ES2281808T3

ES2281808T3 - Antibiotico 107891, sus factores a1 y a2, composiciones y sales farmaceuticamente aceptables y uso del mismo.

Info

Publication number: ES2281808T3
Application number: ES04740916T
Authority: ES
Inventors: Ameriga Lazzarini; Luciano Gastaldo; Gianpaolo Candiani; Ismaela Ciciliato; Daniele Losi; Flavia Marinelli; Enrico Selva; Franco Parenti
Original assignee: Vicuron Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Vicuron Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2003-07-18
Filing date: 2004-07-12
Publication date: 2007-10-01
Anticipated expiration: 2024-07-12
Also published as: US7307057B2; EP1646646A1; JP2007525479A; DE602004005203D1; EP1646646B1; MXPA06000691A; JP4163737B2; AR046809A1; DE602004005203T2; CA2529124A1; US20060183673A1; BRPI0412591A; TW200510541A; CA2529124C; ATE356143T1; WO2005014628A1; TWI340167B

Abstract

Complejo de antibiótico 107891 que comprende factor A1 y factor A2 que es un polvo blanco que tiene las siguientes características: (A) espectro de masas registrado a partir de una disolución 0, 2 mg/ml en metanol:agua 80/20 (v/v) con un 0, 1% de ácido trifluoroacético (figura 1A y 1B) sobre un instrumento Thermofinnigan LCQ deca equipado con una fuente de electropulverización, usando una mezcla de calibración Thermofinnigan en las siguientes condiciones de electropulverización: potencial de pulverización: 4, 7 kV; temperatura capilar: 220º C; potencial capilar: 3V; modo de infusión 10 mul/min, que muestra dos iones dobles protonados a m/z 1124 y m/z 1116, que corresponden a la composición de isótopos inferiores de factor A1 y A2; respectivamente. (B) espectro infrarrojo (figura 2) registrado en KBr con un espectrofotómetro Bruker FT-IR modelo IFS 48, que muestra máximos de absorción a (cm-1): 3263; 2929; 1661; 1533; 1402; 1114; 1026. (C) espectro de UV (figura 3); realizado en metanol:H2O 80:20 (v/v) con un espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 16, que muestra dos hombros a 226 y 267 nm. (D) espectro de 1H-RMN (figura 4) registrado a 600 MHz en la mezcla metanol-d4:H2O (pH 4, 3 HCl) 40:10 (v/v) a 40ºC sobre un espectrómetro Bruker AMX 600 aplicando una secuencia de supresión de agua usando como patrón interno la señal residual de metanol-d4 a 3, 31 ppm, que muestra las siguientes señales [delta = ppm multiplicidad; (atribución)]: 0, 93 d (CH3), 0, 98 d (CH3), 1, 07 t (CH3 superpuestos), 1, 18 t (CH3 superpuestos), 1, 26 s (CH3), 1, 30 t (CH3 superpuestos), 1, 62-1, 74 m (CH2), 1, 78 d (CH3), 1, 80 d (CH3), 2, 03 m (CH2), 2, 24 m (CH), 2, 36 m (CH2), 2, 72-3, 8 m(CH alfa peptídicos), 3, 8-5, 2 m (CH alfa peptídicos), 5, 53-6, 08 s (CH2), 5, 62 d (doble enlace de CH), 6, 42 m (CH), 6, 92 d (doble enlace de CH), 7, 0-7, 55 m (CH aromáticos), 7, 62-10, 4 d y m (NH aromático y peptídico). (E) espectro de 13C-RMN (figura 5) registrado en la mezcla metanol-d4:H2O (pH 4, 3 HCl) 40:10 (v/v) a 40ºC sobre un espectrómetro Bruker AMX 600, usando como patrón interno la señal residual de metanol-d4 a 49, 15 ppm, que muestra las siguientes señales: [delta = ppm; (atribución)]: 13:6-23, 2 (CH3 alifáticos), 26, 16-73 (CH2 alifáticos y CH alfa peptídicos), 105-136 (CH aromáticos y de dobles enlaces y carbonos cuaternarios), 164, 3-176, 3 (carbonilos peptídicos); y sus sales con ácidos.

Description

Antibiótico 107891, sus factores A1 y A2, composiciones y sales farmacéuticamente aceptables y uso del mismo.

\global\parskip0.880000\baselineskip

La presente invención se refiere a una sustancia antibiótica de origen microbiano, denominada arbitrariamente antibiótico 107891, que es un complejo que comprende factores A1 y A2, las sales farmacéuticas aceptables del mismo, composiciones farmacéuticas del mismo y su uso como un agente antibacteriano.

Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para preparar antibiótico 107891 que incluye cultivar Microbispora sp. 107891 (identificado a continuación en el presente documento como Microbispora sp. ATCC PTA-5024) o una variante o mutante del mismo que conserva la capacidad para producir dicho antibiótico, recuperar el antibiótico de la invención del micelio y/o del caldo de fermentación, aislar la sustancia pura por medios cromatográficos y separar los factores A1 y A2.

El antibiótico 107891 es un agente antimicrobiano novedoso con una estructura peptídica que contiene lantionina y metil-lantionina como constituyentes. Éstas son las características típicas de lantibióticos y, en particular, del subgrupo que actúa principalmente sobre la biosíntesis de la pared celular.

Los lantibióticos son péptidos, que contienen el aminoácido de tioéter lantionina así como varios otros aminoácidos modificados (H. G. Sahl y G. Bierbaum, (1998) "Lantibiotics: biosynthesis and biological activities of uniquely modified peptides from gram-positive bacteria", Ann. Rev. Microbiol. 52:41-79). La mayoría de los lantibióticos conocidos tienen actividad antibacteriana, aunque se han notificado algunos como activos sobre diferentes dianas farmacológicas. Los lantibióticos antibacterianos pueden dividirse ampliamente en dos grupos basándose en sus estructuras: los lantibióticos tipo A son normalmente péptidos alargados, anfífilos, mientras que los lantibióticos tipo B son compactos y globulares (O. McAuliffe, R. P. Ross y C. Hill, (2001): "Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action", FEMS Microb. Rev. 25:285-308). La nisina es el representante típico de los lantibióticos tipo A, mientras que la actagardina (gardimicina) y la mersacidina pertenecen a la subclase de lantibióticos tipo B. Tanto los lantibióticos de tipo nisina como de tipo mersacidina interaccionan con el lípido II precursores de peptidoglucano unidos a membrana, aunque las dos clases se diferencian en los efectos que producen sobre el proceso de proliferación bacteriana. Los lantibióticos de tipo nisina destruyen principalmente las bacterias mediante permeabilización de la membrana citoplasmática (H. Brotz, M. Josten, I. Wiedemann, U. Schneider, F. Gotz, G. Bierbaum y H. G. Sahl, (1998): "Role of lipid-bound peptidoglycan precursors in the formation of pores by nisin, epidermin and other lantibiotics", Mol. Microbiol. 30:317-27), mientras que los lantibióticos de tipo mersacidina destruyen principalmente las células bacterianas inhibiendo la biosíntesis de la pared celular (H. Brotz, G. Bierbaum, K. Leopold, P. E. Reynolds y H. G. Sahl, (1998): "The lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan synthesis by targeting lipid II", Antimicrob Agents Chemother.42:154-60).

Dos antibióticos producidos por la cepa NRRLL 30420 de Microbispora corallina, identificados como antibiótico MF-BA-1768\alpha_{1} y MF-BA-1768\beta_{1}, respectivamente, se describen en el documento US 6.551.591 B1. Los datos fisicoquímicos notificados en la patente anteriormente identificada (por ejemplo datos de espectrometría de masa, peso molecular, contenido en aminoácidos) y comparación de tiempos de retención en análisis experimentales de LC-MS muestran claramente que el complejo de antibiótico 107891 así como sus componentes factor A1 y factor A2 son entidades químicas distintas de los antibióticos MF-BA1768 \alpha_{1} y MF-BA-1768 \beta_{1}.

El documento EP 0592835A2 describe antibióticos antitumorales BU-4803TA_{1}, A_{2}, B, C_{1}, C_{2} y D. Los antibióticos BU-4803TA_{1} A_{2}, y B se recuperan a partir del caldo de fermentación de Microbispora ATCC 55327 (AA 9966) mientras que los antibióticos BU4803TC_{1}, C_{2} y D son productos de la transformación de los antibióticos BU 4803TA_{1}, A_{2} y B, respectivamente, cuando se almacenan estos productos en dimetulsulfóxido. Los datos fisicoquímicos notificados en el documento EP 0592 835 A para los antibióticos anteriores (por ejemplo, apariencia, absorción UV, peso molecular, actividad antitumoral) muestran claramente que son sustancias químicas distintas del complejo de antibiótico 107891 y sus factores A1 y A2.

Cepa y fermentación

Se aisló la Microbispora sp. 107891 en el medio ambiente y se depositó el 27 de febrero de 2003 en la Colección Americana de Cultivos Tipo ("American Type Culture Collection" ATCC), 10801 University Blvd, Manassas VA, 20110-2209 EE.UU., bajo la disposición del tratado de Budapest. La cepa se registró con el número de acceso PTA-5024.

La producción de antibiótico 107891 se logra cultivando una cepa de Microbispora sp. que puede producirlo, es decir, Microbispora sp. ATCC PTA-5024 o una variante o mutante de la misma que manifiesta la capacidad para producir dicho antibiótico; aislando el antibiótico resultante del caldo de cultivo completo y/o del micelio separado y/o del caldo de fermentación filtrado; y purificando el antibiótico aislado mediante medios cromatográficos. En cualquier caso, se prefiere producir el antibiótico 107891 en condiciones aerobias en un medio de nutrientes acuoso que contiene fuentes fácilmente asimilables de carbono, nitrógeno, y sales inorgánicas. Pueden usarse muchos de los medios de nutrientes habitualmente empleados en el campo de la fermentación, sin embargo se prefieren ciertos medios.

Fuentes de carbono preferidas son sacarosa, fructosa, glucosa, xilosa, y similares. Fuentes de nitrógeno preferidas son soja triturada, peptona, extracto de carne, extracto de levadura, triptona, aminoácidos, caseína hidrolizada y similares. Entre las sales inorgánicas que pueden incorporarse en el medio de cultivo, hay sales solubles habituales que pueden proporcionar sodio, potasio, hierro, zinc, cobalto, magnesio, calcio, amonio, cloruro, carbonato, sulfato, fosfato, nitrato, e iones similares.

Preferiblemente, la cepa que produce el antibiótico 107891 se cultiva previamente en un tubo de fermentación o en un frasco de agitación, luego se usa el cultivo para inocular fermentadores en recipiente para la producción de cantidades sustanciales de sustancias. El medio usado para el cultivo previo puede ser el mismo que el empleado para las fermentaciones mayores, pero también pueden emplearse otros medios. La cepa que produce el antibiótico 107891 puede
hacerse crecer a una temperatura de entre 17ºC y 37ºC, siendo las temperaturas óptimas de alrededor de 28-30ºC.

Durante la fermentación, puede monitorizarse la producción de antibiótico 107891 mediante bioensayo sobre microorganismos sensibles y/o análisis de HPLC. La producción máxima de antibiótico 107891 se produce generalmente tras cerca de 90 horas y antes de 200 horas de fermentación.

El antibiótico 107891 se produce cultivando Microbispora sp. ATCC PTA-5024 o una variante o mutante de la misma que puede producir el antibiótico 107891, y se encuentra en los caldos de cultivo y/o en el micelio.

En esta descripción y reivindicaciones, el término "antibiótico 107891", a menos que se especifique de otro modo, identifica al complejo de antibiótico 107891 que comprende los factores A1 y A2.

Características morfológicas de Microbispora sp. ATCC PTA-5024

Microbispora sp. ATCC PTA-5024 crece bien en diversos medios sólidos convencionales. Se midieron las dimensiones microscópicas usando el cultivo crecido en ácido húmico - agar de varias sales (composición en g/l: ácido húmico 0,5, FeSO_{4}*7H_{2}O 0,001, MnCl_{2}*4H_{2}O 0,001, ZnSO_{4}*7H_{2}O 0,001, NiSO_{4}*6H_{2}O 0,001, MOPS 2, agar 20) con adición de 1 ml/l de disolución de vitaminas (clorhidrato de tiamina 25 mg/l, pantotenato de calcio 250 mg/l, ácido nicotínico 250 mg/l, biotina 0,5 mg/l, riboflavina 1,25 g/l, cianocobalamina 6,25 mg/l, ácido paraminobenzoico 25 mg/l, ácido fólico 500 mg/l, clorhidrato de piridoxal 500 mg/l).

En cultivo líquido (medio V6, composición en g/l: dextrosa 22, extracto de carne 5, extracto de levadura 5, caseína 3, NaCl 1,5) no se observa fragmentación del micelio tras 6 días de crecimiento a 28ºC. La exploración microscópica sobre ácido húmico - agar de varias sales (tras 21 días de incubación a 28ºC) revela un micelio de sustrato ramificado, no fragmentado, y un micelio aéreo monopodialmente ramificado; también son visibles muchas hifas aéreas largas, lineales y mal ramificadas. Esporóforos cortos que surgen lateralmente de ramificaciones o directamente de las hifas aéreas principales transportan pares de esporas longitudinales característicos. Las esporas son globosas y no motrices. No se observan cuerpos de tipo esporangio ni otras estructuras particulares.

Características de cultivo de Microbispora sp. ATCC PTA-5024

Se hizo crecer Microbispora sp. ATCC PTA-5024 durante seis días en medio líquido AF/MS (véase el ejemplo 1) a 28ºC y 200 rpm, luego se transfirió (inóculo del 5%) a un nuevo medio líquido AF/MS y se hizo crecer durante otros 6 días y finalmente se inoculó (inóculo al 7%) en 100 ml de medio líquido V6 (véase el ejemplo 1). Tras 6 días de crecimiento a 28ºC y 200 rpm, se recogió el micelio mediante centrifugación y se lavó tres veces mediante solución salina estéril, luego se diluyó para proporcionar un inóculo adecuado. Se cultivaron en línea alícuotas de la suspensión de manera de cultivo cruzado sobre diversos medios recomendados por Shirling y Gottlieb (E. B. Shirling y D. Gottlieb, (1966): "Method for Characterization of Streptomyces species", Int. J. Syst. Bacteriol. 16:313-340), y medios recomendados por S.A. Waksman (1961): "The Actinomycetes", The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Vol. 2:328-334).

Se determinó la capacidad para usar una variedad de hidratos de carbono como fuente de carbono y energía usando medio ISP4 sin almidón, con adición de 1 ml/l de la disolución de vitamina descrita anteriormente como medio basal; se añadió cada fuente de carbono a la concentración final del 1% (p/v).

Se determinó la tolerancia a NaCl, intervalo de pH de crecimiento así como la capacidad para crecer a diferentes temperaturas sobre medio ISP2. Se incubaron todos los medios a 28ºC durante tres semanas; las descripciones se refieren a 21 días a menos que se especifiquen. Se evaluó el color con luz del día natural, usando el Atlas de Color de Maerz y Paul (A. Maerz y M. R. Paul, 1950 - A Dictionary of Colour, 2ª edición. McGraw- Hill Book Co. Inc., Nueva York). Se evaluó la capacidad para reducir los nitratos en nitritos en medio de nitrato pegajoso según el procedimiento descrito por Williams et al. (S. T. Williams, M. Goodfellow, G. Alderson, E. M. H. Wellington, P. H. A. Sneath y M. J. Sackin, 1983 - Numerical classification of Streptomyces and related genera- J. Gen. Microbiol. 129, 1743-1813).

El crecimiento, aspecto de colonias, color de sustrato y micelio aéreo y producción de pigmento para la cepa Microbispora sp. ATCC PTA-5024 se registran en la tabla I. El crecimiento vegetativo está presente en la mayoría de los medios usados, a diferencia del micelio aéreo que sólo está presente en algunos de ellos. No se muestra ninguna pigmentación evidente sobre ninguno de los medios usados. Las características fisiológicas de la cepa se presentan en la tabla II. El crecimiento y producción de micelio aéreo están presentes a 17ºC pero no a 43ºC. La producción de micelio aéreo sobre ISP2 está presente a pH superior a 6, mientras que está ausente en presencia de NaCl al 1%.

La capacidad para usar diversos hidratos de carbono para el crecimiento se muestra en la tabla III.

\global\parskip1.000000\baselineskip

TABLA I Características de crecimiento de Microbispora sp. ATCC PTA-5024

2

3

(ISP4 y agar de glucosa - asparagina con adición de 1 ml/L de disolución de vitaminas)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA II Características fisiológicas de Microbispora sp. ATCC PTA-5024

4

TABLA III Uso de fuentes de carbono por Microbispora sp. ATCC PTA-5024

5

\vskip1.000000\baselineskip

Características quimiotaxonómicas de Microbispora sp. ATCC PTA-5024

Se hizo crecer Microbispora sp. ATCC PTA-5024 en medio GYM (glucosa 4 g/l; extracto de levadura 4 g/l; extracto de malta 10 g/l) a 28ºC en un agitador giratorio y se recogió el micelio, se lavó dos veces con agua destilada estéril y posteriormente se liofilizó. Se llevaron a cabo análisis de aminoácidos según el procedimiento de Staneck y Roberts, (J. L. Staneck y G. D. Roberts, (1974): "Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin-layer chromatography", Appl. Microbiol. 28:226-231). Se extrajeron menaquinonas y lípidos polares siguiendo el procedimiento de Minnikin et al. (D. E. Minnikin, A. G. O'Donnell, M. Goodfellow., G. Alderson, M. Athalye, A. Schaal y J. H. Parlett, (1984): "An integrated procedure of isoprenoid quinones and polar lipids", J. Microbiol. Meth. 2:233-241). Se analizaron lípidos polares mediante cromatografía de capa fina (D. E. Minnikin, V. Patel, L. Alshamaony, y M. Goodfellow, (1977): "Polar lipid composition in the classification of Nocardia and related bacteria", Int. J. Syst. Bacteriol. 27:104-117), menaquinonas mediante HPLC (R. M. Kroppenstedt, (1982): "Separation of bacterial menaquinones by HPLC using reverse phase RP18 and a silver loaded ion exchanger as stationary phase", J. Liquid. Chromat. 5:2359-2367; R. M. Kroppenstedt, (1985): "Fatty acid and menaquinone analysis of actinomycetes and related organisms", en: Chemical Methods in Bacterial Systematics. No20 SAB Technical Series págs. 173-199, M. Goodfellow y D. E. Minnikin eds, Academic Press, Londres) y ésteres metílicos de ácidos grasos mediante cromatografía de gas-líquido respectivamente (L. T. Miller, (1982): "A single derivatization method for bacterial fatty acid methyl esters including hydroxy acids", J. Clin. Microbiol. 16:584-586; M. Sasser, (1990): "Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fatty acids", USFCC News Letters 20:1-6). La presencia de ácidos micólicos se comprobó mediante el procedimiento de Minnikin et al. (D. E. Minnikin, L. Alshamaony, y M. Goodfellow, (1975): "Differentiation of Mycobacterium, Nocardia and related taxa by thin layer chromatographic analysis of whole organism methanolyzates", J. Gen. Microbiol. 88:200-204).

Hidrolizados de célula completa de la cepa Microbispora sp. ATCC PTA-5024 contienen ácido meso-diaminopimélico como diaminoácido del peptidoglicano. Las menaquinonas predominantes son MK-9 (III, VIII- H_{4}), MK-9 (H_{2}) y MK-9 (H_{0}). El patrón de lípidos polares se caracteriza por la presencia de fosfatidiletanolamina, metilfosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, difosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilinositolmanósidos y fosfolípido que contiene N-acetilglucosamina, es decir fosfolípido tipo IV según Lechevalier et al. (H. A. Lechevalier, C.
De Brièveand M. P. Lechevalier, (1977): "Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phospholipid composition", Biochem. Syst. Ecol. 5:246-260). Los componentes principales del patrón de ácidos grasos son anteiso 15:0, iso 16:0, n- 16:0, anteiso 17:0, y 10-metil-heptadecanoico (10-Me-17:0), es decir, 3c según Kroppenstedt (R. M. Kroppenstedt, (1985): "Fatty acid and menaquinone analysis of actinomycetes and related organisms", en: Chemical Methods in Bacterial Systematics. No20 SAB Technical Series págs. 173-199. M. Goodfellow and D. E. Minnikin eds, Academic Press, Londres). No se detectan ácidos micólicos.

Secuenciación de ADNr 16S DE Microbispora sp. ATCC PTA-5024

La secuencia parcial del gen del ARNr 16 (ADNr 16S), es decir 1443 nucleótidos, correspondientes al 95% del ARNr entero, de la cepa Microbispora sp. ATCC PTA-5024, se logró siguiendo procedimientos publicados (P. Mazza, P. Monciardini, L. Cavaletti, M. Sosio y S. Donadio, (2003): "Diversity of Actinoplanes and related genera isolated from an Italian soil", Microbial Ecol. 5:362-372). Se notifica en la SEQ ID No 1. Se comparó esta secuencia con la de la cepa Microbispora corallina NRRL 30420 (MF-BA-1768), según se notifica en el documento US 6.551.591 B1. Se alinearon las dos secuencias y se encontraron diferencias en 31 de 1456 posiciones alineadas, que representaban una divergencia de secuencia global del 2,13%. Dos cepas cualesquiera que comparten identidad de secuencia de menos del 97,5% pertenecen normalmente a especies diferentes (Stackebrandt, E. y Embley, M. T. (2000) "Diversity of Uncultered Microorganisms in the Environment". En: Non culturable Microorganisms in the Environment, R. R. Colwell y D. J. Grimes (eds). ASM, Press, Washington DC, págs. 57-75). Por tanto, un nivel del 2% de divergencia de secuencia es bastante elevado (Rossellò- Mora, R., y Amann, R. (2001). "The Species Concept for Prokaryotes". FEMS Microbiol. Rev. 25:39-67) e indica que Microbispora sp. ATCC PTA-5024 y Microbispora corallina NRRL 30420 (MF-BA-1768) son cepas diferentes.

\vskip1.000000\baselineskip

Identidad de la cepa Microhispora sp. ATCC PTA-5024

Se asigna la cepa que produce antibiótico 107891 al género Microbispora, familia Streptosporangiaceae debido a las siguientes características quimiotaxonómicas y morfológicas:

- presencia de ácido meso-diaminopimélico en la pared celular;

- cantidad principal de MK-9 (III, VIII- H_{4}) y fosfolípido tipo IV según Lechevalier et al. (H. A. Lechevalier, C. DeBriève y M.P. Lechevalier, (1977): "Chemotaxonomy of aerobic actinomycetes: phospholipid composition", Biochem. Syst. Ecol. 5:246-260);

- perfil de ácidos grasos de 3c según Kroppenstedt (R. M. Kroppenstedt, (1992): "The genus Nocardiopsis", en: The Prokariotes, Vol II, págs. 1139-1156, A. Balows, H. Truper, M. Dworkin, W. Harder y K. H. Schleifer eds; Nueva York, Springer- Verlag);

- ausencia de ácidos micólicos;

- formación de pares de esporas longitudinales característicos sobre las puntas de esporóforos cortos que se ramifican lateralmente de hifas aéreas. Esporas no motrices.

- secuencia parcial del gen de ARNr 16 (ADNr 16S), es decir 1443 nucleótidos, correspondientes al 95% del ARNr entero, notificada en SEQ ID NO. 1, que muestra una identidad del > 97% con respecto a las secuencias de ADNr 16S de especies de Microbispora descritas.

Tal como con otros microorganismos, las características de la cepa que produce antibiótico 107891 están sometidas a variación. Por ejemplo, pueden obtenerse variantes artificiales y mutantes de la cepa mediante tratamiento con diversos mutágenos conocidos, tales como rayos UV, y productos químicos tales como ácido nitroso, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, y muchos otros. Todas las variantes y mutantes naturales y artificiales de la cepa Microbispora sp. ATCC PTA-5024 que pueden producir antibiótico 107891 se consideran equivalentes para el fin de esta invención y por tanto están dentro del alcance de la invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Extracción y purificación de antibiótico 107891

Tal como se mencionó anteriormente, el antibiótico 107891 se encuentra distribuido casi por igual en el micelio y en la fracción filtrada del caldo de fermentación.

El caldo recogido puede tratarse para separar el micelio del sobrenadante del caldo de fermentación y puede extraerse el micelio con un disolvente miscible con agua para obtener una disolución que contiene el antibiótico 107891, tras eliminación del micelio gastado. Este extracto de micelio puede tratarse entonces por separado o en combinación con el sobrenadante según los procedimientos notificados a continuación en el presente documento para la fracción de sobrenadante. Cuando el disolvente miscible con agua puede interferir con las operaciones para recuperar el antibiótico del extracto de micelio, puede eliminarse el disolvente miscible con agua mediante destilación o puede diluirse con agua hasta una concentración que no interfiera.

El término "disolvente miscible con agua" tal como se usa en esta solicitud, se pretende que tenga el significado facilitado actualmente en la técnica de este término y se refiere a disolventes que, en las condiciones de uso, son miscibles con agua en un intervalo de concentración razonablemente amplio. Ejemplos de disolventes orgánicos miscibles con agua que pueden usarse en la extracción de los compuestos de la invención son: alcanoles inferiores, por ejemplo alcanoles (C_{1}-C_{3}) tales como metanol, etanol, y propanol; fenil-alcanoles (C_{1}-C_{3}) tales como alcohol bencílico; cetonas inferiores, por ejemplo cetonas (C_{3}-C_{4}) tales como acetona y etil metil cetona; éteres cíclicos tales como dioxano y tetrahidrofurano; glicoles y sus productos de eterificación parcial tales como etilenglicol, propilenglicol, y etilenglicol monometil éter, amidas inferiores tales como dimetilformamida y dietilformamida; ácido acético, dimetilsulfóxido y acetonitrilo.

La recuperación del compuesto a partir del sobrenadante del caldo de fermentación del microorganismo productor se realiza según técnicas conocidas en sí mismas que incluyen la extracción con disolventes, precipitación mediante adición de no disolventes o cambio del pH de la disolución, mediante cromatografía de partición, cromatografía de partición en fase inversa, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular y similares o una combinación de dos o más de dichas técnicas. Un procedimiento para recuperar los compuestos de la invención a partir del cultivo de fermentación filtrado incluye la extracción de antibiótico 107891 con disolventes orgánicos no miscibles con agua, seguido de precipitación a partir de los extractos concentrados, posiblemente añadiendo un agente de precipitación.

También en este caso, el término "disolvente no miscible con agua" tal como se usa en esta solicitud, se pretende que tenga el significado actualmente facilitado en la técnica para dicho término y se refiere a disolventes que, en las condiciones de uso, son ligeramente miscibles o prácticamente no miscibles con agua en un intervalo de concentración razonablemente amplio, adecuados para su uso pretendido.

Ejemplos de disolventes orgánicos no miscibles con agua que pueden usarse en la extracción de los compuestos de la invención a partir del caldo de fermentación son:

alcanoles de al menos cuatro átomos de carbono que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos tales como n-butanol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 1-hexanol, 2-hexanol, 3-hexanol, 3,3-dimetil-1-butanol, 4-metil-1-pentanol, 3-metil-1-pentanol, 2,2-dimetil-3-pentanol, 2,4-dimetil-3-pentanol, 4,4-dimetil-2-pentanol, 5-metil-2-hexanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 5-metil-1-hexanol, 2-etil-1-hexanol, 2-metil-3-hexanol, 1-octanol, 2-octanol, ciclopentanol, 2-ciclopentiletanol, 3-ciclopentil-1-propanol, ciclohexanol, cicloheptanol, ciclooctanol, 2,3-dimetil-ciclohexanol, 4-etilciclohexanol, ciclooctilmetanol, 6-metil-5-hepten-2-ol, 1-nonanol, 2-nonanol, 1-decanol, 2-decanol, y 3-decanol; cetonas de al menos cinco átomos de carbono tales como metil isopropil cetona, metil isobutil cetona, metil n-amil cetona, metil isoamil cetona y mezclas de los mismos.

Tal como se sabe en la técnica, la extracción de producto a partir del caldo de fermentación filtrado puede mejorarse ajustando el pH en un valor apropiado, y/o añadiendo una sal orgánica apropiada que forma un par de iones con el antibiótico, que es soluble en el disolvente de extracción.

Tal como se sabe en la técnica, la separación de fases puede mejorarse salando la fase acuosa.

Cuando, tras una extracción, se recupera una fase orgánica que contiene una cantidad sustancial de agua, puede ser conveniente destilar mediante azeótropo el agua de la misma. Generalmente, esto requiere añadir un disolvente que puede formar mezclas azeotrópicas mínimas con el agua, seguido de la adición de un agente de precipitación al producto deseado, si es necesario. Ejemplos representativos de disolventes orgánicos que pueden formar mezclas azeotrópicas mínimas con agua son: n-butanol, benceno, tolueno, butil éter, tetracloruro de carbono, cloroformo, ciclohexano, 2,5-dimetilfurano, hexano, y m-xileno; siendo el disolvente preferido n-butanol.

Ejemplos de agentes de precipitación son éter de petróleo, éteres de alquilo inferior, tales como etil éter, propil éter, y butil éter, y cetonas de alquilo inferior tales como acetona.

Según un procedimiento preferido para recuperar antibiótico 107891, el caldo de fermentación filtrado puede ponerse en contacto con una matriz de adsorción mediante elución con un disolvente polar, miscible con agua o una mezcla de los mismos, concentración hasta obtener un residuo aceitoso a presión reducida, y precipitación con un agente de precipitación del tipo ya mencionado anteriormente.

Ejemplos de matrices de adsorción que pueden usarse convenientemente en la recuperación de los compuestos de la invención son poliestireno o resinas de poliestireno-divinilbenceno mixtas (por ejemplo M112 o S112, Dow Chemical Co.; Amberlite®XAD2 o XAD4, Rohm & Haas; Diaion HP 20, Mitsubishi), resinas acrílicas (por ejemplo XAD7 o XAD8, Rohm & Haas), poliamidas tales como policaprolactamas, nylon y polivinilpirrolidonas reticuladas (por ejemplo Polyamide-CC 6, Polyamide-SC 6,Polyamide-CC 6,6, Polyamide-CC 6AC y Polyamide-SC 6AC, Macherey-Nagel & Co., Alemania; PA 400, M. WoelmAG, Alemania); y la resina de polivinilpirrolidona PVP-CL, (Aldrich Chemie GmbH & Co., KG, Alemania) y dextranos reticulados de poro controlado (por ejemplo Sephadex® LH-20, Pharmacia Fina Chemicals, AB). Preferiblemente, se emplean resinas de poliestireno, siendo particularmente preferida la resina Diaion HP 20.

En el caso de resinas de poliestireno, resinas de poliestireno-divinilbenceno, resinas de poliamida o resinas acrílicas, un eluyente preferido es un disolvente miscible con agua o sus mezclas acuosas. Las mezclas acuosas pueden contener tampones a un valor de pH apropiado.

También en este caso, el término "disolvente miscible con agua", tal como se usa en esta descripción y reivindicaciones, se pretende que tenga el significado actualmente facilitado en la técnica a dicho término tal como se describió anteriormente.

Los sucesivos procedimientos para el aislamiento y la purificación del antibiótico pueden llevarse a cabo en extractos combinados a partir del sobrenadante del caldo y del micelio. Por ejemplo, cuando la parte del producto de antibiótico contenida en el caldo de fermentación filtrado o el sobrenadante se recupera mediante absorción sobre una resina de absorción y la parte del producto de antibiótico contenida en el micelio se extrae a partir del mismo con un disolvente miscible con agua, seguido por adsorción sobre una resina de absorción, las fracciones eluídas de cada uno de los dos conjuntos de resinas de absorción pueden combinarse, opcionalmente tras concentración, y luego tratarse adicionalmente como un cultivo unitario. Alternativamente, cuando los dos conjuntos de resinas de absorción utilizados para las fases de extracción separadas son del mismo tipo y tienen las mismas características funcionales, pueden combinarse juntos y puede someterse la mezcla a una etapa de elución unitaria, por ejemplo, con un disolvente miscible con agua o una mezcla del mismo con agua.

En cualquier caso, sea cual sea el procedimiento adoptado para recuperar el antibiótico 107891 bruto, la etapa de purificación sucesiva se lleva a cabo normalmente sobre la mezcla de los materiales brutos resultantes de la combinación de los productos que se originan de las fases de extracción separadas.

La purificación del antibiótico 107891 bruto puede lograrse mediante cualquiera de las técnicas conocidas por sí mismas pero se realiza preferiblemente por medio de procedimientos cromatográficos. Ejemplos de estos procedimientos cromatográficos son los notificados con respecto a la etapa de recuperación y también incluyen cromatografía sobre fases estacionarias tales como gel de sílice, alúmina, silicato de magnesio activado y similares o cromatografía de fase inversa sobre gel de sílice silanizado que tiene diversas derivatizaciones funcionales, y eluyendo con disolventes miscibles con agua o mezcla acuosa de disolventes miscibles con agua de la clase mencionada anterior-
mente.

Por ejemplo, puede emplearse cromatografía de HPLC preparativa, usando RP-8 o RP-18 como fase estacionaria y una mezcla de tampón HCOONH_{4}:CH_{3}CN como sistema de elución.

Las fracciones activas recuperadas de la etapa de purificación se combinan, se concentran a vacío, se precipitan mediante adición de un agente de precipitación de la clase mencionada anteriormente y se secan o liofilizan en rondas única o iterativas. En el caso de que el producto contenga cantidades residuales de formiato de amonio u otras sales tamponantes, pueden eliminarse mediante absorción del antibiótico 107891 sobre una columna de extracción de fase sólida, por ejemplo, una columna de resina de fase inversa tal como SPE Superclean LCP18 Supelco (Bellefonte PA, EE.UU.) seguido de lavado con agua destilada y elución con una mezcla de disolvente acuosa apropiada, por ejemplo metanol:agua. Entonces se recupera el antibiótico eliminando los disolventes de elución.

En consecuencia, se obtiene una preparación seca de complejo de antibiótico 107891 purificado como un polvo blanco. Tal como es habitual en esta técnica, la producción así como las etapas de recuperación y purificación, pueden monitorizarse mediante una variedad de procedimientos analíticos que incluyen ensayo inhibitorio frente a microorganismos sensibles y control analítico usando HPLC o HPLC acoplada a espectrometría de masas.

Una técnica de HPLC analítica preferida se realiza sobre un instrumento de Waters (Waters Chromathography, Milford, MA) equipado con una columna Waters Simmetry-shield RP8, 5 \mu (250 x 4,6 mm) eluída con una velocidad de flujo de 1 ml/min y a una temperatura de 50ºC.

La elución se realizó con un programa de múltiples etapas: tiempo=0 (30% de fase B); tiempo=8 min (30% de fase B); tiempo=28 min (40% de fase B). La fase A era acetonitrilo:tampón de formiato de amonio 100 mM (pH: 5,0) 5:95 (v/v) y la fase B era acetonitrilo. El detector UV funcionaba a 282 nm.

Se dividió el efluyente de la columna con una razón de 5:95 y se desvió la mayor parte (cerca de 950 \mul/min) hacia un detector con red de fotodiodos. Los 50 \mul/min restantes se desviaron hacia la fase de contacto de ESI de un espectrómetro de masas de trampa iónica Finnigan LCQ (Thermoquest, Finnigan MAT, San Josè CA).

El análisis de espectrometría de masas se realizó en las siguientes condiciones:

Condiciones de entrada de muestra:

: Gas de separador (N_{2}) 413685,4 Pa;

: Gas auxiliar (N_{2}) 34473,8 Pa;

: Calentador capilar 250ºC;

\newpage

Ajustes de potencial de entrada de muestra:

: Polaridad tanto positiva como negativa;

: Potencial de pulverización de iones +/-5 kV;

: Potencial capilar +/-19 V;

: Condiciones de barrido: tiempo de iones máximo 200 ms;

: Tiempo de iones 5 ms;

: Microbarrido completo 3;

\vskip1.000000\baselineskip

Segmento: duración 30 min, acontecimientos de barrido positivos (150-2000 m/z) y negativos (150-2000 m/z).

En estas condiciones de HPLC analítica, los factores A1 y A2 del antibiótico 107891 mostraron tiempos de retención de 13,2 min y 13,9 min, respectivamente. En el mismo sistema de HPLC, el factor A2 de ramoplanina (L. Gastaldo, R. Ciabatti, F. Assi, E. Restelli, J. K. Kettenring, L. F. Zerilli, G. Romanò, M. Denaro y B. Cavalleri, (1992): "Isolation, structure determination and biological activity of A-16686 factors A'1, A'2 y A'3 glycolipodepsipeptid antibiotics", J. Ind. Microbiol. 11:13-18) eluyó con un tiempo de retención de 7,5 min.

Los factores A1 y A2 de Antibiótico 107891 pueden separarse de una muestra purificada de complejo de antibiótico 107891 mediante HPLC preparativa.

Se separó el factor A1 y se purificó sobre una columna Symmetry Prep. C18 a partir del complejo de antibiótico 107891 purificado disuelto en DMSO:ácido fórmico 95:5 (v/v) usando una elución en gradiente lineal de 25 minutos desde el 30% hasta el 45% de fase B con una velocidad de flujo de 3,5 ml.

La fase B era acetonitrilo. La fase A era tampón de formiato de amonio 25 mM pH 4,5:acetonitrilo 95:5 (v/v). Se combinaron las fracciones eluídas que contenían factor A1 de antibiótico 107891 puro y se concentraron a vacío. Se liofilizó la disolución residual dando factor A1 puro como un polvo blanco.

Se separó el factor A2 y se purificó mediante elución isocrática sobre una columna Symmetry Prep. C18 a partir de una muestra de complejo de antibiótico 107891 purificado disuelto en una mezcla de ácido acético:acetonitrilo:tampón de formiato de amonio 100 mM (pH 4) 50:120:80 (v/v). Se realizó la elución isocrática con una velocidad de flujo de 7 ml con una mezcla de tampón de formiato de amonio 100 mM pH 4:acetonitrilo en la proporción 82,5:17,5 (v/v). Se combinaron las fracciones eluídas que contenían factor A2 de antibiótico 107891 puro y se concentraron a vacío. Se liofilizó la disolución residual dando factor A2 puro como un polvo blanco.

Ya que el antibiótico 107891 y sus factores A1 y A2, tal como se muestra mediante valoración ácido/base en 2-metoxietanol (MCS):H_{2}O 12:3 (v/v), contienen una función básica, pueden formar sales con ácidos adecuados según procedimientos convencionales y pueden existir también en la forma de base libre.

El antibiótico 107891 y sus factores A1 y A2, cuando se obtienen en la forma de base libre, pueden convertirse con ácidos en las correspondientes sales, que incluyen sales farmacéuticamente aceptables no tóxicas. Sales adecuadas incluyen aquellas sales formadas mediante reacción convencional con ácidos tanto orgánicos como inorgánicos, por ejemplo, ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, acético, trifluoroacético, tricloroacático, succínico, cítrico, ascórbico, láctico, maléico, fumárico, palmítico, cólico, pamoico, múcico, glutámico, canfórico, glutárico, glicólico, ftálico, tartárico, laurico, esteárico, salicílico, metanosulfónico, bencenosulfónico, sórbico, pícrico, benzoico, cinnámico y similares. Las sales de adición de antibiótico 107891 y sus factores A1 y A2, con ácidos pueden prepararse según los procedimientos habituales comúnmente empleados. Como ejemplo, se disuelve antibiótico 107891 o su factor A1 o su factor A2, en forma de base libre, en la mínima cantidad de un disolvente adecuado, normalmente un alcanol inferior, o una mezcla de alcanol inferior/agua, se añade gradualmente la cantidad estequiométrica de un ácido seleccionado adecuado a la disolución obtenida y se precipita la sal obtenida mediante adición de un no disolvente. La sal de adición que se forma se recupera entonces mediante filtración o evaporación de los disol-
ventes.

Alternativamente, estas sales pueden prepararse en una forma sustancialmente anhidra mediante liofilización; en este caso se disuelve una sal de antibiótico 107891 o su factor A1 o su factor A2 con ácido volátil con una cantidad adecuada de ácido no volátil. Entonces se filtra la disolución para eliminar cualquier resto insoluble y se liofiliza en rondas únicas o iterativas.

También puede obtenerse una sal de adición específica a partir de una disolución de otra sal de antibiótico 107891 o su factor A1 o su factor A2 cuando la sal deseada precipita con la adición del anión apropiado.

\newpage

La transformación del compuesto de la invención que no está en forma de sal para dar las sales de adición correspondientes, y la inversa, es decir, la transformación de una sal de adición de un compuesto de la invención para dar la forma que no es una sal están dentro de la experiencia técnica ordinaria y las abarca la presente invención.

La formación de sales de antibiótico 107891 y sus factores A1 y A2 puede servir para varios fines, incluyendo la separación, purificación de dicho antibiótico 107891 y sus factores A1 y A2 y su uso como agentes terapéuticos o promotores del crecimiento animal. Para fines terapéuticos, se emplean habitualmente las sales farmacéuticamente aceptables.

El término "sales farmacéuticamente aceptables" identifica aquellas sales no tóxicas que pueden utilizarse en el tratamiento de animales de sangre caliente.

Puede administrarse el complejo de antibiótico 107891, sus factores A1 y A2 y una mezcla de dichos factores en cualquier proporción como tal o en mezcla con vehículos farmacéuticamente aceptables y también puede administrarse junto con otros agentes antimicrobianos tales como penicilinas, cefalosporinas, aminoglucósidos y glucopéptidos.

Por tanto, la terapia conjunta incluye administración secuencial, simultánea y separada del principio activo de una manera en la que los efectos terapéuticos del primero administrado no ha desaparecido completamente cuando se administra el siguiente.

Los compuestos de la invención, o sus sales de adición farmacéuticamente aceptables, pueden formularse en formas adecuadas para administración parenteral, oral o tópica. Para la administración i.v. en el tratamiento de cualquier infección que implica un microorganismo sensible al antibiótico, una formulación parenteral está, por ejemplo, en agua con un agente de solubilización apropiado tal como polipropilenglicol o dimetilacetamida y un agente tensioactivo (por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitano o aceite de ricino polietoxilado) o formulaciones basadas en ciclodextrinas o fosfolípidos en agua estéril para inyección. Una formulación inyectable también puede obtenerse con una ciclodextrina apropiada.

También puede usarse el complejo de antibiótico 107891, sus factores A1 y A2 y una mezcla de dichos factores en cualquier proporción en una forma farmacéutica adecuada tal como una cápsula, un comprimido o una suspensión acuosa para administración oral o con cremas o jaleas convencionales para aplicaciones tópicas. Además de su uso como medicamentos en tratamiento de seres humanos y veterinario, los compuestos de la invención también pueden usarse como promotores del crecimiento animal. Para este fin, un compuesto de la invención se administra por vía oral en una alimentación adecuada. La concentración exacta empleada es la que se requiere para proporcionar el principio activo en una cantidad eficaz promotora del crecimiento cuando se consumen cantidades normales de alimentación.

La adición del principio activo de la invención a la alimentación del animal se logra preferiblemente preparando una mezcla previa de alimentación apropiada que contiene el principio activo en una cantidad eficaz e incorporando la mezcla previa a la ración completa. Alternativamente, puede combinarse un complemento alimenticio o concentrado intermedio que contiene el principio activo en la alimentación. La manera en la que pueden prepararse y administrarse tales mezclas previas de alimentación y raciones completas se describen en libros de referencia (tales como "Applied Animal Nutrition", W. H. Freedman y CO., S. Francisco, EE.UU., 1969 o "Livestock Feeds and Feeding" 0 y B books, Corvallis, Ore., EE.UU., 1977).

Características fisicoquímicas del antibiótico 107891

A) Espectrometría de masa:

en experimentos de SM sobre un instrumento Thermofinnigan LCQ deca equipado con una fuente de electrospray, usando una mezcla de calibración Thermofinnigan, el antibiótico 107891 proporciona dos iones doblemente protonados a m/z=1124 y a m/z 1116 correspondientes a la composición de isótopos inferiores de los factores A1 y A2 del complejo, respectivamente. Las condiciones de electrospray fueron: potencial de pulverización: 4,7 kV; temperatura capilar: 220ºC; potencial capilar: 3 V; modo de infusión 10 \mul/min. Se registraron espectros a partir de una disolución de 0,2 mg/ml en metanol/agua 80/20 (v/v) con ácido trifluoroacético al 0,1% y se notifican en la figura 1A (espectro de baja resolución de barrido completo) y 1B (espectro de alta resolución de barrido ampliado).

B) El espectro infrarrojo de antibiótico 107891 grabado en KBr con un espectrofotómetro Bruker FT-IR modelo IFS 48, muestra un máximo de absorción a (cm^{-1}): 3263; 2929; 1661; 1533; 1402; 1114; 1026. El espectro infrarrojo se notifica en la figura 2. Las bandas de absorción a 1631, 1596 y 1346 se atribuyen a cantidades residuales de formiato de amonio.

C) El espectro UV de antibiótico 107891, realizado en metanol/H_{2}O (en una razón de 80:20) con un espectrómetro de Perkin-Elmer Lambda 16, muestra dos hombros a 226 y 267 nm. El espectro UV se notifica en la figura 3

D) El espectro ^{1}H-RMN se registró en la mezcla metanol-d4:H_{2}O (pH 4,3 HCl) 40:10 (v/v) a 40ºC sobre un espectrómetro BrukerAMX 600 aplicando una secuencia de supresión de agua. Como patrón interno se consideró la señal residual de metanol-d4 a 3,31 ppm. El espectro ^{1}H-RMN de antibiótico 107891 se notifica en la figura 4. El espectro ^{1}H-RMN de antibiótico 107891 disuelto en metanol-d4:H_{2}O (HCl 0,01 N) 40:10 (v/v) muestra los siguientes grupos de señales (en ppm) a 600 MHz usando MeOH-d4 como patrón interno (3,31 ppm), [\delta=ppm, multiplicidad; (atribución)]: 0,93 d (CH_{3}), 0,98 d (CH_{3}), 1,07 t (CH_{3} superpuestos), 1,18 t (CH_{3} superpuestos), 1,26 s (CH_{3}), 1,30 t (CH_{3} superpuestos), 1,62-1,74 m (CH_{2}), 1,78 d(CH_{3}), 1,80 d (CH_{3}), 2,03 m (CH_{2}), 2,24 m (CH), 2,36 m (CH_{2}), 2,72-3,8 m (CH alfa peptídicos), 3,8-5,2 m (CH alfa peptídicos), 5,53-6,08 s (CH_{2}), 5,62 d (doble enlace de CH), 6,42 m (CH), 6,92 d (doble enlace de CH), 7,0-7,55 m (CH aromáticos), 7,62-10,4 d y m (NH aromáticos y peptídicos).

E) El espectro ^{13}C-RMN se registró en la mezcla metanol-d4:H_{2}O (pH 4,3 HCl) 40:10 (v/v) a 40ºC sobre un espectrómetro BrukerAMX 600 usando como patrón interno la señal residual de metanol-d4 a 49,15 ppm. El espectro ^{13}C-RMN desacoplado de bb (banda ancha) de antibiótico 107891 se notifica en la figura 5. El espectro ^{13}C-RMN de antibiótico 107891 disuelto en metanol-d4:H_{2}O (HCl 0,01 N) 40:10 (v/v) muestra los siguientes grupos de señales (en ppm) a 600 MHz usando MeOH-d4 como patrón interno (49,15 ppm), [\delta=ppm; (atribución)]: 13,6-23,2 (CH_{3} alifáticos), 26,16-73 (CH_{2} alifáticos y CH alfa peptídicos), 105 -136 (CH aromáticos y con doble enlace y carbonos cuaternarios), 164,3-176,3 (carbonilos peptídicos).

F) Se disolvió complejo de antibiótico 107891 en 2-metoxietanol (MCS):H_{2}O 12:3 (v/v) que contenía un exceso molar de ácido clorhídrico 0,01 M. Entonces se retrovaloró la disolución con una disolución de hidróxido de potasio 0,01 N. La curva de valoración resultante mostró una función ionizable básica.

Composición de aminoácidos de antibiótico 107891 y sus factores A1 Y A2 A) Determinación de aminoácidos "resistentes a ácido" en el complejo de antibiótico 107891

Se sometió el antibiótico 107891 a una hidrólisis ácida completa (HCl 6 N, 105ºC, 24 h) y se identificaron los componentes de aminoácido del antibiótico resistentes al tratamiento ácido. Los aminoácidos lábiles en medio ácido no pudieron detectarse con este enfoque. Se estudió la hidrólisis mediante análisis de HPLC-MS y GC-MS, tras una derivatización adecuada, en comparación con una mezcla de aminoácidos patrón derivatizados de manera similar. Para el análisis de HPLC se trató la muestra hidrolizada con carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilo (kit reactivo AccQ-Tag™ Fluor), para el análisis de GC con una mezcla de HCl 3 N en metanol anhidro y anhídrido trifluoroacético.

Se llevó a cabo el análisis de HPLC cualitativa sobre un sistema de cromatografía de líquidos con detección de DAD y MS simultánea. El procedimiento de HPLC tenía las siguientes condiciones:

: columna: AccQ-Tag™ (Waters C18 NovoPak 4 \mum 3,9 x 150 mm)

: temperatura de columna: 37ºC

: flujo: 1 mL/min.

: Fase A: acetato de amonio 140 mM pH 5 (ácido acético)

: Fase B: agua:acetonitrilo 60:40 (v/v)

: Programa de elución

6

: Detección UV: 254 nm

\vskip1.000000\baselineskip

Las condiciones de MS fueron las siguientes:

: espectrómetro: Finnigan LCQ Deca equipado con fuente de electrospray habitual.

: temperatura capilar: 250ºC

: potencial de fuente: 4,70 KV

: corriente de fuente: 80 \muA

: potencial capilar: -15 V

\newpage

Se llevó a cabo el análisis de GC cualitativa sobre un cromatógrafo de gas equipado con detección MS-EI. El procedimiento de GC tenía las siguientes condiciones:

: columna: J & W Scientific DB-5, 30 m x 0,254 mm ID x 0,25 \mum FT gas portador: helio

: modo de inyección: sin fraccionamiento

: temperatura de inyector: 200ºC

: temperatura de línea de transferencia: 300ºC

: programa de temperatura: desde 50ºC hasta 100ºC a 2,5ºC/min (10 min), desde 100ºC hasta 250ºC a 10ºC/min (15 min), 15 min a 250ºC

: volumen de inyección: 1 \mul

\vskip1.000000\baselineskip

Las condiciones de MS fueron las siguientes:

: espectrómetro: Finnigan TSQ700

: modo de ionización: impacto de electrones

: Ajuste de potencial:

: corriente de filamento: 400 mA

: multiplicador de electrones: 1400 V

: energía de electrones: 70 eV

: modo de iones positivos

: Condición de barrido:

: intervalo de barrido: 40-650 amu

: tiempo de barrido: 1 seg

\vskip1.000000\baselineskip

En los cromatogramas de LC/MS y GC/MS obtenidos sobre el hidrolizado de antibiótico 107891, se identificaron los siguientes aminoácidos junto con otros picos no identificados: lantionina, metil-lantionina, glicina, prolina, valina, ácido aspártico (los estudios de RMN indican que esto es un producto de transformación de asparagina, que genera ácido aspártico mediante hidrólisis), fenilalanina y leucina.

Se sometieron los factores A1 y A2 de antibiótico 107891 a hidrólisis ácida completa en las mismas condiciones (derivatización y HPLC-MS) notificadas para el complejo. Se llevó a cabo el análisis de GC-MS en un instrumento Thermo Finnigan Trace GC-MS equipado con un inyector PTV.

El procedimiento de GC tenía las siguientes condiciones:

: columna: Restek RTX-5MS, 15 m x 0,25 mm ID x 0,25 \mum FT

: gas portador: helio

: temperatura de fase de contacto: 250ºC

: programa de temperatura: 1,5 min a 50ºC, desde 50ºC hasta 100ºC a 20ºC/min, 1 min a 100ºC, desde 100ºC hasta 135ºC a 20ºC/min, 1 min a 135ºC, desde 135ºC hasta 250º a 20ºC/min, 1 min a 250ºC

: volumen de inyección: 1 \mul

: inyector: modo sin fraccionamiento, temperatura de base 50ºC, temperatura de transferencia 280ºC, razón de transferencia 14,5ºC/min

\newpage

Las condiciones de MS fueron las siguientes:

: modo de ionización: impacto de electrones

: ajuste de potencial:

: corriente de filamento: 149 \muA

: multiplicador de electrones: 200 V

: energía de electrones: 70 eV

: Modo de iones positivos:

: Condiciones de barrido:

: intervalo de barrido: 33-500 amu

: tiempo de barrido: 0,6 seg

\vskip1.000000\baselineskip

En el hidrolizado de factor A1 de antibiótico 107891, los cromatogramas de HPLC/MS y GC/MS mostraron la presencia de los siguientes aminoácidos junto con otros picos no identificados: lantionina, metil-lantionina, glicina, prolina, valina, ácido aspártico (estudios de RMN indican que esto es un producto de transformación de asparagina, que genera ácido aspártico mediante hidrólisis), fenilalanina y leucina.

El procedimiento anterior llevado a cabo sobre el factor A2 reveló la presencia de los siguientes aminoácidos junto con otros picos no identificados: lantionina, metil-lantionina, glicina, prolina, valina, ácido aspártico (estudios de RMN indican que esto es un producto de transformación de asparagina, que genera ácido aspártico mediante hidrólisis), fenilalanina y leucina.

B) Determinación de 5-clorotriptófano en el complejo de antibiótico 107891 y en su factor A1 y factor A2

Se realizó la hidrólisis completa de complejo 107891 purificado y sus factores A1 y A2 únicos según el procedimiento descrito por Simpson R J, Neuberger M R, Liu T Y, "Complete Aminoacid Analysis of Proteins from a Single Hydrolysate". Journal Biol. Chem (Estados Unidos), 10 de Abril, 1976, 251 (7), 1936-40.

Este procedimiento de hidrólisis evita la degradación de aminoácidos normalmente inestables durante la digestión con ácidos minerales y por tanto permite la determinación de estos aminoácidos, incluyendo triptófano, a partir de un hidrolizado de un péptido. Se compró una muestra convencional de 5-cloro-DL-triptófano de Biosynt AG, Staad, Suiza y se confirmó su estructura mediante análisis de RMN; se compró DL-triptófano de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania.

Se suspendió factor A1 (1,5 mg) en 0,6 ml de ácido metanosulfónico 4 N que contenía un 0,2% (p/v) de 3-(2-aminoetil)indol como catalizador para la hidrólisis. Se llevó a cabo la hidrólisis a 115ºC durante 16 horas. Entonces se neutralizó el hidrolizado con NaOH 5 N y se diluyó con una cantidad igual de agua destilada. Se analizaron 100 \mul de esta disolución mediante LC-MS. Se realizó la separación en una columna Symmetry C18 (5 \mum) 4,6 x 250 mm (Waters Co. Milford MA, EE.UU.) equipada con una precolumna Symmetry C18 (5 \mum) 3,9 x 20 mm. Se realizó la elución con una velocidad de flujo de 1 ml/min con un gradiente lineal de 25 min desde el 0% hasta el 50% de fase B. La fase A era tampón HCOONH_{4} 25 mM pH 4,5:CH_{3}CN 95:5 (v/v) y la fase B era CH_{3}CN. La detección UV se realizó a 280 nm. El equipo de HPLC se acopló a un espectrómetro de masas de trampa iónica Finnigan LCQ (Thermoquest, Finnigan MAT, San Josè, CA, EE.UU.). Se desviaron 50 \mul/min de los efluyentes de la columna hasta la fase de contacto de ionización por electrospray (ESI) del espectrómetro de masas LCQ. Se realizó el análisis de MS en las siguientes condiciones: entrada de muestra: gas de separador (N_{2}) 413685,4 Pa; calentador capilar 210ºC; polaridad de potencial de entrada de muestra: tanto positivo como negativo; potencial de pulverización de iones +/-4,5 KV; potencial capilar +/-21 V; condiciones de barrido: tiempo de ión máximo 50 ms; microbarrido completo 3.

Los patrones de triptófano y 5-clorotriptófano eluyeron a tiempos de retención de 8,1 minutos y 11,5 minutos correspondientes a M+H^{+} a m/z 205 y 239, respectivamente. En el hidrolizado de factor A1 de antibiótico 107891 la presencia de un pico a 11,5 minutos con m/z a 238,97 indicó la presencia de 5-clorotriptófano.

Pudo detectarse el triptófano de patrón con el sistema cromatográfico usado con un límite de detección de 0,3 \mug/ml. Este valor es inferior al valor que habría sido indicativo de la presencia de dicho aminoácido en la muestra de antibiótico sometida a prueba. No se detectó triptófano dentro del límite mencionado anteriormente en el cromatograma del hidrolizado de factor A1 de antibiótico 107891. Se obtuvieron resultados idénticos a partir del análisis de LC-MS de un hidrolizado de factor A2 y de un hidrolizado de una muestra purificada de complejo de antibiótico 107891.

Espectrometría de masas de factor A1 y factor A2 de antibiótico 107891

El factor A1 de antibiótico 107891 proporciona un ión doblemente protonado a m/z=1124 y el factor A2 a m/z 1116 correspondientes a la composición de isótopos inferiores en experimentos de MS sobre un instrumento Thermofinnigan LCQ deca equipado con una fuente de electrospray, usando una mezcla de calibración Thermofinnigan. Las condiciones de electrospray fueron: potencial de pulverización: 4,7 kV; temperatura capilar: 250ºC; potencial capilar: 8 V; modo de infusión 10 \mul/min. Se registraron los espectros a partir de una disolución 0,1 mg/ml en acetonitrilo:agua 50:50 (v/v) con ácido acético al 0,5% y se notifican en la figura 6A (espectro de baja resolución de barrido completo y 6B (espectro de alta resolución de barrido ampliado) y en la figura 7A (espectro de baja resolución de barrido completo) y B (espectro de alta resolución de barrido ampliado).

Se ha determinado la masa exacta de factor A1 y factor A2 de antibiótico usando un espectrómetro Bruker Daltonics APEXII, de 4,7 Tesla equipado con una fuente de electrospray. Basándose en estos datos, se asignó al factor A1 un peso molecular de 2246,71 \pm 0,06, masa monoisotópica calculada a partir de [M+2H]^{2+} a m/z 1124,36124 (precisión de 30 ppm), determinada mediante ESI-FTMS de alta resolución. Se asignó al factor A2 un peso molecular de 2230,71 \pm 0,06, masa monoisotópica calculada a partir de [M+2H]^{2+} a m/z 1116,36260 (precisión 30 ppm), determinada mediante ESI-FTMS de alta resolución.

Comparación de factor A1 y factor A2 de antibiótico 107891 con antibióticos MF-BA-1768\alpha_{1} y MF-BA-1768\beta_{1}

A) Se adquirió Microbispora corallina NNRL 30420 (MF-BA-1768), descrita en el documento US 6.551.591 B1, de la colección NNRL. En un experimento exploratorio, se fermentó la cepa M. corallina NNRL 30420 (MF-BA-1768) en un matraz Erlenmeyer en las condiciones descritas en el documento US 6.551.591 B1. Se extrajo el caldo recogido mediante dilución con metanol. Tras la centrifugación del micelio, se cargó el sobrenadante sobre una resina de absorción de poliestireno HP20, se eluyó con una mezcla de metanol:agua 70:30, que se redujo hasta un volumen pequeño y entonces se liofilizó. En el cromatograma dos picos mostraron señales de 1091 y 1108 [M+2H]^{2+}, correspondientes al [M+2H]^{2+} notificada en el documento US 6.551.581 B1 para MF-BA-1768\beta_{1} y MF-BA-1768\alpha_{1}, respectivamente. Entonces se realizaron adiciones conocidas al extracto anterior de factores A1 y A2 de antibiótico 107891 y se analizó la mezcla mediante LC-MS. Se encontró que los picos de antibióticos MF-BA-1768\beta_{1} y MF-BA-1768\alpha_{1} y de factores A1 y A2 de antibiótico 107891 tenían tiempos de retención distintos y fragmentos de MS [M+2H]^{2+} distintos.

B) En un experimento adicional, se realizó una fermentación en tanque de 30 l de la cepa NRRL 30420 (MF-BA-1768) de Microbispora sp. y se trató el caldo recogido siguiendo la descripción del documento US 6.551.591 B1. Tras las etapas de purificación secuenciales sobre resina de poliestireno HP20 y resina de poliamida CC 6 0,1-0,3 mm (Macherey-Nagel), se obtuvieron dos sustancias individuales en forma pura mediante HPLC preparativa sobre una columna C18 Phenomenex de 10 \mu de tamaño de partícula (Torrance CA, EE.UU.) Luna (250 x 12,2 mm) eluída con una velocidad de flujo de 27 ml/min con el siguiente programa de múltiples etapas: tiempo = 0 min (un 32% de fase B); tiempo = 8 min (un 32% de fase B); tiempo = 20 min (un 36% de fase B); tiempo = 32 min (un 90% de fase B). La fase A era ácido fórmico al 0,05% (v/v) en agua, la fase B era CH_{3}CN.

Estas sustancias mostraron actividad antibacteriana frente a estafilococos y enterococos tal como se muestra en la tabla IV. En experimentos de LC-MS las dos sustancias mostraron señales de iones protonados doblemente [M+2H]^{++} correspondientes a antibiótico MF-BA-1768\alpha_{1} y MF-BA-1768\beta_{1}, tal como se describe en la patente de los EE. UU. número 6.551.591 B1.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA IV

7

8

Las condiciones experimentales de las pruebas antimicrobianas fueron las mismas que las utilizadas para las pruebas notificadas en la tabla VI a continuación.

Los análisis de LC-MS de los antibióticos aislados MF-BA-1768\alpha_{1} y MF-BA-1768\beta_{1} se realizaron sobre una columna Symmetry C18 (5:m) 4,6 x 250 mm (Waters; Milford MA, EE.UU.) equipada con una precolumna Symmetry C18 (5:m) 3,9 x 20 mm (mantenidas ambas en un horno a 50ºC de temperatura). Se realizó la elución con una velocidad de flujo de 1 ml/min con el siguiente programa de elución de múltiples etapas: tiempo = 0 min (un 30% de fase B); tiempo = 8 min (un 30% de fase B); tiempo = 20 min (un 45% de fase B); tiempo = 24 min (un 90% de fase B); y tiempo = 28 min (un 90% de fase B). La fase A era tampón HCOONH_{4} 25 mM pH 4,5:CH_{3}CN 95:5 (v/v) y la fase B era CH_{3}CN. El equipo de HPLC se acopló con un espectrómetro de masas de trampa iónica Finnigan LCQ (Thermoquest, Finnigan MAT, San Josè CA, EE.UU.). Se desviaron 100 ml/min de los efluyentes de la columna hacia la fase de contacto de ESI del espectrómetro de masas LCQ. Se realizó el análisis de MS en las siguientes condiciones: entrada de muestra: flujo de gas de separador (N_{2}) 172368,9 Pa, flujo de gas auxiliar 34473,8 Pa; calentador capilar: 210ºC; polaridad de potencial de entrada de muestra tanto positivo como negativo; potencial de pulverización de iones: +/-4,75 KV; potencial capilar: +/-12 V; condiciones de barrido: tiempo de iones máximo 50 ms; microbarrido
completo 3.

Se analizaron los factores de antibiótico individuales MF-BA-1768\alpha_{1} y MF-BA-1768\beta_{1} y factores A1 y A2 de antibiótico 107891 de manera individual y en mezcla. Los resultados se resumen en la siguiente tabla V

TABLA V

9

En el mismo sistema cromatográfico, se eluyó factor A2 de ramoplanina (L. Gastaldo, R. Ciabatti, F. Assi, E. Restelli, J. K. Kettenring, L. F. Zerilli, G. Romanò, M. Denaro y B. Cavalleri, (1992): "Isolation, structure determination and biological activity of A-16686 factors A'1, A'2 y A'3 glycolipodepsipeptide antibiotics", J. Ind. Microbiol. 11:13-18) con un tiempo de retención de 11,00 min.

Espectroscopía de RMN de factor A1 y factor A2 de antibiótico 107891

Se registraron espectros de ^{1}H-RMN de factor A1 y factor A2 de antibiótico 107891 en la mezcla CD_{3}CN:D_{2}O (1:1) a 298 K sobre un espectrómetro Bruker AMX 600 aplicando una secuencia de supresión de agua. Como patrón interno se consideró la señal residual de acetonitrilo-d3 a 1,94 ppm.

A) El espectro de ^{1}H-RMN de factor A1 de antibiótico 107891 se notifica en la figura 8.

El espectro de ^{1}H RMN de factor A1 de antibiótico 107891, disuelto en CD_{3}CN:D_{2}O (1:1), muestra los siguientes grupos de señales (en ppm) a 600 MHz usando CD_{3}CN como patrón interno (1,94 ppm), [\delta = ppm, multiplicidad; (atribución)]: 0,84 d (CH_{3}), 0,89 d (CH_{3}), 0,94 t (CH_{3} superpuestos), 1,1 d (CH_{3}), 1,13 d (CH_{3}), 1,15 t (CH_{3} superpuestos), 149 m (CH_{2}), 1,69 d (CH_{3}), 1,75 m (CH_{2}), 2,11 m (CH), 2,26 m (CH), 2,5 m (CH_{2}), 2,68 -3,8 m (CH_{\beta} peptídicos), 3,8-5,0 m (CH_{\alpha} peptídicos), 5,45-6,17 s (CH_{2}), 5,58 d (doble enlace de CH), 6,36 m (CH), 6,86 d (doble enlace de CH), 7,0-7,45 m (CH aromáticos). La señal de dimetilsulfóxido está presente a 2,58 ppm y la señal de formiato también está presente a 8,33 ppm como impurezas.

B) El espectro de ^{1}H-RMN desacoplado de bb de factor A2 de antibiótico 107891 se notifica en la figura 9.

El espectro de ^{1}H-RMN de factor A2 de antibiótico 107891, disuelto en CD_{3}CN:D_{2}O (1:1), muestra los siguientes grupos de señales (en ppm) a 600 MHz usando CD_{3}CN como patrón interno (1,94 ppm), [\delta = ppm, multiplicidad; (atribución)]: 0,84 d (CH_{3}), 0,88 d (CH_{3}), 0,94 d (CH_{3}), 1,06 d (CH_{3}), 1,14 d (CH_{3}), 148 m (CH_{2}), 1,65-1,75 m (CH_{2}), 1,67 d (CH_{3}), 2,15 m (CH), 2,25 m (CH), 2,5 m (CH_{2}), 2,77-3,8 m (CH_{\beta} peptídicos), 3,8-4,9 m (CH_{\alpha} peptídicos), 5,45-6,14 s (CH_{2}), 5,59 d (doble enlace de CH), 6,34 m (CH), 6,84 d (doble enlace de CH), 7,0-7,42 m (CH aromáticos). La señal de dimetilsulfóxido está presente a 2,58 ppm y la señal de formiato también está presente a 8,32 ppm como impurezas.

Los espectros de ^{13}C-RMN de factor A1 y factor A2 de antibiótico 107891 se registraron en la mezcla CD_{3}CN:D_{2}O (1:1) a 298 K sobre un espectrómetro Bruker AMX 600 usando como patrón interno la señal residual de acetonitrilo-d3 a 1,39 ppm.

C) El espectro de ^{13}C-RMN de factor A1 de antibiótico 107891 se muestra en la figura 10. El espectro de ^{13}C-RMN de factor A1 de antibiótico 107891, disuelto en CD_{3}CN:D_{2}O (1:1), muestra los siguientes grupos de señales (en ppm) a 600 MHz usando CD_{3}CN como patrón interno (1,39 ppm), [\delta = ppm; (atribución)]: 13,6-23,03 (CH_{3} alifáticos), 25,69-77,9 (CH_{2} alifáticos y CH_{\alpha} peptídicos), 105-137,3 (CH aromáticos y de dobles enlaces y carbonos cuaternarios), 165,6-176,6 (carbonilos peptídicos).

D) El espectro de ^{13}C-RMN desacoplado de bb de factor A2 de antibiótico 107891 se muestra en la figura 11.

El espectro de ^{13}C-RMN de factor A2 de antibiótico 107891, disuelto en CD_{3}CN:D_{2}O (1:1), muestra los siguientes grupos de señales (en ppm) a 600 MHz usando CD_{3}CN como patrón interno (1,39 ppm), [\delta = ppm; (atribución)]: 13,6-22,9 (CH_{3} alifáticos), 25,65-73 (CH_{2} alifáticos y CH_{\alpha} peptídicos), 105-137,3 (CH aromáticos y de doble enlace y carbonos cuaternarios), 165,7-176,1 (carbonilos peptídicos).

Espectros UV e IR de factor A1 y factor A2 de antibiótico 107891

A) El espectro infrarrojo de factor A1 de antibiótico 107891 registrado en KBr con un espectrofotómetro Bruker FT-IR modelo IFS 48, muestra máximos de absorción a (cm^{-1}): 3294; 3059; 2926; 1661; 1529; 1433; 1407; 1287; 1114; 1021. El espectro infrarrojo se notifica en la figura 12.

B) El espectro UV de factor A1 de antibiótico 107891 registrado en metanol:H_{2}O 80:20 (v/v) con un espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 16, muestra dos hombros a 226 y 267 nm. El espectro UV se notifica en la figura 13.

C) El espectro infrarrojo de factor A2 de antibiótico 107891 registrado en KBr con un espectrofotómetro Bruker FT-IR modelo IFS 48, muestra máximos de absorción a (cm^{-1}): 3296; 3060; 2928; 1661; 1529; 1433; 1407; 1288; 1116. El espectro infrarrojo se notifica en la figura 14.

D) El espectro UV de factor A2 de antibiótico 107891 registrado en metanol:H_{2}O 80:20 (v/v) con un espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 16, muestra dos hombros a 226 y 267 nm. El espectro UV se notifica en la figura 15.

Basándose en los datos fisicoquímicos notificados anteriormente, puede intentar asignarse la siguiente estructura al factor A1 de antibiótico 107891, que es una realización preferida de la invención junto con las sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

10

\vskip1.000000\baselineskip

Basándose en los datos fisicoquímicos notificados anteriormente, puede intentar asignarse la siguiente estructura al factor A2 de antibiótico 107891, que es una realización preferida de la invención junto con las sales farmacéuticamente aceptables del mismo:

\vskip1.000000\baselineskip

11

Actividad biológica in vitro de antibiótico 107891

Se determinó la actividad antimicrobiana del antibiótico 107891 mediante el procedimiento de microdilución de caldo según las recomendaciones del Comité Nacional para las Normas de Laboratorios Clínicos (National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS, documento M7-A5).

Las cepas usadas fueron aislados clínicos o cepas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). El resultado de las pruebas se notifica en la tabla VI y la tabla VII.

Se disolvió antibiótico 107891 en DMSO para obtener una disolución madre de 1000 \mug/ml, y posteriormente se diluyó en agua para obtener una disolución de trabajo. Los medios usados fueron caldo Mueller Hinton ajustado con cationes (CAMHB) para Staphylococci, M. catarrhalis, Enterococci y L. monocytogenes; caldo Todd Hewitt (THB) para Streptococci; medio GC + Isovitalex al 1% + hemina al 1% para Neisseria spp.; infusión de cerebro y corazón + complemento C al 1% para H. influenzae; caldo de lactobacilos para Lactobacilli; Middlebrook 7H9 enriquecido con Middlebrook OADC para M. smegmatis; medio RPMI 1640 para C. albicans. Caldo Wilkins Chalgren + oxirasa (1:25 v/v) para Clostridia; caldo Brucella que contiene cisteína (0,5 g/L) para Propionibacteria. Los inóculos para las bacterias fueron de 10^{5} UFC/ml. El inóculo de C. albicans fue de 1 X 10^{4} UFC/ml. Todas las pruebas se realizaron en presencia de albúmina de suero bovino (BSA) al 0,02%. Se incubaron los cultivos a 35ºC en aire excepto las cepas de Clostridia y Propioniobacteria que necesitaron atmósfera anaerobia. Tras 18-24 horas se realizaron lecturas visuales y se determinaron las CIM. La CIM se definió como la menor concentración de antibiótico a la que no hay crecimiento visible.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA VI Actividad antimicrobiana de antibiótico 107891

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA VII Actividad antimicrobiana de antibiótico 107891 frente a bacterias anaerobias

14

El antibiótico 107891 muestra una buena actividad antibacteriana frente a bacterias gram-positivas.

El intervalo de CIM frente a Staphylococcus spp., incluyendo cepas resistentes a meticilina (MRSA) e intermedio de glucopéptidos (GISA), es = 0,13-4 \mug/ml y frente a aislados clínicos recientes de Enterococcus spp., incluyendo resistente a vancomicina (VRE), es de 0,5-4 \mug/ml. Frente a Streptococcus spp., las CIM son \leq 0,13 \mug/ml.

\newpage

El antibiótico 107891 también es activo frente a cepas gram-positivas anaerobias; las CIM son \leq 0,13 \mug/ml frente a Clostridia y \leq 0,004-4 \mug/ml frente a Propionibacteria. Se mostraron actividades antimicrobianas frente a cepas de L. monocytogenes (CIM de 0,125 \mug/ml) y Lactobacilli (intervalo de CIM \leq 0,13-4 \mug/ml). Algunas bacterias gram-negativas son sensibles al antibiótico 107891; las CIM son de 1-0,25 \mug/ml frente a M. catharralis, 0,5-0,25 \mug/ml frente a Neisseria spp. y 32 \mug/ml frente a H. influenzae.

El antibiótico 107891 no es activo frente a las cepas de E. coli y C. albicans sometidas a prueba.

En experimentos de muerte con respecto al tiempo, el antibiótico 107891 muestra actividad bactericida frente a las cepas S. aureus GISA y E. faecalis VanA; a las 24 horas la concentración bactericida es el valor de CIM en caldo de Mueller Hinton.

S. aureus puede provocar infecciones potencialmente mortales y MRSA es de significación clínica particular porque es resistente a todas las penicilinas y cefalosporinas y también a muchos otros antibióticos; además se extiende fácilmente de paciente en paciente provocando estallidos de infección con importantes implicaciones para las instalaciones de atención sanitaria (W. Witte, (1999): "Antibiotic resistance in Gram-positive bacteria: epidemiological aspects", Journal of Antimicrobial Chemotherapy 44:1-9). El Sistema de Vigilancia de Infecciones Nosocomiales Nacional (National Nosocomial Infección Surveillance System - NNIS) de los Centros para el Control de las Enfermedades (Centers for Disease Control - CDC) notificó que la resistencia a la meticilina entre S. aureus en hospitales de los EE.UU. aumentó desde el 2,4% en 1975 hasta el 29% en 1991, con un grado superior de resistencia en unidades de cuidados intensivos (L. Archibald, L. Philips, D. Monnet, J. E. Jr Mc Gowan, F. Tenover, R. Gaynes, (1997): "Antimicrobial resistance in isolates from inpatients and outpatients in the United States: increasing importance of the intensive care unit", Clinic Infect. Dis. 24:211-5). Las infecciones por estafilococos nosocomiales están asociadas con morbimortalidad considerable, prolongando la duración de la estancia y aumentando los costes de hospitalización. La mayoría de las cepas de MRSA son resistentes frente a varios de los agentes antimicrobianos más comúnmente usados, incluyendo macrólidos, aminoglucósidos, y los antibióticos de \beta-lactamas en uso actualmente, incluyendo la última generación de cefalosporinas.

Los patógenos adquiridos en hospitales resistentes a vancomicina responsables de infecciones (tales como endocarditis, meningitis y septicemia) presentan un desafío terapéutico creciente (Y. Cetinkaya, P. Falk y C. G. Mayhall, (2000): "Vancomycin-resistant enterococci", Clin. Microbiol. Rev. 13:686-707; L. B. Rice, (2001): "Emergence of vancomycin-resistant enterococci", Emerg. Infec. Dis. 7:183-7).

S. pneumoniae y M. catarrhalis son patógenos importantes reconocidos de seres humanos. Son causas comunes de infecciones de las vías respiratorias, particularmente otitis media en niños e infecciones de las vías respiratorias inferiores en ancianos. Recientemente se han aceptado M. catarrhalis y S. pneumoniae como los patógenos más comunes de las vías respiratorias (M. C. Enright y H. McKenzy, (1997): "Moraxella (Branhamella) catarrhalis. Clinical and molecular aspect of a rediscovered pathogen", J. Med. Microbiol. 46:360-71).

Clostridia son responsables de diferentes enfermedades: gangrene gaseosa e infecciones de heridas relacionadas, tétanos, botulismo, diarrea asociada con antibióticos (CDAD) y colitis seudomembranosa. La mayoría de estos microorganismos producen exotoxinas que desempeñan un papel importante en la patogénesis de las enfermedades. C. difficile es el agente causante responsable del 25% de los casos de CDAD y de prácticamente todos los casos de colitis seudomembranosa. A lo largo de los últimos años, la aparición de coinfección por C. difficile se ha producido en pacientes con colonización o infección por enterococos resistentes a vancomicina (J. G. Bartlett, (1992): "Antibiotic associated diarrhea", Clinic. Infect. Dis. 15:573-581).

\vskip1.000000\baselineskip

Actividad biológica in vitro de factores A1 Y A2 de antibiótico 107891

La tabla VIII notifica las actividades antimicrobianas de los factores A1 y A2 individuales de antibiótico 107891. Se determinaron las CIM mediante un procedimiento de dilución de microcaldo tal como se describió anteriormente.

TABLA VIII Actividad antimicrobiana de los factores A1 y A2 de antibiótico 107891

15

\vskip1.000000\baselineskip

Actividad biológica in vivo de antibiótico 107891

Se usaron ratones ICR hembra (Harlan Italia SpA - S. Pietro al Natisone, Italia) que pesaban 23-25 g en experimentos de infección letal aguda en ratones inmunocompetentes o neutropénicos. Se indujo neutropenia mediante dos administraciones por vía intraperitoneal de ciclofosfamida, 200 y 100 mg/kg, a los cuatro días y un día, respectivamente, antes de infectarse los ratones.

Se indujo la infección inoculando por vía intraperitoneal en ratones inmunocompetentes (8 animales / dosis / grupo de tratamiento) una suspensión bacteriana o bien de aislado clínico de estafilococos resistentes a meticilina (Staph. aureus SA3817) o bien una cepa sensible a meticilina habitual (Staph. aureus Smith ATCC19636), o bien inoculando en ratones neutropénicos un aislado clínico de enterococos resistentes a glucopéptido (Ent. faecalis A533). Las exposiciones bacterianas (cerca de 10^{6} células/ratón) se facilitaron suspendidas en 0,5 ml de mucina bacteriológica al 5% (Difco). Los animales no tratados murieron en un plazo de 24-72 h tras la infección. El tratamiento con antibiótico comenzó en un plazo de 10-15 min tras la exposición. Se administró antibiótico 107891 una vez por vía intravenosa o por vía subcutánea en diferentes formulaciones acuosas. La dosis eficaz al 50% (DE_{50}) y límites de confianza al 95% se calcularon mediante el procedimiento de Spearman-Kärber (D. J. Finney, (1952): "The Spearman-Kärber method", en: Statistical methods in biological assay. págs. 524-530, Charles Griffin & Co., Ltd., Londres) a partir del porcentaje de animales que sobrevivieron al día 7. Los resultados se notifican en la siguiente tabla IX.

El antibiótico 107891 no es tóxico hasta la dosis máxima sometida a prueba de 200 mg/kg.

TABLA IX DE_{50} de antibiótico 107891 en infecciones letales agudas en ratones

16

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A (espectro de baja resolución de barrido completo) y 1B (espectro de alta resolución de barrido ampliado) representa los espectros de masas del antibiótico 107891 que muestran un ión doblemente protonado a m/z 1124 y m/z 1116.

La figura 2 representa el espectro de absorción IR del antibiótico 107891 dispersado en KBr.

La figura 3 representa el espectro de UV del antibiótico 107891 disuelto en metanol:H_{2}O.

La figura 4 representa el espectro de ^{1}H-RMN registrado en la mezcla metanol-d4:H_{2}O (pH 4,3 HCl) 40:10 (v/v) a 40ºC sobre un espectrómetro Bruker AMX 600 aplicando una secuencia de supresión de agua.

La figura 5 representa el espectro de ^{13}C-RMN registrado en la mezcla metanol-d4:H_{2}O (pH 4,3 HCl) 40:10 (v/v) a 40ºC sobre un espectrómetro Bruker AMX 600.

La figura 6A (espectro de baja resolución de barrido completo) y 6B (espectro de alta resolución de barrido ampliado) representan espectros de masa del factor A1 de antibiótico 107891 que muestran un ión doblemente protonado [M+2H]^{2+} a m/z 1124.

La figura 7A (espectro de baja resolución de barrido completo) y 7B (espectro de alta resolución de barrido ampliado) representan espectros de masas del factor A2 de antibiótico 107891 que muestran un ión doblemente protonado [M+2H]^{2+} a m/z 1116.

La figura 8 representa el espectro de ^{1}H-RMN del factor A1 de antibiótico 107891 registrado en la mezcla CD_{3}CN:D_{2}O (1:1) a 298 K sobre un espectrómetro Bruker AMX 600 aplicando una secuencia de supresión de agua.

La figura 9 representa el espectro de ^{1}H-RMN del factor A2 de antibiótico 107891 registrado en la mezcla CD_{3}CN:D_{2}O (1:1) a 298 K sobre un espectrómetro Bruker AMX 600 aplicando una secuencia de supresión de agua.

La figura 10 representa el espectro de ^{13}C-RMN del factor A1 de antibiótico 107891 registrado en la mezcla CD_{3}CN:D_{2}O (1:1) a 298 K sobre un espectrómetro Bruker AMX 600.

La figura 11 representa el espectro de ^{13}C-RMN del factor A2 de antibiótico 107891 registrado en la mezcla CD_{3}CN:D_{2}O (1:1) a 298 K sobre un espectrómetro Bruker AMX 600.

La figura 12 representa el espectro de absorción IR del factor A1 de antibiótico 107891 dispersado en KBr.

La figura 13 representa el espectro de UV del factor A1 de antibiótico 107891 disuelto en metanol:H_{2}O.

La figura 14 representa el espectro de absorción IR del factor A2 de antibiótico 107891 dispersado en KBr.

La figura 15 representa el espectro de UV del factor A2 de antibiótico 107891 disuelto en metanol:H_{2}O.

Ejemplos Ejemplo 1 Procedimiento de fermentación de Microbispora sp. ATCC PTA-5024

Se mantuvo la cepa Microbispora sp. ATCC PTA-5024 sobre agar de harina de avena inclinado durante 2-3 semanas a 28ºC. Se rascó el contenido microbiano de una inclinación con 5 ml de agua estéril y se inoculó dentro de matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenían 100 ml de medio de siembre (AF/MS) que estaba compuesto por (g/l): dextrosa 20, extracto de levadura 2, soja triturada 8, NaCl 1 y carbonato de calcio 4. Se preparó el medio en agua destilada y se ajustó el pH hasta 7,3 antes de la esterilización a 121ºC durante 20 min. Se hicieron crecer los matraces inoculados a 28ºC, sobre un agitador giratorio que funcionaba a 200 rpm. Tras 4-6 días, se inoculó el 5% de este cultivo dentro de una segunda serie de matraces que contenían el mismo medio de fermentación. Tras 72 horas de incubación, se transfirieron 200 ml dentro de un biorreactor de 4 l que contenía 3 l del mismo medio vegetativo.

Se llevó a cabo la fermentación a 30ºC, con una agitación de 700 rpm y una aireación de 0,5 vvm. Tras 72 horas se transfirió el cultivo (1,5 l) dentro de un biorreactor de 20 l que contenía 15 l del mismo medio vegetativo. Se llevó a cabo la fermentación durante 48 horas a 30ºC, con una agitación de 500 rpm y una aireación de 0,5 vvm y luego se transfirió al tanque de producción. Se realizó la producción de antibiótico 107891 en un fermentador de 300 l que contenía 200 l del medio de producción M8 compuesto por (g/l): almidón 20, glucosa 10, extracto de levadura 2, caseína hidrolizada 4, extracto de carne 2 y carbonato de calcio 3. Se preparó el medio en agua desionizada y se ajustó el pH hasta 7,2 antes de la esterilización a 121ºC durante 25 min. Tras enfriar, se inocularon en el fermentador aproximadamente 14 l (7%) de cultivo previo. Se hizo funcionar el fermentador a 29ºC, con una agitación de 180 rpm y una aireación de 0,5 vvm con una presión en cabeza de 0,36 bar. Se recogió el fermentador tras 98 horas de fermentación.

Se monitorizó la producción del antibiótico 107891 mediante HPLC tal como se describió anteriormente, tras la extracción del caldo de cultivo completo con el mismo volumen de metanol. Se realizó la extracción a temperatura ambiente con agitación durante una hora.

Ejemplo 2 Procedimiento de fermentación alternativo de Microbispora sp. ATCC PTA-5024

Se inoculó Microbispora sp. ATCC PTA-5024 en matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenían 100 ml de medio de crecimiento (G1) constituido por g/l: glucosa 10, maltosa 10, aceite de soja 10, soja triturada 8, extracto de levadura 2 y carbonato de calcio 4. Se preparó el medio en agua desionizada y se esterilizó a 120ºC x 20 min. sin ajuste de pH. Se incubaron los matraces inoculados durante 120-168 horas a 28ºC, con una agitación de 200 hasta que se observó un buen crecimiento. Entonces se usaron los matraces para inocular (3%) un biorreactor de 4 l que contenía 3 l de medio de siembra AF/MS, que está compuesto tal como se describió en el ejemplo 1. Tras 120 horas de fermentación a 30ºC, agitación de 700 rpm y aireación de 0,5 vvm, se transfirieron 1,5 l del cultivo a un biorreactor de 20 l que contenía 15 l del mismo medio vegetativo. Se llevó a cabo la fermentación durante 96 horas a 30ºC, agitación de 600 rpm y aireación de 0,5 vvm, y entonces se transfirió al tanque de producción.

Se obtuvo la producción de antibiótico en un fermentador de 300 l que contenía 200 l del medio productivo (V6) constituido por (g/l): dextrosa 20, extracto de levadura 5, extracto de carne 5, caseína hidrolizada 3, peptona 5 y NaCl 1,5. Se preparó el medio en agua desionizada y se ajustó el pH hasta 7,5 con NaOH, y se esterilizó a 121ºC durante
20 min.

Se inocularon en el fermentador 14 l de cultivo de siembra (7%) y se llevó a cabo la fermentación a 29ºC, con agitación de 180 rpm, aireado con 100 l de aire convencional por minuto (0,5 vvm). Se monitorizó la producción de antibiótico 107891 mediante HPLC tal como se describió anteriormente. Se recogió la fermentación tras aproximadamente 160 horas.

Ejemplo 3 Recuperación de antibiótico 107891

Se filtró el caldo de fermentación descrito en el ejemplo 1 mediante un sistema de filtración tangencial (membrana de 0,1 \mum de tamaño de poro, Koch Carbo-Cor, Koch Wilmington, EE.UU.) para obtener 170 l de sobrenadante y 30 l de micelio concentrado. Se encontró el complejo de antibiótico 107891 tanto en el filtrado (A) como en el micelio (B).

(A) Se agitó el caldo filtrado durante una noche a temperatura ambiente en presencia de resina de poliestireno Diaion HP-20 (4 l). Entonces se recuperó la resina, se lavó con 10 l de metanol:agua 4:6 (v/v) y se eluyó de manera continua inicialmente con 10 l de metanol:agua 9:1 (v/v) y luego con 10 l de metanol:butanol:agua: 9:1:1 (v/v). Se concentraron las fracciones eluídas combinadas que contenían antibiótico 107891 hasta un pequeño volumen sobre un evaporador giratorio y luego se liofilizaron, dando 32 g de material de partida. Se disolvió este material de partida en n-butanol (1 l) y luego se extrajo secuencialmente tres veces con 800 ml de agua. Se concentró la fase orgánica a presión reducida para dar un residuo aceitoso, que se disolvió en metanol. Con la adición de éter de petróleo, se obtuvieron 5 g de preparación de antibiótico bruto mediante precipitación.

(B) Tras la adición de 25 l de metanol, se agitó la parte retenida que contenía el micelio durante 1 hora y se filtró para obtener 45 l de extracto de micelio. Entonces se diluyó esta disolución con agua (20 l) y se agitó durante una noche a temperatura ambiente resina de poliestireno Diaion HP-20 (1 l). Entonces se recuperó la resina, se lavó con 2 l de metanol:agua 40:60 (v/v) y se eluyó secuencialmente de manera continua con 3 l de metanol:agua 85:15 (v/v) y luego con 2 l de metanol:agua 90:10 (v/v). Se monitorizaron las fracciones eluídas para determinar la presencia de antibiótico 107891 mediante un ensayo de difusión de agar sobre Staphilococcus aureus y mediante un procedimiento de HPLC analítica tal como se notificó anteriormente.

Se combinaron las fracciones eluídas que contenían antibiótico 107891, se concentraron a presión reducida y se liofilizaron, dando 8,1 gramos de antibiótico 107891 bruto.

Ejemplo 4 Recuperación alternativa de antibiótico 107891

Se llevó el caldo recogido de la fermentación en tanque de 200 l descrito en el ejemplo 2 hasta pH 6,8 y se filtró el caldo mediante filtración tangencial (membrana de 0,1 \mu de tamaño de poro, Koch Carbo-Cor). Se agitó el permeado (180 l) de manera continua durante toda la noche a temperatura ambiente con 2 l de resina Diaion HP20 (Mitsubishi Chemical) y entonces se recogió la resina.

Se añadió metanol (25 l) a la parte retenida en el equipo de filtración tangencial (aproximadamente 20 l) que contenía el micelio concentrado. Se agitó esta suspensión durante 1 hora y luego se filtró con el sistema de microfiltración para dar un volumen retenido residual de aproximadamente 20 l. Entonces se añadió metanol adicional (25 l) y se repitió el procedimiento anterior secuencialmente durante un total de 5 ciclos. Se diluyeron los extractos de metanol combinados (aproximadamente 125 l) con 160 l de agua desmineralizada y se agitaron de manera continua durante toda la noche a temperatura ambiente con 3 l de resina Diaion HP 20. Entonces se recogió la resina, y se combinó con la resina Diaion HP 20 usada para extraer el permeado de caldo según el procedimiento descrito anteriormente. Se lavó la resina combinada dentro de una columna cromatográfica con 20 l de agua:metanol 6:4 (v/v). Se eluyó el antibiótico 107891 con 23 l de metanol:tampón de formiato de amonio 50 mM pH 3,5:n-butanol 9:1:1 (v/v). Entonces se concentró a vacío este eluato hasta un volumen final de 3 l. Entonces se cargó la disolución concentrada a pH 4,5 sobre una columna de 2,5 l de poliamida CC 6 0,1-0,3 mm (Macherey-Nagel) condicionada con agua:metanol 7:3 (v/v). Se lavó la columna con agua:metanol 7:3 (v/v) y luego con tampón de formiato de amonio 25 mM pH 3,5:metanol 7:3 (v/v). Se eluyó el antibiótico con mezcla agua:metanol 3:7 (v/v) y luego con 1:9 (v/v). Se completó la elución con tampón de formiato de amonio 25 mM pH 2,8:metanol con una razón de 1:9 (v/v). Se combinaron los eluatos que contenían antibiótico 107891 y se concentraron a vacío hasta un volumen final de 1 l. Se llevó el pH de la disolución concentrada desde 4 hasta 5,7 con hidróxido de amonio 7 M y luego se centrifugó la mezcla para recoger el precipitado. Se suspendió este sólido en agua y se liofilizó, dando 6,96 g de preparación de antibiótico 107891.

Ejemplo 5 Purificación de antibiótico 107891

Se purificó antibiótico 107891 bruto (3,6 g), preparado tal como se describió en el ejemplo 3, mediante cromatografía a presión media sobre 100 g de fase inversa C8 (EC) 40-70 \mum de tamaño de partícula, 60A de tamaño de poro, IST (International Sorbent Technology, Mid-Glamorgan, RU) usando un sistema de cromatografía de presión media Bùchi B-680 (Bùchi laboratoriums-technik AG, Flawil Switzerland) equipado con un formador de gradiente B-687, colector de fracciones B-684, columna de vidrio B-685 70 X 460 mm. Se condicionó previamente la resina con una mezcla de fase A:fase B 8:2 (v/v) y entonces se eluyó a 25 ml/min con un gradiente lineal de 60 min desde el 20% hasta el 60% de fase B en 60 min.

La fase A fue acetonitrilo:tampón de formiato de amonio 20 mM (pH 6,6) 10:90 (v/v); y la fase B fue acetonitrilo:tampón de formiato de amonio 20 mM (pH: 6,6) 90:10 (v/v).

Se combinaron las fracciones que contenían antibiótico 107891, se concentraron a vacío y se liofilizaron dos veces en agua, dando 430 mg de antibiótico 107891 purificado.

Ejemplo 6 Purificación de antibiótico 107891 mediante HPLC preparativa

Se purificó adicionalmente el antibiótico 107891 mediante HPLC preparativa sobre una columna Lichrosorb RP8 preempaquetada de Hibar (7 :m de tamaño de partícula) RT 250-25 mm, Merck, usando una elución en gradiente lineal de 25 minutos desde el 30% hasta el 45% de fase B, con una velocidad de flujo de 30 ml/min. La fase A fue tampón de formiato de amonio 25 mM pH 4,5:acetonitrilo 95:5 (v/v) y la fase B fue acetonitrilo.

Se disolvió una muestra de antibiótico 107891 del ejemplo 5 (300 mg) en 1,5 ml 350:1 de DMSO:ácido fórmico 95:5 (v/v) y se trataron 300 \mul mediante serie cromatográfica. Se eluyó normalmente el antibiótico 107891 a los 15-16 minutos. Se combinaron las fracciones eluídas de 5 series cromatográficas, que contenían antibiótico 107891, y se concentraron a vacío. Se liofilizó secuencialmente la disolución residual en agua tres veces, dando 31 mg de antibiótico 107891 como un polvo blanco.

Ejemplo 7 Separación y purificación de factores A1 y A2 individuales de antibiótico 107891

Se separaron los factores A1 y A2 y se purificaron del complejo de antibiótico 107891 del ejemplo 5 mediante HPLC preparativa sobre una columna Symmetry Prep C18 (7 \mum de tamaño de partícula) 7,8 x 300 mm Waters (Mildfold EE.UU.) usando dos programas de elución diferentes.

A) Se purificó el factor A1 mediante una elución en gradiente lineal de 25 minutos desde el 30% hasta el 45% de fase B, con una velocidad de flujo de 3,5 ml. La fase A fue tampón de formiato de amonio 25 mM pH 4,5:acetonitrilo 95:5 (v/v) y la fase B fue acetonitrilo. Se disolvió el complejo de antibiótico 107891 purificado en 350 \mul de DMSO:ácido fórmico 95:5 (v/v) y se trató mediante serie cromatográfica. Los factores A1 y A2 eluyeron normalmente en un marco de tiempo de 11-13 minutos. Entonces se analizaron las fracciones eluídas mediante HPLC en las condiciones analíticas descritas anteriormente. Se combinaron las fracciones de 14 series cromatográficas, que contenían factor A1 de antibiótico 107891 puro, y se concentraron a vacío. Se liofilizó secuencialmente la disolución resultante en agua tres veces, dando 15 mg de factor A1 puro como un polvo blanco.

B) Se purificó el factor A2 mediante elución isocrática con una velocidad de flujo de 7 ml con tampón de formiato de amonio 100 mM pH 4:acetonitrilo 82,5:17,5 (v/v). Se disolvió el complejo de antibiótico 107891 purificado (5 mg) en 250 \mul de mezcla ácido acético:acetonitrilo:tampón de formiato de amonio 100 mM pH 4 50:120:80 (v/v) y se trató mediante serie cromatográfica. Los factores A1 y A2 eluyeron normalmente en un marco de tiempo de 9-10 minutos. Entonces se analizaron las fracciones eluídas mediante HPLC en las condiciones analíticas descritas anteriormente. Se combinaron las fracciones de 20 series cromatográficas, que contenían factor A2 de antibiótico 107891 puro, y se concentraron a vacío. Se liofilizó la disolución residual dos veces en agua dando 8 mg de factor A2 puro como un polvo blanco.

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Vicuron Pharmaceuticals Inc,

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Antibiótico 107891, sus factores A1 y A2, composiciones y sales farmacéuticamente aceptables, y usos del mismo

\vskip0.400000\baselineskip

<130> G69277

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1443

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Microbispora sp. ATCC PTA-5024

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1).. (1443)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> segmento génico que especifica ARNr 16S

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

19

Claims

1. Complejo de antibiótico 107891 que comprende factor A1 y factor A2 que es un polvo blanco que tiene las siguientes características:

(A) espectro de masas registrado a partir de una disolución 0,2 mg/ml en metanol:agua 80/20 (v/v) con un 0,1% de ácido trifluoroacético (figura 1A y 1B) sobre un instrumento Thermofinnigan LCQ deca equipado con una fuente de electropulverización, usando una mezcla de calibración Thermofinnigan en las siguientes condiciones de electropulverización: potencial de pulverización: 4,7 kV; temperatura capilar: 220º C; potencial capilar: 3V; modo de infusión 10 \mul/min, que muestra dos iones dobles protonados a m/z 1124 y m/z 1116, que corresponden a la composición de isótopos inferiores de factor A1 y A2; respectivamente.

(B) espectro infrarrojo (figura 2) registrado en KBr con un espectrofotómetro Bruker FT-IR modelo IFS 48, que muestra máximos de absorción a (cm^{-1}): 3263; 2929; 1661; 1533; 1402; 1114; 1026.

(C) espectro de UV (figura 3); realizado en metanol:H_{2}O 80:20 (v/v) con un espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 16, que muestra dos hombros a 226 y 267 nm.

(D) espectro de ^{1}H-RMN (figura 4) registrado a 600 MHz en la mezcla metanol-d4:H_{2}O (pH 4,3 HCl) 40:10 (v/v) a 40ºC sobre un espectrómetro Bruker AMX 600 aplicando una secuencia de supresión de agua usando como patrón interno la señal residual de metanol-d4 a 3,31 ppm, que muestra las siguientes señales [\delta = ppm multiplicidad; (atribución)]: 0,93 d (CH_{3}), 0,98 d (CH_{3}), 1,07 t (CH_{3} superpuestos), 1,18 t (CH_{3} superpuestos), 1,26 s (CH_{3}), 1,30 t (CH_{3} superpuestos), 1,62-1,74 m (CH_{2}), 1,78 d (CH_{3}), 1,80 d (CH_{3}), 2,03 m (CH_{2}), 2,24 m (CH), 2,36 m (CH_{2}), 2,72-3,8 m(CH alfa peptídicos), 3,8-5,2 m (CH alfa peptídicos), 5,53-6,08 s (CH_{2}), 5,62 d (doble enlace de CH), 6,42 m (CH), 6,92 d (doble enlace de CH), 7,0-7,55 m (CH aromáticos), 7,62-10,4 d y m (NH aromático y peptídico).

(E) espectro de ^{13}C-RMN (figura 5) registrado en la mezcla metanol-d4:H_{2}O (pH 4,3 HCl) 40:10 (v/v) a 40ºC sobre un espectrómetro Bruker AMX 600, usando como patrón interno la señal residual de metanol-d4 a 49,15 ppm, que muestra las siguientes señales: [\delta = ppm; (atribución)]: 13:6-23,2 (CH_{3} alifáticos), 26,16-73 (CH_{2} alifáticos y CH alfa peptídicos), 105-136 (CH aromáticos y de dobles enlaces y carbonos cuaternarios), 164,3-176,3 (carbonilos peptídicos).

(F) el hidrolizado ácido en HCl 6 N, (105ºC, 24 h) que muestra la presencia de los siguientes aminoácidos, junto con otros picos no identificados, tras la derivatización con carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilo: lantionina, metil-lantionina, glicina, prolina, valina, ácido aspártico (producto de hidrólisis de asparagina), fenilalanina y leucina.

G) el hidrolizado ácido en ácido metanosulfónico 4 N que contiene 3-(2-aminoetil)indol al 0,2% (p/v) como catalizador (115ºC, 16 h) que muestra la presencia de 5-clorotriptofano.

H) una función ionizable básica detectada mediante valoración de ácido/base realizada con hidróxido de potasio 0,01 N en 2-metoxietanol (MCS):H_{2}O 12:3 (v/v) que contiene un exceso molar de ácido clorhídrico 0,01 N;

y sus sales con ácidos.

2. Factor A1 de antibiótico 107891 que es un polvo blanco que muestra:

A) un ión doblemente protonado en m/z 1124 que corresponde a la composición de isótopos inferiores en el espectro de masa registrado a partir de una disolución 0,1 mg/ml en acetonitrilo:agua 50:50 (v/v) con un 0,5% de ácido acético (figuras 6A y 6B) sobre un instrumento Thermofinnigan LCQ deca equipado con una fuente de electropulverización, usando una mezcla de calibración Thermofinnigan en las siguientes condiciones de electrospray: potencial de pulverización: 4,7 kV; temperatura capilar: 250º C; potencial capilar: 8V; modo de infusión 10 \mul/min.

B) la masa exacta de antibiótico determinada usando un espectrómetro Bruker Daltonics APEX II, 4,7 Tesla equipado con una fuente de electropulverización, correspondiente a un peso molecular de 2246,71 \pm 0,06, masa monoisotópica calculada a partir de [M+2H]^{2+} a m/z 1124,36124 (precisión de 30 ppm).

C) cuando se disuelve en CD_{3}CN:D_{2}O (1:1), el espectro de ^{1}H-RMN (figura 8) muestra los siguientes grupos de señales (en ppm) a 600 MHz usando CD_{3}CN como patrón interno (1,94 ppm), [\delta = ppm, multiplicidad; (atribución)]: 0,84 d (CH_{3}), 0,89 d (CH_{3}), 0,94 t (CH_{3} superpuestos), 1,1 d (CH_{3}), 1,13 d (CH_{3}), 1,15 t (CH_{3} superpuestos), 149 m (CH_{2}), 1,69 d (CH_{3}), 1,75 m (CH_{2}), 2,11 m (CH), 2,26 m (CH), 2,5 m (CH_{2}), 2,68 -3,8 m (CH_{\beta} peptídicos), 3,8 -5,0 m(CH_{\alpha} peptídicos), 5,45-6,17 s (CH_{2}), 5,58 d (doble enlace de CH), 6,36 m (CH), 6,86 d (doble enlace de CH), 7,0-7,45 m (CH aromáticos).

D) cuando se disuelve en CD_{3}CN:D_{2}O (1:1), el espectro de ^{13}C-RMN (figura 10) muestra las siguientes señales (en ppm) a 600 MHz usando CD_{3}CN como patrón interno (1,39 ppm), [\delta = ppm; (atribución)]: 13,6-23,03 (CH_{3} alifáticos), 25,69-77,9 (CH_{2} alifáticos y CH_{\alpha} peptídicos), 105-137,3 (CH aromáticos y de doble enlace y carbonos cuaternarios), 165,6-176,6 (carbonilos peptídicos).

E) espectro infrarrojo registrado en KBr con un espectrofotómetro Bruker FT-IR modelo IFS 48 (figura 12) que muestra máximos de absorción a (cm^{-1}): 3294; 3059; 2926; 1661; 1529; 1433; 1407; 1287; 1114; 1021.

F) espectro de UV registrado en metanol:H_{2}O (con una razón de 80:20) con un espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 16 (figura 13) que muestra dos hombros a 226 y 267 nm.

G) el hidrolizado ácido en HCl 6 N, (105ºC, 24 h) que muestra la presencia de los siguientes aminoácidos, junto con otros picos no identificados, tras la derivatización con carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilo: lantionina, metil-lantionina, glicina, prolina, valina, ácido aspártico (producto de hidrólisis de asparagina), fenilalanina, y leucina.

H) el hidrolizado ácido en ácido metanosulfónico 4 N que contiene 3-(2-aminoetil)indol al 0,2% (p/v) como catalizador (115ºC, 16 h) que muestra la presencia de 5-clorotriptofano;

y sus sales con ácidos.

3. Factor A1 de antibiótico 107891 según la reivindicación 2, al que puede asignarse la siguiente fórmula de estructura:

20

4. Factor A2 de antibiótico 107891 que es un polvo blanco que muestra:

A) un ión doblemente protonado en m/z 1116 que corresponde a la composición de isótopos inferiores en el espectro de masa registrado a partir de una disolución 0,1 mg/ml en acetonitrilo:agua 50:50 (v/v) con un 0,5% de ácido acético (figura 7A y 7B) sobre un instrumento Thermofinnigan LCQ deca equipado con una fuente de electropulverización, usando una mezcla de calibración Thermofinnigan en las siguientes condiciones de electropulverización: potencial de pulverización: 4,7 kV; temperatura capilar: 250ºC; potencial capilar: 8 V; modo de infusión 10 \mul/min.

B) la masa exacta determinada usando un espectrómetro Bruker Daltonics APEX II, 4,7 Tesla equipado con una fuente de electropulverización, correspondiente a un peso molecular de 2230,71 \pm 0,06, masa monoisotópica calculada a partir de [M+2H]^{2+} a m/z 1116,36260 (precisión de 30 ppm).

C) cuando se disuelve en CD_{3}CN:D_{2}O (1:1), el espectro de ^{1}H-RMN (figura 9) muestra las siguientes señales (en ppm) a 600 MHz usando CD_{3}CN como patrón interno (1,94 ppm), [\delta = ppm, multiplicidad; (atribución)]: 0,84 d (CH_{3}), 0,88 d (CH_{3}), 0,94 d (CH_{3}), 1,06 d (CH_{3}), 1,14 d (CH_{3}), 148 m (CH_{2}), 1,65-1,75 m (CH_{2}), 1,67 d (CH_{3}), 2,15 m(CH), 2,25 m (CH), 2,5 m (CH_{2}), 2,77-3,8 m (CH_{\beta} peptídicos), 3,8-4,9 m (CH_{\alpha} peptídicos), 5,45-6,14 s (CH_{2}), 5,59 d (doble enlace de CH), 6,34 m (CH), 6,84 d (doble enlace de CH), 7,0-7,42 m (CH aromáticos).

D) cuando se disuelve en CD_{3}CN:D_{2}O (1:1), el espectro de ^{13}C-RMN (figura 11), muestra las siguientes señales (en ppm) a 600 MHz usando CD_{3}CN como patrón interno (1,39 ppm), [\delta = ppm; (atribución)]: 13,6-22,9 (CH_{3} alifáticos), 25,65-73 (CH_{2} alifáticos y CH_{\alpha} peptídicos), 105-137,3 (CH aromáticos y de dobles enlaces y carbonos cuaternarios), 165,7-176,1 (carbonilos peptídicos).

E) espectro infrarrojo registrado en KBr con un espectrofotómetro Bruker FT-IR modelo IFS 48 (figura 14), que muestra máximos de absorción a (cm^{-1}): 3296; 3060; 2928; 1661; 1529; 1433; 1407; 1288; 1116.

F) espectro de UV registrado en metanol:H_{2}O (con una razón de 80:20) con un espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 16 (figura 15) que muestra dos hombros a 226 y 267 nm.

G) el hidrolizado ácido en HCl 6 N, (105ºC, 24 h) que muestra la presencia de los siguientes aminoácidos, junto con otros picos no identificados, tras la derivatización con carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilo: lantionina, metil-lantionina, glicina, prolina, valina, ácido aspártico (producto de hidrólisis de asparagina), fenilalanina y leucina.

y sus sales con ácidos.

5. Factor A2 de antibiótico 107891 según la reivindicación 4, al que puede asignarse la siguiente fórmula de estructura

21

6. Procedimiento para producir antibiótico 107891 y sus factores A1 y A2 y las sales del mismo con ácidos según la reivindicación 1, que comprende:

- cultivar Microbispora sp. ATCC PTA-5024 o una variante o mutante de la misma que conserva la capacidad para producir dicho antibiótico, en condiciones aerobias, en un medio nutriente acuoso que contiene una fuente asimilable de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas;

- aislar el antibiótico resultante del micelio y/o del caldo de fermentación filtrado;

- purificar el antibiótico 107891 aislado y, opcionalmente, separar el factor A1 y el factor A2 del mismo.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que se cultivan previamente la cepa Microbispora sp. ATCC PTA-5024 o la variante o mutante de la misma que produce antibiótico 107891.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7, en el que el aislamiento del antibiótico 107891 se lleva a cabo filtrando el caldo de fermentación y se recupera el antibiótico del caldo de fermentación filtrado según una técnica seleccionada de: extracción con un disolvente no miscible con agua, precipitación mediante adición de un no disolvente o cambiando el pH de la disolución, cromatografía de absorción, cromatografía de partición, cromatografía de partición en fase inversa, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular, y una combinación de dos o más de dichas técnicas.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7, en el que el aislamiento del antibiótico 107891 se lleva a cabo separando el micelio del sobrenadante del caldo de fermentación y se extrae el micelio con un disolvente miscible con agua mediante lo cual, tras retirar el micelio gastado, se obtiene una disolución miscible con agua que contiene el antibiótico bruto, que puede tratarse o bien por separado o bien en combinación con el caldo de fermentación filtrado según la reivindicación 8 para recuperar el antibiótico 107891 por medio de una técnica seleccionada de: extracción con un disolvente, precipitación mediante adición de un no disolvente o cambiando el pH de la disolución, cromatografía de absorción, cromatografía de partición, cromatografía de partición de fase inversa, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión molecular, o una combinación de dos o más de dichas técnicas.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, mediante el cual se reduce la concentración del disolvente miscible con agua en el extracto de micelio antes de tratarlo para recuperar el antibiótico del mismo.

11. Procedimiento según la reivindicación 8, mediante el cual se pone en contacto el caldo de fermentación filtrado con una resina de absorción, preferiblemente una resina de poliestireno, una de poliestireno-divinilbenceno mixta o una de poliamida, y se eluye dicha resina con un disolvente polar, miscible con agua o una mezcla del mismo con agua, mediante lo cual se obtiene una disolución que contiene el antibiótico 107891 bruto.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, en el que se extrae el micelio con un alcanol C_{1}-C_{3}, preferiblemente metanol, y se pone en contacto el extracto de micelio con una resina de absorción, preferiblemente una resina de poliestireno, y se eluye de la misma con un disolvente polar miscible con agua o una mezcla del mismo con agua, mediante lo cual se obtiene una disolución que contiene el antibiótico 107891 bruto.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8, 9, 10 y 12, en el que se combinan las disoluciones que contienen el antibiótico 107891 bruto y se tratan para una purificación adicional de dicho antibiótico 107891.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11, 12 y 13, en el que se concentra la disolución que contiene el antibiótico 107891 bruto y luego se liofiliza para dar un producto sólido de antibiótico 107891 bruto.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, en el que se combinan las resinas de absorción que contienen el antibiótico absorbido y se eluye su mezcla con un disolvente polar, miscible con agua o una mezcla del mismo con agua.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, en el que se purifica el antibiótico 107891 por medio de un procedimiento cromatográfico, preferiblemente mediante HPLC preparativa o cromatografía de presión media.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 16, en el que se separan el factor A1 y el factor A2 mediante HPLC preparativa del antibiótico 107891 purificado.

18. Composición farmacéutica que comprende un antibiótico seleccionado de antibiótico 107891, su factor A1, su factor A2 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y una mezcla de dichos factores en cualquier proporción o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos con un ácido.

19. Composición farmacéutica según la reivindicación 18, que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. Antibiótico 107891, su factor A1, sus factor A2, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una mezcla de dichos factores en cualquier proporción o una sal farmacéuticamente aceptable correspondiente con un ácido para su uso como un medicamento.

21. Uso de antibiótico 107891, su factor A1, su factor A2, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una mezcla de dichos factores en cualquier proporción o una sal farmacéuticamente aceptable correspondiente con un ácido para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas.

22. Uso del antibiótico 107891, su factor A1, su factor A2 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una mezcla de dichos factores en cualquier proporción y una sal no tóxica correspondiente con un ácido como promotor del crecimiento animal.

23. Cultivo biológicamente puro de la cepa Microbispora sp. ATCC PTA-5024, o una variante o mutante de la misma que conserva la capacidad para producir el antibiótico según la reivindicación 1 cuando se cultiva en condiciones aerobias sumergidas en presencia de fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas.