ES2274627T3 - Proteinas y genes de moraxella catarrhalis, antigenos, anticuerpos y usos. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEC ID Nº 2 y la SEC ID Nº 4 durante la longitud entera de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4 respectivamente, donde el polipéptido es capaz de provocar una respuesta inmune, si es necesario cuando se acopla a un vehículo, que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4.

Description

Proteínas y genes de Moraxella catarrhalis, antígenos, anticuerpos y usos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polinucleótidos, (denominados en este documento "polinucleótidos BASB027"), a polipéptidos codificados por ellos (denominados en este documento "BASB027" o polipéptidos "BASB027"), a materiales recombinantes y a procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo vacunas contra infecciones bacterianas. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos diagnósticos para detectar la infección de ciertos patógenos.

Antecedentes de la invención

Moraxela catarrhalis (también llamada Branhamella catarrhalis) es una bacteria Gram negativa aislada frecuentemente del tracto respiratorio superior humano. Es responsable de varias patologías, siendo las principales otitis media en lactantes y niños, y neumonía en ancianos. Es también responsable de sinusitis, infecciones nocosomiales y menos frecuentemente de enfermedades invasivas.

La otitis media es una enfermedad infantil importante tanto por el número de casos como por sus secuelas potenciales. Se registran más de 3,5 millones de casos todos los años en los Estados Unidos, y se estima que el 80% de los niños han experimentado al menos un episodio de otitis antes de alcanzar la edad de 3 años (Klein, JO (1994) Clin.Inf.Dis 19:823). Si se deja sin tratar, o se convierte en crónica, la enfermedad puede conducir a pérdidas de audición que podrían ser temporales (en el caso de acumulación de fluido en el oído medio) o permanente (si se daña el nervio auditivo). En lactantes, tales pérdidas de audición pueden ser responsables de un retraso en el aprendizaje del habla.

Se aíslan principalmente 3 especies bacterianas en el oído medio de los niños con otitis media: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza no tipificable (NTHi) y M. catarrhalis. Están presentes en el 60 al 90% de los casos. Un análisis de estudios recientes muestra que S. pneumoniae y NTHi representan ambos aproximadamente el 30% y M. Catarrhalis aproximadamente el 15% de los casos de otitis media (Murphy, TF (1996) Microbiol.Rev. 60:267). Podrían aislarse otras bacterias del oído medio (H. influenza tipo B, S. pyogenes, etc.) pero a frecuencia mucho más baja (2% de los casos o menos).

Los datos epidemiológicos indican que, para los patógenos encontrados en el oído medio, la colonización del tracto respiratorio superior es un prerrequisito absoluto para el desarrollo de una otitis; se requieren sin embargo otros para conducir a la enfermedad (Dickinson, DP y col., (1988) J. Infect.Dis. 158:205), Faden, HL y col., (1991) Ann.Otorhinol.Laryngol. 100:612). Estos son importantes para disparar la migración de las bacterias al oído medio a través de las trompas de Eustaquio, seguido por el comienzo de un proceso inflamatorio. Estos factores se desconocen hasta la fecha. Se ha postulado que una anomalía transitoria del sistema inmune posterior a la infección viral, por ejemplo, podría causar una incapacidad para controlar la colonización del tracto respiratorio (Faden, HL y col., (1994), J. Infect.Dis 169:1312). Una explicación alternativa es que la exposición a factores ambientales permite una colonización más importante en algunos niños, que posteriormente se hacen susceptibles al desarrollo de otitis media debido a la presencia prolongada de patógenos en el oído medio (Murphy, TF (1996) Microbiol.Rev 60:267).

La respuesta inmune a M. catarrhalis está pobremente caracterizada. El análisis de cepas aisladas secuencialmente de nasofaringes de niños de 0 a 2 años de edad indica que pueden coger y eliminar frecuentemente nuevas cepas. Esto indica que los niños colonizados preparan una respuesta inmune eficaz frente a estas bacterias. (Faden, HL y col., (1994) J. Infect.Dis. 169:1312).

En la mayoría de los adultos analizados, se han identificado anticuerpos bactericidas (Chapman, AJ y col., (1985) J. Infect. Dis. (151:878)). Las cepas de M. catarrhalis presentan variaciones en su capacidad de resistir la actividad bactericida del suero: en general, los aislados de individuos enfermos son más resistentes que los de los que están simplemente colonizados (Hol, C y col., (1993) Lancet 341:1281, Jordan, JL y col., (1990) Am. J. Med. 88 (supl. 5A): 28S). La resistencia al suero podría considerarse por lo tanto como un factor de virulencia de la bacteria. Se ha observado una actividad opsonizante en el suero de niños en recuperación de otitis media.

No se han identificado los antígenos diana de estas respuestas inmunes diferentes en humanos, con la excepción de OMP B1, una proteína de 84 kDa cuya expresión se regula por hierro, y que es reconocida por el suero de pacientes con neumonía (Sethi, S, y col., (1995) Infect. Immun. 63:1516), y de UspA1 y UspA2 (Chen D. y col., (1999), Infect. Immun. 67:1310).

Se han caracterizado otras pocas proteínas de membrana presentes en la superficie de M. catarrhalis usando procedimientos bioquímicos, o su implicación potencial en la inducción de una inmunidad protectora (para análisis, véase Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267). En un modelo de neumonía de ratón, la presencia de anticuerpos inducidos frente algunos de ellos (UspA. CopB) favorece una eliminación más rápida de la infección pulmonar. Otro polipéptido, OMP CD está altamente conservado entre las cepas de M. catarrhalis, y presenta homologías con una porina de Pseudomonas aeruginosa, que ha demostrado ser eficaz frente a esta bacteria en modelos animales.

La frecuencia de infecciones de Moraxella catarrhalis ha aumentado espectacularmente en las últimas décadas. Esto se ha atribuido a la aparición de cepas resistentes a múltiples antibióticos y a una población en aumento de personas con sistemas inmunes debilitados. Ya no es poco común aislar cepas de Moraxella catarrhalis que sean resistentes a algunos o todos los antibióticos convencionales. Este fenómeno ha creado una necesidad y demanda médica insatisfecha de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de detección de fármacos y ensayos diagnósticos para estos organismos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a BASB027, en particular a polipéptidos BASB027 y polinucleótidos BASB027, a materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, la invención se refiere a procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, incluyendo la prevención y tratamiento de enfermedades microbianas, entre otras. En un aspecto adicional, la invención se refiere a ensayos diagnósticos para detectar enfermedades asociadas con infecciones microbianas y afecciones asociadas con tales infecciones, tales como ensayos para detectar la expresión o actividad de polinucleótidos o polipéptidos BASB027.

Se harán fácilmente evidentes para los especialistas en la técnica diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención descrita, a partir de la lectura de las siguientes descripciones y de la lectura de otras partes de la presente descripción.

Descripción de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos BASB027 como se describen con mayor detalle a continuación. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos de BASB027 de Moraxella catarrhalis, que se relaciona por homología de la secuencia de aminoácidos a la proteína de la membrana externa OMP85 de Neisseria meningitidis. La invención se refiere especialmente a BASB027 que tiene las secuencias de nucleótidos y aminoácidos expuestas en la SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2 respectivamente. Se entiende que esas secuencias citadas en la lista de secuencias presentada a continuación como "ADN" representan una ilustración de una realización de la invención, ya que los especialistas habituales reconocerán que tales secuencias pueden emplearse de manera provechosa en polinucleótidos en general, incluyendo ribopolinucleótidos.

Polipéptidos

En un aspecto de la invención se proporcionan polipéptidos de Moraxella catarrhalis denominados en este documento "polipéptidos BASB027" así como variantes de los mismos biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles, y composiciones que los comprenden.

La presente invención proporciona además:

(a)

un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente el 95% de identidad, lo más preferible al menos el 97-99% o identidad exacta con la de la SEC ID Nº 2 ó 4;

(b)

un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 97-99% o identidad exacta, con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 ó 3 durante la longitud completa de la SEC ID Nº 1 ó 3 respectivamente; o

(c)

un polipéptido codificado por un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 97-99% o identidad exacta con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 ó 4.

Los polipéptidos BASB027 proporcionados en la SEC ID Nº 2 ó 4 son los polipéptidos BASB027 de la cepa Mc2931 de Moraxella catarrhalis (ATCC 43617).

La invención proporciona también un fragmento inmunogénico de un polipéptido BASB027 que es una porción contigua del polipéptido BASB027 que tiene la misma o sustancialmente la misma actividad inmunogénica que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 ó 4; es decir el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un soporte) es capaz de provocar una respuesta inmune que reconoce el polipéptido BASB027. Tal fragmento inmunogénico puede incluir, por ejemplo, el polipéptido BASB027 que carece de una secuencia líder N-terminal, y/o una dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento inmunogénico de BASB027 de acuerdo con la invención comprende sustancialmente todos los dominios extracelulares de un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, lo más preferible al menos el 97-99% de identidad con la SEC ID Nº 2 ó 4 durante la longitud entera de la SEC ID Nº 2.

Un fragmento es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es totalmente igual que parte pero no toda la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido de la invención. Como ocurre con los polipéptidos BASB027, los fragmentos pueden ser "independientes" o pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande del cual forman una parte o región, más preferiblemente como una sola región continua en un solo polipéptido más grande.

Los fragmentos preferidos incluyen, por ejemplo, polipéptidos de truncamiento que tienen una porción de una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 ó 4 o de variantes de las mismas, tal como una serie continua de restos que incluye una secuencia de aminoácidos amino y/o carboxilo terminal. Se prefieren también las formas de degradación de los polipéptidos de la invención producidos por o en una célula hospedadora. Son fragmentos preferidos adicionales los fragmentos caracterizados por atributos estructurales o funcionales tales como fragmentos que comprenden alfa hélices y regiones que forman alfa-hélices, láminas beta y regiones que forman láminas beta, giros y regiones que forman giros, enrollamientos y regiones que forman enrollamientos, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones anfipáticas alfa, regiones anfipáticas beta, regiones flexibles, regiones que forman superficies, regiones de unión a sustrato y regiones con índice antigénico alto.

Los fragmentos preferidos adicionales incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50, ó 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 ó 4, o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 15, 20, 30, 40, 50, ó 100 aminoácidos contiguos truncados o suprimidos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 ó 4.

Los fragmentos de los polipéptidos de la invención pueden emplearse para producir los correspondientes polipéptidos de longitud completa por síntesis peptídica; por lo tanto, estos fragmentos pueden emplearse como intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa de la invención.

Son particularmente preferidas las variantes en las que se sustituyen, se suprimen o se añaden varios aminoácidos, 5-10, 1-5, 1-3 o 1 en cualquier combinación.

Los polipéptidos o fragmentos inmunogénicos de la invención pueden estar en forma de proteína "madura" o pueden ser una parte de una proteína más grande tal como un precursor o una proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias secretoras o líderes, pro-secuencias, secuencias que ayudan en la purificación tales como restos de histidina múltiples, o una secuencia adicional para estabilizar durante la producción recombinante. Además, se considera la adición de polipéptidos exógenos o colas lipídicas o secuencias de polinucleótidos para aumentar el potencial inmunogénico de la molécula final.

En un aspecto, la invención se refiere a proteínas de fusión solubles obtenidas por ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversas porciones de las regiones constantes de cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de la IgG humana, particularmente IgG1, en la que la fusión ocurre en la región de bisagra. En una realización particular, puede eliminarse la parte Fc simplemente por incorporación de una secuencia de escisión que puede escindirse con el factor coagulante de la sangre Xa.

Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión por ingeniería genética, y al uso de las mismas para la selección de fármacos, diagnóstico y terapia. Un aspecto adicional de la invención se refiere también a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de tecnología de proteínas de fusión en las Solicitudes de Patente Internacional Nº WO94/29458 y WO94/22914.

Las proteínas pueden conjugarse químicamente, o expresarse como proteínas de fusión recombinantes permitiendo niveles aumentados de producción en un sistema de expresión comparado con proteínas no fusionadas. La pareja de fusión puede ayudar proporcionando epítopes ayudantes T (pareja de fusión inmunológica), preferiblemente epítopes T cooperadores reconocidos por seres humanos, o ayudar en la expresión de la proteína (potenciador de la expresión) a rendimientos más altos que la proteína recombinante nativa. Preferiblemente, la pareja de fusión será tanto una pareja de fusión inmunológica como una pareja potenciadora de la expresión.

Las parejas de fusión incluyen proteínas D de Haemophilus influenzae y la proteína no estructural del virus de la gripe, NS 1 (hemaglutinina). Otra pareja de fusión es la proteína conocida como LytA. Preferiblemente, se usa la porción C-terminal de la molécula. LytA deriva de Streptococcus penumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa, la amidasa LytA (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986) páginas 265-272}), una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces de la cadena principal del peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LytA es responsable de la afinidad por la colina o por algunos análogos de la colina tales como DEAE. Se ha explotado esta propiedad para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LytA de E. coli útiles para expresar proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LytA en su extremo amino terminal {Biotechnology: 10, (1992) página 795-798}. Es posible usar la porción repetida de la molécula de LytA encontrada en el extremo C-terminal que comienza en el resto 178, por ejemplo los restos 188-305.

La presente invención incluye también variantes de los polipéptidos mencionados anteriormente, es decir, polipéptidos que varían de los referentes por sustituciones de aminoácidos conservativas, por las cuales se sustituye un resto por otro con características similares. Tales sustituciones típicas son entre Ala, Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los restos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; y entre los restos básicos Lys y Arg; o entre los restos aromáticos Phe y Tyr.

Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse de cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos que se encuentran de forma natural aislados, polipéptidos producidos de forma recombinante, polipéptidos producidos de forma sintética o polipéptidos producidos por una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar tales polipéptidos se entienden bien en la técnica.

Lo más preferido es que un polipéptido de la invención derive de Moraxella catarrhalis, sin embargo, puede obtenerse preferiblemente de otros organismos del mismo género taxonómico. Puede obtenerse también un polipéptido de la invención, por ejemplo, de organismos de la misma familia u orden taxonómico.

Polinucleótidos

Es un objeto de la invención proporcionar polinucleótidos que codifiquen polipéptidos BASB027, particularmente polinucleótidos que codifiquen los polipéptidos designados en este documento como BASB027.

En una realización particularmente preferida de la invención, el polinucleótido comprende una región codificante de polipéptidos BASB027 que comprende una secuencia expuesta en la SEC ID Nº 1 ó 3 que incluye un gen de longitud completa, o una variante de la misma.

Los polinucleótidos BASB027 proporcionados en la SEC ID Nº 1 ó 3son los polinucleótidos BASB027 de la cepa Mc2931 de Moraxella catarrhalis (ATCC 43617).

Como un aspecto adicional de la invención se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos aislados que codifican y/o expresan polipéptidos y polinucleótidos BASB027, particularmente polipéptidos y polinucleótidos BASB027 de Moraxella catarrhalis, incluyendo, por ejemplo, ARN no procesado, ARN ribozimas, ARNm, ADNc, ADN genómico, ADNz en banda. Otras realizaciones de la invención incluyen polinucleótidos y polipéptidos biológica, diagnóstica, profiláctica, clínica o terapéuticamente útiles y variantes de los mismos, y composiciones que los comprenden.

Otro aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos aislados, incluyendo al menos un gen de longitud completa, que codifica un polipéptido BASB027 que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEC ID Nº 2 ó 4 y a polinucleótidos estrechamente relacionados con ellos y variantes de los mismos.

En otra realización particularmente preferida de la invención existe un polipéptido BASB027 de Moraxella catarrhalis que comprende o está constituido por una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 ó 4 o una variante de la misma.

Usando la información proporcionada en este documento, tal como una secuencia polinucleotídica expuesta en la SEC ID Nº 1 ó 3, puede obtenerse un polinucleótido de la invención que codifica un polipéptido BASB027 usando procedimientos de clonación y detección convencionales, tales como los de clonar y secuenciar fragmentos de ADN cromosómico de bacterias usando células Catlin de Moraxella catarrhalis como material de partida, seguido por obtención de un clon de longitud completa. Por ejemplo, para obtener una secuencia polinucleotídica de la invención, tal como una secuencia polinucleotídica proporcionada en la SEC ID Nº 1 ó 3, típicamente una bilbioteca de clones de ADN cromosómico de Moraxella catarrhalis Catlin en E. coli o alguna otra célula hospedadora adecuada, se trata con una sonda de un oligonucleótido radiomarcado, preferiblemente con un oligonucleótido de 17 unidades o mayor, derivado de una secuencia parcial. Pueden distinguirse los clones que llevan ADN idéntico al de la sonda usando condiciones de hibridación rigurosas. Secuenciando los clones individuales identificados por lo tanto por hibridación con cebadores de secuenciación diseñados a partir de la secuencia del polipéptido o polinucleótido original, es posible extender después la secuencia polinucleotídica en ambas direcciones para determinar una secuencia del gen de longitud completa. De manera conveniente, tal secuenciación se realiza, por ejemplo, usando ADN de doble cadena desnaturalizado preparado a partir de un clon plasmídico. Se describen técnicas adecuadas en el documento de Maniatis, T., Fritsch, E.F. y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York (1989). (Véase en particular Screening By Hybridization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). Puede realizarse también secuenciación directa de ADN genómico para obtener una secuencia del gen de longitud completa. Ilustrativo de la invención, se descubrió cada polinucleótido expuesto en la SEC ID Nº 1 ó 3 en una biblioteca de ADN derivada de Moraxella catarrhalis.

Además, cada secuencia de ADN expuesta en la SEC ID Nº 1 ó 3 contiene una fase de lectura abierta que codifica una proteína que tiene aproximadamente el número de restos de aminoácidos expuesto en la SEC ID Nº 2 ó 4 con un peso molecular deducido que puede calcularse usando valores de peso molecular de los restos de aminoácidos bien conocidos por los especialistas en la técnica.

El polinucleótido de la SEC ID Nº 1, entre el codón de inicio en el nucleótido número 1 y el codón de parada que comienza en el nucleótido número 2440 de la SEC ID Nº 1, codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2. El polinucleótido de la SEC ID Nº 3, entre el codón de inicio en el nucleótido número 1 y el codón de parada que comienza en el nucleótido número 2440 de la SEC ID Nº 3, codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 4.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende o está constituido por:

(a)

una secuencia polinucleotídica que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 97-99% o identidad exacta con la SEC ID Nº 1 ó 3 durante la longitud entera de la SEC ID Nº 1 ó 3 respectivamente; o

(b)

una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad, preferiblemente al menos el 90% de identidad, más preferiblemente al menos el 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos el 97-99% ó 100% exacta con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 ó 4, durante la longitud entera de la SEC ID Nº 2 ó 4 respectivamente.

Puede obtenerse un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención, incluyendo homólogos y ortólogos de especies diferentes de Moraxella catarrhalis, por un procedimiento que comprende las etapas de detectar una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación rigurosas (por ejemplo, usando una temperatura en el intervalo de 45-65ºC y una concentración de SDS de 0,1-1%) con una sonda marcada o detectable constituida por o que comprende la secuencia de la SEC ID Nº 1 ó 3 o un fragmento de la misma; y aislar un gen de longitud completa y/o clones genómicos que contienen dicha secuencia polinucleotídica.

La invención proporciona una secuencia polinucleotídica idéntica durante su longitud completa a una secuencia codificante (fase de lectura abierta) en la SEC ID Nº 1 ó 3. También se proporciona por la invención una secuencia codificante para un polipéptido maduro o un fragmento del mismo, por sí misma así como una secuencia que codifica un polipéptido maduro o un fragmento en fase de lectura con otra secuencia codificante, tal como una secuencia que codifica una secuencia líder o secretora, una secuencia de pre- o pro- o prepro-proteína. El polinucleótido de la invención puede contener también al menos una secuencia no codificante, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitación, al menos una secuencia 5' y 3' no codificante, tal como las secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación (tales como las señales de terminación dependientes de rho e independientes de rho), sitios de unión a ribosomas, secuencias Kozak, secuencias que estabilizan el ARNm, intrones y señales de poliadenilación. La secuencia polinucleotídica puede comprender también secuencias codificantes adicionales que codifican aminoácidos adicionales. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia marcadora que facilite la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas realizaciones de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, como se proporciona en el vector pQE (Quiagen, Inc.) y se ha descrito en el documento Gentz y col., Proc. Natl. Acad Sci., USA 86: 821-824 (1989), o una señal de péptido HA (Wilson y col., Cell 37: 767 (1984), ambos de los cuales pueden ser útiles para purificar la secuencia de polipéptidos fusionada a ellos. Los polinucleótidos de la invención pueden incluir también, pero sin limitación, polinucleótidos que comprenden un gen estructural y sus secuencias asociadas de forma natural que controlan la expresión genética.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido BASB027 de la SEC ID Nº 2 ó 4 puede ser idéntica a la secuencia que codifica el polinucleótido contenido en los nucleótidos 1 a 2439 de la SEC ID Nº 1 ó 3, respectivamente. Como alternativa, puede ser una secuencia, que como resultado de la redundancia del código genético (degeneración), codifica también el polipéptido de la SEC ID Nº 2 ó 4.

La expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido", como se usa en este documento, abarca polinucleótidos que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, particularmente un polipéptido bacteriano y más particularmente un polipéptido de BASB027 de Moraxella catarrhalis que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 2 ó 4. La expresión abarca también polinucleótidos que incluyen una región continua sencilla o regiones discontinuas que codifican el polipéptido (por ejemplo, polinucleótidos interrumpidos por el fago integrado, una secuencia de inserción integrada, una secuencia de vector integrada, una secuencia de transposón integrada, o debidas al montaje del ARN o a la reorganización del ADN genómico) junto con regiones adicionales, que pueden contener también secuencias codificantes y/o no codificantes.

La invención se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos en este documento que codifican variantes de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos deducida de la SEC ID Nº 2 ó 4. Los fragmentos de polinucleótidos de la invención pueden usarse, por ejemplo, para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la invención.

Son realizaciones particularmente preferidas adicionales polinucleótidos que codifican variantes de BASB027, que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido BASB027 de la SEC ID Nº 2 ó 4 en la que se sustituyen modifican, se suprimen y/o se añaden varios, unos pocos, de 5 a 10, de 1 a 5, de 1 a 3, 2, 1 o ningún resto de aminoácido, en cualquier combinación. Son especialmente preferidas entre éstas las sustituciones, adiciones y supresiones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades del polipéptido BASB027.

Son realizaciones preferidas adicionales de la invención polinucleótidos que son al menos el 85% idénticos durante su longitud entera con un polinucleótido que codifica un polipéptido BASB027 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº 2 ó 4, y polinucleótidos que son complementarios con tales polinucleótidos. Como alternativa, los más preferidos son polinucleótidos que comprenden una región que es al menos el 90% idéntica durante su longitud entera a un polinucleótido que codifica un polipéptido BASB027 y polinucleótidos complementarios. En este aspecto, son particularmente preferidos los polinucleótidos que son al menos el 95% idénticos durante su longitud completa. Además, aquellos con al menos el 97% se prefieren altamente entre los que tienen al menos el 95%, y entre éstos se prefieren altamente los que son al menos el 98% y al menos el 99% idénticos, siendo los de al menos el 99% de identidad los más preferidos.

Son realizaciones preferidas polinucleótidos que codifican polipéptidos que mantienen sustancialmente la misma función biológica o actividad que el polipéptido maduro codificado por un ADN de SEC ID Nº 1 a 3.

De acuerdo con ciertas realizaciones preferidas de esta invención, se proporcionan polinucleótidos que hibridan, particularmente en condiciones rigurosas, con secuencias de polinucleótidos BASB027, tales como las de los polinucleótidos de la SEC ID Nº 1 ó 3.

La invención se refiere además a polinucleótidos que hibridan con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en este documento. En este aspecto, la invención se refiere especialmente a polinucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con los polinucleótidos descritos en este documento. Como se usa en este documento, las expresiones "condiciones rigurosas" y "condiciones de hibridación rigurosas" significan que ocurre hibridación sólo si hay al menos el 95% y preferiblemente al menos el 97% de identidad entre las secuencias. Un ejemplo específico de condiciones de hibridación rigurosas es incubación durante toda la noche a 42ºC en una solución que comprende: formamida al 50%, SSC 5x (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5x, sulfato de dextrano al 10% y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y roto, seguido por lavado del soporte de hibridación con SSC 0,1x a aproximadamente 65ºC. Las condiciones de hibridación y lavado se conocen bien y se ejemplifican en el documento de Sambrook, y col., Molecular cloning: A laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), en particular el capítulo 11. Puede usarse también la solución de hibridación con las secuencias de polinucleótidos proporcionadas por la invención.

La invención proporciona también un polinucleótido constituido por o que comprende una secuencia polinucleotídica obtenida por detección de una bilbioteca apropiada que contiene el gen completo para una secuencia polinucleotídica expuesta en la SEC ID Nº 1 ó 3 en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda que tiene la secuencia de dicha secuencia polinucleotídica expuesta en la SEC ID Nº 1 ó 3 o un fragmento de la misma, y por aislamiento de dicha secuencia polinucleotídica. Los fragmentos útiles para obtener tal polinucleótido incluyen, por ejemplo, sondas y cebadores descritos completamente en otra parte de este documento.

Como se ha analizado en otra parte de este documento con respecto a los ensayos de los polinucleótidos de la invención, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención pueden usarse como una sonda de hibridación para ARN, ADNc y ADN genómico para aislar ADNc de longitud completa y clones genómicos que codifican BASB027 y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes que tienen una identidad alta, particularmente identidad de secuencia alta, con el gen BASB027. Tales sondas comprenderán en general al menos 15 restos de nucleótidos o pares de bases. Preferiblemente, tales ondas tendrán al menos 30 restos de nucleótidos o pares de bases y pueden tener al menos 50 restos de nucleótidos o pares de bases. Las sondas particularmente preferidas tendrán al menos 20 restos de nucleótidos o pares de bases y tendrán menos de 30 restos de nucleótidos o pares de bases.

Puede aislarse por detección una región codificante de un gen BASB027 usando una secuencia de ADN proporcionada en la SEC ID Nº 1 ó 3 para sintetizar una sonda de oligonucleótidos. Después se usa un oligonucleótido marcado que tiene una secuencia complementaria a la del gen de la invención para detectar una biblioteca de ADNc, ADN genómico o ARNm para determinar con qué miembros de la biblioteca hibrida la sonda.

Existen varios procedimientos disponibles y bien conocidos por los especialistas en la técnica para obtener ADN de longitud completa, o para extender ADN cortos, por ejemplo los basados en el procedimiento de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, el documento de Frohman y col., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988). Modificaciones recientes de la técnica, ejemplificada por la tecnología Marathon^{TM} (Clontech Laboratories, Inc.) por ejemplo, han simplificado de manera significativa la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología Marathon^{TM}, se preparan ADNc a partir de ARNm extraído de un tejido elegido y una secuencia "adaptadora" ligada a cada extremo. Después se realiza la amplificación del ácido nucleico (PCR) para amplificar el extremo 5' "que falta" del ADN usando una combinación de oligonucleótidos cebadores específicos del gen y específicos del adaptador. Se repite después la reacción de PCR usando cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para hibridar dentro del producto amplificado (típicamente un cebador específico del adaptador que hibrida además en posición 3' en la secuencia del adaptador y un cebador específico del gen que hibrida además en posición 5' en la secuencia del gen seleccionado). Los productos de esta reacción pueden analizarse después por secuenciación de ADN y puede construirse un ADN de longitud completa uniendo el producto directamente al ADN existente para dar una secuencia completa, o realizando una PCR de longitud completa separada usando la nueva información de secuencia para el diseño del cebador 5'.

Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención pueden emplearse, por ejemplo, como reactivos y materiales de investigación para el descubrimiento de tratamientos y diagnósticos de enfermedades, particularmente enfermedades humanas, como se ha analizado además en este documento en relación a ensayos de polinucleótidos.

Los polinucleótidos de la invención que son oligonucleótidos derivados de una secuencia de la SEC ID Nº 1 ó 3 pueden usarse en los procedimientos de este documento como se ha descrito, pero preferiblemente por PCR, para determinar si los polinucleótidos identificados en este documento se transcriben o no en su totalidad o en parte en bacterias de tejidos infectados. Se reconoce que tales secuencias tendrán también utilidad en el diagnóstico del estado de infección y el tipo infección que ha alcanzado el patógeno.

La invención proporciona también polinucleótidos que codifican un polipéptido que es la proteína madura más aminoácidos amino o carboxi-terminales adicionales, o aminoácidos interiores del polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena polipeptídica, por ejemplo). Tales secuencias pueden jugar un papel en el procesamiento de una proteína a partir de un precursor hasta una forma madura, pueden permitir el transporte de la proteína, pueden alargar o acortar la semivida de la proteína y pueden facilitar la manipulación de una proteína para ensayo o producción, entre otras cosas. Como generalmente es el caso in vivo, pueden procesarse los aminoácidos adicionales lejos de la proteína madura con enzimas celulares.

Para todos y cada uno de los polinucleótidos de la invención, se proporciona un polinucleótido complementario a ellos. Se prefiere que estos polinucleótidos complementarios sean completamente complementarios a cada polinucleótido con el cual son complementarios.

Una proteína precursora, que tiene una forma madura del polipéptido fusionada con una o más prosecuencias, puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando se eliminan las prosecuencias, generalmente se activan tales precursores inactivos. Pueden eliminarse algunas o todas de las prosecuencias antes de la activación. En general, tales precursores se llaman proproteínas.

Además de las representaciones A, G, C, T/U convencionales de los nucleótidos, puede usarse también el término "N" para describir ciertos polinucleótidos de la invención. "N" significa que ninguno de los cuatro nucleótidos del ADN o del ARN puede aparecer en tal posición designada en la secuencia de ADN o ARN, excepto si se prefiere que N no sea un ácido nucleico que cuando se toma en combinación con posiciones de nucleótidos adyacentes, cuando se lee en la fase de lectura correcta, tiene el efecto de generar un codón de terminación prematuro en tal fase de
lectura.

En resumen, un polinucleótido de la invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia líder (que puede denominarse preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias que no son las secuencias líder de una preproteína, o una preproteína, que es un precursor de una proproteína, que tiene una secuencia líder y una o más prosecuencias, que se eliminan generalmente durante las etapas de procesamiento que producen formas activas y maduras del polipéptido.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de un polinucleótido de la invención para propósitos terapéuticos o profilácticos, en particular para inmunización genética.

El uso de un polinucleótido de la invención en inmunización genética empleará preferiblemente un procedimiento de liberación adecuado tal como inyección directa de ADN de plásmidos en músculos (Wolff y col., Hum Mol Genet (1992) 1:363, Manthorpe y col., Hum Gene Ther. (1983) 4: 419), liberación de ADN formando un complejo con vehículos de proteína específicos (Wu y col., J Biol Chem. (1989) 264: 16985), coprecipitación de ADN con fosfato cálcico (Benvenisty & Reshef. PNAS USA, (1986) 83: 9551), encapsulación de ADN en diversas formas de liposomas (Kaneda y col., Science (1989) 243: 375), bombardeo de partículas (Tang y col., Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun y col., DNA Cell Biol (1993) 12: 791) e infección in vivo usando vectores retrovirales clonados (Seeger y col., PNAS USA (1984) 81: 5849).

Vectores, células huésped, sistemas de expresión

La invención se refiere también a vectores que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la invención, a células hospedadoras que se modifican por ingeniería genética con vectores de la invención y a la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes. Pueden emplearse también sistemas de traducción sin de células para producir tales proteínas usando ARN derivado de las construcciones de ADN de la invención.

Los polipéptidos recombinantes de la presente invención pueden prepararse por procedimientos bien conocidos por los especialistas en la técnica a partir de células huésped modificadas por ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión. Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células huésped diseñadas genéticamente con tales sistemas de expresión, y a la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes.

Para la producción recombinante de los polipéptidos de la invención, las células hospedadoras pueden modificarse por ingeniería genética para incorporar sistemas de expresión o porciones de los mismos o polinucleótidos de la invención. Puede efectuarse la introducción de un polinucleótido en la célula hospedadora por procedimientos descritos en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis, y col., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) y Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), tal como transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga por raspado, introducción balística e infección.

Los ejemplos representativos de hospedadores apropiados incluyen células bacterianas, tales como células de estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, streptomyces, cianobacterias, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis y Moraxella catarrhalis; células fúngicas, tales como de una levadura, Kluveromyces, Saccharomyces, un basidiomiceto, Candida albicans y Aspergillus; células de insecto tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 y células de melanoma de Bowes; y células de plantas, tales como células de una gimnosperma o angiosperma.

Pueden usarse una gran variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos de la invención. Tales vectores incluyen, entre otros, vectores cromosómicos, episomales y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levaduras, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levaduras, de virus tales como baculovirus, papova virus, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la gripe aviar, virus de la pseudorrabia, picornavirus, retrovirus y alfavirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de plásmidos y elementos genéticos de bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Las construcciones del sistema de expresión pueden contener regiones de control que regulan así como suscitan la expresión. En general, puede usarse para la expresión en este aspecto cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un polipéptido en un huésped. Puede insertarse la secuencia de ADN apropiada dentro del sistema de expresión por cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas y de rutina, tales como, por ejemplo, las expuestas en el documento de Sambrook y col., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (supra).

En sistemas de expresión recombinante en eucariotas, para la secreción de una proteína traducida en el lumen del retículo endoplásmático al espacio periplásmico o al ambiente extracelular, pueden incorporarse señales de secreción apropiadas en el polipéptido expresado. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

Los polipéptidos de la presente invención pueden recuperarse y purificarse a partir de cultivos de células recombinantes por procedimientos bien conocidos incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. Lo más preferible es emplear para la purificación cromatografía de afinidad de metales iónicos (IMAC). Pueden emplearse técnicas bien conocidas de replegamiento de proteínas para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis intracelular, aislamiento y/o purificación.

El sistema de expresión puede ser también un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o una bacteria. El gen de interés puede insertarse en el genoma de un virus o bacteria recombinante viva. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo conducirán a la expresión in vivo del antígeno y a la inducción de respuestas inmunes. Los virus y bacterias usados para este propósitos son por ejemplo: poxvirus (por ejemplo; vaccinia, gripe aviar, gripe del canario), alfavirus (virus Sindbis, virus Semliki Forest, virus de la encefalitis equina venezolana), adenovirus, virus asociados con adeno, picornavirus (poliovirus, rhinovirus), herpesvirus (virus de la varicela zoster, etc), Listeria, Salmonella, Shigella, BCG. Estos virus y bacterias pueden ser virulentos o pueden haberse atenuado en diversas formas para obtener vacunas vivas. Tales vacunas vivas forman parte también de la invención.

Diagnóstico, pronóstico, serotipado y ensayos de mutación

Esta invención se refiere también al uso de polinucleótidos y polipéptidos BASB027 de la invención para su uso como reactivos de diagnóstico. La detección de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB027 en un eucariota, particularmente un mamífero, y especialmente un ser humano, proporcionará un procedimiento de diagnóstico para el diagnóstico de la enfermedad, la determinación de la fase de la enfermedad o la respuesta de un organismo infeccioso a los fármacos. Los eucariotas, particularmente mamíferos, y especialmente seres humanos, particularmente los infectados o sospechosos de estar infectados con un organismo que comprende el gen o proteína BASB027, pueden detectarse en el nivel de ácidos nucleicos o aminoácidos por una diversidad de técnicas bien conocidas así como por procedimientos proporcionados en este documento.

Pueden obtenerse polipéptidos y polinucleótidos para pronóstico, diagnóstico y otros análisis a partir de materiales corporales de individuos supuestamente infectados y/o infectados. Pueden usarse polinucleótidos de cualquiera de estas fuentes, particularmente ADN o ARN, directamente para la detección o pueden amplificarse enzimáticamente usando PCR o cualquier otra técnica de amplificación previa al análisis. El ARN, particularmente ARNm, ADNc y ADN genómico, pueden usarse también de las mismas formas. El uso de amplificación, caracterización de especies y cepas de organismos infecciosos o residentes presentes en un individuo, puede hacerse por un análisis del genotipo de un polinucleótido seleccionado del organismo. Pueden detectarse deleciones e inserciones por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con un genotipo de una secuencia de referencia seleccionada de un organismo relacionado, preferiblemente una especie diferente del mismo género o una cepa diferente de la misma especie. Pueden identificarse mutaciones puntuales hibridando ADN amplificado con secuencias de polinucleótidos BASB027 marcadas. Pueden distinguirse secuencias apareadas de manera perfecta o significativa a partir de duplex desapareados de manera imperfecta o más significativa por digestión con ADNasas o ARNasas, para ADN o ARN respectivamente detectando diferencias en las temperaturas de fusión o en las cinéticas de renaturalización. Pueden detectarse también diferencias en la secuencia polinucleotídica por alteraciones en la movilidad electroforética de fragmentos de polinucleótidos en geles comparado con una secuencia de referencia. Esto puede realizarse con o sin agentes desnaturalizantes. Pueden detectarse también diferencias en los polinucleótidos por secuenciación directa del ADN o ARN. Véase, por ejemplo, el documento de Myers y col., Science, 230: 1242 (1985).

Pueden revelarse también cambios en la secuencia en localizaciones específicas por ensayos de protección de nucleasas, tales como ensayo de protección de ARNasa V 1 y S I o un procedimiento de escisión químico. Véase, por ejemplo, el documento de Cotton y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397-4401 (1985).

En otra realización, puede construirse una serie de sondas de oligonucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos BASB027 o fragmentos de los mismos para realizar la detección eficiente de, por ejemplo, mutaciones genéticas, serotipos, clasificación taxonómica o identificación. Los procedimientos de tecnología en serie se conocen bien y tienen aplicabilidad general y pueden usarse para tratar una diversidad de cuestiones en genética molecular incluyendo expresión genética, conexión genética y variabilidad genética (véase, por ejemplo, el documento de Chee y col., Science, 274: 610 (1996)).

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:

(a)

un polinucleótido de la presente invención, preferiblemente la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 ó 3, o un fragmento de la misma;

(b)

una secuencia de nucleótidos complementaria a la de (a);

(c)

un polipéptido de la presente invención, preferiblemente el polipéptido de la SEC ID Nº 2 ó 4 o un fragmento del mismo; o

(d)

un anticuerpo de un polipéptido de la presente invención, preferiblemente del polipéptido de la SEC ID Nº 2 ó 4.

Se apreciará que en cualquiera de tales kits, (a), (b), (c) o (d) pueden comprender un componente sustancial. Tales kits serán de uso para diagnosticar una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad, entre otros.

Esta invención se refiere también al uso de polinucleótidos de la presente invención como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada de un polinucleótido de la invención, preferiblemente de la SEC ID Nº 1 ó 3, que está asociado con una enfermedad o patogenicidad, proporcionará una herramienta de diagnóstico que puede añadir, o definir, un diagnóstico de una enfermedad, un pronóstico del curso de una enfermedad, una determinación de una fase de la enfermedad, o una susceptibilidad a una enfermedad, que resulta de la expresión inferior, sobreexpresión o expresión alterada del polinucleótido. Pueden detectarse organismos, particularmente organismos infecciosos, que portan mutaciones en tales polinucleótidos, al nivel polinucleotídico por una diversidad de técnicas, tales como las descritas en otra parte de este documento.

Pueden detectarse también células de un organismo que portan mutaciones o polimorfismos (variaciones alélicas) en un polinucleótido y/o polipéptido de la invención al nivel de polinucleótidos o polipéptidos por una diversidad de técnicas, por ejemplo, que permiten el serotipado. Por ejemplo, puede usarse RT-PCR para detectar mutaciones en el ARN. Se prefiere particularmente el uso de RT-PCR en conjunción con sistemas de detección automatizados, tales como, por ejemplo, GeneScan. Puede usarse también ARN, ADNc o ADN genómico para el mismo propósito, PCR. Como ejemplo, pueden usarse cebadores de PCR complementarios a un polinucleótido que codifica un polipéptido BASB027 para identificar y analizar mutaciones.

La invención proporciona además cebadores con 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o 3'.

Estos cebadores pueden usarse para, entre otras cosas, amplificar ADN y/o ARN de BASB027 aislado a partir de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal. Los cebadores pueden usarse para amplificar un polinucleótido aislado de un individuo infectado, de forma que el polinucleótido puede someterse después a diversas técnicas para esclarecer la secuencia del polinucleótido. De esta manera, pueden detectarse mutaciones en la secuencia del polinucleótido y usarse para diagnosticar y/o pronosticar la infección o su fase o curso, o para serotipar y/o clasificar el agente infeccioso.

La invención proporciona además un procedimiento para diagnosticar una enfermedad, preferiblemente infecciones bacterianas, más preferiblemente infecciones causadas por Moraxella catarrhalis, que comprende determinar a partir de una muestra derivada de un individuo, tal como un material corporal, un nivel aumentado de expresión de un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEC ID Nº 1 ó 3. Puede medirse la expresión aumentada o disminuida de un polinucleótido BASB027 usando uno cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica para cuantificar polinucleótidos, tale como, por ejemplo, amplificación, PCR, RT-PCR, protección de ARNasa, transferencia Northern, espectrometría y otros procedimientos de hibridación.

Además, puede usarse un ensayo de diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar la sobre-expresión de un polipéptido BASB027 comparado con muestras de tejido de control normales para detectar la presencia de una infección, por ejemplo. Las técnicas de ensayo que pueden usarse para determinar los niveles de un polipéptido BASB027, en una muestra derivada de un hospedador, tal como un material corporal, son bien conocidas por los especialistas en la técnica. Tales procedimientos de ensayo incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia de Western, ensayos de sándwich de anticuerpos, detección de anticuerpos y ensayos ELISA.

Los polinucleótidos de la invención pueden usarse como componentes de series de polinucleótidos, preferiblemente series de alta densidad o redes. Estas series de alta densidad son particularmente útiles para propósitos de diagnóstico y pronóstico. Por ejemplo, puede usarse un conjunto de puntos que comprenden cada uno un gen diferente, y que comprenden además un polinucleótido o polinucleótidos de la invención para investigar, tal como por medio del uso de hibridación o amplificación de ácidos nucleicos, usando sondas obtenidas o derivadas de una muestra corporal, para determinar la presencia de una secuencia de polinucleótido particular o una secuencia relacionada en un individuo. Tal presencia puede indicar la presencia de un patógeno, particularmente Moraxella catarrhalis, y puede ser útil para diagnosticar y/o pronosticar una enfermedad o el curso de una enfermedad. Se prefiere una red que comprende una diversidad de variantes de la secuencia polinucleotídica de la SEC ID Nº 1 ó 3. Se prefiere también una red que comprende una diversidad de variantes de una secuencia de polinucleótido que codifica la secuencia del polipéptido de la SEC ID Nº 2 ó 4.

Anticuerpos

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención y variantes de los mismos, o células que expresan los mismos pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos de tales polipéptidos o polinucleótidos respectivamente.

En ciertas realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan anticuerpos contra polipéptidos o polinucleótidos BASB027.

Pueden obtenerse anticuerpos generados contra los polipéptidos o polinucleótidos de la invención administrando los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención, o fragmentos que soportan epítopes o ambos, análogos de cualquiera o ambos, o células que expresan cualquiera o ambos, a un animal, preferiblemente no humano, usando protocolos de rutina. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica conocida en la técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen diversas técnicas, tales como las de los documentos de Kohler, G. y Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor y col., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole y col., pg. 77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc (1985).

Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena única (Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos de cadena única de polipéptidos o polinucleótidos de esta invención. También, pueden usarse ratones transgénicos, u otros organismos o animales, tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados inmunoespecíficos de los polipéptidos o polinucleótidos de la invención.

Como alternativa, puede utilizarse la tecnología de presentación de fagos para seleccionar genes de anticuerpos con actividades de unión a polipéptidos de la invención a partir de repertorios de genes v amplificados por PCR o linfocitos de seres humanos en los que se ha detectado que poseen anti-BASB027 o a partir de bilbiotecas sin tratamiento previo (McCafferty, y col., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, y col., (1992) Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos puede mejorarse también, por ejemplo, redistribuyendo las cadenas (Clackson y col., (1991) Nature 352: 628).

Los anticuerpos descritos anteriormente pueden emplearse para aislar o identificar clones que expresan los polipéptidos o polinucleótidos de la invención para purificar los polipéptidos o polinucleótidos, por ejemplo, por cromatografía de afinidad.

Por lo tanto, entre otros, pueden emplearse anticuerpos contra polipéptidos BASB027 o polinucleótidos BASB027 para tratar infecciones, particularmente infecciones bacterianas.

Las variantes del polipéptido incluyen variantes antigénica, epitópica o inmunológicamente equivalentes de un aspecto particular de esta invención.

Preferiblemente, el anticuerpo o variante del mismo se modifica para hacerlo menos inmunogénico en el individuo. Por ejemplo, si el individuo es un ser humano, el anticuerpo puede estar preferiblemente "humanizado", en el que la región o regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo derivado del hibridoma se han transplantado a un anticuerpo monoclonal humano, por ejemplo como se ha descrito en el documento de Jones y col., (1986), Nature 321, 522-525 o en el documento de Tempest y col., (1991) Biotechnology 9, 266-273.

Antagonistas y agonistas - Ensayos y moléculas

Pueden usarse también los polipéptidos y polinucleótidos de la invención para valorar la unión de pequeñas moléculas de sustratos y ligandos en, por ejemplo, células, preparaciones sin células, bibliotecas químicas, y mezclas de productos naturales. Estos sustratos y ligandos pueden ser sustratos y ligandos naturales o pueden ser miméticos estructurales o funcionales. Véase, por ejemplo, el documento de Coligan y col., Current Protocols in Immunology 1 (2): Capítulo 5 (1991).

Los procedimientos de detección pueden medir simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido o polinucleótido, o a células o membranas que soportan el polipéptido o polinucleótido, o una proteína de fusión del polipéptido por medio de una señal directa o indirectamente asociada con el compuesto candidato. Como alternativa, el procedimiento de detección puede implicar competición con un competidor marcado. Además, estos procedimientos de detección pueden analizar si el compuesto candidato produce una señal generada por activación o inhibición del polipéptido o polinucleótido, usando sistemas de detección apropiados para las células que comprenden el polipéptido o polinucleótido. Se ensayan generalmente inhibidores de la activación en presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación del agonista en presencia del compuesto candidato. Pueden emplearse polipéptidos activos de manera constitutiva y/o polipéptidos y polinucleótidos expresados de manera constitutiva en procedimientos de detección de agonistas inversos o inhibidores, en ausencia de un agonista o inhibidor, ensayando si el compuesto candidato produce inhibición de la activación del polipéptido o polinucleótido, como puede ser el caso. Además, los procedimientos de detección pueden comprender simplemente las etapas de mezclar un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido o polinucleótido de la presente invención, para formar una mezcla, medir la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB027 en la mezcla, y comparar la actividad del polipéptido y/o polinucleótido BASB027 de la mezcla con un patrón. Las proteínas de fusión, tales como las producidas a partir de la porción Fc y de un polipéptido BASB027, como se ha descrito anteriormente en este documento, pueden usarse también en ensayos de detección de alta capacidad para identificar antagonistas del polipéptido de la presente invención, así como de polipéptidos filogenéticamente y/o funcionalmente relacionados (Véase el documento de D. Bennett y col., J
Mol Recognition, 8:52-58 (1995); y el documento de K. Johanson y col., J. Biol Chem, 270 (16): 9459-9471 (1995)).

Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen y/o interactúan con un polipéptido de la presente invención pueden usarse también para configurar procedimientos de detección para detectar el efecto de compuestos añadidos sobre la producción de ARNm y/o polipéptidos en las células. Por ejemplo, puede construirse un ensayo ELISA para medir niveles de polipéptido asociados a células o secretados usando anticuerpos monoclonales y policlonales por procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Esto puede usarse para descubrir agentes que puedan inhibir o potenciar la producción de polipéptido (también llamado antagonista o agonista, respectivamente) a partir de células o tejidos adecuadamente manipulados.

La invención proporciona también un procedimiento de detección de compuestos para identificar aquellos que potencien (agonistas) o bloqueen (antagonistas) la acción de los polipéptidos o polinucleótidos BASB027, particularmente aquellos compuestos que sean bacteriostáticos y/o bactericidas. El procedimiento de detección puede implicar técnicas de alta capacidad. Por ejemplo, para detectar agonistas o antagonistas, se incuba una mezcla de reacción sintética, un compartimiento celular, tal como una membrana, una envuelta celular o una pared celular, o una preparación de cualquiera de los mismos, que comprende un polipéptido BASB027 y un sustrato o ligando marcado de tal polipéptido en ausencia o presencia de una molécula candidata que puede ser un agonista o antagonista de BASB027. La capacidad de la molécula candidata de agonizar o antagonizar el polipéptido BASB027 se refleja en la unión disminuida del ligando marcado o la producción disminuida del producto de tal sustrato. Las moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos del polipéptido BASB027, es más probable que sean buenos antagonistas. Las moléculas que se unen bien, como puede ser el caso, aumentan la tasa de producción del producto a partir del sustrato, aumentando la transducción de señales, o aumentan la actividad química de los canales, son agonistas. La detección de la tasa o nivel de producción, como puede ser el caso, del producto a partir del sustrato, transducción de señales o la actividad química de los canales puede potenciarse usando un sistema informador. Los sistemas informadores que pueden ser útiles en este aspecto incluyen pero sin limitación, sustrato colorimétrico y marcado convertido en el producto, un gen informador que es responsable de los cambios en la actividad del polinucleótido o polipéptido BASB027, y ensayos de unión conocidos en la técnica.

Otro ejemplo de un ensayo para agonistas de BASB027 es un ensayo competitivo que combina BASB027 y un agonista potencial con moléculas de unión a BASB027, moléculas de unión a BASBE027 recombinantes, sustratos naturales o ligandos, o miméticos de sustratos o ligandos, en condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitiva. BASB027 puede estar marcado, tal como por radiactividad o un compuesto colorimétrico, de forma que el número de moléculas de BASB027 unidas a la molécula de unión o convertidas en producto pueda determinarse de forma precisa para valorar la eficacia del agonista potencial.

Los antagonistas potenciales incluyen, entre otros, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polinucleótido y/o polipéptido de la invención y que inhiben por lo tanto o suprimen su actividad o expresión. Los antagonistas potenciales pueden ser también moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína estrechamente relacionada o anticuerpo que se una a los mismos sitios en una molécula de unión, tal como una molécula de unión, sin inducir actividades inducidas por BASB027, impidiendo de este modo la acción o expresión de polipéptidos y/o polinucleótidos BASB027 excluyendo a los polipéptidos y/o polinucleótidos BASB027 de la unión.

Los antagonistas potenciales incluyen una molécula pequeña que se une y ocupa el sitio de unión del polipéptido previniendo de ese modo la unión a moléculas de unión celular, de forma que se impide la actividad biológica normal. Los ejemplos de moléculas pequeñas incluyen pero sin limitación moléculas orgánicas pequeñas, péptidos o moléculas similares a péptidos. Otros agonistas potenciales incluyen moléculas antisentido (véase el documento de Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSIÓN, CRC Press, Boca Raton, FL (1988), para una descripción de estas moléculas). Los antagonistas potenciales preferidos incluyen compuestos relacionados y variantes de BASB027.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a proteínas de fusión solubles modificadas por ingeniería genética que comprenden un polipéptido de la presente invención, o un fragmento del mismo, y diversas porciones de las regiones constantes de las cadenas pesadas o ligeras de inmunoglobulinas de diversas subclases (IgG, IgM, IgA, IgE). Se prefiere como inmunoglobulina la parte constante de la cadena pesada de IgG humana, particularmente IgGI, en la que la fusión ocurre en la región de bisagra. En una realización particular, la parte Fc puede eliminarse simplemente por incorporación de una secuencia de escisión que puede escindirse con el factor coagulante de la sangre Xa. Además, esta invención se refiere a procedimientos para la preparación de estas proteínas de fusión por ingeniería genética, y al uso de las mismas para detectar fármacos, diagnóstico y terapia. Un aspecto adicional de la invención se refiere también a polinucleótidos que codifican tales proteínas de fusión. Pueden encontrarse ejemplos de tecnología de proteínas de fusión en las Solicitudes de Patente Internacional Nº WO94/29458 y WO94/22914.

Cada secuencia polinucleotídica proporcionada en este documento puede usarse en el descubrimiento y desarrollo de compuestos antibacterianos. La proteína codificada, tras la expresión, puede usarse como una diana para la detección de fármacos antibacterianos. Adicionalmente, pueden usarse las secuencias de polinucleótidos que codifican las regiones amino terminales de la proteína codificada o Shine-Delgarno u otras secuencias que facilitan la traducción del ARNm respectivo para construir secuencias antisentido que controlen la expresión de la secuencia codificante de interés.

La invención proporciona también el uso del polipéptido o polinucleótido de la invención para interferir con la interacción física inicial entre un patógeno o patógenos y un hospedador eucariótico, preferiblemente un mamífero, responsable de las secuelas de la infección. En particular, las moléculas de la invención pueden usarse: en la prevención de la adhesión de bacterias, en particular bacterias gram positivas y/o gram negativas, a proteínas de la matriz extracelular eucariótica, preferiblemente de mamíferos sobre dispositivos intravasculares o a proteínas de la matriz extracelular en heridas; para bloquear la adhesión bacteriana entre proteínas de la matriz extraceluar eucariótica, preferiblemente de mamíferos y proteínas BASB027 bacterianas que median el daño en el tejido y/o para bloquear la progresión normal de la patogénesis en infecciones iniciadas de forma diferente que por implantación de dispositivos intravasculares o por otras técnicas quirúrgicas.

Los agonistas y antagonistas de BASB027 obtenidos usando el polipéptido o polinucleótido de la presente invención son preferiblemente agonistas y antagonistas bacteriostáticos o bactericidas.

Los antagonistas y agonistas obtenidos usando el polipéptido o polinucleótido de la presente invención pueden emplearse, por ejemplo, para prevenir, inhibir y/o tratar enfermedades.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a mimótopos del polipéptido de la invención. Un mimótopo es una secuencia de péptidos, suficientemente similar a la proteína nativa (secuencialmente o estructuralmente), que puede ser reconocida por anticuerpos que reconocen el péptido nativo; o es capaz de inducir anticuerpos que reconocen el péptido nativo cuando se acopla a un soporte adecuado.

Pueden diseñarse mimótopos del péptido para un propósito particular por adición, supresión o sustitución de aminoácidos elegidos. Por lo tanto, los péptidos pueden modificarse para el propósito de facilitar la conjugación con una proteína de soporte. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos procedimientos de conjugación química incluir una cisteína terminal. Además puede ser deseable para péptidos conjugados a una proteína vehículo incluir un extremo hidrófobo distal del extremo conjugado del péptido, de forma que el extremo no conjugado libre del péptido se mantenga asociado con la superficie de la proteína de soporte. De ese modo se presenta el péptido en una conformación que se parece lo más estrechamente posible a la del péptido como se encuentra en el contexto de la molécula nativa completa. Por ejemplo, los péptidos pueden alterarse para que tengan una cisteína N-terminal y una cola amidada hidrofóbica C-terminal. Como alternativa, puede realizarse la adición o sustitución de una forma de D-esteroisómero de uno o más de los aminoácidos para crear un derivado beneficioso, por ejemplo para potenciar la estabilidad del péptido.

Como alternativa, pueden identificarse mimótopos del péptido usando anticuerpos que son capaces por sí mismos de unirse a los polipéptidos de la presente invención usando técnicas tales como tecnología de presentación de fagos (documento EP 0 552 267 B1). Esta técnica genera un gran número de secuencias peptídicas que imitan la estructura de los péptidos nativos y son, por lo tanto, capaces de unirse a anticuerpos del péptido anti-nativos, pero no necesariamente comparten por sí mismos homología de secuencia significativa con el polipéptido nativo.

Vacunas

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un individuo, particularmente un mamífero, preferiblemente seres humanos, que comprende inocular al individuo un polinucleótido y/o polipéptido BASB027, o un fragmento o variante de los mismos, adecuados para producir respuesta inmune de células T y/o anticuerpos que protejan a dicho individuo de la infección, particularmente infección bacteriana y más particularmente infección por Moraxella catarrhalis. Se proporcionan también procedimientos por los cuales tales respuestas inmunológicas retrasan la replicación bacteriana. Otro aspecto más de la invención se refiere a un procedimiento para inducir respuesta inmunológica en un individuo que comprende administrar a tal individuo un vector de ácidos nucleicos, secuencia o ribozima que dirijan la expresión de polinucleótidos y/o polipéptidos BASB027, o un fragmento o variante de los mismos, para expresar polinucleótidos y/o polipéptidos BASB027, o un fragmento o variante de los mismos in vivo que induzcan una respuesta inmunológica, tal como que produzcan anticuerpos y/o respuesta inmune de células T, incluyendo, por ejemplo, células T productoras de citoquinas o células T citotóxicas, para proteger a dicho individuo, preferiblemente un ser humano, de una enfermedad, si esa enfermedad se ha establecido ya o no dentro del individuo. Un ejemplo de administración del gen es activándolo dentro de las células deseadas como un revestimiento sobre partículas o de otra forma. Tal vector de ácidos nucleicos puede comprender ADN, ARN, una ribozima, un ácido nucleico modificado, un híbrido ADN/ARN, un complejo ADN-proteína o un complejo ARN-proteína.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición inmunológica que cuando se introduce en un individuo, preferiblemente un ser humano, en el que puede inducirse una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en tal individuo a un polinucleótido y/o polipéptido BASB027 codificado a partir del mismo, donde la composición comprende un polinucleótido y/o polipéptido BASB027 recombinante codificado a partir del mismo y/o comprende ADN y/o ARN que codifica y expresa un antígeno de dicho polinucleótido BASB027, un polipéptido codificado a partir del mismo u otro polipéptido de la invención. La respuesta inmunológica puede usarse terapéutica o profilácticamente y puede tomar la forma de inmunidad de anticuerpos y/o inmunidad celular, tal como inmunidad celular que surge de células CTL o T CD4+.

Un polipéptido BASB027 o un fragmento del mismo puede fusionarse con una co-proteína o resto químico que puede o no producir por sí mismo anticuerpos, pero que es capaz de estabilizar la primera proteína y producir una proteína fusionada o modificada que tendrá propiedades antigénicas y/o inmunogénicas, y preferiblemente propiedades protectoras. Por lo tanto, la proteína recombinante fusionada comprende preferiblemente además una co-proteína antigénica, tal como la lipoproteína D de Haemophilus influenzae, Glutatión-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, o cualquier otra co-proteína relativamente grande que solubiliza la proteína y facilita la producción y purificación de la misma. Además, la co-proteína puede actuar como un adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmune del organismo que recibe la proteína. La co-proteína puede estar unida a los extremos amino o carboxilo de la primera proteína.

Se proporcionan por esta invención composiciones, particularmente composiciones de vacunas, y procedimientos que comprenden los polipéptidos y/o polinucleótidos de la invención y secuencias de ADN inmunoestimuladoras, tales como las descritas en el documento de Sato, Y y col., Science 273: 352 (1996).

También, se proporcionan por esta invención procedimientos que usan los polinucleótidos descritos o fragmentos particulares de los mismos, que han mostrado que codifican regiones no variables de proteínas de la superficie celular bacteriana, en construcciones de polinucleótidos usados en tales experimentos de inmunización genética en modelos de infección animales con Moraxella catarrhalis. Tales experimentos serán particularmente útiles para identificar epítopes de proteínas capaces de provocar una respuesta inmune profiláctica o terapéutica. Se cree que esta aproximación permitirá la preparación posterior de anticuerpos monoclonales de valor particular, derivados del órgano requerido del animal que resiste exitosamente o elimina la infección, para el desarrollo de agentes profilácticos o tratamientos terapéuticos de infecciones bacterianas, particularmente infecciones de Moraxella catarrhalis, en mamíferos, particularmente seres humanos.

La invención incluye también una formulación de vacuna que comprende un polipéptido y/o polinucleótido recombinante inmunogénico de la invención junto con un vehículo adecuado, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ya que los polipéptidos y polinucleótidos pueden descomponerse en el estómago, cada uno se administra preferiblemente de manera parenteral, incluyendo, por ejemplo, administración subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmical. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener anti-oxidantes, tampones, compuestos bacteriostáticos y solutos que vuelven la solución isotónica con el fluido corporal, preferiblemente la sangre del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitarias o multi-dosis, por ejemplo, ampollas selladas y viales y pueden almacenarse en condiciones de liofilización que requieren sólo la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su uso.

La formulación de vacuna de la invención puede incluir también sistemas adyuvantes para potenciar la inmunogenicidad de la formulación. Preferiblemente, el sistema adyuvante provoca una respuesta de tipo TH1.

Puede distinguirse ampliamente una respuesta inmune dentro de dos categorías extremas, que son respuestas humorales o mediadas por células (caracterizadas tradicionalmente por mecanismos efectores de protección de anticuerpos y celulares respectivamente). Estas categorías de respuestas se han designado como respuestas tipo TH1 (respuesta mediada por células) y respuestas inmunes tipo TH2 (respuesta humoral).

Las respuestas inmunes tipo TH1 extremas pueden caracterizarse por la generación de respuestas de linfocitos T citotóxicos de haplotipo restringido, con especificidad de antígeno y de células asesinas naturales. Las respuestas tipo TH1 en ratón se caracterizan a menudo por la generación de anticuerpos del subtipo IgG2a, mientras que en el ser humano éstas corresponden a anticuerpos del tipo IgG1. Las respuestas inmunes tipo TH2 se caracterizan por la generación de un intervalo amplio de isotipos de inmunoglobulinas que incluyen en el ratón IgGI, IgA e IgM.

Se puede considerar que la fuerza conductora detrás del desarrollo de estos dos tipos de respuestas inmunes son las citoquinas. Niveles altos de citoquinas tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes al antígeno dado mediadas por células, mientras que niveles altos de citoquinas tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales al antígeno.

La distinción de respuestas inmunes tipo TH1 y TH2 no es absoluta. En la realidad, un individuo soportará una respuesta inmune que se describe como predominantemente TH1 o predominantemente TH2. Sin embargo, es a menudo conveniente considerar las familias de citoquinas en términos de lo descrito en clones de células T CD4 +ve de ratón por Mosmann y Coffman (Mosmann, T.R. y Coffman, R.L. (1989) TH1 y TH2 cells: different patterns of limphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Inmmunology, 7, p145-173) Tradicionalmente, las respuestas tipo TH1 se asocian con la producción de las citoquinas INF-\gamma e IL-2 por linfocitos T. Otras citoquinas asociadas a menudo directamente con la inducción de respuestas inmunes tipo TH1 no se producen por células T, tales como IL-12. Por el contrario, las respuestas tipo TH2 se asocian con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13.

Se sabe que ciertos adyuvantes de vacunas son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de citoquinas tipo TH1 o TH2. Tradicionalmente, los mejores indicadores del equilibrio TH1:TH2 de la respuesta inmune después de una vacunación o infección incluyen la medida directa de la producción de citoquinas TH1 o TH2 por linfocitos T in vitro después de re-estimulación con antígeno, y/o la medida de la proporción IgG1:IgG2a de respuestas de antícuerpos específicos de antígenos.

Por lo tanto, un adyuvante tipo TH1 es uno que preferentemente estimula poblaciones de células T aisladas para producir niveles altos de citoquinas tipo TH1 cuando se re-estimulan con un antígeno in vitro, y promueve el desarrollo tanto de linfocitos T citotóxicos CD8+ como de respuestas de inmunoglobulinas específicas de antígenos asociadas con isotipo tipo TH1.

En las Solicitudes de Patente Internacional Nº WO 94/00153 y WO 95/17209 se describen los adyuvantes que son capaces de estimular preferentemente la respuesta celular TH1.

El monofosforil lípido A 3 de-O-acilado (3D-MPL) es uno de tales adyuvantes. Éste se conoce por el documento GB 2220211 (Ribi). Químicamente, es una mezcla de monofosforil lípido A 3 de-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas y lo fabrica Ribi Immunochem, Montana. En la Patente Europea 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA) se describe una forma preferida del monofosforil lípido A 3 de-O-acilado.

Preferiblemente, las partículas de 3D-MPL son suficientemente pequeñas para esterilizarse por filtración a través de una membrana de 0,22 micrómetros (Patente Europea Nº 0 689 454). 3D-MPL estará presente en el intervalo de 10 \mug- 100 \mug, preferiblemente 25-50 \mug por dosis en la que el antígeno estará presente típicamente en un intervalo de 2-50 \mug por dosis.

Otro adyuvante preferido comprende QS21, una fracción no tóxica purificada por HPLC derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente, ésta puede mezclarse con monofosforil lípido A 3 de-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un vehículo.

El procedimiento de producción de QS21 se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.057.540.

Las formulaciones de adyuvantes no reactogénicos que contienen QS21 se han descrito previamente (documento WO 96/33739). Tales formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han mostrado que son adyuvantes que estimulan a TH1 con éxito cuando se formulan junto con un antígeno.

Los adyuvantes adicionales que son estimuladores preferentes de la respuesta celular de TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo secuencias CpG no metiladas, como se describen en el documento WO 96/02555.

También se contemplan combinaciones de diferentes adyuvantes que estimulan a TH1, tales como las mencionadas en este documento anteriormente, se contemplan también para proporcionar un adyuvante que es un estimulador preferente de la respuesta celular TH1. Por ejemplo, QS21 puede formularse junto con 3D-MPL. La proporción de QS21:3D-MPL estará típicamente en el orden de 1:10 a 10:1, preferiblemente de 1:5 a 5:1 y a menudo sustancialmente 1:1. El intervalo preferido para una sinergia óptima es 2,5:1 a 1:1 de 3D-MPL:QS21.

Preferiblemente está también presente un vehículo en la composición de vacuna de acuerdo con la invención. El vehículo puede ser una emulsión de aceite en agua, o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio.

Una emulsión de aceite en agua preferida comprende un aceite mebolizable, tal como esqualeno, alfa tocoferol y Tween 80. En un aspecto particularmente preferido se combinan en tal emulsión los antígenos en la composición de vacuna de acuerdo con la invención con QS21 y 3D-MPL. Adicionalmente, la emulsión de aceite en agua puede contener span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.

Típicamente para administración a seres humanos, estarán presentes QS21 y 3D-MPL en una vacuna en el intervalo de 1 \mug-200 \mug, tal como 10-100 \mug, preferiblemente 10 \mug-50 \mug por dosis. Típicamente, el aceite en agua comprenderá del 2 al 10% de esqualeno, del 2 al 10% de alfa tocoferol y del 0,3 al 3% de tween 80. Preferiblemente la proporción esqualeno:alfa tocoferol es igual o menor de 1 ya que esto proporciona una emulsión más estable. Puede estar presente también span 85 a un nivel del 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además un estabilizador.

Las emulsiones de aceite en agua no tóxicas contienen preferiblemente un aceite no tóxico, por ejemplo esqualano o esqualeno, un emulsionante, por ejemplo, Tween 80, en un vehículo acuoso. El vehículo acuoso puede ser, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato.

En el documento WO 95/17210 se describe una formulación de adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua.

La presente invención proporciona también una composición de vacuna polivalente que comprende una formulación de vacuna de la invención en combinación con otros antígenos, en particular de antígenos útiles para el tratamiento de cánceres, enfermedades autoinmunes y afecciones relacionadas. Tal composición de vacuna polivalente puede incluir un adyuvante que induce a TH1 como se ha descrito anteriormente en este documento.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a ciertos polipéptidos y polinucleótidos BASB027, se entiende que esto cubre fragmentos de los polipéptidos y nucleótidos que se encuentran de forma natural y polipéptidos y polinucleótidos similares con adiciones, supresiones o sustituciones que no afectan sustancialmente a las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos o polinucleótidos recombinantes.

Composiciones, kits y administración

En un aspecto adicional de la invención se proporcionan composiciones que comprenden un polinucleótido
BASB027 y/o un polipéptido BASB027 para administrar a una célula o a un organismo multicelular.

La invención se refiere también a composiciones que comprenden un polinucleótido y/o un polipéptido analizado en este documento o sus agonistas o antagonistas. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden emplearse en combinación con un vehículo o vehículos no estériles o estériles para su uso con células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para administrarse a un individuo. Tales composiciones comprenden, por ejemplo, un aditivo de medio o una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos incluyen, sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe adecuarse al modo de administración. La invención se refiere además a paquetes y kits de diagnóstico y farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes cargados con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionados anteriormente.

Pueden emplearse polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la invención solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de cualquier manera eficaz y conveniente, incluyendo por ejemplo administración por vía tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica entre otras.

En terapia o como profiláctico, el agente activo puede administrarse a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo como una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido y/o polinucleótido, tal como la forma soluble de un polipéptido y/o polinucleótido de la presente invención, un péptido agonista o antagonista o un compuesto de molécula pequeña, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos incluyen, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La invención se refiere además a paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes cargados con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención mencionadas anteriormente.

Pueden emplearse polipéptidos, polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

La composición se adaptará a la vía de administración, por ejemplo por una vía sistémica u oral. Las formas preferidas de administración sistémica incluyen inyección, típicamente inyección intravenosa. Pueden usarse otras vías de inyección, tales como subcutánea, intramuscular o intraperitoneal. Los medios alternativos de administración sistémica incluyen administración transmucosa y transdérmica usando penetrantes tales como sales biliares o ácidos fusídicos y otros detergentes. Además, si un polipéptido y otros compuestos de la presente invención pueden formularse en una formulación entérica o encapsulada, también puede ser posible la administración oral. La administración de estos compuestos puede ser también tópica y/o localizada, en forma de pomadas, pastas, geles, soluciones, polvos y similares.

Para administrarse a mamíferos, y particularmente seres humanos, se espera que el nivel de dosis diaria del agente activo sea de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, típicamente aproximadamente 1 mg/kg. El médico determinará en cualquier caso la dosis real que será la más adecuada para un individuo y variará con la edad, peso y respuesta del individuo particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplares del caso medio. Puede haber, por supuesto, casos individuales en los que se necesiten intervalos de dosificación superiores o inferiores, y están dentro del alcance de esta
invención.

El intervalo de dosificación requerido depende de la elección del péptido, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la afección del sujeto y el juicio del médico que atiende. Las dosificaciones adecuadas, sin embargo, están en el intervalo de 0,1-100 \mug/kg de sujeto.

Una composición de vacuna está convenientemente en forma inyectable. Pueden emplearse adyuvantes convencionales para potenciar la respuesta inmune. Una dosis unitaria adecuada para vacunación es 0,5-5 microgramos/kg de antígeno, y tal dosis se administra preferiblemente 1-3 veces y con un intervalo de 1-3 semanas. Con el intervalo de dosis indicado, no se observarán efectos toxicológicos adversos con los compuestos de la invención que impidan su administración a individuos adecuados.

Se esperan sin embargo variaciones amplias en la dosificación necesitada en vista de la diversidad de compuestos disponibles y a las diferentes eficacias de las diversas vías de administración. Por ejemplo, se esperaría que la administración oral requiriese dosificaciones más altas que la administración por inyección intravenosa. Pueden ajustarse variaciones en estos niveles de dosificación usando rutinas empíricas convencionales para la optimización, como es bien entendido en la técnica.

Bases de datos de secuencias, secuencias en un medio tangible y algoritmos

Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos forman una fuente de información valiosa con la cual determinar sus estructuras bi y tridimensionales así como para identificar secuencias adicionales de homología similar. Estas estrategias se facilitan más fácilmente almacenando las secuencias en un medio legible por un ordenador y después usando los datos almacenados en un programa de estructura macromolecular conocido o para buscar una base de datos de secuencias usando herramientas de búsqueda bien conocidas, tales como el paquete del programa GCG.

Se proporcionan también por la invención procedimientos para el análisis de secuencias características o cadenas, particularmente secuencias genéticas o secuencias de proteínas codificadas. Los procedimientos preferidos de análisis de secuencia incluyen, por ejemplo, procedimientos de análisis de homología de secuencia, tales como análisis de identidad y semejanza, análisis de la estructura del ADN, ARN y proteínas, ensamblaje de secuencia, análisis cladístico, análisis de motivos de secuencia, determinación de la fase de lectura abierta, requerimiento de la base de ácidos nucleicos, análisis del uso de codones, reducción de la base de ácidos nucleicos y análisis de picos del cromatograma de secuenciación.

Se proporciona un procedimiento basado en ordenador para realizar la identificación de la homología. Este procedimiento comprende las etapas de: proporcionar una primera secuencia polinucleotídica que comprende la secuencia de un polinucleótido de la invención en un medio legible por el ordenador; y comparar dicha primera secuencia polinucleotídica con al menos una segunda secuencia polinucleotídica o polipéptídica para identificar la homología.

Todas las publicaciones y referencias, incluyendo pero sin limitación patentes y publicaciones de patentes citadas en esta memoria descriptiva, se incorporan en este documento como referencia en su totalidad como si se indicara específica e individualmente que cada publicación o referencia individual se incorpora como referencia como si se hubiera explicado con detalle.

Definiciones

"Identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, como puede ser el caso, determinada comparando las secuencias. En la técnica, "identidad" significa también el grado de relación de secuencia entre las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, como puede ser el caso, determinado por el apareamiento entre las cadenas de tales secuencias. Puede calcularse la "identidad" fácilmente por procedimientos conocidos, incluyendo pero sin limitación los descritos en los documentos (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G. eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academis Press. 1987; y Sequence Analisys Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., ed., M Stockton Press, New York, 1991; y Carrillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Se diseñan procedimientos para determinar la identidad que den el apareamiento más grande entre las secuencias analizadas. Además, los procedimientos para determinar la identidad se codifican en programas de ordenador disponibles públicamente. Los procedimientos de programas de ordenador para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero sin limitación, el programa GAP del paquete del programa GCG (Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. y col., J Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)), y FASTA (Person y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988). La familia de programas BLAST está disponible públicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y col., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Atlschul, S., y col., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Puede usarse también el algoritmo de Smith Waterman bien conocido para determinar la identidad.

Los parámetros para la comparación de secuencias polipeptítdicas incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparación: BLOSSUM62 de Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. USA. 89:10915-10919 (1992)

Penalización de hueco: 8

Penalización de longitud de hueco: 2

Está disponible públicamente un programa útil con estos parámetros como el programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por defecto para las comparaciones de péptidos (junto a sin penalización para huecos de extremo).

Los parámetros para la comparación del polinucleótido incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol Bio. 48: 443-453 (1970)

Matriz de comparación: emparejamientos = +10, desemparejamientos = 0

Penalización de hueco: 50

Penalización de longitud de hueco: 3

Disponible como: Programa "gap" de Genetics Computer Group, Madison WI. Estos son los parámetros por defecto para las comparaciones de ácidos nucleicos.

Se proporciona en (1) y (2) a continuación un significado preferido para la "identidad" de polinucleótidos y polipéptidos, como puede ser el caso.

(1)

Las realizaciones de polinucleótidos incluyen además un polinucleótido aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene al menos el 85, 90, 95, 97 o el 100% de identidad con la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 1, donde dicha secuencia polinucleotídica puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 1 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de nucleótidos comparada con la secuencia de referencia, donde dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión de nucleótidos, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción, y en la que dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones 5' y 3' terminales de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, entremezcladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en la que dicho número alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en la SEC ID Nº 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando tal producto de dicho número total de nucleótidos en la SEC ID Nº 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

donde n_{n} es el número de alteraciones de nucleótidos, x_{n} es el número total de nucleótidos en la SEC ID Nº 1, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 85%, 0,97 para el 97% ó 1,00 para el 100% y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en la que cualquier producto de x_{n} e y que no sea un número entero se redondea hacia abajo hasta el número entero más cercano previamente a restarlo de x_{n}. Las alteraciones de una secuencia polinucleotídica que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2 pueden crear mutaciones sin sentido, con fallo del sentido o con cambio de fase en esta secuencia codificante y alteran de ese modo el polipéptido codificado por el polinucleótido posterior a tales alteraciones.

A modo de ejemplo, una secuencia polinucleotídica de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 1, es decir, puede ser el 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de ácidos nucleicos comparada con la secuencia de referencia de forma que el porcentaje de identidad es menos del 100% de identidad. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión de ácidos nucleicos, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción, y donde dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones 5' y 3' terminales de la secuencia polinucleotídica de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, entremezcladas individualmente entre los ácidos nucleicos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de ácidos nucleicos para un porcentaje de identidad dado se determina multiplicando el número total de nucleótidos en la SEC ID Nº 1 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y después restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en la SEC ID Nº 1, o:

n_{n} \leq x_{n} - (x_{n} \cdot y),

donde n_{n} es el número de alteraciones de ácidos nucleicos, x_{n} es el número total de ácidos nucleicos de la SEC ID Nº 1, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 85%, 0,97 para el 97% ó 1,00 para el 100% y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y donde cualquier producto de x_{n} e y que no sea un número entero se redondea hacia abajo hasta el número entero más cercano previamente a restarlo de x_{n}.

(2)

Las realizaciones de polipéptidos incluyen además un polipéptido aislado que comprende un polipéptido que tiene al menos el 85, 90, 95, 97 o el 100% de identidad con una secuencia de polipéptidos de referencia de la SEC ID Nº 2, en donde dicha secuencia polipeptídica puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 2 o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos comparada con la secuencia de referencia, en donde dichas alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión de aminoácidos, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción, y en donde dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia del polipéptido de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, entremezcladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia, y en donde dicho número de alteraciones de aminoácidos se determina multiplicando el número total de aminoácidos en la SEC ID Nº 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y restando después ese producto de dicho número total de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

en donde n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos de la SEC ID Nº 1, y es 0,50 para el 50%, 0,60 para el 60%, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, 0,90 para el 85%, 0,97 para el 97% ó 1,00 para el 100% y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en donde cualquier producto de x_{n} e y que no sea un número entero se redondea hacia abajo hasta el número entero más cercano previamente a restarlo de x_{n}.

A modo de ejemplo, una secuencia polipeptídica de la presente invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de la SEC ID Nº 2, es decir, puede ser el 100% idéntica, o puede incluir has un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos comparada con la secuencia de referencia de forma que el porcentaje de identidad es menor del 100% de identidad. Tales alteraciones se seleccionan entre el grupo constituido por al menos una supresión de aminoácidos, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa o inserción, y en donde dichas alteraciones pueden ocurrir en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones, entremezcladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un % de identidad dado se determina multiplicando el número total de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 por el número entero que define el porcentaje de identidad dividido por 100 y restando después ese producto de dicho número total de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, o:

n_{a} \leq x_{a} - (x_{a} \cdot y),

en donde n_{a} es el número de alteraciones de aminoácidos, x_{a} es el número total de aminoácidos de la SEC ID Nº 2, y es por ejemplo, 0,70 para el 70%, 0,80 para el 80%, 0,85 para el 85%, etc y \cdot es el símbolo del operador de multiplicación, y en donde cualquier producto de x_{n} e y que no sea un número entero se redondea hacia abajo hasta el número entero más cercano previamente a restarlo de x_{n}.

"individuo o individuos", cuando se usa en este documento con referencia a un organismo, significa un eucariota multicelular, incluyendo, pero sin limitación, un metazoo, un mamífero, un óvido, un bóvido, un simio, un primate y un ser humano.

"Aislado" significa alterado "por la mano del hombre" desde su estado natural, es decir, si se encuentra en la naturaleza, se ha cambiado o eliminado de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido presente de forma natural en un organismo vivo no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado", como se emplea el término en este documento. Además, un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo por transformación, manipulación genética o por cualquier otro procedimiento recombinante está "aislado" incluso si está presente en dicho organismo, estando el organismo vivo o no vivo.

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"Polinucleótido o polinucleótidos" se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado incluyendo regiones de cadena única y doble.

"Variantes" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia, pero mantiene las propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere en la secuencia de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios en los nucleótidos pueden producir sustituciones en aminoácidos, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como se analiza posteriormente. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias están limitadas de forma que las secuencias del polipéptido de referencia y de la variante son estrechamente similares en general, y en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, supresiones en cualquier combinación. Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede ser codificado o no por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede encontrarse de forma natural tal como una variante alélica o puede ser una variante que no se sabe que se encuentre de forma natural. Las variantes de polinucleótidos y polipéptidos que no se encuentran de forma natural pueden fabricarse por técnicas de mutagénesis o por síntesis directa.

"Enfermedad o enfermedades" significa cualquier enfermedad causada por o relacionada con una bacteria, incluyendo, por ejemplo, otitis media en lactantes y niños, neumonía en ancianos, sinusitis, infecciones nocosomiales y enfermedades invasivas, otitis media crónica con pérdida de audición, acumulación de fluido en el oído medio, daño en el nervio auditivo, retraso en el aprendizaje del habla, infección del tracto respiratorio superior e inflamación del oído medio.

Ejemplos

Los ejemplos que se presentan a continuación se realizan usando técnicas convencionales, que se conocen bien y son rutinarias para los especialistas en la técnica, excepto que se describa otra cosa con detalle. Los ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la invención.

Ejemplo 1 Descubrimiento y secuenciación de ADN confirmatorio del gen BASB027 de Moraxella catarrhalis cepa ATCC 43617

El gen BASB027 de SEC ID Nº:1 se descubrió por primera vez en la base de datos Incyte Pathoseq que contiene secuencias de ADN genómico sin terminar de la cepa ATCC 43617 de Moraxella catarrhalis (también denominada cepa Mc2931). La traducción de la secuencia polinucleotídica de BASB027, mostrada en SEC ID Nº:2, mostró similitud significativa (identidad de 32% en una superposición de 817 aminoácidos) con la proteína de membrana externa OMP85 de Neisseria meningitidis.

La secuencia del gen BASB027 se confirmó posteriormente de forma experimental. Para este propósito se extrajo ADN genómico de 10^{10} células de las células de M.catarrhalis (cepa ATCC43617) usando el kit de extracción de ADN genómico QIAGEN (Qiagn Gmbh), y se sometió 1 \mug de este material a una amplificación de ADN por reacción en Cadena de Polimerasa usando cebadores E515515 (5'-ACT-ATA-GGG-CAC-GCG-TG-3') [SEC ID NO:5] y e515528: (5'-CCT-GCG-TTT-GTT-TGA-TTG-AG-3') [SEC ID NO:6] . Este producto de PCR se purificó en un aparato Biorobot 9600 (Qiagen Gmbh) y se sometió a secuenciación de ADN usando el kit Big Dye Cycle Sequencing (Perking-Elmer) y un secuenciador de ADN ABI 377/PRISM. La secuenciación de ADN se realizó sobre ambas cadenas con una redundancia de 2 y toda la secuencia se ensambló usando el programa SeqMan del paquete de software DNASTAR Lasergene. La secuencia de ADN resultante y la secuencia polipeptídica deducida se muestran como SEC ID Nº:3 y SEC ID NO:4 respectivamente. Cuatro nucleótidos diferencian la SEC ID Nº:3 de la SEC ID Nº:1. Usando el programa MEGALIGN del paquete de software DNASTAR Lasergene, se realizó un alineamiento de las secuencias polipeptídicas de SEC ID Nº:1 y 3, y se presenta en la Figura 2; se calculó que su nivel de identidad era del 99,8%.

Usando el mismo programa, se realizó el alineamiento de las secuencias polinucleotídica de SEC ID Nº:2 y 4, y se presenta en la Figura 3, se calculó que su nivel de identidad era del 99,8%.

Ejemplo 2 Análisis de variabilidad del gen BASB027 entre varias cepas de Moraxella catarrhalis 2A: Análisis de longitud de fragmento de restricción (RFLP)

Se extrajo el ADN genómico de 16 cepas de M. catarrhalis (presentado en la tabla 1) como se describe a continuación. Se cultivó en estrías M. catarrhalis para obtener colonias únicas sobre placas de agar BHI y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se seleccionaron tres o cuatro colonias únicas y se usaron para inocular un cultivo de siembra de caldo de \sim1,5 ml BHI (infusión de cerebro-corazón) que se dejó crecer durante una noche en un incubador de agitación, \sim300 rpm a 37ºC. Un matraz Erlenmeyer de 500 ml que contenía \sim150 ml de caldo BHI se inoculó con el cultivo sembrado y se dejó crecer durante 12-16 horas a 37ºC en un incubador de agitación, a \sim175 rpm, para generar masas de células para aislamiento de ADN. Las células se recogieron por centrifugación en un rotor Sorvall GSA a \sim2000 X g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se retiró el sobrenadante y el sedimento de células se suspendió en -5,0 ml de agua estéril. Se añadió un volumen igual de tampón de lisis (NaCl 200 mM, EDTA 20 mM, Tris-HCl 40 mM, pH 8,0, SDS al 0,5% (p/v), 2-mercaptoetanol al 0,5% (v/v) y 250 \mug/ml de proteinasa K) y las células se suspendieron mediante suave agitación y trituración. Entonces se incubó la suspensión de células durante \sim1/2 hora a 50ºC para lisar las bacterias y liberar el ADN cromosómico. El material proteico se precipitó mediante la adición de 5,0 ml de NaCl saturado (\sim6,0 M, en agua estéril) y centrifugación a \sim5.500xg en un rotor Sorvall SS34 a temperatura ambiente. Se precipitó el ADN cromosómico del sobrenadante clarificado mediante la adición de dos volúmenes de etanol al 100%. Se recogió el ADN agregado y se lavó usando una suave agitación en un pequeño volumen de una solución de etanol al 70%. Se suspendió el ADN cromosómico purificado en agua estéril y se permitió que se disolviera/dispersara durante una noche a 4ºC mediante suave balanceo. Se determinó la concentración de ADN disuelto de forma espectrofotométrica a 260 nm usando un coeficiente de extinción de 1,0 D.O. unidad \sim50 \mug/ml.

Este material después se sometió a una amplificación por PCR usando los oligonucleótidos MC-D15-BamF (5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TC ACA GGA CTA CAG CGA GTG ACC ATT GAA AGC TTA C -3') [SEC ID NO:7] Y MC-D15-SaIRC (AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA AAA GAC ACT ACC AAT CTG GAA CTG TAC CGT ATC G -3') [SEC ID NO:8]. Los amplicones de gen BASB027 correspondientes entonces se sometieron independientemente a hidrólisis usando enzimas de restricción (AciI, HindIII, MaeIII, NlaIII, RsaI, Sau3Al) y los productos de restricción se separaron mediante electroforesis con gel de agarosa o de poliacrilamida usando procedimientos de biología molecular convencionales como se describe en "Molecular Cloning, Laboratory Manual, second edition, Eds: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989". Las fotografías de los geles resultantes de electroforesis se presentan en la Figura 1. Para cada cepa se puntuaron y se combinaron los patrones de RFLP correspondientes a las 6 enzimas de restricción. Entonces se definieron los grupos de cepas que compartían combinaciones idénticas de patrones de RFLP. Usando esta metodología, las cepas ensayadas en este estudio entraron en 4 grupos genómicos (Grupo 1; Mc2906, Mc2908, Mc2912, Mc2926; Grupo 2: Mc2905, Mc2907, Mc2909, Mc2911, Mc2913, Mc2960, Mc2975; Grupo 3: Mc2910, Mc2912, Mc2956, Mc2969; Grupo 4: Mc2931). Estos datos confirman que la población de Moraxella catarrhalis usada en este estudio presenta una diversidad de secuencias de nucleótidos limitada para el gen BASB027.

TABLA 1 Características de las cepas de Moraxella catarrhalis usadas en este estudio

1

Ejemplo 3 Construcción de un Plásmido para Expresar BASB027 Recombinante A: Clonación de BASB027

Los sitios de restricción BamHiI y SalI introducidos por ingeniería genética en los cebadores de amplificación directos ([SEC ID Nº:7) y complementarios inversos, respectivamente, permitieron la clonación direccional de un producto de PCR de \sim2500 pb en el plásmido de expresión de E. coli disponible comercialmente pQE30 (QiaGen, resistente a ampicilina) de forma que se pudo expresar una proteína BASB07 madura como una proteína de fusión que contenía un marca de cromatografía de afinidad (His)6 en el extremo N. El producto de PCR BASB027 se purificó de la reacción de amplificación usando columnas spin basadas en gel de sílice (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para producir los extremos BamHI y SalI requeridos necesarios para la clonación, se digirió secuencialmente el producto de PCR purificado completamente con enzimas de restricción BamHI y SalI como se recomienda por el fabricante (Life Technologies). Después de la primera digestión, se purificó el producto de PCR mediante columna spin como anteriormente para retirar las sales y se eluyó en agua estéril antes de la segunda digestión enzimática. El fragmento de ADN digerido se purificó de nuevo usando columna spin basadas en gel de sílice antes de la unión con el plásmido pQE30.

B: Producción del Vector de Expresión

Para preparar el plásmido de expresión pQE30 para la unión, se digirió completamente de forma similar con BamI y SalI y después se trató con fosfatasa intestinal de ternero (CIP, \sim0,02 unidades/pmol de extremo 5', Life Technologies) como se dicta por el fabricante para evitar la unión a sí mismo. Se usó un exceso molar de aproximadamente 5-veces del fragmento digerido con respcto al vector preparado se usó para programar la reacción de unión. Se realizó una reacción de unión convencional de \sim20 \mul (\sim16ºC, \sim16 horas), usando métodos bien conocidos en la técnica, usando ADN ligasa de T4 (\sim2,0 unidades/reacción, Life Technologies). Se usó una alícuota de la unión (\sim5 \mul) para transformar células electrocomponentes M15 (pREP4) de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Después de un periodo de crecimiento de \sim2-3 horas a 37ºC en \sim1,0 ml de caldo LB, las células transformadas se colocaron en placas de agar LB que contenían kanamicina (50 \mug/ml) y ampicilina (100 \mug/ml). Ambos antibióticos se incluyeron en el medio de selección para asegurar que todas las células transformadas llevaban el plásmido pREP4 (KnR), que lleva el gen laclq necesario para la represión de la expresión de la expresión inducible por IPTG de proteínas en pQE30, y el plásmido pQE30-BASB027 (ApR). Se incubaron las placas durante una noche a 37ºC durante \sim16 horas. Se seleccionaron colonias individuales KnR/ApR con palillos estériles y se usaron para inocular por "parcheado" placas LB nuevas KR/ApR así como \sim 1,0 ml de un cultivo de caldo LB KnR/ApR. Las placas de parches y el cultivo de caldo se incubaron durante una noche a 37ºC en un incubador convencional (placas) o en un baño de agua
agitado.

Se empleó un análisis PCR basado en células enteras para verificar que los transformantes contenían el inserto de ADN BASB027. Aquí, el cultivo de caldo LB Kn/Ap de \sim1,0 ml se transfirió a un tubo de propileno de 1,5 ml y las células se recogieron por centrifugación en una microcentrífuga Beckmann (\sim3 min., temperatura ambiente, \sim12.000 X g). El sedimento celular se suspendió en \sim200 \mul de agua estéril y se usa una alícuota de \sim10 \mul para programar un volumen final de \sim50 \mul de reacción PCR que contenía los cebadores de amplificación BASB027 directos e inversos. Las concentraciones finales de los componentes de la reacción de PCR eran esencialmente los mismos que los especificados en el ejemplo 2 excepto porque se usaron \sim5,0 de polimerasa Taq. La etapa inicial de desnaturalización a 95ºC se aumentó a 3 minutos para asegurar la ruptura térmica de las células bacterianas y la liberación de ADN plasmídico. Se usaron un ciclador térmico ABI Model 9700 y un perfil de amplificación térmica de tres etapas de 32 ciclos, es decir 95ºC, 45 segundos, 55-58ºC, 45 segundos, 72ºC, 1 min., para amplificar el fragmento de PCR BASB027 de las muestras de transformantes lisados. Después de la amplificación térmica, se analizó una alícuota de \sim20 \mul de la reacción mediante electroforesis en gel de agarosa (agarosa al 0,8% en un tampón Tris-acetato-EDTA (TAE)). Los fragmentos de ADN se visualizaron con iluminación UV después de la electroforesis en gel y la tinción con bromuro de etidio. Se sometió a electroforesis un patrón de tamaño molecular de ADN (escala 1 Kb, Life Technologies) en paralelo con las muestras de ensayo y se usó para estimar el tamaño de los productos de PCR. Los transformantes que produjeron el producto de PCR de \sim2500 pb esperado se identificaron como cepas que contenían una construcción de expresión de BASB027. Después se analizaron las cepas que contenían plásmidos de expresión para comprobar la expresión inducible de BASB027 recombinante.

C: Análisis de Expresión de Transformantes PCR-Positivos

Para cada transformante PCR positivo que se ha identificado anteriormente, se inocularon \sim5,0 ml de caldo LB que contenía kanamicina (50 \mug/ml) y ampicilina (100 \mug/ml) con células de la placa de parches y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC con agitación (\sim250 rpm). Se inoculó una alícuota del cultivo sembrado durante una noche (\sim1,0 ml) en un matraz Erlenmeyer de 125 ml que contenía \sim25 ml de un caldo LB Kn/AP y se dejó crecer a 37º con agitación (\sim250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó un valor de D.O. 600 de \sim0,5, es decir, fase semilogarítmica (habitualmente aproximadamente 1,5-2,0 horas). En este momento aproximadamente la mitad del cultivo (\sim 15,5 ml) se transfirió a un segundo matraz de 125 ml y la expresión de la proteína recombinante BASB027 se indujo por la adición de IPTG (solución madre 1,0 M preparada en agua estéril, Sigma) a una concentración final de 1,0 mM. La incubación de los cultivos inducidos por IPTG y no inducidos continuó durante \sim4 horas adicionales a 37ºC con agitación. Las muestras (\sim1,0 ml) de los cultivos inducidos y no inducidos se retiraron después del periodo de inducción y las células se recogieron por centrifugación en una microcentrífuga a temperatura ambiente durante \sim3 minutos. Los sedimentos de células individuales se suspendieron en \sim50 \mul de agua estéril, entonces se mezclaron con un volumen igual de tampón de muestra Laemelli SDS-PAGE 2X que contenía 2-mercaptoetanol, y se puso en un baño de agua en ebullición durante \sim3 min para desnaturalizar las proteínas. Se cargaron volúmenes iguales (\sim15 \mul) de los lisados de células brutos inducidos por IPTG y no inducidos en gel de poliacrilamida duplicado Tris/glicina al 12% (minigeles de 1 mm de espesor, Novex). Las muestras de lisados inducidos y no inducidos se sometieron a electroforesis junto con marcadores de peso molecular preteñidos (SeeBlue, Novex) en condiciones convencionales usando un tampón convencional de SDS/Tris/glicina (BioRad). Después de la electroforesis, un gel se tiñó con azul brillante de Coomassie R250 (BioRad) y entonces se destiñó para visualizar la nueva proteína o proteínas inducibles por IPTG BASB027. El segundo gel se sometió a electrotransferencia sobre una membrana de PVDF (tamaño de poros 0,45 micrómetros, Novex) durante \sim2 horas a 4ºC usando un aparato de transferencia BioRad mini-Protean II y tampón de transferencia de metanol (20%) de Towbin. El bloqueo de la membrana y las incubaciones de anticuerpos se realizaron de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Se usó un anticuerpo monoclonal anti-RGS (His)3, seguido por un segundo anticuerpo de conejo antiratón conjugado con HRP (QiaGen), para confirmar la expresión y la identidad de la proteína recombinante BASB027. Se logró la visualización del patrón reactivo con anticuerpos anti His usando un sustrato insoluble ABT o usando Hyperfilm con el sistema de quimioluminiscencia Amersham
ECL.

D: Confirmación de Secuencia

Para verificar además que la proteína recombinante BASB027 inducible por IPTG que se expresa está en la fase de lectura abierta correcta y no es una molécula falsa resultante de un artefacto de clonación (es decir un desplazamiento de fase), se determinó la secuencia de ADN del inserto clonado. La secuencia de ADN del gen BASB027 de M. catarrhalis se obtuvo a partir de una cadena usando metodologías de secuenciación de ciclos de PCR asimétrica convencional (ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing, Perkin-Elmer). Se programaron reacciones de secuenciación con ADN de plásmido de expresión no digerido (\sim0,5 \mug/rxn) como plantilla y cebadores de secuenciación apropiados pQE30 específicos de vector y específicos de ORF (\sim3,5 pmol/rxn). Además la plantilla y el cebador de secuenciación, cada reacción de secuenciación (\sim20 \mul) contenía los cuarto dNTP diferentes (es decir, A, G, C, y T) y los cuatro nucleótidos terminadores correspondientes ddNTP (es decir, ddA, ddG, ddC, y ddT); conjugándose cada terminador con uno de los cuatro colorantes fluorescentes, Joe, Tam, Rox o Fam. Los productos de la elongación de secuenciación de cadena única se terminaron en posiciones aleatorias a lo largo de la plantilla por la incorporación de los ddNTP terminadores marcados con colorante. Los productos de terminación marcados por tinción fluorescente se purificaron usando columnas de cromatografía de exclusión molecular microcentrífuga (Princeton Genetics), se secaron al vacío, se suspendieron en un Tapón de Resuspensión de Plantillas (Perkin-Elmer) para electroforesis capilar o formamida desionizada para PAGE, se desnaturalizaron a 95ºC durante \sim5 min, y se analizaron mediante electroforesis capilar de alta resolución (ABI 310 Automated DNA Sequenator. Perkin-Elmer) o PAGE de alta resolución (ABI 377 Automated DNA Sequenator) como se recomienda por el fabricante. Se recogieron los datos de secuencia del ADN producidos a partir de reacciones individuales y las intensidades de pico de fluorescencia relativas se analizaron automáticamente en un ordenador PowerMAC usando el Software ABI Sequence Analysis (Perkin-Elmer). Las secuencias de ADN autoanalizadas individualmente se revisaron de forma manual para conseguir una mayor precisión antes de unirse a una "cadena" de secuencia de monocatenaria consenso usando el software AutoAssembler (Perkin-Elmer). La secuenciación determinó que el plásmido de expresión contenía la secuencia correcta en la fase de lectura abierto correcta.

Ejemplo 4 Producción de BASB027 Recombinante Cepa bacteriana

Se usó una cepa de expresión recombinante de E. coli M15 (pREP4) que contenía un plásmido (pQE30) que codifica BASB027 de M. catarrhalis para producir una masa de células para la purificación de una proteína recombinante. La cepa de expresión se cultivó en placas de agar LB que contenían 50 \mug/ml de kanamicina ("Kn") y 100 50 \mug/ml de ampilcilina ("Ap") para asegurar que se mantenían el plásmido control pREP4 lacl y la construcción de expresión pQE30-BASB027. Para la crioconservación a -80ºC, la cepa se propagó en caldo LB que contenía la misma concentración de antibióticos, después se mezcló con un volumen igual de caldo LB que contenía glicerol al 30% (p/v).

Medio

El medio de fermentación usado para la producción de proteína recombinante constaba de caldo 2X YT (Difco) que contenía 50 \mug/ml de Kn y 100 \mug/ml de Ap. Se añadió antiespumante al medio para la fermentación a 0,25 ml/l (Antifoam 204, Sigma). Para inducir la expresión de la proteína recombinante BASB027, se añadió IPTG (Isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido) al fermentador (1 mM final).

Fermentación

Se inoculó un matraz Erlenmeyer de siembra de 500 ml que contenía 50 ml de volumen de trabajo con 0,3 ml de cultivo congelado descongelado rápidamente, o varias colonias de un cultivo de placa de agar selectiva, y se incubaron durante aproximadamente 12 horas a 37 \pm 1ºC sobre una plataforma de agitación a 150 rpm (Innova 2100. New Brunswick Scientific). Este cultivo de siembra se usó entonces para inocular un fermentador de 5 l de volumen de trabajo que contenía caldo YT 2X y antibióticos Kn y Ap. El fermentador (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) se hizo funcionar a 37 \pm 1ºC, rociador de aire 0,2-0,4 VVM, 250 rpm en impulsadores Rushton. El pH no se controló ni en el cultivo de siembra del matraz ni en el fermentador. Durante la fermentación., el pH estaba en el intervalo de 6,5 a 7,3 en el fermentador. Se añadió IPTG (solución madre 1,0 M, preparada en agua estéril) al fermentador cuando el cultivo alcanzó la fase semilogarítmica de crecimiento (\sim0,7 unidades de D.O.600). Las células se indujeron durante 2-4 horas, entonces se recogieron por centrifugación usando una centrífuga 28RS Heraeus (Sepatech) o RC5C se alta velocidad (Sorvall Instruments). La pasta de células se almacenó a -20ºC hasta el procesamiento.

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Purificación Productos químicos y Materiales

Se obtuvieron imidazol, clorhidrato guanidina, Tris (hidroximetilo) y EDTA (ácido etilendiaminatetraacético) de categoría biotecnológica o mejor de Ameresco Chemical, Solon, Ohio. El Triton X-100 (t-octilfenoxipolietoxietanol), el fosfato sódico, monobásico, y la Urea eran de categoría reactiva o mejor y se obtuvieron de Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. El ácido acético glacial y el ácido clorhídrico se obtuvieron de Mallincrodt Baker Inc., Philipsburg, New Jersey. El metanol se obtuvo de Fisher Scientific, Fairlawn, New Jersey. El Pefabloc®SC (fluoruro de 4-(2-aminoetil)-bencensulfonilo), las pastillas de cóctel de inhibidor de proteasa completo y el PMSF (fluoruro de fenilmetil-sulfonilo) se obtuvieron de Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana. La bestatina, pepstatina A y el inhibidor de proteasa E-64 se obtuvieron de Calbiochem, LaJolla, California. La solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1xPBS) se obtuvo de Quality Biological, Inc., Gaithersburg, Maryland. La solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (10xPBS) se obtuvo de BioWhittaker, Walkersville, Maryland. El Penta-His Antibody. BSA se obtuvo de QiaGen, Valencia. California. La IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa AffiniPure se obtuvo de Jackson Immuno Research. West Grove, Penn. La solución única AEC se obtuvo de Zymed, South San Francisco, California. Todos los demás productos químicos eran de categoría reactiva o
mejor.

La resina Ni-NTA Superflow se obtuvo de QiaGen Inc., Valencia, California. Los geles premoldeados de Tris-glicina al 4-20% y poliacrilamida al 10-20%, todos los tampones y las soluciones, patrones preteñidos SeeBlue, patrones MultiMark multicoloreados y membranas de transferencia de PVDF se obtuvieron de Novex, San Diego, California. Los kits SDS-PAGE de tinción de plata se obtuvieron de Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokyo, Japón. La solución de tinción de coomassie se obtuvo de Bio-Rad Laboratories, Hercules, California. Los filtros de jeringa Acrodisc®PF 0,2 m se obtuvieron de Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan. Los filtros de jeringa desechables GD/X 25 mm se obtuvieron de Whatman Inc., Clifton, New Jersey. Los tubos de diálisis 8.000 MWCO se obtuvieron de BioDesign Inc. Od New York, Carmal New York. Los reactivos de ensayo de proteína BCA y los tubos de diálisis Snake Skin 3,500 MWCO se obtuvieron de Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois.

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Protocolo de Extracción

La pasta de células se descongeló a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Se pesaron de cinco a seis gramos de material en tubos de centrífuga desechables de 50 ml. A esto se añadieron cinco ml/gramo de tampón de clorhidrato de guanidina (Gu-HCl) (clorhidrato guanidina 6 M, fosfato sódico 100 mM, monobásico, tris 10 mM y Tritón X-100 al 0,05%, pH 8,0). La pasta de células se resuspendió usando un homogenizador PRO300D proscientific, a potencia 3/4 durante un minuto. La mezcla de extracción se puso entonces a temperatura ambiente con agitación suave durante 60 a 90 minutos. Después de 60 a 90 minutos se centrifugó a la mezcla de la extracción a 15.800 x g durante 15 minutos (centrífuga Sorvall RC5C, 11.500 rpm). El sobrenadante (S1) se decantó y se guardó para purificación adicional. El sedimento (P1) se guardó para análisis.

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Unión de la BASB027 a la Resina Níquel-NTA

Se añaden tres o cuatro ml de resina Ni-NTA al S1. Esto se pone entonces a temperatura ambiente con agitación suave durante una hora. Después de una hora se carga el S1/Ni-NTA en una columna XK16 Pharmacia. La columna entonces se lava con tampón Gu-HCl 1 M (clohidrato de guanidina 1 M, fosfato sódico 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-100 al 0,05%, pH 8,0). Esto se continua entonces por un lavado con tampón fosfato (fosfato sódico 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-100 al 0,05%, pH 6,3). Entonces se eluye la proteína de la columna con un tampón imidazol 250 mM (imidazol 250 mM, fosfato sódico 100 mM, monobásico, Tris 10 mM y Triton X-al 100 0,05%, pH 5,9).

Formulación Final

BASB027 se formuló por diálisis durante una noche frente a tres cambios de Triton X-100 al 0,1% y 1x PBS, pH 7,4, para retirar el Gu-HCl y el imidazol residuales. La proteína purificada se caracterizó y se usó para producir anticuerpos como se describe a continuación.

Caracterizaciones Bioquímicas SDS-PAGE y Análisis de Transferencia de Western

La proteína recombinante purificada se resolvió en geles de poliacrilamida al 4-20% y se transfirió electroforéticamente a membranas de PVDF de a 100 V durante 1 hora como se ha descrito previamente (Thebaine y col., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354). Las membranas de PVDF se pretrataron entonces con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía 5% de leche seca desnatada. Todas las incubaciones posteriores se realizaron usando este tampón de pretratamiento.

Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:500 de suero preinmune o suero inmune de conejo anti-His durante 1 hora a temperatura ambiente. Entonces se lavaron las membranas de PVDF dos veces con tampón de lavado (tampón Tris 20 mM, pH 7,5, que contiene cloruro sódico 150 mM y Tween-20 al 0,05%). Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:5000 de IgG de cabra anti-conejo marcada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories. West Grove. PA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las membranas de PVDF se lavaron entonces 4 veces con tampón de lavado, y se revelaron con 3-amino-9-etilcarbazol y peróxido de urea suministrado por Zymed (San Francisco. CA) durante 10 minutos cada una.

Los resultados de un SDS-PAGE (Figura 4) muestran una proteína de aproximadamente 95 kDa que es reactiva con un anticuerpo anti RGS (His) por transferencias de western (Figura 5) de la SDS-PAGE.

Secuenciación de Proteínas

La secuenciación del aminoácido del extremo amino de la proteína purificada se realizó para confirmar la producción de la proteína recombinante correcta usando protocolos químicos bien definidos en un secuenciado Hewlett-Packard modelo G1000A con un modelo 1090 LC y un secuenciador Hewlett-Packard modelo 241 con un modelo 1100 LC.

Ejemplo 5 Producción de Antisueros de BASB027 Recombinante

Se generó antisuero polivalente dirigido contra la proteína BASB027 vacunando dos conejos con la proteína recombinante BASB027 purificada. A cada animal se le administraron un total de tres inmunizaciones intramusculares (i.m.) de aproximadamente 20 \mug de proteína BASB027 por inyección (comenzando con el adyuvante completo de Freund y seguido por el adyuvante incompleto de Freund) a intervalos de aproximadamente 21 días. Se extrajo sangre de los animales antes de la primera inmunización ("pre-sangrado") y en los días 35 y 57.

Se midieron los títulos de proteína anti-BASB027 mediante un ELISA usando proteína recombinante BASB027 purificada (0,5 \mug/pocillo)El título se define como la mayor dilución igual o mayor de 0,1 como se calcula por la siguiente ecuación: DO media de dos muestras del ensayo de antisuero - DO media de dos muestras de ensayo del tampón. Los antisueros se usaron como el primer anticuerpo para identificar la proteína en una transferencia de western como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 4. La transferencia de western muestra la presencia de anticuerpo anti-BASB027 en el suero de animales inmunizados (Figura 6).

Ejemplo 6 Caracterización inmunológica Análisis de Transferencia de Western

Se hicieron crecer varias cepas de M. catarrhalis en placas de agar chocolate durante 48 horas a 35ºC en CO_{2} al 5%. Se usaron varias colonias para inocular 25 ml de caldo Mueller Hinton en un matraz de 250 ml. Los cultivos crecieron durante una noche y se recogieron por centrifugación. Entonces se solubilizaron las células suspendiendo 30 \mug de células en 150 \mul de tampón de muestra PAGE (tampón Tris 360 mM, pH 8,8, que contenía dodecilsulfato sódico al 4% y glicerol al 20%) e incubando la suspensión a 100ºC durante 5 minutos. Las células solubilizadas se resolvieron en geles de poliacrilamida al 4-20% y las proteínas separadas se transfirieron por electroforesis a membranas de PVDF a 100 V durante 1 hora como se ha descrito previamente (Thebaine y col.- 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354). Las membranas de PVDF se pretrataron entonces con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco que contenía 5% de leche desnatada deshidratada. Todas las incubaciones posteriores se realizaron usando este tampón de pretratamiento.

Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:500 de suero preinmune o suero inmune de conejo durante 1 hora a temperatura ambiente. Entonces las membranas de PVDF se lavaron dos veces con tampón de lavado (tampón Tris 20 mM, pH 7,5, que contenía cloruro sódico 150 mM y Tween-20 al 0,05%). Las membranas de PVDF se incubaron con 25 ml de una dilución 1:5000 de IgG de cabra anti-conejo marcada con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces se lavaron las membranas de PVDF 4 veces con tampón de lavado, y se revelaron con 3-amino-9-etilcarbazol y peróxido de urea suministrados por Zymed (San Francisco, CA) durante 10 minutos cada una.

Se detecta una proteína de aproximadamente 95 kDa (correspondiente al peso molecular esperado de BASB027) que es reactiva con el antisuero en todas las cepas de Moraxella (Figura 7).

Actividad Bactericida

Se examinó la actividad citotóxica mediada por complemento de anticuerpos anti-BASB027 para determinar el potencial de vacunación del polipéptido BASB027. Se preparó antisuero como se ha descrito anteriormente. Las actividades del suero preinmune y el antisuero antiBASB027 en la mediación de la eliminación por complemento de M. catarrhalis se examinó usando el "Ensayo Bactericida con Suero" descrito por Zollinger y col. (Immune Responses to Neisseria meningitis, en el Manual of Clinical Laboratory Immunology, 3ª ed., pág 347-349), excepto porque se usaron células de cepas o cultivares de M. catarrhalis en vez de células de Neisseria meningitis.

El título bactericida de anti-suero de conejo (eliminación del 50% de la cepa homóloga) era 1:8 (preinmune) y > 1:128 (inmune).

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Ejemplo 7 Presencia de Anticuerpo de BASB027 en Suero Convaleciente Humano

Se realizó análisis de transferencia de western o BASB027 recombinante purificada como se ha descrito anteriormente en los Ejemplos 4 y 6, excepto porque se usó una reserva de suero humano de niños infectados por M. catarrhalis como la primera preparación de anticuerpos. Los resultados muestran que el antisuero de individuos infectados de forma natural reacciona frente al recombinante purificado.

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Ejemplo 8 Producción de péptidos BASB027, Antisuero y Reactividad del mismo

Se produjeron dos péptidos específicos BASB027 cortos que tenían la secuencia de CYAKPLNKKQNDQTDT (SEC ID Nº:9) y YLTARRGQQTTLGEVVC (SEC ID Nº:10) en el laboratorio usando métodos generales bien conocidos. Se usaron estos péptidos unidos a KLH para producir anticuerpos en conejos hembra de 12 semanas Nueva Zelanda específicamente libres de patógenos. Los conejos recibieron 4 inyecciones a intervalos de aproximadamente 3 semanas de 200 \mug de péptido-KLH en adyuvante de Freund completo (primera inyección) o incompleto (segunda, tercera y cuarta inyecciones). Se extrajo sangre de los animales antes de la primera inmunización y un mes después de la cuarta inyección.

Se midieron los títulos de punto medio anti-péptidos mediante un ELISA usando péptidos libres. Los títulos de punto medio anti-péptidos un mes después de la cuarta inmunización eran superiores a 15000. Las transferencias de western de BASB027 recombinante purificada, usando anticuerpos anti-péptidos como el primer anticuerpo, se prepararon como se ha descrito en el Ejemplo 4 y 6. Los resultados se presentan en la Figura 8.

Materiales depositados

Se ha depositado un depósito que contiene una cepa de Moraxella catarrhalis Catlin en la American Type Culture Collection (en este documento "ATCC") el 21 de junio de 1997 y se le asignó el numero de depósito 43617. El depósito se describió como Branhamella catarrhalis (Frosch y Kolle) y es una biblioteca de insertos de 1,5-2,9 kb liofilizados construido a partir de aislado de M. catarrhalis obtenido de un aspirado transtraqueal de un minero de carbón con bronquitis crónica. El depósito se describe en Antimicrob. Agents Chemother. 21:506-508 (1982).

El depósito de cepa de Moraxella catarrhalis se denomina en este documento "la cepa depositada" o "el ADN de la cepa depositada".

La cepa depositada contiene un gen BASB027 completo.

Se ha depositado un depósito del vector pMC-D15 que consta de ADN de Moraxella catarrhalis insertado en pQE30 en la American Type Culture Collection (ATCC) el 12 de febrero de 1999 y se le asignó el número de depósito 207105.

La secuencia polinucleotídica contenida en la cepa/clon depositado, así como la secuencia de aminoácidos de cualquier polipéptido codificado de este modo, son determinantes en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de secuencias en este documento.

El depósito de las cepas depositadas se ha realizado en los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional el Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimientos de Patentes. Las cepas depositadas se publicarán irrevocablemente y sin restricción ni condición al público después de la expedición de una patente. Las cepas depositadas se proporcionan meramente por comodidad para los especialistas en la técnica y no son una admisión de que se necesita un depósito para la habilitación, tal como lo que se requiere según 35 U.S.C. \NAK 112.

<110> SmithKline Beecham Biologicals

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<120> Nuevos Compuestos

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<130> BM45324

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<160> 10

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 2442

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<212> ADN

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<213> Bacteria

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<400> 1

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2

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<210> 2

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<211> 813

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<212> PRT

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<213> Bacteria

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<400> 2

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3

4

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<210> 3

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<211> 2442

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<212> ADN

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<213> Bacteria

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<400> 3

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5

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<210> 4

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<211> 813

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<212> PRT

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<213> Bacteria

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<400> 4

6

7

8

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<210> 5

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

actatagggc acgcgtg

\hfill

17

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<210> 6

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

cctgcgtttg tttgattgag

\hfill

20

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<210> 7

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<211> 61

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 7

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9

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<210> 8

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<211> 67

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido

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<400> 8

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10

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<210> 9

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligopéptido

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<400> 9

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\sa{Cys Tyr Ala Lys Pro Leu Asn Lys Lys Gln Asn Asp Gln Thr Asp Thr}

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<210> 10

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Oligopéptido

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<400> 10

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\sa{Tyr Leu Thr Ala Arg Arg Gly Gln Gln Thr Thr Leu Gly Glu Val Val}

\sac{Cys}

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INFORMACIÓN DE SECUENCIA

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Secuencias de polinucleótidos y polipéptidos BASBO27

SEC ID Nº: 1

Secuencia del polinucleótido BASB027 de Moraxella catarrhalis de la cepa ATCC 43617

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11

\newpage

SEC ID Nº: 2

Secuencia del polipéptido BASB027 de Moraxella catarrhalis deducida de la secuencia del polinucleótido de

la SEC ID Nº 1

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12

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SEC ID Nº: 3

Secuencia del polinucleótido BASB027 de Moraxella catarrhalis de la cepa ATCC 43617

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13

14

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SEC ID Nº: 4

Secuencia del polipéptido BASB027 de Moraxella catarrhalis deducida de la secuencia del polinucleótido de

la SEC ID Nº 3

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15

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SEC ID Nº: 5

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ACT ATA GGG CAC GCG TG

\hfill

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SEC ID Nº: 6

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CCT GCG TTT GTT TGA TTG AG

\hfill

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SEC ID Nº: 7

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100

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SEC ID Nº: 8

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101

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SEC ID Nº: 9

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\vskip0.400000\baselineskip

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CYAKPLNKKQNDQTDT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC ID Nº: 10

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

YLTARRGQQTTLGEVVC

\hfill

Claims (28)

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por la SEC ID Nº 2 y la SEC ID Nº 4 durante la longitud entera de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4 respectivamente, donde el polipéptido es capaz de provocar una respuesta inmune, si es necesario cuando se acopla a un vehículo, que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4.

2. Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la secuencia de aminoácidos tiene al menos el 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por: SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 4, durante la longitud completa de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4, respectivamente.

3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 4.

4. Un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por: SEC ID Nº 2 o SEC ID Nº 4.

5. Un fragmento inmunogénico de un polipéptido aislado constituido por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por: SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 4, durante la longitud completa de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4, respectivamente, donde el fragmento inmunogénico es capaz de provocar una respuesta inmune, si es necesario cuando se acopla a un vehículo, que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4.

6. Un fragmento inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 5 que comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4.

7. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido o un fragmento inmunogénico de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.

8. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido, una proteína de fusión o un fragmento inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2 ó 4 durante la longitud entera de la SEC ID Nº 2 ó 4 respectivamente; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

10. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la SEC ID Nº 2 ó 4 durante la región codificante entera; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

11. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 85% de identidad con la de la SEC ID Nº 1 ó 3 durante la longitud completa de la SEC ID Nº 1 ó 3 respectivamente; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucleótido aislado.

12. El polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 en el que la identidad es al menos el 95% con la SEC ID Nº 1 ó 3.

13. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4, o el fragmento inmunogénico de las reivindicaciones 5 ó 6.

14. Un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de la SEC IC Nº 1 o la SEC ID Nº 3.

15. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº 2, SEC ID Nº 4 obtenible detectando una librería apropiada en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene la secuencia de la SEC ID Nº 1 o la SEC ID Nº 3 o un fragmento de las mismas.

16. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15.

17. Un microorganismo que comprende el vector de expresión de la reivindicación 16.

18. Una célula huésped aislada que comprende el vector de expresión de la reivindicación 16, o una membrana de la célula hospedadora que comprende el polipéptido expresado.

19. Un procedimiento para producir un polipéptido, una proteína de fusión o un fragmento inmunogénico de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende cultivar una célula huésped aislada de la reivindicación 18 en condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido, proteína de fusión o fragmento inmunogénico y recuperar el polipéptido, proteína de fusión o fragmento inmunogénico del medio de cultivo.

20. Un procedimiento in vitro para expresar un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 que comprende transformar una célula hospedadora con un vector de expresión que comprende al menos uno de dichos polinucleótidos y cultivar dicha célula hospedadora en condiciones suficientes para la expresión de uno cualquiera de dichos polinucleótidos.

21. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polipéptido, proteína de fusión o fragmento inmunogénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23. La composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22 en la que dicha composición comprende al menos otro antígeno de Moraxella catarrhalis.

24. Un anticuerpo inmunoespecífico para un polipéptido constituido por una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por: SEC ID Nº 2 y SEC ID Nº 4, durante la longitud entera de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4 respectivamente o un fragmento inmunogénico de la misma en la que el fragmento inmunogénico es capaz de provocar una respuesta inmune, si es necesario cuando se acopla a un vehículo, que reconoce el polipéptido de la SEC ID Nº 2 o la SEC ID Nº 4.

25. Un procedimiento in vitro de diagnóstico de una infección de Moraxella catarrhalis, que comprende identificar un polipéptido como se ha reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un anticuerpo que es inmunoespecífico de dicho polipéptido, presente dentro de una muestra biológica de un animal sospechoso de tener tal infección.

26. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido, proteína de fusión o fragmento inmunogénico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la preparación de un medicamento para usar en la generación de una respuesta inmune en un animal.

27. Uso de una composición que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 en la preparación de un medicamento para usar en la generación de una respuesta inmune en un animal.

28. Una composición terapéutica útil en el tratamiento de seres humanos con infección por Moraxella catarrhalis que comprende al menos un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 24 y un vehículo farmacéuticamente adecuado.