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ES2267046T3 - Antigeno carcinoembrionico rhesus, nucleotidos que lo codifican de los mismos. - Google Patents

Antigeno carcinoembrionico rhesus, nucleotidos que lo codifican de los mismos. Download PDF

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ES2267046T3
ES2267046T3 ES04709218T ES04709218T ES2267046T3 ES 2267046 T3 ES2267046 T3 ES 2267046T3 ES 04709218 T ES04709218 T ES 04709218T ES 04709218 T ES04709218 T ES 04709218T ES 2267046 T3 ES2267046 T3 ES 2267046T3
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cea
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protein
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L.; c/o Irbm AURISICCHIO
Gennaro; c/o Irbm CILIBERTO
Armin; c/o Irbm LAHM
Nicola; c/o Irbm LA MONICA
P.; c/o Irbm MONACI
Fabio; c/o Irbm PALOMBO
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Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
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Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína del antígeno carcinoembriónico de mono rhesus (rhCEA), según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8.

Description

Antígeno carcinoembriónico rhesus, nucleótidos que lo codifican y usos de los mismos.
Campo de la invención
La presente invención generalmente se relaciona con la terapia del cáncer. Más específicamente, la presente invención se relaciona con el antígeno carcinoembriónico polipéptido asociado al homólogo del tumor de mono rhesus, designado aquí rhCEA, con moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para esta proteína, y con vectores recombinantes y células huésped que contienen DNA que codifica para esta proteína. Esta invención también se relaciona con constructos vector adenovirales que llevan rhCEA y con su uso en vacunas y composiciones farmacéuticas para prevenir y tratar el cáncer.
Antecedentes de la invención
La superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF) se compone de numerosos genes que codifican para proteínas con funciones diversas, una de las cuales es la adhesión intracelular. Las proteínas IgSF contienen al menos un dominio relacionado con Ig que es importante para mantener interacciones de unión intermolecular propias. Como tales interacciones son necesarias para las diversas funciones biológicas de los miembros de la IgSF, se ha correlacionado la disrupción o expresión aberrante de muchas moléculas de adhesión de la IgSF con muchas enfermedades
humanas.
El antígeno carcinoembriónico (CEA) pertenece a una subfamilia de la superfamilia Ig compuesta por glicoproteínas de superficie celular. Los miembros de la subfamilia de CEA son conocidos como moléculas de adhesión celular relacionadas con CEA (CEACAMs). En la literatura científica reciente, el gen de CEA se ha renombrado CEACAM5, aunque la nomenclatura para la proteína permanezca como CEA. Funcionalmente, se ha mostrado que los CEACAMs actúan como moléculas de adhesión intercelular homotípicas y heterotípicas (Benchimol et al., Cell 57: 327-334 (1989)). Además de la adhesión celular, el CEA inhibe la muerte celular resultante de la separación de células de la matriz extracelular y puede contribuir a la transformación celular asociada a ciertos proto-oncogenes tales como Bcl2 y C-Myc (ver Berinstein, J. Clin Oncol. 20(8): 2197-2207 (2002)).
Se ha detectado la expresión normal de CEA durante el desarrollo fetal y en la mucosa del colon del adulto. La sobreexpresión de CEA se detectó por primera vez en tumores de colon humano hace unos treinta años (Gold and Freeman, J. Exp. Med. 121:439-462 (1965)), y de hecho se ha encontrado en casi todos los tumores colonorrecta-
les.
Adicionalmente, la sobreexpresión de CEA se puede detectar en un alto porcentaje de adenocarcinomas de páncreas, pecho y pulmón. Debido a la prevalencia de la expresión de CEA en estos tipos de tumores, el CEA se usa clínicamente de forma amplia en el seguimiento y prognosis de estos cánceres.
La correlación entre la expresión de CEA y el crecimiento metastático también ha conducido a su identificación como objetivo de intervención molecular e inmunológica para el tratamiento del cáncer colonorrectal. Una aproximación terapéutica que tiene al CEA como objetivo es el uso de anticuerpos anti-CEA (ver Chester et al., Cancer Chemoter. Pharmacol. 46 (Suppl): S8-S12 (2000)), mientras que otra es activar el sistema inmune para atacar tumores que expresan el CEA usando vacunas basadas en el CEA (para revisión, ver Berinstein, supra).
Se han clonado y caracterizado secuencias que codifican para el CEA humano (Patente EE.UU. Nº 5,274,087; Patente EE.UU. Nº 5,571,710; y Patente EE.UU. Nº 5,843,761. Ver también Beauchemin et al., Mol. Cell. Biol. 7:3221-3230 (1987); Zimmerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:920-924 (1987)). A pesar del aislamiento e identificación de estos genes de CEA, sería deseable identificar genes de mamíferos adicionales que codifiquen para el CEA para permitir el desarrollo de una vacuna para el cáncer que sea eficaz y no se obstaculice mediante auto-tolerancia.
Resumen de la invención
La presente invención se relaciona con moléculas de ácido nucleico aisladas o purificadas (polinucleótidos) que contienen una secuencia de nucleótidos que codifican para un antígeno carcinoembriónico nuevo de mono rhesus (en adelante rhCEA) según se expone en SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:8. Las moléculas de DNA reveladas aquí pueden transfectarse a una célula huésped a elección en la que la célula huésped recombinante proporcione una fuente de niveles sustanciales de una proteína del rhCEA funcional expresada (SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:8).
La presente invención se relaciona adicionalmente con una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para mRNA que expresa una proteína nueva de CEA de mono rhesus; esta molécula de DNA contiene la secuencia de nucleótido revelada aquí como SEQ ID NO:1. Las secuencias de nucleótido que codifican para el CEA de mono rhesus se designan aquí como rhCEACAM5. Un aspecto preferido de esta parte de la presente invención se revela en la Figura 1A, que muestra una molécula de DNA (SEQ ID NO:1) que codifica para una proteína nueva del rhCEA (SEQ ID NO:2).
Otro aspecto de esta invención es una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para una proteína nueva de CEA de mono rhesus (SEQ ID NO:8), comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos, como se muestra en la Figura 1B y según se expone en SEQ ID NO:5.
La presente invención también se correlaciona con vectores recombinantes y células huésped recombinantes, procarióticas y eucarióticas, que contienen las moléculas de ácido nucleico reveladas a través de esta descripción.
La presente invención se relaciona adicionalmente con un proceso para expresar una proteína de CEA de mono rhesus en una célula huésped recombinante, que comprende: (a) introducir un vector que contiene un ácido nucleico según se expone en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:5 en una célula huésped adecuada; y, (b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de CEA de mono rhesus.
Un aspecto preferido de la presente invención es una forma sustancialmente purificada de una proteína de CEA de mono rhesus que está constituida por la secuencia del amino ácido revelada en la Figura 2A (SEQ ID NO:2).
Otro aspecto preferido de la presente invención es una forma sustancialmente purificada de una proteína de CEA de mono rhesus que está constituida por la secuencia del amino ácido revelada en la Figura 2B (SEQ ID NO:8).
Otro aspecto preferido de la presente invención se relaciona con una proteína madura del rhCEA sustancialmente purificada, completamente procesada (incluyendo procesado proteolítico, glicosilación y/o fosforilación), obtenida de una célula huésped recombinante que contiene un vector de expresión de DNA comprendiendo secuencia de nucleótido según se expone en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:5, que expresa la proteína del rhCEA. Se prefiere especialmente que la célula huésped recombinante sea una célula huésped eucariota, tal como una línea celular de mamíferos.
Sin embargo otro aspecto de esta invención es un procedimiento para prevenir o tratar el cáncer que comprender administrar a un mamífero un vector de vacuna que contiene una molécula de ácido nucleico aislada, comprendiendo la molécula de ácido nucleico aislada una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína antigénica (rhCEA) carcinoembriónica de mono rhesus según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8.
La presente invención se relaciona adicionalmente con un vector de vacuna de adenovirus que contiene un genoma adenoviral con una delección en la región E1, y una inserción en la región E1, en la que la inserción contiene un casete de expresión que comprende: (a) un polinucleótido que codifica para una proteína de CEA de mono rhesus; y (b) un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
La presente invención también se relaciona con un plásmido vacuna que contiene una porción de plásmido y una porción de casete de expresión, comprendiendo la porción de casete de expresión: (a) un polinucleótido que codifica para una proteína de CEA de mono rhesus; y (b) un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para proteger a un mamífero del cáncer o tratar a un mamífero que padezca cáncer, que comprende: (a) introducir en el animal un primer vector comprendiendo: i) un polinucleótido que codifica para una proteína de CEA de mono rhesus; y ii) un promotor ligado operativamente al polinucleótido; (b) dejar que pase una cantidad predeterminada de tiempo; y (c) introducir en el animal un segundo vector comprendiendo: i) un polinucleótido que codifica para una proteína de CEA de mono rhesus; y ii) un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
Tal como se usan a través de la descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/uno/una" y "el/la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto claramente lo dicte de otro modo.
Tal como se usan a través de la descripción y en las reivindicaciones adjuntas, a las siguientes definiciones y abreviaturas se aplica:
El término "promotor" se refiere a un lugar de reconocimiento en una hebra de DNA a la cual se liga la RNA polimerasa. El promotor forma un complejo de iniciación con la RNA polimerasa para iniciar y conducir la actividad transcriptora. El complejo se puede modificar activando secuencias denominadas "intensificadores" o inhibiendo secuencias denominadas "silenciadores".
El término "casete" se refiere a la secuencia de la presente invención que contiene la secuencia de ácido nucleico que se tiene que expresar. El casete es similar en concepto a una cinta de casete; cada casete tiene su propia secuencia. De este modo intercambiando el casete el vector expresará una secuencia distinta. Debido a los lugares de restricción en los extremos 5' y 3', el casete puede insertarse, retirarse o sustituirse fácilmente por otro casete.
El término "vector" se refiere a algunos medios mediante los cuales se pueden introducir fragmentos de DNA en un organismo huésped o tejido huésped. Hay varios tipos de vectores incluyendo plásmidos, virus (incluyendo adenovirus), bacteriófagos y cósmidos.
El término "primera generación", tal como se usa en referencia a los vectores adenovirales, describe dichos vectores adenovirales que son de replicación defectuosa. Los vectores adenovirus de primera generación tienen típicamente una región génica E1 suprimida o inactivada, y preferiblemente tienen una región génica E3 suprimida o inactivada.
La designación "pV1J-rhCEA" se refiere a un constructo de plásmido revelado aquí que comprende el promotor CMV temprano-inmediato (IE) humano con intrón A, un gen de CEA de longitud completa del rhesus, secuencias de poliadenilación derivadas de la hormona de crecimiento bovina y de terminación transcriptora, y una columna vertebral pUC mínima.
Las designaciones "pMRK-Ad5-rhCEA" y "MRK-rhCEA" se refieren a un constructo, revelado aquí, que comprende un genoma adenoviral Ad5 suprimido de las regiones E1 y E3. En este plásmido, la región E1 se sustituye por un gen de CEA del rhesus en una orientación paralela de la E1 bajo el control de un promotor CMV humano sin intrón A, seguido de una señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina.
La designación "pBS-rhCEA" se refiere a un constructo revelado aquí que comprende el plásmido pBluescriptII KS (+) y un gen del rhCEA de longitud completa.
El término "cantidad eficaz" significa que la composición de vacuna suficiente se introduce para producir los niveles adecuados de polipéptido, para que cause una respuesta inmune. Alguien cualificado en la técnica reconoce que este nivel puede variar.
"Sustancialmente libre de otros ácidos nucleicos" significa al menos el 90%, preferiblemente el 95%, más preferiblemente el 99%, e incluso más preferiblemente el 99,9%, libre de otros ácidos nucleicos. Tal como se usan recíprocamente, los términos "sustancialmente libre de otros ácidos nucleicos", "sustancialmente purificado", "ácido nucleico aislado" o "ácido nucleico purificado" también se refieren a moléculas de DNA que comprenden una región que codifica para una proteína de CEA de rhesus que ha sido purificada a partir de otros componentes celulares. De este modo, una preparación de DNA de CEA que esté sustancialmente libre de otros ácidos nucleicos contendrá, como un porcentaje de su ácido nucleico total, no más del 10%, preferiblemente no más del 5%, más preferiblemente no más del 1%, e incluso más preferiblemente no más del 0,1%, de ácidos nucleicos de CEA que no sean de rhesus. El que una preparación de DNA de CEA de rhesus dada esté sustancialmente libre de otros ácidos nucleicos puede determinarse mediante técnicas tan convencionales de valoración de pureza del ácido nucleico como, p. ej., electroforesis en gel de azarosa combinada con procedimientos de tinción adecuados, p. ej., tinción con bromuro de etidio, o mediante secuenciación.
"Sustancialmente libre de otras proteínas" o "sustancialmente purificado" significa al menos el 90%, preferiblemente el 95%, más preferiblemente el 99%, e incluso más preferiblemente el 99,9%, libre de otras proteínas. De este modo, una preparación de proteína de CEA de mono rhesus que esté sustancialmente libre de otras proteínas contendrá, como un porcentaje de su proteína total, no más del 10%, preferiblemente no más del 5%, más preferiblemente no más del 1%, e incluso más preferiblemente no más del 0,1%, de proteínas de CEA que no sean de mono rhesus. El que una preparación de proteína de CEA de mono rhesus dada esté sustancialmente libre de otras proteínas puede determinarse mediante técnicas tan convencionales de valoración de pureza de proteína como, p. ej., electroforesis en gel de poliacrilamida de sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) combinada con procedimientos de detección adecuados, p. ej., tinción de plata o inmunomarcaje.
Tal como se usan recíprocamente, los términos "sustancialmente libre de otras proteínas", o "sustancialmente purificado", o "proteína de CEA de mono rhesus aislada" o "proteína de CEA de mono rhesus purificada" también se refieren a proteína de CEA de mono rhesus que se haya aislado de una fuente natural. El uso del término "aislado" o "purificado" indica que la proteína de CEA de mono rhesus se ha retirado de su ambiente celular normal. De este modo, una proteína de CEA de mono rhesus aislada puede estar en una solución libre de células o situada en un ambiente celular distinto de aquel en el que aparece naturalmente. El término aislada no implica que una proteína de CEA de mono rhesus aislada sea la única proteína presente, sí significa en cambio que una proteína de rhCEA aislada esté sustancialmente libre de otras proteínas y material no amino-acídico (p. ej., ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos) asociado naturalmente con la proteína del rhCEA in vivo. De este modo, una proteína de CEA de mono rhesus que se exprese recombinantemente en una célula procariota o eucariota y esté sustancialmente purificada de esta célula huésped que no expresa naturalmente (es decir, sin intervención) esta proteína del rhCEA de mono rhesus por supuesto que es "proteína del rhCEA de mono rhesus aislada" bajo cualquiera de las circunstancias aquí referidas. Como se apuntaba anteriormente, una preparación de proteína de rhCEA que sea una proteína del rhCEA aislada o purificada estará sustancialmente libre de otras proteínas y contendrá, como un porcentaje de su proteína total, no más del 10%, preferiblemente no más del 5%, más preferiblemente no más del 1%, e incluso más preferiblemente no más del 0,1%, de proteínas de CEA que no sean de mono rhesus.
Una "sustitución de aminoácido conservativa" se refiere al reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido químicamente similar. Ejemplos de tales sustituciones conservativas son: sustitución de un residuo hidrofóbico (isoleucina, leucina, valina, o metionina) por otro; sustitución de un residuo polar por otro residuo polar de la misma carga (p. ej., arginina por lisina; ácido glutámico por ácido aspártico).
"rxCEA" se refiere a un antígeno carcinoembriónico de mono rhesus.
El término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo al ser humano.
La abreviatura "Ag" se refiere a un antígeno.
Las abreviaturas "Ab" y "mAb" se refieren a un anticuerpo y un anticuerpo monoclonal, respectivamente.
La abreviatura "ORF" se refiere a la estructura de lectura abierta de un gen.
Breve descripción de los esquemas
La Figura 1 muestra secuencias de nucleótidos de moléculas de cDNA de CEA de mono rhesus, según se expone en SEQ ID NO:1 (Panel A) y SEQ ID NO:5 (Panel B). Ver Ejemplo 2.
La Figura 2 muestra las secuencias de aminoácidos predichas de la primera proteína de CEA de mono rhesus, según se expone en SEQ ID NO:2 (Panel A) y de la segunda proteína de CEA de mono rhesus, según se expone en SEQ ID NO:8 (Panel B). Las dos diferencias de aminoácidos entre la primera y la segunda proteínas de CEA de rhesus se destacan y subrayan en el Panel B.
La Figura 3 muestra una alineación de la región 5' no traducida de miembros de la familia CEACAM humana. Se compararon las secuencias mostradas y se usaron para diseñar cebadores degenerados como se describe en el Ejemplo 2. Se destacan los nucleótidos que son lo mismo que el nucleótido correspondiente en otros miembros de la familia CEACAM. Los guiones indican que se añadieron espacios para facilitar la alineación de las secuencias. El número de nucleótido de cada secuencia de cDNA, según se revela en GenBank, aparece entre paréntesis.
La Figura 4 muestra la expresión de la proteína de CEA de rhesus. Se transfirieron células HeLa con fagémidos obtenidos por exploración de la biblioteca de CEA-lambda y se desarrolló un WESTERN BLOT usando un anticuerpo policlonal de conejo contra proteína de CEA humano. Se muestra la expresión de 2 de entre 15 clones.
La Figura 5 muestra una representación esquemática de la región codificadora de CEA de rhesus. Se indican las repeticiones internas y se señalan los lugares de restricción para la fragmentación génica y la secuencia.
La Figura 6 muestra una alineación de las secuencias de nucleótidos CEACAM-5 humana (SEQ ID NO:6) y de rhesus (SEQ ID NO:1). Los nucleótidos que son distintos entre las dos secuencias CEACAM-5 se muestran destaca-
dos.
La Figura 7 muestra una alineación de las estructuras de lectura abierta CEACAM-5 humana (SEQ ID NO:7) y de rhesus (SEQ ID NO:2). Los aminoácidos que son distintos entre las dos secuencias CEACAM-5 se muestran destacados.
La Figura 8 muestra la respuesta humoral contra el CEA humano en ratones de CEA transgénico. Se ofrece el grado de anticuerpo medio para dos grupos de ratones: uno inmunizado con CEA de rhesus y uno inmunizado con CEA humano (Ejemplo 7).
La Figura 9 muestra la respuesta inmune mediada por célula contra el CEA humano en ratones de CEA transgénico. Se vacunaron ratones de CEA transgénico con vectores que expresan hCEA o con vectores que expresan rhCEA (Ejemplo 9).
La Figura 10 muestra la respuesta inmune mediada por célula contra péptidos de CEA humano en ratones de CEA transgénico inmunizados con CEA humano o de rhesus.
Descripción detallada de la invención
El gen que codifica para el antígeno carcinoembriónico (CEA) se asocia comúnmente con el desarrollo de adenocarcinomas. La presente invención se relaciona con composiciones y procedimientos para ELICIT o acrecentar la inmunidad del producto proteínico expresado por el antígeno CEA asociado a tumor, en el que la expresión aberrante de CEA se asocia con el carcinoma o su desarrollo. La asociación de la expresión aberrante de CEA con un carcinoma no requiere que la proteína de CEA se exprese en tejido tumoral en todos los momentos de su desarrollo, ya que la expresión anormal de CEA puede estar presente en el inicio del tumor y no ser detectable después en la progresión del tumor o vice-versa.
Hasta este momento, se proporcionan nucleótidos que codifican para el antígeno carcinoembriogénico de mono rhesus (rhCEA). Las moléculas de la presente invención se pueden usar en una vacuna de adenovirus recombinante o una vacuna basada en plásmido para proporcionar inmunoprofilaxis eficaz contra adenocarcinomas a través de inmunidad mediada por células. Cuando se introduce directamente en un vertebrado in vivo, los polinucleótidos de la invención inducen la expresión de proteínas codificadas en el animal, incluyendo mamíferos tales como primates, perros y humanos.
La presente invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico aislada (polinucleótido) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican para mRNA que expresa una proteína rhCEA nueva según se expone en (SEQ ID NO:2) o (SEQ ID NO:8). Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención están sustancialmente libres de otros ácidos nucleicos.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden incluir una molécula de ácido desoxirribonucleico (DNA), tal como DNA genómico y DNA complementario (cDNA), que puede ser de cadena sencilla (cadena codificadora o no codificadora) o doble, así como DNA sintético, tal como un polinucleótido sintetizado de cadena sencilla. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención pueden incluir también una molécula de ácido ribonucleico (RNA). Para la mayoría de los objetos de clonación, el DNA es un ácido nucleico preferido.
Una molécula preferida de la presente invención comprende la secuencia de nucleótido revelada aquí como SEQ ID NO:1, mostrada en la Figura 1A, que codifica para la proteína de CEA de rhesus mostrada en la Figura 2A y expuesta como SEQ ID NO:2.
Una molécula preferida de la presente invención comprende la secuencia de nucleótido revelada aquí como SEQ ID NO:5 (en adelante secuencia de DNA del "segundo rhCEA"), mostrada en la Figura 1B, que codifica para la proteína de CEA de rhesus mostrada en la Figura 2B y expuesta como SEQ ID NO:8. Estas moléculas de ácido nucleico rhCEA se identificaron a través de RT-PCR como se describe en detalle en el Ejemplo 2. La secuencia de DNA del segundo rhCEA (SEQ ID NO:5) se diferencia de la primera por dos nucleótidos y se clonó a partir de tejido del colon de un mono rhesus distinto. Esta secuencia de DNA codifica para una proteína de CEA de rhesus que se diferencia de la proteína de CEA del primer rhesus por dos aminoácidos.
Los clones de cDNA aislados, vectores asociados, células huésped, fracciones subcelulares recombinantes y membranas, y las formas expresadas y maduras del rhCEA son útiles para el desarrollo de una vacuna para el cáncer.
La presente invención también incluye fragmentos o mutantes de SEQ ID NOs:1 ó 5 biológicamente activos, que codifican para mRNA que expresa proteínas del rhCEA nuevas. Cualquier fragmento y/o mutante biológicamente activo codificará para una proteína o fragmento de proteína que imita al menos sustancialmente las propiedades farmacológicas de la proteína del rhCEA, incluyendo pero sin limitarse a la proteína del rhCEA según se expone en SEQ ID NO:2 ó SEQ ID NO:8. Cualquiera de tales polinucleótidos incluye aunque no se limita necesariamente a: sustituciones de nucleótido, delecciones, adiciones, mutilaciones amino-terminales y mutilaciones carboxi-terminales. Las mutaciones de la presente invención codifican para moléculas de mRNA que expresan una proteína funcional del rhCEA en una célula eucariota para ser útil en el desarrollo de la vacuna para el cáncer.
La invención también se relaciona con DNA sintético que codifica para la proteína del rhCEA en la que la secuencia del nucleótido del DNA sintético se diferencia significativamente de la secuencia el nucleótido de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:5, pero sin embargo codifica para la proteína del rhCEA según se expone en SEQ ID NO:2 ó SEQ ID NO:8. Tales DNAs sintéticos están destinados a estar dentro del fin de esta invención.
Por tanto, la presente invención revela una redundancia del codón que puede causar que numerosas moléculas de DNA una proteína idéntica. Para objetos de esta descripción, una secuencia que soporte uno o más codones sustituidos se definirá como una variación degenerada. También están incluidas dentro del fin de esta invención mutaciones en la secuencia de DNA o en la proteína traducida que no alteran sustancialmente las propiedades físicas fundamentales de la proteína expresada. Por ejemplo, la sustitución de valina por leucina, arginina por lisina, o asparagina por glutamina puede que no cause un cambio en la funcionalidad del polipéptido.
Se sabe que las secuencias de DNA que codifican para un péptido pueden alterarse para codificar para un péptido que tenga propiedades que son distintas de aquellas del péptido que aparece naturalmente. Los procedimientos para alterar las secuencias de DNA incluyen aunque sin estar limitados a la mutagénesis dirigida a lugar. Ejemplos de propiedades alteradas incluyen aunque sin estar limitados a cambios en la afinidad de una enzima por un sustrato o receptor por un ligando.
Están incluidas en la presente invención secuencias de DNA que se hibridan con SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:5 bajo condiciones rigurosas. A modo de ejemplo, y sin limitación, un procedimiento que usa condiciones de alta rigurosidad es como sigue:
Se llevó a cabo la prehibridación de filtros conteniendo DNA durante 2 horas hasta toda la noche a 65ºC en tampón compuesto por SSC 6x, solución de Denhardt 5x, y 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridan de 12 a 48 horas a 65ºC en mezcla de prehibridación que contiene 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado y 5-20 x 10^{6} cpm de sonda marcada con ^{32}P. El lavado de los filtros se hace a 37ºC durante 1 hora en una solución que contiene SSC 2x, 0,1% de SDS. A éste le sigue un lavado en SSC 0,1x, 0,1% de SDS a 50ºC durante 45 min. Antes de la autorradiografía. Otros procedimientos que usan condiciones de alta rigurosidad incluirían un paso de hibridación llevado a cabo en SSC 5x, solución de Denhardt 5x, formamida al 50% a 42ºC durante 12 a 48 horas o un paso de lavado llevado a cabo en SSPE 0,2x, SDS al 0,2% a 65ºC durante 30 a 60 minutos.
Los reactivos mencionados en los procedimientos precedentes para llevar a cabo hibridación de alta rigurosidad se conocen bien en la técnica. Se pueden encontrar detalles de la composición de estos reactivos en, p.ej., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989, que se incorpora mediante referencia por este medio. Además de las precedentes, otras condiciones de alta rigurosidad que pueden usarse se conocen bien en la técnica.
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Un aspecto preferido de la presente invención es una forma sustancialmente purificada de la proteína de CEA de mono rhesus que comprende una secuencia de aminoácidos según se revela en la Figura 2A (SEQ ID NO:2).
Otro aspecto preferido de la presente invención es una forma sustancialmente purificada de la proteína de CEA de mono rhesus que comprende una secuencia de aminoácidos según se revela en la Figura 2B (SEQ ID NO:8).
La invención también se relaciona con varios dominios funcionales del rhCEA y con moléculas híbridas que comprenden al menos una de estas secuencias. La proteína de CEA comprende un dominio amino-terminal con una secuencia directora procesada y un dominio carboxi-terminal hidrofóbico. El CEA también comprende tres dominios internos a modo de Ig. Taheri et al. (J. Biol. Chem. 275(35): 26935-26943 (2000)) mostraron que se requieren los subdominios del dominio N-terminal para la función de adhesión intercelular de CEA.
La presente invención también incluye fragmentos o mutantes de una proteína del rhCEA biológicamente activos, comprendiendo la secuencia de aminoácido según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8, incluyendo pero sin estar necesariamente limitados a sustituciones de aminoácidos, delecciones, adiciones, mutilaciones amino terminales y mutilaciones carboxi terminales tales que estas mutaciones proporcionan proteínas o fragmentos de proteína de uso diagnóstico, terapéutico o profiláctico y serían útiles para el desarrollo de una vacuna para el cáncer.
Las proteínas del rhCEA del mono rhesus de la presente invención pueden estar en forma de proteína "madura" o pueden ser una parte de una proteína mayor tal como una proteína de fusión. A menudo es conveniente incluir una secuencia de aminoácido adicional que contiene secuencias secretoras o directoras, pro-secuencias, secuencias que ayudan en la purificación tales como múltiples residuos de histidina, o una secuencia adicional para la estabilidad durante la producción recombinante.
La presente invención también se relaciona con los constructos de fusión del rhCEA, incluyendo pero sin limitarse a constructos de fusión que expresan una porción de la proteína de CEA de rhesus ligada a varios marcadores, incluyendo pero sin estar limitado en modo alguno a GFP (proteína verde fluorescente), el epitopo MYC, GST, y Fc. Cualquiera de tales constructos de fusión debe expresarse en la línea celular de interés y usarse para explorar en busca de moduladores de la proteína de CEA de rhesus revelada aquí. También se contemplan los constructos de fusión que se construyen para acrecentar la respuesta inmune al CEA de rhesus, incluyendo pero sin estar limitados a: DOM y hsp70.
La presente invención se relaciona adicionalmente con vectores recombinantes que comprenden las moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas reveladas a través de esta descripción. Estos vectores pueden estar compuestos de DNA o RNA. Para la mayoría de los objetos de clonación, se prefieren vectores de DNA. Vectores típicos incluyen plásmidos, virus modificados, bacteriófagos, cósmicos, cromosomas artificiales de levadura, y otras formas de DNA episomal o integrado que puede codificar para una proteína del rhCEA. Es bueno el determinar dentro del alcance del artesano experimentado un vector apropiado para la transferencia de un gen particular u otro
uso.
Se puede usar un vector de expresión conteniendo DNA que codifica para una proteína del rhCEA para la expresión del rhCEA en una célula huésped recombinante. Los vectores de expresión pueden incluir, pero sin limitarse a, vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos diseñados específicamente o virus. Además, se puede usar una variedad de vectores de expresión bacterianos para expresar rhCEA recombinante en células bacterianas si se desea. Además, se puede usar una variedad de vectores de expresión de células fúngicas para expresar rhCEA recombinante en células fúngicas. Adicionalmente, se puede usar una variedad de vectores de expresión de células e insectos para expresar proteína recombinante en células de insectos.
La presente invención también se relaciona con células huésped transformadas o transfectadas con vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Las células huésped recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas, incluyendo pero sin limitarse a, bacterias tales como E. coli, células fúngicas tales como levadura, células de mamífero incluyendo pero sin limitarse a, líneas celulares de origen bovino, porcino, de mono o de roedor; y células de insectos incluyendo pero sin limitarse a, líneas celulares derivadas de Drosophila y del gusano de seda. Se pueden cultivar tales células huésped recombinantes bajo condiciones adecuadas para producir rhCEA o una forma equivalente biológicamente.
Como se apuntaba anteriormente, se puede usar un vector de expresión conteniendo DNA que codifica para una proteína del rhCEA para la expresión del rhCEA en una célula huésped recombinante. Por tanto, otro aspecto de esta invención es un proceso para expresar una proteína de CEA de mono rhesus en una célula huésped recombinante, que comprende: (a) introducir un vector que comprende un ácido nucleico según se expone en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:5 dentro de una célula huésped adecuada; y, (b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la expresión de la mencionada proteína de CEA de mono rhesus.
Siguiendo a la expresión del rhCEA en una célula huésped, debe recuperarse la proteína del rhCEA para proporcionar proteína del rhCEA en forma activa. Varios procedimientos de purificación de proteína del rhCEA están disponibles y son adecuados para uso. La proteína del rhCEA recombinante debe purificarse a partir de lisatos y extractos celulares por varias combinaciones de, o aplicación individual de fraccionamiento de sales, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de adsorción de hidroxilapatito y cromatografía de interacción hidrofóbica. Además, se puede separar la proteína del rhCEA recombinante de otras proteínas celulares mediante el uso de una columna de inmunoafinidad hecha con anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para proteína del rhCEA de longitud completa, o fragmentos polipeptídicos de proteína del rhCEA.
Los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden ensamblar en un casete de expresión que comprende secuencias diseñadas para proporcionar expresión eficaz de la proteína en una célula humana. El casete contiene preferiblemente el gen del rhCEA de longitud completa, con secuencias relacionadas de control transcriptor y de traducciones ligadas operativamente a él, tales como un promotor y secuencias de terminación. En una forma de realización preferida, el promotor es el promotor citomegalovirus sin la secuencia del intrón A (CMV), aunque aquellos experimentados en la técnica reconocerán que se pueden usar cualquiera de entre una cantidad de otros promotores conocidos tales como la inmunoglobulina fuerte, u otros promotores génicos eucariotas. Un terminador transcriptor preferido es el terminador de la hormona de crecimiento bovino, aunque también se pueden usar otros terminadores transcriptores conocidos. Se prefiere particularmente la combinación de CMV-terminador BGH.
De acuerdo con esta invención, el casete de expresión del rhCEA de rhesus se inserta en un vector. El vector preferiblemente es un vector adenoviral, aunque también se pueden usar DNA lineal ligado a un promotor, u otros vectores, tales como virus adeno-asociados o un vector de virus vaccinia modificado, retroviral o lentiviral. Si el vector elegido es un adenovirus se prefiere que el vector sea un vector adenoviral de los llamados de primera generación. Estos vectores adenovirales se caracterizan por tener una región génica E1 no funcional, y preferiblemente una región génica adenoviral E1 suprimida. En algunas formas de realización, el casete de expresión se inserta en la posición en la que el gen adenoviral E1 se localiza normalmente. Además, estos vectores opcionalmente tienen una región E3 no funcional o suprimida. Se prefiere que el genoma del adenovirus usado esté suprimido de ambas regiones E1 y E3 (\DeltaE1\DeltaE3). Los adenovirus pueden multiplicarse en líneas celulares conocidas que expresen el gen viral E1, tales como células 293, o células PERC.6, o en líneas celulares derivadas de células 293 o PERC.6 que se transforman transitoriamente o establemente para expresar una proteína extra. Por ejemplo, cuando se usan constructos que tienen una expresión génica controlada, tales como un sistema de promotor regulable de tetraciclina, la línea celular puede expresar componentes involucrados en el sistema regulador. Un ejemplo de una línea celular como tal es T-Rex-293; se conocen otras en la técnica.
Por conveniencia al manipular el vector adenoviral, el adenovirus debe estar en una forma de plásmido lanzadera. Esta invención también está dirigida a un vector de plásmido lanzadera que comprende una porción de plásmido y una porción de adenovirus, comprendiendo la porción del adenovirus un genoma adenoviral que tiene una E1 suprimida y una supresión opcional de la E3, y tiene casete de expresión insertado que comprende CEA de rhesus. En formas de realización preferidas, hay un lugar de restricción que flanquea a la porción adenoviral del plásmido para que el vector adenoviral se pueda retirar fácilmente. El plásmido lanzadera puede replicarse en células procariotas o en células eucariotas.
En una forma de realización preferida de la invención, el casete de expresión se inserta en el plásmido del adenovirus pMRKAd5-HV0 (Ver Emini et al., WO 02/22080, que se incorpora mediante referencia por este medio). Este plásmido comprende un genoma adenoviral Ad5 suprimido de las regiones E1 y E3. Se mejoró el diseño del plásmido pMRKAd5-HV0 respecto a anteriores adenovectores extendiendo la región empaquetadora de acción 5'cis más lejos en el gen E1 para incorporar elementos que se han encontrado que son importantes para optimizar el empaquetamiento viral, resultando en amplificación del virus realzada. Convenientemente, este vector adenoviral realzado es capaz de mantener estabilidad genética siguiente a la propagación de paso elevado.
Las técnicas estándar de biología molecular para preparar y purificar constructos de DNA capacitan la preparación de los adenovirus, plásmidos lanzadera, e inmunógenos de DNA de esta invención.
Los vectores escritos anteriormente se pueden usar en composiciones inmunogénicas y vacunas para prevenir el desarrollo de adenocarcinomas asociados a expresión aberrante de CEA y/o para tratar cánceres existentes. Hasta este momento, un aspecto de la invención actual es un procedimiento para prevenir o tratar el cáncer que comprende el administrar a un mamífero un vector de vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico aislada, comprendiendo la molécula de ácido nucleico aislada una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de CEA de mono rhesus según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8.
De acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, el vector de vacuna se puede administrar para el tratamiento o prevención del cáncer en cualquier mamífero. En una forma de realización preferida de la invención, el mamífero es un humano.
Además, alguien experimentado en la técnica puede elegir cualquier tipo de vector para uso en el procedimiento de tratamiento y prevención descrito. En una forma de realización preferida de la invención, el vector es un vector adenoviral que comprende un genoma adenoviral con una delección en la región E1 del adenovirus, y una inserción en la región E1 del adenovirus, en la que la inserción comprende un casete de expresión que comprende: (a) un polinucleótido
que codifica para una proteína de CEA de mono rhesus; y (b) un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
La invención presente se relaciona además con un vector de vacuna de adenovirus que comprende un genoma adenoviral con una delección en la región E1, y una inserción en la región E1 del adenovirus, en la que la inserción comprende un casete de expresión que comprende: (a) un polinucleótido que codifica para una proteína de CEA de mono rhesus; y (b) un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
En una forma de realización preferida de este aspecto de la invención, el vector de adenovirus es un vector Ad5.
En otra forma de realización preferida de la invención, el vector el vector de adenovirus es un vector Ad6.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un plásmido vacuna que comprende una porción de plásmido y una porción de casete de expresión, comprendiendo la porción de casete de expresión: (a) un polinucleótido que codifica para una proteína de CEA de mono rhesus; y (b) un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
En algunas formas de realización de la presente invención, las vacunas de adenovirus recombinantes reveladas aquí se usan en varias combinaciones cebar/estimular con una vacuna de polinucleótido basada en plásmido para inducir una respuesta inmune realzada. En este caso, los dos vectores se administran en un régimen "cebar y estimular". Por ejemplo, se administra el primer tipo de vector, después de una cantidad de tiempo predeterminado, por ejemplo, 1 mes, 2 meses, 6 meses, u otro intervalo apropiado, se administra un segundo tipo de vector. Los vectores llevan preferiblemente casetes de expresión que codifican para el mismo polinucleótido o combinación de polinucleótidos. En la forma de realización en que también se usa un DNA de plásmido, se prefiere que el vector contenga uno o más promotores reconocidos por células de mamíferos o de insectos. En una forma de realización preferida, el plásmido contendría un promotor fuerte tal como, pero sin limitarse a, el promotor CMV. El gen de CEA de rhesus u otros genes que se vayan a expresar estarían ligados a tal promotor. Un ejemplo de tal plásmido sería el plásmido de expresión de mamíferos V1Jns según está descrito (J. Shiver et al., in DNA Vaccines, M.Liu et al. eds., N.Y. Acad. Sci., N.Y. 772:198-208 (1996), que se incorpora mediante referencia por este medio).
Como se apuntaba anteriormente, una vacuna de vector adenoviral y una vacuna de plásmido pueden administrarse a un vertebrado como parte de un régimen terapéutico sencillo para inducir una respuesta inmune. Hasta este momento, la presente invención se relaciona con un procedimiento para proteger a un mamífero del cáncer, que comprende: (a) introducir en el mamífero un primer vector que comprende: i) un polinucleótido que codifica para una proteína de CEA de mono rhesus; y ii) un promotor ligado operativamente al polinucleótido; (b) permitir que pase una cantidad predeterminada de tiempo; y (c) introducir en el mamífero un segundo vector que comprende: i) un polinucleótido que codifica para una proteína de CEA de mono rhesus; y ii) un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
En una forma de realización del procedimiento de protección descrito anteriormente, el primer vector es un plásmido y el segundo vector es un vector de adenovirus. En una forma de realización alternativa, el primer vector es un vector de adenovirus y el segundo vector es un plásmido.
La invención actual se relaciona además con un procedimiento para tratar a un mamífero que sufra de un adenocarcinoma, que comprende: (a) introducir en el mamífero un primer vector que comprende: i) un polinucleótido que codifica para una proteína de CEA de mono rhesus; y ii) un promotor ligado operativamente al polinucleótido; (b) permitir que pase una cantidad predeterminada de tiempo; y (c) introducir en el mamífero un segundo vector que comprende: i) un polinucleótido que codifica para una proteína de CEA de mono rhesus; y ii) un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
En una forma de realización del procedimiento de tratamiento descrito anteriormente, el primer vector es un plásmido y el segundo vector es un vector de adenovirus. En una forma de realización alternativa, el primer vector es un vector de adenovirus y el segundo vector es un plásmido.
La cantidad de DNA expresable o de RNA transcrito que se introducirá en un receptor de la vacuna dependerá parcialmente de la fuerza de los promotores usados y de la inmunogenicidad del producto génico expresado. En general, una dosis inmunológicamente o profilácticamente eficaz de alrededor de 1 ng hasta 100 mg, y preferiblemente entre 10 \mug y 300 \mug de un vector de vacuna de plásmido se administra directamente en el tejido muscular. Una dosis eficaz para adenovirus recombinante es de aproximadamente 10^{6}-10^{12} partículas y preferiblemente entre 10^{7}-10^{11} partículas. También se contemplan la inyección subcutánea, introducción intradermal, impresión a través de la piel, y otros modos de administración tal como distribución intraperitoneal, intravenosa o inhalación. También se contempla que puedan proporcionarse vacunaciones de refuerzo. También es conveniente la administración parenteral, tal como la intravenosa, intramuscular, subcutánea u otros medios de administración con adyuvantes tales como proteína interleukina 12, simultáneamente o subsiguientemente a la introducción parenteral de la vacuna de esta invención.
Los vectores de vacuna de esta invención deben ser desnudos, es decir, no asociados con proteínas, adyuvantes u otros agentes que afecten al sistema inmune del receptor. En este caso, es deseable que los vectores de la vacuna estén en una solución fisiológicamente aceptable, tal como, pero sin limitarse a, salina estéril o salina estéril tamponada. Alternativamente, puede ser conveniente administrar un inmunoestimulante, tal como un adyuvante, citosina, proteína, u otro vehículo con las vacunas o composiciones inmunogénicas de la presente invención. Por tanto, esta invención incluye el uso tales inmunoestimulantes en conjunción con las composiciones y procedimientos de la presente invención. Un inmunoestimulante, tal como se usa aquí, se refiere esencialmente a cualquier sustancia que realce o potencie una respuesta inmune (mediada por anticuerpo y/o célula) a un antígeno exógeno. Dichos inmunoestimulantes pueden administrarse en forma de DNA o de proteína. Cualquiera de entre una variedad de inmunoestimulantes se puede emplear en conjunción con las vacunas y composiciones inmunogénicas de la presente invención, incluyendo, pero sin limitarse a: GM-CSF, IFN\alpha, toxoide de tétanos, IL12, B7.1, LFA-3 y ICAM-1. Dichos inmunoestimulantes se conocen bien en la técnica. También se pueden usar agentes que ayudan en la entrada celular de DNA, tales como, pero sin limitarse al ion calcio. Estos agentes son referidos generalmente como reactivos facilitadores de la transfección y vehículos farmacéuticamente aceptables. Aquellos experimentados en la técnica podrán determinar el vehículo inmunoestimulante o farmacéuticamente aceptable particular así como el tiempo apropiado y modo de administración.
Se puede usar cualquiera entre una variedad de procedimientos para clonar rhCEA. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitarse a, (1) una técnica de clonación RACE PCR (Forman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002 (1988)). Puede desarrollarse el RACE en 5' y/o en 3' para generar una secuencia de cDNA de longitud completa. Esta estrategia requiere usar cebadores de oligonucleótido específicos de gen para la amplificación PCR del cDNA del rhCEA. Estos cebadores específicos de gen se diseñan a través de la identificación de una secuencia de nucleótido con marca de secuencia expresada (EST) que se ha identificado buscando en una cantidad de bases de datos de ácidos nucleicos y proteínas disponibles públicamente; (2) expresión funcional directa del cDNA del rhCEA siguiente a la construcción de una biblioteca de cDNA que contiene rhCEA en un sistema de vector de expresión apropiado; (3) explorar una biblioteca de cDNA que contiene rhCEA construida en un vector de bacteriófago o lanzadera de plásmido con una sonda de oligonucleótido degenerado marcada diseñada a partir de la secuencia del aminoácido de la proteína del rhCEA; (4) explorar una biblioteca de cDNA que contiene rhCEA construida en un vector de bacteriófago o lanzadera de plásmido con un cDNA parcial que codifica para la proteína del rhCEA. Este cDNA parcial se obtiene mediante la amplificación PCR específica de fragmentos de cDNA del rhCEA a través del diseño de cebadores de oligonucleótido degenerado a partir de la secuencia de aminoácido conocida para otras proteínas de membrana que están relacionadas con la proteína del rhCEA; (5) explorar una biblioteca de cDNA que contiene rhCEA construida en un vector de bacteriófago o lanzadera de plásmido con un cDNA parcial u oligonucleótido con homología respecto a una proteína del rhCEA de mamíferos. Esta estrategia también puede requerir el uso de cebadores de oligonucleótido específicos de gen para la amplificación PCR de cDNA del rhCEA identificado como un EST según se describe anteriormente; ó (6) diseñar oligonucleótidos específicos de gen 5' y 3' usando SEQ ID NO:1 como modelo para que el cDNA de longitud completa se pueda generar mediante técnicas RACE conocidas, o se puede generar una porción de la región codificadora mediante estas mismas técnicas RACE conocidas para generar y aislar una porción de la región codificadora para usar como una sonda para explorar uno de los numerosos tipos de cDNA y/o bibliotecas genómicas para aislar una versión de longitud completa de la secuencia de nucleótido que codifica para el rhCEA.
Es fácilmente aparente para aquellos experimentados en la técnica que otros tipos de bibliotecas, así como bibliotecas construidas a partir de otros tipos de células o tipos de especies, pueden ser útiles para asilar un DNA que codifica para rhCEA o un homólogo del rhCEA. Otros tipos de bibliotecas incluyen, pero sin limitarse a, bibliotecas de DNA derivadas de otras células. La selección de células o líneas celulares para uso en la preparación de una biblioteca de cDNA para aislar un cDNA que codifica para rhCEA puede hacerse midiendo primero la actividad de rhCEA asociado a célula usando cualquier ensayo conocido disponible para tal objeto.
La preparación de bibliotecas de cDNA se puede desarrollar mediante técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Se pueden encontrar técnicas de construcción de bibliotecas de cDNA bien conocidas por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989. También se pueden obtener bibliotecas de DNA complementarias de numerosas fuentes comerciales, incluyendo pero sin limitarse a Clontech Laboratorios, Inc. (Palo Alto, CA) y Stratagene (La Jolla, CA).
Las moléculas de DNA, moléculas de RNA, y la proteína recombinante de la presente invención se pueden usar para explorar y medir niveles de rhCEA. Las proteínas recombinantes, moléculas de DNA y moléculas de RNA se prestan a la formulación de kits adecuados para la detección y tipificación del rhCEA. Tal kit comprendería un vehículo compartimentado adecuado para mantener en estrecho confinamiento al menos un contenedor. El vehículo comprendería además reactivos tales como rhCEA o anticuerpos anti-rhCEA adecuados para detectar rhCEA. El vehículo también puede contener un medio para detección tal como antígeno marcado o sustratos de enzima o similares.
Habiendo descrito formas de realización preferidas de la invención con referencia a los esquemas acompañantes, debe entenderse que la invención no se limita a aquellas precisas formas de realización, y que pueden realizarse varios cambios y modificaciones en ella por alguien experimentado en la técnica sin salirse del fin o espíritu de la invención según se define en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1 Aislamiento de RNA de macacos rhesus
Se desarrollaron procedimientos moleculares siguiendo procedimientos estándar bien conocidos en la técnica (Ver, p. ej., Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, F.M., -2^{nd}. ed., John Wiley & Sons, (1992) and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, -2^{nd}. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), que se incorporan mediante referencia por este medio).
Para obtener RNA para el aislamiento de cDNA de CEA de rhesus, se usaron muestras de colon de dos monos rhesus (Macaca mulatta) distintos. Se obtuvieron tejidos congelados del Centro de Investigación Biomédica del Primate (BPRC, Rijswijk, Holanda). Para extraer el RNA total de las muestras de colon, se pulverizaron mecánicamente los tejidos y se combinaron con el reactivo de RNA Ultraspec (Biotecx Laboratorios; Houston, TX) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se comprobó la integridad del RNA purificado mediante gel de agarosa desnaturalizante de formaldehído. Se hicieron alícuotas de las muestras y se almacenaron a -80ºC.
Ejemplo 2 Amplificación de cDNA de CEA de rhesus
Se alinearon secuencias de nucleótidos de las regiones no traducidas 5' y 3' (UTR) de todos los miembros conocidos de la familia de CEA humano para identificar regiones de DNA de CEA altamente conservadas (ver Figura 3). Basadas en las homologías de la familia génica de CEA identificadas, se diseñaron cebadores de oligonucleótido degenerados y se optimizaron las condiciones de PCR para amplificar el cDNA de CEA de rhesus mediante la reacción de cadena de la polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR), descrita a continuación. Los cebadores usados para amplificar todo el cDNA fueron como sigue: 5'-RhCEA EcoRI 5'- C C G A A T T C C G G A C A S A G C A G R C A G C A G R S A C C -3' (SEQ ID NO:3) y CEA-8 RhXhoI 5'- C C G C T C G A G C G G C T G C T A C A T C A G A G C A A C C C C A A C C -3' (SEQ ID NO:4). La amplificación se desarrolló con el SuperScript One-Step RT-PCR con el Platinum Taq kit (Invitrogen; Carlsbad, CA). Se usó un volumen de reacción de 100 \mul que estaba constituido por 1 \mug de RNA, 200 pmoles de ambos cebadores, y DMSO al 10% (concentración final).
Para desarrollar el paso de transcriptasa inversa, se incubaron muestras de RNA total aisladas de cada uno de los dos monos rhesus a 45ºC durante 30 min, siguiendo una incubación de 2 min a 94ºC. La amplificación por PCR de los modelos resultantes estuvo constituida por 40 ciclos de 94ºC durante 15 seg, 52ºC durante 30 seg y 68ºC durante 2 min y 20 seg.
Los productos amplificados por PCR de aproximadamente 2100 bp, el tamaño esperado para un homólogo de CEACAM-5, se obtuvieron independientemente de ambas muestras de RNA y se purificaron a partir de gel de azarosa. El análisis de secuencia parcial de ambos productos del PCR reveló alta homología con el CEACAM-5 humano.
Debido a la alta homología de las repeticiones internas, toda la secuencia génica se obtuvo purificando fragmentos de DNA usando los lugares de restricción indicados en la Figura 5. Las secuencias de nucleótido de CEA de rhesus obtenidas de cada mono se revelan aquí en la Figura 1, según se expone en SEQ ID NO:1 (en adelante rhCEACAM-5) y SEQ ID NO:5 (en adelante rhCEACAM-5 #2). El Análisis de secuencias de nucleótido de CEA reveló una estructura de lectura abierta (ORF) de 2118 nucleótidos, que codifica para un polipéptido de 705 aminoácidos. La comparación de las secuencias de nucleótido de rhCEA obtenidas de los dos monos rhesus indicó que había dos diferencias en los nucleótidos (ver Figuras 1A y 1B), que codifican para dos proteínas distintas (ver Figuras 2A y 2B).
La secuencia de nucleótido de CEACAM-5 (SEQ ID NO:1) también se comparó con la secuencia de CEACAM-5 humano publicado (SEQ ID NO:6), que reveló un 88% de homología al nivel de nucleótido (ver Figura 6). Una comparación similar de la secuencias de polipéptido de CEA (SEQ ID NO:2) de rhesus y del (SEQ ID NO:7) humano mostraron una identidad del 78,9% al nivel de aminoácido (ver Figura 7). Interesantemente, una inserción de tres aminoácidos está presente en el extremo carboxil de CEA de rhesus comparado con el CEA humano, requiriendo probablemente la señal para la modificación del glicosilfosfatidilinositol (GPI).
Ejemplo 3 Generación y exploración de una biblioteca lambda específica de CEA de rhesus
Productos amplificados del rhCEA obtenidos mediante RT-PCR (ver Ejemplo 2) se digirieron con EcoRI/XhoI y se ligaron en el vector lambda ZAP-CMV XR (Stratagene; La Jolla, CA), de acuerdo con las directrices del fabricante. Los productos de ligado se incubaron con extracto dorado de empaquetamiento Gigapack III y los fagos resultantes se usaron para infectar células XL-1 Blue MRF. Esta biblioteca primaria específica de CEA se amplificó después, obteniendo una graduación de \sim1x10^{6} placas por unidad/ml. Se desarrolló la exploración de 5x10^{3} placas levantando sobre filtros de nailon. Los filtros se hibridaron con dos sondas de DNA distintas que cubrían los extremos 5' y 3' de la molécula de CEA. Se escindieron placas positivas dobles en células XL-1 Blue MRF y los fagos filamentosos derivados se amplificaron en células XL-OLR. Entonces se cultivaron los fagémidos y se analizaron mediante digestión de restric-
ción. Los análisis de secuencia y comparaciones Genbank revelaron la alta homología con el CEACAM-5 humano.
Ejemplo 4 Generación de constructos de plásmido y adenovirus
Se escindió rhCEA con PstI/XhoI del vector fagémido pCMV-script EX y se insertó en vector pBluescript II KS, obteniendo pBS-RhCEA. La inserción se secuenció totalmente y después se subclonó como fragmento SmaI/XhoI en vector pVIJnsA, obteniendo pVIJ-RhCEA. El plásmido lanzadera pMRK-RhCEA para generación de adenovirus se obtuvo subclonando el mismo fragmento en el vector poliMRK. Se recombinaron un fragmento PacI/StuI del pMRK-RhCEA que contiene el casete de expresión para RhCEA y las regiones Ad5 que flanquean a E1 con pAd5 ó pAd6 linealizado con ClaI en células BJ5183 de E. coli. Los plásmidos resultantes fueron pAd5-RhCEA y pAd6-RhCEA. Ambos plásmidos se cortaron con PacI para liberar los ITRs de adenovirus y se transfirieron a células PerC-6.
La amplificación viral se llevó a cabo a través de pases en serie. Ad5-RhCEA y Ad6-RhCEA se purificaron usando un protocolo de purificación estándar de CsCl y se dializaron ampliamente contra tampón A105 (Tris 5 mM pH 8,0, MgCl_{2} 1 mM, NaCl 75 mM, sucrosa al 5%, Tween 20 al 0,005%).
Ejemplo 5 Expresión de RhCEA y detección in vitro
Se comprobó la expresión de RhCEA por los vectores generados mediante WESTERN BLOT y análisis FACS. Se transfirieron plásmidos en células HeLa o PerC.6 con Lipofectamina 2000 (Life Technologies;Carlsbad, CA). Se desarrollaron infecciones de adenovirus en medio libre de suero durante 30 min a 37ºC, después se añadió medio fresco. Después de 48 horas de incubación, se analizaron lisatos de células completas mediante WESTERN BLOT usando suero policlonal de conejo contra CEA humano (Fitzgerald, dilución 1:1500). Todos los clones de CEA de rhesus selec-
cionados expresaron una proteína de 180-200 kDa cuando fueron transfectados en células HeLa (ver Figura 4).
Para el análisis FACS, se separaron las células con tripsina y se resuspendieron en tampón FACS (PBS, FCS al 1%). Después de incubar durante 30 min con anticuerpo policlonal de conejo anti-CEA diluido 1:250, se lavaron las células y se incubaron durante 30 min con una IgG-PE anti-conejo y finalmente se analizaron con un FACScalibur (Bevton Dickinson, San José, CA).
Ejemplo 6 Péptidos
Para analizar la respuesta inmune mediada por célula contra el CEA de rhesus en animales inmunizados, se diseñaron 15 mer péptidos solapados por 11 aminoácidos para cubrir toda la proteína. Se adquirieron péptidos liofilizados de CEA de rhesus en Bio-Synthesis, Inc. (Lewisville, TX) y se resuspendieron en DMSO a 40 mg/ml. Se agruparon péptidos en 4 grupos: grupo A (de RhCEA-1 a RhCEA-34, 34 péptidos); grupo B (de RhCEA-35 a RhCEA-79, 45 péptidos); grupo C (de RhCEA-80 a RhCEA-124, 48 péptidos); y grupo D (de RhCEA-125 a RhCEA-173, 53 péptidos). Las concentraciones finales fueron las siguientes: grupo A=1,176 mg/ml; B=0,888 mg/ml; grupo C=0,851 mg/ml; grupo D=0,769 mg/ml. Los péptidos y grupos se almacenaron a -80ºC.
Ejemplo 7 Generación de respuestas inmunes celulares específicas de CEA en ratones mediante inmunización con rhCEA
Los ratones CEA.Tg son ratones que expresan CEA humano como un antígeno propio con una distribución tisular similar a la de humanos. Como se ha demostrado ampliamente en la literatura científica, estos ratones no responden al CEA, como se muestra por la falta de anticuerpos de suero específicos de CEA detectables y por la incapacidad para preparar una respuesta esplénica in vitro de células T al CEA. Muchos informes han mostrado que la inmunización de DNA con genes xenogénicos que codifican para antígenos homólogos protege a los ratones contra el desafío del tumor con células singénicas de melanoma. Para demostrar la capacidad de vacunación del DNA xenogénico para obtener una respuesta inmune contra un antígeno propio en este modelo, inmunizamos ratones CEA.Tg con vectores que codificaban para CEA de rhesus (xeno).
Se adquirieron ratones C57BL/6 (H-2^{b}) a partir de Charles River (Lecho, Italia). Los ratones CEA.Tg (H-2^{b}) fueron proporcionados por HL Kaufman (Albert Einstein Collage of Medicine, New York) y se mantuvieron en condiciones estándar.
Para la transferencia electrogénica (EGT) se expusieron quirúrgicamente cuadriceps de ratones o se les inyectó directamente 50 \mug de pVIJ-RhCEA y se les estimuló eléctricamente como se había descrito previamente (Rizzuto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96(11): 6417-22 (1999)). Para la inyección de adenovirus, se inyectaron 1x10^{10} vp de Ad5-RhCEA en cuadriceps de ratones.
Se inyectó a los ratones en el músculo del cuadriceps 50 \mug de pVIJ-RhCEA y se les electroestimuló inmediatamente después de la inyección una vez a la semana durante 4 semanas. Se usaron ratones C57BL/6 como controles. Se detectaron anticuerpos anti CEA de rhesus en sueros de estos ratones mediante WESTERN BLOT, demostrando una respuesta inmune humoral. Se usó un anticuerpo monoclonal de ratón contra hCEA como control positivo, mientras se usaron sueros pre-inmunes y extractos de células falsamente infectados como controles negativos (no se muestran los datos). Pretendidamente, sólo se podrían medir anticuerpos de reacción cruzada contra proteína de CEA humano en grupos inmunizados de CEA de rhesus (Figura 8) con una graduación media de 1:110. Estos datos indican que, en el modelo de ratón transgénico, es posible romper la tolerancia con vacunación de DNA xenogénico (medida como autoanticuerpos anti-CEA).
Ejemplo 8 Detección de anticuerpo y graduación
Se obtuvieron sueros para la graduación de anticuerpo mediante extracción de sangre retro-orbital. Para la detección WESTERN BLOT, se dejaron fluir extractos de células HeLa transducidos con Ad5-rhCEA en geles SDS-page y se transfirieron sobre filtros de nitrocelulosa. Los sueros se reunieron y se diluyeron 1:50 para incubación en O/N a 4ºC. Se usó un conjunto de IgG-AP anti-ratón (Sigma, 1:2500) para la detección. Para la graduación, se revistieron portaobjetos ELISA (Nunc maxisorp) con 100 ng/pocillo de CEA (CEA altamente puro; Fitzgerald Industries International Inc., Concord MA), se diluyeron en tampón de revestimiento (NaHCO_{3} 50 mM, pH 9,4) y se incubaron en O/N a 4ºC. Entonces se bloquearon los portaobjetos con PBS que contenía BSA al 5% durante 1 hora a 37ºC. Los sueros de ratón se diluyeron en PBS con BSA al 5% (dilución 1/50 para evaluar la tasa de seroconversión; diluciones desde 1:10 hasta 1:31,25 para evaluar el valor de graduación). Se usaron sueros pre-inmunes como fondo. Los sueros diluidos se incubaron en O/N a 4ªc. Se llevaron a cabo lavados con PBS, BSA al 1%, Tween 20 al 0,05%. Se diluyó anticuerpo detector (Peroxidasa IgG de cabra anti-ratón, Sigma, San Luis, MO) 1/2000 en PBS, con BSA al 5%, y se incubó durante 2-3 horas a temperatura ambiente en un agitador. Después de lavar, se cargaron los portaobjetos con 100 \mul/pocillo de sustrato TMB (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford,IL). Las reacciones se detuvieron con 25 \mul/pocillo de solución de H_{2}SO_{4} 1M y los portaobjetos se leyeron a 450 nm/620 nm. Se calcularon las graduaciones de los sueros anti-CEA como la dilución limitante de suero que produce una absorbancia al menos 3 veces mayor que la absorbancia del suero pre-inmune autólogo a la misma dilución.
Ejemplo 9 Ensayo IFN-\gamma ELISPOT
Se revistieron portaobjetos MAIP de 96 pocillos (Millipore, Bedford, MA) con IFN-\gamma de rata anti-ratón purificados (IgG1, clon R4-6ª2, Pharmingen, San Diego, CA) a 2,5 \mug/ml en PBS estéril, dividido en alícuotas de 100 \mul por pocillo. Después de lavar con PBS estéril, se bloquearon los portaobjetos con 200 \mul por pocillo de medio R10 a 37ºC durante al menos 2 horas.
Para la preparación de esplenocitos, se retiró el bazo de un ratón sacrificado de una forma estéril y se disgregó raspando a través de una rejilla. Se obtuvo lisis osmótica de los glóbulos rojos añadiendo 1 ml de PBS 0,1X al peleteado celular y agitando en vórtex durante no más de 15 seg. Después se añadió 1 ml de PBS 2X y se elevó el volumen hasta 4 ml con PBS 1X. Después de centrifugar a 1200 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente, se resuspendió el peleteado celular en 1 ml de medio R10 y se contaron las células viables. Se depositaron los esplenocitos en portaobjetos a razón de 5x10^{5} y 2x10^{5}/pocillo con 1 \mug/ml de cada péptido en R10 y se incubaron durante 20 h en un incubador de CO_{2} a 37ºC. Se usó concanavalina A (ConA) a 5 \mug/ml como un control interno positivo para cada ratón. Después de lavar con PBS, Tween 20 al 0,05%, los portaobjetos se incubaron en O/N a 4ºC con 50 \mul/pocillo de con IFN-\gamma de rata anti-ratón conjugado con biotina (IgG1 de rata, clon XMG 1.2, Pharmingen, San José, CA) diluido 1:250 en tampón de ensayo (PBS con FBS al 5%, Tween 20 al 0,005%).
Al día siguiente, se lavaron e incubaron los portaobjetos durante 2 h a temperatura ambiente con conjugado AP-Estreptavidina (Pharmingen) diluido 1:2500 en tampón de ensayo. Después de lavar ampliamente, los portaobjetos se cargaron mediante adición de 50 \mul/pocillo de NBT/B-CIP (Pierce Biotechnology) hasta que se observase el desarrollo de manchas bajo el microscopio. La reacción se detuvo lavando los portaobjetos enteramente con agua destilada. Se dejó que los portaobjetos se secaran al aire completamente, y las manchas se contaron usando un lector automático ELISPOT.
Para la respuesta inmune mediada por célula, se vacunaron ratones CEA.Tg con vectores que expresan el hCEA o con vectores que expresan el rhCEA. Se analizaron dos grupos: el primer grupo se analizó mediante ensayo ELISPOT 21 días después de la última inyección de DNA, mientras el segundo grupo se estimuló con 1x10^{10} vp de Ad5-hCEA o Ad5-RhCEA, y se analizó dos semanas más tarde. Los resultados demostraron que tras cuatro inyecciones de DNA, se observó una respuesta inmune celular no significativa contra el hCEA según se midió mediante ELISPOT (no se muestra). Por otra parte, los ratones que fueron estimulados con Ad5 manifestaron una respuesta aumentada considerablemente, consistente con la ruptura de inmunotolerancia al CEA. Esta observación sugiere que un protocolo útil de vacunación para el antígeno propio del CEA sería la administración repetida de DNA mediante EGT, seguida de un estímulo de adenovirus (modalidad mixta). De manera importante, la inmunización con CEA de rhesus proporcionó reacción cruzada con péptidos de CEA humano y vice-versa en el tipo silvestre y en ratones transgénicos (no se muestran los datos). En particular, la respuesta inmune contra el CEA humano fue mucho mejor en ratones transgénicos usando rhCEA como inmunógeno (ver Figura 9). Estos resultados muestran que se podría obtener una buena respuesta contra el CEA en ratones transgénicos usando el (xeno) gen de rhesus. En la Figura 10 se muestra la respuesta contra péptidos de CEA de rhesus.
Ejemplo 10 Inmunización de macacos rhesus con rhCEA
Para evaluar la eficacia de inmunización de macacos rhesus (Macaca mulatta) con el homólogo de rhesus del antígeno homólogo del tumor humano CEA, que se expresa en carcinomas colonorrectales, se desarrollaron estudios de inmunización en el Centro de Investigación Biomédica del Primate (BPRC, Rijswijk, Holanda). Tales estudios de inmunización se diseñaron para evaluar respuestas de células B y T a la inmunización con el antígeno CEA de rhesus.
En este estudio (CV-1), 1 grupo de monos (constituido por 2 machos y 2 hembras) se inmunizó con un vector de DNA de plásmido y un vector de adenovirus que expresan el CEACAM-5 de rhesus. Para el priming, los animales se vacunaron intramuscularmente con DNA de plásmido que expresa rhCEA en las semanas 0, 4, 8, 12 y 16 mediante inyección de DNA seguida por estimulación eléctrica. La inyección de DNA estuvo constituida por una solución de 1 ml (vertida sobre 2 lugares, con 0,5 ml/lugar) que contenía 5 mg de DNA de plásmido para animales que pesaban 2-5 kilos. Se inyectó a los animales bajo anestesia (mezcla de ketamina/xilazina).
Para la electroestimulación, se descargaron dos trenes de 100 pulsos bipolares cuadrados (1 seg cada uno) cada nuevo segundo para un tiempo total de tratamiento de 3 seg. La longitud de pulso fue de 2 mseg/fase con una frecuencia y amplitud de pulso de 100 Hz y 100 mA (modo de corriente continua), respectivamente.
Para medir la respuesta inmune al CEA usando el protocolo de inmunización anterior, se recogieron muestras de sangre cada cuatro semanas. Se midió la respuesta mediada por célula mediante ensayo IFN-\gamma Elispot y la respuesta humoral se midió mediante ensayo ELISA. Como no se obtuvo respuesta inmune significativa en la semana 16, se llevaron a cabo dos inyecciones adicionales (semana 24 y 28) usando rhCEA que expresa Ad5. Tras la inyección de Ad5, se detectó una respuesta inmune medible contra rhCEA para dos monos (RI137 y CO12) que abarcaba el conjunto C y el conjunto B + C peptídico, respectivamente. La respuesta inmune mediada por célula comenzó a declinar en ambos monos en la semana 35.
Se siguió la respuesta inmune humoral en el tiempo tras la inyección de DNA. Tres monos (CO12, RI311 y RI002) mostraron un buen grado de anticuerpo anti-CEA, variando de 1:143 a 1:2099 y alcanzando un pico entre las semanas 12 y 16 después de la primera inyección.
Estos datos muestran que vectores genéticos que codifican para rhCEA fueron capaces de romper la inmunotolerancia a este antígeno tumoral en primates. La inmunidad mediada por célula (50% de monos tratados) y la humoral (75% de monos tratados) estuvieron involucradas en la respuesta inmune.
Ejemplo 11 Inmunización de macacos rhesus con homólogos de rhesus de antígenos asociados a tumores humanos
Se desarrolló una segunda serie de estudios de inmunización para evaluar la eficacia de inmunización de macacos rhesus (Macaca mulatta) con los homólogos de rhesus de antígenos asociados a tumores humanos HER2/neu, Ep-CAM y CEA, expresándose todos en carcinomas colonorrectales. Se diseñaron protocolos para evaluar las respuestas de células B y T a estos antígenos tumorales en combinación.
En este estudio, un segundo grupo de 4 monos rhesus (2 machos y 2 hembras) fueron inmunizados con una mezcla de tres vectores de DNA de plásmido que expresan los homólogos de rhesus de antígenos tumorales humanos Ep-CAM (pV1J-rhEpCAM), CEA (pV1J-rhCEA), y HER2/neu (pV1J-rhHER2).
Se introdujeron los cebadores a los animales mediante inyección intramuscular de DNA de plásmido en las semanas 0, 4, 8, 12 y 16, seguida por electroestimulación.
La inyección de DNA estuvo constituida por una solución de 1 ml (vertida sobre 2 lugares, con 0,5 ml/lugar) que contenía 6 mg de DNA de plásmido para animales que pesaban 2-5 kilos. Se inyectó a los animales bajo anestesia (mezcla de ketamina/xilazina).
Para la electroestimulación, se descargaron dos trenes de 100 pulsos bipolares cuadrados (1 seg cada uno) cada nuevo segundo para un tiempo total de tratamiento de 3 seg. La longitud de pulso fue de 2 mseg/fase con una frecuencia y amplitud de pulso de 100 Hz y 100 mA (modo de corriente continua), respectivamente.
Se estimuló al mismo grupo de animales mediante inyección de una mezcla de tres Ad5 que expresan CEA de rhesus (Ad5-rhCEA), HER2/neu de rhesus (Ad5-rhHER2), y EpCAM de rhesus (Ad5-rhEpCAM). Se inyectó una cantidad total de 3x10^{11} partículas víricas (pv) intramuscularmente en las semanas 23 y 27 (1x10^{11} pv para cada uno de los tres virus).
Para medir la respuesta inmune a los tres antígenos tumorales usando el protocolo de inmunización anterior, se recogieron muestras de sangre cada cuatro semanas. Se midió la respuesta mediada por célula mediante ensayo
IFN-\gamma +Elispot, mientras la respuesta humoral se midió mediante ensayo ELISA.
Los monos RI449 y RI519 mostraron una respuesta mediada por célula específica de HER2 detectable, como se midió mediante análisis IFN-\gamma ELISPOT. Un análisis similar no detectó ninguna respuesta significativa contra rhCEA y rhEpCAM.
En un tercer estudio, 4 monos rhesus se inmunizaron con una mezcla de Ad5-rhHER2, Ad5-rhCEA y Ad5-rhEpCAM mediante inyección intramuscular de derivados de Ad5 en las semanas 0, 2 y 4. Se administró una solución de 1 ml (vertida sobre 2 lugares, con 0,5 ml/lugar) que contenía 3x10^{11} pv (10^{11} para cada uno de los tres virus Ad5) a animales que pesaban 2-5 kilos. Se inyectó a los animales bajo anestesia (mezcla de ketamina/xilazina).
Se midió la respuesta mediada por célula mediante ensayo IFN-\gamma Elispot. Para HER2/neu, tres de cuatro monos mostraron una respuesta detectable. No se midieron respuestas mediadas por célula significativas para rhCEA y rhEpCAM.
En resumen, el protocolo de inmunización discutido anteriormente fue eficaz al inducir una respuesta inmune específica contra rhHER2/neu en monos rhesus. No está claro por qué la co-inmunización con vectores que llevaban tres antígenos tumorales distintos no fue eficaz induciendo una respuesta inmune específica contra rhCEA, en comparación con el estudio 1, que solamente usó rhCEA como inmunógeno. Aunque sin esperar estar limitados por la teoría, es posible que la expresión de rhHER2/neu y la presencia de epitopos inmunodominantes limitara la generación y la expansión de células-T subdominantes específicas de rhCEA.
<110> Luigi Aurisicchio
\hskip1cm
Fabio Palombo 
\hskip1cm
Paolo Monaci 
\hskip1cm
Nicola La Monica 
\hskip1cm
Gennaro Ciliberto 
\hskip1cm
Armin Lahm 
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<120> ANTÍGENO CARCINO EMBRIÓNICO DE RHESUS, NUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN AL MISMO, Y USOS DEL MISMO
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<130> ITR0045 PCT
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/447,203
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<151> 2003-02-13
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<160> 16
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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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<210> 1
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<211> 2118
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<212> DNA
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<213> Macaca mulatta 
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<400> 1
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1 
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<210> 2
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<211> 705
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<212> PRT
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<213> Macaca mulatta 
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<400> 2
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3
4 
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<210> 3
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<211> 32
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Primer del PCR
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<221> misc_feature
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<222> (0)...(0)
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<223> S = C or G
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<221> misc_feature
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<222> (0)...(0)
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<223> R=A or G
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccgaattccg gacasagcag rcagcagrsa cc 
\hfill
32 
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<210> 4
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<211> 37
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Primer del PCR
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<400> 4
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ccgctcgagc ggctgctaca tcagagcaac cccaacc 
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37 
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<210> 5
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<211> 2118
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<212> DNA
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<213> Macaca mulatta 
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6
7 
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<211> 2109
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 6
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8 
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<210> 7
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<213> Homo sapiens 
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<400> 7
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9
10
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<211> 705
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<212> PRT
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<213> Macaca mulatta 
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<400> 8
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12
13 
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia de consenso
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140 
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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15 
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<212> DNA
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<212> DNA
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gcacagagga gaacacgcag gcagcagaga ccatggggcc catctcagcc cctt 
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54 
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<213> Homo sapiens 
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<212> DNA
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16 
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<210> 16
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<211> 76
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<212> DNA
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<400> 16
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160

Claims (18)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína del antígeno carcinoembriónico de mono rhesus (rhCEA), según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8.
2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 en la que el ácido nucleico es DNA.
3. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 en la que el ácido nucleico es mRNA.
4. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 en la que el ácido nucleico es cDNA.
5. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 en la que la secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:5.
6. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.
7. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 6.
8. Un procedimiento para expresar una proteína del antígeno carcinoembriónico de mono rhesus (rhCEA) en una célula huésped recombinante, que comprende:
(a)
introducir un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1 en una célula huésped adecuada; y,
(b)
cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de CEA de mono rhesus.
9. Un procedimiento para expresar una proteína del antígeno carcinoembriónico de mono rhesus (rhCEA) en una célula huésped recombinante, que comprende:
(a)
introducir un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 5 en una célula huésped adecuada; y,
(b)
cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la expresión de dicha proteína de CEA de mono rhesus.
10. Una proteína del antígeno carcinoembriónico de mono rhesus (rhCEA) aislada y purificada que comprende una secuencia de aminoácidos según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8.
11. El uso de un vector de vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico aislado, comprendiendo la molécula de ácido nucleico aislado una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína del antígeno carcinoembriónico de mono rhesus (rhCEA) según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8, para la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar el cáncer en un mamífero.
12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 en la que el mamífero es humano.
13. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 en la que el vector es un vector de adenovirus o un vector de plásmido.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 en la que el vector es un vector adenoviral que comprende un genoma adenoviral con una delección en la región E1 del adenovirus, y una inserción en la región E1 del adenovirus, en la que la inserción comprende un casete de expresión que comprende:
(a)
un polinucleótido que codifica para la proteína de CEA de mono rhesus; y
(b)
un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 11 en la que el vector es un vector de vacuna de plásmido, que comprende una porción de plásmido y un casete expresable que comprende:
(a)
un polinucleótido que codifica para la proteína de CEA de mono rhesus; y
(b)
un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
16. Un vector de vacuna de adenovirus que comprende un genoma adenoviral con una delección en la región E1, y una inserción en la región E1 del adenovirus, en la que la inserción comprende un casete de expresión que comprende:
(a)
un polinucleótido que codifica para una proteína del antígeno carcinoembriónico (rhCEA) de mono rhesus según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8.
(b)
un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
17. Un vector de adenovirus de acuerdo con la reivindicación 16 que es un vector Ad5 ó Ad6.
18. Un plásmido vacuna que comprende una porción de plásmido y una porción de casete, comprendiendo la porción de casete:
(a)
un polinucleótido que codifica para una proteína del antígeno carcinoembriónico (rhCEA) de mono rhesus según se expone en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8.
(b)
un promotor ligado operativamente al polinucleótido.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP1658370A1 (en) * 2003-08-22 2006-05-24 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Synthetic gene encoding rhesus monkey carcinoembryonic antigen and uses thereof
US8188244B2 (en) * 2004-02-11 2012-05-29 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti Spa Carcinoembryonic antigen fusions and uses thereof
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5274087A (en) * 1986-08-13 1993-12-28 Molecular Diagnostics, Inc. cDNA coding for carcinoembryonic antigen (CEA)
CA2102623C (en) * 1991-05-06 2003-04-22 Jeffrey Schlom Recombinant virus expressing carcinoembryonic antigen and methods of use thereof
WO2001030847A1 (en) * 1999-10-22 2001-05-03 Aventis Pasteur Limited Modified gp100 and uses thereof
EP1658370A1 (en) * 2003-08-22 2006-05-24 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Synthetic gene encoding rhesus monkey carcinoembryonic antigen and uses thereof

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