ES2276416T3 - Genes de la rafinosa sinteasa y su uso. - Google Patents
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Abstract
SE AISLARON DE VARIAS PLANTAS GENES DE RAFINOSA SINTETASA QUE CODIFICAN PROTEINAS CAPACES DE PRODUCIR RAFINOSA AL COMBINAR UN GRUPO D - GALACTOSILO A TRAVES DE UN ENLACE AL (1->6) CON UN GRUPO HIDROXILO UNIDO AL ATOMO DE CARBONO SITUADO EN POSICION 6 DE UN RESIDUO D - GLUCOSA PRESENTE EN UNA MOLECULA DE SUCROSA. ESTOS GENES DE RAFINOSA SINTETASA SON UTILES PARA MODIFICAR EL CONTENIDO DE OLIGOSACARIDOS DE LA FAMILIA DE LA RAFINOSA PRESENTE EN LAS PLANTAS.
Description
Genes de la rafinosa sinteasa y su uso.
La presente invención se refiere a genes de la
rafinosa sintetasa y a su uso.
Los oligosacáridos de la familia de la rafinosa
son derivados de sacarosa, que están representados por
o-\alpha-D-galactopiranosil-(1\rightarrow6)n-o-\alpha-D-glucopiranosil-(1\rightarrow2)-\beta-D-flucto-furanósido
como fórmula general, y se denominan "rafinosa" cuando n = 1,
"estaquiosa" cuando n = 2, "verbascosa" cuando n = 3, y
"ajugosa" cuando n = 4.
Los contenidos más altos de semejantes
oligosacáridos de la familia de la rafinosa se encuentran en las
plantas, excepto para la sacarosa, y se ha sabido que están
contenidos no sólo en plantas superiores incluyendo gimnospermas
tales como plantas pináceas (v.g., pícea) y angiospermas tales como
plantas leguminosas (v.g., soja, judía), plantas brasicáceas (v.g.,
colza), plantas quenopodiáceas (v.g., remolacha azucarera), plantas
malváceas (v.g., algodón), y plantas salicáceas (v.g., chopo), sino
también en algas verdes, clorella. Así, se producen ampliamente en
el reino de las plantas de una manera similar a la sacarosa.
Los oligosacáridos de la familia de la rafinosa
juegan un papel como azúcares de reserva en los órganos de
almacenamiento o las semillas de muchas plantas como azúcares de
traslocación en el fenómeno del transporte de azúcares entre los
tejidos de algunas plantas.
Además, se ha sabido que los oligosacáridos de
la familia de la rafinosa tienen el efecto de ofrecer buenas
condiciones para la flora enterobacteriana, si estuviera presente en
una cantidad adecuada en los alimentos. Por consiguiente, los
oligosacáridos de la familia de la rafinosa ya han sido utilizados
como sustancia alimenticia funcional para la adición a algunas
clases de alimentos y se utilizan en el campo de los alimentos
saludables especificados.
Los oligosacáridos de la familia de la rafinosa
que tienen semejante papel y utilidad son producidos por el sistema
de síntesis de oligosacáridos de rafinosa que comienza con la
sacarosa en muchas plantas. El sistema de biosíntesis implica
usualmente una reacción para la adición sucesiva de grupos
galactosilo a partir de galactinol a través de un enlace
\alpha(1\rightarrow6) a un grupo hidroxilo del átomo de
carbono de la posición 6 de un resto D-glucosa en
una molécula de sacarosa.
En la primera etapa de este sistema de
biosíntesis, la rafinosa sintetasa es una enzima implicada en la
reacción de producción de rafinosa combinando un grupo galactosilo
del galactinol a través de un enlace
\alpha(1\rightarrow6) con un grupo hidroxilo anclado al
átomo de carbono de la posición 6 de un resto
D-glucosa en una molécula de sacarosa. Se ha
sugerido que esta enzima constituye la etapa limitante de la
velocidad en el sistema de síntesis anterior, y se ha revelado que
esta enzima es bastante importante en el control de la biosíntesis
de los oligosacáridos de la familia de la rafinosa.
El control del nivel de expresión o de la
actividad de la rafinosa sintetasa en plantas hace posible cambiar
los contenidos de oligosacáridos de la familia de la rafinosa en
estas plantas. No obstante, la rafinosa sintetasa, aunque la
presencia de esta misma enzima ya fue confirmada en muchas plantas
mediante la medición de su actividad con una técnica bioquímica,
todavía no ha sido aislada y purificada con éxito en forma de una
proteína homogénea. Castillo E. et al., en el Journal of
Agricultural and Food Chemistry, vol. 38. núm. 2, pág. 351.5, los
autores informan de una purificación doble de rafinosa sintetasa a
partir de semillas de soja. Además, la secuencia de aminoácidos de
esta enzima es todavía desconocida, y no existe ningún informe sobre
el intento de comenzar a aislar un gen que codifique esta
enzima.
La Figura 1 muestra la construcción de plásmidos
utilizados para la expresión de un gen de la rafinosa sintetasa en
Escherichia coli. pBluescriptKS-RS es un
plásmido que contiene clonado el gen de la rafinosa sintetasa. RS
representa el gen de la rafinosa sintetasa, y las secuencias de
nucleótidos mostradas en la porción superior de esta figura son las
de ambas porciones terminales del gen de la rafinosa sintetasa. Una
secuencia parcial representada por letras pequeñas es una secuencia
de nucleótidos derivada del vector pBluescriptII KS-. Las
secuencias de nucleótidos enmarcadas son el codón de iniciación
(ATG) y el codón de terminación (TGATAA) del gen de la rafinosa
sintetasa, respectivamente. Los sitios de reconocimiento para las
diferentes endonucleasas de restricción se muestran encima de las
secuencias de nucleótidos. pGEX-RS y
pTcr-RS son plásmidos utilizados para la expresión
del gen de la rafinosa sintetasa en E. coli. Ptac, Ptrc, GST,
lacI^{q}, y rrnB representan el promotor tac, el promotor tcr, el
gen de la glutation-S-transferasa,
el gen represor de la lactosa, y la señal de terminación de la
transcripción del ARN ribosómico, respectivamente.
La Figura 2 muestra la construcción de los
vectores de expresión utilizados para la expresión en plantas de
genes mixtos que tienen cada uno un gen de la rafinosa sintetasa y
un promotor conectado. El mapa de endonucleasas de restricción del
gen de la rafinosa sintetasa clonado en el plásmido
pBluescriptKS-RS se muestra en la porción inferior
de esta figura. pBI221RS y pBI221(-)RS indican los mapas de
endonucleasas de restricción de los vectores de expresión
utilizados en la transformación de la soja. 35S y NOS representan el
promotor 35S derivado del virus del mosaico de la coliflor y el
terminador del gen de la nopalina sintetasa, respectivamente.
La Figura 3 muestra la construcción de vectores
de expresión utilizados para la expresión en plantas de genes
mixtos que tienen cada uno un gen de la rafinosa sintetasa y un
promotor conectado. El mapa de endonucleasas de restricción del gen
de la rafinosa sintetasa clonado en el plásmido
pBluescriptKS-RS se muestra en la porción superior
de esta figura. pBI121RS y pBI121(-)RS indican los mapas de
endonucleasas de restricción de los vectores binarios utilizados
para la transformación de la mostaza. Para el vector binario,
únicamente se muestra una región entre el límite derecho y el
límite izquierdo. 35S, NOS y NPT representan el promotor 35S
derivado del virus del mosaico de la coliflor, el terminador del
gen de la nopalina sintetasa y el gen de resistencia a la
kanamicina, respectivamente.
Los métodos para construir genes descritos más
abajo se pueden llevar a cabo según métodos ordinarios, por
ejemplo, como se describe en "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual 2^{a} edición" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory
Press, ISBN
0-87969-309-6;
"Current Protocols In Molecular Biology" (1987), John Wiley
& Sons, Inc. ISBN
0-471-50338-X; y
"Current Protocols In Protein Science" (1995), John Wiley &
Sons, Inc. ISBN
0-471-11184-8.
El término "gen de la rafinosa sintetasa" según se utiliza aquí
hace referencia a un gen que tiene una secuencia de nucleótidos que
codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína capaz de
producir rafinosa combinando un grupo D-galactosilo
a través de un enlace \alpha(1\rightarrow6) con un grupo
hidroxilo anclado a un átomo de carbono en la posición 6 del un
resto D-glucosa en una molécula de sacarosa
(referido más adelante como el presente gen), y semejante gen se
puede preparar, por ejemplo, a partir de plantas.
Más específicamente, el presente gen se puede
preparar a partir de dicotiledóneas tales como plantas leguminosas
(v.g., haba, soja) y plantas lamiáceas (v.g., alcachofa) o de
plantas monocotiledóneas tales como las plantas gramíneas (v.g.,
maíz). Los ejemplos específicos del presente gen son un "gen de la
rafinosa sintetasa que tiene una secuencia de nucleótidos que
codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ
ID NO: 1"; un "gen la rafinosa sintetasa que tiene una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una
secuencia de aminoácidos derivada mediante deleción, sustitución,
modificación o adición de un aminoácido en la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 1, y capaz de producir rafinosa
combinando un grupo D-galactosilo a través de un
enlace \alpha(1\rightarrow6) con un grupo hidroxilo
anclado al átomo de carbono de la posición 6 de un resto
D-glucosa en una molécula de sacarosa"; un "gen
de la rafinosa sintetasa que tiene una secuencia de nucleótidos que
codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ
ID NO: 3"; un "gen de la rafinosa sintetasa que tiene una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una
secuencia de aminoácidos derivada mediante deleción, sustitución,
modificación o adición de un aminoácido en la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 3, y capaz de producir rafinosa
combinando un grupo D-galactosilo a través de un
enlace \alpha(1\rightarrow6) con un grupo hidroxilo
anclado al átomo de carbono de la posición 6 de un resto
D-glucosa en una molécula de sacarosa"; un
"gen de la rafinosa sintetasa que tiene una secuencia de
nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:
5"; y un "gen de la rafinosa sintetasa que tiene una secuencia
de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del SEQ ID
NO: 7."
Adicionalmente, se mencionan las moléculas de
ácido nucleico de al menos 15 moléculas de longitud, que hibridan
específicamente con una molécula de ácido nucleico como se ha
descrito antes o con una hebra complementaria de la misma. La
hibridación específica ocurre preferiblemente en condiciones
restrictivas e implica una poca o ninguna hibridación cruzada con
secuencias de nucleótidos que no codifican (oligo)péptidos o
los codifican sustancialmente diferentes. Tales moléculas de ácido
nucleico se pueden utilizar como sondas y/o para el control de la
expresión génica. La tecnología de sondas de ácido nucleico es bien
conocida por los expertos en la técnica que apreciarán fácilmente
que tales sondas pueden variar en longitud. Son preferidas las
sondas de ácido nucleico de 17 a 50, particularmente preferidas de
21 a 50 nucleótidos de longitud. Por supuesto, también pueden ser
apropiado utilizar ácidos nucleicos de hasta 100 y más nucleótidos
de longitud. Las sondas de ácido nucleico son útiles para
diferentes aplicaciones. Por un lado, pueden ser utilizadas como
cebadores de PCR para la amplificación de secuencias reguladoras.
Otra aplicación es el uso como sonda de hibridación para
identificar moléculas de ácido nucleico que hibridan con una
molécula de ácido nucleico de la invención mediante el rastreo de
homología de genotecas de ADN genómico. Las secuencias de ácido
nucleico que son complementarias a una molécula de ácido nucleico
descrita antes también se pueden utilizar para la represión de la
expresión de un gen que comprende tales secuencias reguladoras, por
ejemplo, debido a un efecto antisentido o de triple hélice o para
la construcción de las ribozimas apropiadas (ver, v.g.,
EP-B1 0 291 533, EP-A1 0 321 201,
EP-A2 0 360 257) que escinde específicamente el
(pre)-ARNm de un gen que comprende una molécula de
ácido nucleico de la invención. La elección de los sitios diana
apropiados y de las correspondientes ribozimas se puede realizar
como describe por ejemplo Steinecke, Ribozymes, Methods in Cell
Biology 50, Galbraith et al. eds. Academic Press, Inc.
(1995), 449-460. Además, la persona experta en la
técnica está bien enterada de si también es posible marcar
semejante sonda de ácido nucleico con un marcador apropiado para
aplicaciones específicas, tales como la detección de la presencia
de una molécula de ácido nucleico de la invención en una muestra
derivada de un organismo.
Las moléculas de ácido nucleico descritas
anteriormente pueden ser ADN o ARN o un híbrido de los mismos.
Adicionalmente, dicha molécula de ácido nucleico puede contener,
por ejemplo, enlaces tioéster y/o análogos de nucleótidos,
utilizados comúnmente en enfoques con nucleótidos antisentido.
Dichas modificaciones pueden ser útiles para la estabilización de
la molécula de ácido nucleico frente a endo- y/o exonucleasas en la
célula. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden ser transcritas
mediante un vector apropiado que contiene un gen mixto que permite
la transcripción de dicha molécula de ácido nucleico en la célula.
Tales moléculas de ácido nucleico pueden contener adicionalmente
secuencias de ribozimas que escinden específicamente el
(pre)ARNm que comprende la molécula de ácido nucleico de la
invención. Adicionalmente, se pueden diseñar oligonucleótidos que
son complementarios a una molécula de ácido nucleico de la
invención (triple hélice; ver Lee, Nucl. Acids Res. 6 (1979), 3073;
Cooney, Science 241 (1988), 456 y Dervan, Science 251 (1991), 1360),
evitándose de ese modo la transcripción y la producción del
oligopéptido codificado.
El presente gen se puede obtener, por ejemplo,
mediante el siguiente método.
Los tejidos de una planta leguminosa tal como el
haba (Vicia faba) o la soja (Glycine max) se congelan
en nitrógeno líquido y se trituran físicamente con un mortero u
otros medios a restos de tejido en polvo fino. De los restos de
tejido, el ARN se extrae mediante un método corriente. Los estuches
de extracción de ARN asequibles comercialmente pueden ser
utilizados en la extracción. El ARN completo se separa del extracto
de ARN mediante precipitación en etanol. Del ARN completo separado,
el ARN con colas de poli-A se fracciona mediante un
método corriente. Las columnas de oligo-dT
asequibles comercialmente se pueden utilizar en el fraccionamiento.
El ADNc se sintetiza a partir de la fracción obtenida (es decir, el
ARN con colas de poli-A) mediante un método
corriente. En la síntesis se pueden utilizar los estuches para la
síntesis de ADNc asequibles comercialmente.
Por ejemplo, los fragmentos de ADNc del "gen
de la rafinosa sintetasa que tiene una secuencia de nucleótidos que
codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ
ID NO: 1" como el presente gen se pueden obtener mediante
amplificación por PCR utilizando el ADNc obtenido antes como molde y
los cebadores 1 a 3 mostrado en la lista 1 de más abajo. Los
cebadores utilizados aquí pueden ser diseñados y sintetizados sobre
la base de la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 2, dependiendo
del propósito. Por ejemplo, con el fin de amplificar la región del
marco de lectura abierto del "gen de la rafinosa sintetasa que
tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que
tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1," se pueden
diseñar y sinterizar los cebadores 1 a 4 mostrados en la lista 2 de
más abajo.
De la misma manera, los fragmentos de ADNc del
"gen de la rafinosa sintetasa que tiene una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína que tiene la secuencia de
aminoácidos del SEQ ID NO: 3" se puede obtener mediante
amplificación por PCR con el ADNc derivado de la soja obtenido antes
como molde y, por ejemplo, los cebadores 4 a 6 mostrados en la
lista 1 de más abajo. Los cebadores utilizados aquí se pueden
diseñar y sintetizar sobre la base de la secuencia de nucleótidos
del SEQ ID NO: 4, dependiendo del propósito. Por ejemplo, con el fin
de amplificar la región del marco de lectura abierto del "gen de
la rafinosa sintetasa que tiene una secuencia de nucleótidos que
codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ
ID NO: 3," se pueden diseñar y sintetizar los cebadores 5 a 8
mostrados en la lista 2 de más abajo.
Los fragmentos de ADN amplificados se pueden
subclonar según métodos corrientes, por ejemplo, como se describe
en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2^{a} edición"
(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; y "Current Protocols
In Molecular Biology" (1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBN
0-471-50338-X. Más
específicamente, la clonación se puede efectuar, por ejemplo,
utilizando un estuche de clonación TA (Invitrogen) y un vector
plasmídico tal como pBluescript II (Stratagene). Las secuencias de
nucleótidos de los fragmentos de ADN clonados se pueden determinar
mediante el método de terminación didesoxi, por ejemplo, como
describen F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson, Proceedings of
National Academy of Science U.S.A. (1977), 74, págs.
5463-5467. Por ejemplo, se puede utilizar
preferiblemente el estuche ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit comercialmente asequible de
Perkin-Elmer.
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siguiente)
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Lista
1
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Lista
2
El término "fragmento génico" según se
utiliza aquí hace referencia a un fragmento génico que tiene una
secuencia de nucleótidos parcial del presente gen (referido de aquí
en adelante simplemente como el presente fragmento génico). Por
ejemplo, puede ser un fragmento génico derivado de una planta que
tiene una secuencia de nucleótidos parcial del gen que tiene una
secuencia de nucleótidos que codifica una proteína capaz de producir
rafinosa combinando un grupo D-galactosilo a través
de un enlace \alpha(1\rightarrow6) con un grupo hidroxilo
anclado al átomo de carbono de la posición 6 de un resto
D-glucosa en una molécula de sacarosa. Los ejemplos
específicos del presente fragmento génico son un fragmento génico
que tiene una secuencia de nucleótidos parcial del gen que tiene una
secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos
del SEQ ID NO: 1 y un fragmento génico que tiene una secuencia de
nucleótidos parcial del gen que tiene una secuencia de nucleótidos
del SEQ ID NO: 2, más específicamente un fragmento génico que tiene
una secuencia de nucleótidos o una secuencia de nucleótidos parcial
del mismo, que codifica cualquiera de las secuencias de aminoácidos
mostradas en la lista 3 de más abajo.
Estos fragmentos génicos se pueden utilizar como
sondas en el método de hibridación o como cebadores en el método
PCR. Para cebadores en el método PCR, se prefiere generalmente que
el número de nucleótidos sea mayor desde el punto de vista de que se
asegure la especificidad de la hibridación; también se prefiere, no
obstante, que el número de nucleótidos no sea mayor desde los puntos
de vista de que los propios cebadores tengan la tendencia a tener
una estructura mayor haciendo posibles el deterioro de la eficacia
de hibridación y de que se requieran procedimientos complicados en
la purificación tras la síntesis. En los casos habituales, se
prefiere un fragmento génico que consta de un ADN monocatenario,
donde el número de nucleótidos está en el intervalo de 15 a 50.
Lista
3
El presente fragmento génico está marcado, y se
utiliza como sonda en el método de hibridación e hibrida con un ADN
derivado de un organismo, de manera que se puede detectar el
fragmento de ADN que tiene unida específicamente la sonda. Así, a
partir de una genoteca génica derivada de un Organismo, se pueden
detectar un gen de la rafinosa sintetasa que tiene una secuencia de
nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una enzima
capaz de producir rafinosa combinando un grupo
D-galactosilo a través de un enlace
\alpha(1\rightarrow6) con un grupo hidroxilo anclado al
átomo de carbono de la posición 6 de un resto
D-glucosa en una molécula de sacarosa; o un
fragmento génico que tiene una secuencia de nucleótidos parcial del
mismo, (referido más adelante simplemente como el presente método
detección).
En cuanto al ADN derivado del Organismo, por
ejemplo, se puede utilizar una genoteca de ADNc o una genoteca de
ADN genómico de una planta deseada. La genoteca génica puede ser
también una genoteca génica asequible comercialmente tal cual o un
genoteca preparada según un método de preparación de genotecas
corriente, por ejemplo, como se describe en "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual 2^{a} edición" (1989), Cold Spring Harbor
Laboratory Press; "Current Protocols In Molecular Biology"
(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBN
0-471-50338-X.
En cuanto al método de hibridación, se puede
emplear hibridación en placa o hibridación de colonias, dependiendo
de la clase de vector utilizado en la preparación de la genoteca.
Más específicamente, cuando se construye una genoteca que se va a
utilizar con un fago vector, un microorganismo huésped adecuado se
mezcla con el fago bajo condiciones de infección, que se mezcla
adicionalmente con un medio de agar blando, y la mezcla se cultiva
en placa sobre un medio de agar. Después de eso, se hace crecer un
cultivo a 37ºC hasta que aparece una placa del tamaño apropiado.
Cuando una genoteca que se va a utilizar se construye con un vector
plasmídico, el plásmido es transformado en un microorganismo huésped
adecuado para formar un transformante. El transformante obtenido se
diluye hasta una concentración adecuada, y la dilución se cultiva en
placa sobre un medio de agar, después de lo cual el cultivo se hace
crecer a 37ºC hasta que aparece una colonia del tamaño
apropiado.
En cualquiera de los casos de las genotecas
anteriores, se coloca un filtro de membrana sobre la superficie del
medio de agar después del cultivo, de manera que el fago o el
transformante sean transferidos a la membrana. Esta membrana se
desnaturaliza con un álcali, seguido de neutralización, y por
ejemplo, cuando se utiliza una membrana de nailon, la membrana se
irradia con luz ultravioleta, de manera que el ADN se fije sobre la
membrana. Esta membrana se somete después a hibridación con el
presente fragmento génico marcado mediante un método corriente como
sonda. Para este método, se puede hacer referencia, por ejemplo, a
D.M. Glover ed., "DNA cloning, a practical approach" IRL PRESS
(1985), ISBN
0-947946-18-7.
Existen diferentes reactivos y condiciones de reacción que se van a
utilizar en la hibridación; por ejemplo, la prehibridación se lleva
a cabo mediante la adición de 6 x SSC (NaCl 0,9 M, ácido cítrico 0,9
M), SDS al 0,1-1%, ADN de esperma de salmón de 100
\mug/ml, e incubación a 65°C durante 1 hora. El presente fragmento
génico marcado se añade después como sonda, y se mezcla. La
hibridación se lleva a cabo a 42-68°C durante 4 a 16
horas. La membrana se lava con 2 x SSC, SDS al
0,1-1%, se enjuaga adicionalmente con 0.2 x SSC, SDS
al 0-0,1% SDS, y después se seca. La membrana se
analiza, por ejemplo, mediante autorradiografía u otra técnica, para
detectar la posición de la sonda sobre la membrana y detectar de ese
modo la posición del ADN que tiene una secuencia de nucleótidos
homóloga a la de la sonda utilizada. Así, se puede detectar el
presente gen o el presente fragmento génico. El clon correspondiente
a la posición del ADN detectado de este modo sobre la membrana se
identifica sobre gel medio de agar original, y se selecciona el clon
positivo, de manera que se pueda aislar el clon que tiene el ADN. Se
repiten los mismos procedimientos de detección para purificar el
clon que tiene el ADN.
También se pueden utilizar otros métodos de
detección, por ejemplo, GENE TRAPPER cDNA Positive Selection System
Kit asequible comercialmente de Gibco BRL. En este método, una
genoteca de ADN monocatenario se hibrida con el presente fragmento
génico biotinilado (es decir, la sonda), seguido de la adición de
cuentas magnéticas unidas a estreptavidina y mezclado. De la mezcla,
se recogen con un imán las cuentas magnéticas unidas a
estreptavidina, de manera que se recoge y se detecta el ADN
monocatenario que tiene una secuencia de nucleótidos homóloga a la
de la sonda utilizada, que se ha unido a estas cuentas a través del
presente fragmento génico, la biotina y la estreptavidina. De este
modo, se puede detectar el presente gen o el presente fragmento
génico. El ADN monocatenario recogido se puede cambiar a una forma
bicatenaria mediante tratamiento con una polimerasa de ADN adecuada
utilizando un oligonucleótido adecuado como cebador.
También se puede utilizar el presente método de
detección en el análisis de una planta. Más específicamente, se
prepara un ADN genómico vegetal según un método corriente, por
ejemplo, como se describe en "Cloning and Sequence (Plant
Biotechnology Experiment Manual)" compilado bajo la supervisión
de Itaru Watanabe, editado por Masahiro Sugiura, publicado por Noson
Bunka-sha, Tokyo (1989). El ADN genómico vegetal se
digiere con varias clases de endonucleasas de restricción adecuadas,
seguido de electroforesis, y el ADN sometido a electroforesis se
transfiere a un filtro según un método corriente. Este filtro se
somete a hibridación con una sonda preparada a partir del presente
fragmento génico mediante un método corriente, y se detectan los
fragmentos de ADN con los que hibrida la sonda. La longitud de los
fragmentos de ADN detectados se compara entre las diferentes
variedades de una especie de planta especificada. Las diferencias de
longitud hacen posible el análisis de las diferencias de las
características fenotípicas acompañadas de la expresión de los
oligosacáridos de la familia de la rafinosa entre estas variedades.
Además, cuando se compara la longitud de los fragmentos de ADN
detectados mediante el método anterior entre la planta con genes
recombinantes y la planta sin genes recombinantes de la misma
variedad, la primera planta puede ser diferenciada de la segunda
planta por la detección de bandas de hibridación en mayor número o
en mayor concentración para la primera planta que para la última
planta. Este método se puede llevar a cabo según el método RFLP
(polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción), por
ejemplo, como se describe en "Plant PCR Experiment Protocols"
compilado bajo la supervisión de Ko Shimamoto y Takuji Sasaki,
publicado por Shujun-sha, Tokyo (1995), ISBN
4-87962-144-7, págs.
90-94.
El método PCR que utiliza un cebador que tiene
una secuencia de nucleótidos del presente fragmento génico hace
posible amplificar a partir de un ADN derivado de un Organismo, un
gen de la rafinosa sintetasa que tiene una secuencia de nucleótidos
que codifica la secuencia de aminoácidos de una enzima capaz de
producir rafinosa combinando un grupo D-galactosilo
a través de un enlace \alpha(1\rightarrow6) con un grupo
hidroxilo anclado al átomo de carbono de la posición 6 de un resto
D-glucosa en una molécula de sacarosa; o un
fragmento génico que tiene una secuencia de nucleótidos parcial del
mismo (referido más adelante simplemente como el presente método de
amplificación).
Más específicamente, por ejemplo, se sintetiza
químicamente un oligonucleótido que tiene de 15 a 50 nucleótidos en
la secuencia de nucleótidos del presente fragmento génico en el
extremo 3' mediante un método de síntesis corriente. Basándose en la
tabla de codones siguiente, que muestra la correspondencia de los
aminoácidos codificados en una secuencia de nucleótidos, también se
puede sintetizar un cebador mixto de manera que un resto en una
posición especificada en el cebador se cambia a una mezcla de varias
bases, dependiendo de la variación de codones que pueden codificar
un cierto aminoácido.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Tabla de
codones
\vskip1.000000\baselineskip
Además, también se puede utilizar una base capaz
de formar un par con clases plurales de bases, tales como la
inosina, en lugar de la anterior mezcla de varias bases. Más
específicamente, por ejemplo, se pueden utilizar cebadores que
tienen una secuencia de nucleótidos como las mostradas en la lista
4. En este contexto, un oligonucleótido que tiene la misma secuencia
de nucleótidos que la hebra codificadora del presente gen que
consiste en ADN bicatenario se designa "cebador efector", y un
oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos
complementaria a la hebra codificadora, "cebador
antisentido".
Un cebador efector que tiene la misma secuencia
de nucleótidos que la presente sobre el lado aguas arriba 5' en la
hebra codificadora de un gen de la rafinosa sintetasa o un fragmento
génico que tiene una secuencia de nucleótidos parcial del mismo que
se va a amplificar, y un cebador antisentido que tiene una secuencia
de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos sobre el
lado corriente abajo 3' en esta hebra codificadora, se utilizan
combinados para la reacción PCR para amplificar un fragmento de ADN,
por ejemplo, con una genoteca génica, un ADN genómico o un ADNc como
molde. En este momento, la amplificación del fragmento de ADN se
puede confirmar mediante un método corriente con electroforesis.
Para el fragmento de ADN amplificado, su mapa de endonucleasas de
restricción se construye o su secuencia de nucleótidos se determina
mediante un método corriente, de manera que se puede identificar el
presente gen o el presente fragmento génico. En cuanto a la genoteca
génica utilizada aquí, por ejemplo, se puede utilizar una genoteca
de ADN genómico de una planta deseada. Para la genoteca génica
vegetal, se puede utilizar tal cual una genoteca asequible
comercialmente derivada de una planta; o también se puede utilizar
una genoteca preparada según un método de preparación de genotecas
corriente, por ejemplo, como se describe en "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual 2^{a} edición" (1989), Cold Spring Harbor
laboratory Press o "Current Protocols in Molecular Biology"
(1987), John Wiley & Sons, Inc., ISBN
0-471-50338-X. En
cuanto al ADN genómico o al ADNc utilizado en el presente método de
amplificación, por ejemplo, se puede utilizar el ADNc o el ADN
genómico preparado a partir de una planta deseada.
Más específicamente, por ejemplo, se utiliza un
cebador diseñado sobre la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1
para el presente método de amplificación con ADNc derivado de la
alcachofa japonesa, que es una planta lamiácea, como molde, de
manera que se puede amplificar un fragmento génico de la rafinosa
sintetasa que tiene la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 6.
Además, por ejemplo, se utiliza un cebador diseñado sobre la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1 para el presente método de
amplificación con ADNc derivado de maíz, que es una planta gramínea,
como molde, de manera que se puede amplificar un fragmento génico de
la rafinosa sintetasa que tiene la secuencia de nucleótidos del SEQ
ID NO: 8.
Lista
4
El presente método de amplificación también se
puede utilizar para el análisis de un gen vegetal. Más
específicamente, por ejemplo, se utiliza como molde un ADN genómico
vegetal preparado a partir de diferentes variedades de una especie
vegetal especificada para el presente método de amplificación para
amplificar un fragmento de ADN. El fragmento de ADN amplificado se
mezcla con una solución de formaldehído, que se desnaturaliza
calentando a 85ºC durante 5 minutos, seguido de enfriamiento rápido
sobre hielo. Esta muestra se somete a electroforesis, por ejemplo,
sobre un gel de poliacrilamida al 60% que contiene el 0% o el 10% de
glicerol. En esta electroforesis, se puede utilizar un aparato de
electroforesis asequible comercialmente para el SSCP (polimorfismo
de la conformación de la hebra sencilla), y la electroforesis se
lleva a cabo, mientras que el gel se mantiene a una temperatura
constante, v.g., 5ºC, 25ºC o 37ºC. A partir del gel sometido a
electroforesis, se detecta un fragmento de ADN, por ejemplo,
mediante un método tal como el método de tinción con plata con
reactivos asequibles comercialmente.
A partir de las diferencias de comportamiento
entre las variedades en la electroforesis del fragmento de ADN
detectado, se detecta una mutación en el gen de la rafinosa
sintetasa, y se lleva a cabo un análisis en cuanto a las diferencias
causadas por la mutación en las características genotípicas
acompañadas con la expresión de los oligosacáridos de la familia de
la rafinosa. Este método se puede llevar a cabo según el método
SSPC, por ejemplo, como se describe en "Plant PCR Experiment
Protocols" compilado bajo la supervisión de Ko Shimamoto y
Takuji Sasaki, publicado por Shujun-sha, Tokyo
(1995), ISBN
4-87962-144-7, págs.
141-146.
También se pueden utilizar el presente método de
detección o el presente método de amplificación descritos antes para
identificar un gen de la rafinosa sintetasa o un fragmento génico
que tiene una secuencia de nucleótidos parcial del mismo y después
aislar y purificar el gen o el fragmento génico identificado para
obtener el presente gen (referido más adelante simplemente como el
presente método de adquisición de genes).
Se puede obtener el presente gen o el presente
fragmento génico, por ejemplo, detectando una sonda que consta del
presente fragmento génico hibridado a ADN en la genoteca génica
derivada del Organismo mediante el presente método de detección como
se ha descrito antes para identificar ADN que tiene una secuencia de
nucleótidos homóloga a la de la sonda utilizada; purificar un clon
que porta el ADN; y aislar y purificar un ADN plasmídico o de fago a
partir del clon. Cuando el ADN obtenido de este modo es un fragmento
génico que tiene una secuencia de nucleótidos parcial del gen de la
rafinosa sintetasa, el rastreo adicional de la genoteca génica
mediante el presente método de detección de genes utilizando el ADN
como sonda produce el presente gen completo.
El presente gen o el presente fragmento génico
pueden ser identificados, por ejemplo, efectuando una reacción en
cadena de la polimerasa utilizando un cebador que tenga la secuencia
de nucleótidos del presente fragmento génico para amplificar el
fragmento de ADN del ADN derivado del Organismo mediante el presente
método de amplificación como se ha descrito antes; y después
construir un mapa de endonucleasas de restricción o determinar una
secuencia de nucleótidos para el fragmento de ADN amplificado.
Basándose en la secuencia de nucleótidos del fragmento génico
obtenido, se sintetiza un cebador antisentido para el análisis de
las secuencias 5' terminales, y se sintetiza un cebador efector para
el análisis de las secuencias 3' terminales. La secuencia de
nucleótidos del presente gen completo se puede determinar mediante
el método RACE utilizando estos cebadores y un estuche asequible
comercialmente, v.g., Marathon Kit de Clontech. El presente gen
completo se puede obtener sintetizando nuevos cebadores basados en
ambas secuencias terminales de la secuencia de nucleótidos así
determinada y efectuando de nuevo una reacción en cadena de la
polimerasa.
El presente método de adquisición de genes
descrito antes hace posible obtener genes de la rafinosa sintetasa
como el presente gen de diferentes Organismos. Por ejemplo, un gen
que codifica la rafinosa sintetasa que tiene una secuencia de
aminoácidos que tiene una homología del 50% o mayor, en la región
correspondiente a la longitud de 400 o más aminoácidos, con la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1, y capaz de producir
rafinosa combinando un grupo D-galactosilo a través
de un enlace \alpha(1\rightarrow6) con un grupo hidroxilo
anclado al átomo de carbono de la posición 6 de un resto
D-glucosa en una molécula de sacarosa. Más
específicamente, por ejemplo, se puede obtener un gen de la rafinosa
sintetasa que tiene la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 4
amplificando e identificando un fragmento de ADN que contiene un
fragmento génico que tiene una secuencia de nucleótidos parcial del
gen de la rafinosa sintetasa mediante el presente método de
amplificación utilizando los cebadores diseñados a partir de la
secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1 y un ADNc de soja como
molde; aislando y purificando el fragmento de ADN identificado,
seguido de los procedimientos anteriores para obtener un gen
completo que contiene el fragmento de ADN.
Se pueden construir un gen mixto que comprende
el presente gen y un promotor conectado a él (referido más adelante
simplemente como el presente gen mixto).
El promotor que se va a utilizar no está
particularmente limitado, con tal que funcione en un Organismo
huésped que se vaya a transformar. Entre los promotores se pueden
incluir, por ejemplo, promotores sintéticos que funcionen en
Escherichia coli, tales como el promotor del operón lactosa
de E. coli, el promotor del operón triptófano de E.
coli y el promotor tac, el promotor del gen de la alcohol
deshidrogenasa de levaduras (ADH), el promotor tardío principal de
adenovirus (Ad.ML), el promotor temprano de SV40, y el promotor de
baculovirus.
Cuando el Organismo huésped es una planta o una
célula de la misma, entre los promotores se pueden incluir, por
ejemplo, promotores constitutivos derivados de ADN-T
tales como el promotor del gen de la nopalina sintetasa (NOS) y el
promotor del gen de la octopina sintetasa (OCS); promotores
derivados de virus vegetales tales como los promotores 19S y 35S
derivados del virus del mosaico de la coliflor (CaMV); promotores
derivados tales como el promotor del gen de la
fenilalanina-amonio-liasa (PAL), el
promotor del gen de la chalcona sintetasa (CHS) y el promotor del
gen de la proteína relacionada con la patogénesis (PR). Además,
también se puede utilizar el vector pSUM-GY1 (ver
JP-A 06-189777/1994), que tiene un
promotor que produce una expresión específica en un tejido vegetal
especificado, v.g., un promotor del gen de la proteína glicinina de
almacenamiento en las semillas derivado de la soja. El uso de un
gen mixto construido de manera que tenga semejante promotor hace
posible incrementar o disminuir el contenido de oligosacáridos de la
familia de la rafinosa en un tejido especificado de una planta.
El presente gen mixto es introducido después en
un Organismo huésped según un método de ingeniería genética
corriente para dar un transformante. Si fuera necesario, el presente
gen mixto se puede utilizar en forma de un plásmido dependiendo del
método de transformación para introducir el gen en el Organismo
huésped. Además, el presente gen mixto puede contener un
terminador. En este caso, se prefiere generalmente que el gen mixto
se construya de manera que tenga un terminador aguas abajo del gen
de la rafinosa sintetasa. El terminador que se va a utilizar no
está particularmente limitado, con tal que funcione en un Organismo
huésped que se vaya a transformar. Por ejemplo, cuando el Organismo
huésped es una planta o una célula de la misma, entre los
terminadores se pueden incluir, por ejemplo, los terminadores
constitutivos derivados de ADN-T tales como el
terminador del gen de la nopalina sintetasa (NOS); y terminadores
derivados de plantas tales como los terminadores GV1 o GV2 de virus
de allium.
Si fuera necesario, el presente gen se puede
utilizar en forma de plásmido. Por ejemplo, cuando el Organismo
huésped es un microorganismo, el plásmido construido es introducido
en el microorganismos mediante un método corriente, por ejemplo,
como se describe en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual
2^{a} edición" (1989), Cold Spring Harbor laboratory Press o
"Current Protocols in Molecular Biology" (1987). John Wiley
& Sons, Inc., ISBN
0-471-50338-X. El
microorganismo transformado de este modo se selecciona con un
marcador tal como resistencia a antibióticos o auxotrofía. Cuando
el Organismo huésped es una planta, el plásmido construido es
introducido en una célula vegetal mediante un método corriente tal
como infección con Agrobacterium (ver JP-B
2-58917/1990 y JP-A
60-70080/1985), electroporación en protoplastos (ver
JP-A 60-251887/1985 y
JP-B 5-68575/1993) o el método con
pistola de partículas (ver JP-A
5-508316/1993 y JP-A
63-258525/1988). La célula vegetal transformada
mediante la introducción de un plásmido se selecciona con un
antibiótico tal como la kanamicina o la higromicina. A partir de la
célula vegetal transformada de este modo, se puede regenerar una
planta transformada mediante un método de cultivo de células
vegetales corriente, por ejemplo, como se describe en "Plant Gene
Manipulation Manual (How to Produce Transgenic Plants)" escrito
por Uchimiya, 1990, Kodan-sha Scientific (ISBN
4-06-153513-7),
págs. 27-55. Además, la colección de semillas de la
planta transformada también hace posible la proliferación de la
planta transformada. Además, el cruzamiento entre la planta
transformada obtenida y la planta no transformada hace posible
producir plantas de progenie con el carácter de la planta
transformada.
El contenido de oligosacáridos de la familia de
la rafinosa se puede cambiar introduciendo el presente gen en un
Organismo huésped o en una célula del mismo, y modificando el
metabolismo en el Organismo huésped o en una célula del mismo. En
cuanto a semejante método, por ejemplo, se puede utilizar un método
de modificación metabólica para incrementar la cantidad de
oligosacáridos de la familia de la rafinosa en un Organismo huésped
o en una célula del mismo construyendo el presente gen mixto que
comprende el presente gen y un promotor conectado, en cuyo caso el
presente gen está conectado al promotor en una dirección original
adecuada para la transcripción, la traducción, y la expresión como
proteína, y después introduciendo el presente gen mixto en el
Organismo huésped o en una célula del mismo; o un método para la
modificación metabólica para disminuir la cantidad de
oligosacáridos de la familia de la rafinosa en un Organismo huésped
o una célula del mismo construyendo el presente gen mixto que
comprende el presente gen y un promotor conectado, en cuyo caso el
presente gen se conecta a un promotor en una dirección inversa
inadecuada para la traducción y la expresión como proteína, y
después introduciendo el presente gen mixto en el Organismo huésped
o en una célula del mismo.
El término "rafinosa sintetasa: proteína"
según se utiliza así hace referencia a una proteína codificada en el
presente gen (referida más adelante simplemente como la presente
proteína). Por ejemplo, puede incluir una proteína enzimática que
tiene la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3,
o que tiene una secuencia de aminoácidos derivada mediante deleción,
sustitución, modificación o adición de un aminoácido en la secuencia
de aminoácidos del SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3; y capaz de producir
rafinosa combinando un grupo D-galactosilo a través
de un enlace \alpha(1\rightarrow6) con un grupo hidroxilo
anclado al átomo de carbono de la posición 6 de un resto
D-glucosa en una molécula de sacarosa.
Los ejemplos específicos de la presente proteína
son una proteína enzimática que tiene la secuencia de aminoácidos
del SEQ ID NO: 1 (799 aminoácidos; peso molecular, 89 kDa) y una
proteína enzimática que tiene el aminoácido del SEQ ID NO: 3 (781
aminoácidos; peso molecular, 87 kDa).
La presente proteína, si bien se puede preparar,
por ejemplo, a partir de plantas leguminosas tales como el haba,
(Vicia faba), mediante un método bioquímico corriente tal
como precipitación con (NH_{4})_{2}SO_{4}, columna de
intercambio iónico, columna hidrófoba o columna de filtración en
gel, también se puede preparar a partir del Organismo huésped
transformado con el presente plásmido, o de una célula del mismo.
Más específicamente, por ejemplo, utilizando el GST Gene Fusion
Vectors Kit de Pharmacia, el presente gen es insertado en un
plásmido vector de expresión anclado al estuche. El plásmido vector
resultante es introducido en un microorganismo tal como E.
coli según un método de ingeniería genética corriente. Se hace
crecer un cultivo del transformante obtenido en un medio con la
adición de IPTG
(isopropiltio-\beta-D-galactosido),
de manera que la presente proteína pueda ser expresada y derivada en
forma de una proteína fusionada en el cultivo. La proteína fusionada
expresada e inducida se puede aislar y purificar mediante un método
corriente tal como rotura de células bacterianas, operación en
columna o electroforesis SDS-PAGE. La digestión de
la proteína fusionada con una proteína tal como la trombina o el
factor Xa de coagulación de la sangre produce la presente proteína.
Esto se puede realizar preferiblemente, por ejemplo, según el método
descrito en "Current Protocols In Protein Science" (1995), John
Wiley & Sons, Inc. ISBN
0-471-11184-8. La
actividad de la presente proteína se puede medir, por ejemplo,
mediante el método descrito por L. Lehle y W. Tanner, Eur. J.
Biochem., 38, 103-110 (1973).
Se puede producir un anticuerpo
anti-rafinosa sintetasa capas de unirse a una
proteína rafinosa sintetasa (referido más adelante simplemente como
el presente anticuerpo) mediante un método inmunológico corriente
utilizando la presente proteína preparada antes, como antígeno. Más
específicamente, se puede producir el presente anticuerpo, por
ejemplo, según el método descrito por Ed Harlow y David Lane,
"Antibodies: A Laboratory Manual" (1988), Cold Spring Harbor
Laboratory Press, ISBN
0-87969-314-2.
La presente proteína se puede detectar tratando
las proteínas de ensayo con el presente anticuerpo y detectando una
proteína que tiene el presente anticuerpo unido específicamente.
Semejante método de detección se puede llevar a cabo según una
técnica inmunológica tal como el método de transferencia Western o
el análisis de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA), por
ejemplo, como describen Ed Harlow y David Lane, "Antibodies: A
Laboratory Manual" (1988), Cold Spring Harbor Laboratory
Press.
El método de transferencia Western se lleva a
cabo, por ejemplo, como sigue: Se extraen las proteínas de una
planta, por ejemplo, según el método descrito en Methods in
Enzymology, volumen 182, "Guide to Protein Purification," págs.
174-193, ISBN
9-12-182083-1. La
composición de un tampón de extracción se puede cambiar
adecuadamente dependiendo del tejido vegetal utilizado. Las
proteínas extraídas son sometidas a electroforesis según un método
SDS-PAGE. Las proteínas sometidas a electroforesis
en el gel son transferidas a una membrana mediante transferencia
Western con un método eléctrico corriente. Más específicamente, por
ejemplo, el gel se sumerge en un tampón de transferencia (Tris 25
mM, glicina 192 mM, metanol al 20%) durante 10 minutos, y después se
colocan sobre una membrana PVDF con corte al mismo tamaño que el
gel. El gel junto con la membrana se coloca en un aparato de
transferencia asequible comercialmente de tipo
semi-seco. La transferencia se lleva a cabo a una
corriente constante de 0,8 a 2 mA/cm^{2} durante 45 minutos a 1
hora. Las proteínas transferidas a la membrana se pueden detectar
inmunológicamente con un estuche para la detección de la
transferencia Western utilizando un anticuerpo primario, y un
anticuerpo secundario o proteína A, que ha sido marcado con
fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante. En este momento,
la presente proteína sobre la membrana se puede detectar mediante el
uso del presente anticuerpo como anticuerpo primario.
En el método ELISA, por ejemplo, la propiedad de
las proteínas que se unen a la superficie de una placa ELISA de 96
pocillos elaborada de reina se utiliza en principio para la
detección inmunológica de un antígeno que se une por último a la
superficie de la placa de ELISA. Las proteínas de ensayo se añaden
en forma de solución y se unen a una placa de ELISA, seguido de
bloqueo, por ejemplo, mediante la adición de PBS conteniendo una
proteína tal como seralbúmina bovina al 5%. Después de eso, el
pocillo se lava con PBS, a lo que se añade una solución que
contiene el presente anticuerpo para efectuar la reacción. Después
de lavar el pocillo, se añade adicionalmente al pocillo una solución
que contiene un anticuerpo secundario marcado con fosfatasa alcalina
o peroxidasa de rábano picante, seguido de lavado. Finalmente, se
añade al pocillo una solución sustrato para la detección, y se
detecta el desarrollo de color con un lector de ELISA.
La presente invención se ilustrará
adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
Aproximadamente 250 ml de melazas residuales de
remolacha azucarera se diluyeron cinco veces con metanol. La
dilución se centrifugó a 21.400 x g durante 15 minutos a la
temperatura ambiente para eliminar la materia insoluble. El
sobrenadante obtenido se transfirió a un matraz Erlenmeyer de 2
litros, a lo que se añadió en porciones isopropanol a la mitad de su
volumen agitando. El matraz se dejó a la temperatura ambiente
durante un momento hasta que el precipitado resultante se adhirió al
matraz. El sobrenadante se descartó después mediante decantación. Al
precipitado se le añadieron 500 ml de etanol, y la mezcla se lavó
agitando con un aparato de sacudimiento rotatorio. El lavado se
repitió adicionalmente varias veces. El precipitado lavado se separó
de la pared del matraz rascando, seguido de secado con aire sobre
un papel de filtro. El precipitado secado con aire (polvo seco) se
disolvió en agua purificada hasta aproximadamente el 40% (p/v). A
esta solución se le añadió AG501-X8(D) de
BioRad, seguido de agitación. Esta operación se repitió hasta que
casi no se observó color en la solución. La solución resultante se
trató con una columna Sep-Pak QMA de Millipore, y se
pretrató adicionalmente con columnas Sep-Pak CM, Sep
Pak C18 y Sep Pak Silica de Millipore. La solución resultante se
cargó a un volumen de 5 ml en una columna Wako-gel
LP40C18 (Wako Pure Chemical Industries, 2,6 cm x 85 cm), y se hizo
eluir con agua purificada. El contenido de azúcar del eluato se
midió con un refractómetro para azúcares portátil, y se analizó la
composición de azúcares mediante cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) con una columna Sugar-pak Na (7,8
mm x 300 mm) de Millipore. La detección de los azúcares se llevó a
cabo con un Refractómetro Diferencial modelo 410 de Waters. El
eluato que contenía galactinol se liofilizó, y el polvo liofilizado
resultante se disolvió en 5 ml de agua purificada. La solución se
cargó en una columna TOYOPEARL HW40(S) (Toso, 2,6 cm x 90
cm), y se hizo eluir con agua purificada. El eluato se analizó de la
misma manera que se ha descrito antes, de manera que se obtuvo
galactinol purificado.
El galactinol obtenido se mantuvo a 25ºC durante
40 minutos en la mezcla de reacción que pasó a contener tampón
fosfato 80 mM (pH 6,5), galactinol de 2 mg/ml, y 8,3 U de
\alpha-galactosidasa (Boehringer Mannheim, E.
coli productor en exceso 662038). La mezcla de reacción se
extrajo con cloroformo, y la capa de agua se analizó mediante HPLC.
Se confirmó que el galactinol resultante era hidrolizado en
galactosa y mio-inositol.
Se midió la actividad de la rafinosa sintetasa
en las siguientes condiciones según la descripción de L. Lehle y W.
Tanner, Eur. J. Biochem., 38, 103-110 (1973).
Primero, se añadieron 2 \mul de una muestra
que se iba a utilizar en la medición de la actividad a 18 \mul de
la mezcla de reacción que pasó a contener Tris-HCl
100 mM (pH 7,4), DTT (ditiotreitol) 5 mM, BSA al 0,01%, sacarosa 200
\muM, galactinol 5 mM, sacarosa[C^{14}] de 740 kBq/ml
(31,7 \muM), y la mezcla de reacción se mantuvo a 37ºC durante 3 a
20 horas. Tras la reacción, se añadieron 30 \mul de etanol a la
mezcla de reacción, seguido de agitación y centrifugación a 15.000
rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se aplicó a un volumen de 5
\mul sobre una placa de HPTLC de celulosa para la cromatografía
en capa fina (Merck, 10 cm x 20 cm), y se desarrolló con
n-butanol : piridina : agua : ácido acético = 60 :
40 : 30 : 3. La placa desarrollada se secó y después se analizó
cuantitativamente con un analizador de imágenes (Fuji Photographic
Film, FUJIX Bio Imaging Analyzer BAS-2000II) para la
determinación de la rafinosa[C^{14}] producida.
La purificación de la rafinosa sintetasa a
partir de haba se llevó a cabo como sigue: Para cada solución de
proteína purificada, las proteínas presentes en la solución de
proteína se analizaron mediante SDS-PAGE (Daiichi
Kagaku Yakuhin), y se midió la actividad enzimática de la misma
según el método descrito en el Ejemplo 2.
Primero, se descongelaron y se pelaron 300 de
semillas inmaduras de haba (Nintoku Issun) almacenadas a -80ºC. Las
semillas peladas se colocaron en 600 ml de Tris-HCl
100 mM (pH 7,4), DTT (ditiotreitol) 5 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM
(fluoruro de fenilmetilsulfonilo) y benzamida 1 mM, y se trituraron
sobre hielo con un mortero. El material triturado se centrifugó a
21.400 x g durante 50 minutos a 4ºC. Al sobrenadante resultante se
le añadieron polietilenimina al 10% (pH 8,0) a 1/20 en volumen. La
mezcla se agitó a 4ºC durante 15 minutos, y se centrifugó a 15.700 x
g durante 20 minutos a 4ºC. Al sobrenadante resultante se le
añadieron 196 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4} agitando. La
mezcla se agito sobre hielo durante 30 minutos, y se centrifugó a
15.700 x g durante 20 minutos a 4ºC. Al sobrenadante resultante se
le añadieron adicionalmente 142 g/l of
(NH_{4})_{2}SO_{4} agitando. Después de la agitación en
hielo durante 30 minutos, la mezcla se centrifugó a 15.700 x g
durante 20 minutos a 4ºC. El precipitado resultante se disolvió en
50 ml de Tris-HCl 100 mM (pH 7,4) y DTT
(ditiotreitol) 5 mM, y la solución se sometió a diálisis frente a
Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), DTT (ditiotreitol) 1 mM y
EDTA 1 mM a 4ºC durante la noche. Tras la diálisis, la suspensión se
centrífugo a 70.000 x g durante 60 minutos a 4ºC. Al sobrenadante
resultante se le añadió benzamidina 1 mM \cdot HCl, ácido
\varepsilon-amino-n-capróico
5 mM, antipaína de 1 \mug/ml, leupeptina de 1 \mug/ml y EGTA 10
mM, y se añadió adicionalmente KCl 2 M en porciones a un volumen de
1/40. La mezcla se cargó en una columna
DEAE-Sephacell (Pharmacia, 2,5 cm x 21,5 cm)
equilibrada con KCl 0,05 M, Tris-HCl 20 mM (pH 7,4),
DTT (ditiotreitol) 1 mM y EDTA 1 mM, y las proteínas absorbidas se
hicieron eluir con un gradiente de KCl de 0,05 a 0,5 M. Las etapas
de purificación hasta esta fase se repitieron tres veces, y las
fracciones que tenían actividad rafinosa sintasa se combinaron y
después se purificaron como sigue:
A la fracción eluida que tenía actividad
rafinosa sintetasa se le añadió en porciones
(NH_{4})_{2}SO_{4} saturado a un volumen de 1/4. La
solución se cargó en una columna Phenyl-Sepharose
(Pharmacia, 2,5 cm x 10,2 cm) equilibrada con
(NH_{4})_{2}SO_{4} saturado al 20%,
Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), DTT (ditiotreitol) 1 mM y
EDTA 1 mM, y las proteínas absorbidas se hicieron eluir con un
gradiente de (NH_{4})_{2}SO_{4} del 20% al 0%. La
fracción activa resultante se diluyó mediante la adición de tampón
fosfato de potasio 0,01 M (pH 7,5) al doble del volumen. La solución
diluida se cargó en una columna Econo-Pac 10DG
(BioRad, 5 ml) equilibrada previamente con tampón fosfato de
potasio 0.01 M (pH 7,5) y DTT (ditiotreitol) 2 mM, y las proteínas
absorbidas se hicieron eluir con un gradiente de tampón fosfato de
potasio de 0,01 a 0,5 M (pH 7,5) y DTT (ditiotreitol) 2 mM. Se
encontró que la fracción activa obtenida en esta fase había sido
purificada hasta 6.500 veces o una actividad específica superior.
Parte de la solución de proteína purificada que tenía actividad
rafinosa sintetasa se cargó en una columna Superdex 200 (Pharmacia,
1,6 cm x 60 cm) equilibrada con KCl 0,2 M, Tris-HCl
20 mM (pH 7,4), DTT (ditiotreitol) 1 mM y EDTA 1 mM. Las proteínas
purificadas separadas de este modo se sometieron a
SDS-PAGE, y se midió la actividad rafinosa
sintetasa. Se identificó que una banda de proteína que tenía
actividad rafinosa sintetasa tenía un peso molecular de
aproximadamente 90 kDa en la SDS-PAGE.
A aproximadamente 1 ml de la solución de
proteína purificada, que había sido purificada con una columna
Econo-Pac 10DG (BioRad, 5 ml) en el Ejemplo 3, se
le añadió TCA al 100% a un volumen de 1/9, y la mezcla se dejó sobre
hielo durante 30 minutos. Después de la centrifugación a 10.000 x g
durante 15 minutos, el precipitado resultante se suspendió en 500
\mul de acetona fría (-20ºC), seguido de centrifugación adicional.
Se repitió este lavado con acetona, y el precipitado recogido se
secó y después se disolvió en 200 \mul de tampón de muestra de
SDS, seguido de SDS-PAGE. Se efectúo una tinción CBB
para el gel sometido a electroforesis, del cual se cortó la banda
de una proteína rafinosa sintetasa.
Al gel recogido de este modo se le añadió 1 ml
de acetonitrilo al 50% y carbonato de amonio 0,2 M (pH 8,9), y el
lavado continuó agitando a la temperatura ambiente durante 20
minutos. El gel se lavó de nuevo una vez de la misma manera, y se
secó a presión reducida hasta un grado que produjo una reducción de
volumen. A este gel se le añadieron 1 ml de
Tween-20 al 0,02% y carbonato de amonio 0,2 M (pH
8,9), y la mezcla se agitó a la temperatura ambiente durante 15
minutos. Después de separar la solución, se añadieron 400 \mul de
urea 8 M y NH_{4}HCO_{3} 0,4 M, a la se que se añadieron
adicionalmente 40 \mul de DTT (ditiotreitol) 45 mM, y la mezcla
se dejó a 50°C durante 20 minutos. Tras el retorno completo a la
temperatura ambiente, se añadieron 4 \mul de ácido yodoacético 1
M, y la mezcla se agitó en la oscuridad a la temperatura ambiente
durante 20 minutos. Tras la separación de la solución, se añadió 1
ml de agua purificada, y la mezcla se agitó a la temperatura
ambiente durante 5 minutos, seguido de lavado. Tras dos lavados
adicionales, se añadió 1 ml de acetonitrilo al 50% y carbonato de
amonio 0,2 M (pH 8,9), y la mezcla se agitó a la temperatura
ambiente durante 15 minutos. Se repitió el mismo tratamiento de
nuevo una vez, después de lo cual se separó la solución, y el gel se
secó a presión reducida hasta el grado que se produjo una reducción
de volumen.
A este gel se le añadió una solución de Proteasa
I de Acromobacter (Takara, Residue-specific Protease
Kit) a un volumen de 100 \mul. Se añadió nuevamente
Tween-20 al 0,02% y carbonato de amonio 0,2 M (pH
8,9) hasta un grado que el gel no era expuesto desde la superficie
de la solución, y la mezcla se dejó a 37ºC durante 42 horas. Se
añadieron adicionalmente 500 \mul de TFA al 0,09% y acetonitrilo
al 70%, y la mezcla se agitó a la temperatura ambiente durante 30
minutos. La mezcla resultante contenida en un tubo de muestra se
hizo flotar en un baño ultrasónico, seguido de tratamiento
ultrasónico (BRANSON, potencia de entrada 60 W) durante 5 minutos.
El tubo y el contenido tratado de este modo se centrifugaron, y el
extracto resultante se recogió en otro tubo de muestra recubierto
de silicona. Por otro lado, se añadieron de nuevo 500 \mul de TFA
al 0,09% y acetonitrilo al 70% al precipitado, seguido de la
extracción repetida de la misma manera que se ha descrito antes.
Los extractos resultantes se combinaron y después se concentraron a
presión reducida hasta el grado que se producía una solución que
permanecía a un volumen de 200 a 300 \mul. Al producto concentrado
se le añadieron 25 \mul de urea 8 M y NH_{4}HCO_{3} 0.4 M, y
la mezcla se concentró hasta el punto que se produjo una solución
que permanecía a un volumen de 100 \mul o menos. El producto
concentrado se llevó a aproximadamente 100 \mul con agua
purificada, y la mezcla se filtró a través de un filtro Ultrafree C3
GV (Millipore). El producto filtrado obtenido se sometió después a
elución a través de una columna Aquapore BU-300
C-4 (2.1 mm x 300 mm) con un gradiente de TFA al
0,1%/acetonitrilo del 2,1% al 68,6%. Se verificó la absorbancia a
215 nm para recoger una fracción en un pico de la misma. La muestra
recogida se evaporó a presión reducida hasta una sequedad completa,
y después se analizó con un Protein Sequencer 473A de ABI para
determinar la secuencia de aminoácidos parcial de una rafinosa
sintetasa.
Se congelaron aproximadamente 2 g de semillas
inmaduras de haba (Nintoku Issun) en nitrógeno líquido y después se
trituraron con un mortero, al cual se añadieron 20 ml de Isogen
(Nippon gene), y la mezcla se trituró más cuidadosamente. El
material triturado se transfirió a un tubo de centrifugación, al
cual se añadieron 4 ml cloroformo, y la mezcla se agitó con un
mezclador de vórtice y después se centrifugó a 6.500 x g durante 10
minutos a 4ºC. El precipitado resultante se lavó con 10 ml de etanol
al 70% y después se disolvió en 1 ml de tampón de elución
(Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, SDS al 0,1%).
La solución se dejó a 60ºC durante 10 minutos y después se
centrifugó a 10.000 x g durante 1 minuto para eliminar la materia
insoluble. Al sobrenadante resultante se le añadió un volumen
equivalente de Oligotex-dT30 (Takara), y la mezcla
se agitó y después se dejó a 65ºC durante 5 minutos. La mezcla se
colocó sobre hielo y después se dejó 3 minutos, a lo que se
añadieron 200 \mul de NaCl 5 M, y la mezcla se dejó a 37ºC
durante 10 minutos. La mezcla se centrifugó después a 10.000 x g a
4ºC durante 3 minutos. El precipitado se recogió y después se
suspendió en 1 ml de tampón TE, y la suspensión se dejó a 65ºC
durante 5 minutos, que se colocó sobre hielo y después se dejó
durante 3 minutos, seguido de centrifugación a 10.000 x g durante 3
minutos a 4ºC para eliminar el precipitado.
Al sobrenadante resultante se le añadieron 100
\mul de acetato de sodio 3 M y 2 ml de etanol, y el ARN se
precipitó con etanol y se recogió. El ARN recogido se lavó dos veces
con etanol al 70% y después se disolvió en 20 \mul de agua
esterilizada, que se utilizó para la posterior síntesis de ADNc. La
cantidad de ARN obtenida se determinó mediante la medida de la
absorbancia a 260 nm.
\newpage
Para la síntesis de ADNc, se utilizaron First
Strand Synthesis Kit para RT-PCR (Amercham) y cDNA
Synthesis Kit (Takara), y todas las operaciones se realizaron según
el protocolo.
Basándose en la secuencia de aminoácidos
obtenida en el Ejemplo 4, se sintetizaron cebadores de ADN
sintéticos mixtos que tenían las secuencias de nucleótidos
mostradas en la lista 5 más abajo. Se llevó a cabo el método de la
PCR con Gene Amp PCR Systems 2400 y DNA Thermal Cycler Model 480 de
Perkin-Elmer utilizando Advantage Klen Taq cDNA Kit
de Clontech. La reacción en cadena de la polimerasa se efectuó con
los cebadores anteriores a 94ºC durante 1 minuto, a 50ºC durante 3
minutos, y a 72ºC durante 3 minutos, y esta reacción se repitió
cuarenta veces. Como resultado, las combinaciones de cebadores 8.2 y
13.3RV, cebadores 13.4 y 10.3RV, y cebadores 7.4 y 10,3RV, que
tenían las secuencias de nucleótidos mostradas en la lista 5 más
abajo, daban una amplificación de las bandas de 1,2 kb, 0,5 kb, y
1,2 kb, respectivamente. Estos fragmentos de ADN amplificados se
clonaron con un estuche de clonación TA (Invitrogen), seguido de
reacción de la secuencia utilizando ABI PRISM Dye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit de Perkin-Elmer y el
análisis de la secuencia de nucleótidos con un secuenciador de ADN
373S de ABI. Como resultado, se encontró que estos fragmentos de ADN
tenían una secuencia de nucleótidos que se extendía desde la base
813 a la base 1915, de la base 1936 a la base 2413, y de la base
1226 a la base 2413, respectivamente, en la secuencia de nucleótidos
del SEC ID NUM: 2. Basándose en estas secuencias de nucleótidos, se
prepararon los cebadores de ADN sintéticos que tenían las secuencias
de nucleótidos mostradas en la lista 6 más abajo, y se analizaron
las secuencias de nucleótidos de ambas regiones terminales de ADNc
con Marathon cDNA Amplification Kit de Clontech. Como resultado, se
determinó finalmente la secuencia de nucleótidos del SEC ID NUM:
2.
Lista
5
\newpage
Lista
6
\vskip1.000000\baselineskip
Se sintetizaron los cebadores diseñados a partir
de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NO: 1, es decir, los
cebadores que tienen la secuencia de nucleótidos mostrada en la
lista 7 más abajo. Utilizando estos cebadores y el ADNc obtenido en
el Ejemplo 5 como molde, se amplificó mediante PCR un fragmento de
ADN de la región del marco de lectura abierto en las condiciones
descritas en el Ejemplo 6. El fragmento de ADN amplificado se
digirió con las endonucleasas de restricción Bam HI y
Xba I cuyas secuencias de reconocimiento estaban contenidas
en los cebadores utilizados. Utilizando el Ligation Kit (Takara), se
clonó el fragmento de ADN digerido de este modo en el plásmido
pBluescriptII KS- (Stratagene) previamente digerido con Bam
HI y Xba I. La secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN
clonado se confirmó con el ABI PRISM Dye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit de Perkin-Elmer. En el
clon obtenido de este modo, se encontró que la base de la posición
1591 de la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 2 se había
cambiado de timina (T) a citosina (C). Esta era, no obstante, una
mutación terminadora sin cambio de aminoácido; por lo tanto, este
clon se denominó pBluescriptKS-RS, y se utilizó en
el siguiente experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
Lista
7
El plásmido pBluescriptKS-RS que
tenía el gen de la rafinosa sintetasa de haba obtenido en el Ejemplo
7 se digirió con Bam HI y Not I, y se clonó en el
plásmido pGEX-4T3 (Pharmacia) digerido con
Bam HI y Not I para dar el plásmido
pGEX-RS como se muestra en la Figura 1.
El plásmido pBluescriptKS-RS se
digirió con Nco I y Xba I, y se clonó en el plásmido
pTrc99A (Pharmacia) digerido con Nco I y Xba I para
dar el plásmido pTrc-RS como se muestra en la Figura
1.
Estos plásmidos se introdujeron en la cepa HB101
de E. coli, y los transformantes resultantes se utilizaron
para la confirmación de la expresión de la rafinosa sintetasa. Los
cultivos de los transformantes de una noche se inocularon a un
volumen de 1 ml cada uno en 100 ml de medio LB y se incubaron a 37ºC
durante aproximadamente 3 horas, seguido de la adición de IPTG
(isopropiltio-\beta-D-galactosido)
a una concentración final de 1 mM y de una incubación adicional de
5 horas. Los cultivos se centrifugaron a 21.400 x g durante 10
minutos, y se recogieron las células bacterianas. Las células
bacterianas recogidas se almacenaron a -80ºC. A las células
bacterianas se añadió diez veces el volumen de
Tris-HCl 100 mM (pH 7,4), EDTA 1 mM, DTT 5 mM
(ditiotreitol), PMSF 1 mM (fluoruro de feniltrimetilsulfonilo) y
benzamida 1 mM, y las células bacterianas se descongelaron y se
suspendieron. Estas suspensiones se trataron con una desorganizador
ultrasónico (Branson) para efectuar la desorganización de las
células bacterianas. Las mezclas de células desorganizadas obtenidas
se centrifugaron a 16.000 x g durante 10 minutos, y se recogieron
las soluciones de proteína soluble.
Las soluciones de proteínas obtenidas de este
modo se utilizaron a un volumen de 4 \mul cada una para la medida
de la actividad de la rafinosa sintetasa según el método descrito
antes. La reacción se efectuó a 37ºC durante 64 horas. Como
control, se utilizó la cepa HB101 de E. coli que había sido
transformada con uno de los vectores, pGEX-4T3. Los
resultados se muestran en la Tabla 1. La síntesis de la rafinosa se
detectó en las muestras de los transformantes HB101
(pGEX-RS) y HB101 (pTrc-RS).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De la misma manera que se describe en el Ejemplo
5, se obtuvo ADNc de semillas inmaduras de soja (Glycine
max) Williams 82. Utilizando este ADNc como molde y los
cebadores diseñados a partir de la secuencia de aminoácidos del SEC
ID NO: 1, es decir, cebadores que tienen las secuencias de
nucleótidos mostradas en la lista 8 más abajo, se amplificó un
fragmento de ADN mediante PCR en las condiciones descritas en el
Ejemplo 6. El fragmento de ADN amplificado de este modo mediante
PCR se clonó con un estuche de clonación TA (Invitrogen), seguido
de reacción de la secuencia utilizando el ABI PRISM Dye Terminator
Cycle Sequencing Ready Reaction Kit de Perkin-Elmer
y el análisis de la secuencia de nucleótidos con un secuenciador
373S DNA de ABI. Basándose en esta secuencia, se sintetizaron
cebadores que tenían las secuencias de nucleótidos mostradas en el
lista 9 más abajo. La síntesis de ADNc se llevó a cabo con Marathon
Kit de Clontech utilizando el ARNm obtenido de la misma manera que
en el Ejemplo 1 a partir de hojas de soja Williams 82. El ADNc
obtenido se ligó aun adaptador contenido en este estuche con
ligasa. Esta operación se realizó según el protocolo adjunto.
Utilizando el ADNc ligado al adaptador preparado de este modo, se
efectuó la reacción en cadena de la polimerasa con los cebadores
utilizados en la lista 9 más abajo. Las secuencias de nucleótidos de
ambas regiones terminales del gen se analizaron según el protocolo
adjunto al Marathon Kit de Clontech. Como resultado, se determinó la
secuencia de nucleótidos del SEC ID NO: 4.
\newpage
Lista
8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Lista
9
De la misma manera que se ha descrito en el
Ejemplo 5, se obtuvo ADNc de hojas de alcachofa Japonesa (Stachys
sieboldii). Utilizando esta ADNc como molde y los cebadores
diseñados a partir de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NO: 1,
es decir, los cebadores que tienen las secuencias de nucleótidos
mostradas en la lista 10 más abajo, se amplificó un fragmento de
ADN mediante PCR en las condiciones descritas en el Ejemplo 6. El
fragmento de ADN amplificado de este modo mediante PCR se clonó con
un estuche de clonación TA (Invitrogen), seguido de reacción de la
secuencia utilizando el ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit de Perkin-Elmer y el análisis de
la secuencia de nucleótidos con un secuenciador 373S DNA de ABI.
Como resultado, se determinó la secuencia del SEC ID NO: 6.
Basándose la secuencia de nucleótidos obtenida
de este modo, se prepararon los cebadores de ADN sintetizado, y de
la misma manera que se describe en el Ejemplo 9, se analizan las
secuencias de nucleótidos en ambas regiones terminales del gen con
el Marathon Kit de Clontech.
Lista
10
\vskip1.000000\baselineskip
De la misma manera que se describe en el Ejemplo
5, se obtuvo ADNc a partir de hojas de maíz (Zea mays)
Pioneer 3358. Utilizando este ADNc como molde y los cebadores
diseñados a partir de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NO: 1,
es decir, cebadores que tienen las secuencias de nucleótidos
mostradas en la lista 11 más abajo, se amplificó un fragmento de
ADN mediante PCR en las condiciones descritas en el Ejemplo 6. El
fragmento de ADN amplificado de este modo mediante PCR se clonó con
un estuche de clonación TA (Invitrogen), seguido de reacción de la
secuencia utilizando el ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit de Perkin-Elmer y el análisis de
la secuencia de nucleótidos con un secuenciador 373S DNA de ABI.
Basándose en esta secuencia, se sintetizaron cebadores que tenían
las secuencias de nucleótidos mostradas en el lista 12 más abajo. De
la misma manera que se describe en el Ejemplo 5, se conectó el ARNm
obtenido de hojas de maíz (Zea mays) Pioneer 3358 con un
adaptador contenido en el Marathon Kit de Clontech con ligasa. Esta
operación se realizó según el protocolo adjunto. Utilizando el ADNc
ligado al adaptador preparado de este modo, se efectuó la reacción
en cadena de la polimerasa de la misma manera que se ha descrito
antes con los cebadores mostrados en la lista 12 más abajo. Como
resultado, se determinó la secuencia de nucleótidos del SEC ID NO:
8.
Basándose en la secuencia de nucleótidos
obtenida de esta modo, se preparan cebadores de ADN sintetizados, y
de la misma manera que se describe en el Ejemplo 9, se analiza la
secuencia de nucleótidos de la región 5'-terminal
con el Marathon Kit of Clontech.
Lista
11
Lista
12
El plásmido pBluescriptKS-RS que
tenía el gen de la rafinosa sintetasa de haba obtenido en el Ejemplo
7 se digirió con las endonucleasas de restricción Bam HI y
Sac I. Utilizando el Ligation Kit (Takara), el fragmento de
ADN digerido de este modo se clonó en el vector binario Pbi121
(Clontech) previamente digerido con Bam HI y Sac I. El
vector obtenido de este modo se designó
pBI121-RS.
Para un experimento antisentido, se ligó el
plásmido pBI121 (Clontech) previamente digerido con Bam HI y
Sac I con los conectores mostrados en la lista 13 más abajo
para dar pBI121(-). Este pBI121(-) se utilizó para preparar
pBI121(-)RS de la misma manera que se ha descrito para la
preparación de pBI121-RS antes.
Se preparó un vector similar con pBI221. El
plásmido pBluescriptKS-RS obtenido en el Ejemplo 7
se digirió con las endonucleasa de restricción Bam HI y
Sac I. Utilizando el Ligation Kit (Takara), se clonó el
fragmento de ADN digerido de este modo en el vector pNI221
(Clontech) previamente digerido con Bam HI y Sac I. El
vector obtenido de este modo se designó
pBI221-RS.
Para un experimento antisentido, se ligó el
plásmido pBI221 (Clontech) previamente digerido con Bam HI y
Sac I a los conectores mostrados en la lista 13 más abajo
para dar pBI221(-). Este pBI221(-) se utilizó para preparar
pBI221(-)-RS de la misma manera que se descrito para
la preparación de pBI221-RS anterior.
La construcción de estos vectores de expresión
se muestra en las Figuras 2 y 3.
Lista
13
Se utilizaron los vectores
pBI121-RS y pBI121(-)-RS preparados
en el Ejemplo 12 para la transformación de mostaza (Brassica
juncia) mediante el método de infección con Agrobacterium.
Se transformó Agrobacterium tumefaciens
(cepa C58C1, resistente a rifampicina) que se había hecho pasar
previamente a un estado competente mediante tratamiento con cloruro
de calcio independientemente con dos plásmidos
pBI121-RS y pBI121(-)-RS preparados
en el Ejemplo 12. Se llevó a cabo la selección de los transformantes
en medio LV que contenía 50 \mug/ml de rifampicina y 25 \mug/ml
de kanamicina utilizando el carácter de resistencia a kanamicina
conferido por el gen de resistencia a la kanamicina (neomicin
fosfotransferasa, NPTII) de los plásmidos introducidos.
El Agrobacterium transformante obtenido (cepa
C58 de Agrobacterium tumefaciens, resistente a rifampicina)
se cultivó sobre medio LB que contenía 50 \mug/ml de rifampicina y
25 \mug/ml de kanamicina a 28ºC durante un día y una noche
completos, y se utilizó el cultivo para la transformación de la
mostaza mediante el método descrito más abajo.
Las semillas de mostaza se sembraron
asépticamente en medio 1/2 MS, sacarosa al 2%, agar al 0,7%. Al cabo
de una semana, se cortaron los cotiledones y los pecíolos de las
plantas con retoños con un escalpelo, y se transfirieron a medio MS,
sacarosa al 3%, agar al 0,7%, MBA 4,5 \muM, 2,4-D
0,05 \muM, AgNO_{3} 3,3 \muM, seguido de cultivo previo
durante 1 día. Los cotiledones y los pecíolos precultivados se
transfirieron a una dilución a la milésima del cultivo de
Agrobacterium para causar la infección durante 5 minutos. Los
cotiledones y los peciolos infectados se transfirieron de nuevo al
mismo medio y se utilizaron en el cultivo previo, y se cultivaron
durante 3 a 4 días. Los cotiledones y peciolos cultivados se
transfirieron a medio MS, sacarosa al 3%, BA 4,5 \muM,
2,4-D0,05 \muM, AgNO_{3} 3,3 \muM, 500
mg/litro de cefotaxim, y se esterilizaron con sacudimiento durante 1
día. Los cotiledones y peciolos esterilizados se transfirieron a
medio MS, sacarosa al 3%, agar al 0,7%, BA 4,5 \muM,
2,4-D 0,05 \muM, AgNO_{3} 3,3 \muM, 100
mg/litro de cefotaxim, 20 mg/litro de kanamicina, y se cultivaron
durante 3 a 4 semanas. Los cotiledones y peciolos se transfirieron a
medio MS, sacarosa al 3%, agar al 0,7%, BA 4,5 \muM,
2,4-D 0,05 \muM, 100 mg/litro de cefotaxim, 20
mg/litro de kanamicina, y se cultivaron. El cultivo de este medio
continuó con subcultivos a intervalos de 3 a 4 semanas. Cuando se
empezaba a producir la regeneración de los vástagos, estos vástagos
se subcultivaron en medio MS, sacarosa al 3%, agar al 0,7%, 20
mg/litro de kanamicina, y se cultivaron durante 3 a 4 semanas. Las
plantas arraigadas se transfirieron a vermiculita:esfagno = 1:1, y
se acondicionaron de 21ºC a 22ºC en un ciclo de día/noche = 12
horas:12 horas. Con el progreso del crecimiento del cuerpo vegetal,
las plantas se hicieron crecer adecuadamente tierra de cultivo. De
las hojas de las plantas regeneradas, se extrajo ADN genómico según
el método descrito antes, y se confirmó la inserción del gen en el
genoma de la planta mediante PCR utilizando los cebadores mostrados
en la lista 14 más abajo.
Lista
14
Se dispusieron células cultivadas de embriones
somáticos de soja "Fayette" (400 a 500 mg FW) en una capa
dentro de un círculo que tenía un diámetro de 20 mm en la parte
central de una placa de agar de 6 cm. Se introdujeron dos plásmidos
pBI221-RS y pBI221(-)-RS que tenían
genes mixtos preparados a partir del gen de la rafinosa sintetasa de
haba y promotor 35S en el Ejemplo 12 en los embriones somáticos de
soja según la descripción de la Solicitud de Patente Japonesa Núm.
3-291501/1991. Esto es, se mezclaron estos plásmidos
con el vector de coexpresión de
\beta-glucuronidasa (GUS)/gen resistente a la
higromicina (HPT) pSUM-GH:NotI para la selección
descrito en Soshiki Baiyo, 20, 323-327 (1994). Estos
plásmidos mixtos se utilizaron para la introducción del gen en
embriones somáticos de soja con una pistola de partículas (800
mg/partículas de oro de recubrimiento 200 \mug/disparo; distancia
del tapón del proyectil-muestra, 100 mm). Después
de la introducción, se hicieron crecer cultivos giratorios en el
medio líquido de crecimiento modificado MS (Sigma) que contenía de
25 a 50 \mug/ml de higromicina con iluminación a 25ºC durante 16
horas, y se seleccionaron los embriones somáticos
transformados.
Para los embriones somáticos de soja resistentes
a la higromicina que tenían un color verde amarillento y capacidad
de crecer, que se habían seleccionado después de aproximadamente 3
meses, se efectúa una reacción en cadena por polimerización con los
cebadores mostrados en la lista 14 anterior para determinar si la
región del gen de la rafinosa sintetasa de haba se ha amplificado o
no. Esto confirma que el gen de la rafinosa sintetasa de haba está
insertado en el genoma de la soja.
Además, se utilizan los embriones somáticos
obtenidos para la regeneración de plantas para dar soja
transformante con el gen de la rafinosa sintetasa de haba.
Los medios LB y MS utilizados en los Ejemplos
anteriores tienen las siguientes composiciones respectivas.
\vskip1.000000\baselineskip
Medio
LB
Medio
MS
1. SEQ ID NO:
1
La secuencia del SEQ ID NO: 1 muestra una
secuencia de aminoácidos de una proteína rafinosa sintetasa
codificada en el gen de la rafinosa sintetasa obtenido de haba.
2. SEQ ID NO:
2
La secuencia del SEQ ID NO: 2 muestra una
secuencia de nucleótidos de ADNc del gen de la rafinosa sintetasa
obtenido de haba.
3. SEQ ID NO:
3
La secuencia del SEQ ID NO: 3 muestra una
secuencia de aminoácidos de una proteína rafinosa sintetasa
codificada en el gen de la rafinosa sintetasa obtenido de la
soja.
4. SEQ ID NO:
4
La secuencia del SEQ ID NO: 4 muestra una
secuencia de nucleótidos de ADNc del gen de la rafinosa sintetasa
obtenido de la soja.
5. SEQ ID NO:
5
La secuencia del SEQ ID NO: 5 muestra una
secuencia de aminoácidos de una proteína rafinosa sintetasa
codificada en el gen de la rafinosa sintetasa obtenido de la
alcachofa Japonesa.
6. SEQ ID NO:
6
La secuencia del SEQ ID NO: 6 muestra una
secuencia de ADNc de nucleótidos del gen de la rafinosa sintetasa
obtenido de la alcachofa Japonesa.
7. SEQ ID NO:
7
La secuencia del SEQ ID NO: 7 muestra una
secuencia de aminoácidos de una proteína rafinosa sintetasa
codificada en el gen de la rafinosa sintetasa obtenido del maíz.
8. SEQ ID NO:
8
La secuencia del SEQ ID NO: 8 muestra una
secuencia de ADNc de nucleótidos del gen de la rafinosa sintetasa
obtenido del maíz.
9. Lista
1
Las secuencias de nucleótidos mostradas en la
lista 1 son los cebadores típicos utilizados en la amplificación de
un fragmento de ADNc de un gen de rafinosa sintetasa. Todas estas
secuencias se basan en la secuencia de nucleótidos de la región no
codificadora del gen. El cebador 1 es un cebador efector
correspondiente al extremo 5' de un fragmento de ADNc del gen de la
rafinosa sintetasa derivado de haba. Los cebadores 2 y 3 son
cebadores antisentido correspondientes al extremo 3' del fragmento
de ADNc del gen de la rafinosa sintetasa derivado de haba. El
cebador 4 es un cebador efector correspondiente al extremo 5' de un
fragmento de ADNc del gen de la rafinosa sintetasa derivado de
soja. Los cebadores 5 y 6 son cebadores antisentido correspondientes
al extremo 3' del fragmento de ADNc del gen de la rafinosa
sintetasa derivado de soja. Dependiendo del propósito, se pueden
añadir las secuencias de reconocimiento para endonucleasas de
restricción adecuadas a los extremos 5' de estas secuencias de
nucleótidos de una manera apropiada.
10. Lista
2
Las secuencias de nucleótidos mostradas en la
lista 2 son de los cebadores típicos utilizados en la amplificación
de un marco de lectura abierto que codifica la secuencia de
aminoácidos de una proteína rafinosa sintetasa en la secuencia de
ADNc de un gen de rafinosa sintetasa. Los cebadores 1 y 2 son
cebadores efectores correspondientes al extremo N de la proteína
rafinosa sintetasa derivada de haba. Los cebadores 3 y 4 son
cebadores antisentido correspondientes al extremo C de la proteína
rafinosa sintetasa derivada de haba. Los cebadores 5 y 6 son
cebadores efectores correspondientes al extremo N de la proteína
rafinosa sintetasa derivada de soja. Los cebadores 7 y 8 son
cebadores antisentido correspondientes al extremo C de la proteína
rafinosa sintetasa derivada de soja. Dependiendo del propósito, se
pueden añadir secuencias de reconocimiento para endonucleasas
adecuadas a los extremos 5' de estas secuencias de una manera
apropiada.
\newpage
11. Lista
3
Las secuencias de aminoácidos mostradas en la
lista 3 son secuencias de aminoácidos parciales de una proteína
rafinosa sintetasa.
El Núm. 1 es equivalente a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 110 al
aminoácido 129 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1.
El Núm. 2 es equivalente a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 234 al
aminoácido 247 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1.
El Núm. 3 es equivalente a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 265 al
aminoácido 279 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1.
El Núm. 4 es equivalente a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 296 al
aminoácido 312 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1.
El Núm. 5 es equivalente a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 346 al
aminoácido 361 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1.
El Núm. 6 es equivalente a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 383 al
aminoácido 402 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1.
El Núm. 7 es equivalente a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 411 al
aminoácido 433 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1.
El Núm. 8 es equivalente a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 440 al
aminoácido 453 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1.
El Núm. 9 es equivalente a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 457 al
aminoácido 468 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1.
El Núm. 10 es equivalente a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 471 al
aminoácido 516 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1.
El Núm. 11 es equivalente a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 517 al
aminoácido 559 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1.
El Núm. 12 es equivalente a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 574 al
aminoácido 582 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1.
El Núm. 13 es equivalente a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 586 al
aminoácido 609 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1.
El Núm. 14 es equivalente a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 615 al
aminoácido 627 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1.
El Núm. 15 es equivalente a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 716 al
aminoácido 724 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1.
12. Lista
4
Las secuencias de aminoácidos mostradas en la
lista 4 son de los cebadores típicos sintetizados en algunas de las
secuencias de aminoácidos mostradas en la lista 3. El símbolo
"F" utilizado después del número del cebador significa que el
cebador referido por este símbolo tiene una secuencia efectora. El
símbolo "RV" utilizado después del número del cebador
significa que el cebador referido por este símbolo tiene una
secuencia antisentido. El cebador 1 corresponde a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 119 al
aminoácido 129 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1. El
cebador 2 corresponde a la secuencia de aminoácidos parcial que se
extiende desde el aminoácido 234 al aminoácido 247 de la secuencia
de aminoácidos del SEC ID NUM: 1. El cebador 3 corresponde a la
secuencia de aminoácidos parcial que se extiende desde el
aminoácido 265 al aminoácido 279 de la secuencia de aminoácidos del
SEC ID NUM: 1. El cebador 4 corresponde a la secuencia de
aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido 458 al
aminoácido 468 de la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1. El
cebador 5 corresponde a la secuencia de aminoácidos parcial que se
extiende desde el aminoácido 522 al aminoácido 534 de la secuencia
de aminoácidos del SEC ID NUM: 1. El cebador 6 corresponde a la
secuencia de aminoácidos parcial que se extiende desde el aminoácido
716 al aminoácido 724 de la secuencia de aminoácidos del
SEC ID NUM: 1.
SEC ID NUM: 1.
\newpage
13. Lista
5
Las secuencias de nucleótidos mostradas en la
lista 5 son de los cebadores típicos sintetizados en secuencias de
aminoácidos parciales de la proteína rafinosa sintetasa de haba
purificada. Las bases mostradas entre paréntesis significan que se
utilizó una mezcla de aquellas bases en la síntesis. El símbolo
"RV" utilizado después del número del cebador significa que el
cebador referido por este símbolo tiene una secuencia
antisentido.
14. Lista
6
Las secuencias de nucleótidos mostradas en la
lista 6 son de los cebadores típicos utilizados en el análisis de
ambas regiones terminales de una secuencia de nucleótidos de ADNc
del gen de la rafinosa sintetasa de haba mediante el método RACE.
El símbolo "RV" utilizado después del número de cebador
significa que el cebador referido por este símbolo tiene una
secuencia antisentido.
15. Lista
7
Las secuencias de nucleótidos mostradas en la
lista 7 son de los cebadores típicos utilizados en la clonación del
gen de la rafinosa sintetasa de haba. RS-N
corresponde al extremo N del marco de lectura abierto y contiene
dos sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción
Xba I del lado 5'-terminal.
16. Lista
8
Las secuencias de nucleótidos mostradas en la
lista 8 son de los cebadores típicos utilizados en la clonación de
un fragmento del gen de la rafinosa sintetasa de soja. La base
representada por el símbolo "I" era la inosina utilizada en la
síntesis. El símbolo "RV" utilizado después del número del
cebador significa que el cebador referido por este símbolo tiene
una secuencia antisentido.
17. Lista
9
Las secuencias de nucleótidos mostradas en la
lista 9 son de los cebadores típicos utilizados en el análisis de
la secuencia de nucleótidos de un fragmento del gen de la rafinosa
sintetasa de soja. El símbolo "RV" utilizado después del
número del cebador significa que el cebador referido por este
símbolo tiene una secuencia antisentido.
El análisis de las secuencias de nucleótidos se
llevó a cabo mediante reacción en cadena de la polimerasa
utilizando SN-1 y SC-3RV. Se
utilizaron SC-5 y SC-6 en el
análisis de una secuencia de nucleótidos en la región
3'-terminal, y se utilizaron SN-3RV
y SN-4RV en el análisis de una secuencia de
nucleótidos en la región 5'-terminal.
18. Lista
10
Las secuencias de nucleótidos mostradas en la
lista 10 son de los cebadores típicos utilizados en el análisis de
la secuencia de nucleótidos del ADNc de un fragmento del gen de la
rafinosa sintetasa de alcachofa Japonesa. La base representada por
el símbolo "I" era la inosina utilizada en la síntesis. El
símbolo "RV" utilizado después del número del cebador
significa que el cebador referido por este símbolo tiene una
secuencia antisentido.
19. Lista
11
Las secuencias de nucleótidos mostradas en la
lista 11 son de los cebadores típicos utilizados en el análisis de
la secuencia de nucleótidos del ADNc de un fragmento del gen de la
rafinosa sintetasa de maíz. La base representada por el símbolo
"I" era la inosina utilizada en la síntesis. El símbolo
"RV" utilizado después del número del cebador significa que el
cebador referido por este símbolo tiene una secuencia
antisentido.
20. Lista
12
Las secuencias de nucleótidos mostradas en la
lista 12 son de los cebadores típicos utilizados en el análisis de
la secuencia de nucleótidos del ADNc de un fragmento del gen de la
rafinosa sintetasa de maíz. Se utilizaron M-10 y
M-11 en el análisis de una secuencia de nucleótidos
en la región 3'-terminal.
21. Lista
13
Las secuencias de nucleótidos mostradas en la
lista 13 son de los adaptadores típicos utilizados en la
construcción de vectores para experimentos antisentido. Estos
fragmentos de ADN sintético adoptan una doble forma cuando se
mezclan entre sí porque son hebras complementarias. Este fragmento
de ADN bicatenario tiene extremos cohesivos de los sitios de
escisión para las endonucleasas de restricción Bam HI y
Sac I en ambos extremos, y contiene los sitios de
restricción para las endonucleasa de restricción Bam HI y
Sac I en la región bicatenaria.
\newpage
22. Lista
14
Las secuencias de nucleótidos mostradas en la
lista 14 son de los cebadores típicos utilizados en el experimento
de PCR para confirmar la introducción del gen en el genoma de una
planta recombinante. 35S es un cebador hacia la región aguas abajo
en el sitio del promotor 35S, y NOS es un cebador hacia la región
aguas arriba en el sitio del terminador NOS. RS-F
es un cebador efector del gen de la rafinosa sintetasa de haba, y
RS-RV es un cebador antisentido del gen de la
rafinosa sintetasa de haba.
NUMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 799 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: haba (Vicia faba)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Nintoku Issun
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: semillas
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2746 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 101..2500
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimento
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 781 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: soja (Glycine max)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Williams 82
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: semillas y hojas
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2598 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 62..2407
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimento
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 587 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Alcachofa Japonesa (Stachys sieboldii)
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: hojas
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1762 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..1762
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimento
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 271 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: maíz (Zea mays L.)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Pioneer 3358
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: hojas
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 996 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..817
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimento
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
<110> Sumitomo Chemical Company,
Limited
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Gen de la rafinosa sintetasa y uso
del mismo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 97122417.5
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1997-12-18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 338673/1996
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1996-12-18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 799
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2746
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (101) .. (2500)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 781
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Glycine max
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (62) .. (2407)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 587
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Stachys sieboldii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1762
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Stachys sieboldii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) .. (1762)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 271
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,6cm71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 993
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) .. (817)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 1 (de la lista 1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattttcaag catagccaag ttaaccacct
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 2 (de la lista 1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcacaaga taatgatgtt agtc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 3 (de la lista 1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatacaagtga ggaacttgac ca
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 4 (de la lista 1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaaccata gcaaacctaa gcac
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 5 (de la lista 1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaacagaaa aatatgactc ttattact
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 6 (de la lista 1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaagagagt caaacatcat agtatc
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 1 (de la lista 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggcaccac caagcataac caaaactgc
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 2 (de la lista 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggcaccac caagcataac caaaactgca accctccaag acg
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 3 (de la lista 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaaaataaa aactggacca aagac
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 4 (de la lista 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaaaataaa aactggacca aagacaatgt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 5 (de la lista 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggctccaa gcataagcaa aactg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 6 (de la lista 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggctccaa gcataagcaa aactgtggaa ct
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 7 (de la lista 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaaaataaa aactcaacca ttgac
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 8 (de la lista 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaaaataaa aactcaacca ttgacaattt tgaagcact
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ile Lys Phe Met Ser Ile Phe Arg Phe Lys
Val Trp Trp Thr Thr}
\sac{His Trp Val Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Ile Asp Lys Phe Gly Trp Cys Thr Trp Asp
Ala Phe Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Cys Pro Pro Gly Phe Val Ile Ile Asp
Asp Gly Trp Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ser Ala Gly Glu Gln Met Pro Cys Arg Leu
Val Lys Tyr Glu Glu}
\sac{Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Tyr Val Trp His Ala Leu Cys Gly Tyr Trp
Gly Gly Val Arg Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Met Glu Asp Leu Ala Val Asp Lys Ile Val
Glu Asn Gly Val Gly}
\sac{Leu Val Pro Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu His Ser His Leu Glu Ser Ala Gly Ile
Asp Gly Val Lys Val}
\sac{Asp Val Ile His Leu Leu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Arg Val Glu Leu Ala Arg Ala Tyr Tyr
Lys Ala Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Lys Lys His Phe Lys Gly Asn Gly Val Ile
Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Asp Gly Ser Ile Leu Arg Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Leu Pro Thr Arg Asp Cys Leu Phe Glu Asp
Pro Leu His Asn Gly}
\sac{Lys Thr Met Leu Lys Ile Trp Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Val Leu Gly Leu Phe Asn Cys Gln Gly Gly
Gly Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vicia faba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ala Pro Ile Gly Leu Val Asn Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 1-F (de la lista 4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttnaangtnt ggtggacnac ncantgggtn gg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (41)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 2-F (de la lista 4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatnatngana anttnggntg gtgnacntgg gangcnttnt a
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (41)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 2-RV (de la lista
4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptanaangcnt cccangtnca ccanccnaan ttntcnatna t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (44)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 3-F (de la lista 4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggnggntgnc cnccnggntt ngtnatnatn ganganggnt ggca
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (44)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 3-RV (de la lista
4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgccanccnt cntcnatnat nacnaanccn ggnggncanc cncc
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 4-F (de la lista 4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaanaancant tnaanggnaa nggngtnatn gc
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 4-RV (de la lista
4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcnatnacnc cnttnccntt naantgnttn tt
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 5-F (de la lista 4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggatgggna anttnatnca nccngantgg ganatgtt
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 5-RV (de la lista
4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacatntccc antcnggntg natnaanttn cccatcca
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 6-RV (de la lista
4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatnttnacn arnccnatng gngcnaa
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = a, g, t o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético #8.2 (de la lista 5)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaracngcnc cnagyathat hgacaa
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = a, g, t o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético #13.4 (de la lista 5)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaarathtgga ayctnaacaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = a, g, t o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético #7.4 (de la lista 5)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaargcnagrg tngtngtncc naag
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = a, g, t o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético #13.3RV (de la lista 5)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipyttrttnagr ttccadattt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = a, g, t o c
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético #10.3RV (de la lista 5)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipyttrtcytcr tanagraatt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético RS-2RV (de la lista
6)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctgaggtt cggttcattc ctgaatcatc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético RS-7 (de la lista
6)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaatggta catattggct ccaaggttgt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético RS-8 (de la lista
6)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagagtgtat ctgaattttc acgcgcggtg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético RS-9 (de la lista
6)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtgcaatg ggaaaactcc aatgagcacc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético RS-10 (de la lista
6)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgaagtgtt ctgatagatt gaaagtttcg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético RS-11 (de la lista
6)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtctctgg agtttgatga taatgcaagt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético RS-N (de la lista
7)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatcca ccatggcacc accaagcata accaaaactg c
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético RS-C (de la lista
7)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctctagat tatcaaaata aaaactggac caaagac
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 1-F (de la lista 8)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgattnaang tntggtggac nacncantgg gtngg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 2-RV (de la lista
8)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcctanaan gcntcccang tncaccancc naanttntcn atnat
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (41)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 5-F (de la lista 8)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatggatgg gnaanttnat ncanccngan tggganatgt t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 6-RV (de la lista
8)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccacatnt tnacnarncc natnggngcn aa
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético SN-1 (de la lista
9)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgaactgg ggcacgagac acagatgatg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético SC-3RV (de la lista
9)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcaagtca cggagtgtga atagtcagag
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético SC-5 (de la lista
9)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacacgagact gtttgtttga agaccccttg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético SC-6 (de la lista
9)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggaatctca acaaatatac aggtg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético SN-3RV (de la lista
9)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtcatggc caacgtggac gtataagcac
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético SN-4RV (de la lista
9)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgatcact ggcgcggttt tctcctcgag
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 1-F (de la lista
10)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgattnaang tntggtggac nacncantgg gtngg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (37)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 4-RV (de la lista
10)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccagcnat nacnccnttn ccnttnaant gnttntt
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (44)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 2-F (de la lista
10)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaatnatng anaanttngg ntggtgnacn tgggangcnt tnta
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 6-RV (de la lista
10)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccacatnt tnacnarncc natnggngcn aa
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (41)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 5-F (de la lista
11)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatggatgg gnaanttnat ncanccngan tggganatgt t
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base_modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = i
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 6-RV (de la lista
11)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccacatnt tnacnarncc natnggngcn aa
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético M-10 (de la lista
12)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacgtcgagt ggaagagcgg caagg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético M-11 (de la lista
12)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacctacgag ctcttcgtcg ttgcc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:conector sintético BamSac-(+) (de la lista 13)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcgagctc gtgtcggatc cagct
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:conector sintético BamSac-(+) (de la lista 13)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcgagctc gtgtcggatc cagct
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:conector sintético BamSac-(-) (de la lista 13)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatccgaca cgagctc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético 35S (de la lista 14)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttccagtatg gacgattcaa ggcttgcttc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético NOS (de la lista 14)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgtataatt gcgggactct aatca
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético RS-F (de la lista
14)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagagtgtat ctgaattttc acgcgcggtg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial:cebador sintético RS-RV (de la lista
14)
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<400> 84
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\hskip-.1em\dddseqskipaccttcccat acaccttttg gatgaacctt caa
\hfill33
Claims (16)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica una rafinosa sintetasa vegetal que es capaz de producir
rafinosa combinando un grupo D-galactosilo por medio
de un enlace \alpha(1\rightarrow6) con un grupo hidroxilo
anclado al átomo de carbono en la posición 6 de un resto
D-glucosa en una molécula de sacarosa, donde dicha
molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo formado por:
- (a)
- moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por el SEC ID NUM: 3, SEC ID NUM: 5, y SEC ID NUM: 7;
- (b)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden la región codificadora de la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por el SEC ID NUM: 4, SEC ID NUM: 6, y SEC ID NUM: 8;
- (c)
- moléculas de ácido nucleico que hibridan con la hebra complementaria de una molécula de ácido nucleico indicada en (a) o (b), en condiciones restrictivas, donde la planta es una planta leguminosa, una planta lamiácea o una monocotiledónea;
- (d)
- moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de uno cualquiera de (a) a (c) debido a la degeneración del código genético;
- (e)
- un fragmento de una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de uno cualquiera de (a) a (d) que codifica una proteína capaz de producir rafinosa combinando un grupo D-galactosilo por medio de un enlace \alpha(1\rightarrow6) con un grupo hidroxilo anclado al átomo de carbono de la posición 6 de un resto D-glucosa en una molécula de sacarosa;
- (f)
- moléculas de ácido nucleico de (d) o (e) donde la planta es una planta leguminosa, una planta lamiácea, o una monocotiledónea;
- (g)
- moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína con la secuencia de aminoácidos del SEC ID NUM: 1;
- (h)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden la región codificadora de la secuencia de nucleótidos del SEC ID NUM: 2;
- (i)
- moléculas de ácido nucleico que hibridan con la hebra complementaria de una molécula de ácido nucleico indicada en (g) o (h), en condiciones restrictivas;
- (j)
- un fragmento de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de uno cualquiera de (g) a (i) que codifica una proteína capaz de producir rafinosa combinando un grupo D-galactosilo por medio de un enlace \alpha(1\rightarrow6) con un grupo hidroxilo anclado al átomo de carbono de la posición 6 de un resto D-glucosa en una molécula de sacarosa; y
- (k)
- moléculas de ácido nucleico de (i) o (j), donde la planta es una planta leguminosa.
2. Las moléculas de ácido nucleico de la
reivindicación 1, donde la planta leguminosa es una planta de haba
o de soja.
3. Las moléculas de ácido nucleico de la
reivindicación 1, donde la planta lamiácea es una alcachofa
Japonesa.
4. Las moléculas de ácido nucleico de la
reivindicación 1, donde la monocotiledónea es una planta
gramínea.
5. Las moléculas de ácido nucleico de la
reivindicación 4, donde la planta gramínea es el maíz.
6. Una molécula de ácido nucleico que comprende
la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, conectada
funcionalmente a un promotor.
7. Un plásmido que comprende una molécula de
ácido nucleico de la reivindicación 1 opcionalmente en una
combinación funcional con un promotor, o una molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 6.
8. Un organismo huésped que contiene la molécula
de ácido nucleico de la reivindicación 6 o el plásmido de la
reivindicación 7.
9. El organismo huésped de la reivindicación 8
que es un microorganismo, una célula vegetal o una planta.
10. Un método para la producción de una proteína
rafinosa sintetasa o una porción de la misma, que comprende las
etapas de aislar y purificar una proteína rafinosa sintetasa o una
porción de la misma de un cultivo obtenido cultivando el organismo
huésped de la reivindicación 8 o 9.
11. Una proteína rafinosa sintetasa aislada
codificada por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación
1.
12. Una molécula de ácido nucleico antisentido o
una ribozima que hibrida o se une específicamente a una molécula de
ácido nucleico de la reivindicación 1.
13. Un método para modificar el metabolismo de
un organismo huésped, que comprende introducir la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 1 o 6 o una molécula de ácido nucleico
antisentido o una ribozima de la reivindicación 12 en dicho
organismo huésped o una célula del mismo, de manera que cambie el
contenido de oligosacáridos de la familia de la rafinosa en dicho
organismo huésped o célula del mismo.
14. Una proteína rafinosa sintetasa aislada que
es capaz de producir rafinosa combinando un grupo
D-galactosilo por medio de un enlace
\alpha(1\rightarrow6) con un grupo hidroxilo anclado al
átomo de carbono de la posición 6 de un resto
D-glucosa en una molécula de sacarosa, donde dicha
proteína está relacionada con la proteína rafinosa sintetasa del
SEC ID NUM: 1 o el SEC ID NUM:3, mediante deleción, sustitución,
modificación o adición de un aminoácido.
15. Un anticuerpo anti-rafinosa
sintetasa capaz de unirse específicamente a la proteína rafinosa
sintetasa de la reivindicación 11 o 14.
16. El uso de un anticuerpo
anti-rafinosa sintetasa de la reivindicación 15 para
la detección de una proteína rafinosa sintetasa.
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