ES2270421T3 - Anticuerpos monoclonales especificos para phf-tau, hibridomas que secretan los mismos, reconocimiento de antigeno por estos anticuerpos y sus aplicaciones. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE MAS PARTICULARMENTE A UN ANTICUERPO MONOCLONAL QUE FORMA UN COMPLEJO INMUNOLOGICO CON UN EPITOPO FOSFORILADO DE UN ANTIGENO QUE PERTENECE AL TAU ANORMALMENTE FOSFORILADO (PHF-TAU) QUE RESIDE EN LAS POSICIONES QUE SE EXTIENDEN EN LA REGION (143-254), Y CON EL ANTICUERPO MONOCLONAL CARACTERIZANDOSE POR EL HECHO DE QUE ES CAPAZ DE DETECTAR ESPECIFICAMENTE LA PROTEINA DEL TAU ANORMALMENTE FOSFORILADO (PHF-TAU) EN EL FLUIDO CEREBROESPINAL (CSF).

Description

Anticuerpos monoclonales específicos para PHF-tau, hibridomas que secretan los mismos, reconocimiento de antígeno por estos anticuerpos y sus aplicaciones.

Campo de la invención

La invención se refiere a nuevos anticuerpos monoclonales específicos para PHF-tau, a los hibridomas que secretan estos anticuerpos monoclonales, y al patrón de reconocimiento de antígeno de estos anticuerpos monoclonales y sus aplicaciones. La invención se refiere también a un proceso para diagnosticar enfermedades cerebrales que implican anticuerpos monoclonales de la invención, más particularmente en muestras de fluido cerebroespinal (CSF). La invención se refiere también a una región de la molécula tau modificable in vivo por el proceso de fosforilación, que se ha encontrado está asociado con la enfermedad de Alzheimer o con otros tipos de demencia y que es reconocida específicamente por los anticuerpos monoclonales de la invención.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer (AD) es la forma más común de demencia que comienza en la edad adulta. En la actualidad, no se dispone de ningún ensayo bioquímico fiable para diagnóstico ante mortem de la AD. La enfermedad se diagnostica por tanto clínicamente sobre la base de la exclusión de otras formas de demencia. El diagnóstico puede confirmarse neuropatológicamente por la demostración de grandes cantidades de placas neuríticas (seniles) y ovillos neurofibrilares (NFT) en regiones particulares del cerebro (McKhann et al, 1984).

Los ovillos neurofibrilares consisten en filamentos helicoidales apareados (PHFs). La evidencia inmunocitoquímica sugiere que la proteína tau asociada a los microtúbulos es un componente proteínico principal de PHF y NFT (Brion et al., 1985b; Delacourte y Defossez, 1986; Grundke-Iqbal et al., 1986; Kosik et al., 1986; Wood et al., 1986). Una prueba definitiva de que el dominio de fijación de tubulina de tau está fuertemente asociado con el núcleo de los PHFs se obtuvo por secuenciación de aminoácidos (Kondo et al., 1988). Sin embargo, se ha sugerido que los péptidos de tau pueden representar solamente una pequeña porción del componente principal de PHF (Wischik et al., 1988).

La proteína tau existe en isoformas diferentes, de las cuales 4 a 6 se encuentran en el cerebro adulto pero únicamente la isoforma 1 se detecta en el cerebro fetal. La diversidad de las isoformas se genera a partir de un gen simple en el cromosoma humano 17 por corte y empalme alternativos de mRNA (Andreadis et al., 1992). La característica más llamativa de la proteína tau, tal como se deduce de la clonación molecular, es un tramo de 31 ó 32 aminoácidos, que ocurre en la parte carboxi-terminal de la molécula, y que puede repetirse tres o cuatro veces. Una diversidad adicional es generada por inserciones de 29 ó 58 aminoácidos de longitud en la parte NH_{2}-terminal de las moléculas tau (Goedert et al., 1989). Para simplificar, toda la numeración en esta solicitud de patente se refiere a la variante de tau htau 40 que contiene todos los exones (441 aminoácidos de longitud) de acuerdo con Goedert et al. (1989).

En circunstancias normales, tau promueve el ensamblaje y la estabilidad de los microtúbulos en el compartimiento axonal de las neuronas. El dominio de fijación de microtúbulos en tau está localizado en la región de repetición de tau (255-381) (Lewis et al, 1990) y está modulado por regiones adyacentes: la cola carboxiterminal (382-414) y la región rica en prolina (143-254) (Drubin & Kirschner, 1991). La estabilidad y el empaquetamiento de los microtúbulos está mediada por una cremallera corta hidrófoba en la cola carboxiterminal de tau (Lewis et al, 1989). Tanto el ensamblaje como la estabilidad están regulados por corte y empalme alternativos de mRNA y fosforilación.

En circunstancias normales, el cerebro adulto contiene 2 a 3 moles de fosfato por mol de tau (Selden y Pollard, 1983; Ksiezak-Reding et al, 1992) presentes entre otros en la serina 404 (Poulter et al, 1993), si bien otros resultados demuestran que la fosforilación de sitios diferentes en tau normal sigue diferentes perfiles de desarrollo (Lee et al, 1991; Bramblett et al, 1993; Goedert et al, 1993a). Variantes anormales de tau de 60, 64 y 68 kDa han sido detectadas exclusivamente en áreas cerebrales que exhiben cambios neurofibrilares y placas seniles (Delacourte et al, 1990). El comportamiento anormal de tau en la electroforesis es debido a fosforilación, dado que el tratamiento con fosfatasa alcalina de estas moléculas tau cambia su masa molecular a la de tau normal (Goedert et al., 1992; Flament et al., 1990b, Greenberg & Davies, 1990). Actualmente han sido detectados sitios de fosforilación anormales en PHF-tau en las posiciones 46, 231, 235, 263 y 396 (Iqbal et al., 1989; Lee et al., 1991; Hasegawa et al., 1992). En cuatro de estos sitios, el residuo fosforilado va seguido por un residuo prolina, lo que indica que una quinasa dirigida por prolina está indicada en algunas de las fosforilaciones anormales de tau. Además de estos sitios, están presentes 10 sitios más en htau 40, dos de los cuales están también fosforilados anormalmente, como se indica por su reactividad con anticuerpos (Mab tau2: Watanabe et al., 1992; Mab AT8: Biernat et al., 1992, Goedert et al.,
1993).

La fosforilación anormal de tau en la enfermedad de Alzheimer es debida a un desplazamiento en el equilibrio fosfatasa/quinasa. In vitro, varias quinasas pueden fosforilar tau: las quinasas cdc2 (Vulliet et al, 1992; Ledesma et al, 1992), las quinasas MAP (Drewes et al, 1992, Rodert e Ingram, 1991), las quinasas glucógeno-sintasa (Mandelkow et al, 1992) y TPKI y TPKII (Ishiguro et al, 1992). Las fosfatasas están menos estudiadas en la enfermedad de Alzheimer y hasta ahora solamente una fosfatasa era capaz de desfosforilar in vitro los sitios fosforilados anormalmente, a saber la proteína fosfatasa 2A_{1} (Goedert et al, 1992).

Hasta ahora, la detección de PHF-tau en extractos de cerebro, sea por anticuerpos (Mab Alz50: Ghanbari et al., 1990; Mab Ab423: Harrington et al., 1991), o por el cambio en peso molecular (Flament et al., 1990, Delacourte et al., 1993), o incluso por ensayo funcional (Bramblett et al., 1992) ha sido muy útil para discriminar demencias con propiedades citoesqueléticas alteradas de ancianos normales o pacientes con otros tipos de demencia. Sin embargo, la detección de PHF-tau en CSF seguía siendo imposible, incluso utilizando anticuerpos dirigidos a uno de los sitios fosforilados anormalmente tales como la serina 202 (Goedert et al., 1993). Esto puede adscribirse a una o más de las razones siguientes: 1) la baja concentración de PHF-tau en CSF, 2) el uso irregular de sitios de fosforilación entre todos los sitios de fosforilación potenciales, 3) diferencias en la sensibilidad a las fosfatasas de estos sitios, y, 4) una constante de afinidad demasiado baja de los anticuerpos utilizados.

La finalidad de la presente invención es por consiguiente proporcionar anticuerpos monoclonales que permiten la detección fiable y sensible de tau fosforilada anormalmente presente en fluido cerebroespinal.

La invención está orientada también a proporcionar los hibridomas que secretan los anticuerpos monoclonales citados anteriormente.

La invención está orientada adicionalmente a proporcionar los epítopes de la proteína tau fosforilada anormalmente presentes en homogeneizados de cerebro o en fluidos corporales tales como fluido cerebroespinal, que son reconocidos por dichos anticuerpos monoclonales.

Por último, la invención está orientada a proporcionar un proceso para la detección o diagnóstico in vitro de enfermedades cerebrales que implican proteínas tau fosforiladas anormalmente.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un anticuerpo monoclonal secretado por el hibridoma depositado en la ECACC el 7 de julio de 1993 bajo el No. 93070774; y a dicho hibridoma depositado.

La invención se refiere adicionalmente a un proceso para el diagnóstico, in vitro, de un paciente que se sospecha padece la enfermedad de Alzheimer, que comprende:

- (a) detectar el nivel de PHF-tau en una muestra de CSF obtenida de dicho paciente por fijación inmunológica de anticuerpos monoclonales capaces de reconocer específicamente en un péptido tau fosforilado una secuencia de aminoácidos Pro-Lys-Thr-Pro-Pro (SEQ ID NO 3), estando dicha Thr (181) fosforilada o anticuerpos monoclonales secretados por el hibridoma depositado de la reivindicación 2,

- (b) comparar el nivel obtenido en (a) con el nivel de PHF-tau presente en muestras de CSF obtenidas de controles, por lo cual una concentración incrementada de tau fosforilada anormalmente en dicho paciente apunta al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere más particularmente a un anticuerpo monoclonal que forma un complejo inmunológico con un epítope fosforilado de un antígeno que pertenece a tau fosforilada anormalmente (PHF-tau) que reside en la región que abarca las posiciones 143-254 con la secuencia de aminoácidos siguiente:

1

y caracterizándose dicho anticuerpo monoclonal por el hecho de que el mismo es capaz de detectar específicamente la proteína tau fosforilada anormalmente (PHF-tau) en fluido cerebroespinal (CSF).

Los anticuerpos monoclonales de la invención se seleccionaron de una gama de anticuerpos monoclonales obtenidos por inmunización directa con PHF-tau, extraída de tejido cerebral humano derivado de pacientes de Alzheimer. Más particularmente, los anticuerpos monoclonales de la invención se caracterizan por el hecho de que los mismos se fijan específicamente a tau fosforilada anormalmente que existe naturalmente. El análisis ulterior de sus epítopes demostró que los anticuerpos monoclonales de la invención están dirigidos a epítopes fosforilados confinados a una región particular de la molécula tau, a saber la región entre 143 y 254 que incluye varios sitios de fosforilación potenciales tales como T153 y S235 utilizados por las quinasas dirigidas a SP y TP. Los anticuerpos monoclonales de la invención se caracterizan adicionalmente por el hecho de que reconocen epítopes que son diferentes del epítope del anticuerpo monoclonal AT8 como se define el Goedert et al. (1993) y después de comparación con los anticuerpos AT8 permiten la detección de PHF-tau en el CSF. Aquéllos reconocen preferentemente PHF-tau en secciones de cerebro, inmunotransferencias o en ELISA y son sorprendentemente capaces de detectar PHF-tau en CSF, solos o en combinación con otros anticuerpos específicos de PHF-tau.

En conclusión, los anticuerpos monoclonales de la invención se caracterizan porque se fijan específicamente a tau fosforilada anormalmente que existe naturalmente, cuyo estado de fosforilación está confinado a una región particular de las moléculas tau como se ha especificado arriba, o se fijan a tau recombinante no fosforilada después de tratamiento con quinasas dirigidas por prolina, que pueden provocar la fosforilación de, entre otros, sitios Ser-Pro o Thr-Pro en la sesión especificada. Las quinasas dirigidas por prolina tales como quinasas MAP (Sturgill et al., 1991), quinasas cdc2 (Labbé et al., 1991) y las quinasas glucógeno-sintasa (Vandenheede et al., 1980) pueden purificarse a partir de diversos tejidos o pueden estar presentes en extractos cerebrales. La fosforilación de tau por estas quinasas se anula o disminuye notablemente cuando una o más de las serinas-treoninas siguientes están mutadas a un aminoácido tal como Ala: T153, T175, T181, S199, S202, T205, T212, T217, T231, o S235. Por consiguiente, el epítope de estos anticuerpos puede caracterizarse por dicha tau mutante, o por tau no fosforilada tal como tau recombinante expresada en procariotas y sus homólogos fosforilados, o por péptidos sintéticos que tienen la misma secuencia de aminoácidos como partes de la región arriba especificada de la proteína tau 40 humana, siendo dichos péptidos susceptibles de ser fosforilados por dichas quinasas o siendo incapaces de ser fosforilados después de la síntesis de los péptidos. Los epítopes a que se hace referencia en la presente invención se definen por tanto como la región rica en prolina de tau entre las posiciones 143 y 254 y que pueden estar fosforilados anormalmente en la treonina 153 (T153), T175, T181, S199, S202, T205, T212, T217, T231 y S235 o una combinación de estos sitios incluida el epítope de estos anticuerpos, a los que se hace referencia ulteriormente como "epítopes PHF-tau".

La expresión "detección específica de proteína tau fosforilada anormalmente" corresponde al hecho de que los anticuerpos monoclonales de la invención detectan tau fosforilada anormalmente en CSF sin reacción cruzada con tau normal presente en CSF.

La expresión "formación de un complejo inmunológico con" significa que el anticuerpo monoclonal de la invención se fija al antígeno citado anteriormente en condiciones como las mencionadas en una de las técnicas siguientes:

- Inmunomicroscopía óptica

Muestras de tejido cerebral, de v.g. pacientes de Alzheimer obtenidas por cirugía o autopsia, se fijan por inmersión en formalina al 4% o fijador de Bouin y se incrustan en parafina para su seccionamiento. Los anticuerpos monoclonales de la invención se aplican en asociación con una técnica para visualizar los complejos inmunológicos formados tales como la técnica del complejo avidina-peroxidasa biotinilada (Hsu et al., 1981) utilizando tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina para desarrollo del color. Las secciones se someten a contratinción con el tinte hematoxilina de Harris.

- Microscopía inmunoelectrónica en secciones de tejidos

Muestras de tejido cerebral obtenidas v.g. de pacientes de Alzheimer por cirugía o autopsia se fijan en fijador de Bouin o en formalina tamponada al 10% antes de seccionamiento sin incrustación (Vibrátomo). El anticuerpo monoclonal de la invención se utiliza para inmunotinción por el método indirecto de inmuno-oro después de lo cual se fijan las secciones, se incrustan y se seccionan para microscopía electrónica, todo ello de acuerdo con protocolos estándar conocidos por los expertos en la técnica (Brion et al., 1985a).

- Procedimientos de inmunotransferencia

Para la inmunotransferencia, se preparan fracciones enriquecidas en PHF-tau como ha sido descrito (Greenberg y Davies, 1990). Típicamente, tejido postmortem, constituido en su mayoría por materia gris de la corteza frontal y temporal, se obtuvo de pacientes de Alzheimer confirmados histológicamente. Esta muestra cerebral de materia gris de Alzheimer (5-10 g) se homogeneizó con 10 volúmenes de tampón H frío (Tris 10 mM/EGTA 1 mM/NaCl 0,8 M/sacarosa al 10%, pH 7,4) en un homogeneizador Potter S de Teflón/vidrio (Braun, Alemania). Después de centrifugación del homogeneizado en un rotor 60Ti MSE a 27.000 x g durante 20 min a 4ºC, se retiró el pelet y se ajustó el sobrenadante a 1% (peso/volumen) de N-laurosilsarcosina y 1% (volumen/volumen) de 2-mercaptoetanol y se incubó mientras se mantenía la rotación en un mezclador (Swelab, Suecia) durante 2,5 horas a 37ºC. La mezcla sobrenadante se centrifugó a 108.000 x g durante 35 min a 20ºC. El pelet que contenía PHF-tau se lavó cuidadosamente con PBS y se suspendió finalmente en 1 ml del mismo tampón.

La electroforesis en SDS-poliacrilamida se realiza en condiciones reductoras sobre geles al 12% (Laemmli, 1970). Después de la electroforesis, las proteínas se fijan y se tiñen con azul brillante Coomassie, o se transfiere (Towbin et al., 1979) a hojas de nitrocelulosa (Hybond-C, Amersham) o filtros Immobilon (Millipore).

Después de la transferencia, los filtros se preimpregnan en PBS que contiene 0,05% (vol/vol) de Twin 20 (Twin-PBS) y se incuban luego durante 1 h en Twin-PBS que contiene 5% (peso/vol) de leche desnatada y desecada y 10% (vol/vol) de suero de ternero recién nacido (tampón de bloqueo). A continuación, los filtros se tratan durante una noche a 4ºC con un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención diluido adecuadamente en tampón de bloqueo.

Los filtros se lavan luego 3 veces en Twin-PBS y se tratan durante 1,5 h a la temperatura ambiente con IgG anti-ratón de conejo marcado con peroxidasa de rábano picante (Dakopatts, Dinamarca) diluida 1/3000 en tampón de bloqueo. Después de tres lavados en Twin-PBS, se aplica complejo estreptavidina-peroxidasa de rábano picante biotinilada (Amersham), diluido 1/250 en tampón de bloqueo, durante 1,5 h a la temperatura ambiente. Después de ello, se lavan los filtros tres veces en Twin-PBS y una sola vez en PBS. Los filtros se incuban después en PBS que contiene 0,05% (peso/vol) de diaminobencidina y 0,03% (vol/vol) de peróxido de hidrógeno hasta que se desarrolla la tinción de fondo.

Debe aclararse que la formación de un complejo inmunológico entre los anticuerpos monoclonales y el antígeno no está limitada a las condiciones precisas arriba descritas, sino que todas las técnicas que respeten las propiedades inmunoquímicas de la fijación de anticuerpo y antígeno producirán una formación similar de un complejo inmunológico.

La presente invención se refiere más particularmente a un anticuerpo monoclonal como se define arriba, caracterizado por el hecho de que forma un complejo inmunológico:

- o bien con un epítope fosforilado localizado dentro de la secuencia arriba definida (SEQ ID NO 1),

- o con cualquier otro péptido fosforilado capaz de formar un complejo inmunológico con un anticuerpo monoclonal, que es capaz en sí mismo de formar un complejo con un epítope fosforilado localizado en la región de la proteína tau humana como se muestra en SEQ ID NO 1.

AT180 y AT270 son producidos por hibridomas depositados en la ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures, Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health and Laboratory Service (PHLS), Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, GB-Salisbury, Wiltshire SP4 OJG), el 22 de diciembre de 1992, bajo el No. 92122204 o el 7 de julio de 1993 bajo el No. 93070774.

Los anticuerpos monoclonales arriba mencionados se obtienen por un proceso que implica obtención y aislamiento de hibridomas que secretan estos anticuerpos monoclonales.

Los anticuerpos monoclonales preferidos de la invención permiten la detección de al menos 1, 5, 10 ó 20 pg/ml de tau fosforilada como se determina en un ELISA utilizando estos anticuerpos monoclonales en la fase de recubrimiento e incubándolos con CSF impurificado con diferentes cantidades de tau fosforilada y no fosforilada sin amplificación. La tau fosforilada se prepara por incubación de tau recombinante no fosforilada con un extracto de cerebro de rata capaz de fosforilación de los aminoácidos Ser y Thr en las posiciones correspondientes a los sitios de fosforilación anormal de tau (Goedert et al., 1993), como se encuentran en extractos tau de tejido cerebral derivado de pacientes que han fallecido a consecuencia de la enfermedad de Alzheimer.

Un proceso para obtención de los hibridomas de la invención implica:

- partiendo de células de bazo de un animal, v.g. ratón o rata, inmunizado previamente in vivo o de células de bazo de dichos animales inmunizados previamente in vitro con un antígeno que es preferiblemente tau fosforilada anormalmente (PHF-tau), o un péptido tau humano fosforilado o tau fosforilada anormalmente purificada por inmunoafinidad, como se describe más adelante, reconocida por los anticuerpos monoclonales de la invención;

- fusionar dichas células inmunizadas con células de mieloma en condiciones de formación de hibridoma; y

- seleccionar aquellos hibridomas que secretan los anticuerpos monoclonales que son capaces de reconocer específicamente un epítope fosforilado de tau fosforilada anormalmente (PHF-tau) en fluido cerebroespinal (CSF).

El péptido tau humano fosforilado hace referencia a un péptido que comprende en su secuencia de aminoácidos una secuencia fosforilada comprendida en la región que abarca los aminoácidos 143 a 254 de tau humana, caracterizándose dicho péptido por el hecho de que puede formar un complejo inmunológico con los anticuerpos de la invención.

El antígeno de la invención está contenido ventajosamente en el cerebro, en el fluido cerebroespinal o en el suero de un paciente que sufre enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, enfermedad de Pick, panencefalitis esclerosante subaguda (SSPE) u otras enfermedades neurológicas en las cuales está implicada la proteína tau fosforilada anormalmente; este antígeno provoca una reacción inmunológica con el anticuerpo monoclonal de la invención.

Más particularmente, la presente invención se refiere también a anticuerpos monoclonales como se han definido arriba, obtenidos por un proceso tal como se define arriba, caracterizado porque implica:

- partir de las células de bazo de un ratón inmunizado previamente con tau fosforilada anormalmente (PHF-tau) extraída y purificada de una muestra de cerebro humano de un paciente que sufre la enfermedad de Alzheimer (como se describe en la sección de ejemplos), o un péptido de tau humana fosforilado, o tau fosforilada anormalmente purificada por inmunoafinidad, capaz de reaccionar con los anticuerpos monoclonales de la invención,

- fusionar dichas células inmunizadas con células de mieloma en condiciones de formación de hibridoma,

- seleccionar aquellos hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente PHF-tau y que son capaces de detectar específicamente PHF-tau en CSF (como se ilustra en detalle en la sección de ejemplos).

Un proceso para producir los anticuerpos monoclonales de la invención implica:

- cultivar los hibridomas seleccionados que se han indicado arriba en un medio de cultivo apropiado; y

- recuperar los anticuerpos monoclonales secretados por dicho hibridoma seleccionado; o alternativamente

- implantar el hibridoma seleccionado en el peritoneo de un ratón y, cuando se ha producido ascitis en el animal;

- recuperar los anticuerpos monoclonales formados entonces a partir de dicha ascitis.

Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden prepararse por técnicas convencionales in vitro tales como el cultivo de células inmovilizadas utilizando v.g. fibras huecas o microcápsulas o tales como el cultivo de células en suspensión homogénea utilizando v.g. reactores con emulsor de aire comprimido o biorreactores agitados.

La invención se refiere también a un péptido capaz de formar un complejo inmunológico con cualquiera de los anticuerpos monoclonales de la invención, encontrándose dicho péptido en la forma fosforilada, y,

- comprendiendo o estando constituida la secuencia de dicho péptido por partes fosforiladas de la secuencia como se muestra en SEQ ID NO 1, o,

- comprendiendo o estando constituida la secuencia de dicho péptido por la secuencia de cualquier péptido que es capaz de formar un complejo inmunológico con uno cualquiera de los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención.

Dichos péptidos fosforilados tienen preferiblemente una longitud de 6 a 100 aminoácidos. Los péptidos de acuerdo con esta realización de la invención pueden prepararse por síntesis química clásica. La síntesis puede realizarse en solución homogénea o en fase sólida de acuerdo con cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica.

Los péptidos fosforilados se preparan de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica, (p.ej. de Bont et al., 1990a; de Bont et al., 1990b; Perich, 1991; Orvos et al., 1989).

La presente invención se refiere a un péptido fosforilado como se define arriba constituido por o que comprende en su secuencia de aminoácidos la secuencia siguiente:

Val-Arg-Thr-Pro-Pro (aminoácidos 229-233; numeración de tau 40 humana, SEQ ID NO 2), estando dicha Thr (231) fosforilada y caracterizándose dicho péptido porque es capaz de formar un complejo inmunológico con el anticuerpo monoclonal AT180 producido por el hibridoma depositado en la ECACC en 22 de diciembre de 1992 bajo No. 92122204.

De acuerdo con una realización preferida, la presente invención se refiere a un péptido fosforilado como se define arriba constituido por o que comprende en su secuencia de aminoácidos la secuencia siguiente:

Pro-Lys-Thr-Pro-Pro (aminoácidos 179-183; numeración de tau 40 humana; SEQ ID NO 3), estando dicha Thr(181) fosforilada y caracterizándose dicho péptido porque es capaz de formar un complejo inmunológico con el anticuerpo monoclonal AT270 producido por el hibridoma depositado en la ECACC en 7 de julio de 1993 bajo No. 93070774.

La presente invención se refiere también a un péptido fosforilado como se define arriba, que es capaz de generar un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 después de inmunización.

Los péptidos utilizados para inmunización se encuentran preferentemente en la forma en que los mismos están unidos a una molécula portadora a fin de alcanzar una respuesta inmunógena satisfactoria. Tales moléculas portadoras son bien conocidas en la técnica y se acoplan al péptido por grupos enlazadores, que forman parte también de la técnica.

La invención se refiere también a un proceso para la detección o diagnóstico post-mortem in vitro de una enfermedad cerebral/neurológica que implica PHF-tau, tal como la enfermedad de Alzheimer, que comprende al menos los pasos siguientes:

- poner en contacto un anticuerpo monoclonal de la invención con una preparación de NFT o un homogeneizado de cerebro extraído con detergente aislado de un paciente que había sufrido la enfermedad de Alzheimer o cualquier otra enfermedad que implique proteína tau fosforilada anormalmente (PHF-tau) en condiciones adecuadas para producir un complejo antígeno-anticuerpo;

- detectar la fijación inmunológica de dicho anticuerpo a dicho homogeneizado de cerebro, y separar si es posible dicho complejo y recuperar el antígeno buscado en forma purificada.

La recuperación del antígeno buscado puede hacerse lavando primeramente el complejo antígeno-anticuerpo inmovilizado formado entonces;

- tratar este complejo con una solución (v.g. tiocianato de potasio 3 M, cloruro de magnesio 2,5 M, citrato-ácido cítrico 0,2 M, pH 3,5 o ácido acético 0,1 M) capaz de producir la disociación del complejo antígeno-anticuerpo;
y

- recuperar el antígeno en forma purificada.

La invención se refiere también a un proceso para la detección o diagnóstico in vitro de una enfermedad cerebral/neurológica que implica la proteína tau fosforilada anormalmente, tal como en la enfermedad de Alzheimer, que incluye:

- poner una muestra de CSF, más preferiblemente CSF no concentrado, o una muestra de suero de un paciente que se sospecha padece una enfermedad cerebral que implica PHF-tau, más particularmente enfermedad de Alzheimer, o proteínas o polipéptidos como resultado de un procedimiento de extracción a partir de tejidos cerebrales, fluido cerebroespinal o suero conocido por los expertos en la técnica (Iqbal et al., 1984; Greenberg & Davies, 1990) en contacto en condiciones in vitro con un anticuerpo monoclonal de la invención, siendo dichas condiciones adecuadas para producir un complejo antígeno-anticuerpo; y

- detectar la fijación inmunológica de dicho anticuerpo a dicha muestra de extracto cerebral, fluido cerebro espinal o suero, o proteínas o polipéptidos.

Ventajosamente, los anticuerpos monoclonales de la invención se encuentran en un estado inmovilizado sobre un soporte adecuado, tal como una resina. Alternativamente, el presente proceso puede ponerse en práctica utilizando cualquier otro formato de inmunoensayo conocido por las personas expertas en la técnica.

El proceso para la detección del antígeno puede llevarse a cabo luego por ejemplo como sigue:

- reunir dicho complejo antígeno-anticuerpo formado por el antígeno y los anticuerpos de la invención con:

- un segundo anticuerpo

*

que puede ser un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítope de proteína tau fosforilada anormalmente, o un epítope de cualquier péptido tau fosforilado que lleva un epítope, siendo dichos epítopes diferentes del de la invención, o

*

que puede ser un anticuerpo policlonal que reconoce tau fosforilada anormalmente o un anticuerpo policlonal que reconoce un péptido que lleva un epítope de PHF-tau, siendo dicho anticuerpo policlonal capaz de formar un complejo inmunológico con epítopes que son diferentes del epítope de la invención, estando dicho anticuerpo policlonal preferentemente purificado por cromatografía de inmunoafinidad utilizando proteína tau inmovilizada;

- un marcador para marcación específica o acoplamiento con dicho segundo anticuerpo, siendo dicho marcador cualquier marcador posible conocido por las personas expertas en la técnica;

- soluciones tampón apropiadas para realizar la reacción inmunológica entre el anticuerpo monoclonal de la invención y una muestra del ensayo por una parte, y el segundo anticuerpo fijado y el marcador por otra parte.

La detección del anticuerpo monoclonal fijado inmunológicamente puede realizarse por tecnología convencional conocida en la técnica. Ventajosamente, el segundo anticuerpo lleva en sí mismo un marcador o un grupo para acoplamiento directo o indirecto con un marcador.

Los anticuerpos monoclonales de la invención permiten también el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer (AD) y de cualquier enfermedad que implique la formación de tau fosforilada anormalmente en la región 143 a 254 sobre la base de CSF (es decir, detectar formas modificadas de tau en CSF). El problema asociado con ello es que este antígeno está presente en una cantidad muy baja en CSF, por lo que el ensayo de detección tiene que ser muy sensible. Este problema de sensibilidad puede resolverse adicionalmente por (i) utilización de una combinación de los anticuerpos monoclonales de la invención, o (ii) una combinación de un anticuerpo monoclonal de la invención con cualesquiera otros anticuerpos monoclonales de tau fosforilados normal y/o anormalmente conocidos en la técnica, y/o (iii) por utilización de un anticuerpo monoclonal o una combinación de anticuerpos monoclonales de la invención en combinación con una técnica de amplificación tal como la técnica de amplificación por deposición de informadores catalizada (CARD, Bobrow et al., 1989), que permite un ELISA específico de PHF-tau con mayor sensibilidad.

Los resultados obtenidos con los anticuerpos monoclonales de la invención indican que se encuentran niveles elevados de PHF-tau en AD, pero pueden existir también en otras enfermedades neurológicas en las cuales ocurre una fosforilación anormal de tau en la región de tau comprendida por los aminoácidos 143 a 254.

De acuerdo con otra realización, la presente invención se refiere a un kit para el diagnóstico in vitro de una de las enfermedades siguiente: enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, enfermedad de Pick y otros trastornos neurológicos en los cuales están implicados la proteína tau fosforilada anormalmente o filamentos helicoidales apareados, caracterizado porque el kit comprende:

- al menos un anticuerpo monoclonal de la invención depositado sobre una microplaca;

- una preparación que contiene la muestra (CSF, suero o las proteínas extraídas del mismo) que debe someterse a diagnóstico in vitro,

- un segundo anticuerpo

*

que puede ser un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítope de proteína tau fosforilada anormalmente, o un epítope de cualquier péptido de tau fosforilado que lleva un epítope, siendo dichos epítopes diferentes del de la invención, o

*

que puede ser un anticuerpo monoclonal que reconoce tau fosforilada anormalmente o un anticuerpo policlonal que reconoce un péptido que lleva un epítope de PHF-tau, siendo dicho anticuerpo policlonal capaz de formar un complejo inmunológico con epítopes que son diferentes del epítope de la invención, estando dicho anticuerpo policlonal purificado preferiblemente por cromatografía de inmunoafinidad utilizando proteína tau inmovilizada;

- un marcador para marcación específica o acoplamiento con dicho segundo anticuerpo;

- soluciones tampón apropiadas para realización de la reacción inmunológica entre el anticuerpo monoclonal de la invención y una muestra de ensayo por una parte, y el segundo anticuerpo fijado y el marcador por otra parte,

- posiblemente un péptido que lleva un epítope de PHF-tau comprendido en la región que abarca los aminoácidos 143 a 254 para propósitos estándar, o para propósitos de competición con respecto al antígeno que se busca.

Una realización preferida de la presente invención para la detección o diagnóstico in vitro de una enfermedad cerebral/neurológica que implica proteína tau fosforilada anormalmente, tal como la enfermedad de Alzheimer, se refiere a un método o un kit como se ha definido arriba, que comprende una mezcla (combinación) de anticuerpos monoclonales utilizados en la invención, o una combinación de al menos un anticuerpo monoclonal utilizado en la invención con otros anticuerpos capaces de reconocer específicamente una región de PHF-tau que reside en la región que abarca las posiciones 143-254 de tau 40 humana (SEQ ID NO 1), seleccionándose preferiblemente dichos anticuerpos monoclonales de:

*

(1) el anticuerpo monoclonal AT180 producido por el hibridoma depositado en la ECACC en 22 de diciembre de 1992 bajo No. 92122204;

*

(2) el anticuerpo monoclonal AT270 producido por el hibridoma depositado en la ECACC el 7 de julio de 1993 bajo No. 93070774;

*

(3) el anticuerpo monoclonal AT8 producido por el hibridoma depositado en la ECACC el 8 de octubre de 1991 bajo No. 91100806;

y seleccionándose preferiblemente dicha mezcla de la lista siguiente:

*

una mezcla de anticuerpos monoclonales que comprende los anticuerpos monoclonales (1) y (2),

*

una mezcla de los anticuerpos monoclonales que comprende los anticuerpos monoclonales (2) y (3),

*

una mezcla de los anticuerpos monoclonales que comprende los anticuerpos monoclonales (1), (2) y (3);

caracterizándose adicionalmente dicho método o kit por contener o utilizar:

- una preparación que contiene la muestra a diagnosticar in vitro;

- un segundo anticuerpo

*

que puede ser un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítope de proteína tau fosforilada anormalmente, o un epítope de cualquier péptido tau fosforilado que lleva un epítope, siendo dichos epítopes diferentes del de la invención, o

*

que puede ser un anticuerpo policlonal que reconoce tau fosforilada anormalmente o un anticuerpo policlonal que reconoce un péptido que lleva un epítope de PHF-tau, siendo dicho anticuerpo policlonal capaz de formar un complejo inmunológico con epítopes que son diferentes del epítope de la invención, estando dicho anticuerpo policlonal purificado preferiblemente por cromatografía de inmunoafinidad utilizando proteína tau inmovilizada;

- un marcador para marcación específica o acoplamiento con dicho segundo anticuerpo;

- soluciones tampón apropiadas para realización de la reacción inmunológica entre el anticuerpo monoclonal de la invención y una muestra de ensayo por una parte, y el segundo anticuerpo fijado y el marcador por otra parte,

- posiblemente un péptido que lleva un epítope de PHF-tau para propósitos estándar, o para propósitos de competición con respecto al antígeno que se busca.

De acuerdo con otra realización preferida adicional, la presente invención se refiere a un método o kit para detección o diagnóstico in vitro de una enfermedad cerebral/neurológica que implica proteína tau fosforilada anormalmente, tal como la enfermedad de Alzheimer, que implica un formato de detección ELISA en sándwich es que comprende anticuerpos de recubrimiento y detección, estando constituidos dichos anticuerpos de recubrimiento por al menos un anticuerpo monoclonal utilizado en la invención, y estando constituidos dichos anticuerpos de detección por al menos un anticuerpo monoclonal capaz de detectar tau humana normal y/o fosforilada anormalmente, cuyo epítope es diferente de cualquiera de los epítopes de los anticuerpos monoclonales de la invención. Dicho formato ELISA en sándwich preferido se ilustra extensamente en la sección de ejemplos de la presente inven-
ción.

Leyendas de las tablas y figuras

Tabla 1

Detección de PHF-tau y tau normal utilizando los anticuerpos monoclonales específicos de PHF-tau AT180 y AT270. Microplacas recubiertas con cantidades saturantes de un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente PHF-tau se incubaron con CSF impurificado con cantidades diferentes de tau no fosforilada o fosforilada, preparada la última por incubación de tau recombinante no fosforilada con un extracto de cerebro de rata capaz de fosforilar los aminoácidos Ser y Thr en posiciones correspondientes a los sitios de fosforilación anormal de tau (Goedert et al., 1993). El antígeno fijado se detectó como se describe en la sección de ejemplos.

Tabla 2

Muestras de CSF de paciente de AD, pacientes de control y pacientes que padecían diversos trastornos neurológicos distintos de AD se ensayaron en ELISA utilizando combinaciones diferentes de anticuerpos de captura como se describe (Ejemplo III). Todos los análisis se expresan como unidades mOD excepto para la determinación de tau total que se realizó utilizando la htau Innotest (Innogenetics, Bélgica) y que se expresan en pg/ml de CSF.

Las diferentes condiciones experimentales utilizadas para cada disposición permiten únicamente comparación entre pistas.

Tabla 3

Muestras de CSF de pacientes de control, pacientes de AD y pacientes que sufrían diversos trastornos neurológicos distintos de AD (OND) se ensayaron utilizando la htau Innotest (Innogenetics, Bélgica). De los grupos de pacientes AD y pacientes OND se seleccionaron aquéllos que tenían valores de tau total altos para ensayo ulterior utilizando el ELISA específico de PHF-tau en el cual se utilizaron AT8, AT180 y AT270 como anticuerpos de captura y AT120 y HT7 como anticuerpos de detección como se describe (Ejemplo IV). Los resultados se expresan en pg/ml de tau en CSF para tau total (htau Innotest) y como unidades mOD para el ELISA específico de PHF-tau.

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Figura 1

Detección de PHF-tau y tau normal utilizando el anticuerpo monoclonal AT180. Microplacas recubiertas con cantidades saturantes del anticuerpo monoclonal AT180 que reconoce específicamente PHF-tau se incubaron con CSF impurificado con diferentes cantidades de tau no fosforilada o fosforilada, preparada la última por incubación de tau recombinante no fosforilada con un extracto de cerebro de rata capaz de fosforilar los aminoácidos Ser y Thr en las posiciones correspondientes a los sitios de fosforilación anormal de tau (Goedert et al., 1993). El antígeno fijado se detectó como se describe en la sección de ejemplos.

Figura 2

Detección de PHF-tau y tau normal utilizando el anticuerpo monoclonal AT270. Microplacas recubiertas con cantidades saturantes del anticuerpo monoclonal AT270 que reconoce específicamente PHF-tau se incubaron con CSF impurificado con diferentes cantidades de tau no fosforilada o fosforilada, preparada la última por incubación de tau no fosforilada recombinante con un extracto de cerebro de rata capaz de fosforilar los aminoácidos Ser y Thr en las posiciones correspondientes a los sitios de fosforilación anormal de tau (Goedert et al., 1993). El antígeno fijado se detectó como se describe en la sección de ejemplos.

Figura 3

Fosforilación de tau de tipo salvaje y mutada recombinante (expresada por el clon humano tau24; Goedert y Jakes, 1990) con la actividad de proteína-quinasa de cerebro de rata. Inmunotransferencias con antisuero 134 anti-tau y anticuerpos monoclonales AT8 y AT180. Pistas 1, tau 24; 2, tau 24 más extracto de cerebro; 3, tau 24 T231 A; 4, tau 24 T231 A más extracto de cerebro; 5, tau 24 S235 A; 6, tau 24 S235 A más extracto de cerebro.

Figura 4

Fosforilación de tau de tipo salvaje y recombinante mutada (expresada por el clon de tau 24 humana) con la actividad de proteína-quinasa de cerebro de rata. Inmunotransferencias con antisuero 134 anti-tau y anticuerpos monoclonales AT8 y AT270. Pistas 1, tau 24; 2, tau24 más extracto de cerebro; 3, tau 24 T175 A; 4, tau 24 T175 A más extracto de cerebro; 5, tau 24 T181 A; 6, tau 24 T181 A más extracto de cerebro.

Ejemplos Ejemplo I Preparación de los anticuerpos monoclonales AT180 y AT270 utilizando PHF-tau como antígeno 1. Preparación del antígeno para inmunización

Se purificó parcialmente PHF-tau por una modificación del método de Greenberg y Davis (1990). El tejido postmortem, constituido en su mayoría por materia gris de la corteza frontal y temporal, se obtuvo de pacientes de Alzheimer confirmados histológicamente. Esta muestra de cerebro de materia gris de Alzheimer (5-10 g) se homogeneizó con 10 volúmenes de tampón H frío (Tris 10 mM/EGTA 1 mM/NaCl 0,8 M/10% sacarosa, pH 7,4) en un homogeneizador Potter S de Teflón/vidrio (Braun, Alemania). Después de centrifugación del homogeneizado en un rotor 60 Ti MSE a 27.000 x g durante 20 min a 4ºC, se retiró el pelet y se ajustó el sobrenadante a 1% (peso/volumen) de N-laurosilsarcosina y 1% (vol/vol) de 2-mercaptoetanol y se incubó mientras se mantenía en rotación en un mezclador (Swelab, Suecia) durante 2,5 horas a 37ºC. La mezcla sobrenadante se centrifugó a 108.000 x g durante 35 min a 20ºC. El pelet que contenía PHF-tau se lavó cuidadosamente con PBS y se suspendió finalmente en 1 ml del mismo tampón.

La preparación de antígeno se evaluó por electroforesis en gel de 10% dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida, seguida por transferencia Western utilizando antisuero de tau normal anti-humana policlonal de conejo (Mercken et al., 1992a).

2. Protocolo de inmunización y procedimiento de fusión

Se cebaron subcutáneamente ratones Balb/c con 100 \mug de preparación de PHF-tau en adyuvante de Freund completo y se reforzaron intraperitonealmente 3 veces después de ello a intervalos de 3 semanas con 100 \mug del mismo antígeno en adyuvante de Freund incompleto. Los días 3 y 2 antes de la fusión, los ratones se reforzaron con 100 \mug de PHF-tau en solución salina.

Se fusionaron células de bazo de ratón con células de mieloma SP2/0, utilizando un procedimiento de Köhler y Milstein (1975) modificado con PEG4000.

Las células del experimento de fusión se suspendieron a una densidad de 4,5 x 10^{4} células de bazo/pocillo en placas de 96 pocillos sembradas previamente con células macrófagos peritoneales de ratón como capa de alimentación. Estos pocillos se escrutaron después de 12 días de crecimiento continuo respecto a producción de anticuerpo anti-PHF-tau por medio de un ELISA sándwich como se detalla más adelante.

El crecimiento de hibridoma se realizó en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 20% de suero de ternero fetal, piruvato de sodio (1 mM), L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 mg/ml), y aminoácidos no esenciales. Todos los productos se adquirieron de Gibco (Paisley, U.K.). Las células se incubaron en un incubador de aire con CO_{2} humidificado.

3. ELISA sándwich para escrutinio del anticuerpo anti-PHF-tau

El ELISA de escrutinio utilizado para la detección de los anticuerpos monoclonales anti-PHF-tau era un sistema ELISA sándwich con anticuerpos de anti-tau humana policlonales de conejo purificados por afinidad (Mercken et al., 1992a) en la fase de recubrimiento. A este fin, se utilizó tau normal humana purificada, preparada como se describe en Mercken et al. (1992a) para la preparación de una columna de inmuno-afinidad utilizando inmovilización covalente sobre Sepharosa activada con bromuro de cianógeno (Pharmacia, LKB Suecia). La fracción anti-tau fijada por afinidad se eluyó de esta columna con una solución tamponada de ácido cítrico 0,1 M a pH 2,5. Después de la neutralización, las fracciones que contenían anti-tau se agruparon y se aplicaron en forma de capa durante una noche (1 \mug/ml) a 4ºC sobre placas de microtitulación de alta fijación (Nunc, Gibco, Paisley, UK) en tampón de recubrimiento (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, NaN_{3} 10 mM, pH 8,5). Después de aplicación de sobrecapa durante 30 min con 125 \mul de caseína saturada al 10% en PBS para reducir la fijación inespecífica, las placas se incubaron con 100 \mul de una preparación de PHF-tau diluida adecuadamente y se incubaron durante 60 min a 37ºC. Las placas se lavaron tres veces con PBS-0,05% de Twin 20 (vol/vol); se añadieron 100 \mul de sobrenadante de hibridoma y se continuó la incubación durante 1 h a 37ºC. Después del lavado, los anticuerpos monoclonales fijados se detectaron con suero anti-ratón de conejo conjugado con peroxidasa (Dakopatts, Glostrup, Dinamarca). Todos los reactivos se diluyeron en PBS con 10% de caseína. Después del lavado final, se añadieron como sustrato de peroxidasa 100 \mul de 3,5,3',5'-tetrametilbencidina 0,42 mM, 0,003% de H_{2}O_{2} vol/vol en ácido cítrico 100 mM, hidrogenofosfato disódico 100 mM, pH 4,3. La reacción se paró con 50 \mul de una solución 2 M de H_{2}SO_{4}. La absorbancia se leyó en un Multiscan Titertek (Flow Laboratories, Eflab, Oy, Finlandia) a 450 nM.

A partir de dicho experimento de fusión, utilizando el procedimiento de escrutinio que se describe en la sección 3 anterior, se recuperaron 28 cultivos positivos (es decir cultivos que secretaban anticuerpos monoclonales anti-PHF-tau) de un total de 1440 cultivos. Estos cultivos positivos se designaron arbitrariamente AT1 a AT28 (algunos de estos cultivos de hibridoma, a saber, AT1 a AT14 han sido descritos por Mercken et al., 1992b). Como en esta ronda de escrutinio inicial, se encontró que los cultivos positivos estaban compuestos en la mayoría de los casos de clones mixtos como se observaba por inspección visual de los pocillos (usualmente entre 1 y 4 clones por pocillo). Todos los cultivos de hibridoma se subclonaron ulteriormente por dilución limitante, un método bien conocido por los expertos en la técnica, dando finalmente como resultado clones de hibridoma puros que secretaban anticuerpos con un idiotipo homogéneo. Algunos de estos clones de hibridoma puros se ensayaron ulteriormente con respecto a sus patrones de reactividad sobre tau normal y PHF-tau en ELISA como se describe en el Ejemplo II y la localización de sus epítopes por medio de análisis por transferencia Western utilizando mutantes de tau como se describe en el Ejemplo II.

El último procedimiento se llevó a cabo como sigue: Se aplicaron tau humana normal purificada y PHF-tau a geles de SDS-poliacrilamida al 10% y se corrieron en condiciones desnaturalizantes de acuerdo con Laemmli (1970).

Después de la SDS-PAGE, la transferencia a nitrocelulosa (Hybond-C, Amersham, Bruselas, Bélgica) se llevó a cabo en NaHCO_{3} 10 mM, Na_{2}CO_{3} 3 mM, pH 9,9 durante 120 min a 55 V con enfriamiento. Después de la transferencia, se equilibró la nitrocelulosa a solución salina tamponada con fosfato (PBS), y los sitios de fijación de proteína se bloquearon con tampón de transferencia (PBS complementado con 5% p/v de leche desnatada desecada y 10% v/v de suero de ternero recién nacido). Las proteínas transferidas se incubaron durante una noche a 4ºC con el anticuerpo del hibridoma respectivo. Después de 3 lavados con PBS-0,05% Tween 20 (v/v), se utilizaron inmunoglobulinas anti-ratón de conejo marcadas con peroxidasa de rábano picante (Dakopatts, Glostrup, Dinamarca) a una dilución de 1/3000 y se incubaron durante 90 min a la temperatura ambiente. Todos los antisueros se diluyeron en tampón de transferencia. Las transferencias se lavaron luego tres veces en PBS/Tween y se revelaron con solución sustrato (PBS, 0,05% p/v de 3,3'-diaminobencidina, 0,03% v/v de H_{2}O_{2}) después de lo cual se paró la reacción en H_{2}O.

Como resultado de estos análisis, se encontró que 8 hibridomas de un total de 28 (que incluían AT180 y AT270) eran realmente específicos de PHF-tau. Estos anticuerpos monoclonales específicos de PHF-tau se ensayaron finalmente respecto a su capacidad de detección de PHF-tau en fluido cerebroespinal utilizando un ELISA (como se ilustra en el Ejemplo IV). Como se ilustra en los ejemplos ulteriores, pudieron encontrarse dos anticuerpos monoclonales, a los que se hace referencia como AT270 y AT180, que permitían la detección específica de al menos 10 pg/ml de tau fosforilada como se determina en CSF impurificado con cantidades diferentes de tau fosforilada y no fosforilada sin aplicar técnicas de amplificación (la tau fosforilada se preparó por incubación de tau no fosforilada recombinante con un extracto de cerebro de rata capaz de fosforilar los aminoácidos Ser y Thr en posiciones correspondientes a los sitios de fosforilación anormales de tau como se describe en Goedert et al., 1993). Además, el anticuerpo monoclonal AT270 era capaz de detectar PHF-tau en CSF no concentrado (véase más adelante). Un ensayo basado en el uso de AT180 permitió detectar PHF-tau en CSF concentrado 5 veces, mientras que AT8 no era capaz de detectar PHF-tau en CSF concentrado 10 veces. Basándose en estos criterios, se seleccionaron los hibridomas AT180 y AT270 para caracterización ulterior de sus epítopes y se depositaron en la ECACC bajo los números 92122104 y 93070774.

4. Determinación de la clase y subclase de anticuerpos

La clase y subclase de anticuerpos se determinó por Inno-LIA (Innogenetics, Gante, Bélgica). Los anticuerpos AT180 y AT270 parecían ser de los subtipos IgG1, kappa.

Ejemplo II Caracterización de anticuerpos específicos de PHF-tau y sus epítopes 1. Discriminación de tau fosforilada anormalmente a partir de tau normal en ELISA

La preparación de tau normal purificada por afinidad se describe en Mercken et al. (1992b) y para PHF-tau es esencialmente como se describe en Greenberg y Davies (1990); Mercken et al. (1992a). La pureza de los patrones de tau normal y PHF-tau se determinó por SDS-PAGE. Las muestras se analizaron también en el analizador de aminoácidos 420 A/H (Applied Biosystems B.V., Maarssen, Países Bajos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tanto tau normal como PHF-tau exhibían las composiciones de aminoácidos esperadas. La concentración exacta de proteínas tanto de tau normal purificada por afinidad como de PHF-tau se determinó utilizando un péptido estándar interno.

Los anticuerpos monoclonales de PHF-tau derivados de los hibridomas AT180 o AT270 y purificados de medio acondicionado exento de suero por cromatografía en columna Protein G, se aplicaron como recubrimiento durante una noche a 4ºC sobre placas de microtitulación de alta fijación (Nunc, Gibco, Paisley, UK) en tampón de recubrimiento a 3 \mug/ml (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, NaN_{3} 10 mM, pH 8,5). Después de aplicación de sobrecapa durante 30 min con 150 \mul de caseína saturada al 10% en PBS para reducir la fijación inespecífica, se incubaron las placas con 100 \mul de patrones de tau o PHF-tau adecuadamente diluidos y se incubaron durante 60 min a 37ºC. Las placas se lavaron 5 veces con PBS-Tween 20 al 0,05% (v/v), se añadieron 100 \mul de dos anticuerpos biotinilados (AT120 y HT7, Vandermeeren et al., 1993; Mercken, tesis Ph. D.) a una concentración final de 0,2 \mug/ml, y se incubaron durante 1 hora a la temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (Jackson, Innogenetics, Bélgica) a una dilución de 1/10000 durante 30 min a la temperatura ambiente. Después de un lavado final con PBS/Tween 20, se añadieron 100 \mul de 3,5,3',5'-tetrametilbencidina 0,42 mM, 0,003% (vol/vol) de H_{2}O_{2} en ácido cítrico 100 mM, Na_{2}HPO_{4} 100 mM, pH 4,3 como sustrato de peroxidasa durante 30 min a la temperatura ambiente. La reacción se paró con 50 \mul de una solución 2M de H_{2}SO_{4}. La absorbancia se leyó en un Multiscan Titertek (Flow Laboratories, Eflab Oy, Finlandia) a 450 nm.

Se muestra la especificidad de AT180 y AT270 para PHF-tau (Tabla 1, Figuras 1 y 2), a partir de la cual puede verse que incluso a 1 \mug de tau normal no está presente reactividad alguna.

2. Mapeado del epítope de los anticuerpos específicos de PHF-tau seleccionados por la vía de mutantes de tau recombinantes

Un clon de cDNA de longitud total (tau 24 humana; htau24) correspondiente a una isoforma de 4 repeticiones de tau y con un sitio NdeI en el contexto del codón iniciador (Goedert y Jakes, 1990) se subclonó en el sitio EcoRI de M13mp18. Se utilizó mutagénesis orientada para cambiar los codones representativos de los aminoácidos siguientes a una Ala: T153, T175, T181, T199, T205, T212, T217, T231, S235, al que se hace referencia ulteriormente como T153A, etc., mutantes. Se evaluaron también constructos que contenían combinaciones de estos sitios. Después de escisión con NdeI y EcoRI los fragmentos resultantes se subclonaron aguas abajo del promotor de RNA-polimerasa T7 en el plásmido de expresión pRK172 (Mc Leod et al., 1987) y los plásmidos recombinantes se transformaron en células E. coli BL21(DE3) (Studier et al., 1990). Los cultivos bacterianos se dejaron crecer, se indujeron y las proteínas tau se purificaron como ha sido descrito (Goedert y Jakes, 1990).

La actividad de la proteína-quinasa cerebral se preparó por homogeneización de cerebro de rata adulta (1 g, 2,5 ml) en ácido okadaico 10 mM, PMSF 1 mM, 20 \mug/ml de leupeptina, 20 \mug/ml de aprotinina y 20 \mug/ml de pepstatina y se centrifugó a 40.000 rpm durante 1 h a 4ºC. El sobrenadante se utilizó directamente para fosforilación (Goedert et al., 1993). Las incubaciones (0,05 ml) se llevaron a cabo a 37ºC y comprendían HEPES 40 mM, pH 7,2, ATP 2 mM, MgCl_{2} 2 mM, proteína tau (1 \muM), extracto de cerebro de rata (1 \mul), EGTA 5 mM, DTT 2 mM, ácido okadaico 1 \muM, PMSF 1 mM, 20 \mug/ml de aprotinina y 20 \mug/ml de pepstatina. Las reacciones se iniciaron por adición del extracto de cerebro, se incubaron durante 24 h y se utilizaron partes alícuotas para la SDS-PAGE. Los controles se incubaron en las mismas condiciones, excepto que se omitió el extracto de cerebro.

Resultados

El clon de htau 24 normal o mutantes htau24 se fosforilaron por un extracto de cerebro de rata que contenía proteína-quinasa (Goedert et al., 1993), se corrieron en SDS-PAGE y se sometieron a inmunotransferencia utilizando AT180, AT270 o un antisuero de tau, 134, que es independiente de la fosforilación (Goedert et al., 1989). AT270 y AT180 no tenían las proteínas tau de tipo salvaje o mutantes antes de la fosforilación del extracto de cerebro. En cambio, después de una incubación de 24 h con extracto de cerebro, AT270 reconocía la tau de tipo salvaje, pero no tau T181A (Fig. 3). Esto establece que la tinción por AT270 requiere como mínimo que T181 esté fosforilada. El anticuerpo monoclonal AT180 reconocía igualmente la tau de tipo salvaje fosforilada pera fallaba en el reconocimiento del mutante T231A fosforilado, lo que indicaba que el epítope AT180 requiere fosforilación de T231 para reconocimiento (Fig. 4). La tinción bastante débil en el mutante S235A es debida al hecho de que algunos factores en el extracto de cerebro son limitantes en este tipo de ensayo y por consiguiente el sitio S235 no se convertía siempre por completo a su estado fosforilado, como se confirmó por utilización de proteína-quinasas recombinantes activadas como agentes de fosforilación (datos no presentados). Cuando se trató tau recombinante con la quinasa MAP recombinante activada sola o la quinasa GSK3 sola, no pudo producirse el epítope AT180, mientras que el mismo experimento realizado con una mezcla de quinasa MAP y quinasa GSK3 permitía la fosforilación e inmunorreactividad correctas con AT180.

Ejemplo III Utilización de diferentes combinaciones de los anticuerpos PHF-tau para detectar PHF-tau en CSF no concentrado

Se ha demostrado previamente que un ensayo para detectar tau fosforilada anormalmente basado en el uso exclusivo del anticuerpo AT8 como detector no es capaz de detectar el epítope de AT8 en CSF sin concentrar ni en CSF concentrado (Vandermeeren et al., 1993). Los experimentos de continuación con AT180 y AT270 demuestran que el epítope de AT270 presente en tau fosforilada anormalmente puede detectarse en la mayoría de las muestras no concentradas de CSF de Alzheimer, mientras que el epítope AT180 detecta sólo tau fosforilada anormalmente en aquellas muestras de CSF que contienen niveles altos de tau total y por consiguiente no detecta PHF-tau en todas las muestras de CSF de Alzheimer. Los autores de la invención utilizaron subsiguientemente AT270 solo o en diferentes combinaciones con otros anticuerpos (AT8, AT180). Se utilizaron combinaciones de anticuerpos como anticuerpos de recubrimiento fijados en fase sólida para examinar respecto a la presencia de PHF-tau en CSF de pacientes que padecían diferentes trastornos neurológicos en los cuales se ha descrito tau fosforilada anormalmente, tal como la enfermedad de Pick, la enfermedad de Creutzfeld-Jacob, y la enfermedad de Parkinson (véase la Tabla 2).

Un ensayo específico de PHF-tau preferido puede ser como sigue: aplicación como recubrimiento de los 3 anticuerpos monoclonales, AT8, AT180, y AT270 a una concentración final de 5 \mug/ml en Tris 10 mM de pH 8,6, NaCl 10 mM, NaAz 10 mM durante una noche a 4ºC sobre placas de microtitulación de alta fijación (Nunc, GIBCO, Paisley, U.K.). Después de aplicación de sobrecapa durante 1 h con 150 \mul de caseína saturada al 10% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para reducir la fijación inespecífica, se incubaron las placas con 100 \mul de un estándar de tau recombinante fosforilada diluido adecuadamente, o con muestras de CSF sin concentrar, complementadas con 5% de Tween 20, durante una noche a la temperatura ambiente. Las placas se lavaron 5 veces con PBS/0,05% de Tween 20 (vol/vol), se añadieron 100 \mul de dos anticuerpos biotinilados (AT120 y HT7; Vandermeeren et al., 1993; Mercken, Tesis Ph. D.) a una concentración final de 0,2 \mug/ml y se incubaron durante 1 h a la temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (Jackson, Innogenetics, Bélgica) a una dilución de 1/10000 durante 30 min a la temperatura ambiente. Después de un lavado final con PBS/Tween 20, se añadieron 100 \mul de 3,5,3',5'-tetrametilbencidina 0,42 mM, 0,003% (vol/vol) de H_{2}O_{2} en ácido cítrico 100 mM, Na_{2}HPO_{4} 100 mM, pH 4,3 como sustrato de peroxidasa durante 30 min a la temperatura ambiente. La reacción se paró con 50 \mul de una solución 2M de H_{2}SO_{4}. La absorbancia se leyó en un Multiscan Titertek (Flow Laboratories, Eflab Oy, Finlandia) a 450 nm.

Ejemplo IV Detección de PHF-tau en muestras de fluido cerebroespinal con los anticuerpos monoclonales específicos de PHF-tau seleccionados Muestras de fluido cerebroespinal

Se recogieron muestras de CSF ante-mortem de pacientes en el departamento de Neurología del Hospital Universitario de Amberes. Todas las muestras se obtuvieron por punción lumbar realizada para propósitos de diagnóstico de rutina. Las muestras de CSF se congelaron y mantuvieron a -70ºC hasta su utilización. Se tomaron muestras de pacientes de Alzheimer, de pacientes sin complicación neurológica alguna y de pacientes con diversos trastornos neurológicos. Dichas muestras se ensayaron respecto a la concentración de tau total utilizando la htau Innotest (Innogenetics, Bélgica) y las muestras que tenían valores de tau total altos se retuvieron para análisis ulterior respecto a la presencia de PHF-tau con el ensayo de PHF-tau preferido que se especifica en el Ejemplo III.

Resultados

Utilizando este ensayo y las muestras de CSF descritas, se obtuvieron los resultados resumidos en la Tabla 3. A partir de esto, es evidente que los niveles medios de PHF-tau se mantienen bastante bajos para los controles y los pacientes OND (controles: 381 mOD; OND, degenerativa: 423 mOD; OND, inflamatoria: 392 mOD; OND, vascular: 340 mOD), mientras que el valor medio para los pacientes de Alzheimer es 814 unidades mOD. Adicionalmente, como se puede ver en la Tabla 3, valores de tau total altos en el grupo OND no siempre se reflejan por un aumento paralelo en PHF-tau, mientras que en los pacientes AD los niveles de tau total altos dan siempre lugar a concentraciones elevadas de PHF-tau. La evidencia acumulada del grupo de control, los grupos OND y los pacientes AD apunta por tanto fuertemente a la especificidad de diagnóstico del ensayo PHF-tau para AD y síndromes afines a AD (tales como la demencia por infartos múltiples, la demencia mixta de la enfermedad de Parkinson y una demencia no especificada).

TABLA 1

2

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TABLA 2

3

TABLA 3

Pacientes de Alzheimer

4

TABLA 3 (continuación 1)

\vskip1.000000\baselineskip

Pacientes de Control

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Otros Trastornos Neurológicos. Tipos Degenerativos

6

\newpage

TABLA 3 (continuación 2)

\vskip1.000000\baselineskip

{}\hskip0,5cm Otras enfermedades neurodegenerativas. Tipos inflamatorios

7

\newpage

{}\hskip0,5cm Otras enfermedades neurológicas. Tipos vasculares

8

TABLA 3 (continuación 3)

\vskip1.000000\baselineskip

Otros trastornos neurológicos, no definidos

9

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Innogenetics sa.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: Industriepaark-Zwijnaarde 7, box 4

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Gante

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Bélgica

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): B-9052

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: 00 32 9 241 07 11

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: 00 32 9 241 07 99

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpos monoclonales específicos para PHF-tau, hibridomas que secretan los mismos, reconocimiento de antígeno por estos anticuerpos y sus aplicaciones

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 112 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Arg Thr Pro Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Lys Thr Pro Pro}

Claims (15)

1. Un anticuerpo monoclonal secretado por el hibridoma depositado en la ECACC el 7 de julio de 1993 bajo el No. 93070774.

2. Un hibridoma conforme al depositado en la ECACC el 7 de julio de 1993 bajo el No. 93070774.

3. Un proceso para producir anticuerpos monoclonales de acuerdo con la reivindicación 1, que implica:

-

cultivar los hibridomas seleccionados de acuerdo con la reivindicación 2 en un medio de cultivo apropiado, y

-

recuperar los anticuerpos monoclonales excretados por dichos hibridomas seleccionados; o

\hbox{alternativamente}

-

implantar los hibridomas seleccionados de la reivindicación 2 en el peritoneo de un ratón y, cuando ha sido producida ascitis por el animal, recuperar los anticuerpos monoclonales formados luego a partir de dicha ascitis.

4. Proceso para la detección o diagnóstico post-mortem de una enfermedad cerebral/neurológica que implica la proteína PHF-tau, tal como la enfermedad de Alzheimer, que comprende al menos los pasos siguientes:

-

poner en contacto un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 con una preparación de ovillos neurofibrilares (NFT) o un homogeneizado de cerebro extraído con detergente, aislado de un paciente que tenía la enfermedad de Alzheimer o cualquier otra enfermedad que implique PHF-tau en condiciones adecuadas para producir un complejo antígeno-anticuerpo; y

-

detectar la fijación inmunológica de dicho anticuerpo a dicho homogeneizado de cerebro, y

-

separar posiblemente el antígeno de dicho complejo y recuperar el antígeno buscado en una forma purificada.

5. Proceso para la detección o diagnóstico in vitro de una enfermedad cerebral que implica proteína tau fosforilada anormalmente, tal como la enfermedad de Alzheimer, que incluye:

-

poner una muestra de CSF, preferiblemente CSF no concentrado, o de suero procedente de un paciente que se sospecha padece un trastorno neurológico que implica PHF-tau, más particularmente enfermedad de Alzheimer, o proteínas o polipéptidos extraídos de la misma, en contacto en condiciones in vitro con un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1, siendo dichas condiciones adecuadas para producir un complejo antígeno-anticuerpo; y

-

detectar la fijación inmunológica de dicho anticuerpo a dicha muestra de fluido cerebro-espinal, o suero, o extracto de la misma.

6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual dichos anticuerpos monoclonales están inmovilizados sobre un soporte adecuado tal como resina.

7. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que comprende adicionalmente:

-

reunir dicho complejo antígeno-anticuerpo formado por el antígeno y los anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 1, con:

-

un segundo anticuerpo,

\bullet

que puede ser un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítope de proteína tau fosforilada anormalmente, o

\bullet

que puede ser un anticuerpo policlonal que reconoce tau fosforilada anormalmente o un anticuerpo policlonal que reconoce un péptido que lleva un epítope de PHF-tau, siendo dicho anticuerpo policlonal capaz de formar un complejo inmunológico con epítopes que son diferentes del epítope de la invención, estando dicho anticuerpo policlonal preferiblemente purificado por cromatografía de inmunoafinidad utilizando proteína tau inmovilizada;

-

un marcador sea para marcación específica o acoplamiento con dicho segundo anticuerpo;

-

soluciones tampón apropiadas para llevar a cabo la reacción inmunológica entre el anticuerpo monoclonal de la invención y una muestra de ensayo por una parte, y el segundo anticuerpo fijado y el marcador por otra parte.

8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual dicha muestra se pone en contacto con una combinación de anticuerpos monoclonales constituida por anticuerpos monoclonales de acuerdo con la reivindicación 1 y uno o más anticuerpos monoclonales seleccionados del grupo constituido por:

-

el anticuerpo monoclonal AT180 producido por el hibridoma depositado en la ECACC el 22 de diciembre de 1992 bajo el No. 92122204;

-

el anticuerpo monoclonal AT8 producido por el hibridoma depositado en la ECACC el 8 de octubre de 1991 bajo el No. 91100806.

9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual se utiliza al menos una de las combinaciones siguientes de anticuerpos monoclonales:

-

una mezcla que comprende al menos un anticuerpo mono-clonal de acuerdo con la reivindicación 1 y un anticuerpo monoclonal AT180 producido por el hibridoma depositado en la ECACC el 22 de diciembre de 1992 bajo el No. 92122204;

-

una mezcla que comprende al menos un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 y al menos otro anticuerpo monoclonal que reconoce tau o PHF-tau.

10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado adicionalmente porque implica un formato de detección en sándwich que comprende aplicar en forma de recubrimiento y detectar anticuerpos, estando constituidos dichos anticuerpos de recubrimiento por al menos un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, y estando constituidos dichos anticuerpos de detección por al menos un anticuerpo monoclonal capaz de detectar tau humana normal y/o fosforilada anormalmente cuyo epítope es diferente del epítope de cualquiera de los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la reivindicación 1.

11. Un kit para el diagnóstico in vitro de una o más de las enfermedades siguientes: enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, enfermedad de Pick y otros trastornos neurológicos en los cuales está implicada proteína tau fosforilada anormalmente o filamentos helicoidales apareados, caracterizado porque el kit comprende:

-

al menos un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 depositado sobre una microplaca;

-

una preparación para contener la muestra (CSF, suero, o proteínas extraídas de los mismos) para diagnóstico in vitro,

-

un segundo anticuerpo

\bullet

que puede ser un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítope de proteína tau fosforilada anormalmente, o un epítope de cualquier péptido de tau fosforilado que lleva un epítope de PHF-tau, siendo dichos epítopes diferentes del epítope de la invención, o

\bullet

que puede ser un anticuerpo policlonal que reconoce tau fosforilada anormalmente o un anticuerpo policlonal que reconoce un péptido que lleva un epítope de PHF-tau, siendo dicho anticuerpo policlonal capaz de formar un complejo inmunológico con epítopes que son diferentes del epítope de la invención, y estando dicho anticuerpo policlonal preferiblemente purificado por cromatografía de inmunoafinidad utilizando proteína tau inmovilizada;

-

un marcador, sea para marcación específica o acoplamiento con dicho segundo anticuerpo;

-

soluciones tampón apropiadas para realización de la reacción inmunológica entre el anticuerpo monoclonal de la invención y una muestra de ensayo por una parte, y el segundo anticuerpo fijado y el marcador por otra parte,

-

posiblemente un péptido que lleva un epítope de PHF-tau comprendido en la región definida por SEQ ID No. 1 para propósitos estándar, o para propósitos de competición con respecto al antígeno que se busca.

12. Un kit de acuerdo con la reivindicación 11, para la detección o diagnóstico in vitro de una enfermedad cerebral/neurológica que implica proteína tau fosforilada anormalmente, tal como enfermedad de Alzheimer, que comprende al menos una de las combinaciones de anticuerpos monoclonales siguientes:

-

una mezcla que comprende al menos un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 y un anticuerpo monoclonal AT180 producido por el hibridoma depositado en la ECACC el 22 de diciembre de 1992 bajo No. 92122204;

-

una mezcla que comprende al menos un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 y al menos otro anticuerpo monoclonal que reconoce tau o PHF-tau.

13. Un kit de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado adicionalmente porque implica un formato de detección en sándwich que comprende anticuerpos de recubrimiento y de detección, estando constituidos dichos anticuerpos de recubrimiento por al menos un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, y estando constituidos dichos anticuerpos de detección por al menos un anticuerpo monoclonal capaz de detectar tau humana normal y/o fosforilada anormalmente, cuyo epítope es diferente del epítope de cualquiera de los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la reivindicación 1.

14. Un proceso para el diagnóstico in vitro, de un paciente que se sospecha padece la enfermedad de Alzheimer, que comprende:

-

(a) detectar el nivel de PHF-tau en una muestra de CSF obtenida de dicho paciente por fijación inmunológica de anticuerpos monoclonales, capaz de reconocer específicamente en un péptido tau fosforilado una secuencia de aminoácidos Pro-Lys-Thr-Pro-Pro (SEQ ID No. 3), estando dicha Thr(181) fosforilada o anticuerpos monoclonales de acuerdo con la reivindicación 1;

-

(b) comparar el nivel obtenido en (a) con el nivel de PHF-tau presente en muestras de CSF obtenidas de controles, por lo cual una concentración incrementada de tau fosforilada anormalmente en dicho paciente apunta al diagnóstico de enfermedad de Alzheimer.

15. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 14, en el cual dichos anticuerpos monoclonales se combinan ulteriormente con:

-

anticuerpos monoclonales AT180 producidos por el hibridoma depositado en la ECACC el 22 de diciembre de 1992 bajo el No. 92.122.204; y/o

-

anticuerpos monoclonales AT8 producidos por el hibridoma depositado en la ECACC el 8 de octubre de 1991 bajo el No. 91100806.