ES2270120T3 - Vacuna contra infecciones causadas por oncovirus tales como el virus de la leucemia felina. - Google Patents
Vacuna contra infecciones causadas por oncovirus tales como el virus de la leucemia felina. Download PDFInfo
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Abstract
Constructo de expresión de ADN para la expresión de productos génicos del virus de la leucemia felina (FeLV) en células de gatos que comprende una secuencia promotora operable en felinos y como mínimo una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural "gag" y la proteína de membrana "env" del FeLV según Seq. ID6 y Seq. ID9 o según Seq. ID6 y Seq. ID10.
Description
Vacuna contra infecciones causadas por oncovirus
tales como el virus de la leucemia felina.
La invención se refiere a una vacuna basada en
ADN con la que se puede proteger a los gatos contra infecciones
causadas por el virus de la leucemia felina.
El virus de la leucemia felina (FeLV) es un
virus específico de los gatos propagado en todo el mundo
desencadenando enfermedades graves y se cuenta entre las principales
causas de muerte de la población felina. Actualmente existe una tasa
de infección del 12% al 16% tanto en Europa como en EE.UU.
Parte de los gatos puede superar la infección;
en cambio, el virus puede persistir en el organismo de por vida. En
ese caso, los gatos con infección latente actúan como reservorios de
agentes patógenos.
Actualmente no existe ninguna terapia eficaz de
las infecciones por FeLV que conduzca a una curación. En el mejor
de los casos se logra contener la enfermedad durante cierto tiempo.
Determinados agentes quimioterapéuticos también se pueden emplear en
los gatos, pero sus efectos secundarios son muy problemáticos, al
igual que ocurre en la medicina humana. El tratamiento con
interferones todavía se encuentra en fase experimental.
Los virostáticos no pueden inactivar el virus,
por lo que tampoco conducen a una curación.
El control eficaz de las infecciones por FeLV
sólo se puede lograr de forma preventiva mediante la
vacunación.
Las vacunas disponibles actualmente contra el
FeLV se basan en virus FeL inactivados, en proteínas producidas de
forma recombinante, las denominadas vacunas de subunidades, o en la
utilización de vacunas vivas modificadas genéticamente. Sin embargo,
además de que el éxito de la vacunación es insuficiente, estos tipos
de vacunas también presentan diversas otras desventajas.
Por ejemplo, los preparados de virus inactivados
sólo conducen a la deseada inmunidad en parte de los animales
vacunados. Estas vacunas consisten siempre en mezclas proteínicas en
las que antígenos altamente inmunogénicos han de "competir" con
una gran cantidad de otras proteínas por estar presentes en el
sistema inmunológico. Además, después de la vacunación pueden
aparecer fuertes efectos secundarios tales como reacciones alérgicas
y enfermedades autoinmunes.
Actualmente con frecuencia se utiliza una vacuna
recombinante, que consiste en proteínas de envoltura del FeLV,
producida biotecnológicamente y que tiene como adyuvantes hidróxido
de aluminio y saponina. La vacunación con esta vacuna protege contra
la leucosis en un 80 a un 95% de los gatos (Lutz y col., 1991, J.
Am. Vet. Med. Assoc.: 199 (10): 1446-52).
Sin embargo el riesgo de aparición de
fibrosarcomas en la zona de vacunación es un problema. Otra
desventaja de esta vacuna consiste en que la inmunidad obtenida se
basa principalmente en la formación de anticuerpos neutralizadores
del virus, que resultados de investigación más recientes (Flynn y
col., 2000, Immunology 101, 120-125) demuestran que
para desarrollar una inmunidad protectora también es muy importante
la respuesta inmune
celular.
celular.
Si bien la utilización de vacunas vivas ha
demostrado ser eficaz en lo que respecta a la inmunidad lograda,
también entraña el peligro constante de que las cepas virales
utilizadas desarrollen, por mutación o recombinación, nuevas cepas
virales patógenas. También se ha de tener en cuenta que, al utilizar
estas vacunas que contienen todas las estructuras del virus, ya no
se puede diferenciar en base al estado de los anticuerpos si los
animales están infectados o inmunizados. Por estos dos motivos, las
vacunas de este tipo no son adecuadas en la práctica.
Otro ejemplo de vacuna elaborada con virus
capaces de infección o replicación es aquella de un virus de la
viruela del canario que expresa proteínas superficiales de FeLV
recombinantes. En ensayos de infecciones se logró proteger a un 83%
de los animales frente a la infección (Jarret y col., 1993, J. of
Virology: 2370-2375). Sin embargo, esta vacuna
presenta las desventajas de las vacunas vivas en lo que respecta a
las recombinaciones imprevisibles; además es relativamente costosa
y, en consecuencia, cara de fabricar y caracterizar.
Además de estas vacunas recombinantes clásicas y
modernas, también existe la posibilidad de una vacunación con
constructos de expresión de ADN. En este caso, al gato vacunado sólo
se le administra la información de determinadas partes inmunogénicas
del agente patógeno en forma de ADN. Después de la vacunación, las
células del gato vacunado expresan los antígenos del FeLV, con lo
que estimulan una respuesta inmune contra el virus.
Esta posibilidad de obtener una respuesta inmune
contra un antígeno mediante la inyección de constructos de
expresión de ADN codificadoras de dicho antígeno fue publicada por
vez primera por Tang y Ulmer en relación con ratones (Tang y col.,
1992, Nature 365, 152-154; Ulmer y col., 1993,
Science 259, 1745-1749), y desde entonces ha sido
probada en gran cantidad de especies. Es de suponer que el principio
general de la vacunación con ácidos nucleicos codificadores de
inmunógenos se puede trasladar a todos los animales superiores. Para
cada uso, los especialistas se enfrentan a una serie de problemas
que, en parte sólo se superan con dificultad, en lo que respecta a
la elección de los antígenos adecuados, su codificación en
secuencias de ácidos nucleicos y la elección del régimen de
vacunación adecuado, por ello hasta ahora ninguna vacuna basada en
ADN ha sido sometida a un ensayo en la fase clínica
2 ó 3.
2 ó 3.
El documento de patente francesa FR 2 751 223
describe la vacunación de gatos con constructos de expresión para
la expresión de los genes "env" y "gag". Sin embargo, la
invención esbozada en dicho documento es meramente hipotética y no
da información suficiente; por ejemplo no muestra ningún tipo de
ensayo de expresión e inmunización ni sus resultados. Se trata de
una solicitud puramente especulativa.
El documento US 6,348,196 da a conocer plásmidos
para la expresión de las proteínas env y/o gag del FeLV. Sin
embargo, los plásmidos de este tipo sólo permiten una tasa de
expresión muy reducida. Debido a la escasa expresión, la
inmunización con los plásmidos según US 6,348,196 sólo es posible
con mucha dificultad o no es posible en
absoluto.
absoluto.
TARTAGLIA (Journal of virology, 1993) da a
conocer un bioconstructo recombinante para la expresión de genes
env y gag. Con este tipo de constructos se puede lograr, de forma
limitada, una inmunización a bajo nivel.
KENSIL y col. (1991) también dan a conocer un
producto farmacéutico de vacunación que incluye proteínas
recombinantes. La inmunización de animales lograda con los productos
farmacéuticos dados a conocer por KENSIL y col. es insuficiente.
El documento US 6,348,196 también da a conocer
un producto para la inmunización de gatos, pero éste tampoco
permite la inmunización segura de los animales.
ROBINSON (2002) da a conocer diferentes
tecnologías y vectores para vacunas del SIDA, que principalmente
incluyen la proteína gag.
En el documento WP 00/15824 se dan a conocer
métodos de transferencia para ácidos proteicos específicos. Dicha
publicación también da a conocer una transferencia genética acoplada
con péptidos en relación con una inmunización con ADN.
En las reseñas de ROBINSON arriba mencionadas se
hace referencia a las publicaciones de MEGEDE y col. (2000) y HUANG
y col. (2001). Estas publicaciones dan a conocer una optimización de
codón en genes virales para la utilización de éstos en vacunas de
ADN.
A pesar de las diferentes formas de abordar el
problema y de las diferentes estrategias de las publicaciones arriba
mencionadas, todas tienen la misma desventaja técnica: con ellas no
se puede lograr ninguna inmunización satisfactoria del organismo
diana, en particular de gatos.
Son conocidos diversos intentos de inmunización
con ADN en el campo del FeLV, que por cierto no han tenido un éxito
convincente (Jarrett y col., 2000 Immunology 101,
120-125). En el trabajo anteriormente mencionado se
inoculó genoma completo con una deleción de polimerasa como
constructo de expresión. Sin embargo, el éxito clínico de la
vacunación no se tradujo en una protección de los gatos frente a la
infección y viremia. Además de esta desventaja práctica de dicho
ensayo de vacunación, la utilización de mutantes de deleción o su
genoma para la vacunación también tiene la desventaja de entrañar el
peligro de que a partir de un virus sometido a deleción se formen
nuevos patógenos infecciosos por recombinación con secuencias
virales endógenas o exógenas.
A diferencia de este trabajo de Jarrett, el
objetivo de los esfuerzos de la presente invención consistía en la
expresión única de antígenos aislados del FeLV. Sin embargo, los
ensayos preliminares mostraron que mediante la inoculación de
constructos de expresión codificadores de secuencias de tipo salvaje
homólogas del gen "env" y "gag" de FeLV bajo el control
del promotor de actividad inmediata de citomegalovirus (CMV) no se
provocaba ninguna producción de anticuerpos en gatos. Además, otros
ensayos demostraron que las secuencias correspondientes no se
expresaban o sólo se expresaban en una medida muy reducida en líneas
celulares humanas y en líneas celulares de gatos. Este fenómeno es
conocido para el caso de secuencias del VIH y otros lentivirus
(Wagner y col., 2000, Hum Gene Ther 11 (17),
2403-2413). En este contexto, la expresión de las
secuencias de tipo salvaje en la célula infectada depende de la
expresión precedente de la proteína codificada viral "rev".
El control de expresión del retrovirus FeLV, no
perteneciente a la clase de los lentivirus, es desconocido y
todavía no se ha mostrado ni postulado en la literatura ningún
mecanismo similar al control de "rev".
También es sabido que optimizando el uso de
codón (Codon Usage Optimization) dentro del constructo de
expresión en el codón utilizado, preferentemente en mamíferos, se
puede aumentar considerablemente la expresión de proteínas (Grantham
y col., Nucleic Acids Res 1980, 9:1893-912). Este
método ya se ha utilizado con éxito para aumentar la expresión de
diferentes proteínas estructurales virales del VIH-1
y el VIS. Su efecto se basa en rodear las vías de transporte
dependientes de "rev" para la transcripción rica en AT de esta
proteína tardía en el ciclo de replicación de los lentivirus. De
este modo, mediante la optimización de codón de las secuencias de
ADN de la proteínas "env" y "gag" del VIH humano, se han
logrado títulos de anticuerpos contra estos antígenos sintéticos en
ratones muy superiores a los que se obtienen mediante las secuencias
de tipo salvaje (Haas y col., 1998, J. Virol. 72:
1497-503, Wagner y col., Hum Gene Ther. 2000,
17:2403-13). Los documentos WO 00/029561 y WO
97/48370 también dan a conocer la preparación y el uso de secuencias
optimizadas de este tipo para la vacunación contra el
VIH-1.
Otro problema consiste en la aplicación del ADN
codificante de los antígenos inmunogénicos o de parte de ellos. Una
desventaja de los vectores empleados momentáneamente en el
transporte de ADN (transfección) consiste en que o bien se utilizan
vectores de origen viral, que plantean problemas desde el punto de
vista de la seguridad (Lehrman, 1999, Nature 401:
517-518), o bien se utilizan plásmidos. Dado que los
plásmidos se obtienen mediante fermentación bacteriana, además del
gen deseado contienen el ADN necesario para su multiplicación y
selección, y normalmente también genes de resistencia contra
antibióticos, utilizados durante la fermentación. Esta problemática
se discute detalladamente en el documento WO 98/21322. En él se
indica que cuando se utilizan constructos de expresión de genes
basados en plásmidos-ADN existe un riesgo inherente
y no justificable de propagación de genes de resistencia a
antibióticos, sobre todo en caso de vacunaciones preventivas a gran
escala.
Otro tipo de vector de ADN consiste en
constructos de ADN minimalistas cerrados de forma covalente, tal
como se dan a conocer en el documento EP 0 914 318 B1. Sobre todo su
utilización en forma de constructos de ADN acoplados con péptidos
conduce a una respuesta inmune sorprendente, mejorada
cualitativamente en comparación con plásmidos-ADN no
modificado (véanse también DE 101 56 679.4 y DE 101 56 678.6).
Además de las desventajas derivadas de los
métodos de transferencia genética utilizados hasta ahora, todavía no
se ha logrado desarrollar una vacuna eficaz y segura contra el FeLV.
Hasta la fecha, el tratamiento de las infecciones por FeLV se
limita a reforzar las defensas de los animales y a tratar
infecciones concomitantes y secundarias. Las vacunas existentes
acarrean los efectos secundarios indicados en la introducción.
Partiendo de este estado actual de la técnica,
el objetivo de la presente invención consiste en poner a
disposición una vacuna que proteja a los gatos frente a infecciones
por FeLV y también herramientas de diagnóstico
adecuadas.
adecuadas.
De acuerdo con la invención, este objetivo se
logra inmunizando los gatos con una mezcla (cóctel) de secuencias
de ADN producidas sintéticamente con codón y señal de empalme
optimizados que codifican proteínas estructurales ("gag") y
también la proteína de membrana más importante ("env") del FeLV
según Seq. ID6 y Seq. ID9, o según Seq. ID6 y Seq. ID10.
Durante la optimización de codón y empalme de
las secuencias de ADN utilizadas también se obtuvieron secuencias de
ADN mutagenizadas que condujeron a la sustitución de aminoácidos
individuales en las proteínas estructurales ("gag") y en la
proteína de membrana más importante ("env") del FeLV.
Sorprendentemente, estas proteínas con secuencias de aminoácidos
modificadas presentaban las ventajas según la invención. Por
consiguiente, en el sentido de esta invención, la optimización de
codón y empalme es una estrategia para modificar la secuencia de
aminoácidos de las proteínas estructurales ("gag") y también de
la proteína de membrana más importante ("env") del
FeLV.
FeLV.
En la invención se utilizan los siguientes
términos:
\vskip1.000000\baselineskip
- "env":
- Secuencia de genes codificadora de la proteína de envoltura viral de la cápside interna del virus de la leucemia felina.
- "gag":
- Secuencia de genes codificadora de la proteína estructural viral de la cápside interna del virus de la leucemia felina.
- FeLV:
- Virus de la leucemia felina.
- WT:
- Tipo salvaje
- WT "env":
- Tipo salvaje de la secuencia de ADN "env", tomada del banco de datos NCBI, nº acc. M12500.
- WT "gag":
- Tipo salvaje de la secuencia de ADN "gag", obtenida de la sangre de gatos infectados (véase el Ejemplo 1). No se trata de una secuencia de un banco de datos, pero es homóloga a una de ellas.
- NLS:
- Secuencia de localización de núcleo (\underbar{N}uclear \underbar{L}ocalization \underbar{S}ignal).
- ODN:
- \underbar{O}ligo\underbar{d}esoxi\underbar{n}ucleótido.
- PCR:
- Reacción en cadena de polimerasa.
- LeadFeLVenv (FeLVenv):
- Secuencia de FeLV "env" con secuencia de señal.
- LeadFeLVenvgp85 (FeLVenvgp85):
- Secuencia de FeLV "env" (gp85) con secuencia de señal.
La secuencia de genes "gag" codifica la
proteína estructural viral de la cápside viral interna, la
secuencia de genes "env" la de la proteína de envoltura viral.
La proteína que posee la mayor inmunogenicidad de las proteínas
codificadas en la secuencia "env" es la glicoproteína gp70. En
el organismo del gato se forman anticuerpos neutralizadores del
virus contra la gp70. Estos anticuerpos constituyen la primera
respuesta inmune después de la penetración del agente patógeno en el
cuerpo y, en determinadas circunstancias, ya es suficiente para
superar la infección.
Existe una amplia controversia sobre si son más
adecuadas las proteínas de membrana o las proteínas secretoras para
inducir anticuerpos neutralizadores de virus. Por este motivo se
produjeron dos constructos codificantes de "env" diferentes.
Dado que, como es sabido, la secuencia p15 de la secuencia de genes
"env" contiene como mínimo una sección de secuencia con efecto
inmunomodulador que inhibe la formación de anticuerpos (Haraguchi y
col., 1997, Journal of Leukocyte Biology, 61,
654-666), además de un constructo codificante de
gp70 y p15 (gp85) también se produjo otro que sólo contenía la gp70
y, en consecuencia, conducía a la expresión de la proteína
"env" secretora sin partes transmembrana.
Por consiguiente, una vacuna que puede inducir
tanto anticuerpos neutralizadores de virus contra la gp70 como una
respuesta inmune mediada por células T constituye una clara mejora
frente a las vacunas obtenidas hasta ahora y, en caso dado, también
podría utilizarse para la terapia de gatos infectados.
Las secuencias de tipo salvaje de "gag" y
"env" se optimizaron para expresar más antígeno in vivo
y, en consecuencia, provocar una respuesta inmune más fuerte, la
cual se manifiesta en una protección eficaz y duradera frente a la
infección por FeLV. Por optimización se ha de entender la adaptación
de codón, también denominada
"Codon-Usage-Optimization".
Cada aminoácido se puede codificar mediante
varios codones. La frecuencia con la que se leen los codones
individuales durante la transcripción varía mucho entre virus,
bacterias y vertebrados. La frecuencia de los ARNt en la célula
también varía de igual forma. Los genomas virales tienen en parte
una frecuencia de utilización de codones diferente de la de la
célula huésped, lo que posiblemente sea un elemento de control de
expresión de los virus. Mediante una adaptación de la secuencia al
patrón de utilización de codones específico del huésped se pueden
eludir estos mecanismos de control virales y aumentar
considerablemente la expresión de antígeno.
Por consiguiente, un objetivo de los
experimentos consistía en lograr una expresión mucho más fuerte de
los antígenos mediante transcripción de las secuencias virales en
secuencias que implican una utilización de codones óptima para
genomas de vertebrados. Para ello se desarrolló una estrategia de
clonación que posibilitó la síntesis de esta secuencia de ADN
optimizada a partir de oligonucleótidos.
Las secuencias sintéticas se insertaron en
plásmidos, se multiplicaron en E. coli, se secuenciaron para
el control y a continuación se sometieron a transfección en una
línea celular de gato para probar la expresión de las proteínas
codificadas.
La identificación de la expresión de los
antígenos se llevó a cabo con ayuda del Westernblot.
La identificación de la expresión de las
proteínas por las secuencias de tipo salvaje (WT) del FeLV de
"env" y "gag" se llevó a cabo con ayuda del Westernblot.
Mediante precipitación inmune sólo se pudieron identificar
"env" y "gag" por bandas muy débiles. Sorprendentemente,
lo mismo ocurría en el caso de las secuencias "env" con
optimización de codón. La optimización de codón sólo condujo a una
expresión claramente mejorada en el caso de "gag", como se
muestra en la Figura 1. Después de comprobar otras numerosas
hipótesis que debían explicar la expresión deficiente de los genes
sintéticos, se estudió la secuencia "env" sintética en cuanto
a señales de empalme (splice-sites) predichas
por bioinformática. Una serie de las señales de empalme predichas
por el programa utilizado (Compling PPC, Mac Molly Tetra Versión
3.10a (Softgene GmbH)) se eliminó por mutación puntual para
verificar la hipótesis de que la aparición de estas estructuras
dificulta la expresión de los genes según el promotor utilizado.
Sorprendentemente, gracias a esta medida se pudo identificar
"env" en el Westernblot en forma de una banda proteínica fuerte
(véase la Figura 2). Las secuencias de antígeno sintéticas según la
invención muestran, en bandas más fuertes, la expresión eficaz y
reforzada de los antígenos.
Generalmente se supone que existe una relación
entre la intensidad de expresión de un sistema de expresión y la
intensidad resultante de la respuesta inmune, aunque numerosos
informes sugieren que ni existe una relación lineal ni cada
tratamiento con vectores de expresión implica forzosamente una
inmunidad de la intensidad deseada (Wherry y col., Journal of
Immunology 2002, 168 pp 4455-4461). Por ello,
después de disponer de los resultados de expresión in vitro,
se inmunizaron ratones con constructos de expresión acoplados con
péptidos que codificaban el "env" con optimización de codón y
optimización de señal de empalme. Las ventajas de estos constructos
acoplados con péptidos en la provocación de una respuesta inmune se
explican detalladamente en las publicaciones EP 0 941 318 B1 y DE
101 56 678 A1. Las dos secuencias codificadoras de "env" según
la invención (Seq. ID7, 8, y también 9 y 10) se utilizaron para
aclarar la importancia inmunológica de la proteína p15 del
"env" en la provocación de una respuesta inmune. Los sueros de
los ratones inmunizados se examinaron mediante Westernblot para
determinar la presencia de anticuerpos específicos contra la
proteína del virus FeL "env". El nivel de anticuerpos después
de la segunda inmunización en la semana 4 demuestra que los
constructos sintéticos también producen in vivo una fuerte
estimulación de la formación de anticuerpos. Cinco de seis ratones
del grupo 4 mostraron una fuerte respuesta inmune a la secuencia de
antígeno según la invención. En cambio, el WT (grupo 1) sólo produjo
una débil respuesta de anticuerpos en dos de seis animales (véase la
Figura 3).
Como constructos de expresión de ADN se pueden
utilizar plásmidos, pero de acuerdo con la invención
preferentemente se utilizan constructos de expresión de genes
minimalistas inmunológicamente definidos. Se trata de casetes de
expresión lineales, cerrados de forma covalente, que consisten
únicamente en el promotor CMV, un intrón, la secuencia de genes
correspondiente y una secuencia de poliadenilación. Estos
constructos de ADN minimalistas cerrados de forma covalente se
denominarán en lo sucesivo "vectores midge" (MIDGE:
MINIMALISTIC IMMUNOLOGICALLY DEFINED
GENE EXPRESSION VECTOR); véase EP 0 941 318 B1. Los
constructos midge tienen la ventaja de que permiten prescindir de
estructuras que no son esenciales para su efecto medicinal, lo que
evita las desventajas de los transportadores de genes
convencionales.
Para la transfección se pueden utilizar los
métodos biológicos, químicos y/o físicos que forman parte del
estado actual de la técnica, por ejemplo transfección mediante
transferencia balística. En una forma de realización preferente de
la invención, la transfección se lleva a cabo por inyección
intradérmica mediante jeringas o aparatos de inyección sin
aguja.
Un objeto de la invención consiste en
constructos de expresión que conducen a la expresión de antígenos
de FeLV en células de mamíferos. Por consiguiente, la invención pone
a disposición una vacuna que protege a los gatos frente a
infecciones por el FeLV teniendo en cuenta el aspecto de la
seguridad. De acuerdo con la invención se prescinde de adyuvantes
convencionales, con lo que se puede excluir el peligro de formación
de fibrosarcomas en el punto de inyección.
Otros métodos ventajosos son aquellos métodos de
transfección biológicos como transferencia genética acoplada con
péptidos. En este caso, por ejemplo un constructo de expresión de
ADN que codifica como mínimo la secuencia "env" según la
invención y como mínimo la secuencia "gag" según la invención
de FeLV se une de forma covalente con un oligopéptido que,
preferiblemente, es la secuencia de localización de núcleo
(Nuclear Localization Signal = NLS) del virus del simio
VS-40.
Después de los resultados positivos obtenidos en
el experimento con ratones, se inmunizaron gatos con los
constructos de expresión y se examinó su estado de anticuerpos.
El protocolo de secuencias adjunto, que forma
parte de la solicitud y de la presente descripción, reproduce las
siguientes secuencias:
- \underbar{Seq. ID}
- \underbar{Nombre/descripción de la secuencia}
- Seq. ID1
- Secuencia de ADN del tipo salvaje del gen "env".
- Seq. ID2
- Secuencia de ADN del tipo salvaje del gen "gag".
- Seq. ID3
- Secuencia proteínica del tipo salvaje del gen "env".
- Seq. ID4
- Secuencia proteínica del tipo salvaje del gen "gag".
- Seq. ID5
- Secuencia de ADN del gen "gag" mutágeno.
- Seq. ID6
- Secuencia proteínica del gen "gag" mutágeno.
- Seq. ID7
- Secuencia de ADN del gen "env" mutágeno (gp85). La secuencia de gp70 se prolonga en este caso con la secuencia de nucleótidos codificadora de la proteína inmunogénica p15.
- Seq. ID8
- Secuencia de ADN del gen "env" mutágeno (gp70).
- Seq. ID9
- Secuencia proteínica del gen "env" muta´geno (gp85).
- Seq. ID10
- Secuencia proteínica del gen "env" mutágeno (gp70).
- Seq. ID11
- Secuencia de ADN del tipo salvaje del gen "env" (gp70), tomada de la Seq. ID1 (banco de datos NCBI, nº acc. M12500).
- Seq. ID12 a Seq. ID40
- Secuencias de los cebadores utilizados según los siguientes ejemplos.
Se describe un constructo de expresión de ADN
para la expresión de productos génicos del virus de la leucemia
felina (FeLV) en células de gatos, que consiste en una secuencia
promotora operable en felinos y como mínimo una secuencia de
nucleótidos que es similar a una secuencia de nucleótidos de tipo
salvaje codificadora de una proteína estructural ("gag") y/o
proteína de membrana ("env") originales del FeLV. Dicha
secuencia de nucleótidos de FeLV está modificada y no presenta
ninguna secuencia aceptora y/o donante de empalme abierta u oculta,
y codifica una proteína en gran medida homóloga, pero no idéntica, a
la proteína estructural original ("gag") y/o a la proteína de
membrana original ("env") de FeLV, o una parte de la misma en
gran medida homóloga, pero no idéntica. Las proteínas en gran medida
homólogas, pero no idénticas, a la proteína estructural original
("gag") y/o a la proteína de membrana original ("env") de
FeLV presentan una homología de como mínimo un 98% con el tipo
salvaje correspondiente. Es preferente un constructo de expresión
que contenga las secuencias Seq. ID5, Seq. ID7 y/o Seq. ID8.
Las proteínas estructurales y/o de membrana son
codificadas total o parcialmente por las secuencias de nucleótidos
correspondientes. En el caso del constructo de expresión se trata de
un plásmido o de un constructo en la que las secuencias de
polinucleótidos inmunizadoras están presentes como constructos de
expresión, que consisten en moléculas de ácido desoxirribonucleico
lineales cerradas de forma covalente que presentan una zona de
cadena doble lineal, estando unidas las cadenas simples que forman
la cadena doble mediante bucles cortos de cadena simple de
nucleótidos de ácido desoxirribonucleico, y consistiendo las cadenas
simples que forman la cadena doble únicamente en la secuencia
codificadora bajo el control de un promotor operable en el animal a
vacunar y una secuencia de terminación.
Para una mejor transfección, el constructo de
expresión puede estar unido de forma covalente a uno o más péptidos.
Es preferible un péptido de 3 a 30 aminoácidos de los que como
mínimo la mitad proceden de aminoácidos básicos del grupo de la
arginina y la lisina, en particular un péptido con la secuencia de
aminoácidos PKKKRKV
(prolina-lisina-lisina-lisina-arginina-lisina-valina).
No obstante, de acuerdo con la invención también
están previstas proteínas que constituyen una proteína (Seq. ID6) en
gran medida homóloga con la proteína estructural original
("gag") del virus de la leucemia felina (FeLV), o con la
proteína de membrana original gp85 ("env") del FeLV (Seq. ID9)
o con la proteína de membrana original gp70 ("env") del FeLV
(Seq. ID10). Estas proteínas se pueden utilizar para producir
anticuerpos (monoclonales o policlonales), los cuales a su vez
forman parte del kit para el diagnóstico de infecciones con
el virus de la leucemia felina en gatos.
El constructo de expresión según la invención
está previsto para ser un componente de un medicamento, en
particular una vacuna para producir una inmunidad preventiva y/o
terapéutica en felinos, en particular en gatos.
Las subreivindicaciones y la descripción indican
otras formas de realización ventajosas de la invención. Las figuras
y los ejemplos de realización muestran claramente el efecto
sorprendente del medicamento según la invención (como vacuna para la
terapia contra el FeLV) y también el procedimiento según la
invención. En este contexto se utilizan los siguientes términos:
\vskip1.000000\baselineskip
- Midge-NLS-FeLVenvgp85(-empalme) o Midge-NLS-FeLVgp85(-empalme)
- {}\hskip0.2cm Vector midge acoplado con NLS codificador de la secuencia "env" con {}\hskip0.3cmoptimización de codón y señal de empalme con p15 (gp85)
- Midge-NLS-FeLVenvgp70(-empalme) o Midge-NLS-FeLVgp70(-empalme)
- {}\hskip0.2cm Vector midge acoplado con NLS codificador de la secuencia "env" con {}\hskip0.3cmoptimización de codón y señal de empalme sin p15 (gp70)
- Midge-NLS-WT
- {}\hskip0.2cm Vector midge acoplado con NLS codificador del WT del gen "env"
- mAK vs. gp70
- {}\hskip0.2cm Anticuerpo monoclonal contra gp70
- Control positivo
- {}\hskip0.2cm Vacuna Leucogen
- Tampón
- {}\hskip0.2cm PBS, control negativo
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras muestran:
Figura 1: Comparación de la expresión in
vitro de la proteína "gag" WT y de la proteína "gag"
con optimización de codón. Se aplican lisados celulares de gato que
previamente habían sido sometidos a transfección con los constructos
indicados más abajo. La proteína precursora "gag" tiene un
tamaño de 55 kDa:
Pistas 1 y 2: vectores de expresión
codificadores de "gag" WT.
Pista 3: vectores de expresión codificadores de
"gag" con optimización de codón.
Pista 4: células de gato no infectadas, control
negativo.
Pista 5: vacía.
Pista 6: células de gato infectadas con el
virus, control positivo.
Pista 7: marcador de proteína Boa.
La expresión a través de WT conduce a bandas
proteínicas muy débiles (1 y 2). En cambio, mediante la secuencia
según la invención se logra una expresión fuerte (3). Como
comparación se utilizan células de gato infectadas (6). El
"gag" designa una proteína precursora que se descompone con
ayuda de proteasas, en la célula infectada, en proteínas
estructurales de FeLV. La proteína estructural con el efecto
inmunogénico más fuerte es la p27. Por esta razón, un antisuero
contra el virus total la reconoce muy bien. Esto explica que en la
pista 6 se pueda reconocer tanto una banda de 55 kDa correspondiente
al "gag" total como una banda de 27 kDa. En cambio, la pista 3
no contiene ninguna partícula viral sino células transfectadas con
el gen "gag", lo que evidentemente no conduce a la
descomposición con ayuda de proteasas del gen "gag" en las
proteínas virales, sino a una degradación no específica de toda la
proteína precursora por proteasas propias de la célula.
Figura 2: Comparación de la expresión in
vitro del gen "env" WT y de la secuencia "env" con
optimización de codón y de señal de empalme (gp85). Se aplican
lisados celulares de gato que previamente habían sido sometidos a
transfección con los siguientes constructos:
Pista 1: marcador de proteína Boa.
Pista 2: células de gato no infectadas, control
negativo.
Pista 3: células de gato infectadas con el
virus, lisado, control positivo.
Pista 4: vacía.
Pista 5: células de gato infectadas con el
virus, precipitado, control positivo.
Pista 6: células de gato no infectadas,
precipitado, control negativo.
Pista 7: otro control negativo para la detección
específica de "env".
Pista 8: vacía.
Pista 9: vectores de expresión codificadores de
FeLVenvgp85(-empalme) con optimización de codón y de señal de
empalme.
Pista 10: vacía.
Pista 11: vectores de expresión codificadores de
FeLVenvgp70(-empalme) con optimización de codón.
El control en la pista 5 produce una clara banda
proteínica que se puede utilizar como control positivo para la
expresión de envgp85. La pista 9 muestra que la secuencia
FeLVenvgp85(-empalme) según la invención conduce a la expresión de
la proteína gp85. En la pista 11 se aplica la FeLVenvgp70(-empalme)
según la invención. La ausencia de la banda de 70 kDa se debe a que,
a diferencia de la gp85, la envgp70 es una proteína secretora que
apenas o difícilmente se puede detectar en el lisado celular.
Figura 3: Resultados in vivo después de
la inmunización de ratones con constructos de expresión
codificadoras de "env". Son aplicables los siguientes
significados:
A: control positivo
B: tampón
Esta determinación de anticuerpos se llevó a
cabo en la semana 4 después de la segunda inmunización. En el grupo
3, 3 de 6 ratones son positivos en anticuerpos (pistas de gel bajo
la flecha:
Midge-NLS-FeLVgp85(-empalme)). En el
grupo 4, 5 sueros son muy positivos y 1 ligeramente positivo (pistas
de gel bajo la flecha:
Midge-NLS-FeLVgp70
(-empalme)). En cambio, los animales del grupo 5 inmunizados con WT sólo presentan señales de anticuerpos muy ligeramente positivas (pistas de gel bajo la flecha: Midge-NLS-WT). El ensayo muestra que las secuencias optimizadas también conducen in vivo a una formación de anticuerpos claramente intensificada en comparación con el WT y confirma los resultados de los experimentos in vitro.
(-empalme)). En cambio, los animales del grupo 5 inmunizados con WT sólo presentan señales de anticuerpos muy ligeramente positivas (pistas de gel bajo la flecha: Midge-NLS-WT). El ensayo muestra que las secuencias optimizadas también conducen in vivo a una formación de anticuerpos claramente intensificada en comparación con el WT y confirma los resultados de los experimentos in vitro.
Figura 4: Comparación de secuencias de ADN del
tipo salvaje del gen "gag" (Seq. ID2) y del gen "gag" con
optimización de codón (Seq. ID5). Similitud: 74,51%.
\newpage
Figura 5: Comparación de secuencias de ADN del
tipo salvaje "env" (región gp70 de la Seq. ID1) y del gen
"env" con optimización de codón y señal de empalme (gp70; Seq.
ID8). Similitud: 75,75%.
Figura 6: Comparación de secuencias de ADN del
tipo salvaje del gen "env" (Seq. ID1) y del gen "env" con
optimización de codón y señal de empalme (gp85) (Seq. ID7).
Similitud: 80,25%.
Figura 7: Comparación de secuencias proteínicas:
secuencia proteínica de tipo salvaje del gen "gag" (Seq. ID4)
frente a la secuencia proteínica del gen "gag" con optimización
de codón (Seq. ID6). Similitud: 98,62%.
Figura 8: Comparación de secuencias proteínicas:
tipo salvaje de la proteína "env" (Seq. ID3) frente a la
secuencia proteínica de la proteína "env" con optimización de
codón y señal de empalme (gp70) (Seq. ID10). Similitud: 98,75%.
Figura 9: Comparación de secuencias proteínicas:
tipo salvaje de la proteína "env" (Seq. ID3) frente a la
secuencia proteínica de la proteína "env" con optimización de
codón y señal de empalme (gp85) (Seq. ID9). Similitud: 98,60%.
Los resultados demuestran que las secuencias de
ADN con optimización de codón y señal de empalme tanto del gen
"env" como del gen "gag" de FeLV presentan una homología
de como mínimo un 74% con respecto al tipo salvaje correspondiente.
De ello resultan secuencias proteínicas de la proteína "env" y
"gag" con una homología de como mínimo un 98% con respecto al
tipo salvaje correspondiente. Evidentemente se pueden concebir otras
optimizaciones de la secuencia de ADN del gen "env" y del gen
"gag" de FeLV que conduzcan a un resultado similar, es decir, a
una alta homología entre el tipo salvaje original y la secuencia
proteínica (resultante de la optimización). Estas optimizaciones
también están incluidas en el sentido de la invención.
Las secuencias de tipo salvaje de los antígenos
seleccionados, en particular para el gen "gag", se obtuvieron
de sangre de gatos infectados. La secuencia de ADN para "env"
WT está reproducida en la Seq. ID 1 (banco de datos NCBI, nº acc.:
M12500) y la "gag" WT en la Seq. ID 2. Las secuencias de
aminoácidos correspondientes están reproducidas en la Seq. ID 3
("env") y la Seq. ID 4 ("gag").
Para eliminar dos sitios de corte Eco 31l se
llevaron a cabo 3 PCRs con los siguientes cebadores de
mutación:
\vskip1.000000\baselineskip
gag-mut1-rneu
(Seq. ID12):
- AATTAAGAGCTCCACGTCTCCCCCCGCTAACAGCAACTGGCG
\vskip1.000000\baselineskip
gag-mut2-1 (Seq.
ID13):
- AATTAAGAGCTCCAGGTCTCCGGGGCTCCGCGGGGCTGCAAGACG
\vskip1.000000\baselineskip
gag-mut3-r (Seq.
ID14):
- AATTAAGAGCTCCACGTCTCCTTCCCTTTTGTTGTATATCTTTTCTGC
\vskip1.000000\baselineskip
gag-mut4-1 (Seq.
ID15):
- AATTAAGAGCTCCAGGTCTCCGGAAACCCCAGAGGAAAGGGAAGAAAG
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la ligación de las tres secuencias
obtenidas se llevó a cabo una PCR con los cebadores:
| Felvgag-I (Seq. ID16): | CGGATAAGGTACCATGGGCCAAACTATAACTACC | |
| Felvgag-r (Seq. ID17): | TTCTCAGAGCTCTTAGAGGAGAGTGGAGTTGGCGGGT |
| envl (Seq. ID18): | CGGATAAGGTACCATGGCCAATCCTAGTCCACC | |
| envr (Seq. ID19): | AGTTCTCAGAGCTCTTAGGCTGTTTCAAGGAGGGCTT |
En la Codon Usage Database
(http://www.kazusa.or.ip/codon/) se obtuvo la tabla de uso
de codones para gatos. Para cada aminoácido de las dos secuencias WT
se utilizó el codón que codifica con más frecuencia dicho
aminoácido. Existían las siguientes limitaciones:
Cuando un aminoácido se repetía de forma
consecutiva más de 3 veces, a partir del cuarto aminoácido se
utilizaba el segundo codón más frecuente. De este modo se pretendía
evitar la repentina reducción extrema de los ARNt y asegurar la
eficacia de la traducción.
Para excluir la posibilidad de efectos
inmunoestimuladores incontrolados se evitaron las secuencias con
una C y una G siguiente.
Para evitar sitios de corte de Eco31I, KpnI y
SacI, todas las secuencias con la sucesión de bases GAGCTC,
GG
TACC, GGTCTC y GAGACC se eliminaron eligiéndose otros codones alternativos también utilizados con frecuencia.
TACC, GGTCTC y GAGACC se eliminaron eligiéndose otros codones alternativos también utilizados con frecuencia.
Se encargaron oligonucleótidos con una longitud
de entre 18 y 28 bases (Tip-Molbiol). En total se
unieron entre sí 51 oligonucleótidos por reasociación y ligación. El
excedente era de 4 bases. Siempre se tuvo cuidado de que los
excedentes sólo se encontraran una vez y no fueran palindrómicos.
Cada oligonucleótido individual se hibridó con una cadena y una
contracadena calentando a 80ºC los dos oligonucleótidos individuales
(cadena y contracadena) mezclados con un tampón de quinasa y
enfriándolos después lentamente a temperatura ambiente. Después se
añadió ATP y polinucleótido-quinasa (PNK) y los
oligonucleótidos se fosforilaron durante una hora. A continuación,
en un primer paso se reunieron y ligaron los oligonucleótidos
adyacentes en cada caso (oligonucleótidos 1 + 2, oligonucleótidos 3
+ 4). Después de 1 h de ligación se tomó una parte alícuota de la
carga de ligación de los oligonucleótidos 1 + 2 y una parte alícuota
de la carga de ligación 3 + 4 y las dos partes se reunieron. Se tomó
una parte alícuota de la última carga de ligación y se llevó a cabo
una PCR con cebadores de flanco. Si se formaba una PCR con la
longitud correcta esperada, se sometía a clonación intermedia con
TA-Cloning en el vector TOPO pCR 2.1 controlando la
secuencia. Esto se llevó a cabo de forma análoga para los otros
fragmentos del gen completo. Se obtuvieron 4 fragmentos. Los
fragmentos individuales del plásmido sometido a clonación intermedia
se recortaron con EcoRI y, tras digerirlos con Eco311, se ligaron
con ligasa. El producto de ligación completo con la longitud
correcta se sometió a digestión con BamHI y SacI y se clonó en el
vector igualmente recortado después de extracción con gel en
pMCV1.4. A continuación, la secuencia se controló mediante
secuenciación. El plásmido formado se denominó
pMCV1.4-FeLVenv.
Cebadores para los 4 fragmentos reunidos:
Fragmento 1:
| Cebador izdo. (Seq. ID20): | ATATTGGATCCCATGGCCAACCCCTCCC | |
| Cebador dcho. (Seq. ID21): | ATTATGGTCTCCTGCTGCTTCTTCCTGTCTGTGG |
\vskip1.000000\baselineskip
Fragmento 2:
| Cebador izdo. (Seq. ID22): | TAATAGGTCTCCAGCAGCAGACCTACCCCT | |
| Cebador dcho. (Seq. ID23): | TAATAGGTCTCTGTGAACAGGGCAATGGGGTCA |
\vskip1.000000\baselineskip
Fragmento 3:
| Cebador izdo. (Seq. ID24): | TATTTGGTCTCTTCACAGTGTCCAGGCAGGTGTC | |
| Cebador dcho. (Seq. ID25): | TATTAGGTCTCAGCTTGTGCTGGGGGGTGG |
\vskip1.000000\baselineskip
Fragmento 4:
| Cebador izdo. (Seq. ID26): | AATAAGGTCTCCAAGCTGACCATCTCTGAGGTGT | |
| Cebador dcho. (Seq. ID27): | ATTAAGAGCTCTCAGGCTGTTTCCAGC |
Secuencia completa:
| Cebador izdo. (Seq. ID20): | ATATTGGATCCCATGGCCAACCCCTCCC | |
| Cebador dcho. (Seq. ID27): | ATTAAGAGCTCTCAGGCTGTTTCCAGC |
Para procesar con éxito la proteína "env"
se clonó una secuencia de señal (secuencia líder) delante de la
secuencia "env" con optimización de codón. Esta secuencia de
señal se preparó mediante reasociación y ligación a partir de un
total de 8 ODN con una longitud de entre 22-30 pb.
Tras el último paso de ligación se llevó a cabo una PCR para
amplificar la secuencia líder.
Cebadores para la secuencia de señal
completa:
| Cebador izdo. (Seq. ID28): | ATTGCCGGTACCATGGAGTCCCCCACCCACC | |
| Cebador dcho. (Seq. ID29): | ATCAGAGGTCTCCCATGCCAATGTCAATGGTGAAC |
En el extremo 3' del producto de PCR se generó
una secuencia de reconocimiento Eco31I que, después de su
digestión, produce un excedente que es inverso complementario al
excedente del siguiente producto de PCR producido en el extremo 5'
después de la misma digestión.
En el extremo 5' de la secuencia se generó una
secuencia de reconocimiento Eco31I.
Cebadores utilizados:
| Cebador izdo. (Seq. ID30): | GATCTGGGTCTCCATGGCCAACCCCTC | |
| Cebador dcho. (Seq. ID27): | ATTAAGAGCTCTCAGGCTGTTTCCAGC |
Después de digerir los dos productos PCR con
Eco311, éstos se purificaron y se ligaron entre sí. El producto de
ligación se utilizó en una PCR en la que se generó una secuencia de
reconocimiento para KpnI en el extremo 5' y otra para SacI en el
extremo 3'.
Cebadores utilizados:
| Cebador izdo. (Seq. ID28): | ATTGCCGGTACCATGGAGTCCCCCACCCACC | |
| Cebador dcho. (Seq. ID27): | ATTAAGAGCTCTCAGGCTGTTTCCAGC |
El producto de PCR se sometió a digestión con
KpnI y SacI y se clonó en el vector pMCV1.4 cortado del mismo modo.
El plásmido formado se denominó
pMCV1.4-LeadFeLVenv.
Se clonó la poliproteína "env" completa
consistente en gp70 y gp15. Para ello, la secuencia p15 WT del
plásmido pMCV1.4-FeLVenvp15 se amplificó mediante
PCR y se clonó detrás de la secuencia del
pMCV1.4-LeadFeLVenv arriba indicado.
Durante la amplificación del p15 se generó una
secuencia de reconocimiento Eco31I en el extremo 5'.
Cebadores utilizados:
| Cebador izdo. (Seq. ID31): | ATTATGGTCTCGCAGTTCAGACAACTACAAATGGC | |
| Cebador dcho. (Seq. ID32): | AATTATGAGCTCTCAGGGCCTGTCAGGGTC |
\newpage
Se amplificó la secuencia de LeadFeLVenv. En
este proceso se generó una secuencia de reconocimiento Eco31I en el
extremo 3'.
Cebadores utilizados:
| Cebador izdo. (Seq. ID33): | AATTATGGTACCATGGAGTCCCCCACCC | |
| Cebador dcho. (Seq. ID34): | TATAATGGTCTCAACTGGGCTGTTTCCAGCAGGGC |
Después de la digestión de los dos productos de
PCR con Eco31I, éstos se ligaron entre sí. El producto de ligación
se utilizó en una PCR con los siguientes cebadores:
| Cebador izdo. (Seq. ID33): | AATTATGGTACCATGGAGTCCCCCACCC | |
| Cebador dcho. (Seq. ID32): | AATTATGAGCTCTCAGGGCCTGTCAGGGTC |
En este proceso se generó una secuencia de
reconocimiento KpnI en el extremo 5' y una secuencia de
reconocimiento SacI en el extremo 3'. Después de digerir el producto
de PCR con KpnI y SacI, éste se ligó y clonó en el pMCV1.4 cortado
del mismo modo. El plásmido formado se denominó
pMCV1.4LeadFeLVenvgp85.
La secuencia de ADN del LeadFeLVenv se comprobó
en http://www.fruitfly.org/seq tools/splice.html en cuando a
posibles secuencias de señal de empalme
(splice-sites). Entre las bases 100 y 140 se
reconoció un splice-site con una probabilidad
de un 97%. Después de sustituir la base 119 (de A a G = sustitución
AS de Gln a Arg) ya no se detectó ningún
splice-site potencial más (límite inferior =
probabilidad de un 40%). La producción y clonación de la secuencia
mutada se llevó a cabo de la siguiente manera:
PCR para producir la secuencia mutada:
En primer lugar se amplificó mediante PCR un
fragmento (1) consistente en las bases 1-123 del
LeadsynFeLVenv. El cebador de avance utilizado genera en el extremo
5' del producto de PCR la secuencia de reconocimiento de la enzima
de restricción KpnI.
La secuencia del cebador de retroceso se eligió
de tal modo que el producto de PCR presenta la mutación (base 119 =
G). Además, la PCR genera la secuencia de reconocimiento de la
enzima de restricción del sitio Eco31I en el extremo 3' del producto
de PCR. En principio, Eco311 genera un excedente-5'
de las 4 bases 2-5 en la dirección 3' de la
secuencia de reconocimiento.
El excedente-5' de 4 bases
formado después de la digestión del producto de PCR con Eco31I en el
extremo 3' del fragmento 1 corresponde a las bases
120-123 de la secuencia del LeadFeLVenv. Esta
secuencia corresponde a su vez al excedente que también se forma
cuando LeadFeLVenv se corta con la enzima de restricción BgL11, dado
que las bases 1-19- -1-24 del
LeadFeLVenv constituyen la secuencia de reconocimiento de BgLII.
Por consiguiente, en primer lugar se recortan
las bases 1-123 del constructo
pMCV1.4-LeadFeLVenv mediante KpnI y BgLII.
Después de la digestión del fragmento 1 del
producto de PCR (con mutación de la base 119 = G) con KpnI y Eco31I,
éste se puede ligar y clonar en el
pMCV1.4-LeadFeLVenv cortado y purificado con KpnI y
BgLII. El plásmido resultante se denominó
pMCV1.4-FeLVenvgp70(-empalme).
Cebadores utilizados:
| Cebador izdo. (Seq. ID28): | 5'-ATTGCCGGTACCATGGAGTCCCCCACCCACC | |
| Cebador dcho. (Seq. ID35): | 5'-ATATTAGGTCTCAGATCCGGGGGGGGGAGGG |
Análogamente, el fragmento 1 del producto de PCR
se ligó y clonó en el
pMCV1.4-LeadFeLVenvgp85(-empalme) cortado y
purificado con KpnI y BgLII. El plásmido formado se denominó
pMCV1.4-FeVLenvgp85(-empalme).
La clonación de FeLVgag se llevó a cabo de
acuerdo con los 3 procedimientos descritos más abajo. La secuencia
se produjo a través de oligonucleótidos, que primero se reasociaron
y ligaron en tres fragmentos individuales. La secuencia se compuso
con un total de 2 x 31 oligonucleótidos (cadena de avance y cadena
de retroceso). Los fragmentos se utilizaron como molde en una PCR y
se amplificaron con los siguientes cebadores:
Fragmento 1:
| Cebador izdo. (Seq. ID36): | ATATTGGTCTCAGGAGAGGGACAAGAAGAG | |
| Cebador dcho. (Seq. ID37): | AATATGGTCTCTCAGCCTGCTGGCGATGGGGC |
\vskip1.000000\baselineskip
Fragmento 2:
| Cebador izdo. (Seq. ID38): | ATTATGGTCTCTGCACCTGAGGCTGTACAGGC | |
| Cebador dcho. (Seq. ID39): | AATATGGTCTCGGTGCTCCCTGCCGGCGGGGGTGCA |
\vskip1.000000\baselineskip
Fragmento 3:
| Cebador izdo. (Seq. ID38): | ATTATGGTCTCTGCACCTGAGGCTGTACAGGC | |
| Cebador dcho. (Seq. ID40): | AATATGGTCTCTCTCCTCCTGCCTCTGC |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebadores para todo el fragmento:
| Cebador izdo. (Seq. ID36): | ATATTGGTCTCAGGAGAGGGACAAGAAGAG | |
| Cebador dcho. (Seq. ID40): | AATATGGTCTCTCTCCTCCTGCCTCTGC |
Los fragmentos 1, 2 y 3 se sometieron a
clonación intermedia en el vector TOPO pCR 2.1, a continuación se
digirieron con Eco31I y se extrajeron. El producto de ligación de 1,
2 y 3 se digirió con KpnI y SacI y se clonó en pMCV 1.4. El plásmido
resultante se denominó pCMV1.4-FeLVgag.
Células felinas de la línea celular f3201 se
sometieron a transfección mediante electroporación a 250 V y 1.050
\muF con los plásmidos
pMCV1.4-FeLVenvgp85(-empalme),
pMCV1.4-FeLVenvgp70(-empalme), FeLVgag y los
plásmidos pMOK contenidos en el WT para "env" y "gag".
La identificación de las proteínas expresadas se
llevó a cabo con el método Western Blot. Para la identificación se
utilizaron anticuerpos de ratón monoclonales. Control positivo:
células infectadas con FeLV A de la línea celular f3201.
Los plásmidos
pMCV1.4-FeLVenvgp85(-empalme),
pMCV1.4-FeLVenvgp70(-empalme) y
pMCV1.4-FeLVgag se digirieron por completo a lo
largo de la noche a 37ºC con la enzima de restricción Eco311.
Mediante la digestión de restricción se produjeron dos fragmentos de
ADN. Uno de ellos consistía en el gen de resistencia a la
canamicina, y también otras secuencias necesarias para la
propagación del plásmido en bacterias. El otro fragmento consistía
en las secuencias que debían convertirse en parte integrante del ADN
midge: promotor CMV, intrón quimérico, la secuencia de genes
correspondiente y la secuencia de poliadenilación de SV 40. Los
oligodesoxinucleótidos en forma de horquilla fosforilados en 5'
(TIBMolBiol, Berlín) 5'-PH
GGGAGTCCAGTxTTCTGGAC-3' y 5'PH-AGG
GGT CCA GTT TTC TGG AC-3' se ligaron al fragmento de
ADN que forma el ADN midge, a lo largo de la noche a 37ºC mediante
la enzima T4-ADN-ligasa en
presencia de la enzima de restricción Eco31I. La reacción se
interrumpió mediante calentamiento a 70ºC. La mezcla de ácidos
nucleicos resultante se trató con la enzima
T7-ADN-polimerasa. El ADN midge se
purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico y se
precipitó con isopropanol (véase EP 0 941 318 B1).
El péptido NLS PKKKRKV se acopló a los ODN en
dos pasos. En primer lugar, el oligonucleótido modificado
5'-PH-d(GGGAGTCCAGTxT
TTCTGGAC, siendo xT base de timina amino-modificada
con engarce C_{2}-amino (0,1 mM) se activó con
sulfo-KMUS (5 mM) en PBS a temperatura ambiente
(TA). Ciento veinte minutos después, la reacción se interrumpió con
50 mM tris(hidroximetil)aminometano y el ODN activado
se obtuvo después de precipitación con etanol (300 mM NaOAc pH 5,2,
5,5 mM MgCl_{2}, 70% etanol), centrifugación y lavado con etanol
al 70%. El ODN así obtenido (0,1 mM) se disolvió en PBS y reaccionó
con el péptido (0,2 mM) durante una hora a temperatura ambiente. La
reacción se comprobó mediante electroforesis en gel (3%) y tinción
con bromuro de etidio. El ODN acoplado con NLS así formado se
purificó mediante HPLC y se utilizó para la síntesis de los
constructos midge-NLS como se ha descrito más
arriba.
Se formaron cinco grupos de vacunación de seis
ratones BALB/c cada uno (véase Tabla 1). En todos los grupos
(excepto en los grupos control) los antígenos base eran las
secuencias optimizadas de la proteína "env" con y sin proteína
inmunomoduladora p15. La secuencia codificadora y el promotor de
citomegalovirus (CMV), dispuesto delante de la secuencia, se
utilizan como moléculas de cadena doble lineales según el Ejemplo 8.
Como controles se usaron tampón PBS, vacuna convencional (Leucogen)
y el WT de la proteína "env". Después de la primera
inmunización (50 \mug ADN, 1 mg/ml, i.d.) se llevó a cabo una
segunda inmunización (boost) el día 15. Los días 14, 28 y 42
se tomaron muestras de sangre. Estas muestras de sangre se ensayaron
en cuanto a la presencia de anticuerpos específicos contra
"env".
| Gr. | Ratones | Antígeno utilizado | Planteamiento |
| 1 | 6 | Leucogen | Control positivo |
| 2 | 6 | Tampón PBS | Control negativo |
| 3 | 6 | FeLVenvgp85(-empalme) | Determinar anticuerpos |
| 4 | 6 | FeLVenvgp70(-empalme) | Determinar anticuerpos |
| 5 | 6 | WT "env" | Control positivo |
Los resultados se muestran en la Figura 3.
Ejemplo
10a
Para comprobar si las secuencias sintéticas
pueden provocar una respuesta inmune humoral y celular en gatos, se
formuló el siguiente régimen de vacunación (Tabla 2):
| Gr. | Ratones | Antígeno utilizado | Planteamiento |
| 1 | 5 | FeLVenvgp85(-empalme) FeLVgag | Determinar estado de anticuerpos y citoquina |
| 2 | 5 | FeLVenvgp70(-empalme) FeLVgag | Determinar estado de anticuerpos y citoquina, |
| comparación con grupo 1 | |||
| 3 | 2 | Tampón PBS | Control negativo |
| 4 | 3 | Leucogen | Control positivo |
Los gatos de los dos primeros grupos se
inmunizan dos veces, cada una con una cantidad total de 600 \mug
ADN disueltos en PBS. Los constructos de expresión acoplados con
péptidos se administran en la nuca mediante inyección intradérmica.
La respuesta inmune se vigila durante 12 semanas. La segunda
inmunización tiene lugar la semana 4. Mediante la determinación del
estado de citoquina de las muestras de sangre tomadas cada semana se
ha de obtener información sobre la dirección de la respuesta inmune
(Th1, Th2). Para ello se determina IL-4 como
indicador de una TH2, e IL-2 e
interferón-gamma como indicador de una respuesta con
orientación predominantemente TH1. La vacuna Leucogen contiene
proteína recombinante "env" y se utiliza como control
positivo.
Los anticuerpos contra los antígenos utilizados
se determinaron mediante procedimientos Westernblot y ELISA.
La cantidad de los ARNm de las citoquinas
IL-2, IL-4 y también
interferón-gamma se determinó mediante
procedimientos PCR en tiempo real.
Ejemplo
10b
La detección semicuantitativa de los anticuerpos
contra la proteína "env" se llevó a cabo mediante Westernblot.
Se sometieron a prueba muestras de plasma de los gatos tomadas las
semanas de ensayo 0 y 12. Conforme a lo esperado, en la semana 0 no
se detectó ningún anticuerpo contra "env". Las bandas débiles
(+) indicadas en la Tabla 3 consisten en bandas no específicas. En
la semana 12, todos los animales de los grupos 1, 2 y 4, a excepción
de un gato, mostraban una clara respuesta de anticuerpos. Estos
resultados en el tipo de animal diana confirman los resultados del
ensayo preliminar en ratones (véase el Ejemplo 9).
Son aplicables los siguientes significados:
- +++
- banda muy fuerte
- ++
- banda fuerte
- +
- banda visible
- (+)
- banda débil
La intensidad de las bandas representa la
concentración de los anticuerpos en el plasma de los gatos
inmunizados.
Para comprobar si la alta producción de
anticuerpos lograda también es capaz de proteger realmente frente a
la infección por el virus FeL y poder verificar así la eficacia de
la vacuna según la invención, a continuación se llevó a cabo un
experimento provocando la infección. Para ello, cuatro grupos de 10
gatos cada uno se vacunaron dos veces (día 0 y día 21) con los
constructos correspondientes vía intradérmica con un aparato de
inyección sin aguja (Tabla 4). Como constructos de expresión se
utilizaron los vectores midge acoplados con péptido NLS arriba
descritos. Los días 21, 22 y 23 después de la última vacunación, los
gatos fueron infectados por provocación con virus FeL vivo (Rickard
Stamm, > 10^{6} unidades formadoras de focos/ml). Para evaluar
la eficacia de la vacuna se comprobó si los gatos estaban protegidos
después de la infección provocada. Se consideraron protegidos
aquellos gatos que no presentaban ninguna partícula viral en suero
(gatos seronegativos) y ningún ADN viral en sus células sanguíneas.
El suero de gato se ensayó mediante ELISA para determinar la
presencia del antígeno p27 con el fin de identificar partículas
virales. La cantidad de ADN viral integrado, el denominado ADN
provirus, se comprobó mediante un procedimiento de PCR Taqman. Se
formuló el siguiente régimen de vacunación:
| Gr. | Antígeno utilizado | Dosis de ADN | Cantidad de gatos seronegativos 105 días |
| [\mug] | después de provocar la infección | ||
| 1 | Tampón PBS | - | 0 |
| 2 | FeLVgag | 2 x 100 | 2 |
| 3 | FeLVenvgp70(-empalme) | 2 x 50 | 4 |
\hskip0,3cm Como control negativo se utilizó
tampón PBS.
Los resultados se pueden resumir de la siguiente
manera:
La Tabla 4 muestra los resultados del examen del
suero de los gatos en cuanto a la presencia de la proteína viral
p27. Este ensayo es un ensayo universalmente reconocido para
diagnosticar la viremia por FeLV. Paralelamente se analizaron
glóbulos blancos de los mismos gatos en cuanto a la presencia de ADN
proviral (datos no mostrados). Todos los gatos libres de proteína
viral también estaban libres de ADN proviral.
Dado que los dos sistemas de ensayo detectan
diferentes estadios del desarrollo de virus en el cuerpo, en caso
de un resultado doble negativo se puede partir de la base de que el
virus no se ha podido desarrollar en el cuerpo de los animales, lo
que significa que se ha logrado la protección.
Algunos de los gatos de los grupos 2 y 3 se
pudieron proteger contra la infección por FeLV.
Dos de los 10 gatos del grupo 2 estaban libres
tanto de proteína viral como de ADN proviral. Esta protección
lograda se basaba en la administración de la vacuna según la
invención (Seq. ID5).
Un 40% de los animales del grupo 3 se pudo
proteger con la vacuna según la invención (Seq. ID8) frente a la
infección por virus FeL. Esto constituye una reducción significativa
de los gatos infectados en comparación con el grupo 1.
En estos animales tampoco se pudo detectar
proteína viral y ADN proviral en muestras de suero y sangre.
Resulta notable que la muy pequeña dosis de 50 \mug por inyección
fuera suficiente para proteger los 4 gatos del grupo 3. Esto es
ventajoso porque la concentración de ADN a administrar es pequeña,
lo que reduce los costes de fabricación de la vacuna.
Todos los animales del grupo 1 (grupo control)
presentaban partículas virales en sangre, es decir, no estaban
protegidos y eran totalmente sensibles a la infección provocada.
Durante todo el ensayo de inmunización no se
observó ningún efecto secundario en forma de irritación local ni
trastornos del estado general de los animales de ensayo.
<110> Mologen Forschungs-,
Entwicklungs- und Vertriebs GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vacuna contra infecciones con
oncovirus tales como el virus de la leucemia felina del gato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> XI 1292-03
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 102 44 863.9
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-09-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1929
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la leucemia felina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1929)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADN del gen
"env" de tipo salvaje sin región codificadora de péptido de
señal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<308> NCBI M12500
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
2001-02-21
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (162)..(1990)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la leucemia felina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1527)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADN del gen
"gag" de tipo salvaje
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 642
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la leucemia felina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(447)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
proteína correspondiente a Seq. ID1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 508
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la leucemia felina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(508)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
proteína correspondiente a Seq. ID2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1530
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la leucemia felina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1530)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADN del gen
"gag" mutagenizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 509
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la leucemia felina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(509)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
proteína correspondiente a Seq. ID5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1929
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la leucemia felina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1929)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADN para el gen
"env" mutagenizado (gp85)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1440
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la leucemia felina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1440)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADN del gen
"env" mutagenizado (gp70)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 642
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la leucemia felina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(642)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
proteína correspondiente a Seq. ID7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 479
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la leucemia felina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(479)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
proteína correspondiente a Seq. ID8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1440
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la leucemia felina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1440)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADN del gen
"env" de tipo salvaje (gp70)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
gag-mut1-rneu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattaagagc tccacgtctc cccccgctaa cagcaactgg cg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(45)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
gag-mut2-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattaagagc tccaggtctc cggggctccg cggggctgca agacg
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
gag-mut3-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattaagagc tccacgtctc cttccctttt gttgtatatc ttttctgc
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(48)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
gag-mut4-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattaagagc tccaggtctc cggaacccc agaggaaagg gaagaaag
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mise_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Felvgag-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggataaggt accatgggcc aaactataac tacc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(37)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Felvgag-r
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctcagagc tcttagagga gagtggagtt ggcgggt
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> envl
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggataaggt accatggcca atcctagtcc acc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(37)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> envr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagttctcaga gctcttaggc tgtttcaagg agggctt
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mise_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatattggatc ccatggccaa cccctccc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattatggtct cctgctgctt cttcctgtct gtgg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaataggtct ccagcagcag acctacccct
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaataggtct ctgtgaacag ggcaatgggg tca
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptatttggtct cttcacagtg tccaggcagg tgtc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptattaggtct cagcttgtgc tggggggtgg
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(34)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaataaggtct ccaagctgac catctctgag gtgt
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattaagagct ctcaggctgt ttccagc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgccggta ccatggagtc ccccacccac c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcagaggtc tcccatgcca atgtcaatgg tgaac
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatctgggtc tccatggcca acccctc
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(36)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattatggtc tcgcagttca gacaactaca aatggc
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattatgagc tctcagggcc tgtcagggtc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattatggta ccatggagtc ccccaccc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(35)
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<223> Cebador
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<400> 34
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\hskip-.1em\dddseqskiptataatggtc tcaactgggc tgtttccagc agggc
\hfill35
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<210> 35
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<212> ADN
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<213> Cebador
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(31)
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<223> Cebador
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<400> 35
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\hskip-.1em\dddseqskipatattaggtc tcagatccgg gggggggagg g
\hfill31
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<210> 36
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Cebador
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<220>
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<222> (1)..(30)
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<223> Cebador
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<400> 36
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\hskip-.1em\dddseqskipatattggtct caggagaggg acaagaagag
\hfill30
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Cebador
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<222> (1)..(32)
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<223> Cebador
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<400> 37
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\hskip-.1em\dddseqskipaataggtct ctcagcctgc tggcgatggg gc
\hfill32
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<210> 38
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Cebador
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<222> (1)..(32)
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<223> Cebador
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<400> 38
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\hskip-.1em\dddseqskipattatggtct ctgcacctga ggctgtacag gc
\hfill32
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<210> 39
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Cebador
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(36)
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<223> Cebador
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<400> 39
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\hskip-.1em\dddseqskipaatatggtct cggtgctccc tgccggcggg ggtgca
\hfill36
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<210> 40
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Cebador
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(28)
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<223> Cebador
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<400> 40
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatatggtct ctctcctcct gcctctgc
\hfill28
Claims (14)
1. Constructo de expresión de ADN para
la expresión de productos génicos del virus de la leucemia felina
(FeLV) en células de gatos que comprende una secuencia promotora
operable en felinos y como mínimo una secuencia de nucleótidos que
codifica la proteína estructural "gag" y la proteína de
membrana "env" del FeLV según Seq. ID6 y Seq. ID9 o según Seq.
ID6 y Seq. ID10.
2. Constructo de expresión de ADN según
la reivindicación 1 que comprende la secuencia de nucleótidos
mutágena Seq. ID5 que codifica la proteína estructural
"gag".
3. Constructo de expresión de ADN según
la reivindicación 1 que comprende la secuencia de nucleótidos
mutágena Seq. ID7 que codifica la proteína de membrana
env-gp85.
4. Constructo de expresión de ADN según
la reivindicación 1 que comprende la secuencia de nucleótidos
mutégena Seq. ID8 que codifica la proteína de membrana
env-gp70.
5. Constructo de expresión de ADN según
como mínimo una de las reivindicaciones 2-4 que
contiene las secuencias de nucleótidos indicadas completas y que
codifican en cada caso una proteína estructural completa y/o una
proteína de membrana completa.
6. Constructo de expresión de ADN según
como mínimo una de las reivindicaciones 1 a 5 que consiste en un
plásmido.
7. Constructo de expresión de ADN según
como mínimo una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las
secuencias de polinucleótidos inmunizadoras están presentes como
constructos de expresión que consisten en moléculas de ácido
desoxirribonucleico lineales cerradas de forma covalente que
presentan una zona de cadena doble lineal, estando unidas las
cadenas simples que forman la cadena doble mediante bucles cortos de
cadena simple de nucleótidos de ácido desoxirribonucleico, y
consistiendo las cadenas simples que forman la cadena doble
únicamente en la secuencia codificadora bajo el control de un
promotor operable en el animal a vacunar y una secuencia de
terminación.
8. Constructo de expresión de ADN según
como mínimo una de las reivindicaciones anteriores que está unido
de forma covalente con uno o más péptidos.
9. Constructo de expresión de ADN según
la reivindicación 8, en el que el péptido está compuesto por 3 a 30
aminoácidos de los que como mínimo la mitad procede de aminoácidos
básicos del grupo de la arginina y la lisina.
10. Constructo de expresión de ADN según la
reivindicación 9, en el que el péptido presenta la secuencia de
aminoácidos PKKKRKV
(prolina-lisina-lisina-lisina-arginina-lisina-valina).
11. Medicamento, en particular vacuna, para
generar una inmunidad preventiva y/o terapéutica en felinos, en
particular en gatos, que comprende un constructo de expresión de ADN
según una o más de las reivindicaciones 1 a 10.
12. Proteína con la secuencia de
aminoácidos según Seq. ID6.
13. Proteína con la secuencia de
aminoácidos según Seq. ID9.
14. Proteína con la secuencia de
aminoácidos según Seq. ID10.
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