.

Ejemplo 2

Se formula una composición farmacéutica proporcionando 100 \mug/\mul de pBabe-puro+vpr combinado con solución salina tamponada con fosfato estéril que es isotónica con las células. La composición se administra por inyección directa en una masa tumoral sólida de un individuo.

Ejemplo 3

El ADN que codifica la proteína vpr de VIH-1 se amplifica por PCR a partir del plásmido pNL43 genómico de VIH-1 usando los cebadores de PCR y la estrategia descrita en el Ejemplo 1. El producto de PCR resultante se inserta en el plásmido pSE420 del vector de expresión (Invitrogen, San Diego, CA) y se introdujo en E. coli.

Se prepara una composición farmacéutica aislando la proteína vpr de las células y/o el medio y combinándola con una solución farmacéuticamente aceptable estéril.

Ejemplo 4

El ADN que codifica la proteína vpr de VIH-1 se amplifica por PCR a partir del plásmido pNL43 genómico de VIH-1 usando los cebadores de PCR y la estrategia descrita en el Ejemplo 1. El producto de PCR resultante se inserta en el plásmido pYES2 de vector de expresión (Invitrogen, San Diego, CA) y se introduce en S. cerevisiae.

Se prepara una composición farmacéutica aislando la proteína vpr de las células y/o medio y combinándola con una solución farmacéuticamente aceptable estéril.

Ejemplo 5

El ADN que codifica la proteína vpr de VIH-1 se amplifica por PCR a partir del plásmido pNL43 genómico de VIH-1 usando los cebadores de PCR y la estrategia descrita en el Ejemplo 1. El producto de PCR resultante se inserta en el plásmido pcDNA I del vector de expresión (Invitrogen, San Diego, CA) y se introduce en células de Ovario de Hámster Chino (CHO).

Se prepara una composición farmacéutica aislando la proteína vpr de las células y/o medio y combinándola con una solución farmacéuticamente aceptable.

Ejemplo 6

Se produjo la proteína vpr recombinante en baculovirus. La producción de proteína vpr recombinante permitió estudios de la función de la proteína in vitro, permitió la generación de anticuerpos anti-vpr en conejos y anticuerpos monoclonales en ratones.

El gen vpr se cortó de la construcción vpr-pBabe-puro. Este inserto después se introdujo en el vector de expresión de baculovirus pVL-1393 (PharMingen) por técnicas convencionales. Los virus recombinantes se produjeron como se ha descrito previamente (Matsuura, et al. 1987) usando ADN linealizado Baculogold (PharMingen) en experimentos de cotransfección en células de Spodoptera frugiperda (SF-9). Las células SF-9 y las infecciones virales posteriores se realizaron como se ha descrito previamente (Matsuura et al., 1987, O'Reilly et al., 1991). La presencia de virus recombinante se observó fácilmente al microscopio óptico después de la transfección. La presencia de proteína vpr se ensayó por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y análisis de transferencia de western, usando un suero policlonal de conejo anti-péptido (aminoácidos 2-21 N-terminales) obtenido a partir del depósito de SIDA.

Se infectaron células Sf-9 con virus recombinante a una multiplicidad de infección de 5-10 y se recogieron en diversos momentos después de la infección. Se analizaron células completas y fracciones sobrenadantes por ELISA usando el anticuerpo mencionado anteriormente. Tan pronto como a las 24 horas después de la infección, podía encontrarse la proteína recombinante en el sobrenadante. Esta presencia alcanzaría su pico a las 30 horas después de la infección. Se emprendieron experimentos de fraccionamiento para optimizar la recogida de la proteína vpr. La mayoría de la reactividad de vpr se encontró localizada en el sobrenadante de células Sf-9 recombinantes. Se recuperó poca proteína vpr adicional de lisados con detergente no iónico de sonicados celulares.

La actividad de esta proteína se verificó adicionalmente explorando el sobrenadante de cultivo celular que contenía proteína con una mezcla de muestras de pacientes seropositivos VIH+ como muestras de control. Los pacientes con VIH habían demostrado producir una respuesta inmune humoral contra el producto génico de vpr. Se recubrieron placas ELISA Immulon II (Dynatech laboratories, Chantilly, Virginia) con tres diluciones del sobrenadante vpr. Estos después se sondearon con 2 diluciones en serie de sueros de pacientes inactivados por calor. Los resultados demuestran que los sueros de pacientes positivos a VIH reaccionaban con la vpr presente en el sobrenadante celular. El nivel de su reactividad no se correlacionaba con los niveles de reactividad de los sueros contenidos frente a la envuelta de VIH-1 (medida por ELISA en fase sólida).

Se tituló el anticuerpo anti-proteína vpr de conejo a dilución 1/1000 y se usó en ensayo ELISA para determinar la producción de vpr por diversas preparaciones de células Sf-9. Se observó la reactividad específica y significativa en la fracción sobrenadante de solamente células transfectadas con vpr. El anti-suero de conejo es un anti-suero anti-péptido de epítopo restringido y como tal puede no reconocer una fracción de vpr asociada a células insolubles mal procesada en estas células. Para confirmar la producción de vpr se hicieron reaccionar las muestras idénticas con sueros de pacientes de VIH combinados y se usaron sueros humanos normales combinados como control específico. Los sueros de pacientes positivos a VIH reaccionaron con el sobrenadante que contenía la fracción de un modo similar al antisuero de conejo. Estas mismas muestras de suero reaccionaron muy mal con sobrenadantes de células Sf-9 no infectadas. Los mismos sueros de pacientes reaccionaron mal con sobrenadantes de células Sf-9 que se habían infectado con virus recombinantes de control (virus que se formaron co-transfectando ADN linealizado y pVL 1393 solo). La reactividad observada demuestra la producción de proteína vpr en los sobrenadantes de células Sf-9 infectadas.

El sobrenadante que contiene la proteína vpr se sometió a purificación por dos métodos de cromatografía diferentes.

Los sobrenadantes de células Sf-9 infectadas se concentraron en una unidad de filtración a presión amicon, se dializaron, se aclararon y se trataron con inhibidores de proteasa antes de la cromatografía en columna. El producto vpr de 24 horas en el sobrenadante se concentró, centrifugó a 10000 g durante 10 minutos. Después se añadió inhibidor de proteasa a este sobrenadante (PMSF, aprotinina, leupeptina y EDA) a sus concentraciones apropiadas. Esta solución después se pasó sobre una columna de anticuerpo de conejo anti-vpr-proteína A. Se purificó la inmunoglobulina anti-vpr de conejo en una columna de agarosa-proteína A y se eluyó y dializó y después se acopló a perlas de CNBr-sepharose 4B de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes (Sigma). Esta columna después se utilizó para cromatografía por inmunoafinidad de vpr de baculovirus. Se eluyó vpr en un gradiente de pH. La columna después se lavó con PBS. Se emprendió Na-Fosfato 10 mM, pH 8,0 y elución por un gradiente de pH. La reactividad específica pareció concentrarse en una cantidad de fracciones limitada como se determina por la reactividad de antisueros de conejo anti-vpr en ELISA. El pico de proteína específica y el pico de actividad solapan claramente.

Además, se recogió la proteína vpr de la columna de DEAE sepharose usando un gradiente salino. Se trató el sobrenadante que contiene la proteína vpr de baculovirus como anteriormente y después se colocó en una columna de DEAE-sepharose. La columna se eluyó por gradiente salino, se concentró la actividad de vpr en un intervalo limitado.

Ambos procedimientos de purificación generan muestras que reaccionan con muestras de pacientes de VIH así como los antisueros de conejo anti-péptido vpr en ELISA y en experimentos de transferencia de western. En experimentos de transferencia de western, está presente una proteína de 26 kD dominante a una proteína de 14 kD y se observan dos pequeñas bandas de proteínas sugieren productos de ruptura. La banda de 26 kD puede representar un artefacto de purificación (tal como acetilación) o puede indicar un estado de agregación que requiere investigación adicional.

Ejemplo 7

Se amplificó el ADN que codifica la proteína vpr de VIH-1 por PCR a partir del plásmido pNL43 genómico de VIH-1 usando los cebadores de PCR y la estrategia descrita en el Ejemplo 1. El producto de PCR resultante se inserta en el plásmido de vector de expresión del sistema de expresión de baculovirus completo MaxBac^{TM} (Invitrogen, San Diego, CA) y se introduce en células de insecto usadas en este sistema.

Se prepara una composición farmacéutica aislando la proteína vpr de las células y/o medio y combinándola con una solución farmacéuticamente aceptable estéril.

Ejemplo 8

Se transfectan líneas celulares de glioblastoma con el vector de expresión de vpr y se observaron los ejemplos específicos de acontecimientos de diferenciación. Para experimentos de diferenciación se transfectaron las células por un método mediado por lípidos usando DOTAP (Boehringer Mannheim). La transfección con DOTAP (Boehringer Mannheim) se realizó según las instrucciones de fabricante en matraces de cultivo tisular en 0,5 x 10^{6} células en crecimiento en fase logarítmica. Se añadió medio de selección 48-60 horas después de la transfección y las células se mantuvieron en selección mientras duraron los experimentos. Las células transfectadas con plásmidos que contenían el gen de resistencia a puromicina (PAC) se seleccionaron en 1 \mug/ml de puromicina (Sigma). Para ambas líneas celulares U87-MG y U138MG se observó la diferenciación morfológica específica. En comparación con las células transfectadas de control, las células transfectadas con vpr mostraron pseudópodos extendidos y crecimiento de neuritas demostrado concurrente con una inhibición observada de su proliferación celular. Ambas líneas celulares también demostraron una proporción citoplasmática a nuclear aumentada así como un claro aumento en el tamaño celular. También se observó bipolaridad frecuente en las líneas celulares transfectadas con vpr junto con actividad citoesquelética activa.

Los ensayos de prueba comprenden las etapas de añadir el compuesto de ensayo al medio usado en los cultivos celulares. El compuesto de ensayo se proporciona en 10 diluciones de varía de 10 \muM a 100 \muM.

Puede procesarse opcionalmente un ensayo de control que comprende la etapa de añadir proteína vpr a células sin añadir compuesto de ensayo.

El análisis de marcadores específicos del linaje y no específicos en estas líneas celulares se realizó de 2 a 14 días después de la transfección.

Ejemplo 9

Se realiza una exploración para identificar compuestos que inhiban la capacidad de vpr de inducir la diferenciación de células indiferenciadas del siguiente modo.

Se usa la línea TE671 de rabdomiosarcoma embrionario humano (ATCC HTB 139) y la línea D17 de osteosarcoma canino (ATCC CLL 183). Las células se mantienen en medio de cultivo celular apropiado en condiciones estándar.

Se produce vpr como se ha descrito en los Ejemplos 3, 4, 5 ó 6.

Los ensayos de prueba comprenden las etapas de poner en contacto las células con vpr en presencia de un compuesto de ensayo. Se añade una mezcla de vpr y el compuesto de ensayo al medio de cultivo celular juntos o por separado. El compuesto de ensayo se proporciona en 10 diluciones que varían de 10 \muM a 100 \muM.

Puede procesarse opcionalmente un ensayo de control que comprende la etapa de añadir proteína vpr a células sin añadir compuesto de ensayo.

Después de 2-14 días, se observan las células para determinar si ha sucedido la diferenciación. Se describen cambios morfológicos y de tamaño que indican diferenciación en el Ejemplo 1. La observación visual puede venir acompañada por o sustituirse con un ensayo de anticuerpos para observar si se está produciendo miosina por las células. Se realiza un ensayo anti-miosina como se ha descrito en el Ejemplo 1.

Ejemplo 10

Un sistema basado en ELISA in vitro simple para mapear sitios de interacción entre vpr y gag p55. Se usaron vpr producidas por baculovirus como se ha resumido anteriormente y gag de baculovirus producida por medios similares en ensayos de unión. Se recubrieron placas ELISA con gag y vpr y se hicieron reaccionar con antisueros específicos como controles, o se recubrieron con diluciones de proteína gag seguido por vpr y se pusieron en formato sándwich con anticuerpos anti-vpr. Como alternativa, se recubrieron las placas con diluciones de vpr seguido por proteína gag y se pusieron en formato sándwich con antisueros específicos anti-gag. Los controles para la especificidad incluyen antisueros gag que no reaccionan con vpr, antisueros vpr que no reaccionan con gag, antisueros que no reaccionan ni con gag ni con vpr que reaccionan con BSA. Las placas se recubrieron con antígeno recombinante en tampón carbonato, se lavaron extensivamente, se bloquearon con PBS/BSA al 1% y después se lavaron extensivamente, se disolvió la proteína secundaria en PBS/BSA y se incubó a 4ºC durante 1 hora, después se lavaron extensivamente y se hicieron reaccionar con antisueros específicos. Se detectó la actividad de sándwich específica en ambas direcciones como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 11

Usando PCR y tecnología de ADN recombinante, se construyeron mutantes de truncamiento del gen vpr y se clonaron en plásmidos de expresión pBABE. Estas construcciones delecionan vpr en grupos de aproximadamente 20AA del extremo carboxi que viaja hacia el extremo amino de la proteína. Los productos proteicos resultantes son 72AA, 50AA y 30AA.

Estudios preliminares indican que los 24AA carboxi terminales de vpr son necesarios para la inducción de diferenciación de linajes celulares de rabdomiosarcoma y gliales ya que se ha observado pérdida de la inhibición de la proliferación y pérdida de cambios morfológicos con los mutantes de deleción. Una observación interesante de estos estudios es que esta región carboxi contiene una región significativa de homología con el oncogén muscular ski. El oncogén ski retroviral aviar muestra propiedades que se parecen a las descritas para vpr (Colmenares y Stavnezer, Cell, 1989).

\newpage

Estudios sugieren que los mutantes vpr de deleción carboxi terminal aún retienen la actividad de unión a gag en este sistema. Este ensayo, por lo tanto, diferencia la región funcional de vpr que interacciona con gag y la región funcional para la función de diferenciación celular.

Ejemplo 12

Anticuerpos e Inmunizaciones

Se obtuvo suero de conejo anti-péptido vpr (Garrett, et al., J. Virol., 1991; 65, 1653) (a.a. 2-21: Cys-Glu-Gln-Ala-Pro-Glu-Asp-Gln-Gly-Pro-Gln-Arg-Glu-Pro-His-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu-Glu; SEC ID Nº 4) del Dr. Brian Cullen a través del NIH AIDS Research and Referente Reagen Program. Para producir anticuerpos de conejo adicionales contra vpr, se inmunizó un conejo con 10-20 \mug de proteína vpr parcialmente purificada (producida como se describe a continuación a partir de la columna anti-vpr) en adyuvante completo de Freund (CFA) una vez, después con adyuvante incompleto (IFA) para inmunizaciones posteriores. La inmunización final fue con 50 \mug de cada uno de los tres péptidos vpr acoplados a hemocianina de lapa californiana (KLH) en IFA. Los péptidos se adquirieron de American Bio-Technologies. Las secuencias de los péptidos: vpr 9-20 (Gly-Pro-Gln-Arg-Glu-Pro-His-Asn-Glu-Trp-Thr-Leu; SEC ID Nº 5), 41-55 (Gly-Leu-Gly-Gln-His-Ile-Tyr-Glu-Thr-Gly-Asp-Thr-Trp-Ala; SEC ID Nº 6), 81-96 (Ile-Gly-Val-Thr-Gln-Gln-Arg-Arg-Gln-Arg-Asp-Gly-Ala-Ser-Arg-Ser; SEC ID Nº 7). Para producir suero de ratón anti-vpr, se inmunizaron ratones Balb-c con 20 \mug de péptidos sencillos acoplados a KLH en CFA para la primera inmunización e IFA para posteriores inmunizaciones.

Ejemplo 13

Cromatografía en Columna

Se construyeron columnas de afinidad de acuerdo con Harlow y Lane. Harlow, E. y Lane, E., Antibodies: A Laboratory Manual, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory Press que se incorpora en este documento como referencia. La fracción IgG de 250 \mul del suero peptídico de conejo se unión a 1 ml de perlas de agarosa proteína A (Gibco BRL), se lavaron en tampón borato sódico 0,2 M (pH 9,0) y se acoplaron con dimetilpimelimidato (DMP) 20 mM. La columna de anticuerpo policlonal de conejo anti-vpr se construyó de acuerdo con el mismo procedimiento usando 6 ml de suero y 3 ml de perlas de agarosa proteína G (Gibco BRL).

Ejemplo 14

Detección de Anticuerpos Anti-vpr por ELISA de Captura

Para la detección de anticuerpos anti-vpr, se realizó un ELISA usando vpr producida de forma eucariota unida a fase sólida, seguido por la adición de la muestra de ensayo. Se usó anticuerpo anti-humano acoplado a peroxidasa para la detección (Boehringer Mannheim). El desarrollo de color fue con diclorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se detectaron anticuerpos anti-p24 usando p24 recombinante (American Bio-Technologies) unido a un soporte en fase sólida. Ambas proteínas recombinantes se usaron a una concentración aproximada de 1 \mug/ml, 50 \mul/pocillo). La incubación se hizo durante 1 hora 37º o 12 horas a 4º. Los anticuerpos de detección se usaron a una dilución 1:15000 según las directrices del fabricante.

Ejemplo 15

Detección de vpr por ELISA de Captura

Para la detección de vpr, se realizó una ELISA de captura. Se inmovilizó suero de conejo anti-péptido vpr (reactivo a aa 2-21) en pocillos de una placa ELISA de 96 pocillos (Immulon II, Dynatech) en tampón carbonato-bicarbonato (0,2 M, pH 9,2). La detección del antígeno unido se realizó usando un suero de ratón anti-péptido vpr (reactivo a aa 81-96) seguido por anticuerpo anti-ratón acoplado a peroxidasa (Boehringer Mannheim). El desarrollo de color fue con TMB como se ha descrito previamente. El anticuerpo de conejo se usó a 1:1000, el anticuerpo de ratón se usó a 1:800. La incubación se hizo durante 1 hora a 37º o 12 horas a 4º. Los anticuerpos anti-ratón se usaron a dilución 1:12000 según las directrices del fabricante.

Ejemplo 16

Producción de vpr Eucariota

Para construir un baculovirus recombinante que contenga el gen vpr, se subclonó la fase de lectura abierta de vpr y una secuencia de unión a ribosoma eucariota consenso introducida por PCR, a partir del plásmido de expresión vpr-pBabe-puro previamente descrito (Levy et al., Cell, 1993, 72, 541) e incorporado en este documento como referencia, en el sitio de clonación múltiple del vector de baculovirus pVL1393 (Invitrogen) cadena abajo del promotor del poliedro de baculovirus por técnicas convencionales conocidas para los especialistas en la técnica. Se prevé que esta construcción codifique una proteína vpr nativa no fusionada. La transfección de este plásmido junto con el ADN genómico de AcMNPV linealizado (BaculoGold, PharMingen) por técnicas convencionales en células de insecto SF9 (Spodoptera frugiperda) produjo baculovirus recombinantes que contenían el gen vpr. Veinticuatro horas después de la transfección, se aplicaron sobrenadantes que contienen virus de células transfectadas a nuevas células High Five (Trichoplusia ni) cuyos sobrenadantes y fracciones celulares después se ensayaron para la expresión de la proteína vpr por técnicas convencionales. La proteína vpr se detectó en los sobrenadantes y en las fracciones celulares de células infectadas por ELISA en 12 horas de infección y no en los sobrenadantes o fracciones celulares de células infectadas con baculovirus, preparadas de forma idéntica a los recombinantes vpr pero que carecen de un gen vpr. Se detectaron niveles de vpr de pico en el sobrenadante a las 24 horas después de la infección. Las razones para la exportación preferencial de vpr en los sobrenadantes de baculovirus no se muestran. Sin embargo, la exportación de proteínas recombinantes no es poco habitual para este sistema de expresión.

Ejemplo 17

Purificación Parcial de Proteína vpr

Se aplicaron sobrenadantes que contienen vpr a una columna de afinidad anti-péptido vpr, construida por métodos convencionales. La purificación parcial y concentración se consiguió por elución con trietanolamina (pH 11,5) seguido por cromatografía en DEAE sepharose por técnicas conocidas para los especialistas en la técnica. Este material presentó formas tanto monoméricas como homodiméricas putativas de vpr con casi diez veces más monómero que dímero observado. El material se usó para inmunizar a un conejo 3 veces a intervalos de 6-8 semanas, seguido por una inmunización única con 3 péptidos vpr que representan los restos amino y carboxilo terminales y una parte hidrófila central de la molécula. La inmunización final con péptidos vpr sirvió para aumentar el título anti-vpr específico del suero. El suero resultante se unía a proteínas vpr de baculovirus virales naturales y recombinantes en transferencia de Western y ELISA y reconocía específicamente los 3 péptidos vpr en ELISA. La dilución óptima de suero para ELISA fue 1:10.000. No se observó reactividad cruzada con otros componentes del suero sobrenadante de baculovirus o con cualquier otra proteína por transferencia de Western o ELISA. Se preparó una columna de afinidad usando este suero y se aplicaron sobrenadantes vpr. La proteína que eluye de esta columna presentó tres bandas principales en geles SDS-PAGE teñidos con plata o teñidos con coomassie, que representan las formas monoméricas y diméricas de vpr, más una banda de 50 kDa que probablemente representa la lactoalbumina presente en el medio de crecimiento celular no específicamente unida a la columna.

Ejemplo 18

Actividad Biológica de vpr de Baculovirus

Se puede ensayar la proteína vpr recombinante para la actividad biológica en cultivo tisular. Los sobrenadantes vpr y de control se dializaron frente a PBS y se aplicaron a células TE671 de rabdomiosarcoma. Las células TE671 se diferencian y cesan de proliferar cuando se transfectan con el gen vpr o se infectan con VIH (Gras-Masse et al., supra; Levy et al., supra). Sorprendentemente, las células TE671 expuestas continuamente a sobrenadante vpr al 20% cesaron la proliferación después de aproximadamente 3 días y después de 7-9 días experimentaron diferenciación morfológica similar a la observada después de transfección con el gen de vpr de VIH-1, incluyendo gran aumento, la presencia de largas protuberancias similares a miotubos, multinucleación y cese de la proliferación. La exposición a más del 20% del sobrenadante demostró se rápidamente fatal para las células. La incubación de células TE671 con concentraciones iguales de sobrenadantes de control no logró inducir ninguno de estos cambios. Las células expuestas a vpr durante 3 días se examinaron para la presencia de miosina de músculo adulto, un marcador de diferenciación para estas células (Aguanno et al., Cancer Res., 1990, 50, 3377). Más del 90% de las células tuvieron tinción positiva usando un anticuerpo anti-miosina, que demuestra que la diferenciación fue en la vía a la que están destinadas estas células y es idéntica a la inducida por la expresión de vpr de ellas.

Ejemplo 19

Se transfectaron células de melanoma con moléculas de ácido nucleico que comprendía una secuencia de nucleótidos que codificaba vpr. En experimentos de ensayo, se seleccionaron células transfectadas e implantadas en ratones. Como control, se introdujeron células de melanoma no transfectadas en otros ratones.

Los ratones con células de melanoma transfectadas implantadas presentaron una vasta reducción en la cantidad de tumores que se desarrollan a partir de las células inyectadas en comparación con la cantidad de tumores que se desarrollan en ratones de control. Los resultados de estos experimentos demuestran claramente que aunque vpr no eliminaba completamente la tumorigenicidad de las células de melanoma, la presencia de gen vpr en las células de melanoma reducía significativa y sustancialmente la tumorigenicidad de las células.

1

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: David B WEINER

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(B)

CALLE: 717 Beacom Lane

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Merion

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Pennsylvania

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): PA 19066

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\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: David Nathan LEVY

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(B)

CALLE: 24 Queensbury Street, Apartment 11

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(C)

CIUDAD: Boston

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(D)

ESTADO: Massachussetts

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(E)

PAÍS: USA

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): MA 02215

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\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Yosef REFAELI

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(B)

CALLE: 88 Washington Street, Apartment 27

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(C)

CIUDAD: Boston

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(D)

ESTADO: Massachussetts

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): MA 02135

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\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Función y actividad de VPR

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

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(iv)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible 1,44M

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(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30 (EPO)

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(v)

FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:

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NÚMERO DE SOLICITUD: EP 94909839.6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCGGCTCGA GGATCCGCCG CCACCATG

\hfill

28

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGCTTGTT CCATGGTGGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGCGGATCC TAGGATCTAC TGGC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Glu Gln Ala Pro Glu Asp Gln Gly Pro Gln Arg Glu Pro His Asn}

\sac{Glu Trp Thr Leu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Pro Gln Arg Glu Pro His Asn Glu Trp Thr Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 6:

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\sa{Gly Leu Gly Gln His Ile Tyr Glu Thr Gly Asp Thr Trp Ala}

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 7:

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\sa{Ile Gly Val Thr Gln Gln Arg Arg Gln Arg Asp Gly Ala Ser Arg Ser}

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Pro Gln Arg Glu Pro His Asn Glu Trp Thr Leu}

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Leu Gly Gln His Ile Tyr Glu Thr Tyr Gly Asp Thr Trp Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº 10:

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\sa{Ile Gly Val Thr Gln Gln Arg Arg Ala Arg Asn Gly Ala Ser Arg Ser}

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Claims (13)

1. Un método para inducir que células indiferenciadas se diferencien, que comprende las etapas de:

poner en contacto células indiferenciadas in vitro con una cantidad de la proteína vpr de VIH o un fragmento funcional de la misma eficaz para estimular la diferenciación; o

introducir en células indiferenciadas in vitro una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína vpr de VIH o un fragmento funcional de la misma, por lo que dicha secuencia de nucleótidos se expresa por dichas células,

en el que las células indiferenciadas no son células madre embrionarias humanas.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las células indiferenciadas son células tumorales.

3. Una composición farmacéutica que comprende:

a) proteína vpr de VIH o un fragmento funcional de la misma, o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína vpr de VIH o un fragmento funcional de la misma; y

b) vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3, donde dicha composición farmacéutica está adaptada para su uso en una inyección intratumoral.

5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3, donde dicha composición farmacéutica está adaptada para administración tópica.

6. El uso de la proteína vpr de VIH o un fragmento funcional de la misma o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína vpr de VIH o un fragmento funcional de la misma en la fabricación de un medicamento para tratar a un individuo diagnosticado con o que se sospecha que padece una enfermedad asociada con células indiferenciadas hiperproliferantes.

7. El uso de la proteína vpr de VIH o un fragmento funcional de la misma o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína vpr de VIH o un fragmento funcional de la misma en la fabricación de un medicamento para tratar a un individuo diagnosticado con o que se sospecha que padece cáncer.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el cáncer se caracteriza por un tumor sólido.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el medicamento está adaptado para su uso en una inyección intratumoral.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la enfermedad es psoriasis.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho medicamento está adaptado para administración tópica.

12. Un método para identificar compuestos que inhiban que vpr de VIH estimule la diferenciación de células indiferenciadas, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto, en presencia de un compuesto de ensayo, dichas células indiferenciadas con una cantidad de proteína vpr de VIH suficiente para estimular la diferenciación y

b) comparar la diferenciación que sucede con la diferenciación que sucede cuando dichas células indiferenciadas se ponen en contacto con la proteína vpr de VIH en ausencia de dicho compuesto de ensayo,

en el que las células indiferenciadas no son células madre embrionarias humanas.

13. Un kit para realizar el método para identificar compuestos que inhiban que vpr de VIH estimule la diferenciación de células indiferenciadas de la reivindicación 12, comprendiendo dicho kit

a) un primer recipiente que comprende células indiferenciadas, y

b) un segundo recipiente que comprende la proteína vpr de VIH,

en el que las células indiferenciadas no son células embrionarias humanas.