ES2285174T3

ES2285174T3 - Composiciones inmunogenicas.

Info

Publication number: ES2285174T3
Application number: ES03757056T
Authority: ES
Inventors: T.E.V. GlaxoSmithKline Biolog. SA CABEZON SILVA; Jonathan H. GlaxoSmithKline ELLIS; C.M.G. GlaxoSmithKline Biologicals s.a. GERARD; Paul A. GlaxoSmithKline HAMBLIN; R.M. GlaxoSmithKline Biologicals s.a. PALMANTIER; C. Glaxosmithkline Biolog. Sa Vinals Y De Bassols
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA; Glaxo Group Ltd
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA; Glaxo Group Ltd
Priority date: 2002-06-11
Filing date: 2003-06-06
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2023-06-06
Also published as: RU2004135541A; CN1675237A; DE60313163T2; ATE359295T1; MY139557A; DK1511768T3; EP1511768A1; PL374534A1; CN100360558C; EP1511768B1; NZ537125A; BR0311732A; AU2003246411A1; KR20050010040A; WO2003104272A1; UY27840A1; PE20040554A1; US20060147477A1; PT1511768E; IS7547A

Abstract

Una proteína de la pareja de fusión que comprende un dominio de unión a colina y un epítope auxiliar T promiscuo.

Description

Composiciones inmunogénicas.

La presente invención se refiere a parejas de fusión que actúan como parejas de fusión inmunológicas, como potenciadores de expresión y, preferiblemente, a parejas de fusión que tienen ambas funciones. La invención también se refiere a proteínas de fusión que las contienen, a su fabricación, a su uso en vacunas y a su uso en medicinas. En particular, se proporcionan parejas de fusión que contienen un llamado dominio de unión a colina, por ejemplo las fusiones que comprenden LytA de Streptoccoccus pneumoniae, o la lisozima (CPL1) del fago neumocócico CP1 en la que el dominio de unión a colina se modifica para incluir un epítope auxiliar T heterólogo. Se muestra que tales parejas de fusión mejoran el nivel de expresión de la proteína heteróloga unida a ellas y también encuentran particular utilidad cuando se fusionan a proteínas o péptidos escasamente inmunogénicos que de otra forma son útiles como antígenos de vacunas. Más particularmente, tales parejas de fusión son útiles en construcciones que comprenden autoantígenos, por ejemplo antígenos de tumores específicos o de tejidos específicos.

Antecedentes de la invención

El Streptoccoccus pneumoniae sintetiza una N acetil-L-alanina amidasa, LytA, una autolisina que degrada específicamente el eje central de del peptidoglicano de la pared celular conduciendo eventualmente a la lisis celular. Su cadena de polipéptidos tiene dos dominios. El dominio N terminal es responsable de la actividad catalítica, mientras que el dominio C terminal de LytA es responsable de la afinidad a la colina y anclaje a la pared celular. El dominio C terminal se sabe que se une a la colina y análogos de colina y también se une a aminas terciarias tales como DEAE (dietilaminoetilo) que se usa comúnmente en cromatografía.

LytA es una proteína de 318 aminoácidos y la parte extremo C comprende un tándem de seis repeticiones imperfectas de 20 ó 21 aminoácidos y una cola corta extremo COOH. Las repeticiones se localizan en las siguientes posiciones:

R1: 177 - 191

R2: 192 - 212

R3: 213 - 234

R4: 235 - 254

R5: 255 - 275

R6: 276 - 298

Estas repeticiones se predice que están en una conformación de giro beta. El extremo C es responsable de la unión a colina. Asimismo, el extremo C de CPL 1 es responsable de la afinidad de unión y los restos aromáticos en la repetición contribuyen a tal unión. Estas proteínas se han usado como señales de afinidad para permitir una rápida purificación. (Sáncez Puelles, Eur J Biochem. 1992, 203, 153 - 9).

También se han estudiado en Streptoccoccus pneumoniae otras proteínas con un dominio de unión a colina.

Una de ellos PspA (o proteína A de superficie neumocócica), es un factor de virulencia (Yother J y Briles (1992) J Bacteriol 174 (2) p 601). Esta proteína es antigénica e inmunogénica. Tiene un dominio C terminal que consta de 10 repeticiones de 20 aminoácidos, homólogos con repeticiones de LytA.

CbpA (o proteína A de unión a colina) está implicada en la adherencia del neumococo a las células humanas (Rosenow y col., (1997) Mol Microbiol 25 (5) p 819). Muestra 10 repeticiones de 20 aminoácidos en el dominio C terminal que son casi idénticos a los de PspA.

LytB y LytC tienen una organización modular diferente de las proteínas anteriormente mencionadas como su dominio de unión a colina, hecho de 15 repeticiones y 11 repeticiones respectivamente, se sitúa en el extremo extremo N, no en el extremo del extremo C (García P Mol Microbiol (1999) 31 (4) p 1275 y García P y col (1999) Mol Microbiol 33 (1) p 128). La comparación de secuencias muestra que LytB tiene actividad glucosamidasa. LytC muestra una actividad de tipo lisozima in vitro. Adicionalmente, tres genes llamados PepA, PepB y PepC se clonaron en 1995. Aunque su función es desconocida, estos genes tienen también un número variable de repeticiones homólogas a las de LytA.

En su ciclo de infección, los fagos sintetizan hidrolasas de mureína que facilitan su paso a las bacterias. Las hidrolasas tienen un dominio de unión a colina. Se ha estudiado bien la muramidasa CPL 1 del fago Cp-1. Muestra 6 repeticiones de 20 aminoácidos en el extremo C implicado en el reconocimiento específico de la colina. (García J. L. J. Virol 61 (8) p 2573 - 80; (1987) y García E Prol Natl Acad Sci (1988) p 914). Una comparación de las repeticiones LytA y CPL 1 posibilita un consenso inicial de las repeticiones a realizar.

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Las hidrolasas de mureína de los fagos Dp-1 (García P y col (1983) J Gen Microbiol 129 (2) p 489, Cpl-9 (García P y col (1989) Biochem Biophys Res Comun 158 (1) p 251, HB-3 Romero y col., 1990 J Bacteriol 172 (9) p 5064 - 5070) y EJ-1 Díaz (1992) J Bateriol 174 (17) p 5516), también muestran las características de los dominios de unión a colina.

Esta propiedad también se comparte por la lisozima codificada por un fago neumocócico CP-1. El documento WO 99/10375 describe entre otros, proteínas E6 o E7 del virus del papiloma humano unidas a una señal His y la porción extremo C de LytA (en esta memoria descriptiva (C-LytA) y la purificación de las proteínas mediante cromatografía de afinidad diferencial. El documento WO 99/40188 describe entre otros las proteínas de fusión que comprenden antígenos MAGE con una cola His y una porción C-LytA en el extremo N de la molécula.

Sorprendentemente ahora se ha encontrado que las parejas según la presente invención, cuando se fusionaban a una proteína heteróloga eran capaces de potenciar la inmunogenicidad de las proteínas heterólogas unidas a ellas. También se ha encontrado que se puede potenciar el nivel de expresión de la proteína heteróloga unida a ellas. Por consiguiente, en una realización preferida, la presente invención proporciona una pareja de fusión inmunológica mejorada que también puede actuar como un potenciador de expresión.

Sumario de la invención

Por consiguiente, la presente invención comprende una molécula de pareja de fusión que comprende un dominio de unión a colina o un fragmento del mismo o un análogo del mismo, y un epítope de auxiliar T promiscuo, preferiblemente un epítope T de clase II MHC promiscuo. Dicha pareja de fusión muestra una capacidad para actuar tanto como pareja de fusión inmunológica o como potenciador de expresión y preferiblemente tanto como pareja inmunológica y como potenciador de expresión. Un epítope auxiliar T promiscuo es un epítope que se une a más de un alelo de clase II MHC, preferiblemente más de 3 alelos de clase II MHC. En particular tales epítopes son capaces de inducir la respuesta de la célula del auxiliar T en un gran número de individuos que expresan diversos halotipos de MHC. Opcionalmente, la proteína de fusión puede retener su capacidad para unirse a colina.

En una realización preferida el resto de unión a colina se deriva del extremo C de LytA. Preferiblemente el C-LytA o derivados comprenden al menos cuatro repeticiones de cualquiera de repeticiones R1 a R6 expuestos en la figura 1 (SEC ID Nº 1 a 6). En una realización más preferida el C-LytA se extiende desde el aminoácido 177 al 278 que contiene una porción de la primera repetición y las otras cinco completas.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una pareja de fusión como se define en esta memoria descriptiva que además comprende una proteína heteróloga. La proteína heteróloga se puede bien conjugar químicamente o fusionarse a la pareja de fusión. Preferiblemente la proteína heteróloga es un antígeno asociado a tumores o un fragmento inmunogénico del mismo.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica las proteínas como se ha definido en esta memoria descriptiva. También se proporciona un vector de expresión que comprende dicho ácido nucleico y un huésped transformado con dicho ácido nucleico o vector.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona una composición inmunogénica que comprende una secuencia de proteínas o de ácidos nucleicos como se describe en esta memoria descriptiva, y un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente la composición inmunogénica comprende un adyuvante que induce Th-1.

Todavía en una realización adicional, la invención proporciona la composición inmunogénica o proteína y ácidos nucleicos para uso en medicina. En particular, se proporciona una proteína o un ácido nucleico de la invención, para la fabricación de un medicamento que induzca una respuesta inmune en un paciente, o para uso en el tratamiento o profilaxis de enfermedades infecciosas o enfermedades de cáncer.

La invención además proporciona los procedimientos de tratamiento a un paciente que padece una enfermedad infecciosa o una enfermedad de cáncer, particularmente carcinoma de mama, pulmón (particularmente carcinoma de pulmón de células no pequeñas), colorrectal, ovarios, próstata, gástrico y otros GI (gastrointestinales) mediante la administración de una cantidad segura y eficaz de una composición o ácido nucleico como se describe en esta memoria descriptiva.

Todavía en una realización adicional la invención proporciona un procedimiento de producción de una composición inmunogénica como se describe en esta memoria descriptiva mediante la mezcla de un ácido nucleico o proteína de la invención con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Descripción detallada de la invención

Como se describe en esta memoria descriptiva, en una realización de la presente invención el dominio de unión a colina modificado (pareja de fusión) tiene la capacidad de actuar como potenciador de expresión con la proteína de fusión resultante se expresará en un rendimiento más alto en una célula huésped comparado con la proteína no fusionada, preferiblemente con un rendimiento mayor que aproximadamente 100% (2 veces más alto) ó 150% o más, medido mediante SDS-PAGE seguido de tinción con azul de Coomassie o tinción con plata, opcionalmente seguido de barrido en gel. El dominio de unión a colina modificado según la invención tiene también la capacidad de actuar como una pareja inmunológica con la proteína de fusión resultante con una proteína heteróloga y será más inmunogénica en un huésped comparada con la proteína heteróloga no fusionada.

En otra realización de la presente invención, el dominio de unión a colina modificado tiene la capacidad de actuar como pareja de fusión inmunológica, permitiendo una respuesta inmune potenciada que se obtiene con la proteína de fusión, comparada con la proteína heteróloga sola.

En una realización preferida, el dominio de unión a colina tiene una función dual, que tiene la capacidad de actuar tanto como pareja de fusión inmunológica como potenciador de expresión.

En una realización preferida el resto de unión a colina modificado se deriva del extremo C de LytA. Preferiblemente el C-LytA o derivados comprenden al menos dos repeticiones, preferiblemente al menos cuatro repeticiones. En este contexto, los derivados de C-LytA se refieren a una variante de C-LytA según la presente invención, esto quiere decir variantes que han retenido tanto la capacidad de actuar como pareja inmunológica como un potenciador de expresión. Las variantes preferidas, incluyen, por ejemplo, péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, lo más preferiblemente al menos entre 97 - 99% de identidad con cualquiera de las repeticiones R1 a R6 expuestas en la figura 1 (SEC ID Nº 1 a 6), o un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos expuesta en la figura 1 (SEC ID Nº 1 a 8).

De acuerdo con lo anterior, en un aspecto de la invención se proporciona una proteína de pareja de fusión que comprende un dominio de unión a colina modificado y un epítope auxiliar T promiscuo heterólogo en la que el dominio de unión a colina se selecciona del grupo constituido por:

a): el dominio del extremo C de LytA como se expone en SEC ID Nº 7;

b): La secuencia de SEC ID Nº 8;

c): una secuencia de péptidos que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, lo más preferiblemente al menos entre 97 - 99% de identidad con cualquiera de las SEC ID Nº 1 a 6;

d): una secuencia de péptidos que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos15, 20, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 7 o SEC ID Nº 8.

En una realización más preferida el C-LytA se extiende desde el aminoácido 177 al 298 que contiene una porción de la primera repetición y las otras cinco completas, como se expone en la figura 1.

El segundo componente de la pareja de fusión, el epítope de la célula T heterólogo se selecciona preferiblemente del grupo de epítopes que se unirán a un número de individuo que expresan más de una molécula de MHC II en seres humanos. Por ejemplo, los epítopes que se contemplan específicamente son los epítopes P2 y P30 de la toxina del tétanos, Panina - Bordignon Eur. J Immunol 19 (12), 2237 (1989). En una realización preferible el epítope de células T heterólogo es P2 ó P30 de la toxina del tétanos.

El epítope P2 tiene la secuencia QYIKANSKFIGITE y corresponde a los aminoácidos 830 - 843 de la toxina del tétanos. El epítope P30 (restos 947 - 967 de la toxina del tétanos) tiene la secuencia FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE. La secuencia FNNFTV se puede opcionalmente suprimir. Otros epítopes T universales se pueden derivar de la proteína de circumsporocitos de Plasmodium falciparum en particular la región 378 - 398 que tiene la secuencia DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS (Alexander J, (1994) Immunity 1 (9), p 751 - 761). Otro epítope se deriva de la proteína de fusión del virus Measles en el resto 288 - 302 que tiene la secuencia LSEIKGVIVHRLEGV (Partidos CD, 1990, J. Gen. Virol 71 (9) 2099 - 2105). Todavía otro epítope se deriva del antígeno superficial del virus de la hepatitis B, en particular aminoácidos, que tiene la secuencia FFLLTRILTIPQSLD. Otro conjunto de epítopes se deriva de la toxina de la difteria. Cuatro de estos péptidos (aminoácidos 271 - 290, 321 - 340, 331 - 350, 351 - 370) se sitúan en el mapa dentro
del dominio T del fragmento B de la toxina y los 2 restantes se sitúan en mapa en el dominio R (411 - 430, 431 - 450):

1

El epítope T heterólogo se fusiona preferiblemente a C-LytA conteniendo al menos 4 repeticiones, preferiblemente repeticiones 2 - 5 inclusive. Una o más repeticiones posteriores se pueden fusionar opcionalmente al extremo C del epítope T. Como alternativa, el epítope T heterólogo se inserta preferiblemente entre dos repeticiones consecutivas de C-LytA conteniendo un total de al menos 4 repeticiones, o se inserta en una de las repeticiones de C-LytA conteniendo un total de al menos 4 repeticiones. Más preferiblemente, el C-LytA contiene 6 repeticiones y el epítope heterólogo se inserta dentro y al comienzo de la sexta repetición de C-LytA.

Además la presente invención proporciona, en otros aspectos, las proteínas de fusión que comprenden al menos un polipéptido como se ha descrito anteriormente, así como polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión en forma de composiciones farmacéuticas, por ejemplo, composiciones de vacunas, que comprenden un vehículo y/o un immunoestimulante fisiológicamente aceptables. De este modo una autoproteína u otra proteína escasamente inmunogénica se puede fusionar bien al extremo N o al C de la pareja de fusión resultante. Alternativamente la autoproteína o proteína escasamente inmunogénica se puede insertar en la pareja de fusión. En una realización opcional un indicador de histidina o al menos cuatro, preferiblemente más de 6 restos de histidina, se puede fusionar al extremo alternativo de la proteína escasamente inmunogénica. Esto permitiría que la proteína se purifique mediante etapas de cromatografía de afinidad, como una cola de de histidina, típicamente comprendiendo al menos cuatro, preferiblemente seis o más restos se una a iones metálicos y por lo tanto sea adecuada para cromatografía de afinidad con ion metálico inmovilizado (IMAC).

Por lo tanto las construcciones típicas deberían comprender:

-: Proteína escasamente inmunogénica - repeticiones_{1-4} de C-LytA - epítope P_{2} (insertado en o reemplazando la repetición_{5} de C-LytA) - repetición_{6} de C-LytA.

-: Repeticiones_{1-4} de C-LytA - epítope P_{2} (insertado en o reemplazando la Repetición_{5} de C-LytA) - repetición_{6} de C-LytA-proteína escasamente inmunogénica

-: Proteína escasamente inmunogénica - repeticiones_{2-5} de C-LytA - epítope P_{2} (insertado en la repetición_{6} de C-LytA)

-: C-Lyta_{2-5} - epítope P_{2} (insertado en la repetición_{6} de C-LytA) - proteína escasamente inmunogénica

-: Proteína escasamente inmunogénica - repeticiones_{1-5} de C-LytA - epítope P_{2} - insertado en la repetición_{6} de C-LytA

-: Repeticiones_{1-5} de C-LytA-epítope P_{2} - insertado en la repetición_{6} de C-LytA - proteína escasamente inmunogénica

-: Proteína escasamente inmunogénica - epítope P_{2} insertado en la repetición_{1} de C-LytA - repeticiones_{2-5} de C-LytA

-: Epítope P_{2} insertado en la repetición_{1} de C-LytA - repeticiones_{2-5} de C-LytA - proteína escasamente inmunogénica

-: Proteína escasamente inmunogénica - epítope P_{2} insertado en la repetición_{1} de C-LytA - repeticiones_{2-6} de C-LytA

-: Epítope P_{2} insertado en la repetición_{1} de C-LytA - repeticiones_{2-6} de C-LytA - proteína escasamente inmunogénica

-: Proteína escasamente inmunogénica - repetición_{1} de C-LytA - epítope P_{2} insertado en la repetición_{2} de C-LytA - repeticiones_{3-6} de C-LytA

-: Repetición_{1} de C-LytA - epítope P_{2} insertado en la repetición_{2} de C-LytA - repeticiones_{3-6} de C-LytA - proteína escasamente inmunogénica;

en las que "insertada en" significa en cualquier lugar en la repetición por ejemplo entre el resto 1 y 2, o entre 2 y 3, etc.

El epítope del auxiliar T promiscuo se puede insertar en una región repetida por ejemplo repeticiones_{2-5} de C-LytA - repetición 6a de C-LytA - epítope P_{2} -repetición 6b de C-LytA, en la que el epítope P2 se inserta en la sexta repetición (véase figura 2).

En otras realizaciones preferidas el extremo del extremo C de CPL 1 (C-CPL 1) se puede usar como alternativa a C-LytA.

Como alternativa el epítope P2 en las construcciones anteriores se puede reemplazar por otros epítopes T promiscuos, por ejemplo P30. En una realización de la invención dos o más epítopes promiscuos son parte de la construcción de fusión. Sin embargo se prefiere mantener la pareja de fusión tan pequeña como sea posible, limitando de este modo el número de CD8+ y epítopes B que potencialmente interfieren. De este modo, preferiblemente la pareja de fusión no es mayor de 100 - 140 aminoácidos, preferiblemente no mayor de 120 aminoácidos, típicamente aproximadamente 100 aminoácidos.

El antígeno al que se fusiona la pareja de fusión puede ser procedente de fuentes bacterianas, virales, de protozoos, fúngicas o de mamíferos incluyendo seres humanos.

Las parejas de fusión de la presente invención preferiblemente se fusionan a un autoantígeno tal como a un antígeno asociado a tumores o de tejidos específicos tales como los de próstata, mama, colorrectal, pulmón, ovarios, renal o cánceres de melanoma. Los fragmentos de dichos antígenos auto o de tumores se contemplan expresamente para fusionarse a la pareja de fusión de la invención. Típicamente el fragmento contendrá al menos 20, preferiblemente 50, más preferiblemente 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de longitud completa. Típicamente dichos fragmentos estarán desprovistos de uno o más dominios de transmembrana o pueden tener supresiones en el extremo N o extremo C de aproximadamente 3, 5, 8, 10, 15, 20, 28, 33, 50, 54 aminoácidos. Cuando se presenten adecuadamente, dichos fragmentos serán capaces de generar respuestas inmunes que reconocen la proteína de longitud total. Particularmente los polipéptidos ilustrativos de la presente invención comprenden una secuencia de aminoácidos de al menos 10 aminoácidos contiguos, preferiblemente 20, más preferiblemente 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 aminoácidos de una proteína asociada a tumores o de tejidos específicos fusionada a la pareja de fusión.

Los polipéptidos de la invención son inmunogénicos, es decir reaccionan detectablemente con un inmunoensayo (tal como un ELISA o ensayo de estimulación de células T) con antisueros y/o células T de un paciente con cripto que expresa cáncer. El análisis de la actividad inmunogénica se puede realizar usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, dichos análisis se pueden realizar usando procedimientos tales como los descritos por Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En un ejemplo ilustrativo, un polipéptido se puede inmovilizar en un soporte sólido y poner en contacto con los sueros de un paciente para permitir la unión de anticuerpos con los sueros al polipéptido inmovilizado. Después los sueros no unidos se puede retirar y detectar los anticuerpos unidos usando, por ejemplo, proteína A marcada con ^{125}I. Como reconocerían los expertos en la técnica, las porciones inmunogénicas del antígeno asociado a tumores o específico de tumores también se comprenden en la presente invención. Una "porción inmunogénica", como se usa en esta memoria descriptiva, es un fragmento que él mismo es inmunológicamente reactivo (es decir, se une específicamente) con las células B y/o receptores de antígenos superficiales de células T que reconocen el polipéptido. En general las porciones inmunogénicas se pueden identificar usando técnicas bien conocidas, tal como las resumidas por Paul, Fundamental Immunology, 3ª ed., 243 - 247 (Raven Press, 1993) y las referencias citadas en esta memoria descriptiva. Dichas técnicas incluyen el análisis de polipéptidos por la capacidad para reaccionar con anticuerpos de antígenos específicos, antisueros y/o líneas o clones de células T. Como se usa en esta memoria descriptiva, antisueros y anticuerpos son "específico del antígeno" si se unen específicamente a un antígeno (es decir, reaccionan con la proteína en un inmunoensayo ELISA u otro, y no reaccionan detectablemente con proteínas no relacionadas). Dichos antisueros y anticuerpos se pueden preparar como se describe en esta memoria descriptiva, usando técnicas bien conocidas. En una realización preferida, una porción inmunogénica de un polipéptido es una porción que reacciona con antisueros y/o células T a un nivel que sustancialmente no es inferior a la reactividad del polipéptido de longitud completa (por ejemplo, en un ensayo de reactividad ELISA y/o de células T). Preferiblemente, el nivel de actividad inmunogénica de la porción inmunogénica es al menos de aproximadamente 50%, preferiblemente al menos aproximadamente 70% y más preferiblemente mayor que aproximadamente 90% de la inmunodenicidad del polipéptido de longitud completa. En algunos casos, se identificará que las porciones inmunogénicas preferidas tienen un nivel de actividad inmunogénica mayor que la correspondiente al polipéptido de longitud completa, por ejemplo teniendo una actividad inmunogénica aproximadamente mayor que 100% ó 150%.

En ciertas otras realizaciones, las porciones inmunogénicas ilustrativas pueden incluir péptidos en las que una secuencia conductora del extremo N y/o dominio transmembrana se han suprimido. Otras porciones inmunogénicas ilustrativas contendrán una pequeña supresión en el extremo N- y/o C- (por ejemplo, aproximadamente 1 - 50 aminoácidos, preferiblemente aproximadamente 1 - 30 aminoácidos, más preferiblemente aproximadamente 5 - 15 aminoácidos), relativo a la proteína madura.

Los antígenos ejemplares o fragmentos derivados de ellos incluyen antígenos MAGE 1, Mage 3 y MAGE 4 u otro MAGE tales como los descritos en el documento WO 99/40188, PRAME (documento WO 96/10577), BAGE, RAGE, LAGE 1 (documento WO 98/32855), LAGE 2 (también conocido como NY - ESO - 1, documento WO 98/14464), XAGE (Liu y col, Cancer Res, 2000, 60: 4752 - 4755; documento 02/18584) SAGE, y HAGE (documento WO 99/53061) o GAGE (Robbins y Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pp 628 - 636; Van den Eynde y col., Internacional Journal of Clinical & Laboratory Research (presentado 1997); Correale y col., (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p 293. Sin duda estos antígenos se expresan en un amplio intervalo de tipos de tumores tales como melanoma, carcinoma de pulmón, sarcoma y carcinoma de vejiga.

En una realización preferida se utilizan antígenos de próstata, tales como el antígeno específico de próstata (PSA), PAP, PSCA (PNAS 95 (4) 1735 - 1740 1998), PSMA o el antígeno conocido como prostasa.

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En una realización particularmente preferida el antígeno de próstata es P501S o un fragmento del mismo. P501S, también llamado prosteína (Xu y col., Cancer Res. 61, 2001, 1563 - 1568), se conoce como SEC ID Nº 113 del documento WO98/37814 y es una proteína de 553 aminoácidos. Los fragmentos inmunogénicos y porciones del mismo comprenden al menos 20, preferiblemente 50, más preferiblemente 100 aminoácidos contiguos como se describe en la solicitud de patente referenciada anteriormente y se contemplan específicamente en la presente invención. Los fragmentos preferidos se describen en el documento WO 98/50567 (antígeno PS108) y como proteína asociada a cáncer de próstata (SEC ID Nº 9 del documento WO 99/67384). Otros fragmentos preferidos son los aminoácidos 51 - 553, 34 - 553 ó 55 - 553 de la proteína P501S de longitud total. En particular, las construcciones 1, 2 y 3 (véase la figura 2, SEC ID Nº 27 - 32) se contemplan expresamente y se pueden expresar en sistemas de levaduras, por ejemplo, secuencias de ADN que codifican dichos polipéptidos se pueden expresar en el sistema de levaduras.

La prostasa es una serina proteasa específica de la próstata (de tipo tripsina), de 254 aminoácidos de longitud, con una triada H-D-S catalítica de proteasa de serina y una secuencia de prepropéptidos de terminal amino, que indica una función potencial secretora (P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Linas, L. Hood y K. Wand, "Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen - regulated serine protease with prostase restricted expresión, en Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 3114 - 3119)." Se ha descrito un sitio de glicosilación putativo. La estructura pronosticada es muy similar a otras proteasas de serina conocidas, que muestran que el polipéptido maduro se pliega en un dominio único. La proteína madura es de 224 aminoácidos de longitud, con un epítope A2 mostró que se procesaba naturalmente. La secuencia de nucleótidos de la prostasa y la secuencia polipeptídica deducida y homólogos se describen en Ferguson y col., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114 - 3119) y en las solicitudes de patente internacional número de documento WO 98/12302 (y también la correspondiente patente concedida de Estados Unidos 5.955.306), documento WO 98/20117 (y también las correspondientes patentes concedidas de Estados Unidos 5.840.871 y Estados Unidos 5.786.148) (calicreína específica de la próstata) y documento WO 00/04149 (P703P).

Otros antígenos específicos de la próstata se conocen del documento WO98/37418 y documento WO/004149. Otro es STEAP (PNAS 96 14523 14528 7 - 12 1999).

Otros antígenos asociados a tumores útiles en el contexto de la presente invención incluyen: Plu-1 J. Biol. Chem 274 (22) 15633 - 15645, 1999, HASH-1, HASH-2, (Alders, M. y col., Hum. Mol. Genet. 1997, 6, 859 - 867), Cripto (Salomon y col., Bioessays 199, 21 61 - 70, patente de Estados Unidos 5654140), CASB616 (documento WO 00/53216), Criptina (documento de Estados Unidos 5.981.215). Adicionalmente, los antígenos particularmente relevantes para vacunas en la terapia de cáncer también comprenden tirosinasa, telomerasa, P53, NY-Br1,1 (documento WO 01/47959) y los fragmentos de los mismos como se describen en el documento WO 00/43420, B726 (documento WO 00/60076, SEC ID números 469 y 463; documento 01/79286, SEC ID números 474 y 475), P510 (documento WO 01/34802 SEC ID números 537 y 538) y survivina.

La presente invención también es útil en combinación con antígenos de cáncer de mama tales como Her-2/neu, mamaglobina (patente de Estados Unidos Nº 5.668.267), B305D (documento WO 00/61753 SEC ID números 299, 304, 305 y 315), o los descritos en los documentos WO 00/52165, WO 99/33869, WO 99/19479, WO 98/45328. Los antígenos Her-2/neu se describen entre otros en la patente de Estados Unidos 5.801.005. Preferiblemente el Her-2/neu comprende el dominio extracelular entero (que comprende aproximadamente los aminoácidos 1 - 645) o fragmentos del mismo y al menos una porción inmunogénica del o el dominio intracelular entero aproximadamente el extremo C de 580 aminoácidos. En particular, la porción intracelular debe comprender el dominio de fosforilación o fragmentos del mismo. Dichas construcciones se describen en el documento WO 00/44899. Una construcción particularmente preferida se conoce como ECD-PhD, una segunda se conoce como ECD deltaPhD (véase documento WO 00/44899). El Her-2/neu como se utiliza en esta memoria descriptiva se puede derivar de rata, ratón o ser humano.

Ciertos antígenos de tumores son antígenos de péptidos pequeños (es decir menores de 50 aminoácidos). Estos antígenos se pueden conjugar químicamente con la proteína de unión a colina modificada de la presente invención.

Los péptidos ejemplares incluyen péptidos derivados de mucina tales como MUC-1 (véase por ejemplo el documento de Estados Unidos 5.744.144, e el documento de Estados Unidos 5.827.666, el documento WO 88/05054, el documento de Estados Unidos 4.963.484). Específicamente se contemplan los péptidos derivados de MUC-1 que comprenden al menos una unidad repetida del péptido MUC-1, preferiblemente al menos dos de tales repeticiones y que se reconocen mediante el anticuerpo SM3 (documento de Estados Unidos 6.054.438). Otros péptidos derivados de mucina incluyen el péptido de MUC-5.

Como alternativa, dicho antígeno es una interleuquina tal como IL 13 e IL 14, que son los preferidos. O dicho antígeno puede ser una hormona de autopéptidos tal como la hormona gonadrotrofina de longitud entera que libera hormona (GnRH, documento 95/20600), un péptido corto de 10 aminoácidos de longitud, útil en el tratamiento de muchos cánceres o en inmunocastración.

Otros antígenos específicos de tumores que son adecuados para acoplarse con la proteína de unión a colina modificada de la presente invención incluyen, pero no se restringen a gangliósidos específicos de tumores tales como GM2 y GM3.

El acoplamiento covalente del péptido a la proteína de unión a colina modificada se puede llevar a cabo de una manera bien conocida en la técnica. De este modo, por ejemplo, para el acoplamiento covalente directo es posible utilizar una carboddiimida, glutaraldehído o éster de (N-[\gamma-maleimidobutiriloxi]succinimida, utilizando enlazadores heterobifuncionales comúnmente disponibles comercialmente tales como CDAP y SPDP (usando las instrucciones de los fabricantes). Después de la reacción de acoplamiento, se puede aislar y purificar fácilmente el inmunógeno por medio de un procedimiento de diálisis, un procedimiento de filtración en gel, un procedimiento de fraccionamiento, etc.

El antígeno también se puede derivar a partir de fuentes que son patógenas para los seres humanos tales como el virus de inmunodeficiencia humano VIH-1 (tal como tat, nef, transcriptasa inversa, gag, gp 120 y gp160), los virus del herpes simplex humano, tales como gD o derivados del mismo o proteína inmediata temprana tal como ICP27 de VSH1 o VSH2, citomegalovirus ((especie humana) (tal como gB o derivados del mismo), Rotavirus (incluyendo virus vivos atenuados), virus de Epstein-Barr (tal como gp 350 o derivados del mismo), virus de varicela Zoster (tales como gpI, II e IE63) o virus de hepatitis tales como virus de hepatitis B (por ejemplo antígeno superficial de hepatitis B o un derivado del mismo), virus de hepatitis A, virus de hepatitis C y virus de hepatitis E, o de otros patógenos virales tales como paramixovirus: virus respiratorio sincitial (tales como las proteínas F y G o derivados de las mismas), virus de la parainfluenza, virus del sarampión, virus de la parotidistis infecciosa, virus del papiloma humano (por ejemplo HPV6, 11, 16, 18, ...), flavivirus (por ejemplo virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, virus de la encefalitis transmitido por las garrapatas, virus de la encefalitis japonesa) o virus de la influenza (virus vivo entero o inactivado, virus de la influenza partido, desarrollados en huevos o células MDCK, o viromas flu enteros (como describe R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915 - 920) o proteínas purificadas o recombinantes de los mismos, tales como proteínas HA, NP, NA o M, o combinaciones de las mismas), o derivados de patógenos bacterianos tales como Neisseria spp, incluyendo N. gonorrea y N. meningitidis (por ejemplo, polisacáridos capsulares y conjugados de los mismos, proteínas de unión de transferrína, proteínas de unión de lactoferrína, PilC, adhesinas); S. pyogenes (por ejemplo proteínas M o fragmentos de las mismas, proteasa C5A, ácidos lipoteicoicos), S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp, incluyendo M catarrhalis también conocida como Branhamella catarrhalis (por ejemplo adhesinas e invasinas de alto y bajo peso molecular); Bordetella spp, incluyendo B. pertussis (por ejemplo toxina de pertactina, pertusis o derivadas de las mismas, hemaglutinina filamentosa, adenilatociclasa, fimbria), B. parapertussis y B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., incluyendo M. tuberculosis (por ejemplo ESAT6, Antígeno 85A, -B o -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, incluyendo L. pneumophila; Escherichia spp, incluyendo E. coli enterotóxica (por ejemplo factores de colonización, toxina termolábil o derivados de la misma, toxina termoestable o derivados de la misma), E. coli enterohemorrágica, E. coli enteropatogénica(por ejemplo toxina del tipo toxina siga o derivados de la misma); Vibrio spp, incluyendo V. cholera (por ejemplo toxina del cólera o derivados de la misma); Shigella spp, incluyendo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, incluyendo Y. enterocolitica (por ejemplo una proteína Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluyendo C. jejuni (por ejemplo toxinas, adhesinas e invasinas) y C. coli; Salmonella spp, incluyendo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., incluyendo L. monocytogenes; Helicobacter spp, incluyendo H. pylori (por ejemplo ureasa, catalasa, toxina de vacuolación); Pseudomonas spp, incluyendo P. aeruginosa; Staphylococcus spp., incluyendo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., incluyendo E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., incluyendo C. tetani (por ejemplo toxina del tétanos y derivadas de la misma), C. botulinum (por ejemplo toxina botulínica y derivadas de la misma), C. difficile (por ejemplo toxinas clostrídicas A o B y derivadas de las mismas); Bacillus spp., incluyendo B. anthracis (por ejemplo toxina botulínica y derivadas de la misma); Corynebacterium spp., incluyendo C. diphtheriae (por ejemplo toxina diftérica y derivadas de la misma); Borrelia spp., incluyendo B. burgdorferi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., incluyendo E. equi y el agente de la erliquiosis granulocítica humana; Rickettsia spp, incluyendo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluyendo C. trachomatis (por ejemplo MOMP, proteínas de unión a heparina), C. pneumoniae (por ejemplo MOMP, proteínas de unión a heparina), C. psittaci; Leptospira spp., incluyendo L. interrogans; Treponema spp., incluyendo T. pallidum (por ejemplo las proteínas de la membrana externa raras), T. denticola, T. hyodysenteriae; o derivadas de parásitos tales como Plasmodium spp., incluyendo P. falciparum; Toxoplasma spp., incluyendo T. gondii (por ejemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluyendo E. histolytica; Babesia spp., incluyendo B. microti; Trypanosoma spp., incluyendo T. cruzi; Giardia spp., incluyendo G. lamblia; Leshmania spp., incluyendo L. major; Pneumocystis spp., incluyendo P. carinii; Trichomonas spp., incluyendo T. vaginalis; Schisostoma spp., incluyendo S. mansoni, o derivados de levaduras tales como Candida spp., incluyendo C. albicans; Cryptococcus spp., incluyendo
C. neoformans.

Otros antígenos específicos preferidos para M. tuberculosis son por ejemplo Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 y hTCC1 (WO 99/51748). Proteínas para M. tuberculosis también incluyen proteínas de fusión y variantes de las mismas, donde al menos dos, preferiblemente tres polipéptidos de M. tuberculosis se fusionan en una gran proteína. Las fusiones preferidas incluyen Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (documento WO 99/51748).

Los antígenos más preferidos para Clamidia incluyen por ejemplo la proteína de alto peso molecular (HWMP) (documento WO 99/17741), ORF3 (EP 366 412), y proteínas de la membrana putativas (Pmps). Otros antígenos de Clamidia de la formulación de vacunas se pueden seleccionar del grupo descrito en el documento WO 99/28475.

Los antígenos bacterianos preferidos se derivan de Streptococcus spp, incluyendo S. pneumoniae (por ejemplo polisacáridos capsulares y conjugados de los mismos, PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de unión a colina) y el antígeno proteico neumolisina (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins y col., Microbial Pathogenesis, 25, 337 - 342), y derivados mutantes detoxificados del mismo (documento WO 90/06951; documento WO 99/03884). Otros antígenos bacterianos preferidos se derivan de Haemophilus spp., incluyendo H. influenzae tipo B (por ejemplo PRP y conjugados del mismo), H. influenzae no tipificada, por ejemplo OMP26, adhesinas de alto peso molecular, P5, P6, proteína D y lipoproteína D, y la fimbrina y péptidos derivados de la fimbrina (documento de Estados Unidos 5.843.464) o variantes de múltiples copias o proteínas de fusión de las mismas.

Se conocen bien en la técnica los derivados del antígeno superficial de la hepatitis B e incluyen, entre otros, los antígenos PreS1, PreS2 S indicado y descrito en las solicitudes de patentes europeas EP-A-414 374; EP-A-0304 578 y EP 198-474. En una preferida el antígeno VBH es VBH polimerasa (Ji Hoon Jeong y col., 1996, BBRC 223, 264 - 271; Lee H.J. et al, Biotechnol. Lett. 15, 821-826). En otro aspecto preferido el antígeno dentro de la fusión es un antígeno VIH-1, gp120, especialmente cuando se expresa en las células CHO. En una realización adicional, el antígeno comprende gD2t como se ha definido previamente en esta memoria descriptiva.

En una realización preferida de la presente invención las fusiones comprenden un antígeno derivado del virus del papiloma humano (VPH 6a, 6b, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68), en particular los serotipos VPH que se considera que son responsables de verrugas genitales(VPH 6 ó VPH 11y otros)y los virus VPH responsables del cáncer cervical (VPH 16, VPH 18 y otros).

Los antígenos VPH adecuados son E1, E2, E4, E5, E6, E7, L1 y L2. Las formas particularmente preferidas de fusiones profilácticas o terapéuticas de verrugas genitales comprenden partículas o capsómeros L1, y proteínas de fusión que comprenden uno o más antígenos seleccionados de las proteínas de VPH 6 y VPH 11 E6, E7, L1, y L2.

Las formas más preferidas de las proteínas de fusión son: L2E7 como se describe en el documento WO 96/26277, y la proteína D(1/3)-E7 descrita en el documento GB 9717953,5 (PCT/EP98/05285).

Una composición preferida de vacuna terapéutica o profiláctica contra el cáncer o infección cervical por VPH, profilaxis o vacuna terapéutica puede comprender 16 ó 18 antígenos de VPH. Por ejemplo los monómeros de los antígenos L1 y L2, o los antígenos L1 o L2 presentados juntos como una partícula de tipo virus (VLP) o la proteína sola de L1 presentada sola en a estructura de VLP o de capsómero. Tales antígenos, partículas semejantes a virus y capsómero se conocen per se. Véase por ejemplo el documento WO94/00152, documento WO94/20137, documento WO94/05792 y documento WO93/02184.

Se pueden incluir proteínas tempranas adicionales solas o como proteínas de fusión tales como por ejemplo E7, E2 o preferiblemente E5; las realizaciones particularmente preferidas de esto incluyen una VLP que comprende proteínas de fusión L1E7 (documento WO 96/11272). Los antígenos de VPH 16 particularmente preferidos comprenden las proteínas tempranas E6 o E7 en fusión con un vehículo de proteína D para formar las fusiones proteína D-E6 o E7 del VPH 16 o combinaciones de las mismas; o combinaciones de E6 y E7 con L2 (documento WO 96/26277). Como alternativa las proteínas tempranas de VPH 16 ó 18 E6 y E7, se pueden presentar en una molécula única, preferiblemente una fusión de proteína D-E6/E7. Opcionalmente otras fusiones contienen bien proteínas E6 y E7 de VPH 18 o ambas, preferiblemente en la forma de una proteína de fusión Proteína D-E6 o Proteína D-E7 o proteína de fusión Proteína D E6/E7. Las fusiones pueden comprender antígenos de otras cepas de VPH, preferiblemente de cepas VPH 31 ó 33.

Las fusiones según la presente invención comprenden antígenos derivados de parásitos que producen malaria. Por ejemplo, los antígenos preferidos de Plasmodia falciparum incluyen RTS,S y TRAP. RTS es una proteína híbrida que sustancialmente comprende todas las porciones de extremo C de la proteína de circumsporocitos (CS) de P. falciparum unida mediante cuatro aminoácidos de la porción preS2 del antígeno superficial de la hepatitis B al antígeno superficial (S) del virus de la hepatitis B. Su estructura completa se describe en la solicitud de patente internacional Nº PCT/EP92/02591, publicada con el número de documento WO 93/10152 reivindicando prioridad de la solicitud de patente del Reino Unido Nº 9124390,7. Cuando se expresa en RST de levadura se produce en forma de una partícula de proteína y cuando se coexpresa con el antígeno S de VBH produce una partícula mezclada conocida como RTS,S. Los antígenos TRAP se describen en la solicitud de patente universal Nº PCT/GB89/00895, publicada como documento WO 90/01496. Una realización preferida de la presente invención es una fusión en la que la preparación antigénica comprende una combinación de los antígenos RTS,S y TRAP. Otros antígenos de plasmodios que son probablemente candidatos que van a ser componentes de la fusión son P. faciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, secuestrin, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 y sus análogos en Plasmodium spp.

La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica la pareja de fusión según la presente invención. Además la invención se refiere a un polinucleótido que se hibrida a la secuencia polinucleotídica proporcionada en esta memoria descriptiva en la figura 1 (SEC ID Nº 9 a 16). Con relación a esto, especialmente la invención se refiere a polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas al polinucleótido descrito en esta memoria descriptiva. Como se usa en esta memoria descriptiva, las expresiones "condiciones rigurosas" y "condiciones de hibridación rigurosas" significa la hibridación que ocurre solamente si hay al menos 95% y preferiblemente 97% de identidad entre secuencias. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación rigurosas es la incubación durante una noche a 42ºC en una solución que comprende: formamida al 50%, 5 x de SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x de solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 microorganismos/ml de ADN de esperma de salmón fraccionado desnaturalizado seguido de lavado del soporte de hibridación en 0,1 x SSC a aproximadamente 65ºC. Las condiciones de hibridación y lavado se conocen bien y se ejemplifican en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Sprong Harbor, N. Y., (1989), en particular el su capítulo 11. Se puede usar también hibridación en solución con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas por la invención.

La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido que comprende la pareja de fusión según la presente invención fusionada a a un antígeno asociado a tumores o fragmento del mismo. En particular, la presente invención proporciona secuencias de polinucleótidos que codifican una pareja de fusión que comprende un dominio de unión a colina y un epítope auxiliar T promiscuo heterólogo, preferiblemente cuando el dominio de unión a colina se deriva del extremo C de LytA. En una realización más preferida, el resto C-LytA de los polinucleótidos según la invención comprenden al menos cuatro repeticiones de cualquiera de SEC ID Nº 9 - 14, más preferentemente comprenden la secuencia SEC ID Nº 15, todavía más preferible la secuencia de SEC ID Nº 16. En otras realizaciones relacionadas, la presente invención proporciona variantes de polinucleótidos que son sustancialmente idénticas a las secuencias descritas en esta memoria descriptiva en la SEC ID Nº 9 - 16, por ejemplo las que comprenden al menos 70% de identidad de secuencias, preferiblemente al menos 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% o más, de identidad de secuencias comparada con la secuencia polinucleotídica de esta invención usando procedimientos convencionales, por ejemplo, análisis BLAST que usa parámetros estándar. Todavía en una realización adicional el polinucleótido que se reivindica comprende además una proteína heteróloga.

Tales secuencias de polinucleótidos se pueden insertar en un vector de expresión adecuado y expresarse en un huésped adecuado. Se pueden proporcionar vectores que codifican la proteína de unión a colina modificada de la invención y que contiene un sitio de restricción adecuado en el que un ADN que codifica una proteína escasamente inmunogénica se puede insertar para producir una proteína de fusión. En otras realizaciones de la invención, las secuencias de polinucleótidos o fragmentos del mismo que codifican fusiones de polipéptidos de la invención, se pueden usar en moléculas de ADN recombinante para dirigir la expresión de un polipéptido en células huéspedes adecuadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, se pueden producir otras secuencias que codifiquen sustancialmente la misma o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente y estas secuencias se pueden utilizar para clonar y expresar un polipéptido dado.

Como entenderán los expertos en la técnica, en algunos casos puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifiquen polipéptidos que poseen codones de origen no natural. El código de ADN tiene cuatro letras (A, T, C y G) y utiliza éstas para deletrear "codones" de tres letras que representan los códigos de los aminoácidos de las proteínas en los genes de un organismo. La secuencia lineal de codones junto con la molécula de ADN se traduce en la secuencia lineal de de aminoácidos en la (s) proteína (s) codificada (s) por estos genes. El código es altamente degenerativo, con 61 codones que codifican los 20 aminoácidos naturales y 3 codones que representan señales de "parada". De este modo, la mayoría de los aminoácidos se codifican por más de un codón, de hecho varios se codifican por cuatro o más codones diferentes.

Cuando se dispone de más de un codón para codificar un aminoácido dado, se ha observado que los patrones de uso de codones de organismos son altamente no aleatorios. Las diferentes especies muestran una diferente desviación en su selección de codones y, además, la utilización de codones puede ser notablemente diferente en una única especie entre genes que se expresan en niveles altos y bajos. Esta desviación es diferente en virus, plantas, bacterias y células de mamíferos, y algunas especies muestran una desviación mayor de una selección de codones aleatoria que otras. Por ejemplo, los seres humanos y otros mamíferos presentan una desviación menos fuerte que ciertas bacterias o virus. Por estas razones existe una probabilidad significativa de que un gen de mamífero expresado en E. coli o un gen viral expresado en células de mamíferos tenga una distribución inapropiada de codones para su expresión eficaz. Se cree que la presencia en una secuencia de ADN heteróloga de grupos de codones que se observan raramente en el huésped en el que se va a producir la expresión, predice niveles bajos de expresión heteróloga en ese huésped.

En consecuencia, se pueden optimizar los codones preferidos por un huésped procariótico (por ejemplo E. coli o levadura) o eucariótico en particular, esto se selecciona para incrementar la velocidad de expresión de proteínas con el fin de producir una transcripción de ARN recombinante que tiene propiedades deseables, tales como por ejemplo una semivida que es mayor que la de una transcripción generada de la secuencia de origen natural, o para optimizar la respuesta inmune en seres humanos. El procedimiento de la optimización de codones puede incluir cualquier secuencia, generada bien manualmente o por programa de ordenador, donde se modifican alguno o todos los codones de la secuencia nativa. Se han publicado diversos procedimientos (Nakamura y col., Nucleic Acids Research 1996, 24: 214 - 215; documento WO98/34640). Un procedimiento preferido según esta invención es el procedimiento Syngene, una modificación del procedimiento Calcgene (R. S. Hale y G Thompson (Protein expresión and Purification Vol. 12 pp. 185 - 188 (1998)).

De acuerdo con lo anterior, en una realización preferida la secuencia de ADN de la proteína tiene un RSCU (uso de codones sinónimos relativos (también como índice de codones CI)) de al menos 0,65 y tienen menos de 85% de identidad con la correspondiente región de tipo salvaje.

Este procedimiento de optimización de codones y las construcciones resultantes son ventajosas ya que pueden tener alguno o todos de los siguientes beneficios: 1) mejorar la expresión del producto génico reemplazando los codones raros o infrecuentemente usados con codones usados más frecuentemente, 2) retirar o incluir sitios de enzimas de restricción para facilitar la clonación hacia abajo y 3) reducir el potencial de recombinación homóloga entre la secuencia de inserción en el vector de ADN y las secuencia genómicas y 4) mejorar la respuesta inmune en seres humanos aumentando una respuesta celular y/o de un anticuerpo (preferiblemente ambas respuestas) frente al antígeno diana. Las secuencias de la presente invención han reducido ventajosamente el potencial de recombinación, pero se expresan al mismo nivel que las secuencias de tipo salvaje. Debido a la naturaleza de los algoritmos usados por el programa SynGene para generar una secuencia de codón optimizado, es posible generar un número extremadamente grande de secuencias de codón optimizado que realizarán una función similar. Brevemente, los codones se asignan usando un procedimiento estadístico para proporcionar genes sintéticos que tengan una frecuencia de codones más próxima que la encontrada naturalmente en E. coli altamente expresada y en genes humanos. Brevemente, los codones se asignan usando un procedimiento estadístico para proporcionar un gen sintético que tenga una frecuencia de codones más próxima que la encontrada naturalmente en genes humanos altamente expresados tales como actina \beta. Los ejemplo ilustrativos, aunque no limitantes, de secuencias de codón optimizadose proporcionan en las SEC ID Nº 19 - 22 y SEC ID Nº 24 - 26.

En los polinucleótidos de la presente invención, el patrón de uso de codones se altera del típico del antígeno diana para representar más cercanamente la desviación de codones de un gen altamente expresado en un organismo diana, por ejemplo la actina \beta humana. El "coeficiente de uso de codones" es una medida del nivel de semejanza del patrón de codones de una secuencia polinucleotídica dada con el de una especie diana. Las frecuencias de codones pueden proceder de fuentes bibliográficas para los genes altamente expresados de muchas especies (véase, por ejemplo, Nakamura y col., Nucleic Acids Research 1996, 24: 14 - 215). Las frecuencias de codones de cada uno de los 61 codones (expresados como el número de apariciones por 1000 codones de la clase seleccionada de genes) se normalizan para cada uno de los veinte aminoácidos naturales, de manera que el valor para el codón usado más frecuentemente de cada aminoácido se establece en 1 y las frecuencias de los codones menos comunes se gradúan para que estén entre cero y uno. De este modo a cada uno de los 61 codones se le asigna un valor de 1 o inferior para los genes altamente expresados de la especie diana. Con el fin calcular el coeficiente de uso de codones de un polinucleótido específico, relativo a los genes altamente expresados de esa especie, se anota el valor de la escala de cada codón del polinucleótido específico y se toma la media geométrica de todos estos valores (dividiendo la suma de los logaritmos naturales de estos valores por el número total de codones y obteniendo el antilogaritmo). El coeficiente tendrá un valor entre cero y 1 y cuanto más alto sea el coeficiente más serán los codones del polinucleótido que se usan frecuentemente. Si una secuencia polinucleotídica tiene un coeficiente de uso de codones de 1, todos los codones son los codones "más frecuentes" para los genes altamente expresados de la especie diana.

De acuerdo con la presente invención, el patrón de uso de codón del polinucleótido excluirá preferiblemente codones que representan < 10% de los codones usados para un aminoácido particular. Un valor de uso de codones sinónimo relativo (RSCU) es el número observado de codones dividido por el número esperado si todos los codones para los aminoácidos se usaran con igual frecuencia. Un polinucleótido de la presente invención preferentemente excluirá codones con un valor de RSCU inferior a 0,2 en genes altamente expresados del organismo diana. Un polinucleótido de la presente invención generalmente tendrá un coeficiente de uso de codones para genes humanos altamente expresados mayor que 0,6, preferiblemente mayor que 0,65, más preferiblemente mayor que 0,7. Las tablas de uso de codones para seres humanos se pueden también encontrar en el Genbank.

En comparación, un gen de actina beta altamente expresado tiene un RSCU de 0,747.

La tabla de uso de codones (tabla 1) para un Homo sapiens se establece a continuación:

TABLA 1 Uso de codones para genes humanos (altamente expresados) 24/1/91 (human_high.cod)

2

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Una secuencia de ADN que codifica las proteínas de fusión o la proteína de unión a colina modificada de la presente invención se puede sintetizar usando técnicas estándar de síntesis de ADN, tales como unión enzimática según describen D. M. Roberts y col., en Biochemistry 1985, 24, 5090 - 5098, mediante síntesis química, mediante polimerización enzimática in vitro, o mediante tecnología PCR que utiliza, por ejemplo, una polimerasa termoestable, o mediante una combinación de estas técnicas.

La polimerización enzimática de ADN se puede llevar acabo in vitro usando una ADN polimerasa tal como la ADN polimerasa I (fragmento Klenow) o Taq polimerasa en un tampón apropiado que contiene los nucleósidos trifosfato dATP, dCTP, dGTP y dTTP según se requiera a una temperatura de 10º -37ºC, generalmente en un volumen de 50 \mul o menos. La unión enzimática de los fragmentos de ADN se puede llevar a cabo usando ADNligasa tal como ADNligasa T4 en un tampón adecuado tal como Tris 0,05M (pH 7,4), MgCl_{2} 0,01M, ditiotreitol 0,01M, espermidina 1 mM, ATP 1 mM y albúmina sérica bovina 0,1 mg/ml a una temperatura de 4ºC hasta ambiente, generalmente en un volumen de 50 \mul o menos. La síntesis química del polímero o fragmentos de ADN se puede llevar a cabo mediante la química de los fosfotriésteres, fosfatos o fosforamiditas, que usan técnicas de fase sólida tales como las descritas en "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual" (ed. H.G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), u otras publicaciones científicas, por ejemplo, M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat, y R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat, y W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci y M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams y col., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, y H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; y H.W.D. Matthes y col., EMBO Journal, 1984, 3, 801.

El procedimiento de la invención se puede realizar mediante técnicas de recombinación convencionales tales como las descritas en Maniatis y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989.

En particular el procedimiento puede comprender las etapas de:

i): preparar un vector de expresión replicable o de integración capaz, en una célula huéspeda, de expresar un polímero de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína o un derivado inmunogénico de la misma.

ii): transformar una célula huésped con dicho vector

iii): cultivar dicha célula huésped en condiciones que permitan la expresión de dicho polímero de ADN para producir dicha proteína; y

iv): recubrir dicha proteína

El término "transformador" se usa en esta memoria descriptiva para significar la introducción de un ADN extraño en una célula huésped. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante transformación, transfección o infección con un vector plásmido o viral adecuado usando, por ejemplo técnicas convencionales como se describe en Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman y A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988. El término "transformado" o "transformante" se aplicará posteriormente en esta memoria descriptiva a la célula huésped resultante que contiene y expresa el gen extraño de interés.

Los vectores de expresión son nuevos y también forman parte de la invención.

Los vectores de expresión replicables se pueden preparar de acuerdo con la invención, mediante el desdoblamiento de un vector compatible con la célula huésped para proporcionar un segmento lineal de ADN que tiene un replicón intacto, y combinando dicho segmento lineal con una o más moléculas de ADN que, junto con dicho segmento lineal codifican el producto deseado, tal como el polímero de ADN que codifica la proteína de la invención, o un derivado del mismo, en condiciones de unión.

De este modo, el polímero de ADN se puede producir o formar durante la construcción del vector según se desee.

La elección del vector se determinará en parte por la célula huésped, que puede ser procariótico o eucariótico pero preferiblemente E. coli, levadura o células CHO. Los vectores adecuados incluyen plásmidos, bacteriófagos, cósmidos y virus recombinantes. Los vectores de expresión y clonación contienen preferiblemente un marcador seleccionable de tal manera que solamente las células huéspedes que expresen el marcador sobrevivirán en las condiciones selectivas. Los genes de selección incluyen pero no se limitan a la codificación de la proteína que confiere resistencia a la ampicilina, tetraciclina o canamicina. Los vectores de expresión también contienen secuencias de control que son compatibles con el huésped designado. Por ejemplo, las secuencias de control de expresión de E. coli y más generalmente de procariotas, incluyen sitios de unión a promotores y ribosomas. Las secuencias de promotores pueden ser de origen natural, tales como la lactamasa \beta (penicilinasa) (Weissman 1981, en Interferon 3 (ed. L. Gresser), lactosa (lac) (Chang y col., Nature, 1977, 198: 1056) y triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucl. Acids Res. 1980, 8, 4057) y sistema del promotor P_{L} lambda derivado. Además, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo este es el caso del promotor del híbrido sintético tac que se deriva de las secuencias de los promotores de trp y lac (De Boer y col., Proc. Natl Acad Sci. USA 1983, 80, 21-26). Estos sistemas son particularmente adecuados con E. coli.

Los vectores compatibles de levaduras también llevan marcadores que permiten la selección de transformantes exitosos confiriendo fototrofía a mutantes autotróficos o resistencia a metales pesados en cepas salvajes. Las secuencias de control de expresión de vectores de levadura incluyen promotores de enzimas glicolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 1968, 7, 149), el gen PHO5 que codifica la fosfatasa ácida, el gen CUP1, el gen ARG3, promotores de los genes GAL y secuencias de promotores sintéticos. Otros elementos de control útiles en la expresión de levaduras son terminadores y secuencias conductoras de mRNA. La secuencia que codifica la posición 5' es particularmente útil ya que típicamente codifica un péptido señal que comprende aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína de la célula. Las secuencias señal adecuadas se pueden codificar mediante genes de proteínas secretadas de levaduras tales como el gen de la invertasa de levadura y el gen del factor a, fosfatasa ácida, toxina asesina, el gen del factor de igualamiento alfa y recientemente la secuencia señal de inulinasa heteróloga derivada del gen INU1A de Kluyveromyces marxianus. Los vectores adecuados se han desarrollado por expresión en Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae.

Se dispone de una diversidad de vectores de expresión de P. pastoris basándose en diversos promotores inducibles o constitutivos (Cereghino and Cregg, FEMS Microbiol. Rev. 2000,24:45-66). Para la producción de proteínas citosólicas y secretadas los vectores de P. pastoris comúnmente usados contienen el promotor de alcohol oxidasa (AOX1) regulado muy fuerte y firmemente. Los vectores también contienen el gen histidinol denhidrogenasa (HIS4) de P. pastoris para selección en huéspedes de his4. La secreción de proteína extraña requiere la presencia de una secuencia señal y la secuencia señal del factor de igualamiento de prepro alfa de S. cerevisiae se ha usado amplia y exitosamente en el sistema de expresión de Pichia. Los vectores de expresión se integran en el genoma de P. pastoris para maximizar la estabilidad de cepas de expresión. Como en S. cerevisiae, el desdoblamiento de un vector de expresión P. pastoris con una secuencia compartida por el genoma huésped (AOX1 o HIS4) estimula los sucesos de recombinación homóloga que dirigen eficazmente la integración del vector en el locus genómico. En general, una cepa recombinante que contiene múltiples copias integradas de un módulo de expresión puede producir proteínas más heterólogas que la cepa de una sola copia. La forma más eficaz de obtener transformantes de alto número de copias requiere la transformación de una cepa receptora de Pichia mediante la técnica de esferoplastos (Creeg y col., Mol Cell. Biol. 5: 3376 - 3385).

La preparación del vector de expresión replicable se puede llevar a cabo convencionalmente con enzimas adecuadas para restricción, polimerización y unión de ADN, mediante procedimientos descritos, por ejemplo, Manialis y col., citado anteriormente.

La célula huésped recombinante se prepara, de acuerdo con la invención, mediante la transformación de una célula huéspeda con un vector de expresión replicable de la invención en condiciones de transformación. Las condiciones de transformación adecuadas son convencionales y se describen en, por ejemplo, Maniatis y col., citado anteriormente o "DNA Cloning" Vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985.

La elección de las condiciones de transformación depende de la elección de la célula huésped que se va a transformar. Por ejemplo, la transformación in vivo que usa un vector viral vivo como el agente de transformación de los polinucleótidos de la invención se ha descrito anteriormente. La transformación bacteriana de un huésped tal como E. coli se puede hacer mediante absorción directa de los polinucleótidos (que pueden ser los vectores de expresión que contienen la secuencia deseada) después de que el huésped se ha tratado con una solución de CaCl_{2} (Cohen y col., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) o con una solución que comprende una mezcla de cloruro de rubidio (RbCl), MnCl_{2}, acetato potásico y glicerol, y después con ácido 3-[N-morfolino]-propano-sulfónico, RbCl y glicerol o mediante electroporación. La transformación de organismos eucarióticos inferiores tales como células de levaduras en cultivo mediante absorción directa se puede llevar a cabo mediante por ejemplo el uso del procedimiento de Hinnen y col., (Proc. Natl. Acad. Sci. 1978, 75: 1929 - 1933). Las células de mamíferos en cultivo se pueden transformar usando la coprecipitación del fosfato cálcico del ADN vector en las células (Graham & Van der Eb, Virology 1978, 52, 546). Otros procedimientos para la introducción de polinucleótidos en células de mamíferos incluyen la transfección mediada pordextrano, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación, encapsulación del (de los) polinucleótido (s) en los liposomas, y la microinyección directa de los polinucleótidos en los núcleos.

La invención también se extiende a una célula huésped transformada con un ácido nucleico que codifica la proteína de la invención en un vector de expresión replicable de la invención.

El cultivo de la célula huésped transformada que permiten la expresión del polímero de ADN se lleva a cabo convencionalmente, como se describe, por ejemplo, en Maniatis y col., y "DNA cloning" citados anteriormente. De este modo, preferiblemente a la célula se la suministra un nutriente y se cultiva a una temperatura inferior a 50ºC, preferiblemente entre 25ºC y 42ºC, más preferiblemente entre 25ºC y 35ºC, y más preferiblemente a 30ºC. El tiempo de incubación puede variar entre unos pocos minutos y unas pocas horas, según la proporción del polipéptido en la célula bacteriana, según se aprecia mediante SDS-PAGE o transferencia de Western.

El producto se puede recuperar mediante procedimientos convencionales según la célula huésped y según la localización del producto de expresión (intracelular o secretada en el medio de cultivo o en el periplasma celular). De este modo, cuando la célula huésped es bacteriana, tal como E. coli puede, por ejemplo, lisarse físicamente, químicamente o enzimáticamente y el producto de la proteína aislarse a partir del lisado resultante. Cuando la célula huésped es de un mamífero, generalmente el mamífero se puede aislar a partir del medio nutriente o a partir de extractos exentos de células. Cuando la célula huésped es una levadura tal como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, generalmente el producto se puede aislara partir de células lisadas o a partir del medio de cultivo, y después purificarse adicionalmente usando técnicas convencionales. La especificidad del sistema de expresión se puede valorar mediante las transferencias de Western o mediante ELISA usando un anticuerpo dirigido contra el polipéptido de interés.

Las técnicas de aislamiento de proteínas convencionales incluyen precipitación selectiva, cromatografía de adsorción y cromatografía de afinidad que incluye una columna de afinidad de anticuerpos monoclonal. Cuando las proteínas de la presente invención se expresan con una cola de histidina (señal His) se pueden purificar fácilmente mediante cromatografía de afinidad que usa una columna de afinidad de iones metálicos (IMAC). El ión metálico puede ser cualquier ión adecuado por ejemplo cinc, níquel, hierro, magnesio o cobre, pero es preferible cinc o níquel. Preferiblemente el tampón IMAC contiene detergente, preferiblemente un detergente aniónico tal como SDS, más preferiblemente un detergente no iónico tal como Tween 80, o un detergente bipolar tal como Empigen BB, ya que esto puede dar como resultado niveles más bajos de endotoxina en el producto final.

Las etapas cromatográficas adicionales incluyen por ejemplo una etapa de Q-Sefarosa que se puede llevar a cabo bien antes o después de la columna IMAC. Preferiblemente el pH está en el intervalo entre 7,5 y 10, más preferiblemente entre 7,7 y 9,5, óptimamente entre 8 y 9.

De este modo, las proteínas de la invención se pueden purificar según el siguiente protocolo. Después de la ruptura de celular, los extractos celulares que contienen la proteína se pueden solubilizar en un tampón Tris pH 8,5 que contiene urea (8,0 M por ejemplo) y SDS (entre 0,5 y 1% por ejemplo). Después de centrifugación el sobrenadante resultante se puede cargar en una columna de Sefarosa FF de IMAC (níquel) equilibrada con un tampón Tris pH 8,5. Después la columna se puede lavar con un tampón que contiene una alta concentración de sal (por ejemplo, NaCl 0,75 - 1,5 m, tampón Tris 15 mM pH 8,5). Opcionalmente la columna se puede lavar otra vez con tampón fosfato sin sal. Las proteínas de la invención se pueden eluir de la columna con solución tamponada que contiene imidazol. Después las proteínas se pueden someter a una etapa adicional de cromatografía, tal como una cromatografía de intercambio aniónico (por ejemplo, Sefarosa Q).

Las proteínas de la presente invención se proporcionan bien solubles en forma líquida o en forma liofilizada, que es la forma preferida. Generalmente se espera que cada dosis humana comprenda entre 1 y 1000 \mug de proteína y preferiblemente entre 30 y 300 \mug. El procedimiento de purificación puede también incluir una etapa de carboxiamidación en la que la proteína primero se reduce en presencia de glutation y después se carboximetila en presencia de yodoacetamida. Esta etapa ofrece la ventaja de controlar la agregación oxidante de la molécula consigo misma o con los contaminante de la proteína de la célula huésped a través de un puente covalente con enlaces
disulfuro.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas e inmunogénicas que comprenden una proteína de la presente invención en un excipiente farmacéuticamente aceptable. Una composición de vacuna preferida comprende al menos una proteína según la invención. Preferiblemente dicha proteína tiene grupos tioles bloqueados y está altamente purificada, por ejemplo, tiene menos de 5% de contaminación de la célula huésped. Dicha vacuna puede opcionalmente contener uno o más otros antígenos asociados a tumores y derivados. Por ejemplo, otro antígeno asociado adecuado incluye próstata, PAP-1, PSA (antígeno específico de próstata), PMSA (antígeno de membrana específico de próstata), PSCA (antígeno de células madre de próstata), STEAP.

En otra realización, las composiciones ilustrativas inmunogénicas, tales como por ejemplo composiciones de vacunas, de la presente invención comprenden ADN que codifica uno o más de los polipéptidos de fusión como se ha descrito anteriormente, de manera que el polipéptido de fusión se genera in situ. Como se ha indicado anteriormente, el polinucleótido se puede administrar en una diversidad de sistemas de administración conocidos por los expertos en la técnica. Sin duda, se conocen bien en la técnica numerosas técnicas de liberación génica, tales como las descritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998, y las referencias citadas en dicho documento. Por supuesto, los sistemas de expresión de polinucleótidos adecuados contienen las secuencias reguladoras de ADN necesarias para la expresión en un paciente (tales como un promotor adecuado y señal de terminación). Alternativamente, los sistemas de administración bacterianos pueden implicar la administración de una bacteria (tal como Bacillus-Calmette-Guerrin) que expresa una porción inmunogénica del polipéptido en su superficie celular o que secreta dicho epítope.

Por lo tanto, en ciertas realizaciones, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos inmunogénicos descritos en esta memoria descriptiva se introducen en células huéspedes de mamíferos adecuadas para expresión usando cualquiera de los numerosos sistemas a base de virus conocidos. En una realización ilustrativa, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente y eficaz de sistemas de administración génica. Una secuencia de nucleótidos seleccionada que codifica un polipéptido de la presente invención se puede insertar en un vector y empaquetarse en partículas retrovirales usando tecnologías conocidas en la técnica. Después el virus recombinante se puede aislar y administrar a un sujeto. Se han descrito numerosos sistemas ilustrativos retrovirales (por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa y col., (1991) Virology 180: 849 - 852; Burns y col., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033 - 8037; y Boris - Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102 - 109.

Además, también se han descrito numerosos sistemas ilustrativos a base de adenovirus. A diferencia de los retrovirus que se integran en el genoma huésped, los adenovirus persisten extracromosómicamente minimizando de esta manera el riesgo asociado con la mutagénesis insercional (Haj-Ahmad y Graham (1986) J. Virol. 57: 267 - 274; Bett y col., (1993) J. Virol. 67: 5911 - 5921; Mittereder y col., (1994) Human Gene Therapy 5: 717 - 729; Seth y col., (1994) J. Virol. 68: 933 - 940; Barr y col., (1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6: 616 - 629; y Rich y col., (1993) Human Gene Therapy 4: 461 - 476). Ya que los seres humanos se infectan a veces con serotipos de adenovirus humanos comunes tales como AdHu5, una proporción significativa de la población tiene una respuesta de anticuerpos neutralizadora al adenovirus, que probablemente efectúa la respuesta inmune a un antígeno heterólogo en un sistema a base de vacunas recombinante. Los vectores adenovirales de primates no humanos tales como el adenovirus 69 de chimpancé (AdC68, Fitzgerald y col., (2003) J. Immunol 170(3): 1416 - 22)) pueden ofrecer un sistema adenoviral alternativo sin la desventaja de una respuesta de anticuerpo neutralizante preexistente.

Se han desarrollado también diversos sistemas vectores de virus asociados a adenovirus (AAV) para la administración de polinucleótidos. Los vectores AAV se pueden construir fácilmente usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 5.173.414 y 5.139.941; las publicaciones internacionales números WO 92/01070 y WO 93/03769; Lebkoski y col., (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent y col., (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3: 533 - 539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158: 97 - 129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793 - 801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1: 165 - 169; and Zhou y col., (1994) J. Exp. Med. 179: 1867 - 1875.

Los vectores virales adicionales útiles para la administración de moléculas de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la presente invención mediante transferencia génica incluyen los derivados de la familia del virus de la viruela, tales como virus de vaccinia y poxvirus aviar. Como ejemplo, los recombinantes de virus de vaccinia que expresan las moléculas nuevas se pueden construir como sigue. Primero el ADN que codifica un polipéptido se inserta en un vector adecuado de manera que sea adyacente a un promotor de vaccinia y a secuencias de ADN flanqueantes de vaccinia, tales como la secuencia que codifica la timidinaquinasa (TK). Después este vector se usa para transfectar células que se infectan simultáneamente con vaccinia. La recombinación homóloga sirve para insertar el promotor de vaccinia más el gen que codifica el polipéptido de interés en el genoma viral. El recombinante TK.sup.(-) resultante se puede seleccionar mediante el cultivo de las células en presencia de 5-bromodesoxiuridina y recogiendo las placas virales resistentes al mismo.

Un sistema de infección/transfección a base de vaccinia se puede usar convenientemente para proporcionar expresión o coexpresión inducible y transitoria de uno o más polipéptidos descritos en esta memoria descriptiva en células huéspedes de un organismo. En este sistema particular, primero las células se infectan in vitro con un recombinante de virus de vaccinia que codifica la ARN polimerasa del bateriófago T7. Esta polimerasa muestra una especificidad exquisita porque solamente transcribe moldes que soportan promotores T7. Después de la infección, se transfectan las células con el polinucleótido o polinucleótidos de interés, conducidos por un promotor T7. La polimerasa expresada en el citoplasma del recombinante del virus de vaccinia transcribe el ADN trasfectado en ARN que después se traduce en un polipéptido mediante la maquinaria traductora del huésped. El procedimiento proporciona una producción de alto nivel, transitoria y citoplámica de grandes cantidades de ARN y sus productos de traducción. Véase por ejemplo, Elroy-Stein y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 6743 - 6747; Fuerst y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8122 - 8126.

Como alternativa, los virus de la viruela aviar, tales como los virus de la viruela de las aves de corral y de la viruela de canarios, también se pueden usar para administrar las secuencias de codificación de interés. Se sabe que los virus de la viruela aviar recombinantes, que expresan inmunogenes de patógenos mamíferos, confieren inmunidad protectora cuando se administran a especies no aviares. El uso de un vector Avipox (viruela aviar) se desea particularmente en seres humanos y otras especies de mamíferos ya que los miembros del género Avipox (la viruela aviar) solamente se pueden replicar productivamente en especies aviares susceptibles y por lo tanto no son infecciosos en células de mamíferos. Los procedimientos para producir virus de la viruela aviar se conocen en la técnica y emplean recombinación genética, como se ha descrito anteriormente con respecto a la producción de virus de vaccinia. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 91/12882; WO 89/03429; y WO 92/03545.

Cualquiera de los numerosos vectores alfavirus se pueden utilizar para la administración de composiciones de polinucleótidos de la presente invención, tales como los vectores descritos en las patentes de Estados Unidos números 5.843.723; 6.015.686; 6.008.035 y 6.015.694. También se pueden usar ciertos vectores basados en la encefalitis equina venezolana (VEE), los ejemplos ilustrativos de éstos se pueden encontrar en las patentes de Estados Unidos números 5.505.947 y 5.643.576.

La composiciones de la presente invención se pueden administrar mediante numerosas vías tales como intramuscular, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa.

En otra realización de la invención, se dispensa/administra un polinucleótido en forma de ADN "desnudo", por ejemplo como se describe en Ulmer y col., Science 259:1745-1749, 1993 y revisado por Cohen, Science 259: 1691 - 1692, 1993. La absorción de ADN desnudo se puede incrementar mediante la aplicación de ADN como un recubrimiento en perlas biodegradables, que se transportan eficazmente en las células. En una realización preferida, la composición se administra intradérmicamente. En particular, la composición se administrar mediante técnicas de administración de pistola génica (en particular bombardeo de partículas) que implican el recubrimiento del vector en una perla (por ejemplo oro) que se administran después a alta presión en la epidermis; como, por ejemplo, se describe en Haynes y col., J Biotechnology 44: 37 - 42 (1996).

En un ejemplo ilustrativo, la aceleración de partículas accionada por gas se puede llevar a cabo con dispositivos tales como los fabricados por Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) y Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI), algunos ejemplos de los cuales se describen en las patentes de Estados Unidos números 5.846.796; 6.010.478; 5.865.796; 5.584.807; y la patente de EP Nº 0500 799. Este planteamiento ofrece un método de administración sin aguja en el que una formulación de polvo seco de partículas microscópicas, tal como un polinucleótido, se aceleran a alta velocidad en un chorro de gas de helio generado por un dispositivo manual, que impulsa las partículas a un tejido diana de interés, típicamente la piel. Preferiblemente las partículas son perlas de oro encerradas en un cartucho o módulo para colocarlas en el "cañón de genes".

En una realización relacionada, otros dispositivos y procedimientos que pueden ser útiles para la inyección sin aguja accionada por gas de composiciones de la presente invención incluyen los proporcionados por Bioject, Inc. (Portland, OR), algunos ejemplos de los cuales se describen en las patentes de Estados Unidos números 4.790.824; 5.064.413; 5.312.335; 5.383.851; 5.399.163; 5.520.639 y 5.993.412.

Para el componente inmunogénico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido antigénico es posible que se administre de una vez o que se administre repetidamente, por ejemplo, entre 1 y 7 veces, preferiblemente entre 1 y 4 veces, a intervalos entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 18 meses. Sin embargo, este régimen de tratamiento variará significativamente dependiendo del tamaño del paciente, la enfermedad que se está tratando/previniendo, la cantidad de secuencia de nucleótido administrada, la vía de administración y otros factores que serán evidentes para el profesional sanitario experto.

Por consiguiente otro aspecto de la presente invención es proporcionar el uso de una proteína o ADN que codifica dichas proteína, como se describe en esta memoria descriptiva en la fabricación de una composición inmunogénica para inducir una respuesta en un paciente. Preferiblemente la respuesta inmune se va a inducir mediante administración secuencial de i) dicha proteína seguido de dicha secuencia de ADN; o ii) dicha secuencia de ADN seguido de dicha proteína. Más preferiblemente la secuencia de ADN se recubre en perlas biodegradables o se administra mediante un método de bombardeo de partículas. Todavía más preferiblemente la proteína con adyuvantes, preferiblemente adyuvante inductor de TH-1, preferiblemente con una formulación de adyuvante a base de CpG/Qs21.

Los vectores que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican péptidos antigénicos se administran en tal cantidad que sean profiláctica o terapéuticamente eficaces. La cantidad a administrar está generalmente en el intervalo entre un picogramo y 16 miligramos, preferiblemente entre 1 picogramo y 10 microgramos para administración mediada por partículas y entre 10 microgramos y 16 microgramos para otras vías de nucleótidos por dosis. La cantidad exacta puede variar considerablemente dependiendo del peso del paciente que se está inmunizando y la vía de administración.

Las técnicas adecuadas para introducir el polinucleótido o vector desnudo en un paciente también incluye la aplicación tópica con un vehículo apropiado. El ácido nucleico se puede administrar tópicamente a la piel, o a las superficies mucosas por ejemplo, mediante administración intranasal, oral, intravaginal o intrarrectal. El vector o polinucleótido desnudo puede estar presente junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS). La absorción de ADN se puede adicionalmente facilitar mediante el uso de agentes que lo facilitan tales como bupivacaína, bien separadamente o incluida en la formulación de ADN. Otros procedimientos para administrar el ácido nucleico a un receptor incluyen ultrasonidos, estimulación eléctrica, electroporación y microsiembra que se describe en el documento de Estados Unidos 5.697.901.

La absorción de las construcciones de ácido nucleico se puede potenciar mediante diversas técnicas de transfección conocidas, por ejemplo las que incluyen el uso de agentes de transfección. Los ejemplos de estos agentes incluyen agentes catiónicos, por ejemplo, fosfato cálcico y DEAE - dextrano y lipofectantes, por ejemplo lipofectam y trasfectam. Se puede alterar la dosificación del ácido nucleico a administrar.

Las proteínas de fusión y polipéptidos codificadores según la invención se pueden también formular en forma de una composición farmacéutica/inmunogénica, por ejemplo como una vacuna. Por lo tanto según el caso, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica/inmunogénica que comprende una proteína de fusión de la presente invención en un excipiente farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, también se proporciona un procedimiento para la preparación de una composición inmunogénica según la presente invención, que comprende la mezcla de la proteína de fusión de la invención o el polinucleótido de codificación con un adyuvante, diluyente u otro vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado.

Las proteínas de fusión de la presente invención se proporcionan al menos 80% puras más preferiblemente 90% puras según se visualiza mediante SDS PAGE. Preferiblemente las proteínas aparecen como una banda única mediante SDS PAGE.

En general la preparación de vacunas se describe en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds. Powell M.F. y Newman M.J). (1995) Plenum Press New York). La encapsulación con liposomas se describe en Fullerton, Patente de Estados Unidos 4.235.877.

Preferiblemente, a las proteínas de fusión de la presente invención y a los polipéptidos codificadores se les añaden adyuvantes en la formulación de vacuna de la invención. Ciertos adyuvantes están comercialmente disponibles como, por ejemplo, el adyuvante incompleto y el adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI); adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); las sales de aluminio tales como el gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio; las sales de calcio, hierro cinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos catiónica o aniónicamente derivatizados; polifosfacenos; microsferas biodegradables; monofosforil lípido A y quil A. También se pueden usar como adyuvantes las citoquinas tales como GM-CSF, interleuquina - 2, -7, -12, y otros factores de crecimiento similares.

Con ciertas realizaciones de la invención, la composición de adyuvantes es preferiblemente una que induce una respuesta inmune predominantemente del tipo Th 1. Altos niveles de citoquinas de tipo Th 1 (por ejemplo, IFN-\gamma, TNF\alpha, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células a un antígeno administrado. En contraste, altos niveles de citoquinas de tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales. Después de la aplicación de una vacuna como se proporciona en esta memoria descriptiva, un paciente soportará una respuesta inmune que incluye respuestas de tipo Th1- y de tipo Th2. En una realización preferida, en la que predominantemente la respuesta es del tipo Th1, el nivel de las citoquinas de tipo Th1 se incrementará hasta un grado mayor que el nivel de las citoquinas de tipo Th2. Los niveles de estas citoquinas se pueden valorar fácilmente usando ensayos estándar. Para una revisión de las familias de citoquinas véase Mosmann y Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145 - 173, 1989.

Los adyuvantes preferidos que inducen TH-1 se seleccionan del grupo de adyuvantes constituido por: 3D-MPL. QS21, una mezcla de QS21 y colesterol, y un oliginucleótido CpG o una mezcla de dos o más de dichos adyuvantes. Ciertos adyuvantes preferidos para inducir una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente lípido A monofosforilo 3-de-O-acilado, junto con una sal de aluminio. Los adyuvantes MPL® están disponibles de Corixa Corporation (Settle, WA; véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (en los que el dinucleótido CpG no está metilado) también inducen una respuesta predominantemente Th1. Se conocen bien dichos oligonucleótidos y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/02555, WO 99/33488 y en las patentes de Estados Unidos números 6.008.200 y 5.856.462. Las secuencias de ADN inmunoestimuladoras también las describen, por ejemplo, Sato y col., Science 273: 352, 1996. Otro adyuvante preferido comprende una saponina, tal como Quil A o derivados de la misma, que incluyen QS21 y QS 7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); Escina; Digitonina; o Gypsophila o Chenopodium quinoa saponins. Otras formulaciones preferidas incluyen más de una saponina en las combinaciones de adyuvantes de la presente invención, por ejemplo, las combinaciones de al menos dos del siguiente grupo que comprende QS21, QS7, Quil A, escina \beta, o digitonina.

Como alternativa las formulaciones de saponina se pueden combinar con vehículos de vacunas compuestos de quitosana u otros polímeros policatiónicos, partículas de polilactida y polilactida-co-glicolida, matriz polimérica a base de poli-N-acetil glucosamina, partículas compuestas de polisacáridos o polisacáridos químicamente modificados, liposomas y partículas a base de lípidos, partículas compuestas de monoésteres de glicerol, etc. Las saponinas también se pueden formular en presencia de colesterol para formar estructuras de partículas tales como liposomas o ISCOMs. Además, las saponinas se pueden formular junto con un éter o éster de polioxietileno, bien en una solución o suspensión no particulada, o en una estructura particulada tal como un liposoma oligolamelar o ISCOM. Las saponinas también se pueden formular con excipientes tales como Carbopol^{R} para incrementar la viscosidad, o se pueden formular en forma de polvo seco con un excipiente en polvo tas como la lactosa.

En una realización preferida, el sistema adyuvante incluye la combinación de un lípido A monofosforilo y un derivado de saponina, tal como la combinación de adyuvante QS21 y 3D-MPL®, como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición de menor reacción en la que QS21 se inactiva con colesterol, como se describe en WO 96/33739. Otras formulaciones preferidas comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Otra formulación de adyuvante particularmente preferida que emplea el QS21, adyuvante 3D-MPL® y tocoferol en una emulsión aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210.

Otro sistema adyuvante potenciado implica la combinación de un oligonucleótido que contiene CpG y un derivado de saponina particularmente la combinación de CpG y QS21 como se describe en el documento WO 00/09159 y en el documento WO 00/62800. Preferiblemente, la formulación adicionalmente comprende una emulsión de aceite en agua y tocoferol.

Todavía en otra realización adicional la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína de fusión según la invención, y que, además, comprende D3-MPL, una saponina preferiblemente QS21 y un oligonucleótido CpG, formulada opcionalmente en una emulsión aceite en agua.

Los adyuvantes ilustrativos adicionales para uso en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, France), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), la serie de adyuvantes SBAS (por ejemplo, SBAS-2 o SBAS-4, disponible de SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox (Enhanzyn®) (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) y otros 4-fosfatos de glucosaminida de alquilo (AGP), tales como los descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos pendiente números de serie 08/853,826 y 09/074,720 las descripciones de las cuales se incorporan en esta memoria descriptiva como referencia en su totalidad, y adyuvantes de éter de polioxietileno tales como los descritos en el documento WO 99/52549A1.

Otros adyuvantes preferidos incluyen moléculas adyuvantes de fórmula general (I):

HO(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-A-R,

en la que n es 1-50, A es un enlace o -C(O)-, R es alquilo(C_{1}-C_{50}) o fenilalquilo(C_{1}-C_{50}). Una realización de la presente invención consiste en una formulación de vacunas que comprende un éter de polioxietileno de fórmula general (I), en la que n está 1 y 50, preferiblemente entre 4 y 24, más preferiblemente 9; el componente R es C_{1}-C_{50} preferiblemente alquilo(C_{4}-C_{20}) y más preferiblemente alquiloC_{12}, y A es un enlace. La concentración de los éteres de polioxietileno debe estar en el intervalo 0,1 - 20%, preferiblemente entre 0,1 y 10% y más preferiblemente en el intervalo entre 0,1 y 1%. Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del grupo siguiente: 9-lauriléter de polioxietileno, 9-esteoriléter de polioxietileno, 8-esteoriléter de polioxietileno, 4-lauriléter de polioxietileno, 35-lauriléter de polioxietileno y 23-lauriléter de polioxietileno. Los éteres de poloxietileno tales como lauriléter de polioxietileno se describen en el índice Merck (edición 12: entrada 7717). Estas moléculas de adyuvantes se describen en el documento WO 99/52549. El éter de polioxietileno según la fórmula general (I) anterior puede, si se desea, combinarse con otro adyuvante. Por ejemplo, un a combinación preferida de adyuvantes es preferiblemente con CpG como se describe en la solicitud de patente de Reino Unido pendiente 9820956,2.

Una realización de la invención es que los antígenos, incluyendo el vector de ácido nucleico, de la invención se utilicen con un agente inmunoestimulador. Preferiblemente el agente inmunoestimulador se administra al mismo tiempo que los antígenos de la invención y en realizaciones preferidas se formulan juntos. Otra realización de la invención es que el antígeno y el agente inmunoestimulador (o viceversa) se administren de forma secuencial en el mismo o sitios adyacentes, separados en tiempo por períodos entre 0 y 100 horas. Dichos agentes inmunoestimuladores incluyen pero no se limitan a: imidazoquinolinas sintéticas tales como el imiquimod [S-26308, R-837], (Harrison, y col., Vaccine 19: 1820-1826, 2001; y el resiquimod [S-28463, R-848] (Vasilakos, y col., Cellular immunology 204: 64 - 74, 2000.; bases de Schiff de carbonilos y aminas que se expresan constitutivamente en el antígeno que presenta superficies de células y de células T, tales como tucaresol (Rhodes, J. y col., Nature 377: 71 - 75, 1995), citoquina, quemoquina y moléculas coestimuladoras bien como proteína o como péptido, que incluyen por ejemplo citoquinas proinflamatorias tales como interferón, GM-CSF, IL-1 alfa, IL-1 beta, TGF-alfa y TGF-beta, inductores de Th1 tales como el interferón gamma, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21, inductores de Th2 tales como IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 y otra quemoquina y genes coestimuladores tales como MCP-1, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, RANTES, TCA-3, CD80, CD86 y CD40L, otros ligandos de diana inmunoestimuladores tales como CTLA-4 y selectina L, proteínas y péptidos estimuladores de apoptosis tales como Fas, (49), adyuvantes a base de lípidos sintéticos tales como el vaxfectin, (Reyes y col., Vaccine 19: 3778 - 3786, 2001) esqualeno, tocoferol alfa, polisorbato 80, DOPC y colesterol, endotoxina, [LPS], (Beutler, B., Current Opinion in Microbiology 3: 23-30, 2000); CpG oligo- y di-nucleótidos (Sato, Y. y col., Science 273 (5273): 352 - 354, 1996; Hemmi, H. y col., Nature 408: 740 - 745, 2000) y otros ligandos potenciales que inducen a los receptores Toll para que produzcan citoquinas inductoras de la Th1, tales como lipoproteínas micobacterianas sintéticas, la proteína micobacteriana p19, peptidoglicano, ácido teicoico y un lípido A.

Otro adyuvante adecuado incluye CT (tóxina colérica, subunidades A y B) y LT (enterotoxina termolábil de E. coli, sbunidades A y B), la familia de proteínas de choque térmico (HPS) y LLO (listeriolisina O; documento WO 01/72329).

Cuando el agente inmunoestimulador es una proteína, el agente se puede administrar bien como una proteína o como un polinucleótido que codifica al proteína.

Otros sistemas de administración adecuados incluyen microesferas en las que el material antigénico se incorpora en o se conjuga con polímeros/microesferas biodegradables de forma que el material antigénico se puede mezclar con un vehículo farmacéutico adecuado y usarse como una vacuna. El término "microesferas" generalmente se emplea para describir partículas coloidales que son sustancialmente esféricas y tienen un diámetro en el intervalo entre 10 nm y 2 mm. Se ha encontrado que las microesferas hechas de un amplio rango de polímeros naturales y sintéticos tienen uso en una diversidad de aplicaciones médicas. Este sistema de administración es especialmente ventajoso para proteínas que tienen semividas cortas in vivo requiriendo múltiples tratamientos para proporcionar eficacia, o son inestables en fluidos biológicos o no se absorben totalmente en el tracto gastrointestinal debido a su s pesos moleculares relativamente altos. Se han descrito diversos polímeros como matriz para la liberación de proteínas. Los polímeros adecuados incluyen gelatina, colágeno, alginatos, dextrano. Los sistemas de administración preferidos incluyen poli(ácido láctico DL) (PLA), poli(lactida-co-glicolida) (PLG), poli(ácido glicólico) (PGA), poly(caprolactona \varepsilon) (PCL), y copolímeros poli(ácido láctico DL-co-glicólico) (PLGA). Otros sistemas preferidos incluyen hidrogeles heterogéneos tales como copolímeros multibloque poli (éter éster) que contienen bloques de repetición a base de poli(etilenglicol) hidrófilo (PEG) y poli(tereftalato de butileno) hidrófobo (PBT), o tereftalato de poli(etilenglicol)/poli(tereftalato de butileno) (PEGT/PBT) (Sohier y col., Eur. J. Pharm y Biopharm, 2003, 55, 221 - 228). Se prefieren los sistemas que proporcionan una liberación mantenida durante 1 a 3 meses tales como PLGA, PLA y PEGT/PBT.

Es posible para la composición inmunogénica o de vacunas que se administre de una vez o, preferiblemente, que se administre repetidamente tantas veces como sea necesario, por ejemplo, entre 1 y 7 veces, preferiblemente entre 1 y 4 veces, a intervalos entre aproximadamente 1 día y aproximadamente 18 meses, preferiblemente un mes. Opcionalmente a esto puede seguir una dosificación a intervalos regulares entre 1 y 12 meses durante un período hasta el resto de la vida del paciente. En una realización preferida, el paciente recibe el antígeno de diferentes maneras en un régimen de "cabado-refuerzo". Así por ejemplo, el antígeno, la proteína de fusión, se administra primero como una formulación a base de adyuvantes de proteínas y después se administran posteriormente en forma de una vacuna a base de ADN. Se prefiere este modo de administración. El adyuvante preferido es una combinación de un oligonucleótido que contiene CpG y un derivado de saponina, particularmente la combinación de CpG y QS21 como se describe en el documento WO 00/09159 y en el documento WO 00/62800. La absorción de ADN desnudo se puede potenciar mediante recubrimiento del ADN en perlas biodegradables, que son transportadas eficazmente en las células. Alternativamente el ADN se puede administrar mediante un método de bombardeo de partículas, por ejemplo, aceleración de partículas accionada por gas con dispositivos tales como los fabricados por Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, Reino Unido) y Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI) como se ha enseñado en esta memoria descriptiva. Este planteamiento ofrece un método de administración sin aguja en el que una formulación de polvo seco de partículas microscópicas, tales como partículas de polinucleótidos o de polipéptidos, se aceleran hasta una alta velocidad en un chorro de gas helio generado por un dispositivo manual, impulsando las partículas en el tejido diana de
interés.

En otra realización preferida la vacuna a base de ADN se administrará primero, seguido de la formulación a base de adyuvantes de proteínas. Todavía en otra realización los autores se preocupan de la administración de la construcción de ADN mediante vectores de administración especializados, preferiblemente mediante los medios del sistema viral, más preferiblemente mediante los medios de los sistemas a base de adenovirus. Otros sistemas a base de virus adecuados de administración de ADN incluyen sistemas a base de retrovirus, lentivirus, virus asociados a adeno, virus del herpes y de virus de vaccinia.

En otra realización preferida, la formulación a base de adyuvantes de proteínas y vacunas a base de ADN se puede coadministrar en sitios adyacentes o de superposición. Dependiendo de la formulación de la vacuna de ADN, esto se puede llevar a cabo mediante la mezcla del ADN y formulaciones adyuvantes de proteínas antes de la administración o mediante la administración simultánea del ADN y formulación de adyuvantes de proteínas.

El régimen de tratamiento variará significativamente dependiendo del tamaño y especie del paciente considerado, la cantidad de vacuna de ácidos nucleicos y/o composición de proteínas administrada, la vía de administración, la pureza y dosis de cualquier compuesto adyuvante usado y otros factores que serían aparentes para un experto profesional sanitario.

En aspectos adicionales, la presente invención proporciona procedimientos para estimular una respuesta inmune en un paciente, preferiblemente una respuesta de células T en un paciente humano, que comprende la administración de una composición farmacéutica descrita en esta memoria descriptiva. El paciente puede estar afligido con un cáncer de pulmón o colon o cáncer colorrectal o cáncer de mama, en cuyo caso los procedimientos proporcionan el tratamiento de la enfermedad o del paciente considerado con riesgo de dicha enfermedad para que se pueda tratar profiláctica-
mente.

En aspectos adicionales, la presente invención proporciona procedimientos para inhibir el desarrollo de un cáncer en un paciente, que comprende la administración a un paciente de una composición farmacéutica como se ha indicado anteriormente. El paciente puede estar afligido con, por ejemplo, sarcoma, cáncer de próstata, ovarios, vejiga, pulmón, colon, colorrectal o mama en cuyo caso los procedimientos proporcionan tratamiento de la enfermedad; o el paciente considerado con riesgo de dicha enfermedad, se pueda tratar profilácticamente.

La presente invención también proporciona adicionalmente, en otros aspectos, procedimientos para eliminar células tumorales de una muestra biológica, que comprende poner en contacto una muestra biológica con células T que reaccionan específicamente con un polipéptido de la presente invención, en la que la etapa de contacto se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la eliminación de las células que expresan la proteína de la muestra.

En aspectos relacionados, los procedimientos se proporcionan para inhibir el desarrollo de un cáncer en un paciente, que comprende la administración a un paciente de una muestra biológica tratada como se ha descrito anteriormente.

Los procedimientos se proporcionan además, en otros aspectos, para estimular y/o expandir células T específicas de un polipéptido de la presente invención que comprende poner en contacto las células T con uno o más de: (i) un polipéptido como se ha descrito anteriormente; (ii) un polinucleótido que codifica dicho polipéptido; y/o (iii) un antígeno que presenta células que expresan dicho polipéptido; en condiciones y durante un tiempo suficiente para que permita la estimulación y/o expansión de células T. También se proporcionan las poblaciones de células T aisladas que comprenden las células T preparadas como se ha descrito anteriormente.

En aspectos adicionales, la presente invención proporciona procedimientos para inhibir el desarrollo de un cáncer en un paciente que comprende la administración a un paciente de una cantidad eficaz de una población de células T como se ha descrito anteriormente. Además la presente invención proporciona procedimientos para inhibir el desarrollo de un cáncer en un paciente, que comprende las etapas de: (a) incubar células CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente con uno o más de: (i) un polipéptido descrito en esta memoria descriptiva; (ii) un polinucleótido que codifica dicho polipéptido; y (iii) una célula que presenta un antígeno que expresaba dicho polipéptido; y (b) administrar al paciente una cantidad eficaz de las células T multiplicadas y que, por lo tanto, inhiben el desarrollo de un cáncer en el paciente. Las células proliferadas se pueden, pero no necesariamente, clonar antes de la administración al
paciente.

De acuerdo con otra realización de esta invención, una composición inmunogénica descrita en esta memoria descriptiva se administra a un huésped mediante células (APCs) que presentan un antígeno, tales células dendríticas, macrófagos, células B, monocitos y otras células que se pueden modificar genéticamente para que sean eficaces APCs. Dichas células pueden, pero no es necesario, modificarse genéticamente para aumentar la capacidad de presentar el antígeno, con el fin de mejorar la activación y/o mantener la respuesta de las células T, para que tengan efectos antitumorales per se y/o que sean inmunológicamente compatibles con el receptor (es decir, igualado al halotipo HLA). En general las APCs se pueden aislar de cualquiera de una diversidad de fluidos y órganos biológicos, que incluyen tejidos tumorales y peritumorales y pueden ser células autólogas, alogénicas, singénicas o xenogénicas.

Ciertas realizaciones preferidas de la presente invención usan células dendríticas o progenitores de las mismas como células presentadoras de antígenos. Las células dendríticas son altamente potentes APCs (Banchereau y Steinman, Nature 392: 245 - 251, 1998) y han mostrado que son eficaces como un adyuvante fisiológico para inducir inmunidad profiláctica o terapeútica antitumoral (véase Timmerman y Levy, Ann. Rev. Med. 50: 507 - 529, 1999). En general, las células dendríticas se pueden identificar en función de su forma típica (estrellada in situ, con procesos (dendritas) citoplásmicos marcados visibles in vitro), su capacidad para recoger, procesar y presentar antígenos con alta eficacia y su capacidad para activar las respuestas de células T inexpertas. Por supuesto, las células dendríticas se pueden modificar genéticamente para expresar los receptores superficiales de las células específicas o ligandos que no se encuentran comúnmente sobre las células dendríticas in vivo o ex vivo, y dichas células dendríticas modificadas se contemplan en la presente invención. Como alternativa a las células dendríticas, se pueden usar en una vacuna las células dendríticas de vesículas de secreción cargadas de antígenos (llamadas exosomas) (véase Zitvogel y col., Nature Med. 4: 594 - 600, 1998).

Las células dendríticas y progenitoras se pueden obtener de sangra periférica, tuétano de huesos, células infiltradas en tumores, células infiltradas en tejidos peritumorales, ganglios linfáticos, columna vertebral, piel, sangre del cordón umbilical o cualquier tejido o fluido adecuado. Por ejemplo, las células dendríticas se pueden diferenciar ex vivo añadiendo una combinación de citoquinas tales como GM-CSF, IL-4, IL-13 y/o THF \alpha a cultivos de monocitos recogidos de sangre periférica. Alternativamente, las células CD34 positivas recogidas de sangre periférica, sangre de cordón umbilical o tuétano de hueso se pueden diferenciar en células dendríticas mediante la adición a un medio de cultivo combinaciones de GM-CSF, IL-3, THF \alpha, ligando CD40, LPS, ligando flt3 y/u otro (s) compuesto (s) que inducen diferenciación, maduración y proliferación de células dendríticas.

Las células dendríticas se catalogan convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", que permite una forma sencilla de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, esta nomenclatura no se debe construir para excluir todas las etapas intermedias posibles de diferenciación. Las células dendríticas inmaduras se caracterizan como APC con una alta capacidad para la absorción y procesamiento de antígenos y, que se correlaciona con la alta expresión del receptor Fc\gamma y receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una expresión menor de estos marcadores, pero una alta expresión de moléculas superficiales celulares responsable de la activación de células T tales como MHC de clase I y clase II, moléculas de adhesión (por ejemplo CD54 y CD11) y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1BB).

En general las APC se pueden transfectar con un polinucleótido de la invención (o porción u otras variantes del mismo) de manera que el polipéptido codificado, o una porción inmunogénica del mismo se exprese en la superficie celular. Dicha transfección puede tener lugar ex vivo, y después se puede usar una composición farmacéutica que comprende dichas células transfectadas para propósitos terapéuticos como se describe en esta memoria descriptiva. Alternativamente, un vehículo de administración génica que dirige una célula dendrítica o que presenta otro antígeno se puede administrar a un paciente, dando como resultado la transfección que se produce in vivo. Por ejemplo, la transfección in vivo y ex vivo de células dendríticas generalmente se puede realizar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, tales como los descritos en el documento WO 97/14447 o el método de la pistola génica descrito por Mahvi y col., Immunology and cell Biology 75: 456 - 460, 1997. La carga de antígeno en las células dendríticas se puede llevar a cabo incubando las células dendríticas o células progenitoras con el polipéptido del tumor, ADN (desnudo o dentro de un vector de plásmido) o ARN; o con bacteria o virus recombinantes que expresan el antígeno (por ejemplo, vectores de vaccinia, virus de pollo, adenovirus o lentivirus). Antes de la carga, se puede conjugar covalentemente el polipéptido a una pareja inmunológica que proporciona un auxiliar de células T (por ejemplo una molécula de vehículo). Alternativamente, una célula dendrítica se puede someter a pulsos con una pareja inmunológica no conjugada, separadamente o en presencia del polipéptido.

Definiciones

La invención también proporciona procedimientos para el análisis de secuencias de caracteres o cadenas, particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteínas codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencias incluyen, por ejemplo, los procedimientos de análisis de homología de secuencias, tal como el análisis de identidad y similitud, análisis de estructura de ADN, ARN y proteínas, conjunto de secuencias, análisis cladísticos, análisis de motivos de secuencias, determinación del cuadro de lectura abierta, llamada de bases de ácidos nucleicos, análisis de uso de codones, afinamiento de bases de ácidos nucleicos, y secuenciación de análisis de los picos del cromatograma.

Se proporciona un procedimiento computarizado para realizar la identificación de homología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar un primera secuencia de poli nucleótidos que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio legible en ordenador; y comparar dicha primera secuencia polinucleotídica con al menos una secuencia polinucleotídica o polipéptido para identificar la homología. También se proporciona un procedimiento computarizado para realizar la identificación de la homología, dicho procedimiento comprendiendo las etapas de: proporcionar una primera secuencia polipeptídica que comprende la secuencia de un polipéptido de la invención en un medio legible de ordenador; y comparar dicha primera secuencia polipeptídica con al menos una secuencia polinucleotídica o polipeptídica para identificar la homología.

"Identidad" como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, como puede ser el caso, según se determina comparando las secuencias. En la técnica "identidad" también significa el grado de la relación de secuencias entre las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, como puede ser el caso, según se determina por la coincidencia entre cadenas de dichas secuencias. La "Identidad" se puede calcular fácilmente mediante procedimientos conocidos, incluyendo pero no limitándose a los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos para determinar la identidad se diseñan para conseguir la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Además, los procedimientos para determinar la identidad se codifican en programas de ordenador disponibles públicamente. Los procedimientos de programas de ordenador para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan al programa GAP en el paquete de programas GCG (Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. y col., J. Molec. Biol. 215: 403 - 410 (1990), y FASTA (Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444 - 2448 (1988). La familia de programas BLAST está públicamente disponible de NCIB y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y col., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.,y col., J. Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990). También se puede utilizar para determinar la identidad el algoritmo de Smith Waterman bien conocido.

Los parámetros para la comparación de secuencias de polipéptidos incluyen los siguientes:

: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

: Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff,

: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)

: Penalización del hueco: 8

: Penalización de longitud del hueco: 2

Un programa útil con estos parámetros está públicamente disponible como el programa "hueco" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros anteriormente mencionados son los parámetros de omisión de comparaciones de péptidos (junto con ninguna penalización para los huecos del extremo)

Los parámetros para la comparación de polipéptidos incluyen lo siguiente:

: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

: Matriz de comparación: coincidencias = + 10, no coincidencias = 0

: Penalización del hueco: 50

: Penalización de longitud del hueco: 3

Disponible como: el programa "hueco" de Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parámetros de omisión de las comparaciones de ácidos nucleicos.

Un significado preferente de "identidad" de polinucleótidos y polipéptidos, como puede ser el caso, se proporcionan en (1) y (2) a continuación.

(1) Además las realizaciones de polinucleótidos incluyen un polinucleótido que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene al menos 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% de identidad con cualquiera de las secuencias de referencia de SEC ID Nº 9 a SEC ID Nº 16, en las que dicha secuencia polinucleotídica puede ser idéntica a cualquiera de las secuencias de referencia de SEC ID Nº 9 a SEC ID Nº 16 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparada con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una supresión, sustitución de nucleótidos, que incluye la transición y transversión, o inserción, y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones terminales 5' ó 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, interespaciadas bien individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos con la secuencia de referencia y en la que dicho número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en cualquiera de las secuencias de SEC ID Nº 9 a SEC ID Nº 16 por un número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en cualquiera de las SEC ID Nº 9 a SEC ID Nº 16, ó:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de nucleótidos en cualquiera de las SEC ID Nº 9 a SEC ID Nº 16, y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97% ó 1,00 para 100%, y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo al número más próximo entero antes de restarlo de x_{n}. Las alteraciones de las secuencias de polinucleótidos que codifican los polipéptidos de cualquiera de SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 8 puede crear mutaciones sin sentido, de sentido erróneo o de desplazamiento de fase en esta secuencia de codificación y por lo tanto altera el polipéptido codificado por polinucleótido que sigue a dichas altera-
ciones.

Como ejemplo, una secuencia polinucleotídica de la presente invención puede ser idéntica a cualquiera de las secuencias de referencia de SEC ID Nº 9 a SEC ID Nº 16 que puede ser 100% idéntico, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de ácidos nucleicos comparada con la secuencia de referencia de manera que el porcentaje de identidad es inferior al 100% de identidad. Dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una supresión, sustitución de ácidos nucleicos, que incluye transición y transversión, o inserción y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones terminales 5' ó 3' de la secuencia polinucleotídica de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, interespaciadas bien individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos con la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácidos nucleicos para un porcentaje de identidad establecido se determina multiplicando el número total de ácidos nucleicos en cualquiera de las secuencias de SEC ID Nº 9 a SEC ID Nº 16 por un número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en cualquiera de las SEC ID Nº 9 a SEC ID Nº 16, ó:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

en la que n_{n} es el número de alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos en cualquiera de las SEC ID Nº 9 a SEC ID Nº 16, y es por ejemplo 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, etc., \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{n} e y se redondea hacia abajo al número más próximo entero antes de restarlo de x_{n}.

(2) Además las realizaciones de polipéptidos incluyen un polipéptido aislado que comprende una polipéptido que tiene al menos 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 ó 100% de identidad con la secuencia de referencia de polipéptidos de cualquiera de SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 8, en las que dicha secuencia polipeptídica puede ser idéntica a cualquiera de las secuencias de referencia de SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 8 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos comparada con la secuencia de referencia, en la que dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una supresión, sustitución de aminoácidos, que incluye una sustitución conservadora y no conservadora, o inserción y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, interespaciadas bien individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos con la secuencia de referencia y en la que dicho número de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos en cualquiera de las secuencias de SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 8 por un número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de aminoácidos en cualquiera de las SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 8, ó:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en cualquiera de las SEC ID Nº 2, y es 0,50 para 50%, 0,60 para 60%, 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, 0,90 para 90%, 0,95 para 95%, 0,97 para 97% ó 1,00 para 100%, y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo al número más próximo entero antes de restarlo de x_{a}.

Como ejemplo, una secuencia polipeptídica de la presente invención puede ser idéntica a cualquiera de las secuencias de referencia de SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 8 que puede ser 100% idéntico, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos comparada con la secuencia de referencia de manera que el porcentaje de identidad es inferior al 100% de identidad. Dichas alteraciones se seleccionan del grupo constituido por al menos una menos una supresión, sustitución de aminoácidos, que incluye una sustitución conservadora y no conservadora, o inserción y en la que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, interespaciadas bien individualmente entre los aminoácidos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos con la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un porcentaje de identidad establecido se determina multiplicando el número total de aminoácidos en cualquiera de las secuencias de SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 8 por un número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de ácidos nucleicos en cualquiera de las SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 8, ó:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

en la que n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos en cualquiera de las SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 8, y es por ejemplo 0,70 para 70%, 0,80 para 80%, 0,85 para 85%, etc., \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto no entero de x_{a} e y se redondea hacia abajo al número más próximo entero antes de restarlo de x_{a}.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Información de la secuencia de C-LytA. Cada repetición se ha definido en base a tanto la alineación de las secuencias múltiples como a la predicción de las secuencias secundarias usando los siguientes programas de alineación: 1) MatchBox (Depiereux E y col., (1992) Comput Applic Biosci 8:501-9); 2) ClustalW (Thompson JD y col., (1994) Nucl Acid Res 22: 4673 - 80); 3) Block-Maker (Henikoff S et al (1995) Gene 163:gc17 - 26)

Figura 2: CPC y construcciones nativas (SEC ID Nº 27 - 36)

Figura 3: Estructura esquemática de la proteína de fusión CPC-p501 His expresada en S. cerevisiae

Figura 4: Estructura primaria de la proteína de fusión CPC-P501 His (SEC ID Nº 41)

Figura 5: Secuencia de nucleotidos de CPC P501 His (pRIT15201) (SEC ID Nº 42)

Figura 6: Estrategia de clonación para la generación del plásmido pRIT 15201

Figura 7: Mapa del plásmido de pRIT15201

Figura 8. Expresión comparativa de CPC P501 y P501 en S. cerevisiae cepa DC5

Figura 9: Producción de CPC-P501S HIS (Y1796) a pequeña escala. La Fig. 9A representa al productividad de antígenos estimada por SDS-PAGE con tinción con plata; La Fig. 9B representa la productividad de antígenos estimada por las transferencias de Western.

Figura 10: Esquema de purificación de CPC-P501-His producida por Y1796.

Figura 11: Patrón de la proteína purificada CPC P501 His (geles de poliacrilamida premoldeados 4-12% de Novex Nu-Page).

Figura 12: Secuencia P501S de longitud completa nativa (SEC ID Nº 17)

Figura 13: Secuencia del módulo de expresión CPC-P501S de JNW735 (SEC ID Nº 18)

Figura 14: Dos secuencias P501S de codón optimizado(SEC ID Nº 19 - 20)

Figura 15: Secuencia de codón optimizado remodificadas genéticamente 19 (SEC ID Nº 21)

Figura 16: Secuencia de codón optimizado remodificadas genéticamente 20 (SEC ID Nº 22)

Figura 17: La secuencia de partida para la optimización de CPC (SEC ID Nº 23)

Figura 18: Secuencias CPC de codón optimizadorepresentativas (SEC ID Nº 24 - 25)

Figura 19: Secuencia de codón optimizado CPC modificado genéticamente (SEC ID Nº 26)

Figura 20: Secuencias y construcciones candidatas de fusión P501S CPC (SEC ID Nº 37 - 40 y 45 - 48)

Figura 21: Análisis de transferencias de Western de células CHO seguido de transición transitoria con P501S (JNW680), CPC-P501S (JNW735) y control de vector vacío.

Figura 22: Respuestas de anticuerpos de Anti-P501S seguido de inmunización los días 0, 21 y 42 con pVAC-P501S (JNW680, ratones B1-9) o vector vacío (pVAC, ratones A1-6). Se hizo un presangrado en el día -1. Posteriormente se hicieron sangrados en los días 28 y 49 (ratones A1-3, B1-3) y día 56 (ratones A4-6, B4-9). Todos los sueros se ensayaron a dilución 1/100. Se promediaron los resultados de los ratones inmunizados con pVAC-P501S. Se muestran los resultados promediados de los ratones inmunizados con pVAC-P501S. Como control positivo, se incluyen sueros de ratones inmunizados con adeno - P501S (Corixa, Corp, diluidos 1/100).

Figura 23: Análisis de biblioteca de péptidos que usan ratones C57BL/6 inmunizados los días 0, 21, 42, y 70 con pVAC-P501S (JNW680). Todos los péptidos se usaron a una concentración final de 50 \mug/ml. Los péptidos 1 - 50 que solapan 15 -20 meros obtenidos de Corixa. Los péptidos 51 - 70 son epítopes 8 - 9 meros Kb y Db previstos y se pidieron a Mimotopos (Reino Unido). Las muestras 71 - 72 y 73 - 78 son controles DMSO y controles sin péptidos respectivamente. El gráfico A muestra las respuestas de IFN-\gamma mientras que el gráfico B muestras las respuestas de IL-2. Los péptidos seleccionados para uso en inmunoensayos posteriores se muestran en negro.

Figura 24: Respuestas celulares mediante ELISPOT el día 77 seguido de inmunización con PMID los días 0, 21, 42, y 70 con pVAC-P501S (JNW680, B6-9) y pVAC vacío (A4-6). Los péptidos 18, 22 y 48 se usaron a 50 \mug/ml. La proteína CPC-P501S se usó a 20 \mug/ml. El gráfico A muestra las respuestas de IFN-\gamma mientras que el gráfico B muestra las respuestas de IL-2.

Figure 25: Comparación de P501S y CPC-P501S. Las respuestas celulares se midieron mediante IL-2 ELISPOT usando el péptido 22 (10 \mug/ml) el día 28. Los ratones se inmunizaron con PMID el día 0 y 21 con pVAC vacío (control), pVAC-P501S (JNW680) y CPC-P501S (JNW735).

Figura 26: Respuesta inmune (linfoproliferación en células de bazo) seguido de inmunización de proteínas con CPC-P501S.

Figura 27: Evaluación de la respuesta inmune a diferentes construcciones CPC-P501S. Las respuestas celulares se midieron mediante IL-2 ELISPOT el día 28. Los ratones se inmunizaron mediante PMID el día 0 y 21 con p 7313-ie vacío (control), JNW735 y construcciones de CPC-P501S (JNW770, 771 y 773)

Figura 28: Secuencias MUC-1 CPC (SEC ID Nº 49 y 50)

Figura 29: Secuencias ss-CPC-MUC-1 (SEC ID Nº 51 y 52)

Adicionalmente la invención se describirá por referencia a los siguientes ejemplos:

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Ejemplo I

Preparación de la cepa de levadura recombinante Y1796 que expresa la proteína de fusión P501 que contiene un C-LytA-P2-C-LytA (CPC) como pareja de fusión 1.- Diseño de proteínas

La estructura de la proteína de fusión C-P2-C-p501 (alternativamente denominado CPC-P501) que se va a expresar en S. cerevisiae se muestra en la figura 3. Esta fusión contiene la región extremo C del gen LytA (restos 187 - 306) en la que se ha insertado el fragmento P2 de la toxina de tétanos (restos 830 - 843). El fragmento P2 se sitúa entre los restos 277 y 278 de C-Lyt-A-. Al fragmento C-lytA que contiene la inserción P2 le sigue P501 (restos de aminoácidos 51 a 553) y la cola His.

La estructura primaria de la proteína de fusión resultante tiene la secuencia descrita en la figura 4 y la secuencia de codificación que corresponde al diseño de proteínas anterior se muestra en la figura 5.

2.- Estrategia de clonación para la generación de un plásmido de levaduras que expresa la proteína de fusión CPC-P501 (51-553)-His

\bullet El material de partida es el vector de levaduras pRIT15068 (solicitud de patente de Reino Unido 0015619,0).

\bullet Este vector contiene el promotor de levaduras Cup1, la secuencia de codificación de la señal prepro alfa de levaduras y la secuencia de codificación correspondiente a los restos 55 - 553 de P501S seguido de la cola His.

\bullet La estrategia de clonación indicada en la figura 6 incluye las siguientes etapas:

(a): La primera etapa es la inserción de la secuencia P2 (optimización de codones para expresión de levaduras) en cuadro, dentro de la secuencia de codificación C-lytA. La secuencia de codificación C-lytA. La secuencia de codificación C-lytA se encubre por el plásmido pRIT 14662 (PCT/EP99/00660). La inserción se hace usando un adaptador formado por dos oligonucleótidos complementarios llamados P21 y P22 en el plásmido pRIT 14662 previamente abierto por NcoI

: La secuencia de P21 y P22 es:

	P21	5' catgcaatacatcaaggctaactctaagttcattggtatcactgaaggcgt 3'
	P22	3' gttatgtagttccgattgagattcaagtaaccatagtgacttccgcagtac 5'

Después de la unión y transformación de E. coli y caracterización del transformante, se obtiene el plásmido llamado pRIT15199.

b): La segunda etapa es la preparación del fragmento de ADN C-lytA-P2-C-lytA mediante ampliación por la PCR. La amplificación se realiza usando pRIT15199 como molde y los oligopnucleótidos llamados C-LytANOTATG y C-LytA-aa55. Siendo la secuencia de ambos nucleótidos:

	C-LytANOTATG	= 5'aaaaccatggcggccgcttacgtacattccgacggctcttatccaaaagacaag 3'
	C-LytA-aa55	=5'aaacatgtacatgaacttttctggcctgtctgccagtgttc 3'

El fragmento amplificado se trata con las enzimas de restricción NcoI y AflIII para generar los extremos de cohesión respectivos.

c): La siguiente etapa es la unión del fragmento anterior con el vector pRIT15068 (fragmento más largo obtenido después del tratamiento de NcoI) para generar la secuencia que codifica la proteína de fusión completa. Después de la unión y transformación de E. coli se obtiene el plásmido llamado pRIT15200. En este plásmido el único sitio restante NcoI contiene el ATG que codifica el codón de partida.

d): En la siguiente etapa un fragmento NcoI que contiene el promotor CUP1 y una porción de secuencias de plásmidos de 2 \mu se prepara a partir del plásmido PRIT15202. El plásmido PRIT15202 es un derivado de levaduras de 2 \mu que contiene el promotor CUP1 con un sitio NcoI en ATG (secuencia ATG: AAACC ATG)

e): El fragmento NcoI aislado a partir de pRIT 15202 se liga a pRIT15200, previamente abierto con NcoI, en la orientación derecha, de tal manera el promotor pCUP1 está en el lado 5' de la secuencia de codificación. Esto da como resultado la generación de un plásmido de expresión final llamado pRIT15201 (véase la figura 7).

3.- Preparación de la cepa de levadura recombinante Y1796 (RIX4440)

Se usa el plásmido pRIT 15201 para transformar la cepa DC5 (ATCC 20220) de S, cerevisiase. Después de la selección y caracterización de los transformantes de levadura que contienen el plásmido pRIT 15201 se obtiene una cepa de levadura recombinante llamada Y1796 que expresa la proteína de fusión CPC-P501-His. Después de la reducción y carboxilación, la proteína se aísla y purifica mediante cromatografía de afinidad (IMAC) seguida de una cromatografía de intercambio aniónico (Q Sefarosa FF).

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Ejemplo II

De manera análoga, pueden expresarse construcciones de proteínas como las representadas en la figura 2 utilizando las correspondientes secuencias de ADN mostradas en dicha figura. En particular, la cepa de levadura SC333 (construcción 2) corresponde a la cepa Y1796 pero que expresa P501_{55-553} desprovista de la pareja de fusión de CPC. La cepa de levadura Y1800 (construcción 2) corresponde a la cepa Y1796 pero adicionalmente comprende la secuencia de señal nativa para P501S (aa1-aa34), mientras la cepa de levadura Y1802 (construcción 4) comprende la secuencia de señal alfa pre hacia arriba de la secuencia CPC-P501S. La cepa de levadura Y1790 (construcción 5) expresa una construcción P501S desprovista de CPC y que tiene la secuencia de señal alfa prepro.

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Ejemplo III

Preparación de CPC-P501 purificada 1.- Producción a pequeña escala de CPC-P501S HIS (Y1796)

Para Y1796, en medio mínimo suplementado con histidina, la expresión se induce en fase logarítmica mediante la adición de CuSO4 que varía entre 100 y 500 \muM y el cultivo se mantiene a 30ºC. Se recogen las células después de 8 ó 24 horas de inducción. Se añade cobre justo antes de su uso y no se mezcla con el medio por adelantado.

Para el análisis de SDS PAGE, se realiza la extracción de las células de levaduras en tampón fosfato citrato pH 4,0 + NaCl 130 mM. Se realiza la extracción con perlas de vidrio para una pequeña cantidad de células y con prensa francesa para una cantidad mayor de células y después se mezcla con tampón de muestra y se analiza por SDS-PAGE. Los resultados del análisis comparativo sobre SDS PAGE de las diferentes construcciones se muestran en la figura 8 y se resumen en la tabla 2 más adelante. Como se muestra en la tabla 1 más adelante, el nivel de expresión del cultivo es mucho mayor para la cepa Y1796 comparada con el nivel de expresión de la cepa parental SC333, una cepa que expresa la correspondiente P501S-His desprovista de la pareja CPC. Del mismo modo, la presencia de una secuencia señal (alfa pre) no afecta a los resultados descritos anteriormente: el nivel de expresión del cultivo es mucho mayor para la cepa Y1802 comparado con el nivel de expresión de la cepa Y1790 correspondiente, una cepa que expresa la correspondiente P501S-His desprovista de pareja CPC.

TABLA 2

5

CPC = clyta P2 clyta

ND = no detectable, incluso en las transferencias de Western

+ = detectable en las transferencias de Western

+++/++++ = detectable en las transferencias de Western y visible en geles teñidos con plata.

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2.- Fermentación a mayor escala de Y1796 (RIX4440)

Se extienden 100 \mul de siembra de trabajo en un medio sólido y se hacen crecer durante aproximadamente 24 horas a 30ºC. Después este cultivo previo se usa para inocular un cultivo previo en matraces vibratorios.

Este cultivo previo líquido se hace crecer durante 20 horas a 30ºC y se transfiere a un fermentador de 20 l. La fermentación en cultivo discontinuo incluye una fase de crecimiento de aproximadamente 44 horas y una fase de inducción de aproximadamente 22 horas.

La fuente de carbono (glucosa) se proporcionó al cultivo mediante una alimentación continua. Se mantuvo la concentración de glucosa residual muy baja (\leq 50 mg/l) con el fin de minimar la producción de etanol por fermentación. Esto se realizó limitando el desarrollo del microorganismo limitando la velocidad de alimentación de glucosa. Al final de la fase de crecimiento, el promotor CUP1 se induce mediante la adición de CuSO4 con el fin de producir el antígeno.

La ausencia de contaminaciones se comprobó inoculando 10^{6} células en TSB estándar y los viales de THI suplementados con nistatina se incubaron respectivamente durante 14 días a 20 - 25ºC y a 30 - 35ºC. Como se esperaba no se detectó ningún crecimiento.

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3.- Caracterización de antígenos y productividad

Se prepararon homogeneizados de células mediante prensado francés de las muestras de fermentación recogidas a tiempos diferentes durante la fase de inducción y se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencias de Western. Se mostró que la mayor parte de la proteína de interés se localizaba en la fracción insoluble obtenida del homogeneizado de células después de la centrifugación. Los análisis de SDS-PAGE y transferencias de Western mostrados en las figuras más adelante se realizaron en los sedimentos obtenidos después de la centrifugación de estos homogeneizados de células.

Las figuras 8 A y B muestran una cinética de la producción de antígenos durante la fase de inducción para el cultivo PRO127. Parece que no se produce ninguna expresión de antígenos durante la fase de crecimiento. La productividad del antígeno específico parece incrementarse a partir del comienzo de la fase de inducción hasta alcanzar las 6 horas y después permanece completamente estable hasta el final. Pero la productividad volumétrica aumentó por un factor entre 1,5 y 2 debido a la acumulación de biomasa observada durante al mismo período de tiempo. La productividad del antígeno se estimó en aproximadamente 500 mg por litro de caldo de fermentación comparando la referencia purificada del antígeno y los extractos brutos en análisis SDS-PAGE con tinción con plata (figura 9) y transferencias de Western usando un anticuerpo anti-P501S (un ascites murino dirigido contra P501S aa439-aa459 usado a una dilución de 1/1000) (figura 9 B).

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Ejemplo IV

Purificación de la proteína de fusión CPC-P501 (51-553)-His producida por Y1796

Después de la ruptura celular, la proteína se asocia con la fracción sedimentada. Se ha introducido en el procedimiento una carbaimidometilación de la molécula con el fin de hacer frente a la agregación oxidante de la molécula consigo misma o con los contaminantes de la proteína de la célula huésped mediante un puente covalente con enlaces disulfuro. También se ha requerido el uso de detergentes para manejar el carácter hidrófobo de esta proteína (12 dominios transmembrana pronosticados).

El protocolo de purificación, desarrollado para la escala de 1 l de cultivo de 120 de DO (densidad óptica) se describe en la figura 10. Todas las operaciones se realizan a temperatura ambiente (TA). De acuerdo con el ensayo de proteínas DOC TCA BCA, el rendimiento de purificación global es 30 - 70 mg de antígeno purificado/l de cultivo de 120 de DO. El rendimiento está unido al nivel de expresión del cultivo y es mayor comparado con el rendimiento de purificación de la cepa parental que expresa la P501 S-His no fusionada. El ensayo de proteínas se realizó como sigue: primero las proteínas se precipitan usando TCA (ácido tricloroacético) en presencia de DOC (desoxicolato) después se disuelve en medio alcalino en presencia de SDS. Después la proteína se hace reaccionar con BCA (ácido bicinconínico) (Pierce) para formar un complejo púrpura soluble que presenta una alta absorbancia a 562 nm, que es proporcional a la cantidad de proteínas presentes en la muestra. El análisis SDS-PAGE de tres masas purificadas (figura 11) no muestra diferencia en condiciones reductoras y no reductoras (franjas cf. 2,3 y 4 frente a las franjas 5, 6 y 7). El patrón consta de una banda mayor a 70 kDa, una mancha de mayor peso molecular y bandas de degradación tenues. Todas las bandas se detectan mediante un anticuerpo monoclonal específico anti P501S.

Ejemplo V

Preparación de vacunas usando la proteína CPC-P501S His

La proteína del ejemplo 3 ó 4 se puede formular en una vacuna que contiene QS21 y 3D-MPL en una emulsión aceite en agua.

1.- Preparación de vacunas

El antígeno producido como se muestra en los ejemplos 1 a 3 es una C-LytA-P2-P501S His. Como adyuvante, la formulación comprende una mezcla monofosforil lípido A 3 des-O-acilado (3D-MPL) y QS21 en una emulsión aceite/agua. El sistema adyuvante SBAS2 se describió previamente en el documento WO 95/17210.

3D-MPL: es un inmunoestimulante derivado del lipopolisacárido (LPS) de la bacteria Gram negativa Salmonella minnesota. El MPL se ha desacilado y está carente de u grupo fosfato en el resto del lípido A. Este tratamiento químico reduce drásticamente la toxicidad mientras conserva las propiedades inmunoestimulantes (Ribi, 1986). Ribi Immunochemistry produce y suministra MPL a SB-Biologicals.

Los experimentos realizados en SmithKline Beecham Biologicals han mostrado que 3D-MPL combinado con diverso vehículos potencia fuertemente la inmunidad tanto humoral como un tipo TH1 de inmunidad celular.

QS21: es una molécula de saponina natural extraída de la corteza del árbol sudamericano Quillaja saponaria Molina. Una técnica de purificación desarrollada para separar las saponinas individuales de los extractos brutos de la corteza permitió el aislamiento de la saponina particular QS21, que es un glicósido triterpeno que demuestra una mayor actividad adyuvante y una menor toxicidad comparada con el componente parental. La QS21 ha mostrado que activa las CTL restringidas de clase I MHC a diversas subunidades Ags, así como estimula la proliferación linfocítica específica de Ag (Kensil, 1992). Aquila (formalmente Cambridge Biotech Corporation) produce y suministra QS21 a SB-Biologicals. Los experimentos realizados en SmithKline Beecham Biologicals han demostrado un claro efecto sinérgico de combinaciones de MPL y QS21 en la inducción de respuestas inmunes celulares tanto humorales como del tipo TH1.

La emulsión aceite en agua se compone de una fase orgánica hecha de 2 aceites (tocoferol y escualeno) y una fase acuosa de PBS que contiene Tween 80 como emulsionante. La emulsión comprendía escualeno al 5% tocoferol al 5% Tween 80 al 0,4% y tenía un tamaño medio de partícula de 180 nm y se conoce como SB62 (véase el documento WO 95/17210).

Los experimentos realizados en SmithKline Beecham Biologicals han probado que la adición de esta emulsión de aceite/agua a 3D-MPL/QS21 (SBAS2) incrementa además las propiedades inmunoestimulantes de la última frente a diversos subunidades antigénicas.

2.- Preparación de la emulsión SB62 (concentrado 2 veces)

Se disolvió Tween 80 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para proporcionar una solución al 2% en PBS. Para proporcionar 100 ml de emulsión concentrada dos veces, se agitaron hasta crear vórtice 5 g de de alfatocoferol DL y 5 ml de escualeno hasta mezclar completamente. 90 ml de solución de PBS/Tween se añade y se mezcla completamente. Después la emulsión resultante se pasa a través de una jeringa y finalmente se microfluififica usando una máquina de microfluidificación M110S. Las gotitas de aceite resultantes tienen un tamaño de aproximadamente 180 nm.

3.- Formulaciones

Una formulación típica que contiene 3D-MPL y QS21 en una emulsión agua aceite se prepara como sigue: se diluyen 20 \mug - 25 \mug de C-LytA P2-P501S en PBS 10 veces concentrada pH 6,8 y H_{2}O antes de la adición consecutiva de SB62 (50 \mul), MPL (20 \mug), QS21 (20 \mug), que opcionalmente comprende el oligonucleótido CpG (100 \mug) y 1 \mug/ml de tiomersal como conservante. La cantidad de cada componente puede variar según sea necesario. Todas las incubaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente con agitación.

Ejemplo VI

Secuencias de codón optimizadoP501S 1.- Generación de los plásmidos recombinantes de control

La secuencia de longitud completa P501S se clonó en pVAC (Thomsen, Immunology, 1998; 95: 51OP105), generando el plásmido de expresión JNW680. La SEC ID Nº 17 representa el módulo de expresión P501S en el plásmido JNW680 y se ilustra en la figura 12. La secuencia de proteínas de SEC ID Nº 17 se muestra en un formato de letras únicas, los codones de inicio y de parada se muestran en negrita. La secuencia Kozak se designa por los símbolos de almohadilla. El índice de uso del codón de la secuencia humana P501S (SEC ID Nº 17) es 0,618 según se calculó con el programa SynGene.

Progama SynGene

Básicamente, los codones se asignan usando un procedimiento estadístico para proporcionar el gen sintético que tiene una frecuencia de codones próxima a la encontrada naturalmente en E. coli altamente expresados y genes humanos.

El SynGene es una versión actualizada del programa en Visual Basic llamado Calcgene, escrito por R. S. Hale y G Thompson (Protein Expression and Purification Vol. 12 p,185 -188 (1998). Para cada resto de aminoácido en la secuencia original, se asignó un codón en función de la probabilidad de que aparezca en genes altamente expresados de E. coli. Los detalles del programa Calcgene, que funciona en Microsft Windows 3,1, se pueden obtener de los autores. Como el programa aplica un procedimiento estadístico para asignar codones al gen sintético, no todos los codones resultantes son los más frecuentemente usados en el organismo diana. Más bien, la proporción de codones frecuente e infrecuentemente usados del organismo diana se refleja en lasecuencia sintética mediante la asignación de codones en las proporciones correctas. Sin embargo, cada vez que se ejecuta el programa producirá un gen sintético diferente aunque cada uno tendrá el mismo patrón de uso de codón y cada uno codificará la misma secuencia de aminoácidos. Si el programa se ejecuta varias veces para una secuencia de aminoácidos dada y un organismo diana dado, se producirán varias secuencias diferentes de nucleótidos que se pueden diferenciar en el número, tipo y posición de sitios de restricción, señales de empalme de intrones etc., algunas de las cuales pueden ser indeseables. El experto en la técnica será capaz de seleccionar una secuencia apropiada para uso en la expresión del polipéptido en base de estas características.

Además, ya que los codones se asignan al azar en base estadística, es posible (aunque quizás improbable) que dos o más codones que se usan relativamente rara vez en el organismo diana se puedan agrupar en una proximidad cercana. Se cree que tales grupos pueden perturbar la maquinaria de traducción y dar cómo resultado una velocidad particularmente baja de expresión, de este modo el algoritmo para elegir los codones en el gen optimizado excluye cualquier codón con un valor de RSCU inferior a 0,2 para los genes altamente expresados con el fin de evitar cualquier grupo de codones raros que fortuitamente se seleccionen. Después las distribución de los codones restantes se localiza según las frecuencias para E. coli altamente expresado para proporcionar una distribución global en el gen sintético que es típica de dichos genes (coeficiente = 0,85) y también para los genes humanos altamente expresados (coeficiente = 0,50). Syngene (Meter Ertl, no publicado), una versión actualizada del programa Calcgene, permite que la exclusión de codones raros sea opcional y también se usa para localizar codones según el patrón de frecuencia de codones de genes humanos altamente expresados.

La secuencia del módulo CPC-P501S clonado a partir del vector pRIT15201 (véase la figura 7) en pVAC, por lo tanto generando el plásmido JNW735, se indica en la SEC ID Nº 18 y se ilustra en la figura 13. Esta secuencia es idéntica a la secuencia pRIT15201 con la excepción de la eliminación de la señal His y la adición de una secuencia Kozak (GCCACC) y sitios de enzimas de restricción apropiados. La secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 18 se muestra en un formato de una sola letra, los codones de inicio y de parada se muestran en negrita. Los restos encuadrados son el epítope auxiliar P2 del toxoide del tétanos. Los restos subrayados son la señal de purificación Clyta. La secuencia Kozak se marca por los símbolos de almohadilla.

2.- Generación de los plásmidos recombinantes con secuencias de codón optimizadode P501S

Aunque el índice de coeficiente de codones (CI) de la secuencia nativa de P501S es ya alta (0,618), es posible incrementar el valor de CI posteriormente. Esto tendrá dos beneficios potenciales mejorar la expresión y/o inmunogenicidad del antígeno y reducir la posibilidad de recombinación entre el vector de P501 S y las secuencias genómicas.

Usando el programa Syngene se obtuvo una selección (SEC ID Nº 19 a SEC ID Nº 20) de secuencias de codón optimizado(figura 14). La tabla 3 más adelante muestra una comparación del índice de coeficiente de codones, seleccionado en base a un perfil de sitios de enzimas de restricción adecuados y un buen índice de CI.

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TABLA 3 Comparación de índices de coeficiente de codones de dos genes de P501S optimizados de codones

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3.- Evaluación adicional de las secuencias optimizadas de codones Secuencia SEC ID Nº 19

Aunque la SEC ID Nº 19 tiene un buen índice de CI (0,725) contiene un doblete de codones raros en los aminoácidos de posición 202 y 203. Estos codones se sustituyeron manualmente con codones más frecuentes cambiando la secuencia de ADN de TTGTTG a CTGCTG. Para facilitar la clonación y expresión, se añadieron los sitios de las enzimas de restricción y una secuencia Kozak. La secuencia final modificada genéticamente (SEC ID Nº 21) se muestra en la figura 15. Se utilizó el programa Syngene para fragmentar esta secuencia en oligonucleótidos con una superposición mínima de 19 - 20 bases. Por lo tanto, la figura 15 muestra la SEC ID Nº 19 de codón optimizado P501S remodificada genéticamente. Los sitios de las enzimas de restricción están subrayados, la secuencia Kozac está en negrita, la secuencia de ADN remodificada genéticamente para retirar un doblete de codones raro esta encuadrada.

Usando un protocolo de la PCR de dos etapas, los cebadores de superposición generados por el programa Syngene primero se ensamblaron usando el protocolo de ensamblaje (detallado mas adelante). El fragmento de longitud completa correcto se recuperó/amplificó usando el protocolo de recuperación de la PCR y los cebadores terminales. El fragmento de PCR resultante se eliminó a partir de un gel de agarosa, se purificó, se restringió con NheI y XhoI y se clonó en pVAC. Los clones positivos se identificaron mediante análisis de enzimas de restricción y se confirmaron mediante secuenciación de doble cadena. Esto genera el plásmido JNW766, que, debido a la naturaleza propensa al error del procedimiento de la PCR, contenía una única mutación silenciosa (C a T en la posición 360 de la SEC ID Nº 21).

1. Condiciones de la reacción de ensamblaje - PCR, protocolo genérico

Mezcla de reacción (volumen total = 50 \mul):

-: 1x Tampón de reacción (Pfx o comienzo de la prueba)

-: 1 \mul Conjunto de oligo (mezcla igual de todos los oligos superpuestos)

-: dNTPs 0,5 mM

-: ADN polimerasa (Pfx o comienzo de la prueba, 2,5-5U)

-: MgSO_{4} +/- 1 mM

-: +/- 1x de solución potenciadora (potenciador de Pfx o tampón de comienzo de la prueba Q)

: 1. 94ºC durante 120 seg. (solamente comienzo de la prueba)

: 2. 94ºC durante 30 seg.

: 3. 40ºC durante 120 seg.

: 4. 72ºC durante 10 seg

: 5. 94ºC durante 15 seg

: 6. 40ºC durante 30 seg

: 7. 72ºC durante 20 seg. + 3 seg./ciclo

: 8. Ciclo a etapa 5, 25 veces

: 9. Mantenido a 4ºC

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2. Condiciones de la reacción de recuperación - PCR (protocolo genérico)

Mezcla de reacción (volumen total = 50 \mul):

-: 1x Tampón de reacción (Pfx o comienzo de la prueba)

-: 5-10 \mul mezcla de reacción de ensamblaje

-: dNTPs 0,3 - 0,75 mM

-: 50 pmol de cebador (cebador del terminal 5', orientación con sentido)

-: 50 pmol de cebador (cebador del terminal 3', orientación antisentido)

-: ADNpolimerasa (Pfx o comienzo de prueba, 2,5 - 5U)

-: MgSO_{4} +/-1 mM

: 1. 94ºC 120 seg. (solamente comienzo de la prueba)

: 2. 94ºC 45 seg.

: 3. 60ºC 30 seg.

: 4. 72ºC 120 seg.

: 5. Ciclo a etapa 2, 25 veces

: 6. 72ºC 240 seg.

: 7. Mantenido a 4ºC

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Secuencia SEC ID Nº 20

Aunque la SEC ID Nº 20 tiene un muy buen índice de CI (0,755) se observó que contenía un doblete de codones raros en los aminoácidos de posición 131 y 132. Estos codones se sustituyeron manualmente con codones más frecuentes cambiando la secuencia de ADN de TTGTTG a CTGCTG. Para facilitar la clonación, se retiró un sitio BamHl interno mediante la mutación de G a C (véase le nucleótido doblemente subrayado de la figura 16). Para facilitar la clonación y expresión se añadieron los sitios de las enzimas de restricción y una secuencia Kozak. La secuencia final modificada genéticamente (SEC ID Nº 22) se muestra en la figura 16. Se utilizó el programa Syngene para fragmentar esta secuencia en oligonucleótidos con una superposición mínima de 19 - 20 bases. Por lo tanto la figura 16 muestra la secuencia 20 (SEC ID Nº 22) de codón optimizado P501S remodificada genéticamente. Los sitios de las enzimas de restricción están subrayados, la secuencia está en negrita, la secuencia de ADN remodificada genéticamente para retirar un doblete de codones raros esta encuadrada y una mutación puntual silenciosa para retirar un sitio BamHl está doblemente subrayada.

Usando un protocolo de la PCR de dos etapas similar al descrito anteriormente, el fragmento de longitud completa de P501 se amplificó y se clonó en pVAC. Los clones positivos se identificaron mediante análisis enzimático de restricción y se confirmaron mediante secuenciación de doble cadena. Esto genera el plásmido JNW764. La secuencia del módulo que codifica P501S se muestra en la figura 16 (SEC ID Nº 22).

Similitud de secuencias de ADN

Las distancias pares que siguen a la alineación mediante el procedimiento ClustalV (en peso) se muestran en la tabla 3 más adelante. La tabla 4 más adelante muestra el porcentaje de similitud entre la secuencia de comienzo humana de P501S y las dos secuencias de codón optimizadoSEC ID Nº 21 y 22 seleccionadas para posterior investigación. Los datos confirman que las secuencias de ADN de codón optimizadoson aproximadamente 80% similares a la secuencia original de P501S.

TABLA 4

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Ejemplo VII

Secuencias CPC optimizadas de codones 1.- Planteamiento

Ya que la secuencia CPC original se diseñó originalmente para la expresión óptima en levaduras. Esta sección describe el procedimiento de optimización de codones para expresión humana.

2.- Diseño de secuencias

La secuencia de inicio para la optimización de CPC se muestra en la figura 17 (SEC ID Nº 23). Esto se deriva completamente del pRIT15201 y contiene la secuencia de codificación completa de CPC más cuatro aminoácidos de P501S para facilitar la clonación hacia abajo. Usando el programa Syngene, se obtuvieron una selección de secuencias de codón optimizadode las que las secuencias representativas se muestran en la figura 18 (SEC ID Nº 24 - 25). La tabla 5 más adelante muestra una comparación del índice de coeficiente de codones para la secuencia CPC de inicio y las dos secuencias representativas de codón optimizado.

TABLA 5 Índice de coeficiente del codón para dos secuencias optimizadas CPC

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Además de la optimización de codones, todas las secuencias se analizaron también para los sitios de clonación de enzimas de restricción. En base a los valores de CI más altos y un perfil de sitios de enzimas de restricción favorables, se seleccionó para construcción la SEC ID Nº 24. Para facilitar la clonación y expresión se añadieron los sitios de clonación en 5' y 3' y se insertó una secuencia Kozak (GCCACC) en 5' del codón de inicio ATG. Esta secuencia modificada genéticamente se muestra en la figura 19 (SEC ID Nº 26). Esta secuencia incluye cuatro aminoácidos de P501S (encuadrados), sitios de clonación de enzimas de restricción (NheI y XhoI, subrayados), una secuencia Kozak (en negrita), un codón de parada (en itálica) y 4 pares de bases de ADN flanqueante irrelevante para facilitar la clonación.

Se usó el programa Syngene para fragmentar esta secuencia en oligonucleótidos de 50 - 60 - meros con una superposición mínima de 18 - 20 bases. Usando un protocolo de la PCR de dos etapas similar al descrito anteriormente, se recuperó/amplificó el fragmento correcto y se clonó en pVAC. Los clones positivos se identificaron mediante el análisis de enzimas de restricción y se verificó la secuencia generando el vector JNW759.

4.- Similitud de ADN

Las distancias pares que siguen a la alineación mediante el procedimiento ClustalV (en peso) se muestran en la tabla 6 más adelante. La tabla muestra el porcentaje de similitud a nivel de ADN entre la secuencia de comienzo de CPC y la secuencia de codón optimizado y confirma que las secuencias de codón optimizadoson aproximadamente 80% similares a la secuencia original de CPC.

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TABLA 6

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Ejemplo VIII

Construcción del candidato de fusión de P501S

Todos los candidatos mostrados en el esquema más abajo codones optimizados y construidos usando metodologías de superposición de PCR a partir de los plásmidos JNW764 y JNW759 como moldes (SEC ID Nº 22 y SEC ID Nº 26 respectivamente) y se clonan en el vector de expresión p7313 ie.

Los cuatro candidatos mostrados esquemáticamente más adelante se basan en CDP-P501S. El codón optimizado CPC-P501S es la construcción A. Los candidatos B, C, D también incluyen la secuencia que codifica los 50 aminoácidos del extremo N de P501S, posicionados bien en el extremo N de CPC-P501S (construcción D), el extremo C de CPC-P501S (construcción C), o entre CPC y P501S (construcción B). Una representación esquemática de las construcciones se proporciona en la figura 20.

La secuencia de nucleótidos y proteínas de cada uno de las cuatro construcciones se muestra en la SEC ID Nº 37 - 40 para las secuencias de nucleótidos, y la SEC ID Nº 45 - 48 para las correspondientes secuencias de polipéptidos. En las construcciones A, C y D, el codón subrayado codifica preferentemente tirosina (bien TAC o TAT) pero la secuencia de nucleótidos se puede alterar para que codifique treonina (bien ACA, ACC, ACG o ACT). En la construcción B, el codón subrayado subrayado codifica preferentemente treonina (bien ACA, ACC, ACG o ACT), pero la secuencia de nucleótidos se puede alterar para que codifique tirosina (bien TAC o TAT). En todas las construcciones la secuencia de codificación está flanqueada por sitios de clonación de enzimas de restricción adecuadas (en este caso, NotI y BamHI), y una secuencia Kozak inmediatamente hacia arriba de ATG de inicialización. La tabla 7 más adelante muestra la identificación de plásmidos para las construcciones detalladas anteriormente:

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TABLA 7

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Las respuestas celulares que siguen a la inmunización con p7313-ie (vector vacío), pVAC-P501S (JNW735), JNW770, JNW771 y JNW773 se valoraron mediante ELISPOT seguido de una inmunización principal mediante PMID el día 0 y tres refuerzos los días 21, 42 y 70. Los ensayos se llevaron a cabo 7 días después del refuerzo. La figura 27 muestra que se detectaron buenas respuestas de IL-2 ELISPOT en ratones inmunizados con JNW770, JNW771 y JNW773.

Ejemplo IX

Experimentos de inmunogenicidad usando estudios de administración intradérmica mediada por partículas PMID

El P501S de longitud completa cuando se administra mediante administración intradérmica mediada por partículas (PMID), genera buenas respuestas de anticuerpos y celulares. Estos datos demuestran que la PMID es una muy eficaz vía de administración. Además, la comparación de P501S y CPC-P501S confirma que CPC-P501S induce una respuesta inmune más fuerte como se determina por ELISPOT de péptidos.

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1. Materiales y procedimientos 1,1. Inmunización mediante cañón de genes cutáneo

ADN de plásmido se precipitó en perlas de oro de 2 \mum de diámetro usando cloruro cálcico y espermidina. Las perlas cargadas se revistieron en un tubo Teftel como se ha descrito (Eisenbraum y col., 1993; Pertmer y col., 1996). El bombardeo por partículas se realizó usando el sistema de administración génica Accell (PCT documento WO 95/19799). Para cada plásmido, se inmunizaron hembras de ratones C57BL/6 los días 0, 21, 42 y 70. Cada administración constaba de dos bombardeos con ADN/oro proporcionando una dosis total de aproximadamente 4 - 5 \mug de plásmido.

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1.2. Ensayos ELISPOT para las respuestas de células T al producto génico de P501S a) Preparación de esplenocitos

Se obtuvieron bazos de animales inmunizados a los 7 - 14 días después del refuerzo. Los bazos se procesaron oprimiendo entre dos portaobjetos de vidrio para producir una suspensión celular. Se lisaron los glóbulos rojos mediante tratamiento cloruro amónico y los desechos se retiraron para dejar una suspensión fina de esplenocitos. Las células se volvieron a suspender a una concentración de 8 x 10^{6}/ml en medio completo de RPMI para uso en los ensayos de ELISPOT.

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b) Análisis de biblioteca de péptidos

Se obtuvo de Corixa Corp una biblioteca de péptidos que cubría una mayoría de la secuencia de P501S. La biblioteca contenía cincuenta péptidos de 15 - 20 meros que se superponen con 4 - 11 aminoácidos. Los péptidos se numeraron 1 - 50. Además, un programa de predicción (H-G. Rammensee, et al.: Immunogenetics, 1999, 50: 213-219) (http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/) se usó para predecir los supuestos epítopes Kb y Db de la secuencia P501S. Los diez mejores epítopes de Kb y Db se pidieron a Mimotopes (Reino Unido) y se incluyeron en la biblioteca (péptidos 51 - 70). Para analizar la biblioteca de péptidos, se usaron los péptidos a una concentración final de 50 \mug/ml (aproximadamente 25 - 50 \muM) en ELISPOTS de IFN\gamma e IL-2 usando el protocolo descrito más adelante. Para ELISPOTS de IFN\gamma, se añadió IL-2 a los ensayos a 10 ng/ml. Los esplenocitos usados para el análisis se cogieron el día 84 de ratones C57BI/6 inmunizados los días 0, 21, 42 y 70. Se identificaron tres péptidos del análisis de la biblioteca - péptidos 18 (HCRQAYSVYAFMISLGGCLG), 22 (GLSAPSLSPHCCPCRARLAF) y 48 (VCLAAGITYVPPLLLEVGV). Estos péptidos se usaron posteriormente en los ensayos de ELISPOT.

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c) Ensayo ELISPOT

Se cubrieron las placas con 15 \mug/ml (en PBS) de IFN\gamma de rata anti ratón o IL-2 de ratas anti ratón (Pharmingen). Se cubrieron las placas durante una noche a +4ºC. Antes de usar las placas se lavaron tres veces con PBS. Se añadieron esplenocitos a las placas a 4 x 10^{5} células/pocillo. Los péptidos se identificaron en el análisis de la biblioteca se volvieron a perdir a Genemed Sinthesis y se usaron a una concentración final de 50 \mug/ml. La proteína CPC-P501S (GSKBio) se usó en el ensayo a 20 \mug/ml. Los ensayos ELISPOT se llevaron a cabo en presencia bien de IL-2 (10 ng/ml), IL-7 (10 ng/ml) o sin citoquina. El volumen total en cada pocillo fue de 200 \mul. Las placas que contenían células estimuladas de péptidos se incubaron durante 16 horas en un incubador humidificado a 37ºC.

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e) Desarrollo de las placas de ensayo de ELISPOT

La células se retiraron de las placas mediante el lavado una vez con agua (poniendo en remojo 10 minutos para asegurar la lisis de las células) y tres veces con PBS. El IFN de rata anti ratón conjugado con Biotina o IL-2 (Phamingen) se añadió a 1 \mug/ml en PBS. Se incubaron las placas en agitación con vibración durante 2 horas a temperatura ambiente. Después las placas se lavaron tres veces con PBS antes de la adición de fosfatasa alcalina de Estreptavidina (Caltag) a una dilución de 1/1000. Después de tres lavados en PBS se revelaron las manchas mediante incubación con sustrato BCICP (Biorad) durante 15 - 45 minutos. Se lavó el sustrato usando agua y se dejó que las placas se secaran. Se enume-
raron las manchas usando un sistema de análisis proyectado por Brian Hayes, Asthma Cell Biology unit, GSK.

1.3. Ensayo ELISA para anticuerpos contra el producto génico de P501S

Se obtuvieron las muestras de suero de los animales mediante punción en vena los días -1, 28, 49 y 56 y se ensayaron para la presencia de anticuerpos anti-P501S. Se realizó ELISA usando placas de Nunc Maxisorp cubiertas durante una noche a 4ºC con 0,5 \mug/ml de proteína de CPC-P501S (GSKBio) en tampón bicarbonato sódico. Después de lavar con TBS-Tween (solución salina tamponada con Tris, pH 7,4 que contenía 0,05% de Tween 20) se bloquearon las placas con tampón de bloqueo (BSA al 3% en tampón TBS-Tween) durante 2 horas a temperatura ambiente. Todos los sueros se incubaron a una dilución 1:100 durante 1 hora a temperatura ambiente en tampón de bloqueo. De detectó la unión de anticuerpo usando inmunoglobulinas de conejo anti-ratón conjugadas con HPR (#P0260, Dako) a dilución 1:2000 en tampón de bloqueo. Se lavaron las placas de nuevo y se detectó el conjugado unido usando reactivos de color Fast OPD (Sigma, Reino Unido). Se detuvo la reacción mediante la adición de ácido sulfúrico 3 M y el producto OPD se cuantificó midiendo la absorbancia a 490 nm.

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1.4. Ensayos de transfección transitoria

Se analizó la expresión de P501S humano da partir de diversas construcciones de ADN mediante transfección transitoria de los plásmidos en células de CHO (ovario de hámster chino) seguido de transferencias de Western en la proteína celular total. Las trasfecciones transitorias se realizaron con el reactivo Transfectan (Promega) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos se sembraron con 5 x 10^{4} células CHO por pocillo en 1 ml de medio completo DMEM (DMEM, FCS al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 UI/ml, estreptomicina 100 \mug/ml)y se incubaron durante 16 horas a 37ºC. Se añadieron 0,5 \mug de ADN a 25 \mul de NaCl 0,3 M (suficiente para un pocillo) y se añadieron 2 \mul de Transfectam a 25 \mul de Milli-Q. Las soluciones de ADN y Transfectam se mezclaron suavemente y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Durante esta etapa de incubación, se lavaron las células una vez en PBS y se cubrieron con 150 \mul de medio exento de suero (DMEM, L-glutamina 2 mM). La solución de ADN-Transfectam se añadió gota a gota a las células, la placa se agitó con vibración suavemente y se incubó a 37ºC durante 4 - 6 horas. Se añadieron 500 \mul de medio completo de DMEM y se incubaron las células durante 48 - 72 horas adicionales a 37ºC.

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2. Análisis de transferencias de Western de células de CHO transfectadas transitoriamente con plásmidos de P501S

Las células de CHO transfectadas transitoriamente se lavaron con PBS y se trataron con Verseno (1:5000)/solución de tripsina al 0,025% para transferir las células a la suspensión. Después de tripsinización, las células de CHO se sedimentaron y se volvieron a suspender en 50 \mul de PBS. Se añadió un volumen igual de 2 x de tampón de lisis NP40 y se incubaron las células en hielo durante 30 minutos. Se añadieron 100 \mul de 2 x de tampón de muestra TRIS-glicina SDS (Invitrogen) que contenía DTT 50 mM y se calentó la solución hasta 95ºC durante 5 minutos. Se cargó 1 - 20 \mul de muestra en una columna de gel de TRIS-glicina al 4 - 20% de 1,5 mm (Invitrogen) y se sometió a electroforesis a una tensión constante (125 V) durante 90 minutos en 1 x de tampón TRIS-glicina (Invitrogen). Se usó un marcador preteñido de amplio rango (Nueva Inglaterra Biolabs, #P7708S) para calibrar las muestras. Después de la electroforesis, se transfirió la muestra a una membrana de Immobilon-P (Millipore), se prehumedeció en metanol, usando un módulo Xcell III Blot (Invitrogen), 1 x tamón de transferencia (Invitrogen) que contenía metanol al 20% y una tensión constante de 25 V durante 90 minutos. Se bloqueó la membrana durante una noche a 4ºC en TBS-Tween (solucion salina tamponada con TRIS, pH 7,4 conteniendo 0,05% de Tween 20) que contenía leche desnatada seca (Marvel). Se diluyó el anticuerpo principal (10E3) 1: 1000 y se incubó con la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de un lavado abundante en TBS-Tween, el anticuerpo secundario (inmunoglobulinas de conejo anti-ratones conjugadas con HPR (#P260, Dako)) se diluyó 1:2000 en TBS-Tween que contenía 3% de leche desnatada seca y se incubó con la membrana durante una hora a temperatura ambiente. Después de un lavado abundante, se incubó la membrana con sustrato Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate (Pierce) durante 5 minutos. Se retiró el exceso de líquido y se selló la membrana entre dos hojas de láminas adherentes y se expuso a una lámina de Hyperfilm ECL (Amersham-PharmaciaBiotech) durante 1 - 30 minutos.

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3. Generación del módulo de expresión P501S humano de longitud completa

El punto de inicio de la construcción de un módulo de expresión de P501S era el plásmido pcDNA3,1-P501S (Corixa Corp), que tiene un eje central pcDNA3,1 (Invitrogen) que contenía un módulo P501S ADNc de longitud completa entre los sitios EcoRI y NotI. Este vector también se denomina JNW673. Las presencia de P501S se confirmó mediante secuenciación fluorescente. La secuencia del módulo de ADNc se proporciona mediante la secuencia NCBI/Genbank (número de acceso AY033593). El P501S humano era PCR amplificado a partir del ADN de molde JNW673, restringido con XbaI y SalI y clonado en los sitios NheI/XhoI de pVAC generando el vector JNW680. La correcta orientación del fragmento relativa al promotor de CMV se confirmó mediante PCR y por secuenciación de ADN. La secuencia del módulo de expresión se muestra en la figura 12 (SEC ID Nº 17). Para construir un módulo de expresión CPC-P501S, se amplificó CPC-P501S mediante PCR a partir del vector pRIT15201 (véase la figura 7), restringido con XbaI y SalI y se clonó en los sitios NheI y XhoI de pVAC, generando el plásmido JNW735. Se confirmó la correcta orientación mediante PCR y secuenciación. La secuencia del módulo de expresión CPC-P501S se muestra en la figura 13 (SEC ID Nº 18).

4. Expresión de P501S humano de plásmidos JNW680 y JNW735

Los plásmidos de expresión de P501S se trasfectaron transitoriamente en células CHO y se preparó un lisado total de células como se describe en los procedimientos. Unas transferencias de Western de un lisado de células total identificó bandas únicas de aproximadamente 55 kDa y 62 kDA para muestras transfectadas con JNW680 y JNW735 respectivamente (figura 21). Esto es consistente con los pesos moleculares predichos de 59,3 kDa y 63,3 kDA para P501 S y CPC-P501S respectivamente. La adición de CPD tag no afecta adversamente la expresión de P501 S.

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5. Resultados 5.1. Respuestas anticuerpo a P501 humano después de inmunización con PMID

Las respuestas anticuerpo después de inmunización con pVAC (vector vacío) y pVAC-P501S (JNW680) se valoraron mediante análisis ELISA seguido de una inmunización primaria por PMID el día 0 y tres refuerzos los días 21 y 42 y el día 70. La figura 22 muestra las respuestas anticuerpo de sueros recogidos los días -1, 28 y 49 (ratones A1-3, B1-3) y el día 56 (ratones A4-6, B4-9). Mientras tres eran respuestas algo no específicas para el vector pVAC vacío, respuestas específicas a la construcción P501S se veían en 5 de 9 ratones.

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5.2. Identificación de epítopes de células T nuevos de P501S humano en ratones C57BU6 mediante análisis de una biblioteca de péptidos de P501S

Después de la inmunización con JNW680 (pVAC-P501S) mediante PMID el día 0 y tres refuerzos el día 21 y el día 42 y el día 70, se llevaron a cabo ensayos ELISPOT el día 84. Los péptidos de la biblioteca P501S se ensayaron a una concentración final de 50 \mug/ml. De este primer análisis, se encontró que tres péptidos estimulaban la secreción de IFN\gamma y/o IL-2. Los péptidos 18, 22 y 48 (figura 23). Estos péptidos se utilizaron en posteriores ensayos celulares.

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5.3. Respuestas celulares a pVAC-P501S (JNW680) después de inmunización con PMID

Las respuestas celulares después de inmunización con pVAC (vector vacío) y pVAC-P501S se valoraron mediante ELISPOT seguido de una inmunización primaria mediante PMID el día 0 y tres refuerzos los días 21, 42 y 70. Se llevaron a cabo los ensayos 7 días después del refuerzo. Se utilizaron dos condiciones de ensayo diferentes: 1) los péptidos 18, 22 y 48 identificados en la selección de la biblioteca de péptidos se usaron a 50 \mug/ml de concentración final y 2) la proteína CPC-P501S usada a 20 \mug/ml de concentración final. La figura 24A muestra que mientras no había respuestas específicas de P501S al vector vacío (A4-6), la construcción pVAC-501S inducía respuestas específicas de IFN-\gamma a los péptidos 18 y 22 en todos los ratones (B6-9) mientras un ratón (B7) también mostró una respuesta de IFN-\gamma al péptido 48. La figura 24B muestra que todos los ratones mostrabas respuestas específicas de IL-2 a los péptidos 18, 22 y 48. Además, los ratones (B6-9) inmunizados con pVAC-P501S también mostraron respuestas moderadas de IL-2 a CPC-P501S, mientras que los ratones (A4-6) inmunizados con el vector vacío no mostraron
respuestas.

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5.4. Comparación de respuestas celulares a P501S y CPC-P501S después de inmunización con PMID

Las respuestas celulares después de inmunización con pVAC (vector vacío) y pVAC-P501S (JNW680) y CPC-P501S (JNW735) se valoraron mediante ELISPOT seguido de una inmunización primaria mediante PMID el día 0 y refuerzos los días 21 y 42. Se llevaron a cabo los ensayos 7 días después de los refuerzos. Se utilizaron dos condiciones de ensayo diferentes: 1) los péptidos 18, 22 y 48 identificados en la selección de la biblioteca de péptidos se usaron a 50 \mug/ml de concentración final y 2) la proteína CPC-P501S usada a 20 \mug/ml de concentración final. La figura 25 muestra que el día 28, CPC-P501S inducía buenas respuestas de IL-2 a 10 \mug/ml del péptido 22, mientras que no había respuestas específicas de P501S bien al vector vacío o al pVAC-501S. Estos resultados también se veían usando proteína CPC-P501S para volver a estimular los esplenocitos. El día 49 (después de la 2ª estimulación) las respuestas inducidas por P501S y CPC-P501S eran equivalentes. Estos datos sugieren que la adición de la señal CPC mejora la cinética y/o la magnitud de la respuesta a P501 S.

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Ejemplo IX

Estudios de experimentos de inmunogenicidad en ratones usando proteína P501S + adyuvante 1. Diseño y formulación de adyuvantes

La respuesta inmune inducida por vacunación que usa la proteína CPC-P501S recombinante purificada formulada en adyuvantes se caracteriza en experimentos realizados en ratones. Se vacunaron grupos de 5 a 10 hembras de ratones C57BL6 de 8 semanas de edad, 2 - 6 veces intramuscularmente a intervalos de 2 semanas con 10 \mug de la proteína CPC-P501S formulada en diferentes sistemas de adyuvantes. El volumen administrado corresponde a 1/10 de una dosis humana (50 \mul). La serología (respuesta de Ig total) y respuesta celular (linfoproliferación de células T y producción de citoquina) se analizaron en células de bazo, 6 - 14 día después de la última vacunación usando protocolos estándar como describen Gérard, C. y col., 2001, Vacine 19, 2583 - 2589.

Se muestran los datos de un experimento representativo. Incluyó 5 grupos de ocho hembras de ratones C57BI/6 que recibieron 4 inyecciones intramusculares de CPC P501S (10 \mug) + adyuvante (A, B, C) los días 0, 14, 28, 42. El ejemplo V proporciona un protocolo experimental de cómo llevar a cabo las formulaciones. Brevemente las formulaciones de adyuvantes son como siguen (cantidades dadas por una dosis de 100 \mul):

-: Adyuvante A: QS21 (10 \mug), MPL (10 \mug) y CpG7909 (100 \mug) realizado según el procedimiento descrito en el documento WO 00/62800;

-: Adyuvante B: formulación de QS21 (20 \mug), MPL (20 \mug), CpG7909 (100 \mug) y 50 \muf SB62 de emulsión aceite en agua (documento WO 95/17210);

-: Adyuvante C: formulación de QS21 (10 \mug), MPL (10 \mug), CpG7909 (100 \mug) y 10 \mul SB62 de emulsión aceite en agua (documento WO 99/12565).

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2. Serología

La respuesta total de Ig inducida por vacunación se midió mediante análisis ELISA usando bien la CPC-P501 o RA12-P501 (extremo C, que es una forma truncada de la proteína P501 correspondiente al extremo C de la proteína fusionada a su extremo N, a una proteína RA12-Ra12 derivada de TB se deriva a partir del antígeno MTB32A descrito en Skeiky y col., Infection and Immun. (1999) 67: 3998 - 4007). Las proteínas CPC-P501S con adyuvantes proporcionan una buena respuesta de anticuerpo después de la vacunación.

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3. Respuesta celular 3.1. Linfoproliferación

Siete días después de la última vacuna se realizó la linfoproliferación sobre células de bazo individualmente. Se sembraron células 2,10^{5} por cuadruplicado en microplacas de 96 pocillos, en medio RPMI que contenía suero de ratones normal al 1%. Después de 72 horas de reestimulación bien con el inmunógeno (CPC-P501) o bien con la proteína truncada (RA12 P501) a concentración diferente, se añadió 1 \muCi de ^{3}H timidina (Amersaham 5 Ci(ml). Después de 16 horas, se recogieron las células en placas de filtro. La radiactividad incorporada se contó en un contador \beta. Los resultados se expresan en CPM o como índices* de estimulación (media geométrica de CPM en cultivos con antígeno/media geométrica de CPM en cultivos sin antígeno). La reestimulación con ConA (2 \mug/ml) como control positivo se incluyó como control positivo.

Como se muestra en la figura 26, una linfoproliferación específica de P501S se ve en el bazo de todos los grupos de ratones que reciben la proteína con adyuvantes después de una reestimulación bien con el inmunógeno o bien con otra proteína de P501S realizado en otro sistema de expresión (E. coli), indicando que las células T se han cebado in vivo mediante la vacunación.

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3.2. Producción de IFNg medida mediante tinción intracelular de células de bazo

Células dendríticas de médula ósea (BMDC) se obtuvieron de un cultivo de PBL de ratón durante 7 días en presencia de GMCSF. Siete días después de la última vacuna, el bazo o PBL se recogen y se prepara una suspensión celular. 10^{6} células (1 conjunto por grupo) se incubaron +/- 18 horas con 10^{5} de BMDC pulsadas durante una noche con 10 \mug/ml bien de la proteína CPCp501 o de la RA12. Después de un tratamiento con el anticuerpo 2,4.G,2, se tiñeron las células de bazo con anticuerpos antiCD4 y CD8 fluorescentes (anti CD4-APC y anti CD8PerCP). Después de una etapa de permeabilización y fijación, se tiñeron las células con un anticuerpo anti IFNg-FITC.

En ratones vacunados con CPC P501 en diferentes adyuvantes, tanto las células T CD4 como las CD8 se muestran para producir IFNg en respuesta a pulsos de DC tanto con el inmunógeno como con el p501 C terminal realizado en E. coli (como se muestra mediante tinción intracelular de bazo y PBLs). Existe un incremento de 4 - 10 x en el % de células que producen esta citoquina en los grupos que reciben la CPD con adyuvantes (adyuvantada) comparada con la proteína sola y entre 0,1 y 10% de células T de CD4 o CD8 se muestran para producir IFNg.

En conclusión, estos datos permiten concluir que la proteína CPC-P501 con adyuvantes (adyuvantada) es inmunogénica en ratones. Se pueden detectar tanto unas respuestas humorales y celulares específicas de P501 que incluyen la producción de IFNg mediante células T de CD4 y CD8 después varias vacunaciones intramusculares con CPC P501 en adyuvantes.

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Ejemplo X

Construcciones y secuencias de CPC-MUC-1

La secuencia CPC se coge del nucleótido SEC ID Nº 28.

La secuencia MUC1 está disponible de la base de datos de Genbank (número de acceso NM_002456).

1. Construcción MUC1-CPC

Debido a la presencia de una secuencia señal en MUC1 que se escinde después de la traducción, el motivo CPC se situó en el extremo C. La secuencia de ADN MUC1-CPC resultante se muestra en la SEC ID Nº xx (figura 28A) y la secuencia de la proteína MUC1-CPC correspondiente SEC ID Nº yy (figura 28B).

2. Construcción ss-CPC-MUC1

Debido a la presencia de una secuencia señal en MUC1 que se escinde después de la traducción, la secuencia señal MUC1 se reemplazó mediante una secuencia conductora heteróloga (a partir de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana) y el motivo CPC se insertó entre la secuencia conductora heteróloga y la secuencia MUC1, generando una secuencia llamada ss-CPC-MUC1 como se muestra en la figura 29.

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<110> GlaxosmithKline Biologicals sa

\hskip1cm

Glaxo Group Ltd

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<120> Composiciones inmunogénicas

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<130> B45311

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 52

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ para Windows Version 4,0

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Streptococcus pneumoniae

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\sa{Gly Trp Gln Lys Asn Asp Thr Gly Tyr Trp Tyr Val His Ser Asp}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

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<212> PRT

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<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys Ile Asn Gly Thr Trp Tyr}

\sac{Tyr Phe Asp Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp}

\sac{Tyr Trp Phe Asp Asn Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> PRT

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<213> Streptococcus pneumoniae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr}

\sac{Phe Asn Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr}

\sac{Leu Asp Ala Lys Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ala Met Val Ser Asn Ala Phe Ile Gln Ser Ala Asp Gly Thr Gly}

\sac{Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 142

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<212> PRT

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<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctggcaga agaatgacac tggctactgg tacgtacatt cagac

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

14

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<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgaaatgg ctacaggctg gaagaaaatc gctgataagt ggtactattt caacgaagaa

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 429

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Streptococcus pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 1674

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 17

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19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1947

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gen híbrido entre C-LytA de St. pneum., epítope auxiliar de T P2 y P501S humano.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1662

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P501S humana de codón optimizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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21

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

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<211> 1662

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P501S humana de codón optimizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1688

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P501S humana de codón optimizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1688

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P501S humana de codón optimizado

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 435

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gen híbrido entre C-LytA de St. pneum., epítope auxiliar de T P2 y una pequeña porción del extremo 5' de P501S humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 435

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gen híbrido entre C-LytA de St. pneum., epítope auxiliar de T P2 y una pequeña porción del extremo 5' de P501S humano de codón optimizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 435

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 464

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 652

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína híbrida entre C-LytA de St. pneum., epítope auxiliar de T P2 y aminoácidos 51 - 553 de P501S humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

31

32

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1959

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN que codifica la proteína híbrida entre C-LytA de St. pneum., epítope auxiliar de T P2 y los aminoácidos 51-553 de P501S humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 507

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P501S humano (aminoácidos 55-553) fusionado a 6 restos de histidina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

35

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1524

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN que codifica P501S humano (aminoácidos 55 - 553) fusionado a 6 restos de histidina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 685

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P501S humano (aminoácidos 1-34 fusionados a los 55-553) fusionado a 6 restos de histidina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

38

39

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2058

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN que codifica P501S humano (aminoácidos 1-34 fusionados a los 55-553) fusionado a 6 restos de histidina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

41

410

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 671

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Porción C-LytA de St. pneum. fusionada al epítope auxiliar de T P2 fusionada a P501S humano (aminoácidos 55-553) fusionado a 6 restos de histidina cadena abajo de la secuencia señal alfaprepro de levaduras

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

42

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2477

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN que codifica la porción C-LytA de St. pneum. fusionada al epítope auxiliar de T P2 fusionado a P501S humano (aminoácidos 55 - 553) fusionado a 6 restos de histidina cadena abajo de la secuencia señal alfaprepro de levaduras

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 595

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P501S humano (aminoácidos 55-553) fusionado a 6 restos de histidina cadena abajo de la secuencia señal alfaprepro de levaduras

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

45

46

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1788

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN que codifica P501S humano (aminoácidos 55-553) fusionado a 6 restos de histidina cadena abajo de la secuencia señal alfaprepro de levaduras

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1955

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN que codifica P501S humano con codones optimizados (aminoácidos 51-553) fusionado al epítope auxiliar P2 de C-Lyta de St. Pneum.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2045

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN que codifica P501S humano con codones optimizados (aminoácidos 1 - 553) fusionado al epítope auxiliar P2 de C-Lyta de St. pneum.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN que codifica el epítope auxiliar P2 de C-Lyta de St. Pneum. fusionado a P501S humano (aminoácidos 51-553) fusionado P510S humano (aminoácidos 1 - 50) - con codones optimizados

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN que codifica P501S humano (aminoácidos 1-50) fusionado al epítope auxiliar P2 de C-Lyta de St. pneum C-Lyta fusionado a P501S humano (aminoácidos 51-553) - con codones optimizados

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 652

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Epítope auxiliar P2 de C-Lyta de St. pneum C-Lyta fusionado a P510S humana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

53

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1959

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN que codifica el epítope auxiliar P2 de C-Lyta de St. pneum. fusionado a P501S humano (más señal his)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 553

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 644

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Epítope del auxiliar P2 de C-Lyta de St. pneum. C-Lyta fusionado a P510S humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

58

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 644

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína híbrida con codones optimizados entre el epítope auxiliar P2 de C-Lyta de St. pneum. C-Lyta fusionado a P510S humana (aminoácidos 51-553)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

60

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 694

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Epítope auxiliar P2 de C-Lyta de St. pneum C-Lyta fusionado a P501S humano con codones optimizados (aminoácidos 1-553)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

62

63

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 694

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Epítope auxiliar P2 de C-Lyta de St. pneum C-Lyta fusionado a P501S humano (aminoácidos 51-553) fusionado a P501S Humano (aminoáacidos 1-50) con codones optimizados

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

65

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 694

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> P501S humano (aminoácidos 1-50) fusionado al epítope auxiliar P2 de C-Lyta de St. pneum. C-Lyta fusionado a P501S Humano (aminoácidos 51-553) de codón optimizado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

67

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1971

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN que codifica MUC-1 humana fusionada al epítope auxiliar P2 de C-Lyta de St. pneum C-Lyta

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 656

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> MUC-1 humana fusionada al epítope auxiliar de P2 de C-Lyta de St. pneum. C-LytA.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

70

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2037

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN que codifica el epítope auxiliar P2 de C-Lyta de St. pneum C-Lyta fusionado a MUC-1 humana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 678

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Epítope auxiliar P2 de C-Lyta de St. pneum C-Lyta fusionado a MUC-1 humana.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

73

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Claims

1. Una proteína de la pareja de fusión que comprende un dominio de unión a colina y un epítope auxiliar T promiscuo heterólogo.

2. Una proteína de la pareja de fusión según la reivindicación 1 en la que el dominio de unión a colina es el extremo C de LytA o un derivado del mismo en el que el derivado del extremo C de LytA retiene tanto la capacidad de actuar como una pareja inmunológica como un potenciador de expresión.

3. Una proteína de la pareja de fusión según la reivindicación 2 en la que el C-LytA o sus derivados comprende al menos cuatro repeticiones de cualquiera de las SEC ID Nº 1 a 6.

4. Una proteína de la pareja de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el dominio de unión a colina se selecciona del grupo que comprende:

a): el dominio del extremo C de LytA como se expone en la SEC ID Nº 7; o

b): la secuencia de SEC ID Nº 8; o

c): una secuencia de péptidos que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad, preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, lo más preferible al menos 97 - 99% de identidad a cualquiera de las SEC ID Nº 1 a 6; o

d): una secuencia de péptidos que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 40, 50 ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 7 ó SEC ID Nº 8.

5. Una proteína de fusión que comprende una proteína de la pareja de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y una proteína heteróloga.

6. Una proteína de fusión según la reivindicación 5, en la que la proteína heteróloga está conjugada químicamente a la pareja de fusión.

7. Una proteína de fusión según la reivindicación 5 ó 6 en la que la proteína heteróloga se deriva de un organismo seleccionado del grupo siguiente: el virus de inmunodeficiencia humano VIH-1, los virus del herpes simplex humano, citomegalovirus, Rotavirus, virus de Epstein-Barr, virus de varicela Zoster, de un virus de hepatitis tales como virus de hepatitis B, virus de hepatitis A, virus de hepatitis C y virus de hepatitis E, de virus respiratorio sincitial, virus de la parainfluenza, virus del sarampión, virus de la parotidistis infecciosa, virus del papiloma humano, flavivirus o virus de la influenza, de Neisseria spp, Moraxella spp, Bordetella spp, Mycobacterium spp., incluyendo M. tuberculosis; Escherichia spp, incluyendo E. coli enterotóxica; Salmonella spp; Listeria spp.; Helicobacter spp; Staphylococcus spp., incluyendo S. aureus, S. epidermidis; Borrelia spp; Chlamydia spp., incluyendo C. trachomatis, C. pneumoniae; Plasmodium spp., incluyendo P. falciparum; Toxoplasma spp., Candida spp.

8. Una proteína de fusión según la reivindicación 5 ó 6 en la que la proteína heteróloga es una proteína asociada a tumores o proteína específica de tejidos o fragmento inmunogénico de la misma.

9. Una proteína de fusión según la reivindicación 8 en la que la proteína heteróloga o un fragmento de la misma se selecciona de MAGE 1, MAGE 3, MAGE 4, PRAME, BAGE, LAGE 1, LAGE 2, SAGE, HAGE, XAGE, PSA, PAP, PSCA, prosteína, P501S, HASH2, Cripto, B726, NY-BR1,1, P510, MUC-1, Prostasa, STEAP, tirosinasa, telomerasa, survivin, CASB616, P53 o her 2 neu.

10. Una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 que comprende además una señal de afinidad de al menos cuatro restos de histidina.

11. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de la reivindicación 1 a 10.

12. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 11.

13. Una célula huésped transformada con una secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 11 o con un vector de expresión de la reivindicación 12.

14. Una composición inmunogénica que comprende una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una secuencia de ADN según la reivindicación 11 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

15. Una composición inmunogénica según la reivindicación 14 que comprende adicionalmente un adyuvante que induce TH-1.

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16. Una composición inmunogénica según la reivindicación 15 en la que el adyuvante que induce TH-1 se selecciona del grupo de adyuvantes comprendido por: 3D-MPL, QS21, una mezcla de QS21 y colesterol, un oligonucleótido CpG o una mezcla de dos o más de dichos adyuvantes.

17. Un procedimiento para la preparación de una composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, que comprende la mezcla de la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 o un polinucleótido de codificación de la reivindicación 11 con un adyuvante, diluyente u otro vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado.

18. Un procedimiento para producir un proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende el cultivo de una célula huésped de la reivindicación 13 en condiciones suficientes para la producción de dicha proteína de fusión y la recuperación de la proteína de fusión del medio de cultivo.

19. Una proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una secuencia de ADN de la reivindicación 11 para uso en medicina.

20. Uso de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una secuencia de ADN de la reivindicación 11 en la fabricación de una composición inmunogénica para inducir una respuesta inmune en un paciente.

21. Uso según la reivindicación 20, en el que dicha respuesta inmune se va a inducir mediante la administración secuencial de i) la proteína dicha seguido de dicha secuencia de ADN; o ii) la mencionada secuencia dicha de ADN seguido de la mencionada proteína.

22. Uso según la reivindicación 21 en el que dicha secuencia de ADN se aplica a modo de revestimeinto sobre perlas biodegradables o se administra mediante un enfoque de bombardeo de partículas.

23. Uso según la reivindicación 21 o reivindicación 22 en el que a la mencionada proteína se le han añadido adyuvantes.

24. Uso de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una secuencia de ADN de la reivindicación 11 en la fabricación de una composición inmunogénica para el tratamiento inmunoterapéutico de un paciente que padece o es susceptible de cáncer.

25. Uso según la reivindicación 24 en el que dicho cáncer es cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama o melanoma.