ES2283671T3 - Composiciones y formulaciones para producir analgesia y para inhibir la progresion de transtornos de dolor neuropatico. - Google Patents
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Abstract
El uso de un omega conopéptido bloqueante de canales de calcio dependientes de voltaje tipo N, caracterizado por la capacidad para (a) inhibir la contracción estimulada eléctricamente de íleon de cobaya, y (b) unirse selectivamente a sitios de unión de omega conopéptido MVIIA presentes en tejido neuronal, como se demuestra mediante la capacidad del omega conopéptido para desplazar MVIIA de dicho sitio, en la fabricación de un medicamento para inhibir la progresión de un trastorno de dolor neuropático, cuando el omega conopéptido es para ser administrado mediante administración intratecal a un individuo en el sitio de progresión de lesión del nervio.
Description
Composiciones y formulaciones para producir
analgesia y para inhibir la progresión de trastornos de dolor
neuropático.
La presente invención se refiere al uso de
omega-conopéptidos en la fabricación de medicamentos
para inhibir la progresión de trastornos de dolor neuropático. La
invención también se refiere al uso de omega conopéptidos en la
fabricación de medicamentos adecuados para administración epidural a
un paciente.
Las terapias analgésicas están indicadas para
tratar síntomas que tienen en común la percepción de dolor por un
paciente. La forma más común de dolor, el dolor somático o
nociceptivo, resulta de cualquiera de una diversidad de estímulos
nocivos o dolorosos que se originan en la piel, tejido subyacente o
vísceras. El dolor nociceptivo resulta de la activación de fibras
nerviosas A y C aferentes nociceptivas periféricas, que se proyectan
al asta dorsal de la médula espinal, y que hacen sinapsis con
aferentes a áreas del cerebro específicas.
Los ejemplos de estímulos que provocan
respuestas de dolor nociceptivo son estímulos nocivos en la piel
(calor, frío), lesión de tejidos tales como desgarros de la piel y
tejidos subyacentes, e inflamación. Se puede proporcionar alivio de
dolor nociceptivo mediante analgésicos no narcóticos, tales como
aspirina, ibuprofeno o indometacina, o mediante compuestos
opioides, que tienen acción inhibitoria directa en el disparo de
fibras C. Se pueden usar ciertos anestésicos locales (p.ej.,
bupivicaína), antihistaminas, anfetaminas y antidepresivos para
aumentar los efectos de los opioides. Además, la patente compartida
de EE.UU. nº 5.364.842 revela la efectividad de composiciones de
omega-conopéptidos bloqueantes de canales de calcio
tipo N para producir analgesia o aumentar la analgesia opioide.
El dolor neuropático es dolor que resulta de la
lesión de, o cambios crónicos en, las vías somatosensoriales
periféricas o centrales, denominadas colectivamente aquí como
"trastornos de dolor neuropático". Generalmente es un síntoma
crónico que tiene una etiología compleja y variable. El daño al
nervio periférico subyacente que causa dolor neuropático es
atribuible típicamente a traumatismo o lesión del nervio periférico,
plexo nervioso o del tejido blando que rodea al nervio. El dolor
neuropático puede ser también consecuencia de una o más de varias
patologías subyacentes, que incluyen cáncer, enfermedades
degenerativas óseas, y SIDA.
El dolor neuropático se presenta en diversas
formas, que tienen componentes tanto provocados como no provocados
(espontáneos). El componente provocado del dolor neuropático implica
normalmente hipersensibilidad a estímulos sensoriales, y puede
incluir hiperalgesia (respuesta exagerada a un estímulo nocivo),
hiperestesia (respuesta exagerada al contacto) y alodinia
(percepción de dolor a partir de estímulos mecánicos o térmicos
inocuos). Los pacientes pueden experimentar también dolor
espontáneo, que tiene una diversidad de manifestaciones. Una
manifestación, denominada "causalgia", es típica de lesión del
nervio y se caracteriza por dolor urente continuo grave y alodinia.
La neuralgia es una forma de dolor neuropático que resulta de
traumatismo o irritación del nervio periférico, y tiene síntomas de
acuerdo con su etiología focal. En algunos casos (tales como
neuralgia trigeminal), el paciente experimenta dolor paroxístico,
lancinante. Las neuropatías sensoriales difusas, por contraste, se
presentan con dolor simétrico, distal, que afecta típicamente a pies
y manos. El dolor neuropático resulta también del daño a las vías
somatosensoriales centrales, tales como la vía somatosensorial
ascendente a nivel de la médula espinal, tronco cerebral, tálamo o
corteza. Tales lesiones pueden dar como resultado un síndrome de
dolor continuo espontáneo, que se siente en la periferia.
Actualmente, los clínicos pueden intentar tratar
el dolor neuropático con los mismos fármacos que son efectivos para
tratar el dolor nociceptivo; sin embargo, los resultados son en
general decepcionantes. Los intentos para tratar el dolor
neuropático han incluido, además de analgésicos no narcóticos,
opioides y anestésicos locales, el uso de anticonvulsionantes
(fenitoína), antisimpáticos, antidepresivos tricíclicos y
estimulación nerviosa transcutánea. El documento WO 93/13128 revela
que los omega conopéptidos bloqueantes de canales de calcio tipo N
producen alivio del dolor neuropático.
Una complicación de un trastorno de dolor
neuropático es su naturaleza progresiva, que da como resultado un
empeoramiento de los síntomas del dolor neuropático con el tiempo.
La etiología de esta degeneración no se comprende bien; sin
embargo, parece que los nervios dañados y los nervios adyacentes se
hacen más sensibles a niveles bajos de estimulación.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que los omega-conopéptidos
bloqueantes de canales de calcio dependientes de voltaje (CCDV)
tipo N impiden la progresión de los trastornos de dolor neuropático,
en particular cuando tales compuestos se administran en el sitio de
dolor neuropático, de forma que los síntomas del dolor no empeoran
con el tiempo.
La presente invención revela también una vía
nueva de administración de omega conopéptidos para el tratamiento
del dolor. En vista de la naturaleza hidrofílica, cargada de los
omega conopéptidos y de las propiedades de permeación de las
meninges espinales, anteriormente se creía que la administración
epidural de los omega-conopéptidos requeriría la
adición de un potenciador de permeación de membrana. Según un
descubrimiento de la presente invención, los omega conopéptidos
pueden proporcionar alivio del dolor cuando se administran
epiduralmente en ausencia de un potenciador de permeación de
membrana, a dosis que son comparables a las dosis analgésicas
efectivas que usan administración intratecal (p.ej., administración
directa al líquido cefalorraquídeo). Como se describe aquí, tal
administración epidural es particularmente efectiva cuando se lleva
a cabo de forma que el compuesto administrado se pone en contacto
prolongado con el espacio epidural, y, más particularmente, con las
meninges espinales. El método mejorado tiene la ventaja de que la
administración epidural es menos exigente técnicamente que la
administración intraespinal del compuesto, y plantea menos riesgos
para el paciente.
La presente invención revela también
formulaciones mejoradas de omega conopéptidos, que confieren
estabilidad a las disoluciones que contienen los compuestos. Tales
formulaciones son particularmente útiles en los métodos de
tratamiento prolongado (administración continua). Estas
formulaciones estabilizadas son útiles también para el
almacenamiento a largo plazo de disoluciones de conopéptidos.
En un aspecto, la invención incluye el uso de un
omega conopéptido antagonista de canales de calcio tipo N en la
fabricación de un medicamento para inhibir la progresión de un
trastorno de dolor neuropático, caracterizado por dolor
neuropático, cuando el compuesto es para ser administrado a un
individuo en el sitio de progresión de la lesión del nervio
mediante administración intratecal, epidural o intravenosa. El omega
conopéptido se caracteriza por su capacidad para (a) inhibir la
contracción estimulada eléctricamente de íleon de cobaya, y (b)
unirse selectivamente a un sitio de unión de omega conopéptido MVIIA
presente en el tejido neuronal, como se demuestra mediante la
capacidad de los compuestos para desplazar MVIIA del sitio.
Según las realizaciones preferidas, el omega
conopéptido usado en el medicamento se caracteriza además por:
(i) actividades en inhibición de contracción de
íleon de cobaya y en unión selectiva a sitio de unión de MVIIA, que
están dentro de los intervalos de tales actividades de las
omega-conotoxinas MVIIA y TVIA;
(ii) actividad en unión selectiva a sitio de
MVIIA, que se demuestra mediante una proporción de selectividad de
afinidad de unión por el sitio de unión de MVIIA respecto de la
afinidad de unión por un sitio 2, sitio de unión de omega
conopéptido, que está dentro del intervalo de proporciones de
selectividad determinado para los omega conopéptidos
MVIIA/SNX-111, SNX-199,
SNX-236, SNX-239 y
TVIA/SNX-185;
(iii) la inclusión de un antioxidante efectivo
para evitar la oxidación de metionina;
(iv) el uso mediante administración perineural
para inhibir la progresión de un trastorno de dolor neuropático en
un sitio de nervio lesionado; o
(v) la selección entre los omega conopéptidos
TVIA/SNX-185, MVIIA/SNX-111,
SNX-236, SNX-159,
SNX-239, SNX-199,
SNX-273, SNX-279, y sus
derivados.
La invención se puede llevar a cabo mediante una
formulación de omega conopéptido estable, que incluye un omega
conopéptido y una composición antioxidante de tampón de ácido
carboxílico. En una realización preferida, el tampón de ácido
carboxílico es tampón lactato, y también puede incluir metionina
libre.
En las realizaciones preferidas, el
omega-conopéptido seleccionado para uso en el
medicamento se caracteriza por:
(i) una proporción de selectividad de unión a un
sitio de unión de MVIIA y de unión a un sitio 2, sitio de unión de
omega conopéptido, que está dentro del intervalo de proporciones de
selectividad determinado para los omega conopéptidos
MVIIA/SNX-111, SNX-199,
SNX-236, SNX-239 y
TVIA/SNX-185;
(ii) la inclusión en el medicamento de un omega
conopéptido seleccionado del grupo que consiste en
MVIIA/SNX-111, TVIA/SNX-185,
SNX-236, SNX-159,
SNX-239, SNX-199,
SNX-273, SNX-279, y sus
derivados;
(iii) la administración del medicamento mediante
infusión continua; o
(iv) la inclusión de una formulación de
liberación sostenida para efectuar el contacto prolongado del
conopéptido con la región epidural.
En otras realizaciones preferidas, el
medicamento para administración epidural puede incluir uno o más de
los omega-conopéptidos
MVIIA/SNX-111, TVIA/SNX-185,
SNX-236, SNX-159,
SNX-239, SNX-199,
SNX-273, SNX-279, y sus
derivados.
Aún en otras realizaciones relacionadas, la
invención usa el omega-conopéptido
SNX-273 que tiene la secuencia:
CKGKGAKCSRLAYDCCTGSCRSGKC. La invención también hace uso de un
omega-conopéptido SNX-279 que tiene
la secuencia CKGKGAKCSRLM(O)YDCCTGSCRSGKC, en la que
M(O) indica un residuo de metionina oxidado. Estos dos
omega-conopéptidos tienen propiedades analgésicas y
son adecuados para la inclusión en los medicamentos descritos
anteriormente.
Estos y otros objetivos y características de la
invención se harán más completamente evidentes cuando se lea la
siguiente descripción detallada de la invención conjuntamente con
los dibujos adjuntos.
Las figuras 1 y 2 muestran las secuencias
primarias de varios omega-conopéptidos naturales,
MVIIA/SNX-111 (ID SEC N: 01),
MVIIB/SNX-159 (ID SEC N: 02),
GVIA/SNX-124 (ID SEC N: 03),
GVIIA/SNX-178 (ID SEC N: 04),
RVIA/SNX-182 (ID SEC N: 05),
SVIA/SNX-157 (ID SEC N: 06),
TVIA/SNX-185 (ID SEC N: 07),
SVIB/SNX-183 (ID SEC N: 08), y
MVIIC/SNX-230 (ID SEC N: 29), y
SNX-231 (ID SEC N: 21);
Las figuras 3 y 4 muestran las secuencias
primarias de MVIIA/SNX-111, que incluyen su patrón
de enlaces disulfuro y los omega-conopéptidos
análogos de SNX-111 SNX-190 (ID SEC
N: 09), SNX-191 (ID SEC N: 10),
SNX-193 (ID SEC N: 11), SNX-194 (ID
SEC N: 12), SNX-195 (ID SEC N: 13),
SNX-196 (ID SEC N: 14), SNX-197 (ID
SEC N: 15), SNX-198 (ID SEC N: 16),
SNX-199 (ID SEC N: 33), SNX-200 (ID
SEC N: 17), SNX-201 (ID SEC N: 18),
SNX-239 (ID SEC N: 32), SNX-240 (ID
SEC N: 34), SNX-273
([Ala^{12}]-SNX-111; ID SEC N:
35), y SNX-279
(Met(O)^{12}-SNX-111;
ID SEC N: 36), en las que Nle indica norleucina, y Met(O)
indica una sustitución de sulfoxi-metionina;
La Figura 5 muestra el análogo de
SVIB/SNX-183, SNX-202, y los
análogos de TVIA/SNX-185, SNX-207 y
SNX-236;
La Figura 6 muestra las agrupaciones de
omega-conopéptidos: I, MVIIA,
SNX-199 (ID SEC N: 33), MVIIB y
SNX-239 (ID SEC N: 32), II, TVIA,
SNX-207 y SNX-236, y III, RVIA,
SVIA, GVIIA, SVIB, MVIIC, SNX-231;
La Figura 7 muestra los gráficos de corrientes
de calcio dependientes de voltaje, inducidas mediante un escalón de
voltaje en células de neuroblastoma N1E-115 sin
tratar (curva a) y en células de neuroblastoma expuestas a
concentraciones crecientes de MVIIA (SNX-111)
(curvas b-d);
La Figura 8 muestra curvas de unión competitiva
ajustadas por ordenador de la unión de
omega-conopéptidos al sitio de unión de MVIIA
(SNX-111) en sinaptosomas de cerebro de rata;
La Figura 9 muestra curvas de unión competitiva
ajustadas por ordenador de la unión de
omega-conopéptidos al sitio de unión de MVIIC
(SNX-230) en sinaptosomas de cerebro de rata;
La Figura 10 muestra la eficacia analgésica de
una formulación de SNX-111 que combina metionina en
tampón lactato;
La Figura 11 muestra un gráfico de
desplazamiento de unión de [^{125}I]SNX-111
a homogeneizados de membrana piaaracnoide de mono mediante
[Nle^{12}]SNX-111;
La Figura 12 muestra histogramas de umbrales de
alodinia mecánica como %EPM a diversos tiempos tras inyección
rápida epidural de 30 \mug de SNX-111;
La Figura 13 muestra histogramas de umbrales de
alodinia mecánica como %EPM tras 24, 72, 120 ó 168 horas de
infusión intratecal continua de solución salina o 0,1 \mug/hora de
SNX-111; y
La Figura 14 muestra histogramas de umbrales de
alodinia mecánica como %EPM tras 24, 48 o 72 horas de infusión
epidural constante de solución salina o cantidades variables de
SNX-111 en el espacio epidural lumbar espinal de
ratas.
A menos que se indique de otra forma, los
términos de más adelante tienen las siguientes definiciones:
"Dolor" incluye tanto dolor somático
(nociceptivo) como dolor neuropático.
"Dolor somático" y "dolor nociceptivo"
se usan de forma intercambiable para referirse al dolor que resulta
de cualquiera de una diversidad de estímulos nocivos o dolorosos que
se originan en la piel, tejido subyacente o vísceras, y que activan
fibras nerviosas C y A aferentes nociceptivas periféricas que se
proyectan hacia la raíz dorsal de la médula espinal y que hacen
sinapsis con aferentes a áreas del cerebro específicas.
El "dolor neuropático" resulta de lesión o
cambios crónicos en vías somatosensoriales periféricas o centrales.
Etiología compleja y variable.
El daño al nervio periférico subyacente que
causa dolor neuropático es típicamente atribuible a traumatismo o
lesión en un nervio periférico, plexo nervioso o tejido blando que
rodea al nervio. El dolor neuropático también puede ser
consecuencia de una o más de varias patologías subyacentes, que
incluyen cáncer, enfermedades degenerativas óseas, y SIDA. Este
tipo de dolor se puede presentar de varias formas, como se discutió
anteriormente; sin embargo, típicamente incluye hipersensibilidad a
estímulos sensoriales, que puede estar acompañada de una sensación
persistente de dolor en la región afectada. Estas causas subyacentes
variadas de dolor neuropático se denominan colectivamente
"trastornos de dolor neuropático".
"Progresión de un trastorno de dolor
neuropático" se refiere al empeoramiento de los síntomas del
dolor neuropático con el tiempo. Se dice que un régimen terapéutico
inhibe o retarda la progresión de un trastorno de dolor neuropático
si evita o inhibe el empeoramiento de tales síntomas. Los ejemplos
específicos de trastornos de dolor neuropático incluyen, pero no se
limitan a, neuropatías centrales, tales como las que se pueden
causar por agresión a la médula espinal, neuropatías periféricas
tales como distrofia simpática refleja (DSR), neuropatía por herpes
zoster, y neuropatía diabética, neuropatías que son consecuencia de
agresión a nervios periféricos, así como dolor neuropático asociado
a causas desconocidas pero que se presenta con los síntomas clásicos
de dolor neuropático, tales como hiperestesia, alodinia, e
hiperalgesia.
"Administración perineural" significa
aplicación de agente terapéutico a, o cerca de, un nervio,
particularmente un nervio dañado.
"Administración epidural" se refiere a la
administración de un compuesto en el espacio epidural, definido
como la región entre la duramadre y la membrana aracnoide que rodea
la médula espinal dentro del canal espinal.
"Administración intratecal" se refiere a la
administración de un compuesto en el espacio subaracnoideo de la
médula espinal; por espacio subaracnoideo se alude a la región entre
la membrana aracnoide y la piamadre que rodea la médula
espinal.
La administración de un medicamento "en el
sitio de progresión de lesión del nervio" incluye cualquier medio
que colocará el medicamento en estrecha proximidad de un nervio
afectado, ganglio, sinapsis espinal, o región de tejido afectado.
Los modos de administración incluidos en este término incluyen, pero
no se limitan a, administración perineural, epidural, intratecal, e
intravenosa.
"Omega conopéptidos activos" se refiere a
péptidos que (a) bloquean canales de calcio dependientes de voltaje
tipo N, (b) se ajustan a ciertas restricciones estructurales, y (c)
tienen actividades in vitro especificadas para (i) inhibir
las contracciones estimuladas eléctricamente de íleon de cobaya, y
(ii) unirse a sitios de unión de MVIIA en membranas neuronales. Los
péptidos tienen una longitud de 25-35 aminoácidos y
se ajustan a otras restricciones de secuencia como se describió en
la Sección IIA, aquí. Las actividades in vitro están
preferiblemente dentro del intervalo de actividades medidas para los
omega conopéptidos MVIIA y TVIA en ensayos apropiados.
Esta sección describe la preparación de una
composición de omega conopéptido para uso en la inhibición de la
progresión de un trastorno de dolor neuropático, de acuerdo con la
invención.
Los omega-conopéptidos son
componentes o derivados de toxinas peptídicas producidas por
caracoles marinos del género Conus, que actúan como
bloqueantes de canales de calcio (Gray, et al., 1988). Las
secuencias primarias de ocho omega-conopéptidos
naturales se muestran en las figuras 1 y 2, en las que
SNX-231 es una forma alternativa de
MVIIC/SNX-230. Se usan las iniciales convencionales
para los residuos aminoácidos, y X representa
4-hidroxiprolina, también abreviada 4Hyp. Todos los
péptidos mostrados en la figura están amidados en sus extremos
C-terminales.
Los omega-conopéptidos útiles
para formar los medicamentos de la presente invención se ajustan a
ciertas restricciones físicas y químicas, como se describe más
adelante. En general, los omega-conopéptidos útiles
en el método de tratamiento tienen una longitud de
25-35 aminoácidos, y tienen tres enlaces disulfuro
en posiciones especificadas. Esta sección proporciona orientación
adicional para la selección de omega-conopéptidos
analgésicos; sin embargo, se aprecia que los principios
proporcionados más adelante están subordinados a los ensayos
predictivos in vitro descritos aquí.
Basándose en un análisis de homología de
secuencia de los péptidos cuyas secuencias completas son conocidas
(Figura 6), los omega-conopéptidos activos naturales
se pueden agrupar en distintos grupos, I y II, cada uno con
homologías internas distintas del otro grupo, como se puede apreciar
en la Figura 6. Un tercer grupo incluye péptidos inactivos
SNX-231, y SVIA (SNX-157) y
omega-conopéptidos cuyas actividades de unión por el
sitio de MVIIA en membranas neuronales y/o actividad en la
inhibición de norepinefrina están fuera del intervalo de los
compuestos activos.
Los tres grupos de
omega-conopéptidos están dispuestos en la Figura 6
con sus seis residuos de Cys alineados, lo que coloca estos
residuos en las posiciones 1, 8, 15, 16, 20, y 28. Para hacer esta
alineación, se introdujeron huecos en las posiciones mostradas en
los tres grupos. En el siguiente análisis, estos huecos conservan el
número asignado mostrado en la figura, aunque representan
deleciones de aminoácidos en los grupos respectivos de los
omega-conopéptidos.
La variación de secuencia en los péptidos,
basándose solamente en la estructura primaria, se analizó adoptando
las siguientes restricciones:
1. Los péptidos en ambos grupos activos (I y
II) incluyen los residuos de Cys en posición 1, 8, 15, 16, 20, y
28.
2. Los péptidos en los grupos activos
incluyen tres enlaces disulfuro que conectan los residuos de Cys en
las posiciones 1 y 16, 8 y 20, y 15 y 28. Esta restricción excluye
las variaciones de aminoácidos en otras posiciones que impiden o
dificultan de otra manera la formación de los tres puentes
seleccionados.
3. Dentro del grupo I, las variaciones de
aminoácidos que ocurren en los siete residuos no conservados están
permitidas, incluyendo los péptidos en los que el extremo carboxilo
está amidado o tiene forma de ácido libre. Es decir, los derivados
de compuestos del primer grupo incluyen las estructuras peptídicas
que tienen la forma: C K G K G
A-X_{1}-C-X_{2}-X_{3}-X_{4}-X_{5}-Y
D C C T G S
C-X_{6}-R-X_{7}-G
K C-t, en la que X_{1}=K o S; X_{2}=S o H;
X_{3}=R, L, o A; X_{4}=L o T; X_{5}=M o S; X_{6}=N o una
deleción; X_{7}=S o deleción, y t= grupo carboxiterminal
carboxilo o amidado.
4. Dentro del grupo II, las variaciones de
aminoácidos que ocurren en los cuatro residuos no conservados están
permitidas, incluyendo los péptidos en los que el extremo carboxilo
está amidado o tiene forma de ácido libre. Así, los derivados de
compuestos del segundo grupo incluyen las estructuras peptídicas que
tienen la forma: C L S X G S S C
S-X_{1}X_{2}X_{3}-Y N C C R S
C N-X_{4}-Y S R K C
R-t, en la que X_{1}=X o R; X_{2}=T o L;
X_{3}=S o M, X_{4}=X o P; y t= grupo carboxiterminal carboxilo o
amidado.
5. Considerando juntos ambos grupos activos,
las posiciones de aminoácidos que se conservan en todas las
especies activas están conservadas. Así, por ejemplo, los residuos
de Cys, la glicocola de la posición 5, la tirosina de la posición
13, la serina de la posición 19, y la lisina de la posición 26 están
conservados. Los análogos o derivados de OCT preferidos se pueden
seleccionar comparando, a efectos de conservación y sustitución
entre secuencias, aquellas secuencias que se sabe que son
activas.
6. Considerando juntos ambos grupos activos,
hay posiciones de aminoácidos que son probablemente variables
dentro del intervalo de especies activas. Por ejemplo, el aminoácido
de la posición 2 puede ser lisina o leucina, el aminoácido de la
posición 3 puede ser glicocola o serina, y el aminoácido de la
posición 4, hidroxiprolina o arginina. Además, si dos o más
aminoácidos de una posición variable están en una clase de
sustitución común, la sustitución dentro de esa clase puede ser
favorable. Las clases de sustitución estándar son las seis clases
basadas en las propiedades de cadena lateral comunes, y la
frecuencia más alta de sustitución en proteínas homólogas en la
naturaleza, como se determinó, por ejemplo, mediante una matriz de
intercambio de frecuencia de Dayhoff estándar (Dayhoff). Estas
clases son la clase I: Cys; clase II: Ser, Thr, Pro, Hyp, Ala, y
Gly, que representan cadenas laterales alifáticas pequeñas y
cadenas laterales con grupo OH; clase III: Asn, Asp, Glu, y Gln,
que representan cadenas laterales neutras y cargadas negativamente
capaces de formar enlaces de hidrógeno; clase IV: His, Arg, y Lys,
que representan cadenas laterales polares básicas; clase V: Ile,
Val, y Leu, que representan cadenas laterales alifáticas
ramificadas, y Met; y clase VI: Phe, Tyr, y Trp, que representan
cadenas laterales aromáticas. Además, cada grupo puede incluir
análogos de aminoácidos relacionados, tales como ornitina,
homoarginina, N-metil lisina, dimetil lisina, o
trimetil lisina en la clase IV, y una tirosina halogenada en el
grupo VI. Además, las clases pueden incluir tanto estereoisómeros L
como D, aunque se prefieren los L-aminoácidos para
las sustituciones.
7. Considerando las especies inactivas
conocidas (grupo III), las sustituciones de aminoácidos que están
presentes en las especies inactivas, pero no en las activas, en
cualquier posición de residuo seleccionada, no están favorecidas
para conservar la actividad en los compuestos activos.
Las reglas 6-7 anteriores de
selección de aminoácidos pretenden ser una guía de sustituciones de
aminoácidos permitidas dentro de los
omega-conopéptidos activos. Una vez que se hace una
sustitución o modificación de aminoácido, el péptido se criba
posteriormente en cuanto a las propiedades in vitro
necesarias que son identificadas por la presente invención como
predictivas de actividad antagonista de canales de calcio, y las
actividades in vivo necesarias en modelos animales
apropiados de dolor.
Esta sección describe las propiedades in
vitro de omega conopéptidos activos. Los omega conopéptidos
activos (i) bloquean canales de calcio dependientes de voltaje tipo
N, (ii) son selectivos, específicos, uniéndose al sitio de unión
del omega conopéptido MVIIA (sitio 1) en membranas neuronales, y
(iii) inhiben la liberación de neurotransmisor en el ensayo de
contracción de íleon de cobaya, como se discute más adelante.
Los omega conopéptidos activos inhiben la
transmisión de iones de calcio a través de canales de calcio
dependientes de voltaje (CCDV) tipo N. El bloqueo de CCDV tipo N se
puede medir en un sistema celular aislado, tal como la línea
celular de neuroblastoma de ratón, cepa N1E115 o la línea celular
IMR32 de neuroblastoma humano, como se describió en la patente de
EE.UU. 5.364.842. Las corrientes de calcio tipo N se bloquean
mediante el omega conopéptido MVIIA, pero no mediante
dihidropiridinas. Las corrientes de membrana se miden
convenientemente con la configuración celular completa del método
de control en parche, según el procedimiento detallado en el
Ejemplo 1.
La Figura 7 muestra un gráfico de una corriente
de calcio hacia dentro provocada mediante un escalón de voltaje de
-80 mV a -20 mV, en la que el bario (Ba) reemplazó al calcio (Ca)
como portador de carga a través de los canales de calcio
(McCleskey, E.W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:4327-31 (1987)). La curva a muestra una
gráfica de control en presencia de nifedipina, un bloqueante de
canales de calcio tipo L que no tuvo efecto en las características
de corriente del canal. Las curvas b-d
muestran el bloqueo del canal mediante la adición de
concentraciones crecientes de omega conopéptido MVIIA. Los
conopéptidos usados en los medicamentos de la presente invención
también bloquean esta corriente.
Una característica de los
omega-conopéptidos activos es su capacidad para
unirse a una población específica de sitios de unión presentes
principalmente en tejido neuronal. Las dihidropiridinas y otros
bloqueantes de canales tipo L no desplazan la unión de omega
conotoxinas de estos sitios.
Esta afinidad de unión se puede caracterizar
mediante la constante de unión del compuesto por el sitio de unión
de alta afinidad de MVIIA (SNX-111), también
denominado "sitio 1" aquí, y/o la constante de unión del
compuesto por el sitio de unión de alta afinidad de SVIB
(SNX-183) o de MVIIC (SNX-230),
también denominado "sitio 2" aquí. Las características de
estos dos sitios de unión distintos se resumen más adelante. También
es útil caracterizar los omega-conopéptidos según
la proporción de sus constantes de unión medidas para la unión a
los dos sitios de unión.
La unión al sitio de unión de MVIIA en tejido
neuronal se puede demostrar en una diversidad de tipos celulares y
fracciones celulares de sinaptosomas. Una fracción de sinaptosomas
preferida es una preparación de membrana de sinaptosomas de cerebro
de mamífero, tal como la preparación de sinaptosomas de cerebro de
rata descrita aquí en el Ejemplo 2. La constante de unión de un
compuesto por el sitio de unión de MVIIA se mide típicamente en un
ensayo de desplazamiento competitivo, en el que un compuesto de
prueba compite con MVIIA (SNX-111) marcado
radiactivamente para unirse a la preparación de sinaptosomas.
Usando el análisis de Scatchard convencional de
un experimento de unión en equilibrio de saturación, se calculó una
constante de unión K_{d} de aproximadamente 10 pM para la unión de
omega conopéptido MVIIA a membranas de sinaptosomas. Del mismo
modo, se determinaron K_{d}s para la unión de SVIB
(SNX-183) y MVIIC (SNX-230)
marcados radiactivamente a sitios de unión en membranas de
sinaptosomas.
Para determinar la constante de unión de un
compuesto bloqueante de CCDV tipo N de prueba por un sitio de
unión, se añade el compuesto de prueba, en concentraciones
crecientes, a una preparación de membrana, tal como una preparación
de sinaptosomas, en presencia de una concentración estándar de
omega-conopéptido MVIIA (SNX-111)
marcado radiactivamente. Después se filtra rápidamente el material
de sinaptosomas, se lava y se ensaya el marcador radiactivo unido.
Se analizan las curvas de unión de desplazamiento competitivo, tales
como las que se muestran en la Figura 8 para el desplazamiento de
unión de MVIIA, para determinar primero el valor de CI_{50} del
compuesto para el sitio de unión de MVIIA, es decir, la
concentración que da un 50% de desplazamiento de péptido MVIIA
marcado. Se determina una K_{i} según métodos estándar a partir
del valor de K_{d} de MVIIA y el valor CI_{50} del compuesto,
como se detalla en el Ejemplo 2. También se puede calcular un valor
de potencia relativa a partir de esta información, como se describe.
Igual que el valor de K_{i}, este valor permite comparaciones
entre ensayos realizados en condiciones ligeramente diferentes o en
momentos distintos. Aunque el valor de CI_{50} específico para un
compuesto particular puede variar de preparación a preparación, la
jerarquía de afinidades de unión entre compuestos debería permanecer
esencialmente igual entre experimentos. Al probar un compuesto para
determinar si será útil para su inclusión en un medicamento de la
presente invención, se compara la potencia del compuesto de prueba
con compuestos estándar (tales como MVIIA y GVIA) dentro de una
preparación dada, para determinar si el compuesto de prueba desplaza
la unión de MVIIA dentro de un intervalo de potencia considerado
útil en los métodos de la invención, como se discute más
adelante.
Los valores de CI_{50} calculados para varios
omega-conopéptidos para la unión de MVIIA
(SNX-111) a un sitio de unión de MVIIA ("sitio
1") en una preparación de sinaptosomas de rata se dan en la Tabla
1. Los compuestos están dispuestos por orden de valores de
CI_{50} crecientes, en donde los valores inferiores se asocian a
mayor afinidad por el sitio de unión.
Del mismo modo, se pueden calcular los valores
de CI_{50} y K_{i} para la unión de compuesto al sitio de unión
"sitio 2" (SVIB/SNX-183 o
MVIIC/SNX-230), como anteriormente, determinando la
K_{d} de la unión de SVIB (SNX-183) o MVIIC
(SNX-230) marcados a una preparación de
sinaptosomas, usando después desplazamiento competitivo del
compuesto marcado por el compuesto de prueba, para determinar
CI_{50} y K_{i} o valores de potencia relativa del compuesto de
prueba. La Figura 9 muestra curvas de unión competitiva ajustadas
por ordenador para diversos omega-conopéptidos cuya
unión a los sitios de unión de SVIB (SNX-183) y/o
MVIIC (SNX-230) se examinó. A partir de estas
curvas, se determinaron los valores de CI_{50}.
Las tablas 2 y 3 enumeran las potencias
relativas de unión de diversos omega-conopéptidos a
los sitios de unión 1 y 2. Estos datos ilustran cómo se pueden usar
los valores de K_{i} (Tabla 2) o CI_{50} (Tabla 3) para
calcular proporciones de selectividad de unión a los sitios.
En general, los omega conopéptidos útiles para
formar medicamentos de la presente invención tendrán afinidades de
unión por el sitio de MVIIA, o proporción de selectividad por el
sitio de MVIIA respecto del sitio 2, dentro del intervalo de
afinidades determinado para los omega conopéptidos MVIIA y TVIA. Más
en general, el intervalo de proporciones de selectividad se
definirá mediante los omega conopéptidos
MVIIA/SNX-111, SNX-199,
SNX-236, SNX-239 y
TVIA/SNX-185.
| ^{a}Los valores de K_{i} se derivaron del análisis de unión competitiva realizado como se describe en la Figura 8. |
| ^{b}La selectividad se expresa como la proporción del valor de K_{i} determinado para competición con unión de |
| \hskip0.1cm [^{125}I]-SNX-230 de alta afinidad dividido por el valor de K_{i} para competición con unión de [^{125}I]-SNX-111. |
| ^{a}La selectividad se expresa como la proporción del valor de CI_{50} determinado para competición con unión de |
| \hskip0.1cm [^{125}I]-SNX-230 dividido por el valor de CI_{50} para competición con unión de [^{125}I]-SNX-111. |
Los omega-conopéptidos activos
también inhiben la liberación de neurotransmisor en diversas
regiones del sistema nervioso. Los neurotransmisores que se pueden
medir, de acuerdo con diversos aspectos de la invención, incluyen,
pero no se limitan a, dopamina, norepinefrina, acetilcolina, GABA,
glutamato, y varios neurotransmisores peptídicos, tales como el
péptido relacionado genéticamente con calcitonina.
Los ensayos en tejido aislado son métodos
farmacológicos tradicionales para medir los efectos sobre la
liberación de neurotransmisor. Una preparación de este tipo es el
íleon de cobaya, en el que la inhibición de contracciones
estimuladas eléctricamente se correlaciona con la inhibición de
liberación de acetilcolina. El Ejemplo 4 describe la preparación y
ensayo con detalle. La Tabla 4 muestra los valores de CI_{50} para
diversos omega-conopéptidos en la contracción de
íleon de cobaya en respuesta a estimulación eléctrica. Los omega
conopéptidos activos SNX-111 y
SNX-185 son los más potentes inhibiendo tal
contracción, mientras los compuestos inactivos
SNX-183 y SNX-157 son mucho menos
potentes.
En resumen, los omega conopéptidos bloqueantes
de CCDV tipo N que son útiles en la fabricación de medicamentos de
la presente invención muestran ciertas propiedades in vitro y
farmacológicas, inhibiendo la contracción estimulada eléctricamente
en íleon de cobaya, y uniéndose selectivamente a sitios de unión de
MVIIA en tejido neuronal, como se observó para los omega
conopéptidos MVIIA/SNX-111,
TVIA/SNX-185, SNX-236,
SNX-159, SNX-239,
SNX-199, SNX-273 y
SNX-279.
Una vez seleccionado para el uso en un
medicamento según los criterios in vitro anteriormente
mencionados, el omega-conopéptido activo se puede
probar en cualquiera de varios modelos experimentales animales de
neuropatía para determinar los intervalos de dosificación para
humanos.
Los omega-conopéptidos se pueden
producir mediante métodos sintéticos convencionales o aislarse a
partir de fuentes naturales. Los péptidos sintéticos y naturales
que tienen la misma secuencia se comportan sustancialmente de forma
idéntica al usarlos en los medicamentos descritos aquí. Todos los
omega-conopéptidos mostrados tienen tres enlaces
disulfuro que conectan los residuos de cisteína 1 y 4, 2 y 5, y 3 y
6, como se indica para el péptido MVIIA en la Figura 3. Las figuras
3-5 muestran análogos o derivados de los omega
conopéptidos naturales MVIIA, TVIA, y SVIB que se han sintetizado y
probado de acuerdo con la invención. Se usan los códigos estándar
de aminoácidos de una sola letra en las figuras; además, se usan las
siguientes abreviaturas: X=hidroxiprolina; Nle=norleucina;
Met(O)=sulfoxi-metionina; el grupo NH_{2} en el extremo C-terminal indica que el péptido está amidado en el extremo C-terminal; G-OH indica terminación en un residuo de glicocola no modificado.
Met(O)=sulfoxi-metionina; el grupo NH_{2} en el extremo C-terminal indica que el péptido está amidado en el extremo C-terminal; G-OH indica terminación en un residuo de glicocola no modificado.
Muchos omega conopéptidos están disponibles de
fuentes comerciales (p.ej., MVIIA, GVIA, MVIIC están disponibles de
Bachem, Torrance, CA; SVIB está disponible de Peninsula
Laboratories, Belmont, CA). Los omega-conopéptidos
se pueden sintetizar también mediante métodos en fase sólida
convencionales, tal como se han descrito (Olivera, B., et al.,
Biochemistry 23:5087-5090 (1984);
patentes de EE.UU. 5.051.403 y 5.364.842). Los tres enlaces
disulfuro de los péptidos se pueden formar mediante oxidación al
aire en presencia de ditiotreitol (DTT), u opcionalmente otros
compuestos que contienen tiol (p.ej., cisteína, glutatión), y
purificarse posteriormente según los procedimientos descritos en
otra parte (documento WO 93/13128).
Las disoluciones de SNX-111 en
las que la concentración de péptido es menor de alrededor de 0,1
mg/ml se oxidan rápidamente al disolverlas en agua, solución
salina, o cualquiera de varios tampones usados en la técnica de
química de péptidos. Tal oxidación da como resultado una reducción o
pérdida de actividad biológica. De acuerdo con un aspecto de la
presente invención, se ha descubierto que los
omega-conopéptidos se pueden estabilizar
significativamente en disolución evitando la oxidación de los
residuos de metionina presentes en la estructura peptídica. En
particular, SNX-111, que contiene una metionina en
la posición 12, es aproximadamente 10 veces menos potente en la
unión a sitios de unión de omega-conopéptido MVIIA
cuando su metionina está presente en forma sulfóxido.
En los experimentos llevados a cabo en apoyo de
la presente invención, se descubrió que la oxidación de
SNX-111 se puede evitar mediante la adición de
tampón de ácido carboxílico (lactato) a la disolución de péptido.
Las disoluciones de SNX-111 que oscilan de
0,01-0,1 mg/ml son estables a 45ºC durante varias
semanas al estabilizarlas con lactato (150 mM, pH
4-4,5). Además, los tampones que contienen metionina
50 \mug/ml son efectivos también estabilizando
SNX-111. Aquí, se puede usar tampón lactato 150 mM o
solución salina acidificada (pH 4-4,5) para
tamponar la disolución.
Tales formulaciones de
omega-conopéptidos estables son útiles para
almacenamiento o para uso en métodos que implican la infusión lenta
del compuesto. La disolución se puede administrar directamente o
neutralizar antes de la administración, según la vía particular de
administración en la que se usa la formulación. Por ejemplo, se han
administrado aproximadamente 10 \mul de SNX-111 en
tampón lactato (150 mM, pH 4-4,5) directamente en
médulas espinales de rata (intratecalmente) sin efectos adversos
sensibles. La Figura 10 muestra los resultados de experimentos que
demuestran que SNX-111 administrado como formulación
de metionina-lactato es tan efectivo como
SNX-111 solo para reducir el dolor neuropático.
Las formulaciones adicionales pueden incluir
medios para aumentar la permeación del conopéptido a través de los
tejidos meníngeos que pueden rodear el nervio dañado o nervio diana.
Los medios para aumentar el transporte de compuesto se conocen en
la técnica y pueden incluir encapsular el conopéptido en membranas
liposomales, adición de un tensoactivo a la composición, adición de
un agente de pares iónicos, y similares. El transporte
transmeníngeo se puede facilitar también administrando al individuo
una disolución de dosificación hipertónica efectiva para
desestabilizar las barreras meníngeas, según métodos bien conocidos
en la técnica. Alternativamente, el transporte transmeníngeo o
transcutáneo se puede facilitar adicionalmente modificando la
secuencia primaria del omega-conopéptido, por
ejemplo sustituyendo cadenas laterales de aminoácidos neutros o
restos hidrofóbicos por residuos catiónicos.
Es descubrimiento de la presente invención que
la progresión de los trastornos de dolor neuropático se puede
retardar en un individuo que exhibe síntomas de estadio temprano de
dolor neuropático, administrando al individuo un omega conopéptido
bloqueante de CCDV tipo N que tiene las características físicas y
farmacológicas descritas anteriormente, particularmente cuando tal
administración se localiza en el sitio neuropático.
Esta sección describe los diversos modos de
administración que se pueden usar para prevenir la progresión de
los trastornos de dolor neuropático. Esta sección describe también
un modelo ejemplar de trastorno de dolor neuropático caracterizado
por alodinia (sensibilidad a estímulo débil) en el cual se usa un
medicamento de omega conopéptido para evitar la progresión del
trastorno.
El modelo de alodinia en rata descrito en el
Ejemplo 5 es un modelo ejemplar de un trastorno de dolor
neuropático. Este modelo proporciona un ejemplo de cómo los
medicamentos de la presente invención se pueden usar para inhibir
la progresión del dolor neuropático. Además, se ha usado el modelo
para evaluar intervenciones y terapéutica efectivas para inhibir la
progresión del dolor neuropático.
En el modelo, después de la ligadura
experimental de un nervio, los síntomas de dolor neuropático se
incrementan en los días 1-7 tras la agresión al
nervio, con una meseta de respuesta al dolor después. Se evalúa un
omega conopéptido activo seleccionado de acuerdo con los principios
resumidos en la Sección II anterior, en cuanto a su capacidad para
inhibir o evitar tal progresión de neuropatía durante los días
1-7, administrando el compuesto al individuo de
prueba justo antes, durante o después de la agresión al nervio. Se
miden las respuestas de dolor umbrales en un paradigma estándar en
los días 1-7, o más, tras la agresión por ligadura.
Tal administración de omega-conopéptido se lleva a
cabo según cualquiera de los métodos descritos en la subsección 2,
más adelante.
En este modelo ejemplar, la inhibición de la
progresión del trastorno de dolor neuropático se observa cuando hay
un umbral aumentado al estímulo doloroso durante los días
1-7, o cuando hay una prolongación del tiempo de
meseta, comparado con los animales neuropáticos de control.
Se pueden extrapolar las dosificaciones y
formulaciones eficaces determinadas en este modelo a animales
grandes equivalentes y a dosificaciones humanas, según los métodos
bien conocidos de la técnica.
Esta sección describe diversos modos de
administración que se pueden usar para administrar
omega-conopéptidos activos al sitio de progresión
de dolor neuropático, para inhibir tal progresión, de acuerdo con la
presente invención.
Administración perineural. Los
medicamentos que contienen omega conopéptidos bloqueantes de CCDV
tipo N se pueden administrar perineuralmente para evitar la
progresión de trastornos de dolor neuropático. Aquí, los compuestos
se administran directamente al nervio afectado, o a regiones de piel
afectada, caracterizadas por la proliferación de crecimiento de
neuritas subsiguiente al daño del nervio. Para administración a las
regiones de piel afectadas, el compuesto se puede administrar
tópicamente, directamente o con el uso de un aplicador
transdérmico.
Alternativamente, el medicamento se puede
inyectar subdérmicamente a la región del nervio. En otra forma de
administración perineural, se puede usar un manguito alrededor del
nervio dañado, en la que el manguito está hecho de una matriz
biodegradable que incluye un compuesto terapéutico bloqueante de
canales de calcio tipo N. Alternativamente o además, el compuesto
terapéutico se puede poner en proximidad estrecha del nervio dañado
conjugando el compuesto a, o revistiendo el compuesto sobre, una
férula de nervio diseñada para reparar nervios dañados. Las
patentes de EE.UU. 4.534.349 y 4.920.962 proporcionan ejemplos de
tales férulas de nervio. La administración perineural se puede
efectuar también incorporando omega conopéptidos activos en
materiales de sutura, tales como el material de sutura basado en
colágeno descrito en la patente de EE.UU. 5.308.889. Este material
se usa después para suturar tejidos dañados, tales como los debidos
a traumatismo o cirugía.
El compuesto se puede administrar también a
sitios perineurales vía administración transdérmica. En general, la
administración transdérmica implica el uso de un "parche"
transdérmico que permite la administración lenta del compuesto a
una región de piel seleccionada. Para la administración transdérmica
de omega-conopéptidos, la administración
transdérmica se puede llevar a cabo preferiblemente usando métodos
iontoforéticos, tales como los descritos en la patente de EE.UU.
5.032.109 (sistema de administración transdérmica de electrolitos),
y en la patente de EE.UU. 5.314.502. Puede ser deseable incluir
sustancias potenciadoras de permeación, tales como sustancias
liposolubles (p.ej., ácidos carboxílicos alifáticos, alcoholes
alifáticos), o sustancias hidrosolubles (p.ej., polioles de alcanos
tales como etilenglicol, 1,3-propanodiol, glicerol,
propilenglicol, y similares). Alternativamente, la patente de
EE.UU. 5.362.497 describe una "resina superabsorbente de agua"
que se puede añadir a formulaciones transdérmicas para aumentar
adicionalmente la administración transdérmica. Los ejemplos de
tales resinas incluyen, pero no se limitan a, poliacrilatos,
copolímeros de éster de acetato de vinilo-ácido acrílico
saponificados, copolímeros de poli(alcohol
vinílico)-anhídrido maleico reticulados, polímeros
de injerto de poliacrilonitrilo saponificado, polímeros de injerto
de almidón ácido acrílico, y similares. Tales formulaciones se
pueden usar también en apósitos oclusivos en la región de
interés.
Para liberación retardada, el compuesto
bloqueante de CCDV tipo N se puede incluir en una composición
farmacéutica formulada para liberación lenta, tal como en
microcápsulas hechas a partir de polímeros biocompatibles conocidos
en la técnica. Para liberación continua de péptidos, el péptido se
puede conjugar covalentemente a un polímero soluble en agua, tal
como una polilactida o un hidrogel biodegradable derivado de un
copolímero en bloque anfipático, como se describió en la patente de
EE.UU. 5.320.840. Los implantes de matriz basada en colágeno, tales
como los descritos en la patente de EE.UU. 5.024.841, son útiles
también para administración sostenida de terapéutica peptídica.
También es útil, particularmente para administración subdérmica de
liberación lenta a regiones perineurales, una composición que
incluye un polímero biodegradable que es autopolimerizable y que
forma un implante in situ, tras administración en forma
líquida. Tal composición se describe, por ejemplo, en la patente de
EE.UU. 5.278.202.
Aunque las dosificaciones variarán según las
características físicas del propio paciente, se debería seleccionar
una dosis para proporcionar una administración de entre alrededor de
1 y 100 \mug/g de tejido en la región afectada.
Administración intratecal. Los
medicamentos de la invención se pueden administrar también a
aquellas regiones de la médula espinal, tales como las regiones del
asta dorsal en niveles vertebrales afectados, en los que ocurre la
retransmisión polisináptica de la sensación de dolor. Este tipo de
aplicación local se puede efectuar mediante administración
intratecal, como se describió en el documento WO 93/13128.
Los omega conopéptidos activos se pueden
administrar intratecalmente mediante infusión lenta. Son conocidas
en la técnica varias bombas implantables o instalables en el cuerpo
útiles para administrar compuesto a una velocidad regulada. La
bomba descrita en la patente de EE.UU. 4.619.652 es una bomba
instalable en el cuerpo, que se puede usar para administrar
compuesto a un caudal tónico o en pulsos periódicos. Cuando se
administra el omega conopéptido activo MVIIA a humanos por vía
intratecal de flujo continuo, pueden ser necesarias dosis en el
intervalo aproximado de 0,1-500 ng/kg/h para
conseguir una concentración terapéutica del compuesto.
Administración epidural. La
administración a regiones de la médula espinal también puede ser
mediante inyección epidural a una región de la médula espinal
exterior a la membrana aracnoidea. Se aprecia adicionalmente que
para la administración de omega conopéptidos por esta vía, puede ser
ventajoso añadir a la composición de conopéptido medios para
aumentar la permeación del conopéptido a través de las membranas
meníngeas. Tales medios se conocen en la técnica, e incluyen
encapsulación liposomal, o adición de un tensoactivo o un agente de
pares iónicos a la composición de péptido. Alternativamente, o
además, se puede realizar la permeación incrementada de la membrana
aracnoide administrando una disolución de dosificación hipertónica
efectiva para incrementar la permeabilidad de las barreras
meníngeas.
Según otro aspecto de la invención descrita
aquí, la administración epidural de omega conopéptidos activos se
puede llevar a cabo también administrando los
omega-conopéptidos epiduralmente sin adición
de un agente permeabilizante de membrana. Este aspecto de la
invención se discute en la Sección IIIB, más adelante.
Administración intravenosa. Se puede usar
administración intravenosa de omega conopéptidos activos para
conseguir concentraciones terapéuticas de compuesto en regiones
perineurales y/o en sinapsis espinales, de acuerdo con los
principios de tratamiento descritos anteriormente. Para conseguir
niveles intraespinales efectivos de omega conopéptido, pueden ser
necesarias dosis humanas equivalentes a un intervalo de dosis de
0,1-15 mg/kg en rata. Además, el compuesto se puede
administrar mediante infusión intravenosa continua a una velocidad
de 1-10 mg/kg/h para conseguir niveles
terapéuticos.
El descubrimiento adicional de la presente
invención es que se puede producir analgesia mediante administración
epidural de un omega conopéptido, sin la adición de agentes
permeabilizantes de membrana a la composición. Este descubrimiento
fue inesperado, basado en las propiedades hidrofílicas, cargadas de
los omega conopéptidos, y la permeabilidad relativamente baja de
las membranas meníngeas que rodean el espacio epidérmico a los
compuestos que tienen tales propiedades fisicoquímicas.
Este resultado inesperado se puede explicar en
parte mediante los resultados de experimentos llevados a cabo en
apoyo de la presente invención, a partir de los cuales se ha
determinado que las membranas meníngeas espinales poseen sitios de
unión específicos, de relativamente baja afinidad para los omega
conopéptidos (Ejemplo 3, Figura 11). Sin suscribirse a una teoría
mecanicista particular, tal unión puede proporcionar un fundamento
para los resultados observados in vivo. La curva de unión
competitiva muestra baja unión no específica (aproximadamente 20%),
y un coeficiente de Hill cercano a uno, coherente con la unión a un
único sitio de baja afinidad. El valor de CI_{50} calculado es 41
\muM.
En experimentos llevados a cabo en apoyo de la
invención, se demuestra que los omega-conopéptidos
activos, como se definió anteriormente, pueden producir analgesia
en individuos al administrar estos compuestos epiduralmente a dosis
que son equivalentes a, o sólo ligeramente más altas que, una dosis
intratecal (intraespinal) efectiva del mismo compuesto. Las dosis
intratecales efectivas determinadas en ratas sometidas al modelo de
alodinia en ratas de neuropatía periférica descrito en el Ejemplo 5
oscilan de 0,1-0,3 \mug (SNX-239,
SNX-159, SNX-273,
SNX-279, SNX-111). Cuando se dan
mediante infusión intratecal continua, la dosis total de omega
conopéptido activo necesaria para producir analgesia es casi la
misma (2,4 \mug de SNX-111) que la dosis en
inyección rápida.
En experimentos ejemplares llevados a cabo en
apoyo de la presente invención, una dosis epidural de 30 \mug de
SNX-111 es efectiva para producir analgesia en una
rata sometida a neuropatía periférica (Figura 12). Esta dosis está
dentro del intervalo efectivo (3-30 \mug) de una
dosis intratecal de SNX-111 en el mismo modelo
experimental. Más sorprendentemente, el omega conopéptido activo
SNX-111 produjo analgesia en dosis comparables al
administrarlo mediante infusión intratecal constante a 0,5 \mug/h
(Figura 13) o infusión epidural constante a 0,1, 0,3 ó 1,0 \mug/h
(Figura 14). Cuando el compuesto se administra de esta manera, está
en contacto prolongado con la región epidural. A partir de estos
datos se puede ver que tal contacto prolongado es deseable en la
administración epidural. Otras formas útiles de proporcionar
contacto prolongado, tales como por medio de formulaciones de
liberación sostenida, se conocen en la técnica, y se revelan en la
Sección IIIA2, anteriormente.
Al poner en práctica la invención, se da a un
individuo que experimenta dolor, por medio de procedimientos de
administración epidurales estándar, una dosis analgésica efectiva de
un omega conopéptido activo, según esa expresión se define en las
secciones I y II, anteriormente. Por "dentro del intervalo" se
quiere decir que la dosis debería estar dentro de ± un orden de
magnitud de la dosis intratecal efectiva, y más preferiblemente
dentro de ± 0,5 unidades logarítmicas de la dosis. Así, en el
ejemplo descrito anteriormente, en el que una dosis total de
1-3 \mug de SNX-111 es efectiva
intratecalmente para producir analgesia en una rata, el intervalo
para administración epidural será de alrededor de
0,1-30 \mug.
En humanos, se ha descubierto que
SNX-111 proporciona analgesia cuando se da como
infusión continua intratecalmente a una dosis de entre 0,3 y 300
ng/kg/h durante un periodo de 24 horas. Aunque la dosis exacta
dependerá del tamaño y otros atributos fisiológicos del individuo,
una dosis epidural humana estará dentro del intervalo de dosis
necesario para la analgesia cuando el compuesto se da
intratecalmente. Basándose en lo anterior, se podría esperar que
una dosis epidural efectiva en humanos esté en el intervalo de
0,3-3000 ng/kg/h.
Aunque se prefiere dar la dosis epidural
mediante infusión continua durante al menos 24 horas, esto y los
parámetros de dosificación los ajustará el clínico, según las
necesidades del paciente concreto, en el marco de los protocolos
clínicos estándar para regular la medicación del dolor. Se puede
determinar información adicional acerca de la dosificación respecto
de modelos animales estándar conocidos en la técnica, de acuerdo
con principios farmacocinéticos estándar.
Además del modelo de alodinia en ratas de
neuropatía periférica descrito anteriormente, se pueden usar otros
modelos animales estándar, tales como el modelo de sacudida de cola
en rata o el modelo de formalina en rata, para determinar la
eficacia y para estimar las dosis para tratar el dolor nociceptivo
usando administración epidural de un
omega-conopéptido activo. En general, las dosis
antinociceptivas son más bajas que las dosis necesarias para
producir analgesia en pacientes que sufren dolor neuropático.
Las formulaciones estabilizadas, como se
describieron en la Sección IIC, anteriormente, son útiles para
fabricar los medicamentos para administración epidural, y así
forman parte de la invención. Aunque puede ser deseable neutralizar
las disoluciones antes de la administración, las formulaciones que
utilizan lactato o solución salina acidificada como excipiente se
pueden administrar también directamente por medio de inyección
rápida aguda epidural o intratecal, o mediante otras vías para las
que se usan apropiadamente los excipientes acidificados. La
neutralización, si es necesaria, se puede conseguir mediante
disolución en un tampón excipiente de neutralización
farmacéuticamente aceptable, justamente antes de la administración
al individuo.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar
diversas características del método de la invención, pero no
pretenden de ninguna forma limitar el alcance de la invención.
Se examinaron las corrientes iónicas a través de
canales de calcio en células a las que se controló el voltaje
mediante un electrodo de control en parche único. Estos estudios de
control en parche en células enteras se realizaron en células de
neuroblastoma de ratón N1E115, aunque se puede usar también una
diversidad de tipos celulares, que incluye la línea celular
IMR-32 de neuroblastoma humano, para determinar la
actividad antagonista de calcio.
Se diseñaron disoluciones de baño para permitir
la medida de canales de calcio en ausencia de otros canales. Las
disoluciones se prepararon según protocolos estándar, y contenían
N-metil-D-glucamina
(NMDG) 80 mM (como sustituto de sodio), cloruro de tetraetilamonio
(TEACl) 30 mM (para bloquear las corrientes de potasio), BaCl_{2}
10 mM (como portador de carga a través de los canales de calcio), y
HEPES a pH 7,3 10 mM. Algunas disoluciones contenían también
quinidina 2 mM (para bloquear las corrientes de potasio) y
tetrodotoxina 3 \muM (para bloquear las corrientes de sodio). La
solución salina normal del baño fue (mM): NaCl 140, glucosa 10, KCl
3, CaCl_{2} 2, MgCl_{2} 1, HEPES pH 7,3 10 mM. Las disoluciones
intracelulares contenían CsCl 150 mM, CaCl_{2} 0,5 mM, EGTA 5 mM,
MgCl_{2} 5 mM, K_{2}ATP a pH 7,3-7,4 2 mM. Se
filtraron la solución salina de baño y todas las disoluciones
internas antes de
su uso.
su uso.
Las pipetas estaban hechas de vidrio Corning
7052 (Garner Glass Company, Claremont, CA 91711), revestidas con
Sylgard (Dow Corning, Midland, MI 48640) y pulidas al fuego antes de
su uso. Los números de burbuja fueron típicamente 5 a 6, con
resistencias de pipeta típicamente 2-5 Mohmios. Se
usaron también Corning 8161, Kimble, y otros vidrios, sin efecto
sensible sobre las corrientes de calcio observadas.
Se llevaron a cabo registros a temperatura
ambiente con un amplificador Axopatch 1-C (Axon
Instruments, Foster City, CA 94404) y se analizaron con soporte
lógico pCLAMP (Axon Instruments). Se filtraron los datos a 1000 Hz
para una velocidad de muestreo típica de 0,1 kHz; se realizó el
análisis en pantalla con salida de impresión por una
Hewlett-Packard LaserJet Printer
(Hewlett-Packard, Palo Alto, CA 94306).
El experimento típico se realizó como sigue:
tras la formación de sello, seguida de compensación de resistencia
en serie y cancelación transitoria capacitiva, se realizó un
protocolo de control de voltaje en el que el potencial de la célula
se escalonó desde el potencial de mantenimiento (típicamente -100
mV) a los potenciales de prueba que oscilaron de -60 mV a +20 mV en
incrementos de 10 mV. La célula se mantuvo en el potencial de
mantenimiento durante 5 segundos entre los pulsos.
Se tomaron gráficos de corriente de calcio de
una célula de neuroblastoma de ratón N1E-115, como
se muestra en la Figura 7. La figura se lee de izquierda a derecha
en el tiempo, con desviaciones hacia abajo del gráfico, que indican
corriente positiva fluyendo hacia dentro de la célula. Las
corrientes se provocaron mediante un escalón de voltaje de 100 mV a
-10 mV. La célula se bañó en solución salina con sodio sustituido
por NMDG y Ba^{++} 10 mM en vez de Ca^{++} 2 mM. Las corrientes
de potasio se bloquearon mediante TEA en el baño y Cs^{+} en la
disolución de la pipeta.
Los tres gráficos de la Figura 7, marcados
b-d, muestran corrientes de calcio decrecientes, con
concentraciones de omega-conopéptido MVIIA
crecientes de 10 nM, (b), 50 nM (c), y 200 nM (d).
Se prepararon sinaptosomas a partir de cerebro
entero de rata o región del hipocampo del cerebro. Las ratas se
sacrificaron, y se retiraron los cerebros anteriores y se
transfirieron a 10 ml de sacarosa 0,32 M helada que contenía los
siguientes inhibidores de proteasas (IP): EGTA 1 mM; EDTA 1 mM;
pepstatina 1 \muM; leupeptina 2 \muM. Se homogeneizaron los
cerebros usando un homogeneizador de vidrio-teflón
accionado por motor (aprox. 8 pases a 400 rpm). Los homogeneizados
de 4 cerebros se mezclaron y se centrifugaron a 900 \times g
durante 10 minutos a 4ºC. Después se centrifugaron los
sobrenadantes a 8.500 \times g durante 15 minutos. Los sedimentos
resultantes se resuspendieron en 10 ml cada uno de sacarosa 0,32 M
helada más IP, con mezclado en vórtex. Después se centrifugó la
suspensión a 8.500 \times g durante 15 minutos. Los sedimentos se
resuspendieron en 20 ml de sacarosa 0,32 M helada más IP. La
suspensión (5 ml/tubo) se dispuso en un gradiente de densidad de
sacarosa de 4 fases (7 ml cada uno: sacarosa 1,2 M, sacarosa 1,0 M,
sacarosa 0,8 M, sacarosa 0,6 M; todas las disoluciones de sacarosa
contenían IP). Los tubos de gradiente se centrifugaron en un rotor
basculante a 160.000 \times g durante 60 minutos a 4ºC. Se
recogió la capa de sacarosa 1,0 M más la interfase entre las capas
de sacarosa 1,0 y 1,2 M, y se diluyeron con agua desionizada helada
más IP, para producir una concentración final de sacarosa de 0,32
M. La suspensión resultante se centrifugó a 20.000 \times g
durante 15 minutos. Después se resuspendieron los sedimentos en 5
ml de solución salina helada tamponada con fosfato más IP. Después
los sinaptosomas de cerebro de rata resultantes se alicuotaron y se
almacenaron en un sistema de contención de nitrógeno líquido.
Antes del uso en ensayos de unión, los
sinaptosomas se descongelaron y se diluyeron con 3 volúmenes de agua
desionizada helada más IP. Esta suspensión se homogeneizó usando un
PT 10-35 Polytron (posición 6) durante dos ráfagas
de 10 segundos. Se centrifugó el homogeneizado a 40.000 \times g
durante 20 minutos a 4ºC. Los sedimentos resultantes se
resuspendieron en alrededor de 5 ml de solución salina helada
tamponada con fosfato más IP. La preparación de membrana de
sinaptosomas de cerebro de rata resultante se alicuotó y se
almacenó a -80ºC hasta su uso. Se determinó la concentración de
proteína de la preparación de membrana usando reactivo de Bradford
(BioRad), con albúmina de suero bovino como estándar.
1. Desplazamiento competitivo de OCT
MVIIA. Las membranas de sinaptosomas de cerebro de rata
preparadas como se describió en la Parte A se suspendieron en un
tampón de unión que consiste en HEPES, pH 7,0 20 mM, NaCl 75 mM,
EGTA 0,1 mM, EDTA 0,1 mM, leupeptina 2 \muM, aprotinina 0,035
\mug/ml, y 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA). Se alicuotaron
OCT [^{125}I]-MVIIA (SNX-111)
(25-30.000 cpm, aproximadamente
1500-2000 Ci/mmol) y compuesto de prueba en tubos
de polipropileno, en ausencia o presencia de OCT MVIIA
(SNX-111) 1 nM, para determinar la unión no
específica. Se diluyó la suspensión de membrana y se alicuotó en
último lugar en los tubos de ensayo, de forma que cada tubo de
ensayo contenía 10 \mug de proteína de membrana y el volumen
total era 0,5 ml. Tras incubar durante 1 hora a temperatura
ambiente, los tubos se pusieron en un baño de hielo, después se
filtraron a través de filtros GF/C (Whatman), que se preimpregnaron
con polietilenimina del 0,6% y se prelavaron con tampón de lavado
(HEPES pH 7,0 20 mM, NaCl 125 mM, BSA 0,1%) usando un sistema de
filtración Millipore. Justo antes de la filtración, cada tubo de
ensayo recibió 3 ml de tampón de lavado helado. Las membranas
filtradas se lavaron con dos volúmenes de 3 ml de tampón de lavado
helado, se secaron, y se midió la radiactividad unida al filtro en
un contador gamma de Beckman (75% de eficacia de contaje).
Los valores de CI_{50} se calcularon a partir
de curvas de ajuste lineal de desplazamiento competitivo generadas
mediante una función lógica de 4 parámetros. Estos valores
representan la concentración de compuesto de prueba necesario para
inhibir el 50% de la unión específica total de OCT
[^{125}I]-MVIIA (SNX-111) a
membranas de sinaptosomas de cerebro de rata, en la que la unión
específica se define como la diferencia entre la unión de OCT
[^{125}I]-MVIIA (SNX-111) en
ausencia y presencia de exceso de OCT MVIIA sin marcar (1 nM). La
unión no específica es la unión de compuesto marcado
radiactivamente que se mide en presencia de exceso de OCT MVIIA sin
marcar. Tales valores sirven como aproximaciones de las afinidades
relativas de una serie de compuestos por un sitio de unión
específico.
2. Desplazamiento competitivo de OCT
SVIB. Se prepararon membranas de sinaptosomas de cerebro de rata
como se describió anteriormente. Se marcó radiactivamente OCT SVIB
mediante yodación con ^{125}I-yoduro mediante la
reacción de Iodogen. Se llevó a cabo la unión por desplazamiento de
SVIB marcado radiactivamente en membranas de sinaptosomas de
cerebro de rata como en el Ejemplo 4B. Los valores de CI_{50} y
valores de potencia relativa se calcularon como se describe más
adelante. Las tablas 2 y 3 muestran los valores de potencia
relativa para los omega-conopéptidos examinados, y
la proporción de potencias relativas de los compuestos por el sitio
de OCT MVIIA y por el sitio de unión de SVIB.
La constante de unión (K_{i}) para cada
sustancia de prueba se calculó usando análisis de regresión no
lineal de mínimos cuadrados (Bennett, G.J. y Xie, Y.-K.,
Pain 33:87-107 (1988)) de datos de
unión competitiva de 2 ensayos realizados por duplicado en momentos
distintos. La relación entre K_{i} y CI_{50} (concentración a
la que el 50% de compuesto marcado es desplazado por el compuesto de
prueba) se expresa mediante la ecuación de Cheng-
Prusoff:
Prusoff:
K_{i} =
CI_{50}/(1 +
[L]/K_{d})
en la que CI_{50} es la
concentración de sustancia de prueba necesaria para reducir la unión
específica de ligando marcado al 50%; [L] es la concentración de
OCT [^{125}I]-MVIIA (SNX-111)
usada en el experimento; y K_{d} es la constante de unión
determinada para la unión de OCT [^{125}I]-MVIIA
(SNX-111) a membranas de sinaptosomas de cerebro de
rata en experimentos de unión saturante. La Tabla 3 resume los
CI_{50} calculados para diversos
omega-conopéptidos por el sitio de unión de MVIIA de
membranas de sinaptosomas de cerebro de rata. La potencia relativa
de desplazamiento de unión se calcula como una proporción de
CI_{50} del compuesto de prueba y CI_{50} del compuesto de
referencia. El compuesto de referencia es generalmente el
equivalente sin marcar del ligando marcado. El cálculo de la
potencia relativa es como
sigue:
[log \
(potencia \ relativa)] = log \
(CI_{50(ref)})-log(CI_{50(prueba)})
Se obtuvieron membranas meníngeas a partir de
médulas espinales (T3 a L5) de monos Macaque nemestrina. Se
extirparon las médulas espinales y se hicieron incisiones
simultáneamente a través de las tres capas meníngeas a lo largo de
las superficies ventrales. Cuidadosamente se recogieron juntas la
duramadre, aracnoides, y piamadre de cada médula espinal,
conservando sus relaciones anatómicas normales.
Las membranas piaaracnoides espinales congeladas
se desmenuzaron, se suspendieron en 5 ml de agua desionizada que
contenía inhibidores de proteasas (EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, pepstatina
1 \muM; leupeptina 2 \muM), se homogeneizó con un Polytron
(PT-10-35, velocidad 6) durante 10
segundos, y se centrifugó a 40.000 g durante 20 min. El sedimento
de membrana se resuspendió en 5 ml de tampón fosfato 0,05 M, pH 7,4,
que contenía inhibidores de proteasas, y se almacenó en nitrógeno
líquido hasta su uso. La concentración de proteína en la preparación
de membrana se determinó usando el reactivo de Bradford
(Bio-Rad) con albúmina de suero bovino (BSA) como
estándar. El OCT MVIIA se marcó radiactivamente con
^{125}I-yoduro mediante reacción con
Iodogen^{TM}, esencialmente según el método de Ahmad y Miljanich
(Ahmad, S.N. y Miljanich, G.P., Brain Research
453:247-256 (1988). Los ensayos de unión se
llevaron a cabo a temperatura ambiente en tubos de polipropileno de
12 \times 75 mm. El tampón de unión contenía Hepes de pH 7,2 20
mM, NaCl 75 mM, EDTA 0,1 mM, EGTA 0,1 mM, leupeptina 2,0 \muM,
aprototinina 0,5 U, y 0,1% de BSA. La mezcla de unión contenía 5
\mug de membranas meníngeas en 0,2 ml,
^{125}I-SNX-111 en 0,1 ml, y 0,2
ml de tampón de unión, para dar un volumen final de 0,5 ml por
tubo. Las curvas de unión competitiva de
^{125}I-SNX-111 se generaron
añadiendo diversas concentraciones de SNX-194
([Nle^{12}] SNX-111) a los tubos de ensayo. La
unión no específica se determinó en presencia de 500 \muM de
SNX-194. Se finalizó la reacción transfiriendo los
tubos de ensayo a un baño de agua helada y diluyendo cada muestra
con 3 ml de tampón de lavado enfriado (Hepes de pH 7,2 20 mM, NaCl
125 mM, BSA 0,1%). La radiactividad unida a membrana se separó en
un sistema de filtración múltiple Millipore usando filtros de fibra
de vidrio que se preimpregnaron con polietilenimina del 0,6%. Se
lavaron los filtros dos veces (3 ml) con tampón de lavado helado, y
se contaron en un contador gamma de Beckman (modelo
G-500) a una eficacia de contaje del 75%. Los datos
se ajustaron a una función lógica de cuatro parámetros:
Efecto =
E_{0} + (E_{i} - E_{0}) \cdot 1/1 +
(K/L)^{h}
en la que E_{0} = efecto a dosis
0, E_{i} = efecto a dosis infinita, K = CI_{50}, L =
concentración de ligando competidor, y h = pendiente. Los valores
de los parámetros se calcularon por ordenador
(Hewlett-Packard 9000) usando un algoritmo de
ajuste de curvas no lineal, de mínimos
cuadrados.
Se decapitaron cobayas (300-400
gr) y se extirpó el íleon. Se puso una sección de íleon, que estaba
a alrededor de 6 cm desde el ciego, inmediatamente en tampón
modificado de Krebb mantenido a 37ºC en un baño de agua, y se aireó
con una mezcla de 95% de O_{2} y 5% de CO_{2}. El tampón
contiene: KCl 4,6 mM, KH_{2}PO_{4} 1,2 mM; MgSO_{4} 1,2 mM;
glucosa 10,0 mM; NaCl 118,2 mM; NaHCO_{3}, 24,8 mM; CaCl_{2},
2,5 mM.
Se cortaron trozos pequeños de íleon y se
ciñeron a una pipeta de vidrio, se estriaron y se eliminó el músculo
longitudinal. Cada pieza se unió a un electrodo en un extremo y a
un transductor de fuerza en el otro extremo. La preparación se bajó
a un baño de órganos mantenido a 37ºC y se aireó con
O_{2}:CO_{2}. La tensión de reposo se ajustó a 1 gr., y se
estimuló el tejido a 30-50 V con una duración de 4,5
mseg por estimulación.
Se registraron las respuestas de línea base
(contracciones) durante 10-15 min, y se añadieron
alícuotas (100 ml) de fármaco al baño hasta que se dio inhibición.
Tras la prueba, se lavaron los tejidos hasta que se consiguió la
magnitud de respuesta original.
El modelo animal de neuropatía descrito aquí se
parece al síntoma humano denominado causalgia o distrofia simpática
refleja (DSR), secundaria a lesión de un nervio periférico. Este
síntoma se caracteriza por hiperestesia (sensibilidad aumentada a
estímulos naturales), hiperalgesia (sensibilidad anormal al dolor),
alodinia (sensibilidad general, caracterizada por hipersensibilidad
a estímulos táctiles), y dolor urente espontáneo. Estos síntomas en
general se incrementan o progresan con el tiempo.
El modelo experimental descrito más adelante
está diseñado para lesionar de forma reproducible nervios
periféricos (nervios espinales L5 y L6) de ratas. Las ratas
desarrollan un estado hiperestésico que se puede medir. Aquí, la
alodinia se midió mediante estimulación de patas traseras de rata
neuropáticas usando pelos de alambre que tenían grados clasificados
de rigidez. Los compuestos analgésicos invierten la sensibilidad
aumentada que tales animales exhiben al estímulo. Los datos de tal
modelo se expresan en general como efecto máximo en porcentaje, en
el que el efecto máximo indica una inversión completa de alodinia
inducida quirúrgicamente, o insensibilidad relativa a un estímulo
máximo proporcionado por un "pelo" o "alambre" de 15
gramos.
Para la administración intratecal de compuestos,
se prepararon ratas Sprague-Dawley macho
(250-350 gr) con catéteres intratecales lumbares
crónicos insertados con anestesia de halotano (Yaksh, T.L., y Rudy,
T.A., Physiol. Behav. 17:1031-1036
(1976)).
Cirugía neuropatogénica: Los animales se
anestesiaron con pentobarbital sódico, colocados en una posición de
decúbito prono, y los músculos paraespinales izquierdos se separaron
de los procesos espinales en los niveles
L_{4}-S_{2}, como describieron Kim y Chung (Kim,
S.H. y Chung, J.M., Pain 50:355-363
(1992)). Las raíces nerviosas L5 y L6 se descubrieron y se ligaron
estrechamente con sutura de seda quirúrgica 6-0.
Se dejó a los animales recuperarse de la cirugía
neuropatogénica y se midieron las respuestas nociceptivas
diariamente hasta que los animales exhibieron signos consistentes de
alodinia mecánica (aproximadamente 7-10 días). Para
la administración epidural de fármacos, después se implantaron a los
animales catéteres epidurales (lumbares) espinales permanentes,
según el procedimiento de Durant y Yaksh (Durant, P.A.C., y Yaksh,
T.L., Anesthesiology 64:43-53
(1986)), con modificaciones menores. Se administró
SNX-111 o vehículo (solución salina) mediante
inyección rápida un día después de la colocación del catéter, o
mediante infusión continua, a velocidad constante, iniciada en el
momento de la implantación del catéter. Para la inyección rápida, se
administró SNX-111 en un volumen de 30 \mul,
seguido de 10 \mul de solución salina para limpiar el tubo. Para
infusión epidural continua, los catéteres se conectaron a bombas
miniosmóticas permanentes y las disoluciones de prueba se
administraron a una velocidad de 0,5-1,0 \mul/h.
Los umbrales de alodinia mecánica se midieron inmediatamente antes
y a intervalos fijos durante o tras la administración de
SNX-111.
Para la administración intratecal de fármacos,
se cateterizó el espacio subaracnoideo lumbar con entubado de
polietileno (PE-10) lleno de solución salina, como
describieron Yaksh y Rudy (Yaksh, T.L., y Rudy, T.A., Physiol.
Behav. 17:1031-1036 (1976)). El catéter
se ancló con suturas tirantes al tejido muscular adyacente donde
emerge de la cisterna magna. Para inyección rápida, el compuesto de
prueba se disolvió en solución salina y se administró en un volumen
de 10 \mul a través del catéter intratecal, seguido de 10 \mul
de solución salina para limpiar el tubo del catéter. La infusión
continua se llevó a cabo como se describió anteriormente.
Se dio a los animales al menos 3 días para
recuperarse de la cateterización antes de valorar los umbrales de
alodinia mecánica. Se observó que la alodinia ocurría típicamente
empezando 1-2 días post-cirugía y
continuaba durante hasta 45 días. Los animales que mostraban
déficits motores se excluyeron de estudios posteriores.
Para valorar el umbral de un estímulo no nocivo
necesario para producir una retirada de la pata izquierda trasera
(alodinia), se aplicaron sistemáticamente filamentos de Von Frey
(Stoelting, Wood Dale, IL) de rigidez graduada (que oscilaba de
0,4-15 gramos) al plantar tratado quirúrgicamente de
la pata trasera. El pelo se mantuvo contra la superficie con fuerza
suficiente para causar curvatura ligera y se mantuvo durante
6-8 segundos. Si no había respuesta, se probaba el
siguiente pelo más rígido. La provocación de una respuesta de
retirada enérgica fue motivo para probar la siguiente intensidad de
estímulo más baja. Este paradigma se repitió según un método
estadístico (Dixon, W.J., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.
20:441-462 (1976)) para definir el umbral de
respuesta del 50%. La alodinia se evidenció mediante un umbral menor
de 3 gramos (con relación a la intensidad de estímulo de pelo)
exhibida por todos los animales tratados quirúrgicamente.
El límite superior de estímulo mecánico para
ensayos de umbral se fijó en 15 gramos. Los valores de %EPM cercanos
a 100 indican umbrales mecánicos normales (es decir, en o cerca de
15 gr); los valores cercanos a 0 indican alodinia. Tras completar
el ensayo, se mataron los animales y se diseccionaron las columnas
vertebrales para confirmar la posición de los catéteres y para
examinar el estado de las puntas de los catéteres. Después se
retiraron los catéteres y se limpiaron con solución salina para
detectar fugas y confirmar la permeabilidad. Los animales se
excluyeron del estudio si los catéteres estaban obstruidos o no
colocados apropiadamente en el espacio epidural.
Los datos obtenidos en este modelo se expresan
como efecto máximo en porcentaje (%EPM) según la ecuación siguiente,
en la que el efecto máximo indica una inversión completa de la
alodinia, o insensibilidad al estímulo (el máximo es igual al punto
de corte de pelo de 15 gramos). Una línea base de cero indica una
sensibilidad media menor de 3 gramos.
%EPM =
\frac{NuevoUmbral \ (g) \ - \ UmbralL\text{í}neaBase \ (g) \ \times
100}{15 \ gramos -
UmbralL\text{í}neaBase}
Según este análisis, cuanto más alto es el %EPM,
mejor es el efecto antinociceptivo. Los conopéptidos activos, que
incluyen SNX-273 y SNX-279, bloquean
la alodinia mecánica significativamente en comparación con el
control de solución salina. Este orden de potencia aparente para la
supresión de la alodinia es
SNX-111=SNX-273>SNX-279.
Esto está de acuerdo con las afinidades relativas de los compuestos
en el sitio de unión de SNX-111 (CI_{50}:
SNX-111, 8 pM; SNX-273, 8 pM;
SNX-279, 40 pM).
\newpage
También se observó en los animales la aparición
de disfunción motora general, evidenciada por la incapacidad para
ambular simétricamente y por cualesquiera otras señales evidentes de
actividad extraña. No se observaron efectos sobre la actividad
motora en los animales tratados con solución salina; se observó un
temblor dependiente de dosis característico de la administración de
SNX-111 en los animales a los que se dio
SNX-111.
Se administra SNX-111 a animales
para valorar la prevención del desarrollo de neuropatía, como se
demuestra mediante la reducción en el desarrollo de alodinia
mecánica y térmica. Se implantan a los animales catéteres
intravenosos (vena yugular derecha) permanentes o catéteres
intratecales espinales unidos a minibombas osmóticas implantadas
subcutáneamente (Alza Corp., Palo Alto, CA) para proporcionar
infusión continua a velocidad constante de compuesto o vehículo
(solución salina fisiológica acidificada, pH 4-4,5).
Para estudios crónicos, se permite a los animales un tiempo de
recuperación de veinticuatro horas antes de someterlos al
procedimiento quirúrgico descrito anteriormente para producir una
lesión en nervio periférico. La infusión de fármaco o vehículo
comienza un día antes de la cirugía. Las dosis de
SNX-111 probadas en estudios iniciales son 100
\mug/kg/h i.v. (14 días) y 100 ng/kg/h i.t. (14 días).
La alodinia mecánica se valora cada día durante
alrededor de cuarenta (40) días, comenzando el día antes de la
cirugía usando estímulos de alambre de Von Frey, como se describió
anteriormente. Los umbrales de estímulo medios se comparan en el
tiempo entre animales tratados con fármaco y controles (tratados con
vehículo).
Además, o en un grupo separado de animales
tratados, se dan estímulos térmicos como estímulos agudos o
persistentes. Los estímulos agudos se administran aplicando acetona
en la superficie plantar de la pata afectada y contando las
retiradas enérgicas de la pata en respuesta a la aplicación. La
respuesta a estímulos persistentes se mide poniendo a la rata sobre
una placa de latón mantenida a temperatura neutra (30ºC) o fría
(5ºC). Tras cinco minutos de adaptación, se mide la duración
acumulativa de tiempo que la rata mantiene la pata separada de la
placa durante un periodo de observación de cinco minutos. Los datos
se analizan como se describió anteriormente.
La eficacia analgésica de
SNX-111 administrado espinalmente se ensayó usando
la formulación de tampón metionina-lactato del
paradigma detallado en el Ejemplo 5. Se disolvieron
SNX-111 (10 \mug/ml) y L-metionina
(50 \mug/ml) en un vehículo compuesto de lactato sódico (150 mM)
ajustado a pH 4-4,5 con ácido láctico 250 mM. Esta
formulación se usó para administrar 0,1 \mug de
SNX-111 intratecalmente, como se describió en el
Ejemplo 5, a 30, 60, 120 y 240 minutos tras tratamiento con
compuesto de prueba o control. La Figura 10 muestra los efectos de
la alodinia mecánica de una inyección rápida intratecal única de 10
\mul de solución salina (círculos claros) o tampón lactato (150
mM) que contienen 50 \mug/ml de metionina con (cuadrados oscuros)
o sin (triángulos oscuros) 10 \mug/ml de SNX-111.
Ni la solución salina sola ni el tampón de control de metionina
lactato solo fueron efectivos para suprimir la alodinia, mientras
que la formulación de SNX-111 fue efectiva a este
respecto. Además, se observó que los valores de %EPM para los
controles tratados con solución salina no fueron significativamente
diferentes de aquellos de los animales a los que se les dio tampón
de metionina-lactato solo.
Aunque la invención se ha descrito con respecto
a realizaciones particulares, será evidente para los expertos que
se pueden hacer diversos cambios y modificaciones sin apartarse de
la invención.
Claims (3)
1. El uso de un omega conopéptido bloqueante
de canales de calcio dependientes de voltaje tipo N,
caracterizado por la capacidad para (a) inhibir la
contracción estimulada eléctricamente de íleon de cobaya, y (b)
unirse selectivamente a sitios de unión de omega conopéptido MVIIA
presentes en tejido neuronal, como se demuestra mediante la
capacidad del omega conopéptido para desplazar MVIIA de dicho sitio,
en la fabricación de un medicamento para inhibir la progresión de
un trastorno de dolor neuropático, cuando el omega conopéptido es
para ser administrado mediante administración intratecal a un
individuo en el sitio de progresión de lesión del nervio.
2. El uso de un omega conopéptido bloqueante
de canales de calcio dependientes de voltaje tipo N,
caracterizado por la capacidad para (a) inhibir la
contracción estimulada eléctricamente de íleon de cobaya, y (b)
unirse selectivamente a sitios de unión de omega conopéptido MVIIA
presentes en tejido neuronal, como se demuestra mediante la
capacidad del omega conopéptido para desplazar MVIIA de dicho sitio,
en la fabricación de un medicamento para inhibir la progresión de
un trastorno de dolor neuropático, cuando el omega conopéptido es
para ser administrado mediante administración epidural a un
individuo en el sitio de progresión de lesión del nervio.
3. El uso de un omega conopéptido bloqueante
de canales de calcio dependientes de voltaje tipo N,
caracterizado por la capacidad para (a) inhibir la
contracción estimulada eléctricamente de íleon de cobaya, y (b)
unirse selectivamente a sitios de unión de omega conopéptido MVIIA
presentes en tejido neuronal, como se demuestra mediante la
capacidad del omega conopéptido para desplazar MVIIA de dicho sitio,
en la fabricación de un medicamento para inhibir la progresión de
un trastorno de dolor neuropático, cuando el omega conopéptido es
para ser administrado mediante administración intravenosa a un
individuo.
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