ES2265643T3 - Bacteria de borrelia burgdorferi. - Google Patents
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Abstract
SE FACILITA UNA BACTERINA QUE INCLUYE CANTIDADES INMUNIZANTES EFECTIVAS DE DOS AISLADOS DE PROTECCION NO CRUZADA DE BORRELIA BURGDORFERI AISLADA, UN ADYUVANTE EN CANTIDAD SUFICIENTE PARA MEJORAR LA INMUNOGENICIDAD DE LOS AISLADOS DE BORRELIA BURGDORFERI INACTIVADOS Y UN VEHICULO APROPIADO. LA BACTERINA PUEDE CONTENER TAMBIEN UN TERCER AISLADO DE PROTECCION NO CRUZADA. SE FACILITA TAMBIEN UNA BACTERINA QUE INCLUYE CANTIDADES INMUNIZANTES EFECTIVAS DE UNA SUBUNIDAD ANTIGENICA DERIVADA DE UN PRIMER AISLADO DE BORRELIA BURGDORFERI Y DE UN SEGUNDO AISLADO DE BORRELIA BURGDORFERI DE PROTECCION NO CRUZADA, UN ADYUVANTE EN CANTIDAD SUFICIENTE PARA MEJORAR LA INMUNOGENICIDAD DE LAS SUBUNIDADES ANTIGENICAS Y UN VEHICULO APROPIADO. LA BACTERINA PUEDE CONTENER TAMBIEN UNA CANTIDAD INMUNIZANTE EFECTIVA DE UNA SUBUNIDAD ANTIGENICA DE UNA TERCERA BORRELIA BURGDORFERI. ADEMAS SE PROPORCIONA UNA BACTERINA QUE INCLUYE CANTIDADES INMUNIZANTES EFECTIVAS DE DOS AISLADOS DE PROTECCION NO CRUZADA DE BORRELIA BURGDORFERI INACTIVADA Y UNA O MAS SUBUNIDADES DE LOS AISLADOS DE PROTECCION NO CRUZADA, UN ADYUVANTE EN CANTIDAD SUFICIENTE PARA MEJORAR LA INMUGENICIDAD DE LA BORRELIA BURGDORFERI INACTIVADA Y SUBUNIDADES ANTIGENICAS ASI COMO UN VEHICULO APROPIADO. TAMBIEN SE PROPORCIONAN METODOS PARA INMUNIZAR A UN ANIMAL CONTRA LA INFECCION POR BORRELIA BURGDORFERI QUE SUPONEN LA ADMINISTRACION AL ANIMAL DE UNA DOSIS DE LA BACTERINA DESCRITA.
Description
Bacterina de Borrelia burgdorferi.
La enfermedad de Lyme fue descrita por primera
vez por Steere et al. en 1977, quienes dieron cuenta de una
epidemia de artritis en Lyme, Old Lyme y East Haddam, Connecticut.
En 1982, el Dr. Willy Burgdorfer descubrió una nueva espiroqueta en
el intestino medio de las garrapatas Ixodes dammini (véase
Burgdorfer, W. A. et al., (1982) Science 216:
1317-1319). Posteriormente se demostró que esta
espiroqueta generaba una respuesta inmunitaria en conejos
infectados equivalente a la de seres humanos con la enfermedad de
Lyme, y se sabe en la actualidad que se trata del agente etiológico
de la enfermedad. Después la espiroqueta se denominó Borrelia
burgdorferi.
Aunque las garrapatas Ixodes son los
vectores más frecuentes de Borrelia burgdorferi, también se
han encontrado las espiroquetas en moscas de venado, moscas de
caballo y mosquitos. Las espiroquetas penetran en el animal
hospedador cuando éste es picado por el vector. Las espiroquetas de
B. burgdorferi residen en varios tejidos del animal
hospedador, pudiendo dar lugar a una infección prolongada.
Se ha demostrado recientemente que Borrelia
burgdorferi posee un tipo único de ADN extracromosómico,
plásmidos lineales, con longitudes de 0,5 a 50 kb (Bergstrom, S.
et al., (1991) Scand. J. Infect. Dis. - Suppl. 77:
102-107). Dichos plásmidos contienen los genes que
codifican las dos proteínas principales de la superficie externa
(Osp) expresadas por B. burgdorferi, OspA y Osp B (Bergstrom
et al., 1991). Se cree que estas proteínas son los
principales antígenos implicados en la inmunidad contra la infección
por B. burgdorferi. Schwan y Simpson (Schwan, T. G. y
Simpson, W. J., (1991) Scand. J. Infect. Dis. - Suppl. 77:
94-101) describen la heterogeneidad de las
proteínas Osp A y B en diferentes cepas aisladas de B.
burgdorferi, así como en la misma cepa aislada cultivada a
diferentes temperaturas in vivo, y estudios en diferentes
etapas durante la infección de ratones.
La etapa inicial de la enfermedad de Lyme se
caracteriza por una lesión cutánea que se extiende, el eritema
crónico migratorio (Asbrink, E. y Hovmark, A., (1988) Ann. N.Y.
Acad. Sci. 539: 4-15; Halperin, J. J., (1991)
Scand. J. Infect. Dis. - Suppl. 77: 74-80).
Los individuos afectados contraen frecuentemente artritis. Sin
embargo, la artritis es crónica sólo un pequeño porcentaje de estos
individuos (Steere, A. C., (1991) Scand. J. Infect. Dis. - Suppl.
77: 51-54). Borrelia burgdorferi
también puede infectar el miocardio. Se ha descrito que la
afectación cardíaca en la enfermedad de Lyme es predominantemente
transitoria. No obstante, los estudios con animales han demostrado
que los músculos esquelético y cardíaco están habitualmente
afectados, y que las espiroquetas parecen estar localizadas en el
interior de las fibras musculares. Esta observación indica que las
espiroquetas son capaces de sobrevivir a largo plazo en el
hospedador, con lo que pueden causar complicaciones cardíacas
crónicas (Stanek, G. et al. (1991) Scand J. Infect. Dis.
-
Suppl. 77: 85-87).
Suppl. 77: 85-87).
B. burgdorferi también infecta el sistema
nervioso en un elevado porcentaje de los casos, dando lugar a una
amplia gama de trastornos agudos, crónicos y progresivos del sistema
nervioso central y periférico (Reik, L. et al. (1991) Ann.
N. Y. Acad. Sci. 539: 1-3). Los informes
publicados indican que las poblaciones europeas afectadas por la
enfermedad presentan manifestaciones clínicas muy llamativas de
trastornos neurológicos, mientras que los pacientes norteamericanos
presentan formas más leves de afectación del sistema nervioso
(Halperin, 1991; Halperin, J. J. et al., (1988) Ann. N. Y.
Acad. Sci. 539: 24-34). Sin embargo, Halperin
(1991) ha descrito que parece cada vez más claro que, por lo menos
en lo referente a la afectación del sistema nervioso, ambas
poblaciones presentan la misma gama de manifestaciones
neurológicas.
El diagnóstico de la enfermedad de Lyme depende
de una combinación del reconocimiento de las características
clínicas presentadas y también de la probabilidad de la exposición
en áreas infectadas de forma endémica. Sin embargo, a menudo se
atribuye la aparición de artritis a otras causas, y no se pone en
relación con una infección por espiroquetas. Los síntomas
neurológicos que pueden ser resultado de la infección por B.
burgdorferi pueden remedar diversos trastornos neurológicos
distintos (Reik et al., 1988). A estas complicaciones en el
diagnóstico se añade la dificultad de la detección de las
espiroquetas en los tejidos afectados.
La infección por Borrelia se trata con
antibióticos, por ejemplo, tetraciclina, penicilina, amoxicilina,
doxicilina, eritromicina y fenoximetilpenicilina (Neu, H., (1988)
Ann. N. Y. Acad. Sci., 539: 314-316;
Skoldenberg, B. et al. (1988) Ann. N. Y. Acad. Sci.
539: 317-323; Weber, K. et al. (1988)
Ann. N. Y. Acad. Sci. 539: 325-345; Luft.,
B. J. et al. (1988) Ann. N.Y. Acad. Sci. 539:
352-361). La ceftriaxona y los compuestos del mismo
tipo químico también ha sido útiles como agentes quimioterapéuticos
(Neu, 1988). Sin embargo, el establecimiento de protocolos para
tratamiento químico eficaz de la enfermedad de Lyme se ha visto
dificultado por la falta de datos que permitan determinar un
período temporal adecuado para el tratamiento. Además, faltan
estudios sobre la eficacia de los fármacos en pacientes humanos.
Este escenario terapéutico se complica adicionalmente por la
necesidad de alcanzar y mantener concentraciones de antibióticos
suficientemente elevadas en los tejidos para combatir la infección
crónica por Borrelia (Neu, 1988; Skoldenberg et al.,
1988).
Dadas las dificultades en la detección y el
tratamiento de la enfermedad de Lyme, así como el carácter
impracticable del control de la diseminación de vectores de
espiroquetas, se ha reconocido la necesidad de una vacuna para
inmunizar animales y seres humanos susceptibles contra la infección
por Borrelia burgdorferi. Se han estudiado vacunas en
modelos en hámster (Johnson, R. C. et al. (1988) Ann. N. Y.
Acad. Sci, 539: 258-263) y en rata
(Barthold, S. W. et al. (1988) Ann. N. Y. Acad. Sci.
539: 264-273). Se ha desarrollado una
bacterina de células enteras de Borrelia burgdorferi para su
utilización en animales domésticos (Patente U. S. n.º 4.721.617).
También se han desarrollado vacunas basadas en las proteínas Osp A
y/o B de B. burgdorferi. Sin embargo, estas vacunas con
células enteras y subunidades contienen, o proceden de, una sola
cepa aislada de B. burgdorferi.
También hay informes en la literatura que han
identificado la existencia de diversos grupos seroprotectores
distintos en cepas aisladas norteamericanas y europeas de la propia
B. burgdorferi y de Borrelia garinii y Borrelia
afzelli mediante estudios in vitro. Entre dichos informes
figuran los de Lovrich, S.D. et al, (1993) Infection and
Immunity 61 (10): 4367-4374, y Lovrich, S.D.
et al, (1994), The Journal of Infectious Diseases
170: 115-121. Estos resultados han sido
interpretados por algunos en el sentido en el que indican que serán
necesarias combinaciones de diferentes cepas aisladas, de sus
antígenos, o de sus proteínas inmunógenas protectoras, para
proporcionar una vacuna de carácter general. En relación con los
resultados descritos en dichos informes, además de otros informes,
Figrig E. et al. ((1995) J. Exp. Medicine 181:
215-221) señalaron que las evaluaciones de la
eficacia de las vacunas contra la enfermedad de Lyme deberían
utilizar el modo natural de transmisión y no basarse en sistemas de
clasificación o ensayos que no dependen del vector para la
transmisión de la infección, y presentan, frente a dichos informes,
inmunizaciones satisfactorias con OspA o OspB contra la infección
por B. burgdorferi heterogénea. Otros documentos de la
literatura que corroboran las ideas de Fikrig son, por ejemplo, el
documento EP-A-0 465 204 que
describe una vacuna que contiene una cantidad de los principales
antígenos de B. burgdorferi procedentes de una única cepa
aislada que es capaz de proteger a un mamífero susceptible de la
infección producida por varias cepas. Véase también, Telford et
al. J. Exp. Medicine, 1993, 178 (2):
755-8, que describen la protección contra B.
burgdorferi de características antigénicas variables conferida
utilizando un protocolo de inmunización activa con proteínas
recombinantes formadas por la fusión de la
glutatión-transferasa y las proteínas A o B de la
superficie de la membrana externa (OspA o OspB) y metodología de la
infección natural.
En contraposición, la bacterina de la presente
invención contiene, o procede de, por lo menos dos cepas aisladas,
sin protección cruzada, de B. burgdorferi. Por consiguiente,
la bacterina de la presente invención proporcionará protección
inmunitaria contra dos tipos diferentes de cepas aisladas de B.
burgdorferi, mientras que las bacterinas descritas previamente
proporcionan protección solamente contra un tipo de cepa aislada.
Por tanto, la bacterina proporcionada por la presente invención
será más útil para vacunar animales contra la enfermedad de
Lyme.
La presente invención proporciona una bacterina
que comprende en cada dosis una cantidad, eficaz para la
inmunización, de por lo menos dos cepas aisladas, sin protección
cruzada, de Borrelia burgdorferi inactivada, un adyuvante en
una cantidad eficaz para potenciar la capacidad inmunógena de la
Borrelia burgdorferi inactivada y un excipiente adecuado.
Las cepas aisladas sin protección cruzada de Borrelia
burgdorferi pueden seleccionarse a partir de los grupos
seroprotectores Wisconsin, Chicago y europeo de cepas aisladas de
Borrelia burgdorferi. En la actualidad son preferidas las
cepas aisladas de los grupos Wisconsin y Chicago. Sin embargo,
también pueden utilizarse cepas aisladas pertenecientes a otros
grupos seroprotectores. La bacterina puede comprender además una
tercera cepa aislada, sin protección cruzada, de Borrelia
burgdorferi inactivada.
La presente invención también proporciona una
bacterina que comprende en cada dosis una cantidad eficaz de por lo
menos una subunidad antigénica procedente de por lo menos una de dos
cepas aisladas, sin protección cruzada, de Borrelia
burgdorferi, un adyuvante en una cantidad eficaz para potenciar
la capacidad inmunógena de la subunidad o subunidades antigénicas o
la cepa aislada, y un excipiente adecuado.
La presente invención también proporciona una
bacterina que comprende en cada dosis una cantidad, eficaz para la
inmunización, de una subunidad antigénica procedente de una primera
cepa aislada de Borrelia burgdorferi, una cantidad, eficaz
para la inmunización, de una subunidad antigénica procedente de una
segunda cepa aislada, sin protección cruzada, de Borrelia
burgdorferi, un adyuvante en una cantidad eficaz para potenciar
la capacidad inmunógena de las subunidades antigénicas y un
excipiente adecuado. La bacterina puede comprender, además, una
cantidad, eficaz para la inmunización, de una subunidad antigénica
de una tercera cepa aislada, sin protección cruzada, de Borrelia
burgdorferi.
La presente invención también proporciona una
bacterina que comprende en cada dosis una cantidad, eficaz para la
inmunización, de por lo menos dos cepas aisladas, sin protección
cruzada, de Borrelia burgdorferi inactivada y una o más
subunidades antigénicas de las cepas aisladas sin protección
cruzada, un adyuvante en una cantidad eficaz para potenciar la
capacidad inmunógena de la Borrelia burgdorferi inactivada y
subunidades antigénicas y un excipiente adecuado.
La presente invención proporciona, además, la
utilización de una bacterina que comprende una cantidad, eficaz
para la inmunización, de por lo menos dos cepas aisladas, sin
protección cruzada, de Borrelia burgdorferi inactivada, un
adyuvante en una cantidad eficaz para potenciar la capacidad
inmunógena de la Borrelia burgdorferi inactivada y un
excipiente adecuado para la preparación de una composición
farmacéutica para la inmunización de animales contra la infección
por Borrelia burgdorferi.
La presente invención también proporciona la
utilización de una bacterina que comprende una cantidad eficaz de
por lo menos una subunidad antigénica procedente de por lo menos dos
cepas aisladas, sin protección cruzada, de Borrelia
burgdorferi inactivada, un adyuvante en una cantidad eficaz para
potenciar la capacidad inmunógena de las subunidades antigénicas, y
un excipiente adecuado para la preparación de una composición
farmacéutica para la inmunización de animales contra la infección
por Borrelia burgdorferi.
La presente invención también proporciona la
utilización de una bacterina que comprende una cantidad, eficaz
para la inmunización, de por lo menos dos cepas aisladas, sin
protección cruzada, de Borrelia burgdorferi inactivada y una
o más subunidades antigénicas de las cepas aisladas sin protección
cruzada, un adyuvante en una cantidad eficaz para potenciar la
capacidad inmunógena de la Borrelia burgdorferi inactivada y
de las subunidades antigénicas, y un excipiente adecuado para la
preparación de una composición farmacéutica para la inmunización de
animales contra la infección por Borrelia burgdorferi.
El animal puede ser un mamífero, incluidos, sin
limitarse a los mismos, seres humanos y perros. La presente
invención contempla una composición farmacéutica de tal naturaleza
que pueda aplicarse una dosis adicional de la vacuna al animal en
un intervalo de tiempo adecuado tras la administración de la dosis
anterior.
La Figura 1 muestra una curva de crecimiento
de un cultivo de B. burgdorferi viable. El eje vertical
indica el número de células (x 10^{7}) determinado por recuento
en una cámara de Petroff-Hauser.
La Figura 2 muestra el consumo de dextrosa y
producción de lactato en cultivos de B. burgdorferi. Los
círculos negros denotan la producción de lactato, y los círculos
vacíos el consumo de dextrosa en el cultivo. Los valores se
expresan en gramos por litro de medio de cultivo.
La Figura 3 muestra los valores obtenidos con
el pletismógrafo que muestran el desplazamiento de mercurio por las
patas de hámsteres testigos y vacunados. Los hámsteres fuera
inoculados con suero normal de hámster (NHS) o con suero de
hámsteres que habían sido inoculados con la cepa aislada indicada
(297 o 35211) de B. burgdorferi. El eje vertical muestra el
desplazamiento de mercurio en mm de Hg. El eje horizontal indica el
número de días posteriores a la infección en el que se midió el
desplazamiento de mercurio. Círculos vacíos = valores iniciales
correspondientes a hámsteres no inoculados y no sometidos a
exposición; círculos negros = hámsteres inoculados con antisueros
procedentes de hámsteres inoculados con una cepa aislada 297 viva de
B. burgdorferi y después sometidos a exposición a la cepa
297; cuadrados negros = hámsteres inoculados con antisueros
anti-297 y sometidos a exposición a la cepa aislada
35211; cuadrados vacíos = hámsteres inoculados con suero normal de
hámster y sometidos a exposición a la cepa aislada 35211; y
triángulos negros = hámsteres inoculados con suero normal de
hámster y sometidos a exposición a la cepa 297.
La Figura 4 muestra una prueba de la
capacidad inmunógena: Anticuerpos borrelicidas contra la cepa
S-1-10 medidos con el ensayo de
actividad borrelicida tras la vacunación con una bacterina bivalente
de B. burgdorferi y la exposición subsiguiente a garrapatas
infectadas con B. burgdorferi.
La Figura 5 muestra una prueba de la
capacidad inmunógena: Anticuerpos borrelicidas contra la cepa
C-1-11 medidos con el ensayo de
actividad borrelicida tras la vacunación con una bacterina bivalente
de B. burgdorferi y la exposición subsiguiente a garrapatas
infectadas con B. burgdorferi.
La Figura 6 muestra una prueba de la
capacidad inmunógena: Anticuerpos detectados contra el antígeno
S-1-10 medidos por ELISA tras la
vacunación con una bacterina bivalente de B. burgdorferi y la
exposición subsiguiente a garrapatas infectadas con B.
burgdorferi.
La Figura 7 muestra una prueba de la
capacidad inmunógena: Anticuerpos detectados contra el antígeno
C-1-11 medidos por ELISA tras la
vacunación con una bacterina bivalente de B. burgdorferi y la
exposición subsiguiente a garrapatas infectadas con B.
burgdorferi.
Las Figuras 8A y 8B muestran unas
inmunoelectrotransferencias de suero vacunado extraído en la primera
vacunación (PV), siete meses después de la segunda vacunación
previa a la exposición a garrapatas (PC), y ocho semanas después de
la exposición a garrapatas (PsC) contra las cepas aisladas
S-1-10 (Figura 8A) y
C-1-11 (Figura 8B).
Las Figuras 9A y 9B muestran unas
inmunoelectrotransferencias de suero vacunado extraído en la primera
vacunación (PV), siete meses después de la segunda vacunación
previa a la exposición a garrapatas (PC), y ocho semanas después de
la exposición a garrapatas (PsC) contra las cepas aisladas
S-1-10 (Figura 9A) y
C-1-11 (Figura 9B).
Las Figuras 10A y 10B muestran unas
inmunoelectrotransferencias de suero vacunado extraído en la primera
vacunación (PV), siete meses después de la segunda vacunación
previa a la exposición a garrapatas (PC), y ocho semanas después de
la exposición a garrapatas (PsC) contra las cepas aisladas
S-1-10 (Figura 10A) y
C-1-11 (Figura 10B).
Las Figuras 11A y 11B muestran unas
inmunoelectrotransferencias de suero vacunado extraído en la primera
vacunación (PV), siete meses después de la segunda vacunación
previa a la exposición a garrapatas (PC), y ocho semanas después de
la exposición a garrapatas (PsC) contra las cepas aisladas
S-1-10 (Figura 11A) y
C-1-11 (Figura 11B).
Las Figuras 12A y 12B muestran unas
inmunoelectrotransferencias de suero no vacunado extraído siete
meses después de la segunda vacunación previa a la exposición a
garrapatas (PC) contra las cepas aisladas
S-1-10 (Figura 12A) y
C-1-11 (Figura 12B).
Las Figuras 13A y 13B muestran unas
inmunoelectrotransferencias de suero no vacunado extraído a las ocho
semanas después de la exposición a garrapatas (PsC) contra las
cepas aisladas S-1-10 (Figura 13A) y
C-1-11 (Figura 13B).
La Figura 14 muestra un resumen del
porcentaje de perros que presentaban cojera tras la exposición a
garrapatas, medido durante siete meses.
Las Figuras 15A y 15B muestran unas
inmunoelectrotransferencias (cepa
C-1-11) de suero de perros vacunados
con bacterina formulada a dosis completa (5 x 10^{8} células de
cada cepa aislada por dosis). El suero se extrajo antes de la
vacunación (PV), antes de la exposición a garrapatas (PC), y doce
semanas después de la exposición.
Las Figuras 16A y 16B muestran unas
inmunoelectrotransferencias (cepa
S-1-10) de suero de perros vacunados
con bacterina formulada a dosis completa (5 x 10^{8} células de
cada cepa aislada por dosis). El suero se extrajo antes de la
vacunación (PV), antes de la exposición a garrapatas (PC), y doce
semanas después de la exposición.
Las Figuras 17A y 17B muestran unas
inmunoelectrotransferencias (cepa
C-1-11) de suero de perros vacunados
con bacterina formulada a dosis completa (5 x 10^{7} células de
cada cepa aislada por dosis). El suero se extrajo antes de la
vacunación (PV), antes de la exposición a garrapatas (PC), y doce
semanas después de la exposición.
Las Figuras 18A y 18B muestran unas
inmunoelectrotransferencias (cepa
C-1-11) de suero extraído de
testigos no vacunados en el momento de la exposición a garrapatas
(Figura 18A) y doce semanas después de la exposición a garrapatas
(Figura 18B).
Las Figuras 19A y 19B muestran unas
inmunoelectrotransferencias (cepa
S-1-10) de suero extraído de
testigos no vacunados en el momento de la exposición a garrapatas
(Figura 19A) y doce semanas después de la exposición a garrapatas
(Figura 19B).
La Figura 20 muestra un
resumen del porcentaje de perros que presentaban cojera tras la
exposición a garrapatas, medido durante doce meses.
La presente invención proporciona una bacterina
que comprende en cada dosis una cantidad, eficaz para la
inmunización, de por lo menos dos cepas aisladas, sin protección
cruzada, de Borrelia burgdorferi inactivada, un adyuvante en
una cantidad eficaz para potenciar la capacidad inmunógena de la
Borrelia burgdorferi inactivada y un excipiente
adecuado.
Típicamente, la cantidad, eficaz para la
inmunización, de las cepas aisladas, sin reactividad cruzada, de
Borrelia burgdorferi inactivada es una cantidad desde
aproximadamente 1 x 10^{4} microorganismos hasta aproximadamente
1 x 10^{10} microorganismos de cada cepa aislada. Es deseable que
la cantidad, eficaz para la inmunización, de las cepas aisladas de
Borrelia burgdorferi inactivada sea una cantidad desde
aproximadamente 1 x 10^{4} microorganismos hasta aproximadamente
1 x 10^{9} microorganismos de cada cepa aislada. Es más deseable
que la cantidad, eficaz para la inmunización, de las cepas aisladas
de Borrelia burgdorferi inactivada sea una cantidad desde
aproximadamente 1 x 10^{4} microorganismos hasta aproximadamente 1
x 10^{8} microorganismos de cada cepa aislada. En una forma de
realización preferida la cantidad, eficaz para la inmunización, de
las cepas aisladas de Borrelia burgdorferi inactivada es una
cantidad de aproximadamente 10^{7} microorganismos de cada cepa
aislada. En una forma de realización particularmente preferida la
cantidad, eficaz para la inmunización, de las cepas aisladas de
Borrelia burgdorferi inactivada es aproximadamente 5 x
10^{7} microorganismos de cada cepa aislada. En otra forma de
realización particularmente preferida la cantidad, eficaz para la
inmunización, de las cepas aisladas de Borrelia burgdorferi
inactivada es aproximadamente 5 x 10^{8} microorganismos de cada
cepa aislada.
A efectos de la presente invención, una cepa
aislada "inactivada" de Borrelia burgdorferi es una cepa
aislada que es capaz de generar una respuesta inmunitaria en un
animal, pero que es incapaz de infectar al animal. Las cepas
aisladas de Borrelia burgdorferi pueden inactivarse empleando
un agente seleccionado a partir del grupo formado por etilenimina
binaria, formol, \beta-propriolactona o calor. En
la forma de realización de la presente invención preferida en la
actualidad las cepas aisladas de Borrelia burgdorferi se
inactivan empleando etilenimina binaria.
Dichas por lo menos dos cepas aisladas, sin
protección cruzada, de Borrelia burgdorferi inactivada pueden
seleccionarse a partir de los grupos seroprotectores A, B o C de
cepas aisladas de Borrelia burgdorferi. Tal y como se
utilizan en la presente invención, la expresión "grupo
seroprotector A de cepas aisladas de B. burgdorferi"
define un grupo seroprotector de cepas aisladas de B.
burgdorferi que incluye la cepa
S-1-10 Wisconsin, y las cepas
aisladas 297 y B31; la expresión "grupo seroprotector B de cepas
aisladas de B. burgdorferi" define un grupo seroprotector
de cepas aisladas de B. burgdorferi que incluye la cepa
C-1-11 Chicago; y la expresión
"grupo seroprotector C de cepas aisladas de B.
burgdorferi" define un grupo seroprotector de cepas aisladas
de B. burgdorferi que incluye las cepas aisladas europeas. El
Ejemplo 10 describe los estudios de protección cruzada in
vitro de nueve cepas aisladas de B. burgdorferi que
indican que seis pertenecen al grupo seroprotector A, una pertenece
al grupo seroprotector B y dos pertenecen al grupo seroprotector C.
No obstante, se contempla la utilización de cepas aisladas sin
protección cruzada de otros grupos seroprotectores en la bacterina
de la presente invención. Los resultados expuestos en el Ejemplo 12
(véase a continuación) demuestran que existen por lo menos dos
grupos seroprotectores de Borrelia burgdorferi además de los
grupos seroprotectores A, B y C.
La protección cruzada puede determinarse
inoculando un animal, por ejemplo, un hámster, con una cepa aislada
viva de B. burgdorferi. El antisuero de dicho animal se
administra a continuación a cultivos de cepas aisladas de B.
burgdorferi. Los anticuerpos, junto con el complemento, deberían
causar la muerte celular en cultivos de la misma cepa aislada
utilizada para inocular al animal. Si los anticuerpos reconocen un
determinante antigénico en una segunda cepa aislada, provocarán la
muerte celular en un cultivo de dicha cepa aislada. Por
consiguiente, se dice que la primera y la segunda de las cepas
aisladas de B. burgdorferi presentan protección cruzada. La
protección cruzada también puede valorarse inoculando un animal con
una cepa aislada de B. burgdorferi, aislando el antisuero
del animal e inoculando otro animal de la misma especie con dicho
antisuero. Posteriormente este animal se somete a exposición a la
misma o a una segunda cepa aislada de B. burgdorferi. Los
anticuerpos deberían conferir inmunidad pasiva al animal receptor
frente a la exposición a la misma cepa aislada. Si los anticuerpos
confieren asimismo inmunidad pasiva contra una segunda cepa aislada,
las cepas aisladas presentan protección cruzada.
Las cepas aisladas que presentan protección
cruzada expresan proteínas de la superficie externa (Osp) que
comparten determinantes antigénicos reconocidos por los mismos
anticuerpos. Se dice que las cepas aisladas que presentan
protección cruzada pertenecen al mismo grupo seroprotector. Por
consiguiente, la expresión "grupo seroprotector" es un grupo
de cepas aisladas de B. burgdorferi que comparten proteínas
protectoras comunes de la superficie externa. Los anticuerpos que
reconocen dichas proteínas confieren inmunidad pasiva contra la
exposición a cualquier cepa aislada que pertenezca al mismo grupo
seroprotector.
Los anticuerpos dirigidos contra un miembro de
un par de cepas aisladas sin protección cruzada no conferirán
inmunidad pasiva contra el otro miembro del par. Por consiguiente,
las cepas aisladas sin protección cruzada pertenecen a diferentes
grupos seroprotectores. La vacunación con una cepa aislada de B.
burgdorferi inactivada no conferirá inmunidad pasiva a un
animal contra la exposición a cepas aisladas sin protección cruzada.
La bacterina de la presente invención, que comprende por lo menos
dos cepas aisladas sin protección cruzada, será eficaz para
producir anticuerpos borrelicidas contra los miembros de dos grupos
seroprotectores. Por consiguiente, la bacterina proporciona un
espectro más amplio de protección inmunitaria que el que se obtiene
con las vacunas disponibles en la actualidad, que no utilizan
múltiples cepas aisladas, sin protección cruzada, de B.
burgdorferi.
En una forma de realización de la presente
invención, las cepas aisladas sin protección cruzada de Borrelia
burgdorferi se seleccionan a partir de grupos seroprotectores A
y B de cepas aisladas de Borrelia burgdorferi. La cepa
aislada de Borrelia burgdorferi del grupo seroprotector A
puede ser la cepa S-1-10 Wisconsin,
o la cepa 297 o B31. En la forma de realización de la presente
invención preferida en la actualidad, la cepa aislada de
Borrelia burgdorferi del grupo seroprotector A es la cepa
S-1-10 Wisconsin. Preferentemente,
la cepa aislada de Borrelia burgdorferi del grupo
seroprotector B es la cepa C-1-11
Chicago. No obstante, la presente invención también puede
practicarse con otras cepas aisladas de B. burgdorferi
inactivada, que pertenecerán a la clase del grupo seroprotector
B.
Para los efectos de la presente invención, un
adyuvante es una composición de un material capaz de potenciar la
capacidad inmunógena de antígenos cuando se administra el adyuvante
como parte de una bacterina. Los ayudantes útiles en la bacterina
de la presente invención pueden seleccionarse a partir del grupo
formado por hidróxido de aluminio, Carbopol, lipopolisacárido (LPS)
y derivados de los mismos. El término "lipopolisacárido", tal
y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un grupo de
polisacáridos conocidos por los expertos en la materia debido a su
presencia en la pared celular de las bacterias, y que son útiles con
ayudantes. Ciertos ejemplos de lipopolisacáridos y derivados de los
mismos, que demuestran un efecto adyuvante, han sido utilizados en
vacunas. Se contempla la utilización de lipopolisacáridos o
derivados de los mismos en relación con la bacterina de la presente
invención. En la forma de realización de la presente invención
preferida en la actualidad el adyuvante es hidróxido de aluminio.
No obstante, cualquier otro adyuvante capaz de potenciar la
capacidad inmunógena de la Borrelia burgdorferi inactivada
puede utilizarse en la bacterina de la presente invención.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la
expresión una "cantidad eficaz" de un adyuvante es cualquier
cantidad del adyuvante eficaz para potenciar la capacidad inmunógena
de antígenos en la bacterina. Típicamente, la cantidad eficaz del
adyuvante es una cantidad desde aproximadamente 1,0% en volumen de
una dosis de la bacterina hasta aproximadamente 15% en volumen. Es
deseable que la cantidad eficaz del adyuvante de hidróxido de
aluminio sea una cantidad desde aproximadamente 5% en volumen hasta
aproximadamente 10% en volumen. Lo más preferible es que la
cantidad eficaz de adyuvante de hidróxido de aluminio sea 7,5% en
volumen.
El término "Excipientes", tal y como se
utiliza el término en la presente memoria, se refiere a los
diluyentes estándar para una bacterina, que son bien conocidos por
los expertos en la materia. En la forma de realización de la
presente invención preferida en la actualidad el excipiente
comprende un tampón acuoso, por ejemplo, solución salina
fisiológica, y conservantes, por ejemplo, nistatina y
gentamicina.
La bacterina de la presente invención puede
comprender, además, una cantidad, eficaz para la inmunización, de
una tercera cepa aislada, sin protección cruzada, de Borrelia
burgdorferi inactivada.
La presente invención proporciona la utilización
de una bacterina de la presente invención para la preparación de
una composición farmacéutica para inmunizar a un animal contra la
infección por Borrelia burgdorferi por medio de la cual se
administra al animal una dosis de la bacterina de la presente
invención. Para los expertos en la materia es un hecho bien
conocido que Borrelia burgdorferi es el agente causante de la
enfermedad de Lyme y que la infección sobreviene como resultado de
la picadura de garrapatas portadoras de bacterias en animales
homeotermos hospedadores. Se ha comprobado que los animales
sintetizan anticuerpos en respuesta a la inoculación de Borrelia
burgdorferi y, por consiguiente, la vacunación con Borrelia
burgdorferi inactivada, o con una subunidad de la misma, es una
estrategia factible para la prevención de la enfermedad de Lyme.
Dada la dificultad del diagnóstico correcto de la enfermedad de
Lyme, la incertidumbre de los protocolos de tratamiento y la
imposibilidad de controlar los vectores de la enfermedad, es
necesaria una estrategia preventiva para el control de la
enfermedad. Las vacunas contra B. burgdorferi utilizadas
previamente contenían solamente una cepa aislada de la bacteria.
Por tanto, dichas vacunas son, en el mejor de los casos, capaces de
inmunizar solamente frente a la exposición a cepas aisladas
pertenecientes al mismo grupo seroprotector que la cepa aislada
utilizada para la vacunación. La bacterina suministrada por la
presente invención puede proporcionar inmunidad frente a cepas
aisladas pertenecientes a por lo menos dos grupos seroprotectores,
por lo que ofrece una protección más amplia que las vacunas
disponibles en la actualidad.
Típicamente, el animal al que se administra la
vacuna de la presente invención es un mamífero. En una forma de
realización preferida, el mamífero es un ser humano. En otra forma
de realización preferida de la presente invención, el mamífero es
un perro. En la práctica de la presente invención el experto en la
materia será capaz de determinar, para cada animal que va a ser
inoculado, la edad apropiada a la que el animal es inmuncompetente,
es decir, que tiene un sistema inmunitario que funciona de forma
adecuada. Por consiguiente, sería apropiado administrar la
inmunización en el momento en el que el animal es inmuncompetente y,
preferentemente, antes de la exposición a Borrelia
burgdorferi. Por ejemplo, cuando el animal inoculado es un
perro, el perro tiene por lo menos aproximadamente doce semanas de
edad, preferentemente desde aproximadamente seis semanas hasta
aproximadamente dieciséis semanas de edad, en el momento en el que
se administra por primera vez la bacterina.
La presente invención también contempla que la
bacterina de la presente invención se ha de administrar al animal
en una dosis de vacuna adicional en un intervalo de tiempo adecuado
tras la administración de la dosis anterior. De este modo, la
presente invención contempla que se han de administrar múltiples
dosis de la bacterina inactivada de Borrelia burgdorferi a
un animal. La administración de más de una dosis de una bacterina
tiene por objeto potenciar la respuesta inmunitaria del animal
vacunado contra los antígenos bacterianos, en comparación con la
situación en la que se administra una sola dosis. La administración
de cada dosis debe realizarse de forma separada por un intervalo de
tiempo adecuado para permitir al sistema inmunitario del animal
responder de forma más eficaz a múltiples dosis de la bacterina que
en el caso en el que se administra una única dosis. Un intervalo de
tiempo "adecuado" entre la administración de múltiples dosis de
una bacterina a un animal es, por consiguiente, cualquier intervalo
de tiempo entre la administración de dosis de una vacuna suficiente
para provocar en el animal la generación de una respuesta
inmunitaria mayor que la que se obtiene cuando se administra una
sola dosis. Típicamente, el intervalo de tiempo adecuado entre la
administración de dosis de la bacterina de la presente invención es
desde aproximadamente dos semanas hasta aproximadamente cinco
semanas, preferentemente, aproximadamente tres semanas. La presente
invención contempla además la administración de una dosis adicional
de la bacterina al animal aproximadamente un año después de la
primera administración, y a intervalos anuales a partir de
entonces. Dicha administración, conocida como dosis de
"refuerzo", es una práctica estándar de la técnica de
vacunación. La bacterina inactivada de Borrelia burgdorferi
puede administrarse a través de cualquier vía aceptada en la
técnica para la administración de vacunas. La vía de administración
de la bacterina preferida en la actualidad es la inyección
intramuscular.
intramuscular.
La presente invención también proporciona una
bacterina que comprende en cada dosis una cantidad, eficaz para la
inmunización, de una o más subunidades antigénicas procedentes de
una primera cepa aislada de Borrelia burgdorferi, una
cantidad, eficaz para la inmunización, de una o más subunidades
antigénicas procedentes de una segunda cepa aislada, sin protección
cruzada, de Borrelia burgdorferi, un adyuvante en una
cantidad eficaz para potenciar la capacidad inmunógena de las
subunidades antigénicas, y un excipiente adecuado. Es un hecho bien
conocido en la técnica que los determinantes antigénicos de
Borrelia burgdorferi se denominan "proteínas de la
superficie externa" (Osp) y están codificadas por plásmidos
contenidos en las bacterias. Las proteínas Osp de B.
burgdorferi conocidas en la actualidad son las proteínas Osp A,
Osp B, Osp C, Osp D y Osp E. De ellas, las proteínas Osp A y Osp B
son las más estudiadas y caracterizadas. La bacterina de la presente
invención contempla la utilización de una proteína Osp A o una
combinación de la proteína Osp A y la proteína Osp B de por lo
menos dos cepas aisladas, sin protección cruzada, de B.
burgdorferi. La bacterina contempla asimismo la utilización de
otras proteínas Osp, bien solas o en combinación con las proteínas
Osp A y Osp B, de las que se sabe que generan una respuesta de
anticuerpos borrelicidas similar a la comprobada en el caso de la
proteína Osp A y la combinación de las proteínas Osp A/Osp B. Para
una revisión de la preparación de vacunas contra la enfermedad de
Lyme utilizando subunidades antigénicas y polipéptidos derivados de
las proteínas de la superficie externa de B. burgdorferi
puede consultarse la solicitud internacional PCT
n.º PCT/US94/08529, publicada el 9 de febrero de 1995 como
publicación internacional n.º WO 95/04145, cuyo contenido se
incorpora a la presente memoria a título de referencia.
Como se ha explicado anteriormente en la
presente memoria, las cepas aisladas con protección cruzada
comparten determinantes antigénicos que son susceptibles de ser
reconocidos por anticuerpos, que se unen a los mismos. De este
modo, las proteínas Osp de cepas aisladas con protección cruzada
comparten determinantes antigénicos y están sujetas al
reconocimiento por los mismos anticuerpos. Se dice que las cepas
aisladas con protección cruzada pertenecen al mismo grupo
seroprotector. La vacunación con un miembro de un grupo
seroprotector generará inmunidad contra la exposición a otras cepas
aisladas clasificadas en el mismo grupo seroprotector. Los
anticuerpos dirigidos contra un miembro de un par de cepas aisladas
sin protección cruzada no conferirán inmunidad pasiva contra el
otro miembro del par. Las cepas aisladas sin protección cruzada
pertenecen a diferentes grupos seroprotectores. La vacunación con
un miembro de un par de cepas aisladas sin protección cruzada no
conferirá inmunidad cruzada contra la exposición al otro miembro
del par. Así, la vacunación con una cantidad eficaz de una proteína
Osp A o con una combinación de proteína Osp A y proteína Osp B de
una cepa aislada conferirá inmunidad pasiva contra la exposición a
la misma cepa aislada, así como contra las otras cepas aisladas con
protección cruzada.
Típicamente, la cantidad, eficaz para la
inmunización, de cada una de las subunidades antigénicas derivadas
de cepas aisladas sin protección cruzada de Borrelia
burgdorferi es una cantidad desde aproximadamente un microgramo
hasta aproximadamente 1.000 microgramos.
La bacterina de la presente invención puede
comprender, además, una cantidad, eficaz para la inmunización, de
una o más subunidades antigénicas derivadas de una tercera cepa
aislada sin protección cruzada de Borrelia burgdorferi. Sin
embargo, la bacterina no se limita a contener una, dos o tres cepas
aisladas sin protección cruzada, sino que puede contener, además,
cuatro o más de dichas cepas aisladas.
La presente invención proporciona la utilización
de una bacterina que comprende tres o más cepas aisladas sin
protección cruzada de B. burgdorferi para la preparación de
una composición farmacéutica para inmunizar a un animal contra la
enfermedad causada por B. burgdorferi.
La presente invención proporciona una bacterina
que comprende en cada dosis una cantidad, eficaz para la
inmunización, de por lo menos dos cepas aisladas, sin protección
cruzada, de Borrelia burgdorferi inactivada y una o más
subunidades antigénicas de las cepas aisladas sin protección
cruzada, un adyuvante en una cantidad eficaz para potenciar la
capacidad inmunógena de la Borrelia burgdorferi inactivada y
las subunidades antigénicas, y un excipiente adecuado. También se
proporciona la utilización de dicha bacterina para la preparación de
una composición farmacéutica para inmunizar a un animal contra la
enfermedad causada B. burgdorferi, con la cual se ha de
administrar al animal una dosis de dicha bacterina.
La presente invención proporciona, además, la
utilización de una bacterina que comprende una cantidad, eficaz
para la inmunización, de por lo menos dos cepas aisladas, sin
protección cruzada, de Borrelia burgdorferi inactivada, un
adyuvante en una cantidad eficaz para potenciar la capacidad
inmunógena de la Borrelia burgdorferi inactivada y un
excipiente adecuado para la preparación de una composición
farmacéutica para la inmunización de animales contra la infección
por Borrelia burgdorferi.
En una forma de realización de la utilización
descrita anteriormente, la cantidad, eficaz para la inmunización,
de las cepas aisladas, sin reactividad cruzada, de Borrelia
burgdorferi inactivada es una cantidad desde aproximadamente
10^{4} microorganismos hasta aproximadamente 10^{10}
microorganismos de cada cepa aislada. En una forma de realización
preferida la cantidad, eficaz para la inmunización, de las cepas
aisladas, sin reactividad cruzada, de Borrelia burgdorferi
inactivada es una cantidad desde aproximadamente 10^{4}
microorganismos hasta aproximadamente 10^{9} microorganismos de
cada cepa aislada. En otra forma de realización preferida la
cantidad, eficaz para la inmunización, de las cepas aisladas, sin
reactividad cruzada, de Borrelia burgdorferi inactivada es
una cantidad desde aproximadamente 10^{4} microorganismos hasta
aproximadamente 10^{8} microorganismos de cada cepa aislada. En
una forma de realización preferida la cantidad, eficaz para la
inmunización, de las cepas aisladas, sin reactividad cruzada, de
Borrelia burgdorferi inactivada es aproximadamente 10^{7}
microorganismos de cada cepa aislada. En una forma de realización
particularmente preferida la cantidad, eficaz para la inmunización,
de las cepas aisladas, sin reactividad cruzada, de Borrelia
burgdorferi inactivada es aproximadamente 5 x 10^{7}
microorganismos de cada cepa aislada. En otra realización
particularmente preferida la cantidad, eficaz para la inmunización,
de las cepas aisladas, sin reactividad cruzada, de Borrelia
burgdorferi inactivada es aproximadamente 5 x 10^{8}
microorganismos de cada cepa
aislada.
aislada.
La invención también proporciona la utilización
de una bacterina que comprende una cantidad, eficaz para la
inmunización, de por lo menos dos cepas aisladas, sin protección
cruzada, de Borrelia burgdorferi inactivada y una o más
subunidades antigénicas de las cepas aisladas sin protección
cruzada, un adyuvante en una cantidad eficaz para potenciar la
capacidad inmunógena de la Borrelia burgdorferi inactivada y
las subunidades antigénicas, y un excipiente adecuado para la
preparación de una composición farmacéutica para la inmunización de
animales contra la infección por Borrelia burgdorferi.
En una forma de realización preferida de la
utilización descrita anteriormente la cantidad, eficaz para la
inmunización, de las subunidades antigénicas derivadas de cada una
de las cepas aisladas sin protección cruzada de Borrelia
burgdorferi es una cantidad desde aproximadamente diez
microgramos hasta aproximadamente 10.000 microgramos.
La invención se ilustra de forma adicional en la
sección experimental siguiente. La sección experimental y los
Ejemplos aquí mencionados se presentan para facilitar la comprensión
de la invención. Esta sección no pretende limitar de ningún modo,
ni debe interpretarse en tal sentido, la invención expuesta en las
reivindicaciones que se presentan a continuación.
\newpage
Equipo necesario:
Estéril: tubos de 20 ml, frascos de 250
ml y vasijas de 10 litros; fermentador de 200, 500 o 3.000 litros;
pipetas serológicas; imanes; tanques para el mezclado y para el
almacenamiento; y centrifugadora.
No estéril: motores para agitación
magnética; material para pipetas; bombas peristálticas; tubos y
pinzas para tubos; cámara de recuento de Petroff/Hauser;
microscopio de campo oscuro; batas, guantes, gorras, máscaras,
cubrezapatos y mascarillas faciales; micropipetas y puntas de
micropipeta; blancos con solución salina.
Microorganismos utilizados: Se utilizan
dos cepas aisladas de Borrelia burgdorferi para la
preparación del producto: las cepas aisladas
C-1-11 y
S-1-10 de B. burgdorferi
obtenidas del Dr. Steven M. Callister, Gundersen Medical
Foundation, La Crosse, WI. La bacterina contendrá recuentos
ajustados de cada cultivo de cepas de Borrelia, para cumplir las
exigencias estándar de potencia.
Identidad de cada microorganismo y frecuencia
de los métodos de identificación: La identificación se realiza
sobre la base de las características morfológicas y serológicas. La
identificación serológica de los cultivos madre originales para
siembra se realizará con antisueros específicos, utilizando una
prueba de inmunofluorescencia indirecta.
Virulencia, pureza, mantenimiento y tipo de
los cultivos: La virulencia de los cultivos no es un criterio
esencial de la capacidad antigénica. La pureza de la cepa se
determina mediante examen cuidadoso del cultivo utilizando
microscopía de campo oscuro, tinción de Gram, identificación
serológica con antisueros específicos, y pruebas con arreglo al
Título 9 del C.F.R. (siglas inglesas del Código de Reglamentos
Federales), Parte 113.27, utilizando muestras de 0,5 ml a 1,0
ml.
Los cultivos se mantienen en medio de
Barbour-Stoenner-Kelly (BSK), que se
prepara como se describe más adelante (véase el Ejemplo 5). Los
subcultivos se preparan en medio de BSK, y el número de subcultivos
se limita a 10.
Composición de los cultivos para siembra y
para producción: Los cultivos para siembra y para producción se
hacen crecer en medio de BSK. Los cultivos madre para siembra se
hacen crecer en medio de BSK y se congelan tras añadir glicerol
(concentración final de 10-14%). Los cultivos madre
congelados se mantienen a -70ºC, o menos.
Naturaleza, tamaño y forma de los recipientes
utilizados para el crecimiento de los cultivos: Los cultivos
madre congelados se hacen crecer en tubos de tapón roscado de 20 ml
que contienen diez mililitros de medio. Los tubos de cultivo de 20
ml se utilizarán para inocular frascos o matraces de 250 ml que
contienen 200 ml de medio. Los frascos o matraces de 250 ml se
utilizarán para inocular vasijas de 10 litros que contienen seis a
ocho litros de medio. Las vasijas de 10 litros pueden utilizarse
para inocular vasijas de 40 litros que contienen 25 a 35 litros de
medio, un fermentador de 200 litros que contiene 90 a 175 litros de
medio, un fermentador de 500 litros que contiene 175 a 375 litros
de medio, o un fermentador de 3000 litros que contiene 800 a 2500
litros de medio. El fermentador de 200 litros puede utilizarse para
inocular un fermentador de 3.000 litros que contiene 300 a 2300
litros de medio.
Condiciones de almacenamiento de los cultivos
para siembra: Los cultivos madre se mantienen en medio de BSK
en forma de cultivos congelados a -70ºC, o menos.
Métodos para la preparación de suspensiones
para siembra o inoculación: Se descongelan cuatro viales de un
mililitro de la cepa deseada de B. burgdorferi y se añaden a
cada uno 9,0 ml de medio de
Barbour-Stoner-Kelly (BSK) (véase
más adelante). Los cultivos madre y para siembra se propagan durante
10 a 96 horas, controlando la velocidad de crecimiento, a 32ºC
\pm 1ºC antes de su transferencia a medio de BSK. Los cultivos
para siembra se controlan de forma sistemática por microscopía para
comprobar la pureza antes de la transferencia en medio de
producción. El crecimiento celular de los tubos de muestra se midió
por recuento en cámara de Petroff/Hauser a las 12 horas y en cada
hora subsiguiente, hasta su propagación por pases. Los cultivos de
B. burgdorferi se propagan por pases a una concentración
superior o igual a 1 x 10^{8} células por mililitro. Cuando la
concentración de células es superior a 1 x 10^{8} células/ml se
realiza la tinción de Gram en cada tubo de cultivo y se mezclan dos
tubos de cultivo aceptables para formar un inóculo de 250 ml. Se
inoculan cuatro matraces de 250 ml que contienen 196,0 ml de medio
de BSK con cuatro mililitros del inóculo descrito anteriormente y
se incuban después a 32ºC de forma estacionaria durante 48 a 60
horas. El crecimiento celular se determina por recuento en cámara
de Petroff/Hauser a las 24 horas y, después, cada seis horas, hasta
su propagación por pases. La propagación por pases se realiza a
concentraciones superiores o iguales a 1 x 10^{8} células por
mililitro. Cuando la concentración de células alcanza este nivel se
realiza la tinción de Gram en cada matraz de cultivo, y se mezclan
dos matraces aceptables para su inoculación en una vasija de diez
litros. Cada una de las tres vasijas de diez litros, que contienen
5880 ml de medio de BSK, se inocula con 120 ml del cultivo descrito
anteriormente. Los matraces se incuban después a 32ºC durante 36 a
48 horas, agitando lentamente con una barra magnética. Se determina
el crecimiento celular de una vasija mediante recuento en cámara de
Petroff/Hauser a las 10 horas, y después cada seis horas, hasta su
propagación por pases, que se realiza a una concentración superior
o igual a 1 x 10^{8} células por mililitro. Cuando la
concentración de células en los cultivos alcanza este nivel se
realiza la tinción de Gram en cada vasija de cultivo, y se utiliza
una vasija que contiene seis litros para inocular un fermentador de
200 litros que contiene 144 litros de medio de BSK. Los
fermentadores se incuban a 32ºC durante aproximadamente 96 horas,
agitando lentamente (55 rpm), manteniendo el pH a 7,2 \pm 0,2. A
las 12, 24, 48 y 72 horas, y después cada cuatro horas, se determina
el crecimiento celular por recuento en cámara de Petroff/Hauser y
se controla la tinción de Gram. El cultivo se inactiva cuando
alcanza la fase logarítmica tardía de crecimiento (aproximadamente
5-7 x 10^{8} células por mililitro).
La Figura 1 muestra una curva de crecimiento de
un cultivo de Borrelia burgdorferi. Como puede apreciarse en
la figura, el crecimiento exponencial del cultivo comenzó entre
aproximadamente 24 y aproximadamente 48 horas, y continuó hasta
aproximadamente 96 horas, momento en el que el crecimiento se
estabilizó.
La Figura 2 muestra el consumo de dextrosa y la
producción de lactato de un cultivo de Borrelia burgdorferi.
Como puede apreciarse en la figura, la producción de lactato aumentó
constantemente en el cultivo, lo que indica la importancia del
control del pH en el cultivo. Además, puede apreciarse en la figura
que el consumo de dextrosa aumenta con el tiempo, lo que indica que
las bacterias la están utilizando como fuente de energía, por lo
que es necesario añadir más para mantener la viabilidad o el
crecimiento del cultivo.
Técnica de inoculación de medios para siembra
y para producción: El medio para siembra se inocula mediante
transferencia directa a partir del cultivo madre congelado. El medio
para producción se inocula mediante transferencia directa a partir
del cultivo para siembra. La inoculación del cultivo no utiliza más
del 2% del inóculo.
Período de tiempo, condiciones y nivel de la
temperatura de incubación: Tras la inoculación, los recipientes
se incuban a 32ºC \pm 1ºC durante 10 a 96, y los fermentadores
para producción se incuban a 32ºC \pm 1ºC durante 24 a 120 horas.
Se añade solución estéril de NaOH según sea necesario para ajustar
el pH hasta 7,2 \pm 0,2.
Naturaleza y magnitud del crecimiento: A
diario, durante toda la incubación, se examinan los cultivos de
producción inoculados por microscopía para la cuantificación en
cámara de Petroff/Hauser. Al final del período de incubación, los
cultivos se controlan por microscopía para comprobar la
contaminación utilizando tinción de Gram y/o exploración en campo
oscuro.
Tiempos mínimo y máximo para la recogida de
células: El período mínimo de incubación hasta la recogida de
células es 24 horas. El período máximo de incubación hasta la
recogida de células es 120 horas.
Técnica de recogida de células: Al final
del período de incubación se controla cada cultivo de producción
por microscopía para comprobar la pureza por tinción de Gram y/o
exploración en campo oscuro, y se extraen muestras para recuento de
células totales. Los recipientes del cultivo se almacenan a 2ºC a
7ºC.
Especificaciones del material aceptable para
la recogida de células: Los medios de producción aceptables
contienen cultivos puros de Borrelia burgdorferi,
verificados por tinción de Gram y/o microscopía de campo oscuro, y
tienen un recuento de células de Borrelia no inferior a 1 x
10^{8} microorganismos por mililitro. La concentración se
determina utilizando una cámara de recuento de Petroff/Hauser (o
equivalente).
Eliminación de los materiales desechados:
Todos los materiales que no se han utilizado en la preparación de
la bacterina se eliminan con arreglo a la Circular n.º 800.56 de los
Servicios Veterinarios.
Método de inactivación: El crecimiento
del cultivo de producción se inactiva con etilenimina binaria (BEI).
La inactivación se lleva a cabo a 32ºC \pm 2ºC. Se prepara la
cantidad adecuada de BEI en forma de solución 0,344 M (7,05%). Se
prepara una solución de BEI al 7,05% disolviendo 70,48 gramos de
clorhidrato de 2-bromoetilamina (peso molecular
204,89) y 8,00 gramos de NaOH (PM: 40,00) en un litro de agua
desionizada. La solución disuelta se incuba a 37ºC durante dos
horas y después se añade al cultivo en una proporción de 30 ml por
litro con agitación continua (agitación lenta). La inactivación se
lleva cabo durante no menos de 24 horas a un pH de 7,3 \pm 0,2
con agitación (agitación lenta). Una vez completada la inactivación
se neutraliza la BEI añadiendo tiosulfato de sodio estéril. La
cantidad adecuada de solución de tiosulfato de sodio estéril se
prepara en forma de solución 3,015 M (47,7%) disolviendo 477,0
gramos de tiosulfato de sodio en un litro de agua desionizada. Esta
solución se filtra a través de un filtro de 0,2 micrómetros antes de
su utilización, y se añade al cultivo inactivado en una proporción
de 10,6 ml por litro con agitación continua (agitación lenta). Se
deja transcurrir la reacción de neutralización durante no menos de
6 horas a 32ºC con agitación continua (agitación lenta) a un pH de
7,3 \pm 0,2. Se añaden sulfato de gentamicina y nistatina al
cultivo a concentraciones finales de 30,0 microgramos por
mililitro, y 30,0 unidades por mililitro, respectivamente. A
continuación se agrupan los microorganismos del cultivo de
producción en tanques de retención estériles para su procesamiento
ulterior.
Pruebas de inactivación: Se lleva a cabo
una prueba de la inactivación del cultivo a granel con arreglo al
Título 9 del C.F.R, Parte 113.100. Se extrae una muestra del cultivo
inactivado y se inocula un tubo que contiene 29 ml de medio de BSK
con 1,0 ml de la muestra. Al mismo tiempo, una muestra del mismo
microorganismo a una concentración de 10 células por mililitro, que
se sabe que es viable como testigo positivo del crecimiento, se
diluye en una relación 1:30 en medio de BSK recién preparado
utilizando un blanco de medio de BSK de 29,0 ml y diluyéndolo en
medio de BSK desde 10^{-1} hasta 10^{-4} empleando blancos de
medio de BSK de 9,0 ml. Los tubos se incuban durante 14 días a 32ºC
\pm 2ºC y después se examinan para comprobar el crecimiento. La
falta de crecimiento de Borrelia en el tubo que contiene la muestra
inactivada indica que la prueba es satisfactoria. Los tubos
inoculados con el microorganismo vivo deben tener una DI_{50}
\leq 100 y \geq 1 según el método de
Reed-Muench.
Composición, proporciones, conservantes y
ayudantes:
1. Adyuvante de hidróxido de aluminio:
Se añade hidróxido de aluminio [Al(OH)_{3}]
Rehydragel® HPA obtenido de Reheis Chemical Company (Berkley
Heights, Nueva Jersey) a la suspensión de bacterias a una
concentración final no inferior a 1,5 mg (0,15%) de óxido de
aluminio (A1203) por dosis.
2. Solución salina: Puede añadirse
solución salina fisiológica estéril (NaCl al 0,85%, pH 7,2 \pm
0,2) como diluyente.
3. Conservantes: Se añaden sulfato de
gentamicina y nistatina al producto a una concentración final no
superior a 30,0 microgramos por mililitro, y 30,0 unidades por
mililitro, respectivamente.
4. pH: El pH del producto completado se
ajusta hasta 7,3 \pm 0,1 con NaOH o HCl estériles.
Método y magnitud de la concentración: El
material de la recogida de Borrelia se concentra por
centrifugación y resuspensión en solución salina estéril que
contiene sulfato de gentamicina y nistatina hasta concentraciones
finales de 30,0 microgramos/ml y 30,0 unidades/ml, respectivamente.
El material de la recogida de Borrelia puede concentrarse hasta
1/20 del volumen original.
Procedimientos para la normalización del
antígeno: La bacterina se prepara utilizando recuento en cámara
de Petroff/Hauser determinado tras la concentración y la
resuspensión del material del sedimento. La concentración de
Borrelia en cada cultivo se determina como se ha descrito
anteriormente. Puede utilizarse una mezcla de cultivos con
concentraciones altas y bajas para ajustar las concentraciones
finales.
Preparación de una serie:
1. Preparación de unidades para formar
una serie: Se extraen suficientes recipientes para el almacenamiento
a granel de mezclas individuales de cada cepa aislada de
Borrelia del refrigerador mantenido a 4ºC a 7ºC. Si es
necesario, se utiliza solución salina fisiológica estéril (0,85%
NaCl) como diluyente. El diluyente se esteriliza en autoclave a
121ºC \pm 2ºC durante 30 minutos, o cuando la sonda en el líquido
alcance 119°C durante no menos de 20 minutos.
2. Ejemplo de preparación de una
serie:
| Ingredientes | Microorganismos | Producto acabado | Cuentas finales por | |
| por ml en | Litros | 1,0 ml de dosis no | ||
| Concentración | inferiores a | |||
| B. burgdorferi Cepa C-1-11 | 8,0 x 10^{9} | 18,750 | 5,0 x 10^{8} | |
| B. burgdorferi Cepa S-1-10 | 8,0 x 10^{9} | 18,750 | 5,0 x 10^{8} | |
| Óxido de aluminio (Al_{2}O_{3} al 2%) | - - - - - - - - - - - - | 22,500 | - - - - - - - - - - - - | |
| Sulfato de gentamicina (20,0 mg por ml) | - - - - - - - - - - - - | 0,394 | - - - - - - - - - - - - | |
| Nistatina (25,000 unidades por ml) | - - - - - - - - - - - - | 0,315 | - - - - - - - - - - - - | |
| Solución salina fisiológica | - - - - - - - - - - - - | 239,291 | - - - - - - - - - - - - | |
| Volumen total | \overline{300.000} | litros |
\vskip1.000000\baselineskip
El pH se ajusta a 7,3 \pm 0,1 con NaOH o HCl
estériles. El tamaño promedio de la serie es 300 litros. El tamaño
máximo de la serie es 900 litros. Se mezclan suspensiones de
Borrelia inactivada en un tanque de acero inoxidable
esterilizado para su preparación. Tras el mezclado, se almacena toda
la serie en un tanque de preparación de acero inoxidable
esterilizado o se divide en recipientes más pequeños y se almacena a
2ºC a 7ºC hasta el momento de llenado, o bien, puede introducirse
el producto inmediatamente en viales y almacenarse a 2ºC a 7ºC.
3. Volumen de llenado y tipo de vial
utilizado: La bacterina se introduce en viales a 1,20 ml \pm 0,05
ml por cada vial de dosis. Los viales que se van a utilizar son dos
viales de vidrio de dos mililitros.
Método y técnica del llenado y del sellado
del envase final: Se llenan viales estériles mediante
procedimiento mecánico o manual estéril del lote con agitación
continua. Los viales llenados se cubren con tapones estériles, de
forma mecánica o manual, y se sellan con tapas de aluminio.
Cantidad de material antigénico por dosis en
el envase final: cada dosis contiene cantidades de
microorganismos no inferiores a las siguientes:
Cepa aislada
C-1-11 de B. burgdorferi: 5 x
10^{8} microorganismos/ml.
Cepa aislada
S-1-10 de B. burgdorferi: 5 x
10^{8} microorganismos/ml.
Pureza: Cada serie o subserie se analiza
para comprobar la presencia de bacterias y hongos con arreglo al
Título 9 del C.F.R, Parte 113.26.
Seguridad: Las pruebas de seguridad se
llevan a cabo en los envases a granel o finales con arreglo al
Título 9 del C.F.R, Partes 113.38 y 113.40, que dispone la
realización de una prueba de seguridad en perros utilizando una
dosis 2X (2 cc) administrada por inyección intramuscular.
Potencia: Las pruebas de potencia se
realizan en los envases preparados a granel o finales. Las pruebas
de potencia se realizan utilizando una prueba de ELISA de captura
de antígeno. Las series satisfactorias deben tener una potencia
relativa \geq 1,0 determinada por la versión 3.0 del software para
el cálculo de la potencia relativa del Programa de Reactivos
Biológicos en Veterinaria del Departamento de Agricultura de los EE.
UU.
Forma y tamaño de los envases finales en los
que se va a distribuir el producto: La bacterina se comercializa
en un vial de 2,0 ml, de una sola dosis (una dosis: 1,0 ml). Se
completa el etiquetado del envase final.
Extracción, almacenamiento y envío de
muestras representativas: Se extraen muestras representativas de
cada serie o subserie para APHIS-USDA con arreglo
al Título 9 del C.F.R, Parte 113.3, empleando un colector de
muestras autorizado de la empresa.
Fecha de caducidad del producto: La fecha
de caducidad que figura en el producto será 24 meses desde el inicio
de las pruebas de potencia satisfactorias con arreglo al Título 9
del C.F.R, Parte 114.13. La fecha será confirmada con arreglo al
Título 9 del C.F.R, Parte 114.13.
Utilización, dosificación y vía de
administración para cada especie animal: La bacterina está
recomendada para la vacunación de perros sanos contra la enfermedad
causada por B. burgdorferi. Cada dosis contiene 1,0 ml (1,0
cc). Se vacunan los perros sanos a las 12 semanas de edad, o
superior, con dos dosis, separadas por intervalo de dos a tres
semanas. Los cachorros de menos de 6 semanas de edad deben ser
vacunados de nuevo cada 2 a 3 semanas hasta que alcancen una edad
de por lo menos 12 semanas. Se recomienda la revacunación anual con
una dosis. La vía de administración es la inyección
intramuscular.
Composición: El medio se utiliza para
hacer crecer cultivos de Borrelia para su utilización en la
preparación de bacterinas. Tras lavar con detergente, se aclara a
fondo todo el material de vidrio con agua desionizada y después se
esteriliza en autoclave. Todos los ingredientes se añaden lentamente
en el orden mencionado en la lista con agitación lenta y continua.
El medio de base se prepara de la siguiente manera:
| Ingredientes: | Cantidad | |
| 1) | Agua desionizada | 500,00 ml |
| 2) | HEPES | 4,60 g |
| 3) | Neopeptona | 3,83 g |
| 4) | Citrato de sodio | 0,54 g |
| 5) | Glucosa | 3,83 g |
| 6) | Bicarbonato de sodio | 1,69 g |
| 7) | TC Yeastolate | 1,92 g |
| 8) | Ácido pirúvico, sal de sodio | 0,61 g |
| 9) | N-acetil-glucosamina | 0,31 g |
La solución se agita lentamente para disolver
todos los componentes. Se añaden a la mezcla 76,70 ml de 10 X CMRL
1066 sin glutamina, con agitación continua y lenta.
Preparación del medio completo: Para
cultivos en tubo de 10,0 ml o en frasco de 200,0 ml se añaden
lentamente al medio de base los siguientes ingredientes, con
agitación continua:
| Ingredientes: | Cantidad/litro | |
| 1) | Suero de conejo estéril, termoinactivado | 49,00 ml |
| (El suero de conejo estéril se calienta durante 30 minutos a 58,5ºC \pm 0,5ºC) | ||
| 2) | Seroalbúmina bovina | 38,34 g |
| 3) | Se ajusta el pH a 7,3 \pm 0,1 con NaOH 2 N. |
Se añade una cantidad suficiente (c.s.) a 800 ml
con agua desionizada a temperatura ambiente. Se esteriliza la
mezcla utilizando un filtro de 0,2 micrómetros con bajo nivel de
unión a proteínas.
| 4) | Gelatina estéril | 200,00 ml |
La gelatina estéril se prepara añadiendo 10,74 g
de gelatina a 200,0 ml de agua desionizada. La suspensión se
esteriliza en autoclave durante 30 minutos a 121 2ºC o cuando una
sonda en el líquido alcanza 119ºC durante no menos de 20 minutos.
La solución se enfría hasta por lo menos 45ºC \pm 2ºC antes de la
adición del medio de base.
Para cultivos en vasija de 10 litros o
fermentadores de 100 litros o más, se añaden los siguientes
ingredientes lentamente con agitación continua al medio de
base:
| Ingredientes: | Cantidad/litro | |
| 1) | Suero de conejo estéril, termoinactivado | 49,00 ml |
| (El suero de conejo estéril se calienta durante 30 minutos a 58,5ºC \pm 0,5ºC) | ||
| 2) | Seroalbúmina bovina | 38,34 g |
Se ajusta el pH a 7,3 \pm 0,1 con NaOH 2 N. Se
añade suficiente cantidad de agua desionizada hasta completar un
litro. Se esteriliza la mezcla utilizando un filtro de 0,2
micrómetros con bajo nivel de unión a proteínas.
Información sobre los ingredientes:
1. Seroalbúmina bovina (BSA): La BSA en
polvo se adquiere de un proveedor comercial. La BSA en polvo
utilizada en la producción puede ser analizada con arreglo al Título
9 del C.F.R, Partes 113.50 y 113.53, y autorizarse su empleo. En
ausencia de dichas pruebas, la BSA en polvo puede irradiarse con
rayos gamma a no menos de 2,7 megarrads.
2. Suero de conejo: El suero de conejo
se adquiere de un proveedor comercial. El suero de conejo utilizado
en la producción puede analizarse con arreglo al Título 9 del C.F.R,
Partes 113.50 y 113.53, y autorizarse su empleo. El suero de conejo
puede irradiarse con rayos gamma a no menos de 2,7 megarrads con
arreglo a las pruebas dispuestas en el Título 9 del C.F.R, Partes
113.50 y 113.53.
Todos los componentes químicos eran de calidad
U.S.P., o equivalente.
Pruebas: El medio se considera estéril,
por lo que no se somete a pruebas.
Conservación y utilización: El medio
estéril se conserva a 4ºC a 30ºC hasta su utilización. El medio
puede utilizarse inmediatamente después de la preparación o durante
un período no superior a seis meses. El medio se utiliza para hacer
crecer cultivos de Borrelia para su utilización en la
producción de bacterina.
Se extrajo sangre de hámsteres vacunados con la
bacterina de Borrelia burgdorferi, inactivada con etilenimina
binaria (BEI), calor o formol (FORM.), y se sometió a los animales
a exposición dos o tres semanas, según se indica, después de la
vacunación única. Los animales vacunados fueron sometidos a
exposición con una mezcla de tres cepas aisladas de Borrelia
burgdorferi. Los animales no vacunados fueron utilizados como
testigos que no habían sido inoculados con la bacterina de
Borrelia burgdorferi, pero que fueron sometidos a exposición
con la cepa aislada individual, como se indica con el nombre de la
cepa aislada, o con una mezcla de tres cepas aisladas, como se
indica con Tri.
| Vacunados | |||
| \hskip0.5cmBacterina | ELISA | AB | Porcentaje de infección |
| \hskip0.5cmBEI | 0,258 \pm 0,070 | 56 \pm 23 | 0 (0/3) |
| \hskip0.5cmCALOR | 0,157 \pm 0,068 | 43 \pm 30 | 0 (0/5) |
| \hskip0.5cmFORM. | 0,139 \pm 0,132 | 35 \pm 32 | 25 (1/4) |
| No vacunados | |||
| \hskip0.5cmExposición a la | ELISA | AB | Porcentaje de infección |
| \hskip0.5cmcepa aislada | |||
| \hskip0.5cmP/Bi | 0,003 \pm 0,008 | 0 \pm 0 | 0 (0/3) |
| \hskip0.5cmWis. | 0,000 \pm 0,000 | NT | 100 (4/4) |
| \hskip0.5cmChi. | 0,000 \pm 0,000 | NT | 100 (3/3) |
| \hskip0.5cmTri. | NT | NT | 80 (4/5) |
Exposición tres semanas después
de la
vacunación
| Vacunados | |||
| \hskip0.5cmBacterina | ELISA | AB | Porcentaje de infección |
| \hskip0.5cmBEI | 0,218 \pm 0,018 | 34 \pm 25 | 50 (2/4) |
| \hskip0.5cmCALOR | 0,259 \pm 0,059 | 29 \pm 19 | 75 (3/4) |
| \hskip0.5cmFORM. | 0,384 \pm 0,202 | 40 \pm 18 | 100 (4/4) |
| No vacunados | |||
| \hskip0.5cmExposición a la | ELISA | AB | Porcentaje de infección |
| \hskip0.5cmcepa aislada | |||
| \hskip0.5cmP/Bi | 0,000 \pm 0,000 | 4 \pm 2 | 0 (0/4) |
| \hskip0.5cmWis. | 0,000 \pm 0,000 | NT | 50 (2/4) |
| \hskip0.5cmChi. | 0,000 \pm 0,000 | NT | 50 (2/4) |
| \hskip0.5cmTri. | NT | NT | 67 (2/3) |
| \hskip0.5cmAB = Ensayo de actividad borrelicida |
Los resultados presentados en la Tabla 1
demuestran que no hay una diferencia significativa (P = 0,05) en la
respuesta serológica con respecto al método de inactivación de
células de B. burgdorferi a las 2 o 3 semanas después de la
vacunación. Las respuestas serológicas disminuyeron o aumentaron
ligeramente a partir de las 2 a 3 semanas posteriores a la
vacunación; no obstante, la protección (relativa a las cepas
aisladas C-1-11 y
S-1-10) disminuyó en cada grupo
vacunado a las 3 semanas después de la vacunación. La cepa aislada
P/Bi no es virulenta, y se comprobó que no infectaba los tejidos de
los animales vacunados o de los testigos.
Se analizó la capacidad de la bacterina para
estimular una respuesta inmunitaria en perros. Los perros fueron
vacunados con la bacterina proporcionada por la presente memoria
(V), o bien, no fueron vacunados (NV), y se determinaron sus
niveles de anticuerpos contra los antígenos de recubrimiento de
S-1-10 y
C-1-11 mediante la técnica ELISA a
las tres semanas después de la primera vacunación y a las dos
semanas después de una segunda vacunación posterior, según se
indica.
| Grupo | Prevac. | Tres semanas tras la vacunación | Dos semanas tras la vacunación |
| V | 0,013 \pm 0,020 | 0,672 \pm 0,128 | 1,369 \pm 0,167 |
| NV | 0,012 \pm 0,016 | 0,027 \pm 0,011 | 0,014 \pm 0,015 |
Antígeno de recubrimiento =
C-1-11
| Grupo | Prevac. | Tres semanas tras la vacunación | Dos semanas tras la vacunación |
| V | 0,033 \pm 0,015 | 0,511 \pm 0,122 | 1,550 \pm 0,148 |
| NV | 0,023 \pm 0,019 | 0,017 \pm 0,013 | 0,037 \pm 0,016 |
Los datos demuestran que la inoculación con la
bacterina de la presente invención da lugar a la producción de
anticuerpos contra ambas cepas aisladas de B. burgdorferi:
S-1-10 de Wisconsin y
C-1-11 de Chicago. Los perros
vacunados presentaban un mayor nivel sérico de anticuerpos contra
los antígenos de recubrimiento de
S-1-10 y de
C-1-11 que los animales no
vacunados. Estos niveles de producción de anticuerpos aumentaron
tras la administración de una segunda dosis de la bacterina a los
perros. Por consiguiente, estos resultados demuestran que la
bacterina de la presente invención puede estimular en los animales
la producción de anticuerpos contra Borrelia que serán útiles
contra exposiciones posteriores a las bacterias.
Se vacunaron perros con la bacterina de
Borrelia burgdorferi. Se aisló el suero de dichos perros y se
mezcló con un cultivo en crecimiento de la cepa
S-1-10 de B. burgdorferi. El
porcentaje de las células de Borrelia muertas en los
cultivos que se habían hecho crecer en presencia y en ausencia de
este suero de perro inmunizado se indica en la Tabla 4 (véase a
continuación).
| Prevac. | Tres semanas tras la 1.^{a} vacunación | Dos semanas tras la 2.^{a} vacunación | |
| No vac. | 0 \pm 0 | 0,5 \pm 1,7 | 1,5 \pm 2,7 |
| Vac. I.M. | 0 \pm 0 | 59,5 \pm 6,3 | 87,9 \pm 10,3 |
| Vac. Subc. | 0 \pm 0 | 63,7 \pm 20,6 | 86,1 \pm 12,0 |
| No vac.: suero de perros no vacunados; Vac. I.M.: perros vacunados por vía intramuscular; Vac. Subc.: perros | |||
| vacunados por vía subcutánea; Prevac.: suero de perros antes de la vacunación. |
Como puede apreciarse en la Tabla 3, el suero
extraído de perros antes de su vacunación con la bacterina (prevac.)
y de animales no vacunados (No vac.) fue incapaz de desencadenar la
muerte celular en un cultivo en crecimiento de Borrelia. En
contraposición, el suero de perro inmunizado fue capaz de
desencadenar la muerte celular. El suero aislado de perros
vacunados por vía intramuscular (Vac. I.M.) con la bacterina fue
capaz de provocar un porcentaje similar de muerte celular al del
suero aislado de perros vacunados por vía subcutánea (Vac. Subc.).
El suero aislado de perros que habían recibido una segunda dosis de
la bacterina provocó una tasa superior de muerte celular en
comparación con el suero de perros vacunados una sola vez.
Se analizó el suero de perros antes y después de
la inoculación de la cepa aislada N-40 de
Borrelia burgdorferi en busca de anticuerpos borrelicidas
dirigidos contra las células de la cepa 297 empleando el ensayo de
actividad borrelicida.
| Suero | 1:20 | 1:40 | 1:80 | 1:160 | 1:320 | 1:640 |
| Preinoc. vivos | 140 | 158 | 173 | 133 | NC | NC |
| Preinoc. muertos | 6 | 7 | 13 | 7 | NC | NC |
| 5 semanas tras la infección, vivos | 1 | 0 | 2 | 15 | 100 | 102 |
| 5 semanas tras la infección, muertos | 51 | 39 | 57 | 33 | 23 | 7 |
| NC: Sin recuento. |
Los datos presentados en la Tabla 4 demuestran
que los perros inoculados con la cepa aislada N-40
de B. burgdorferi producen anticuerpos borrelicidas contra
una cepa aislada diferente (es decir, la cepa 297) pero del mismo
grupo seroprotector al que pertenece N-40, que no
está presente en los perros no inoculados, exentos de B.
burgdorferi.
Se analizó el suero de perros antes y después de
la inoculación de la cepa aislada N-40 de
Borrelia burgdorferi en busca de anticuerpos borrelicidas
dirigidos contra las células de la cepa N-40
empleando el ensayo de actividad borrelicida.
| Suero | 1:20 | 1:40 | 1:80 | 1:160 | 1:320 | 1:640 |
| Preinoc. vivos | 154 | 226 | 204 | 219 | 280 | 135 |
| Preinoc. muertos | 0 | 9 | 6 | 5 | 5 | 3 |
| 5 semanas tras la infección, vivos | 0 | 0 | 3 | 1 | 138 | 99 |
| 5 semanas tras la infección, muertos | 54 | 65 | 72 | 48 | 3 | 5 |
Los datos presentados en la Tabla 5 demuestran
que los perros inoculados con la cepa aislada N-40
de B. burgdorferi producen anticuerpos borrelicidas contra
la cepa aislada inoculada que está ausente en los perros no
inoculados, exentos de B. burgdorferi.
La Tabla 7 (véase a continuación) presenta los
hospedadores naturales de varias cepas aisladas de Borrelia
burgdorferi utilizadas en los estudios de protección cruzada
in vitro, el origen de las cepas aisladas en los animales
hospedadores y los lugares geográficos en los que se aislaron las
cepas.
| Nombre | Hospedador | Fuente | Localización |
| 297 | Seres humanos | LCR | Este de EE. UU. |
| B31 | I. dammini | - - - | Este de EE. UU. |
| S-1-10 | P. leucopus | riñón | Wisconsin |
| IPT | I. pacificus | - - - | Costa Oeste de EE. UU. |
| MMTI | I. dammini | - - - | Minnesota |
| 35211 | I. ricinus | - - - | Suiza |
| Chicago (C-1-11) | M. pennsylvanicus | riñón | Illinois |
| PBi | Seres humanos | LCR | Alemania |
| G25 | I. ricinus | - - - | Suecia |
| LCR: líquido cefalorraquídeo. |
Se inocularon hámsteres con una forma viva de
una de las cepas aisladas indicadas en la primera columna de la
Tabla 8. Se extrajo antisuero de estos hámsteres y se añadió a
cultivos de las cepas aisladas de B. burgdorferi indicadas
en la fila correspondiente de la Tabla 8. El grado de reconocimiento
de las bacterias en cultivo por el anticuerpo y, por tanto, el
grado de muerte celular causada, se midió de la siguiente manera. Se
extrajo suero de hámsteres infectados con cepas aisladas
individuales, vivas, de Borrelia burgdorferi, se diluyó en
medio de BSK, se inactivó con calor y se añadieron 100 \mul a cada
tubo de reacción. También se añadieron diez microlitros de
complemento. La densidad del cultivo se ajustó a continuación hasta
una concentración de 10^{5} células por mililitro, y después se
añadieron 100 \mul del cultivo a cada tubo de reacción. Los tubos
de reacción resultantes con anticuerpo/B. burgdorferi se
incubaron a 32ºC durante dos horas, y después se añadieron 800
\mul de medio de BSK recién preparado. Los tubos de reacción se
incubaron después a 32ºC durante cuatro días, y después se valoró
la viabilidad como porcentaje de células intactas, determinado con
el citómetro de Coulter. Los resultados de los estudios de
protección cruzada in vitro se presentan a continuación en la
Tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
| Antisueros | 297 | B31 | S-1-10 |
| BSK | 100,0 \pm 3,0 | 100,0 \pm 5,8 | 100,0 \pm 3,5 |
| NHS | 100,0 \pm 3,8 | 107,9 \pm 7,9 | 99,5 \pm 3,5 |
| 297 | 0,6 \pm 0,2 | 0,9 \pm 0,0 | 1,0 \pm 0,2 |
| B31 | 0,5 \pm 0,1 | 0,9 \pm 0,2 | 0,9 \pm 0,1 |
| S-1-10 | 0,3 \pm 0,1 | 0,7 \pm 0,1 | 0,8 \pm 0,1 |
| 35211 | 0,3 \pm 0,1 | 0,7 \pm 0,1 | 1,0 \pm 0,1 |
| MMTI | 2,4 \pm 1,6 | 0,5 \pm 0,0 | 1,0 \pm 0,0 |
| IPT | 0,4 \pm 0,1 | 3,3 \pm 0,1 | 0,9 \pm 0,0 |
| Chicago | 32,6 \pm 1,7 | 55,7 \pm 3,8 | 91,2 \pm 7,3 |
| PBi | 93,5 \pm 2,8 | 97,5 \pm 10,9 | 103,5 \pm 5,2 |
| G25 | 103,5 \pm 5,3 | 113,5 \pm 8,0 | 97,1 \pm 8,9 |
| Antisueros | 35211 | MMTI | IPT |
| BSK | 100,0 \pm 7,7 | 100,0 \pm 12,4 | 100,0 \pm 9,0 |
| NHS | 99,5 \pm 3,5 | 103,9 \pm 4,1 | 108,9 \pm 1,4 |
| 297 | 1,0 \pm 0,2 | 2,5 \pm 0,4 | 0,3 \pm 0,0 |
| B31 | 0,9 \pm 0,1 | 11,0 \pm 1,0 | 0,4 \pm 0,0 |
| S-1-10 | 0,8 \pm 0,1 | 0,7 \pm 0,3 | 0,3 \pm 0,1 |
| 35211 | 1,0 \pm 0,1 | 1,7 \pm 0,3 | 0,3 \pm 0,0 |
| MMTI | 1,0 \pm 0,0 | 0,9 \pm 0,2 | 0,2 \pm 0,0 |
| IPT | 0,9 \pm 0,0 | 1,9 \pm 0,2 | 0,2 \pm 0,0 |
| Chicago | 91,2 \pm 7,3 | 84,7 \pm 5,4 | 100,5 \pm 2,8 |
| PBi | 103,5 \pm 5,2 | 104,2 \pm 13,4 | 96,2 \pm 3,6 |
| G25 | 97,1 \pm 8,9 | 106,4 \pm 13,2 | 106,3 \pm 9,6 |
| Antisueros | Chicago | PBi | G25 |
| BSK | 100,0 \pm 3,5 | 100,0 \pm 8,0 | 100,0 \pm 7,2 |
| NHS | 111,2 \pm 14,5 | 105,7 \pm 7,8 | 104,4 \pm 5,8 |
| 297 | 99,2 \pm 3,6 | 113,4 \pm 3,0 | 91,5 \pm 2,9 |
| B31 | 114,2 \pm 6,7 | 108,9 \pm 8,9 | 96,4 \pm 8,9 |
| S-1-10 | 99,5 \pm 7,3 | 85,1 \pm 6,6 | 90,7 \pm 6,4 |
| 35211 | 107,3 \pm 11,4 | 102,1 \pm 3,8 | 92,2 \pm 3,8 |
| MMTI | 102,5 \pm 8,5 | 108,7 \pm 9,1 | 96,5 \pm 6,0 |
| IPT | 109,5 \pm 8,5 | 119,5 \pm 8,0 | 97,1 \pm 6,8 |
| Chicago | 0,8 \pm 0,1 | 93,6 \pm 3,6 | 105,2 \pm 8,2 |
| PBi | 114,8 \pm 11,4 | 0,2 \pm 0,0 | 0,3 \pm 0,0 |
| G25 | 115,7 \pm 0,4 | 0,2 \pm 0,0 | 0,3 \pm 0,0 |
| \begin{minipage}[t]{157mm}BSK: medio de Barbour-Stoenner-Kelly; NHS: suero normal de hámster, es decir, suero que no contiene anticuerpos contra Borrelia.\end{minipage} |
\newpage
Los valores de viabilidad en la Tabla 8 se
expresan como porcentaje de la viabilidad celular en un cultivo, en
comparación con la viabilidad del 100% de los testigos con
"BSK". Los cultivos testigo con BSK son cultivos que se ponen
en contacto con medio de
Barbour-Stoenner-Kelly en vez de con
antisuero de hámsteres inoculados con una cepa aislada de B.
burgdorferi. Por tanto, estos cultivos no deberían experimentar
muerte celular debida a las reacciones con anticuerpos. Por
consiguiente, la viabilidad de estos cultivos se fija a 100%, en
comparación con la de los cultivos a los que se añade antisuero. La
baja viabilidad de un cultivo en comparación con los valores del
testigo indica que ha tenido lugar la muerte celular en el cultivo,
debida a las reacciones de los anticuerpos con los determinantes de
la superficie celular.
Los datos de la Tabla 8 demuestran que los
cultivos de una cepa puesta en contacto con antisuero de un hámster
inoculado con la misma cepa aislada presentan baja viabilidad; es
decir, los anticuerpos sintetizados contra la cepa aislada
inoculada reconocen la cepa aislada en el cultivo y, junto con el
complemento, causan la muerte celular. Por ejemplo, un cultivo de
la cepa 297 de B. burgdorferi puesto en contacto con medio de
BSK o NHS, es decir, suero que no contiene anticuerpos contra
Borrelia, mostró una viabilidad de 100%. Sin embargo, un
cultivo de la cepa 297 puesto en contacto con antisuero extraído de
un hámster inoculado con la cepa 297 presentó una viabilidad de
0,6%. Además, un cultivo de la cepa Chicago de B. burgdorferi
puesto en contacto con NHS tenía una viabilidad de 111%, mientras
que un cultivo de la cepa Chicago puesto en contacto con un
antisuero contra la cepa Chicago presentó una viabilidad de
0,8%.
Los datos de la Tabla 8 también demuestran que
el antisuero de hámsteres inoculados con una cepa aislada provocó
muerte celular en los cultivos de algunas otras cepas aisladas. Como
se ha examinado anteriormente, la viabilidad de los cultivos que se
habían puesto en contacto con medio de BSK se fija a 100%. Los datos
demuestran que la viabilidad de los cultivos que se habían puesto
en contacto con suero normal de hámster (NHS) es asimismo
aproximadamente 100%, como se esperaba. Sin embargo, los cultivos de
las seis primeras cepas aisladas de B. burgdorferi
mencionadas en la lista, es decir, las cepas 297, B31,
S-1-10, 35211, MMTI y IPT, al ser
puestos en contacto con antisuero obtenido de hámsteres inoculados
con cualquiera de las mismas seis cepas aisladas, presentaron todos
valores de viabilidad significativamente inferiores a los de los
testigos. Estos datos demuestran que la viabilidad de los cultivos
fue baja cuando se añadió antisuero contra una cepa aislada a los
cultivos de la misma cepa aislada. La viabilidad de los cultivos
fue baja cuando los cultivos se pusieron en contacto con antisueros
dirigidos contra otras cepas aisladas. Por ejemplo, se añadieron
antisueros contra la cepa 297 a cultivos de las cepas 297, B31,
S-1-10, 35211, MMTI y IPT. La
viabilidad de los cultivos fue 0,6%, 0,9%, 1,0%, 1,0%, 2,5% y 0,3%,
respectivamente, lo que indica que los anticuerpos había reconocido
y reaccionado con los determinantes de dichas cepas aisladas.
Los datos de la Tabla 8 demuestran, por
consiguiente, que las cepas aisladas 297, B31,
S-1-10, 35211, MMTI y IPT presentan
protección cruzada. Es decir, como se ha explicado anteriormente,
los anticuerpos contra una cepa aislada reconocen y reaccionan con
los determinantes superficiales de otras cepas aisladas. Estas cepas
aisladas son, por lo tanto, miembros del mismo grupo seroprotector.
Este grupo se conoce como el grupo seroprotector A de cepas
aisladas de Borrelia burgdorferi.
Los antisueros de hámsteres inoculados con las
cepas Chicago, PBi y G25 no provocaron muerte celular en los
cultivos de estas cepas aisladas y, por consiguiente, pertenecen a
uno o más grupos seroprotectores distintos. Los antisueros contra
la cepa Chicago no provocaron un grado significativo de muerte
celular en los cultivos de ninguna de las otras cepas aisladas
analizadas. Por tanto, la cepa Chicago (también denominada
C-1-11) es la única cepa analizada
que pertenece al grupo seroprotector B.
El antisuero contra la cepa PBi produjo muerte
celular tanto en los cultivos de PBi como de G25, como fue también
el caso del antisuero contra la cepa G25. Por consiguiente, PBi y
G25 son cepas aisladas que presentan protección cruzada y que se
clasifican en el mismo grupo seroprotector, el grupo "europeo"
de cepas aisladas de Borrelia burgdorferi.
Así, los resultados de los estudios de
protección cruzada presentados en la Tabla 8 indican que las cepas
aisladas de Borrelia burgdorferi pueden clasificarse en por
lo menos tres grupos seroprotectores distintos.
Los hámsteres fueron inoculados con células
vivas de la cepa 297 de Borrelia burgdorferi. A continuación
se administró suero de estos hámsteres, o de hámsteres normales, es
decir, no inoculados, o suero normal de hámster (NHS), a otros
hámsteres. Después se sometió a estos hámsteres a exposición a la
cepa 297 ó 35211 (Suiza) como se indica en la Figura 3. Se evaluó
la capacidad los antisueros para transferir inmunidad pasiva a
hámster receptores contra la infección por B. burgdorferi,
en días sucesivos posteriores a la infección, como se indica.
La Figura 3 presenta los resultados del estudio
serológico y de exposición. La protección contra la infección por
B. burgdorferi se evaluó a partir de los valores obtenidos
con el pletismógrafo de animales sometidos a exposición, en
comparación con los valores iniciales para el testigo, es decir,
animales no inoculados. El pletismógrafo mide la cantidad de
mercurio desplazado por las patas de un hámster. Como se ha
explicado anteriormente, uno de los síntomas provocados por la
infección por B. burgdorferi es la artritis y la tumefacción.
De este modo, los hámsteres infectados con Borrelia deberían
tener patas hinchadas, que desplazan mayores cantidades de mercurio
que las patas de hámsteres normales. Los hámsteres protegidos contra
la infección por B. burgdorferi no deberían presentar patas
hinchadas. Por consiguiente, un aumento en el tamaño de la pata de
un hámster infectado, es decir, un aumento en la cantidad de
mercurio desplazado, indica que los antisueros administrados no
habían protegido al hámster contra la exposición a B.
burgdorferi.
Los resultados presentados en la Figura 3
indican que el suero normal de hámster (NHS), como se esperaba, no
protegió a los hámsteres contra la infección por la cepa aislada 297
de B. burgdorferi (el valor obtenido con el pletismógrafo
del hámster inoculado con NHS /expuesto a 297 aumentó hasta un
máximo de aproximadamente 1,0 mm de Hg ocho días tras la
exposición, en comparación con el valor inicial de aproximadamente
0,35). Tampoco el suero normal de hámster protegió a los hámsteres
contra la infección por la cepa aislada de B. burgdorferi
35211 (el valor obtenido con el pletismógrafo del hámster inoculado
con NHS /expuesto a 35211 aumentó hasta un máximo de
aproximadamente 0,85 mm de Hg nueve días tras la infección, en
comparación con el valor inicial).
En contraposición, la Figura 3 indica que el
antisuero contra la cepa 297 protegió a los hámsteres contra la
exposición subsiguiente a la cepa aislada 35211. Los valores
obtenidos con el pletismógrafo del hámster inoculado con
297/expuesto a 35211 fueron aproximadamente los mismos que los
valores iniciales entre los dos y los catorce días tras la
exposición. Estos resultados confirman los estudios in vitro,
que demuestran que las cepas aisladas de Borrelia
burgdorferi pueden tener protección cruzada, es decir, que los
anticuerpos contra una cepa pueden conferir inmunidad pasiva contra
la otra cepa aislada. Los resultados indican que las cepas aisladas
297 y 35211 presentan protección cruzada, y por consiguiente,
pertenecen al mismo grupo seroprotector.
Se examinaron cuarenta y tres cepas aisladas
individuales de B. burgdorferi procedentes de Estados Unidos
y de Europa. Se incubaron cultivos en crecimiento exponencial de las
cepas individuales con antisueros contra la cepa aislada 297 de
Borrelia burgdorferi perteneciente al grupo seroprotector A,
la cepa aislada PBi del grupo seroprotector C y una cepa
C-1-11 del grupo seroprotector
B.
| Antisuero | Cepas aisladas | ||||
| "A" | "C" | "B" | |||
| anti-297 | anti-PBi | anti-Chicago | EE. UU. | Europeas | Total |
| S | R | P | 15 | 1 | 16 |
| R | S | R | 0 | 13 | 13 |
| R | R | S | 1 | 0 | 1 |
| S | R | S | 3 | 3 | 6 |
| S | S | S | 1 | 0 | 1 |
| R | R | R | 0 | 6 | 6 |
| 43 | |||||
| S: Sensible al efecto letal; R: Resistente al efecto letal; PE: Efecto letal parcial. |
La sensibilidad (S) al efecto letal provocado
por el antisuero anti-297, pero no por los
antisueros anti-PBi o anti-Chicago,
indica que una cepa aislada de Borrelia burgdorferi se
clasifica en el mismo grupo seroprotector, es decir, el grupo
seroprotector A, como la cepa 297. La resistencia (R) al efecto
letal provocado por el antisuero anti-297 indica
que una cepa debe clasificarse en un grupo seroprotector distinto.
La Tabla 9 indica que 15 de las 16 cepas aisladas clasificadas en
el grupo seroprotector A fueron aisladas en EE. UU. La Tabla 9
también indica que 13 de las 13 cepas aisladas sensibles al efecto
letal únicamente en el caso del antisuero anti-PBi,
y por consiguiente clasificadas en el grupo seroprotector C, fueron
aisladas en Europa. La Tabla 9 también muestra que 6 de las 43
cepas aisladas eran resistentes al efecto letal provocado por los
antisueros anti-297, anti-PBi y
anti-Chicago, es decir, que los anticuerpos no
reconocieron los determinantes de la superficie celular expresados
por estas cepas. Por tanto, estas seis cepas aisladas no presentaban
protección cruzada con ninguna de las otras cepas aisladas
analizadas. Por consiguiente, los datos demuestran que hay por lo
menos otro grupo seroprotector de cepas aisladas de B.
burgdorferi, además de los grupos seroprotectores A, B o C.
La enfermedad de Lyme, causada por la
espiroqueta Borrelia burgdorferi (Bb) y transmitida por
garrapatas Ixodes, es una enfermedad multisistémica que pueda
afectar a la piel, al sistema nervioso, al corazón y a las
articulaciones de los seres humanos y los perros no protegidos.
(Anderson, J. F., et al. (1988) J. Clin. Microbiol.
26: 2209-2212; Appel, et al. (1993)
J. Inf. Dis. 167: 651-664; Lane, R. S. et
al. (1989) J. Clin. Microbiol. 27:
2344-2349; LeFebvre, R. B. et al. (1990) J.
Clin. Microbiol. 28: 700-707; Levy, S. A.
et al. (1992) Canine Practice 17:
5-14; Nelson, J. A., et al. (1991) J. Clin.
Microbiol. 29: 1732-1734; Piesman, J. et
al. (1990) Am. J. Trop. Med. Hyg. 42:
352-357; Steere, A. C., et al. (1983) N.
Engl. J. Med. 308: 733-740; Steere, A. C.,
et al. (1977) Ann. Intern Med. 86:
685-698). Aunque el tratamiento con antibióticos
puede ser eficaz, es necesario administrarlo al comienzo de la
enfermedad. Los antibióticos administrados durante las etapas
tardías de la enfermedad pueden no ser eficaces para eliminar
completamente el microorganismo del hospedador. Los hámsteres o
ratones vacunados con bacterinas experimentales que contenían
células enteras inactivadas o subunidades de antígenos generan una
respuesta inmunitaria que les protegerá de las vías de infección
artificiales o naturales. (Fikrig, E., et al. (1990) Science
250: 553-556; Fikrig, E., et al.
(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 5418-5421;
Johnson, R. C. et al. (1986) Immun. 54:
897-898; Johnson, R. C. et al. (1986) Zbl.
Bakt. Hyg. A. 263: 45-48; Kochi, S. K. et
al. (1988) Infect. and Immun. 56:
314-321; Schmitz, J. L. et al. (1991) Infect.
and Immun. 59: 3815-3818). Más recientemente,
una vacuna comercializada ha demostrado ser eficaz contra la
exposición en el laboratorio y sobre el terreno.
(Hsien-Jue, C., L. G. Chavez, Jr., B. M. Blumer, R.
W. Sebring, T. L. Wasmoen, y W. M. Acree. (1992) JAVMA 201:
403-411). Aunque las vacunas proporcionan
protección, es importante que la inmunidad (anticuerpos
borrelicidas) esté presente antes de la infección, ya que los
animales infectados pueden permanecer infectados a pesar de la
presencia de anticuerpos borrelicidas circulantes (Callister, S. M.
et al. (1991) J. Clin. Microbiol. 29:
1773-1776; Johnson, R. C. et al. (1986)
Immun. 54: 897-898; Johnson, R. C. et
al.(1986) Zbl. Bakt. Hyg. A. 263: 45-48;
Kochi, S. K. et al. (1988) Infect. and Immun. 56:
314-321; Schmitz, J. L. et al. (1991) Infect.
and Immun. 59: 3815-3818).
La Tabla 10 presenta una lista de los grupos
seroprotectores de Bb que han sido caracterizados en estudios de
protección pasiva en hámsteres y en pruebas in vitro (Ensayo
de actividad borrelicida) que pueden diferenciar entre los grupos
seroprotectores sobre la base de la respuesta de anticuerpos tras la
infección (Lovrich, S. D. et al. (1993) Infect. and Immun.
[En prensa]). Es posible que los anticuerpos producidos contra una
cepa aislada de un grupo seroprotector no proporcionen protección en
los perros, u otras especies, contra la exposición a una cepa
aislada de un grupo seropositivo diferente. Por consiguiente, es
necesario incorporar cepas aisladas que representen diferentes
grupos seroprotectores para garantizar una vacuna de amplia
eficacia.
Las garrapatas Ixodes scapularis
infectadas con Bb pueden infectar ratones o perros cuando se fijan a
los animales y se les permite alimentarse en ellos. (Appel, Max J.
G. et al. (1993) J. Inf. Dis. 167:
651-664; Fikrig, E. et al. (1992) Proc.
Natl. Acad. Sci. 89: 5418- 5421; Rowhrig, J. T. et al.
(1992) Journ. Immunol. 149: 3648-3653). La
respuesta inmunitaria a Bb de los perros inoculados con jeringuillas
es diferente a la de la transmisión por garrapatas (Rowhrig, J. T.
et al. (1992) Journ. Immunol. 149:
3648-3653). Por este motivo, hemos evaluado la
capacidad inmunógena de una vacuna bivalente contra la exposición
natural a garrapatas.
Se utilizaron cuatro (4) sabuesos exentos de
B. burgdorferi (Bb), de más de 21 semanas de edad,
procedentes de Solvay Animal Health, Inc., Charles City, IA., en
una prueba del modelo de exposición a garrapatas. Se utilizaron
treinta (30) sabuesos exentos de Bb, de 5 a 16 semanas de edad,
procedentes de Harlan Sprague Dawley, Indianápolis, Indiana, para
la prueba de la capacidad inmunógena (19 vacunados y 9 no
vacunados). Se comprobó que los perros estaban exentos de Bb
mediante pruebas serológicas y cultivo de sangre en medio de
Barbour-Stoenner-Kelly (BSK).
La bacterina se preparó como se ha descrito
anteriormente. La bacterina se preparó con dos cepas aisladas,
C-1-11 y S-1- 10,
que habían sido propagadas por pases 8 veces (nivel de propagación
por pases: X+8) a partir del cultivo madre original utilizado para
la siembra.
Se vacunaron diecinueve perros de acuerdo con
las siguientes instrucciones:
- 1.
- Se dejó calentar la vacuna hasta la temperatura ambiente.
- 2.
- Se agitó ligeramente el vial antes de extraer su contenido con técnica aséptica.
- 3.
- Se aplicó una dosis (1,0 ml) por vía intramuscular en la zona inferior del músculo. La dosis inicial se administró a las 5 a 16 semanas de edad. La segunda dosis se administró tres semanas después de la vacunación inicial.
Los perros fueron sometidos a inspección visual
para detectar reacciones anómalas a la vacunación.
Se recogieron garrapatas Ixodes
scapularis machos y hembras procedentes de dos zonas de
Wisconsin en las que la enfermedad de Lyme es endémica (zonas
rurales cercanas a Hixton y Ettrick, WI.). Se examinaron los
intestinos medios de 50 y 48 garrapatas I. scapularis machos
de Hixton y Ettrick, WI., respectivamente, mediante un ensayo con
anticuerpos fluorescentes (FA) específicos para Bb. Se agruparon
estos conjuntos de garrapatas y se utilizaron tanto para las
pruebas del modelo de exposición como para las pruebas de la
capacidad inmunógena.
- 1.
- Detección de B. burgdorferi por inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo monoclonal.
- a)
- Preparación de muestras:
- i.
- Garrapatas - Se separó la cabeza utilizando un bisturí. Se extrajo el intestino medio de la garrapata y se hizo con él una extensión en un portaobjetos de microscopio utilizando un bastoncillo aplicador, y después se secó a fondo la extensión.
- ii.
- Cultivo - Las espiroquetas cultivadas se concentraron por centrifugación (13.000 x g, temperatura ambiente) y se lavaron en PBS 0,01 M pH 7,2. Se colocaron quince microlitros de la suspensión lavada en un portaobjetos de microscopio, y se secaron a fondo.
- b)
- Los portaobjetos secados se fijaron en acetona durante 10 minutos y se secaron.
- c)
- El anticuerpo monoclonal de ratón H5332 (obtenido inicialmente de Alan Barbour, University of Texas, San Antonio) se diluyó 1:40 utilizando PBS y se aplicó al portaobjetos. Los portaobjetos se incubaron durante 30 minutos a 37ºC en una cámara húmeda.
- d)
- Tras la incubación, los portaobjetos fueron aclarados con un chorro de PBS y se sumergieron durante 5 a 10 minutos en una cubeta de Coplan que contenía PBS.
- e)
- A continuación se hicieron reaccionar los portaobjetos con un conjugado de anticuerpo, marcado con FITC, contra la IgG de ratón, diluido 1:400 con PBS. Los portaobjetos se incubaron durante 30 minutos a 37ºC en una cámara húmeda.
- f)
- Tras la incubación, los portaobjetos fueron aclarados con un chorro de PBS y se sumergieron durante 5 a 10 minutos en una cubeta de Coplan que contenía PBS, y los portaobjetos se secaron con papel secante.
- g)
- Se colocaron en los portaobjetos glicerol tamponado y un cubreobjetos, y se sometieron a observación por microscopia de fluorescencia.
- 1.
- Prueba del modelo de exposición. Para determinar el método de fijación e infección se colocaron 4 garrapatas hembras y 1 ó 2 garrapatas machos en una zona afeitada localizada a cada lado del tórax de cada uno de 4 perros. Las hembras fueron colocadas en los perros para que se alimentasen, mientras que los machos están presentes para fomentar la alimentación completa de las hembras (Appel, Max J. G. et al. (1993) J. Inf. Dis. 167: 651-664). Se dejó que las garrapatas se alimentasen durante 1 semana; después se recogieron, si era posible, y se examinaron para detectar la presencia de Bb. Se hicieron biopsias cutáneas del lado izquierdo del sitio de fijación una semana después de la fijación, y del lado derecho dos semanas después de la fijación.
- 2.
- Prueba de la capacidad inmunógena. Se colocaron cuatro garrapatas hembras y una garrapata macho en una zona afeitada localizada en el lado derecho de cada animal vacunado y no vacunado una semana después de la segunda vacunación. Se dejó que las garrapatas se alimentasen durante 9 días, después se recogieron, si era posible, y se examinaron para detectar la presencia de Bb. Catorce a quince días después de la fijación de la garrapata se hicieron biopsias cutáneas del sitio de fijación de la garrapata y de un sitio localizado aproximadamente a 15 cm del sitio de fijación.
Los sitios en los que se iban a recoger biopsias
cutáneas fueron afeitados, lavados con solución Solvahex™ para
lavado quirúrgico, y aclarados a fondo con agua estéril, para
eliminar los restos de desinfectante. Las biopsias cutáneas se
recogieron practicando incisiones elípticas a través de las capas
dérmica y subcutánea de la piel. Cada biopsia cutánea se subdividió
en secciones, que se colocaron en 9,0 ml de medio de BSK recién
preparado. Las muestras se homogeneizaron y se colocó 1,0 ml en
medio de BSK recién preparado que contenía agarosa, con o sin
rifampicina (40 microgramos por mililitro). Los cultivos se
incubaron a 32ºC durante 6 semanas y se examinaron periódicamente
para detectar la presencia de espiroquetas. En el caso de los
cultivos que resultaron positivos a la prueba de espiroquetas se
confirmó que el germen era Bb mediante FA. Después de 6 semanas de
incubación, los cultivos negativos fueron propagados por pases en
medio de BSK recién preparado inoculando 1,0 ml del cultivo
negativo en 9,0 ml de medio de BSK recién preparado que contenía
agarosa y rifampicina (40 microgramos por mililitro). Estos
cultivos se incubaron a 32ºC durante 6 semanas y se examinaron como
se ha descrito anteriormente.
Se extrajo sangre en tubos que contenían citrato
de sodio en el momento de la fijación de la garrapata y semanalmente
después de la fijación de la garrapata. Para cada muestra se
colocaron 3,0 ml de sangre de cada perro en 27,0 ml de medio de BSK
recién preparado. Los cultivos de sangre se diluyeron adicionalmente
1:100 y 1:1000 utilizando 9,0 ml de blancos de BSK. Los cultivos se
incubaron a 32ºC durante por lo menos 3 semanas y se examinaron
como se ha descrito anteriormente. En el caso de los cultivos que
resultaron positivos a la prueba de espiroquetas se confirmó que el
germen era Bb mediante FA.
- 1.
- Prueba del modelo de exposición. Se extrajo sangre en el momento de la fijación de la garrapata y semanalmente después de la fijación de la garrapata. Las pruebas del ensayo de actividad borrelicida y de ELISA se realizaron en suero obtenido de las muestras sanguíneas recogidas.
- 2.
- Prueba de la capacidad inmunógena. Se extrajo sangre en el momento de la primera y la segunda vacunación, en el momento de la fijación de la garrapata, y semanalmente después de la fijación de la garrapata. Se obtuvo el suero y se realizaron las pruebas de AB en muestras recogidas en las semanas 0, 4, 9 y 10. Las pruebas de ELISA se realizaron en muestras recogidas en las semanas 0, 3, 4, 5, 6, 8, 9 y 10.
- a)
- Un cultivo de 72 horas de la cepa C-1-11 o S-1-10 de B. burgdorferi (Bb) se cuantificó en cámara de Petroff/Hauser y se diluyó hasta 1 x 10^{5} células por mililitro con medio de BSK recién preparado.
- b)
- El suero que se iba analizar se diluyó 1:20 en medio de BSK recién preparado, se filtró a través de un filtro de 0,2 micrómetros y se termoinactivó a 56ºC durante 45 minutos.
- c)
- Para realizar la prueba se añadieron 100 \mul del cultivo diluido y 100 \mul del suero termoinactivado, diluido y filtrado en un tubo de 1,5 ml con tapón roscado. Se añadieron al mismo tubo quince (15) microlitros de complemento de cobaya. Se mezcló el contenido y se incubó a 32ºC durante 2 horas.
- d)
- Después del período de incubación de 2 horas, se añadieron al tubo 800 \mul de medio de BSK recién preparado. El tubo se incubó después a 32ºC durante 5 a 7 días.
- e)
- Después del período de incubación de 5 a 7 días, se determinó el crecimiento de Bb extrayendo una muestra de 300 a 600 \mul del tubo de reacción y colocándola en un vial que contenía 10,0 ml de solución salina al 2,0%. El recuento de Bb en la muestra diluida se realizó utilizando un citómetro de Coulter (Modelo ZBi). El porcentaje de células muertas se determinó utilizando la siguiente ecuación:
Porcent. céls
muertas = 100 - \left[\frac{Media \ del \ recuento \ de \ células
\ en \ el \ suero \ problema}{Media \ del \ recuento \ de \ células
\ en \ el \ suero \ negativo} \ X 100 \
\right]
- 1.
- Preparación del antígeno de células enteras:
- a)
- Se hicieron crecer cepas aisladas C-1-11 o S-1-10 de Borrelia burgdorferi en medio de Barbour-Stoenner-Kelly (BSK) hasta la fase logarítmica tardía (aproximadamente 2 x 10^{8} células por mililitro) y se inactivaron con etilenimina binaria.
- b)
- Las células se lavaron con solución salina estéril (NaCl al 0,85%, pH 7,10 \pm 0,2) tres veces.
- c)
- El contenido de proteína total se determinó utilizando un kit comercial.
\newpage
- 2.
- Protocolo de la prueba:
- a)
- Se recubrieron placas de Immulon-3 con antígeno de células enteras de C-1-11 o de S-1-10 (0,3 microgramos de antígeno de células enteras en 100 microlitros de tampón de carbonato para recubrimiento, por pocillo). Las placas se incubaron a 4ºC durante 15 a 17 horas en una cámara húmeda.
- b)
- Se extrajo el contenido de cada placa (solución con antígeno de células enteras) y se añadió solución de leche en polvo al 5% (p/v) a cada pocillo (400 microlitros por pocillo). Las placas se incubaron a 37°C durante 60 minutos en una cámara húmeda.
- c)
- Se extrajo el contenido de cada placa (solución de leche en polvo al 5%) y las placas se dejaron secar durante 30 minutos. (En ese momento se almacenaron las placas a 4ºC, o bien se utilizaron inmediatamente).
- d)
- Las muestras de suero se diluyeron 1:200 en PBS 0,01 M pH 7,2, Tween-20 al 0,05%, y se analizaron por triplicado añadiendo 50 microlitros del suero diluido a cada uno de dos pocillos. También se analizaron muestras de suero testigo positivo y negativo por duplicado en cada placa. Las placas se incubaron a 37ºC durante 60 minutos.
- e)
- Se extrajo el contenido de cada placa (diluciones de muestras de suero) y las placas se lavaron tres veces con una solución de NaCl al 0,9%, Tween-20 al 0,05%.
- f)
- Se añadió a cada pocillo conjugado de anticuerpos caprinos, marcados con peroxidasa, contra la IgG canina (cadenas pesadas y ligeras) diluido 1:1500 en PBS 0,01 M pH 7,2, Tween-20 al 0,05% (50 microlitros por pocillo). Las placas se incubaron a 37ºC durante 60 minutos en una cámara húmeda.
- g)
- Se extrajo el contenido de cada placa (solución de conjugado) y las placas se lavaron como en la etapa 6 anterior.
- h)
- El sustrato de O-fenilendiamina (30,0 mg) se disolvió en una solución de fosfato de sodio dibásico 0,051 M, ácido cítrico 0,0224 M, peróxido de hidrógeno al 0,012% (74,83 ml) y se añadió a cada pocillo (100 microlitros por pocillo). Se dejó reaccionar al sustrato durante 8 a 10 minutos.
- i)
- La reacción con sustrato se paró con 50 microlitros por pocillo de ácido sulfúrico 2 N. Se midió la densidad óptica de cada pocillo a 490 nm. La media de los valores de la densidad óptica de los pocillos problema se normalizó frente a los valores de densidad óptica del testigo positivo (es decir: los valores de la media de la densidad óptica de los pocillos problema de una muestra de suero analizada se dividieron por los valores de la media de la densidad óptica del testigo positivo).
Tras la exposición, todos los perros fueron
sometidos a observación para detectar signos clínicos tales como
fiebre, letargo, cojera e inapetencia.
Los resultados de los cultivos de las biopsias
cutáneas se compararon utilizando la prueba exacta de Fisher.
No hubo reacciones anómalas a la vacunación.
Se comprobó que las muestras analizadas por FA
de garrapatas machos recogidas en Hixton y Ettrick presentaban
niveles de infección de 52% y 54%, respectivamente.
Las garrapatas quedaron fijadas en un periodo de
entre 1 y 2 horas. Después de 2 días, las garrapatas se hincharon.
Tres días después, la mayor parte de los perros se habían
desprendido de las garrapatas fijadas, no obstante, se recogieron
tres garrapatas hinchadas de uno de los cuatro perros (n.º 450). Las
células de Bb fueron cultivadas a partir de la sangre extraída de
la hemocele de 1 de las 3 garrapatas, y el intestino medio de la
misma garrapata resultó positivo en la prueba de FA para detectar
Bb. Las biopsias cutáneas tomadas del sitio de fijación de este
perro una semana después de la fijación no resultaron positivas para
Bb. De hecho, una semana después de la fijación de la garrapata se
recuperaron espiroquetas de las biopsias cutáneas solamente en el
caso de un perro (Tabla 11a). En contraposición, dos semanas tras
la fijación de la garrapata se recuperaron espiroquetas de las
biopsias cutáneas realizadas en el lado opuesto de todos los 4
perros (Tabla 11a). Los perros presentaban espiroquetas en la
sangre 2 y 9 semanas tras la fijación de la garrapata (Tabla 11b).
Los anticuerpos borrelicidas fueron detectables y aumentaron a las
10 y 11 semanas después de la fijación de la garrapata (Tabla 12a).
Se detectaron anticuerpos tanto contra los antígenos de
C-1-11 como de
S-1-10, determinado por ELISA tras
la fijación de la garrapata (Tabla 12b).
Cultivos de biopsias
cutáneas
| Perro n.^{o} | Una semana después de la fijación | Dos semanas después de la fijación |
| 450 | 0/5^{a} | 3/3 |
| 400 | 4/5 | 2/4 |
| 402 | 0/5 | 4/4 |
| R | C^{b} | 2/2 |
| ^{a} Muestras positivas por número de muestras analizadas. | ||
| ^{b} Contaminado. |
Cultivos de
sangre
| Semanas tras la fijación | ||||||||
| Perro n.^{o} | 1 | 2 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 |
| 450- | - | + | - | - | - | - | - | - |
| 400- | - | + | + | - | - | - | - | - |
| 402- | - | + | - | - | - | - | - | - |
| R- | - | + | - | - | - | - | - | - |
| + (Crecimiento) | ||||||||
| - (Sin crecimiento) |
Ensayo de actividad
borrelicida Media del porcentaje de células
muertas
| Semanas tras la fijación^{a} | ||||||
| Cepa aislada | 0 | 1 | 2 | 9 | 10 | 11 |
| C-1-11 | 6 \pm 4 | 6 \pm 4 | 6 \pm 6 | 2 \pm 3 | 14 \pm 10^{b} | 21 \pm 9^{b} |
| S-1-10 | 2 \pm 2 | 5 \pm 5 | 1 \pm 1 | 7 \pm 13^{b} | 13 \pm 17 | 20 \pm 18b |
| ^{a} Están en curso las pruebas de AB correspondientes a las semanas 12 a 16. | ||||||
| ^{b} Las desviaciones típicas resultaron elevadas debido a las respuestas negativas de AB en algunos perros. |
ELISA Media de los
valores de la densidad
óptica
| Semanas tras la fijación | ||||||||
| Cepa aislada: C-1-11 | ||||||||
| 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | |
| Media \pm | 0,408 | 0,392 | 0,446 | 0,429 | 0,464 | 0,447 | 0,490 | 0,455 |
| D.T.^{a} | 0,233 | 0,251 | 0,261 | 0,262 | 0,258 | 0,262 | 0,306 | 0,266 |
| Cepa aislada: S-1-10 | ||||||||
| Media \pm | 0,499 | 0,374 | 0,385 | 0,406 | 0,414 | 0,601 | 0,559 | 0,573 |
| D.T.^{a} | 0,251 | 0,256 | 0,226 | 0,259 | 0,263 | 0,365 | 0,373 | 0,326 |
| ^{a} \begin{minipage}[t]{155mm}Las desviaciones típicas fueron elevadas debido a que un perro presentó respuestas de ELISA uniformemente bajas contra ambos antígenos C-1-11 y S-1-10.\end{minipage} | ||||||||
Se recogieron de una a cuatro garrapatas en
todos los perros, excepto en 6 vacunados (los perros habían soltado
o desprendido los vendajes en las últimas etapas de la alimentación,
con lo que se perdieron las garrapatas que se habían fijado y
alimentado). Algunas de las garrapatas recuperadas estaban dañadas o
muertas. Se recuperaron garrapatas positivas a Bb de 3 de 19
vacunados y de 3 de 9 testigos (Tabla 13). La existencia de
garrapatas positivas a Bb no correlacionaba necesariamente con la
infección observada.
Cuatro de nueve (44%) perros no vacunados
presentaron biopsias cutáneas positivas (Tabla 4). Todas las
biopsias cutáneas realizadas en perros vacunados fueron negativas
para Bb, lo que indica una reducción significativa (P = 0,0016,
prueba exacta de Fisher) de la infección en el grupo vacunado. En
todos los cultivos en los que crecieron espiroquetas, éstas fueron
identificadas como Bb por FA. Todos los cultivos propagados por
pases a ciegas permanecieron negativos. Ninguna de las biopsias
cutáneas realizadas aproximadamente a 15 cm de la zona de fijación
de la garrapata en los grupos testigo o con animales vacunados
resultó positiva a Bb (Tabla 13).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
| N.^{o} de garrapatas | Sitio de fijación | Sitio alejado | |
| pos. por FA por | N.^{o} de biop. pos. por | N.^{o} de biop. pos. por | |
| Vacunados | n.^{o} de analizadas | n.^{o} de analizadas | n.^{o} de analizadas |
| KCP | NT^{a} | 0/4 | 0/2 |
| PIP | 1/2 | 0/4 | 0/2 |
| KHP | 0/1 | 0/4 | 0/2 |
| PGP | 0/3 | 0/4 | 0/2 |
| OGO | NT | 0/4 | 0/2 |
| JAO | 0/1 | 0/4 | 0/2 |
| HXO | 0/4 | 0/4 | 0/2 |
| KIP | 0/1 | 0/4 | 0/2 |
| PDP | NT | 0/4 | 0/2 |
| PBP | 0/2 | 0/4 | 0/2 |
| JIO | NT | 0/4 | 0/2 |
| LUP | 0/3 | 0/4 | 0/2 |
| PZP | NT | 0/4 | 0/2 |
| PQP | 0/3 | 0/4 | 0/2 |
| HZO | 1/3 | 0/4 | 0/2 |
| OEP | 0/1 | 0/4 | 0/2 |
| IXP | 0/1 | 0/4 | 0/2 |
| OWO | NT | 0/4 | 0/2 |
| RJP | 1/3 | 0/4 | 0/2 |
| Perros pos. /n.º de expuestos | 0/19 | 0/19 | |
| No vacunados | |||
| OIP | 2/4 | 3/3 | 0/2 |
| LLO | 1/4 | 0/4 | 0/2 |
| QDP | 0/2 | 0/4 | 0/2 |
| JXP | 0/2 | 3/4 | 0/2 |
| OPP | 0/2 | 0/4 | 0/2 |
| JBO | 0/1 | 1/4 | 0/2 |
| JCO | 0/1 | 0/4 | 0/2 |
| IOP | 2/2 | 0/4 | 0/2 |
| KYO | 0/2 | 2/4 | 0/2 |
| Perros pos. /n.º de expuestos | 4/9 | 0/9 | |
| ^{a} NT (No analizado. Las garrapatas estaban dañadas o no se recuperaron garrapatas viables). |
La Tabla 14 presenta los resultados de los
cultivos de sangre. Uno de nueve animales no vacunados tenía
cultivos de sangre positivos a las diluciones 1:10 y 1:100
aproximadamente una semana después de la fijación de las garrapatas
(es decir, durante la alimentación). El resto de los cultivos de
sangre fueron negativos, excepto en la semana 6 tras la fijación de
la garrapata. En ese momento, 9 de 19 animales vacunados y 6 de 9
animales testigo tenían cultivos de sangre positivos a las
diluciones 1:100 y 1:1000 (determinado por crecimiento y por FA),
pero no a la dilución 1:10 inicial. Como se trataba de un resultado
cuestionable, las muestras de sangre se cultivaron de nuevo, y se
analizaron por FA la sangre y la dilución 1:10. No hubo crecimiento
de espiroquetas en la sangre que se había cultivado de nuevo y no
se detectaron espiroquetas en la sangre o en la dilución 1:10 por
FA.
Cultivos de
sangre
| Semanas tras la fijación | ||||||||||
| Vacunados | 0 | 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| KCP | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| PIP | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| KHP | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| PGP | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| OGO | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| JAO | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| HXO | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| KIP | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| PDP | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| PBP | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| JIO | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| LUP | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| PZP | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| PQP | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| HZO | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| OEP | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| IXP | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| OWO | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| RJP | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Perros pos. por | ||||||||||
| n.º de analizados | 9/19 | |||||||||
| No vacunados | ||||||||||
| OIP | - | + | - | - | - | + | - | - | - | - |
| LLO | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| QDP | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| JXP | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| OPP | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| JBO | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| JCO | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - |
| IOP | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| KYO | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Perros pos. por | ||||||||||
| n.º de analizados | 1/9 | 6/9 | ||||||||
| ^{a} Sangre extraída en el momento del acoplamiento de las garrapatas a los perros. | ||||||||||
| + (Crecimiento) | ||||||||||
| - (Sin crecimiento) |
\vskip1.000000\baselineskip
Las Figuras 4 y 5 ilustran las respuestas de
anticuerpos borrelicidas contra las cepas aisladas
S-1-10 y
C-1-11 tras la vacunación y la
fijación de la garrapata. Las muestras de suero de animales
vacunados presentaron una potente respuesta de anticuerpos contra
S-1-10 y
C-1-11 una semana después de la
segunda vacunación. Cinco semanas tras la fijación de la garrapata,
las respuestas de anticuerpos borrelicidas contra
S-1-10 y
C-1-11 aumentaron ligeramente en el
grupo con animales no vacunados. Sin embargo, 6 semanas tras la
fijación de la garrapata se observó una respuesta más intensa de
anticuerpos borrelicidas sólo contra la cepa
S-1-10 en el grupo no vacunado.
Las muestras de suero analizadas por ELISA
también presentaron una potente respuesta de anticuerpos contra los
antígenos S-1-10 y
C-1-11 una semana después de la
segunda vacunación (Figuras 3 y 4). Después, la respuesta de
anticuerpos disminuyó lentamente. Se observaron mayores respuestas
de anticuerpos en los animales no vacunados en las semanas 8, 9 y
10 (4, 5 y 6 semanas tras la fijación de la garrapata - Figuras 6 y
7).
Ninguno de los perros presentó reacciones
adversas a la vacunación, bien inmediatamente, o bien durante los
períodos de observación posteriores a las vacunaciones y a la
fijación de la garrapata.
Hasta la fecha, ninguno de los perros ha
presentado los signos clínicos asociados a la enfermedad de
Lyme.
Todos los perros en el estudio del modelo de
exposición resultaron infectados, según se determinó por cultivos
de biopsias cutáneas (4 de 4 perros positivos), cultivos de sangre
(4 de 4 perros positivos) y pruebas serológicas (todos los perros,
excepto el perro n.º 450, presentaron seroconversión, determinada
por AB o por ELISA). Los perros se encuentran en la actualidad en
observación para detectar signos clínicos. Las garrapatas utilizadas
para infectar estos perros fueron utilizadas también para infectar
los perros de la prueba de la capacidad inmunógena.
Las garrapatas infectaron 4 de 9 animales no
vacunados y ninguno de los 19 animales vacunados, lo que indicaba
una reducción significativa (P = 0,0016, prueba exacta de Fisher) de
la infección y correlacionaba con la presencia de anticuerpo
borrelicida. Hubo una reducción significativa (P=0,0422, prueba
exacta de Fisher) de la infección en el grupo vacunado cuando se
evaluaron de forma conjunta la infección de las biopsias cutáneas y
la presencia de espiroquetas en sangre.
Los animales vacunados para la prueba de la
capacidad inmunógena presentaban potentes respuestas de anticuerpos
borrelicidas contra ambas cepas aisladas de la vacuna en el momento
de la fijación de la garrapata. Tras la fijación de la garrapata,
las respuestas de anticuerpos medidas por AB disminuyeron en el
grupo vacunado para ambas cepas aisladas. En contraposición, los
anticuerpos borrelicidas contra
S-1-10 aumentaron en el grupo no
vacunado. Este aumento reflejaba las infecciones observadas en este
grupo. Un aumento en el grupo no vacunado dirigido contra ambos
antígenos C-1-11 y
S-1-10 fue determinado por ELISA.
Éstas observaciones corroboran las citadas anteriormente (Lovrich,
S. D. et al. (1993) Infect. and Immun. [En prensa]) en el
sentido de que el ensayo de actividad borrelicida distingue entre
las cepas aisladas de diferentes grupos seroprotectores, mientras
los ensayos de ELISA no son capaces de hacer tal distinción. Los
datos indican que las células de Borrelia que portan las
garrapatas probablemente pueden clasificarse en el mismo grupo
seroprotector al que pertenece
S-1-10. Sin embargo, la media de las
respuestas de AB aumentó contra ambas cepas aisladas en la prueba
del modelo de exposición tras la fijación de la garrapata. Es
posible que el conjunto de las garrapatas estuviesen infectadas con
alguna de las cepas aisladas de alguno de los grupos seropositivos,
con ambos grupos, o quizá con otros grupos seroprotectores.
Las bacterias cultivadas en medio rico en
proteínas e incorporadas en bacterinas de varios componentes son
capaces de producir reacciones adversas (edema, tumefacción,
inflamación, letargo, hipersensibilidad) originadas por la
interacción entre el animal, la vacuna y el medio ambiente. En el
presente estudio no se observaron reacciones anómalas en ninguno de
los animales vacunados después de cada vacunación con una bacterina
que contenía 2 cepas aisladas de Bb.
Las garrapatas utilizadas en estos estudios
fueron capaces de infectar a perros con B. burgdorferi.
La vacuna generó elevados niveles de anticuerpos
borrelicidas, fue eficaz frente a la exposición natural a
garrapatas y resultó segura.
En este estudio se utilizaron sabuesos
procedentes de la colonia ubicada en Solvay Animal Health, Inc.,
Charles City, Iowa. Los perros tenían 12 a 24 semanas de edad en el
momento de la vacunación (Tabla 15) y eran seronegativos (<
1:20) a B. burgdorferi según se determinó por ELISA de
células enteras.
| Perro n.º | Sexo | Fecha de nacimiento | Edad (semanas) en la primera vac. |
| Vacunados | |||
| 558 | H | 5-10-92 | 18 |
| 560 | H | 5-06-92 | 20 |
| 562 | H | 5-11-92 | 20 |
| 564 | H | 5-11-92 | 20 |
| 566 | H | 5-11-92 | 20 |
| 568 | H | 5-11-92 | 20 |
| 570 | H | 5-25-92 | 18 |
| 574 | H | 5-25-92 | 18 |
| 580 | H | 5-26-92 | 16 |
| 582 | H | 5-26-92 | 16 |
| 584 | H | 6-19-92 | 12 |
| 586 | H | 6-19-92 | 12 |
| 609 | M | 4-14-92 | 24 |
| 615 | M | 4-14-92 | 24 |
| 617 | M | 4-22-92 | 20 |
| 627 | M | 4-22-92 | 22 |
| 639 | M | 5-06-92 | 18 |
| 641 | M | 5-06-92 | 18 |
| 643 | M | 5-06-92 | 18 |
| 647 | M | 5-11-92 | 18 |
| No vacunados | |||
| 554 | H | 4-22-92 | 22 |
| 556 | H | 5-10-92 | 20 |
| 598 | H | 8-12-92 | 4 |
| 608 | H | 8-12-92 | 4 |
| 610 | H | 8-17-92 | 4 |
| 612 | H | 8-17-92 | 4 |
| 651 | M | 5-25-92 | 18 |
| 655 | M | 5-26-92 | 18 |
| 661 | M | 7-10-92 | 11 |
| 663 | M | 7-14-92 | 11 |
| 665 | M | 7-14-92 | 11 |
| 669 | M | 8-12-92 | 4 |
| 671 | M | 8-12-92 | 4 |
| 673 | M | 8-12-92 | 4 |
| 677 | M | 8-12-92 | 4 |
La bacterina se preparó con los serotipos
S-1-10 y
C-1-11 de B. burgdorferi tras
ocho pases de propagación a partir del cultivo madre original para
siembra, como se ha descrito anteriormente. La bacterina se formuló
de modo que contuviese 5 x 10^{8} células de cada serotipo por
cada dosis de un mililitro, y como adyuvante se empleó hidróxido de
aluminio (Rehydragel HPA, Reheis Chemical Co., Berkeley Hts., Nueva
Jersey) a una concentración de 1,5 mg de óxido de aluminio por cada
dosis de un mililitro. La vacuna se conservó a 4ºC hasta el momento
de su utilización.
Se vacunaron veinte perros por vía intramuscular
en la zona inferior del muslo empleando dos dosis de 1,0 ml
separadas por un intervalo de tres semanas. La primera dosis se
administró a las 12 a 24 semanas de edad. La segunda dosis se
administró tres semanas después de la primera dosis. Los perros se
sometieron a observación para detectar reacciones anómalas; se
registraron las temperaturas y se sometieron a palpación los sitios
de la inyección diariamente durante una semana después de cada
vacunación. Un grupo de quince perros no vacunados sirvieron como
testigos.
Se extrajo sangre antes y después de la
vacunación, y a intervalos tras la exposición. Se analizó el suero
para detectar anticuerpos contra B. burgdorferi empleando un
ensayo de anticuerpos borrelicidas, ELISA de células enteras y
ELISA de OspA, así como inmunoelectrotransferencia.
La respuesta de anticuerpos contra los antígenos
superficiales de B. burgdorferi se determinó empleando una
modificación de una prueba de ELISA de células enteras utilizada en
el Laboratorio Regional de Sanidad Animal, Baron, WI. Los cultivos
de la fase logarítmica tardía de ambas cepas
C-1-11 y
S-1-10 fueron inactivados con
etilenimina binaria (BEI). Tras la neutralización de la BEI con
tiosulfato de sodio, las células se lavaron por centrifugación tres
veces con solución salina estéril. El contenido de proteínas totales
de los microorganismos inactivados se determinó utilizando el
ensayo de proteínas con ácido bicinconínico (BCA) (Pierce Co.,
Rockford, IL). Se recubrieron los pocillos de las placas de
Immunol-3 (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly,
VA) con antígenos de células enteras a un nivel de 0,3 \mug en
100 \mul de tampón de recubrimiento de carbonato de sodio. Las
placas se incubaron en una cámara húmeda a 4ºC durante 15 a 17
horas. Tras la incubación, se desechó el contenido de la placa y
los pocillos se llenaron con PBS que contenía leche desnatada en
polvo (NFDM) al 5% y se incubaron en una cámara húmeda durante 60
minutos a 37ºC. Los pocillos se vaciaron y se añadieron 50 \mul
de suero problema diluido en PBS que contenía
Tween-20 al 0,05% (PBSTW) a pocillos duplicados, y
se incubaron en una cámara húmeda durante 60 minutos a 37ºC. En
cada placa se incluyó suero testigo de perros positivo y negativo.
Las placas se lavaron tres veces con solución salina que contenía
Tween-20 al 0,05%, y se añadieron partes alícuotas
de 50 \mul por pocillo de anticuerpos caprinos contra la IgG
canina marcados con peroxidasa (Kirkegaard & Perry
Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) y diluidos 1:1500 en
PBS-TW. Las placas se incubaron en una cámara
húmeda durante 60 minutos a 37ºC y se lavaron tres veces con
PBS-TW. El sustrato se preparó disolviendo 30,0 mg
de O-fenilendiamina en una solución de fosfato de
sodio dibásico 0,051 M, ácido cítrico 0,024 M, peróxido de
hidrógeno al 0,012%, y se añadieron partes alícuotas de 100 \mul a
cada pocillo. La reacción se paró con 50 \mul por pocillo de
ácido sulfúrico 2 N, y se determinó la densidad óptica de cada
pocillo a 490 nm en un lector de ELISA. El título se definió como el
recíproco de la última dilución que proporcionó una densidad óptica
del 30% de la máxima densidad óptica.
Se recubrieron los pocillos de una placa de
microvaloración de 96 pocillos con 50 ng de OspA recombinante y se
incubaron durante toda la noche a 4ºC. Después del recubrimiento los
pocillos se trataron con NFDM al 5% en PBS durante 30 minutos a
37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces con PBS-TW
y se añadieron a los pocillos 50 \mul de diluciones dobles de
suero de perro. Las placas se incubaron a 37ºC durante una hora. Los
pocillos se lavaron con PBS-TW y se añadieron a los
pocillos 50 \mul de anticuerpos caprinos, marcados con HRP,
contra la IgG canina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.,
Gaithersburg, MD). Tras incubar durante una hora a 37ºC, los
anticuerpos unidos se detectaron añadiendo el sustrato ABTS
(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). La
densidad óptica de cada pocillo se determinó a 405 nm en un lector
de ELISA. El título se definió como el recíproco de la última
dilución que proporcionó una densidad óptica del 30% de la máxima
densidad óptica.
Los cultivos de B. burgdorferi en la fase
logarítmica media a tardía se recogieron por centrifugación a 15000
x g, 4ºC, 30 minutos, y se lavaron tres veces por centrifugación con
solución salina estéril. Una suspensión de aproximadamente 1 x
10^{8} células se hirvió en tampón para muestras de electroforesis
durante nueve minutos y se sometió a electroforesis en un gel de
poliacrilamida-SDS al 10% (Laemmli, E. K. (1970)
Nature 227: 680-685). Las proteínas fueron
electrotransferidas a una membrana Immobilon™ de PVDF (Millipore
Corp., Bedford, MA) empleando una modificación del procedimiento
descrito por Towbin (Towbin, H. et al. (1979) Proc. Natl.
Acad. Sci. 76: 4350-4354). La membrana de PVDF se
incubó durante 90 minutos a 22ºC en Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2
(TBS) con NFDM al 5%. Las tiras se incubaron con suero de perro o
con anticuerpo monoclonal contra OspA diluido 1:75 en el tampón de
bloqueo durante 60 minutos a 22ºC. Después se lavaron las tiras dos
veces en TBS que contenía Triton X-100 al 0,2%, y
una vez en TBS. El anticuerpo unido se detectó añadiendo
anticuerpos, marcados con peroxidasa de rábano, contra la IgG canina
o contra la IgG murina (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.,
Gaithersburg, MD). Las bandas de proteína se visualizaron con un
sistema de sustrato TMB para peroxidasa en membranas (Kirkegaard
& Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD).
El ensayo de actividad borrelicida se llevó a
cabo utilizando una modificación de los procedimientos descritos
anteriormente (Lim, L.C. et al., (1993) Clin. Diag. Lab.
Immunol. (en prensa; Sachsenmeirer, K. F. et al. (1992) J.
Clin. Microbiol. 30: 1457-1461). Brevemente,
los cultivos de 72 horas en fase logarítmica media de las cepas
aisladas C-1-11 y
S-1-10 de B. burgdorferi en
medio de Barbour-Stoenner-Kelly
(BSK) modificado se cuantificaron en una cámara de
Petroff-Hauser y se diluyeron hasta contener 1 X
10^{6} células/ml de medio de BSK. Se mezclaron partes alícuotas
de 100 \mul de suero diluido, termoinactivado, con 100 \mul de
cada suspensión de B. burgdorferi, y se añadieron 10 \mul
de complemento de suero de cobaya (210 unidades CH_{50}; GIBCO
Laboratories, Grand Island, NY). La suspensión se mezcló suavemente
y se incubó a 32ºC durante 16 hasta 24 horas. Tras la incubación de
los tubos de reacción, se diluyeron 100 \mul de la mezcla de
reacción con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que
contenía naranja de acridina 5,4 X 10^{-9} M. La detección de la
actividad borrelicida se llevó a cabo utilizando una modificación de
los procedimientos descritos anteriormente (Callister, S. M. et
al., (1992) J. Infec. Dis. 167: 158-164).
La muerte celular provocada por los anticuerpos borrelicidas causa
la aparición de protuberancias en las paredes celulares de B.
burgdorferi, con lo que se absorben mayores concentraciones de
naranja de acridina en las células y en las paredes celulares
dañadas. Por consiguiente, los microorganismos muertos de B.
burgdorferi fluorecen de modo mucho más intenso que las
espiroquetas vivas normales. Un aumento en la intensidad de la
fluorescencia de \geq 16% en comparación con los microorganismos
expuestos a suero normal de perro se consideró una prueba positiva
de la actividad borrelicida. El título de punto final se expresó
como el recíproco de la última dilución a la que se observó un
aumento
de \geq 16% en la intensidad de la fluorescencia. Los perros con un título de < 1:20 fueron considerados negativos.
de \geq 16% en la intensidad de la fluorescencia. Los perros con un título de < 1:20 fueron considerados negativos.
Se recogió un total de 631 garrapatas machos y
732 garrapatas hembras de I. scapularis de una zona cercana
a Ettrick, Wisconsin, en la que la enfermedad de Lyme es endémica.
Para determinar la tasa global de infección de las garrapatas por
B. burgdorferi, se examinaron los intestinos medios de 50
garrapatas machos de I. scapularis mediante una prueba de
inmunofluorescencia (FA) utilizando el anticuerpo monoclonal contra
la Osp A proporcionado por el Dr. A. G. Barbour. A los siete meses
después de la segunda vacunación, los perros fueron sometidos a
exposición con 10 garrapatas hembras y 6 garrapatas machos. Las
garrapatas hembras son las únicas garrapatas adultas que transmiten
la enfermedad. Las garrapatas machos son necesarias para la
alimentación adecuada de las garrapatas hembras. Para cada perro se
seleccionaron al azar cinco garrapatas hembras y tres garrapatas
machos a partir del conjunto de garrapatas, y se colocaron en dos
placas de Petri pequeñas que se fijaron a un área afeitada de la
zona torácica dorsal izquierda anterior de cada perro. Se dejó que
las garrapatas se alimentasen durante una semana. Durante este
tiempo las garrapatas fueron sometidas a observación a intervalos
de dos días. Una semana después de la fijación se recuperaron las
garrapatas y se examinaron los intestinos medios para detectar la
presencia de B. burgdorferi mediante FA empleando el
anticuerpo monoclonal contra B. burgdorferi.
Los perros fueron sometidos a observación
diariamente después de la exposición para detectar signos clínicos
asociados a la enfermedad de Lyme. El síntoma empleado como
indicador principal del curso clínico de la enfermedad de Lyme fue
la cojera. La cojera se definió como la renuencia a cargar el peso
en la extremidad afectada, con o sin tumefacción y aumento de la
temperatura en la articulación afectada, patas rígidas, y migración
de la cojera de una articulación a otra o de una extremidad a otra.
Los perros también fueron sometidos a observación para detectar
letargo y fiebre.
Se intentó aislar B. burgdorferi de la
piel, sangre, articulaciones y órganos de los perros. Se realizaron
biopsias cutáneas de perros anestesiados a los dieciocho a
diecinueve días tras la fijación de la garrapata y en el momento de
la autopsia. Se realizaron biopsias cutáneas en el sitio de fijación
de la garrapata y, en algunos perros, se realizaron biopsias
cutáneas en sitios alejados del sitio de la picadura de la
garrapata. Los sitios alejados estaban ubicados en posición ventral
al sitio de la picadura de la garrapata, posterior al sitio de la
picadura de la garrapata, y en el lado derecho de la zona torácica
dorsal anterior situada en el lado opuesto del perro. Los sitios en
los que se iban a realizar biopsias cutáneas fueron afeitados,
lavados con solución Solvahex™ para lavado quirúrgico, y aclarados a
fondo con agua estéril para eliminar los restos de desinfectante.
Se practicó una incisión elíptica a través de las capas dérmica y
subcutánea de la piel. Se colocó aproximadamente un gramo de piel
en nueve mililitros de medio de BSK que contenía agarosa al 0,15% y
40 \mug de rifampicina/ml. La muestra de la biopsia fue
homogeneizada y se prepararon dos diluciones adicionales de 10
veces de homogeneizado en nueve mililitros de blancos de medio de
BSK. Los cultivos se incubaron a 32ºC durante seis semanas y
después se examinaron por microscopía a intervalos semanales para
detectar el crecimiento de las espiroquetas. En el caso de los
cultivos que presentaban crecimiento de espiroquetas se confirmó
que el germen era Bb mediante FA, empleando un anticuerpo monoclonal
contra B. burgdorferi. Después de seis semanas de incubación
los cultivos negativos fueron subcultivados en medio de BSK recién
preparado inoculando un mililitro del cultivo negativo en nueve
mililitros de medio de BSK recién preparado. Estos cultivos se
incubaron a 32ºC durante otras seis semanas y se examinaron como se
ha descrito anteriormente. Los cultivos que resultaron negativos
para el crecimiento de espiroquetas fueron desechados.
Se homogeneizaron por separado el corazón
entero, el bazo, los riñones y la vejiga en 50 ml de BSK que
contenía agarosa y rifampicina empleando un aparato Stomacher
(Seward Medical, Londres, Inglaterra). Se vertió una muestra de 50
ml y se diluyó 10^{-1} y 10^{-2} en medio de BSK. La muestra de
50 ml y las diluciones se incubaron durante seis semanas a 32ºC, se
sometió a observación y se confirmó que el germen era B.
burgdorferi como se ha descrito.
Una muestra de dos a tres mililitros de líquido
cefalorraquídeo se añadió a nueve mililitros de medio de BSK y se
preparó otra dilución 1:10 en el mismo medio, se incubó y se sometió
a observación como se ha descrito.
Se extrajo tejido de las articulaciones del
codo, el carpo, la rodilla, y el tarso. Se añadió el tejido de cada
articulación a nueve mililitros de medio de BSK que contenía agarosa
y rifampicina. Se preparó otra dilución 1:10 en el mismo medio y
los cultivos se incubaron y se sometieron a observación como se ha
descrito.
Se recogieron muestras de sangre heparinizada
para el aislamiento de B. burgdorferi en el momento de la
exposición, a intervalos semanales tras la exposición y en el
momento de la autopsia. La sangre de cada perro se diluyó
10^{-1}, 10^{-2} y 10^{-3} en medio de BSK. Los cultivos se
incubaron a 32ºC durante seis semanas y se examinaron semanalmente
para detectar el crecimiento de B. burgdorferi como se ha
descrito.
Las diferencias significativas se compararon por
análisis de la ji cuadrado de Pearson.
Los perros fueron vacunados con dos dosis de
vacuna separadas por un intervalo de tres semanas. Después de la
primera vacunación, 14 de 20 perros presentaron una fiebre ligera de
0,83ºC (1,5ºF) por encima de las temperaturas iniciales (Tabla 16).
Las temperaturas se mantuvieron en la mayoría de estos perros
durante sólo tres días. Se registraron temperaturas ligeramente
elevadas en los perros 566 y 568 durante siete días después de la
vacunación. Se observó un sitio de vacunación tumefacto en el perro
560, que se mantuvo durante 4 días y después desapareció. Después
de la segunda vacunación, 13 de 20 perros presentaron fiebre ligera
de 0,83°C (1,5ºF) por encima de la temperatura inicial, que se
mantuvo durante tres o cuatro días (Tabla 17). El perro 615
presentó temperaturas elevadas que duraron ocho días. Los perros no
presentaron ninguna otra reacción posterior a la vacunación, y
tampoco se observaron reacciones de hipersensibilidad o de
anafilaxia.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}
\newpage
Se utilizó una prueba de ELISA que empleaba
células enteras de B. burgdorferi para demostrar la respuesta
serológica de perros vacunados y expuestos a antígenos de la
superficie de B. burgdorferi. Antes de la vacunación todos
los perros eran seronegativos. A las tres semanas después de la
segunda vacunación la media geométrica del título (MGT) fue 1.236
contra la cepa S-1-10 y 816 contra
la cepa C-1-11 (Tabla 18). Seis
meses después, en el momento de la exposición, los títulos de
anticuerpos en los animales vacunados habían disminuido hasta 343 y
234 para S-1-10 y
C-1-11, respectivamente. Los títulos
de anticuerpos contra ambas cepas permanecieron esencialmente
invariables en los animales vacunados tras la exposición a
garrapatas infectadas. Lo perros testigo no vacunados fueron
seronegativos durante todo el período anterior a la exposición. Tras
la exposición, todos los perros testigo fueron seropositivos tanto
para S- 1-10 como para
C-1-11. Las MGT en los perros
testigo fueron 1167 y 1404 contra
S-1-10 y
C-1-11, respectivamente, y
resultaron cuatro a cinco veces mayores que los títulos de los
perros vacunados tras la exposición. Sin embargo, los títulos de
anticuerpos contra ambas cepas en el perro n.º 669 fueron 8 a 16
veces menores que las MGT de los perros testigo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}
\newpage
Se analizaron sueros de perros vacunados y de
perros testigo no vacunados antes y después de la exposición, para
determinar la reactividad del anticuerpo con antígenos específicos
de B. burgdorferi. Todos los perros eran seronegativos antes
de la vacunación. A los siete meses después de la segunda
vacunación, el suero de perros vacunados contenía anticuerpos que
reaccionaban principalmente contra la proteína Osp A (31
kilodaltons) y contra una proteína de 34 kilodaltons que
correspondía al peso molecular descrito para Osp B (Figuras 1 a 4).
Los anticuerpos presentaban casi el mismo grado de reacción a estas
proteínas procedentes de las cepas
S-1-10 y
C-1-11. Sin embargo, las diferencias
en la pauta de tinción y en la movilidad relativa de las proteínas
indicaban la existencia de claras diferencias entre las proteínas de
las dos cepas. Se detectaron anticuerpos contra otros proteínas de
B. burgdorferi tales como flagelina (41 kilodaltons) y contra
proteínas de mayor peso molecular en el suero de algunos animales
vacunados. Tras la exposición a garrapatas apenas hubo cambios en
el perfil de la inmunotransferencia de los perros vacunados. Los
anticuerpos de los perros vacunados reaccionaron principalmente
contra las proteínas Osp A y Osp B. El perfil de anticuerpos en
inmunotransferencia obtenido en los perros testigo no vacunados
tras la exposición a garrapatas fue diferente al perfil de
inmunotransferencia de los perros vacunados. Los testigos no
vacunados eran seronegativos antes de la exposición (Figura 5). Tras
la exposición, los animales no vacunados produjeron anticuerpos
contra la proteína flagelina de 41 kilodaltons y contra una
proteína de 39 kilodaltons, así como contra proteínas de B.
burgdorferi de mayor peso molecular (Figura 6). Apenas se
detectaron anticuerpos contra Osp A y Osp B en el suero de los
perros testigo tras la exposición a garrapatas. Los estudios han
demostrado que los animales no vacunados producen cantidades muy
bajas de anticuerpos contra OspA y OspB tras la exposición a
garrapatas infectadas con B. burgdorferi (Appel, et
al.(1993); Burgdorfer, et al. (1982); Roelerig, et
al. (1992); Schaible U.E. et al., (1993) Immunol. Let.
36: 219-226).
Se utilizó Osp A recombinante en una prueba de
ELISA para determinar la respuesta de anticuerpos contra uno de los
principales antígenos protectores en perros tras la vacunación con
la bacterina. Los perros vacunados generaron títulos de anticuerpos
contra OspA en el intervalo de 320 a 2560 después de la segunda
vacunación (Tabla 19). La MGT contra OspA fue 640 después de la
vacunación y 279 antes de la exposición. No se detectaron
anticuerpos contra OspA en los perros testigo no vacunados a las
ocho semanas tras la exposición a garrapatas.
\vskip1.000000\baselineskip
| Título de anticuerpos en ELISA contra Osp A recombinante^{a} | |||
| Perro n.º | Antes de la vacunación | Después de la vacunación^{b} | Antes de la exposición |
| Vacunados | |||
| 574 | NEG^{c} | 640 | 160 |
| 586 | NEG | 320 | 160 |
| 615 | NEG | 640 | 320 |
| 627 | NEG | 2560 | 320 |
| 639 | NEG | 640 | 320 |
| 558 | NEG | 320 | 160 |
| 560 | NEG | 1280 | 320 |
| 562 | NEG | 640 | 320 |
| 564 | NEG | 640 | 320 |
| 566 | NEG | 1280 | 640 |
| 568 | NEG | 320 | 320 |
| 570 | NEG | 1280 | 320 |
| 580 | NEG | 320 | 320 |
| 582 | NEG | 320 | 160 |
| 584 | NEG | 640 | 80 |
| 609 | NEG | 640 | 320 |
| 617 | NEG | 320 | 320 |
| 641 | NEG | 640 | 320 |
| 643 | NEG | 1280 | 640 |
| 647 | NEG | 640 | 320 |
| GMT^{d} | NEG | 640 | 279 |
| Título de anticuerpos en ELISA contra Osp A recombinante^{a} | |||
| Perro n.º | Antes de la vacunación | Después de la vacunación^{b} | Antes de la exposición |
| No vacunados | |||
| 598 | NEG | NEG | NEG |
| 655 | NEG | NEG | NEG |
| 663 | NEG | NEG | NEG |
| 669 | NEG | NEG | NEG |
| 677 | NEG | NEG | NEG |
| 610 | NEG | NEG | NEG |
| 612 | NEG | NEG | NEG |
| 651 | NEG | NEG | NEG |
| 661 | NEG | NEG | NEG |
| 671 | NEG | NEG | NEG |
| 673 | NEG | NEG | NEG |
| 554 | NEG | NEG | NEG |
| 556 | NEG | NEG | NEG |
| 608 | NEG | NEG | NEG |
| 665 | NEG | NEG | NEG |
| MGT | NEG | NEG | NEG |
| ^{a} Anticuerpos contra la proteína Osp A recombinante unidos a los pocillos de la placa. | |||
| ^{b} Tres semanas después de la segunda vacunación. | |||
| ^{c} Negativo - corresponde a un título < 1:20. | |||
| ^{d} Media geométrica del título. |
La actividad funcional de los anticuerpos
generados contra B. burgdorferi como consecuencia de la
vacunación con la bacterina fue medida con el ensayo de anticuerpos
borrelicidas. La presencia de anticuerpos borrelicidas se demostró
mediante la inhibición del crecimiento de B. burgdorferi
debida a la lisis del microorganismo mediada por los anticuerpos.
Los perros vacunados generaron elevados títulos de anticuerpos
borrelicidas contra S-1-10 y
C-1-11 (Tabla 20). La MGT de la
actividad borrelicida fue 520 frente a la cepa
S-1-10 y 1.076 frente a la cepa
C-1- 11. De forma similar al caso de la respuesta de
anticuerpos contra células enteras y contra OspA, los títulos de
anticuerpos borrelicidas disminuyeron desde la segunda vacunación
hasta el momento de la exposición. En el momento de la exposición,
siete meses después de la segunda vacunación, se detectaron títulos
de anticuerpos borrelicidas de 113 y 279 para S-1-
10 y C-1-11, respectivamente, en los
animales vacunados. Los perros vacunados también generaron
anticuerpos borrelicidas contra una cepa diferente de B.
burgdorferi en el mismo grupo seropositivo que
S-1-10 (Tabla 21). No se detectaron
anticuerpos borrelicidas en ninguno de los perros testigo no
vacunados antes o después de la exposición (datos no presentados).
La ausencia de anticuerpos borrelicidas en perros testigo tras la
exposición es similar a los resultados que mostraron la falta de
detección de anticuerpos contra OspA mediante ELISA de OspA e
inmunoelectrotransferencia en perros testigo tras la
exposición.
| Antes de la exposición | |||
| Perro n.º | C-1-11 | S-1-10 | 297^{a} |
| Vacunados | |||
| 574 | 320 | 20 | 16 |
| 586 | 80 | 160 | 32 |
| 615 | 320 | 80 | 16 |
| 627 | 320 | 160 | 64 |
| 639 | 320 | 320 | 64 |
| 558 | 320 | 80 | 32 |
| 560 | 160 | 160 | 32 |
| 562 | 320 | 160 | 64 |
| 564 | 320 | 160 | 64 |
| 566 | 320 | 80 | 64 |
| 568 | 640 | 160 | 128 |
| 570 | 320 | 160 | 32 |
| 580 | 320 | 160 | 128 |
| 582 | 320 | 80 | 16 |
| 584 | 80 | 80 | 16 |
| 609 | 160 | 320 | 128 |
| 617 | 320 | 160 | 128 |
| 641 | 320 | 40 | 32 |
| 643 | 640 | 320 | 256 |
| 647 | 320 | 20 | 16 |
| GMT^{b} | 279 | 113 | 66 |
| No vacunados | |||
| 598 | NEG^{c} | NEG | NEG |
| 655 | NEG | NEG | NEG |
| 663 | NEG | NEG | NEG |
| 669 | NEG | NEG | NEG |
| 677 | NEG | NDd | NEG |
| 610 | NEG | NEG | NEG |
| 612 | NEG | NEG | NEG |
| 651 | NEG | NEG | NEG |
| 661 | NEG | NEG | NEG |
| 671 | NEG | NEG | NEG |
| 673 | NEG | ND | NEG |
| 554 | NEG | NEG | NEG |
| 556 | NEG | NEG | NEG |
| 608 | NEG | NEG | NEG |
| 665 | NEG | NEG | NEG |
| ^{a} Cepa aislada de líquido cefalorraquídeo humano de Connecticut. | |||
| ^{b} Media geométrica del título. | |||
| ^{c} \begin{minipage}[t]{155mm}Negativo - corresponde a un título < 1:20 para las cepas aisladas C-1-11 y S-1-10, y < 1:16 para la cepa aislada 297.\end{minipage} | |||
| ^{d} No realizado. |
Se recogió un total de 1.363 garrapatas de I.
scapularis (732 hembras y 631 machos) en las cercanías de la
zona de Ettrick, WI. Se comprobó que la tasa de infección por B.
burgdorferi en las garrapatas era 44%, determinada por análisis
de FA de los intestinos medios de garrapatas machos. Esta tasa de
infección es similar a la tasa de infección de 47% descrita por
Lacombe y colaboradores (Lacombe, E, et al., (1993) J.
Infect. Dis. 167: 1236-1238). Se realizaron
cálculos para determinar la probabilidad de que cada perro recibiese
por lo menos una garrapata en el momento de la exposición. Los
resultados demuestran que hubo una probabilidad de 99,4% de que el
último de los 35 perros expuestos recibiese por lo menos una
garrapata infectada (Tabla 22). En el momento de la exposición, se
colocaron 10 garrapatas hembras y 6 garrapatas machos en cada perro,
y se permitió que se alimentasen durante una semana. En general,
las garrapatas se fijaban en el plazo de 24 horas y la mayoría de
las garrapatas se alimentaban hasta hincharse completamente o casi
completamente durante el período de exposición de una semana. Las
garrapatas que se habían desprendido del perro se mantuvieron en la
placa. Al final del período de fijación de la garrapata de una
semana, se analizaron las garrapatas recuperadas mediante FA para
detectar la presencia de B. burgdorferi. Las garrapatas
fueron recuperadas de 18 a 20 animales vacunados, y se recuperó por
lo menos una garrapata infectada con B. burgdorferi de 8 de
los 18 (44%) animales. Se recuperaron garrapatas en 14 a 15 perros
no vacunados, y 12 de 14 (86%) resultaron positivos para B.
burgdorferi. Fikrig ha descrito (15) asimismo que se recuperan
menos garrapatas infectadas de animales vacunados que de animales
no vacunados (Fikrig, E. et al. (1992) P.N.A.S. 89:
5418-5421).
Se ha utilizado el aislamiento de B.
burgdorferi de la piel de animales como indicador de la
infección por B. burgdorferi. Por consiguiente, se
realizaron biopsias cutáneas de perros anestesiados a los 18 días
tras la exposición a garrapatas, para comprobar la infección con
garrapatas infectadas con B. burgdorferi. Se aisló B.
burgdorferi de la piel de 1 de 20 (5%) de los perros vacunados,
en comparación con 14 a 15 (93%) de los testigos no vacunados
(Tabla 23).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}
\newpage
En la Tabla 22, el número teórico de garrapatas
infectadas colocadas en los perros se basó en la tasa de infección
actual. Por ejemplo, 322/732, o 44%, de las garrapatas estaban
teóricamente infectadas. Por tanto, 40% de 10 garrapatas analizadas
indica un máximo de 5 garrapatas infectadas, en el peor de los
casos, con la probabilidad de no contar con suficientes garrapatas
infectadas para algunos de los últimos perros del estudio. Este
número se utilizó para valorar las nuevas tasas de infección de la
población para el siguiente perro.
En el cálculo de la probabilidad de tener por lo
menos 1 garrapata infectada, se sumaron 10 probabilidades (1
garrapata, 2 garrapatas, 3 garrapatas, 4 garrapatas, ... y 10
garrapatas) sobre la base de la población actual de garrapatas
infectadas, garrapatas totales, y garrapatas totales restantes. Como
recurso matemático se utilizó una distribución hipergeométrica para
determinar la probabilidad de tener 1 garrapata infectada de una
muestra de 10 tomada de una población de 732 garrapatas con 322
garrapatas infectadas. Para obtener por lo menos 1 garrapata
infectada, se calcularon y se sumaron las probabilidades de 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 garrapatas.
| Perro n.º | Biopsia cutánea^{a} | Fecha en la que | Patas afectadas | Letargo y fiebre |
| se observó la cojera | ||||
| Vacunados | ||||
| 574 | - | - | - | - |
| 586 | + | - | - | - |
| 615 | - | Jul. | 2 | - |
| 627 | - | Sept. | 1 | - |
| 639 | - | - | - | - |
| 558 | - | - | - | - |
| 560 | - | - | - | - |
| 562 | - | - | - | - |
| 564 | - | - | - | - |
| 566 | - | - | - | - |
| 568 | - | - | - | - |
| 570 | - | - | - | - |
| 580 | - | - | - | - |
| 582 | - | - | - | - |
| 584 | - | - | - | - |
| 609 | - | - | - | - |
| 617 | - | - | - | - |
| 641 | - | - | - | - |
| 643 | - | - | - | - |
| 647 | - | - | - | |
| No vacunados | ||||
| 598 | + | Jul. | 4 | L |
| 655 | + | Sept. | 1 | - |
| 663 | + | - | - | - |
| 669 | - | - | - | - |
| 677 | + | - | - | - |
| 610 | + | Jun. | 3 | L, F |
| 612 | + | Oct. | 1 | F |
| 651 | + | Jun. | 1 | F |
| 661 | + | Sept. | 1 | L, F |
| 671 | + | Oct. | 1 | F |
| 673 | + | Sept. | 1 | F |
| 554 | + | - | - | - |
| 556 | + | - | - | - |
| 608 | + | Nov. | 1 | L, F |
| 665 | + | Nov. | 1 | F |
| ^{a} \begin{minipage}[t]{155mm}Biopsias cutáneas realizadas en los sitios de picadura de la garrapata dos semanas después de la fijación de la garrapata.\end{minipage} |
El principal signo clínico de la enfermedad de
Lyme en perros es la cojera. Se valoró la protección de los perros
contra la enfermedad de Lyme como una reducción significativa en el
número de perros cojos entre los animales vacunados y los testigos.
Hasta el momento, los perros han sido sometidos a observación diaria
para detectar cojera durante siete meses tras la exposición a
garrapatas. El número de los perros que han presentado cojera y los
signos clínicos asociados se muestran en la Tabla 23. Se observó
cojera en dos perros vacunados. Uno de los animales vacunados tenía
una extremidad afectada, mientras que el otro animal vacunado tenía
dos extremidades afectadas. Diez testigos no vacunados presentaron
cojera, y los signos asociados de letargo y/o fiebre se
manifestaron en 9 de los 10 perros. El perro testigo tenía tres
extremidades afectadas. La cojera fue más pronunciada en los perros
no vacunados, en el sentido de que los perros eran más renuentes a
cargar peso en la extremidad afectada. En la mayoría de los perros
no vacunados las articulaciones afectadas aparecían tumefactas y
calientes al tacto.
La observación temporal de la cojera en los
perros tras la exposición se presenta en la Tabla 24. Se observó
cojera por primera vez en perros aproximadamente dos meses después
de la exposición a garrapatas. En ese momento, un perro vacunado y
dos perros testigo presentaban cojera. A comienzos de septiembre,
cuatro meses después de la exposición, se había observado cojera en
otro perro vacunado y en otros cuatro perros testigo. Dado que no
se sabía si alguno del resto de los perros iba a presentar cojera,
se decidió hacer la autopsia a cinco animales vacunados y a cinco
animales no vacunados para determinar si podía aislarse B.
burgdorferi de los perros. La recuperación de la espiroqueta de
los perros que no habían presentado cojera indicaría la
supervivencia del microorganismo en los perros, aunque no
presentasen signos clínicos. Dos de los cinco perros en cada grupo
habían presentado cojera y tres perros en cada grupo habían
permanecido normales. Debido a que se habían retirado tres perros
de la población de cada grupo de prueba, el número de los perros en
los grupos con animales vacunados y en el grupo testigo con
animales no vacunados se redujo a 17 y 12, respectivamente. A los
siete meses después de la exposición a garrapatas, se observó
cojera en un total de 2 de 17 (12%) animales vacunados y 10 de 12
(83%) testigos no vacunados. De aquí se deduce una puntuación del
índice de protección de 85,6%, que representa una reducción
significativa (p \leq 0,01) en la enfermedad clínica entre
animales vacunados y testigos. En la Figura 14 se muestra un
resumen del porcentaje de perros que presentaron cojera tras la
exposición.
Se intentó hacer la autopsia de los perros cojos
en el plazo de tres a cuatro días del episodio de cojera, con el
objeto de aislar B. burgdorferi de la piel, articulaciones y
órganos de los perros (Tabla 25). No se aisló B. burgdorferi
de la piel, articulaciones u órganos de ninguno de los dos perros
vacunados cojos, pero se aisló el microorganismo de la piel y la
articulación del perro vacunado sin cojera que resultó inicialmente
positivo en la biopsia cutánea. En contraposición, se aisló B.
burgdorferi de las muestras de biopsia cutánea, tomadas en el
momento de la autopsia a partir del sitio de la picadura de la
garrapata o de sitios alejados del sitio de la picadura de la
garrapata, de todos los perros testigo no vacunados que estaban
cojos. La espiroqueta también se aisló de las articulaciones u
órganos de todos los perros testigo cojos no vacunados. El perro
testigo no vacunado que resultó inicialmente negativo en la biopsia
cutánea siguió siendo negativo en la biopsia cutánea en el momento
de la autopsia, y no se recuperó B. burgdorferi de las
articulaciones o los órganos de dicho perro.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
| Reaislamiento de B. burgdorferi en | |||||
| el momento de la cojera/autopsia | |||||
| Perro n.º | Biopsia | Fecha de observación | Piel | Articulaciones | Órganos^{b} |
| cutánea^{a} | de la cojera | ||||
| Vacunados | |||||
| 574 | - | - | - | - | - |
| 586 | + | - | + | + | - |
| 615 | - | Jul. | - | - | - |
| 627 | - | Sept. | - | - | - |
| 639 | - | - | - | - | |
| 558 | - | - | |||
| 560 | - | - | |||
| 562 | - | - | |||
| 564 | - | - | |||
| 566 | - | - | |||
| 568 | - | - | |||
| 570 | - | - | |||
| 580 | - | - | |||
| 582 | - | - | |||
| 584 | - | - | |||
| 609 | - | - | |||
| 617 | - | - | |||
| 641 | - | - | |||
| 643 | - | - | |||
| 647 | - | ||||
| No vacunados | |||||
| 598 | + | Jul. | + | + | - |
| 655 | + | Sept. | + | + | - |
| 663 | + | - | + | + | - |
| 669 | - | - | - | - | - |
| 677 | + | - | + | + | +^{B} |
| 610^{c} | + | Jun. | + | + | +^{B,H,K} |
| 612 | + | Oct. | -/+^{d} | + | - |
| 651 | + | Jun. | + | + | +^{S} |
| 661 | + | Sept. | + | + | - |
| 671 | + | Oct. | +/+ | + | - |
| 673 | + | Sept. | +/+ | + | - |
| 554 | + | - | |||
| 556 | + | - | |||
| 608 | + | Nov. | -/+ | + | +^{H} |
| 665 | + | Nov. | +/+ | + | - |
| ^{a} \begin{minipage}[t]{155mm}Biopsias cutáneas realizadas en los sitios de picadura de las garrapatas dos semanas después de la fijación de la garrapata.\end{minipage} | |||||
| ^{b} B: Vejiga/H: Corazón/K: Riñón/S: Bazo | |||||
| ^{c} También se aisló B. burgdorferi del líquido cefalorraquídeo. | |||||
| ^{d} \begin{minipage}[t]{155mm}Biopsia realizada en el sitio de picadura de la garrapata / Biopsia realizada en un sitio alejado del sitio de la picadura de la garrapata.\end{minipage} | |||||
Se ha demostrado que la respuesta de inmunidad
humoral desempeña un papel fundamental en la protección de animales
contra la enfermedad de Lyme (Barthold, S.W. et al. (1993)
Infect. Immunol. 61: 4696-4702; Callister,
et al. (1991); Callister, et al. (1992); Johnson,
et al. (1986); Johnson, et al. (1986); Johnson, et
al. (1988); Kochi, et al. (1988); Schaible, U.E. et
al. (1990) P.N.A.S. 87: 3768-3722;
Schmitz, et al. (1991)). En el presente estudio se
utilizaron diversos ensayos serológicos para caracterizar la
respuesta de anticuerpos en perros vacunados con la bacterina. Se
utilizó la prueba de ELISA de células enteras para poner de
manifiesto la respuesta de anticuerpos contra antígenos de la
superficie de B. burgdorferi. La generación de títulos de
anticuerpos que persisten durante siete meses después de la
vacunación es una prueba de la capacidad antigénica de la
bacterina. La especificidad de la respuesta de anticuerpos se
demostró con inmunoelectrotransferencia. En el momento de la
exposición, siete meses después de la vacunación, los anticuerpos en
el suero de los perros vacunados reaccionaban principalmente con
las proteínas superficiales OspA y OspB. Otros investigadores han
demostrado asimismo que la respuesta predominante de anticuerpos
contra células de B. burgdorferi cultivadas in vitro
se dirige contra las proteínas de la superficie externa (Appel,
et al. (1993); Gern, L. et al. (1993) J. Infect. Dis.
167: 971-975; Roerhign et al. (1992)).
La prueba de ELISA de OspA demostró adicionalmente la presencia de
elevados títulos de anticuerpos en el suero de los perros vacunados
y confirmó la capacidad de la bacterina para generar una respuesta
de anticuerpos contra un antígeno protector de la espiroqueta.
Se utilizó el ensayo de anticuerpos borrelicidas
para demostrar la actividad funcional del anticuerpo contra B.
burgdorferi en el suero de los perros vacunados. La lisis,
mediada por anticuerpos, de células de Borrelia es el
resultado de la combinación de anticuerpos específicos con
componentes del complemento y de la formación del complejo de
ataque a la membrana. En efecto inhibidor del crecimiento de la
lisis, mediada por anticuerpos, de B. burgdorferi puede
considerarse análogo al de los anticuerpos neutralizantes de virus.
Los estudios han demostrado que la protección de animales de
laboratorio contra la enfermedad de Lyme correlaciona con los
títulos de anticuerpos borrelicidas (Jobe, D. A. et al.,
(1994) J. Clin. Microbiol. (En prensa); Lourich, S.D. et al.
(1991) Infect. Immunol. 59: 2522- 2528)). Por consiguiente,
la presencia de anticuerpos borrelicidas en los perros vacunados
puede utilizarse para demostrar la capacidad inmunógena de la
bacterina. Se comprobaron elevados niveles de anticuerpos
borrelicidas en todos los perros vacunados, que seguían siendo
detectables en el momento de la exposición, siete meses después de
la vacunación. Los anticuerpos en los animales vacunados resultaron
también borrelicidas para la cepa heteróloga 297 de B.
burgdorferi. Los resultados que muestran que los anticuerpos de
perros testigo no vacunados tras la exposición no reaccionaban con
OspA y no eran borrelicidas indican que gran parte de la actividad
borrelicida se debe a anticuerpos que reaccionan con OspA y con
otras proteínas de la superficie protectora. Callister y
colaboradores han demostrado que la actividad borrelicida de los
anticuerpos contra B. burgdorferi en el suero humano puede
ser adsorbida con proteína OspA recombinante (Callister, S.M. et
al. (1992)). De este modo, los perros vacunados con la bacterina
generaron una respuesta protectora de anticuerpos contra cepas
diferentes de la cepa presente en la
vacuna.
vacuna.
En el presente estudio se utilizó un modelo de
exposición natural a garrapatas, similar al descrito por Appel y
colaboradores (Appel et al. (1993)), para provocar la
enfermedad de Lyme en perros. El modelo utilizado representa la vía
natural de exposición, dosis y virulencia de B. burgdorferi
presentes en las condiciones naturales sobre el terre-
no.
no.
Las garrapatas utilizadas en el presente estudio
fueron recogidas de una zona en la que enfermedad de Lyme es
endémica, y se comprobó que tenían una tasa de infección con B.
burgdorferi del 44%. Esta tasa de infección es similar a la
descrita por Lacombe (Lacombe et al. (1993)), aunque inferior
a la descrita por Appel (Appel et al. (1993). Shih y
Spielman han demostrado que las garrapatas infectadas transmiten
B. burgdorferi a ratones tras alimentarse en ellos durante
tan sólo 2 días (Shih C. et al., (1993) J. Clin. Microbiol.
31: 2878-2881). Por consiguiente, el período
de una semana de alimentación de la garrapata utilizado en el
presente estudio sería más que suficiente. De hecho, la eficacia de
la exposición se demostró de dos maneras. La prueba de ELISA de
células enteras detectó una respuesta serológica contra B.
burgdorferi en 14 de 15 perros testigo no vacunados tras la
exposición. Los resultados correlacionaron con los resultados de las
biopsias cutáneas en el sentido de que un perro que apenas
presentaba respuesta serológica fue el mismo perro cuya biopsia
cutánea resultó negativa tras la exposición y cuya biopsia cutánea
resultó negativa en el momento de la autopsia. Es interesante
señalar que se recuperaron menos garrapatas infectadas con B.
burgdorferi de perros vacunados que de perros testigo no
vacunados. Estas observaciones son similares a las realizadas por
Fikrig y colaboradores (Frikig et al., P.N.A.S. (1992)).
Estos autores conjeturaron que el número reducido de B.
burgdorferi en las garrapatas de perros vacunados se debía al
aumento de la eliminación de las espiroquetas mediada por
anticuerpos.
anticuerpos.
La cojera es la principal manifestación de la
borreliosis de Lyme en el perro, y fue utilizada en el presente
estudio como el principal criterio de la enfermedad clínica. Tras la
exposición, el desarrollo temporal de cojera en los perros fue
variable durante el período de siete meses tras la exposición. Se
observó cojera en dos perros testigo no vacunados un mes después de
la exposición. Sin embargo, la mayoría de los episodios de cojera
no apareció hasta cuatro a cinco meses después de la exposición.
Appel describió asimismo que la cojera en perros no aparecía hasta
dos a cinco meses después de la exposición (Appel, et al.
(1993)). Diez de doce perros testigo no vacunados que resultaron
positivos en las biopsias cutáneas tras la exposición presentaron
cojera, y se aisló de nuevo B. burgdorferi de la piel y las
articulaciones u otros órganos de todos estos perros. La
observación de que B. burgdorferi permanecía en la piel de
estos perros hasta siete meses después de la exposición y en
lugares completamente alejados del sitio de la picadura de la
garrapata pone de relieve el desarrollo evolutivo del parásito para
garantizar la transmisión de hospedador a hospedador. No volvió a
aislarse B. burgdorferi de los dos perros vacunados que
presentaron cojera. La cojera de estos dos perros no puede
explicarse sobre la base de la respuesta de inmunidad humoral. Otra
posible explicación incluye la predisposición genética de los
perros, la dosis de espiroquetas y la eficacia de la transmisión a
partir de las garrapatas. Aunque B. burgdorferi ha sido
ampliamente estudiada en los últimos años, los mecanismos patógenos
del microorganismo no están bien caracterizados. Es bien conocida la
capacidad de otras especies de Borrelia de quedar
secuestradas en sitios inmunológicamente privilegiados del
hospedador y de burlar sus mecanismos de defensa (Geogitis, K.
et al. (1992) J. Infect. Dis. 166:
440-444; Levy et al. (1992); Ramachandra,
R.N. et al. (1992) J. Med. Entomol. 29:
818-826), y se ha conjeturado este comportamiento en
el caso de B. burgdorferi.
La eficacia de la bacterina se valoró por una
reducción significativa en la cojera entre los animales vacunados y
los perros no vacunados expuestos a garrapatas infectadas con B.
burgdorferi. La incidencia global de cojera de 2 de un total de
17 (12%) animales vacunados, en comparación con 10 de un total de 12
(83%) testigos no vacunados arroja, una puntuación del índice de
protección de 86%. Este valor representa una reducción
significativa (p \leq 0,01) en la aparición de las manifestaciones
clínicas de la enfermedad de Lyme entre animales vacunados y
testi-
gos.
gos.
En el presente estudio se demostró la seguridad
de la bacterina. La eficacia y la duración de la inmunidad fueron
demostradas por la capacidad de la vacuna para reducir el desarrollo
de la enfermedad clínica en perros vacunados en comparación con los
testigos a los siete meses tras la exposición a garrapatas
infectadas con B. burgdorferi.
En la comparación de los resultados del Ejemplo
13 y del Ejemplo 14, se considera que el Ejemplo 14 proporciona
mejores resultados debido a la utilización de más garrapatas, así
como garrapatas más sanas y mejores biopsias cutáneas en el Ejemplo
14. Como resultado, se comprobó que los perros testigo tenían signos
clínicos de la enfermedad de Lyme y, por consiguiente, se demuestra
una reducción en los signos clínicos de los animales vacunados en
comparación con los testigos cuando se utiliza la bacterina de la
presente invención.
En este estudio se utilizaron sabuesos
procedentes de la colonia ubicada en Solvay Animal Health, Inc.,
Charles City, Iowa. La media de edad de los perros en el momento de
la vacunación fue 13 semanas (Tabla 26). Todos los perros eran
seronegativos (título < 20) a B. burgdorferi según se
determinó por ELISA de células enteras.
\vskip1.000000\baselineskip
| Perro n.º | Sexo | Fecha de nacimiento | Edad (semanas) en la primera vac. |
| Vacunados con | |||
| dosis completa | |||
| 760 | H | 5-23-93 | 15 |
| 774 | H | 6-02-93 | 13 |
| 786 | M | 6-16-93 | 11 |
| 831 | M | 5-16-93 | 16 |
| 843 | M | 5-13-93 | 16 |
| 849 | M | 5-23-93 | 15 |
| 853 | M | 5-25-93 | 15 |
| 859 | M | 6-12-93 | 12 |
| 871 | M | 6-16-93 | 11 |
| 881 | M | 6-28-93 | 10 |
| Perro n.º | Sexo | Fecha de nacimiento | Edad (semanas) en la primera vac. |
| Vacunados con | |||
| dosis completa | |||
| 746 | H | 5-16-93 | 16 |
| 758 | H | 5-23-93 | 15 |
| 768 | H | 6-02-93 | 13 |
| 782 | H | 6-12-93 | 12 |
| 835 | M | 5-16-93 | 16 |
| 847 | M | 5-23-93 | 15 |
| 851 | M | 5-25-93 | 15 |
| 855 | M | 6-02-93 | 13 |
| 863 | M | 6-12-93 | 12 |
| 879 | M | 6-28-93 | 10 |
| Testigos no | |||
| vacunados | |||
| 756 | H | 5-23-93 | 15 |
| 762 | H | 5-23-93 | 15 |
| 764 | H | 5-25-93 | 15 |
| 766 | H | 5-25-93 | 15 |
| 770 | H | 6-02-93 | 13 |
| 772 | H | 6-02-93 | 13 |
| 776 | H | 6-02-93 | 13 |
| 845 | M | 5-23-93 | 15 |
| 857 | M | 6-02-93 | 13 |
| 861 | M | 6-12-93 | 12 |
| 865 | M | 6-12-93 | 12 |
| 867 | M | 6-12-93 | 12 |
| 869 | M | 6-16-93 | 11 |
| 883 | M | 6-28-93 | 10 |
Se utilizaron dos bacterinas en el estudio. La
dosis completa de bacterina se preparó a partir de los serotipos
S-1-10 y
C-1-11 de B. burgdorferi en
la octava ronda de propagación por pases del cultivo madre original
para siembra, como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 2 anteriores.
Esta bacterina se formuló de modo que contuviese 5 x 10^{8}
células de cada serotipo por cada dosis de un mililitro, y como
adyuvante se empleó hidróxido de aluminio al 7,5% (p/v) (Rehydragel
HPA, Reheis Chemical Co., Berkeley Hts., Nueva Jersey). La
bacterina a dosis reducida se preparó diluyendo la dosis completa de
bacterina 1:10 en diluyente de adyuvante compuesto de solución
salina que contenía hidróxido de aluminio al 7,5% (p/v) (Rehydragel
HPA) y gentamicina y nistatina como conservantes. Ambas bacterinas
se almacenaron a 4ºC hasta el momento de su utilización.
Se vacunaron diez perros por vía intramuscular
en la zona inferior del muslo empleando dos dosis de 1,0 ml
separadas por un intervalo de tres semanas para cada bacterina. Tras
cada vacunación los perros se sometieron a observación para
detectar reacciones anómalas, se registraron las temperaturas y se
sometieron a palpación los sitios de la inyección diariamente
durante cinco días. Un grupo de catorce perros no vacunados
sirvieron como testigos.
Se extrajo sangre antes y después de la
vacunación, y a intervalos tras la exposición. Se analizó el suero
para detectar anticuerpos contra B. burgdorferi empleando
ELISA de células enteras, ELISA de OspA, ensayo de actividad
borrelicida, e inmunoelectrotransferencia.
La respuesta de anticuerpos en perros contra los
antígenos superficiales de B. burgdorferi se determinó
empleando una modificación de una prueba de ELISA de células
enteras utilizada en el Laboratorio Regional de Sanidad Animal,
Baron, WI. Los cultivos de la fase logarítmica tardía de cepas
C-1-11 y
S-1-10 de B. burgdorferi
fueron inactivados con etilenimina binaria (BEI). Se recubrieron
los pocillos de las placas de Immunol-3 (Dynatech
Laboratories, Inc., Chantilly, VA) con antígenos de células enteras
de S-1-10 o
C-1-11 a un nivel de 0,3 \mug en
tampón de recubrimiento de carbonato de sodio. Las placas se
incubaron en una cámara húmeda a 4ºC durante 15 a 17 horas. Se
desechó el contenido de los pocillos y los sitios reactivos no
unidos se bloquearon añadiendo solución salina tamponada con
fosfato (PBS) que contenía leche desnatada en polvo
(PBS-NFDM) al 5%, y se incubaron en una cámara
húmeda durante 60 minutos a 37ºC. Los pocillos se vaciaron y se
añadieron 50 \mul de suero problema diluido en PBS que contenía
Tween-20 al 0,05% (PBS-TW) a
pocillos duplicados, y se incubaron en una cámara húmeda durante 60
minutos a 37ºC. En cada placa se incluyó suero testigo de perros
positivo y negativo. Las placas se lavaron tres veces con solución
salina que contenía Tween-20 al 0,05%, y se
añadieron partes alícuotas de 50 \mul por pocillo de anticuerpos
caprinos, marcados con peroxidasa, contra la IgG canina (Kirkegaard
& Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) y diluidos 1:1500
en PBS-TW. Las placas se incubaron en una cámara
húmeda durante 60 minutos a 37ºC y se lavaron tres veces con
PBS-TW. El sustrato se preparó disolviendo 30,0 mg
de O-fenilendiamina en una solución de fosfato de
sodio dibásico 0,051 M, ácido cítrico 0,024 M, peróxido de
hidrógeno al 0,012%, y se añadieron partes alícuotas de 100 \mul a
cada pocillo. La reacción se paró con 50 \mul por pocillo de
ácido sulfúrico 2 N, y se determinó la densidad óptica de cada
pocillo a 490 nm en un lector de ELISA. El título se definió como
el recíproco de la última dilución que proporcionó una densidad
óptica del 30% de la máxima densidad óptica.
Se recubrieron los pocillos de una placa de
microvaloración de 96 pocillos con 75 ng de OspA recombinante de
S-1-10 o
C-1-11 y se incubaron durante toda
la noche a 4ºC. Después del recubrimiento los pocillos se trataron
con NFDM al 5% en PBS durante 30 minutos a 37ºC. Los pocillos se
lavaron tres veces con PBS-TW y se añadieron a los
pocillos 50 \mul de diluciones dobles de suero de perro. Tras
incubar a 37ºC durante una hora, los pocillos se lavaron con
PBS-TW y se añadieron a los pocillos 50 \mul de
anticuerpos caprinos, marcados con HRP, contra la IgG canina
(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). Los
anticuerpos unidos se detectaron añadiendo el sustrato ABTS
(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD). La
densidad óptica de cada pocillo se determinó a 405 nm en un lector
de ELISA. El título se definió como el recíproco de la última
dilución que proporcionó una densidad óptica del 30% de la máxima
densidad óptica.
Los cultivos de las cepas
S-1-10 y
C-1-11 de B. burgdorferi en
la fase logarítmica media a tardía se recogieron por centrifugación
a 15.000 x g a 4ºC durante 30 minutos. Las bacterias se lavaron tres
veces por centrifugación con solución salina estéril. Se hirvieron
suspensiones de aproximadamente 1 x 10^{8} células en tampón para
muestras de electroforesis durante nueve minutos, y se sometieron a
electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS al
10% (Laemmli, 1970). Las proteínas separadas fueron
electrotransferidas a una membrana Immobilon™ de PVDF (Millipore
Corp., Bedford, MA) empleando una modificación del procedimiento
descrito por Towbin (Towbin et al. 1979). La membrana de PVDF
se incubó durante 90 minutos a 22ºC en Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH
7,2 (TBS) con NFDM al 5%. Las tiras se incubaron con suero canino o
con anticuerpo monoclonal contra OspA diluido 1:75 en el tampón de
bloqueo durante 60 minutos a 22ºC. Después se lavaron las tiras dos
veces en TBS que contenía Triton X-100 al 0,2% y
una vez en TBS. El anticuerpo unido se detectó añadiendo anticuerpos
caprinos, conjugados con HRP, contra la IgG canina o contra la IgG
murina (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg,
MD). Las bandas de proteína se visualizaron con un sistema de
sustrato TMB para peroxidasa en membranas (Kirkegaard & Perry
Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD).
El ensayo de actividad borrelicida se llevó a
cabo utilizando una modificación de los procedimientos descritos
anteriormente (6, 7). Brevemente, los cultivos de 72 horas en fase
logarítmica media de las cepas aisladas
C-1-11 y
S-1-10 de B. burgdorferi en
medio de Barbour-Stoenner-Kelly
(BSK) modificado se cuantificaron en una cámara de
Petroff-Hauser y se diluyeron hasta contener 1 x
10^{6} células/ml de medio de BSK. Se mezclaron partes alícuotas
de 100 \mul de suero diluido, termoinactivado, con 100 \mul de
cada suspensión de B. burgdorferi, y se añadieron 10 \mul
de complemento de suero de cobaya (210 unidades CH_{50}; GIBCO
Laboratories, Grand Island, NY). La suspensión se mezcló suavemente
y se incubó a 32ºC durante 16 hasta 24 horas. Tras la incubación de
los tubos de reacción, se diluyeron 100 \mul de la mezcla de
reacción con PBS que contenía naranja de acridina 5,4 x 10^{-9}
M. La detección de la actividad borrelicida se llevó a cabo
utilizando una modificación de los procedimientos descritos
anteriormente (Callister, et al. (1994). La muerte celular
provocada por los anticuerpos borrelicidas causa la aparición de
protuberancias en las paredes celulares de B. burgdorferi,
con lo que se adsorben mayores concentraciones de naranja de
acridina en las paredes celulares dañadas y en el interior. Por
consiguiente, los microorganismos muertos de B. burgdorferi
fluorecen de modo mucho más intenso que las espiroquetas vivas
normales. Un aumento en la intensidad de la fluorescencia de \geq
16% en comparación con los microorganismos expuestos a suero normal
de perro se consideró una prueba positiva de la actividad
borrelicida. El título de punto final se expresó como el recíproco
de la última dilución a la que se observó un aumento
de \geq 16% en la intensidad de la fluorescencia. Los perros con un título de < 1:20 fueron definidos seronegativos.
de \geq 16% en la intensidad de la fluorescencia. Los perros con un título de < 1:20 fueron definidos seronegativos.
Se recogió un total de 300 garrapatas machos y
360 garrapatas hembras de I. scapularis de una zona cercana
a Ettrick, Wisconsin, en la que la enfermedad de Lyme es endémica.
Para determinar la tasa global de infección de las garrapatas por
B. burgdorferi, se examinaron los intestinos medios de 49
garrapatas machos de I. scapularis mediante una prueba de
inmunofluorescencia (FA) utilizando el anticuerpo monoclonal contra
la Osp A proporcionado por el Dr. A. G. Barbour. A las cuatro
semanas después de la segunda vacunación, cada perro fue sometido a
exposición con 10 garrapatas hembras y 6 garrapatas machos. Las
garrapatas hembras son las únicas garrapatas adultas que transmiten
la enfermedad. Las garrapatas machos son necesarias para la
alimentación adecuada de las garrapatas hembras. Para cada perro se
seleccionaron al azar cinco garrapatas hembras y tres garrapatas
machos a partir del conjunto de garrapatas y se colocaron en dos
placas de Petri pequeñas que se fijaron a un área afeitada de la
zona torácica dorsal izquierda anterior de cada perro. Se dejó que
las garrapatas se alimentasen durante una semana y se sometieron a
observación a intervalos de dos días. Una semana después de la
fijación se recuperaron las garrapatas y se examinaron los
intestinos medios para detectar la presencia de B.
burgdorferi mediante FA empleando el anticuerpo monoclonal
contra B. burgdorferi.
Los perros fueron sometidos a observación diaria
después de la exposición para detectar signos clínicos asociados a
la enfermedad de Lyme. Los signos clínicos utilizados como
indicadores principales del curso clínico de la enfermedad de Lyme
fueron cojera, letargo y fiebre. La cojera se definió como la
renuencia a cargar el peso en la extremidad afectada, con o sin
tumefacción y aumento de la temperatura en la articulación afectada,
patas rígidas, y migración de la cojera de una articulación a otra
o de una extremidad a otra. Los perros también fueron sometidos a
observación para detectar letargo y fiebre.
Para el aislamiento de B. burgdorferi se
tomaron muestras de la piel, sangre, articulaciones y órganos de
los perros. Se realizaron biopsias cutáneas en el sitio de fijación
de la garrapata y en sitios alejados del sitio de la picadura de la
garrapata en perros anestesiados a los 21 días después de la
fijación de la garrapata y en el momento de la autopsia. Los sitios
alejados estaban ubicados en posición ventral al sitio de la
picadura de la garrapata, posterior al sitio de la picadura de la
garrapata, y en el lado derecho de la zona torácica dorsal anterior
situada en el lado opuesto del perro. La piel se afeitó y se lavó
con solución Solvahex para lavado quirúrgico, y se aclaró a fondo
con agua estéril para eliminar los restos de desinfectante. Se
practicó una incisión elíptica a través de las capas dérmica y
subcutánea de la piel. Se colocó aproximadamente un gramo de piel
en nueve mililitros de medio de BSK que contenía agarosa al 0,15% y
40 \mug de rifampicina/ml. La muestra de la biopsia fue
homogeneizada y se prepararon dos diluciones adicionales de 10 veces
de homogeneizado en nueve mililitros de blancos de medio de BSK.
Los cultivos se incubaron a 32ºC durante seis semanas y después se
examinaron por microscopía a las tres y a las seis semanas tras la
inoculación, para detectar el crecimiento de las espiroquetas. En
el caso de los cultivos que presentaban crecimiento de espiroquetas
se confirmó que el germen era B. burgdorferi mediante FA,
empleando el anticuerpo monoclonal contra B. burgdorferi. Los
cultivos que resultaron negativos para el crecimiento de
espiroquetas fueron desechados. En el momento de la autopsia se
extrajeron el corazón, el bazo, los riñones y la vejiga, y se
homogeneizaron en 50 ml de BSK que contenía agarosa y rifampicina
empleando un aparato Stomacher (Seward Medical, Londres,
Inglaterra). Se vertió una muestra de 50 ml y se prepararon
diluciones de 10 veces en medio de BSK. Los cultivos se incubaron
durante seis semanas a 32ºC, se sometieron a observación y se
confirmó que el germen era B. burgdorferi mediante FA. Una
muestra de dos a tres mililitros de líquido cefalorraquídeo se
añadió a nueve mililitros de medio de BSK y se preparó otra
dilución 1:10 en el mismo medio, se incubó y se sometió a
observación como se ha descrito. Se extrajo tejido de las
articulaciones del codo, el carpo, la rodilla, y el tarso. Se añadió
el tejido de cada articulación a nueve mililitros de medio de BSK
que contenía agarosa y rifampicina. Se preparó otra dilución 1:10
en el mismo medio, y los cultivos se incubaron y se sometieron a
observación como se ha descrito
Los perros fueron vacunados con dos dosis de
bacterina separadas por un intervalo de tres semanas. No se
observaron reacciones locales o sistémicas en ninguno de los
perros. Las temperaturas de los perros en ambos grupos de
vacunación permanecieron normales tras la primera y segunda dosis de
bacterina, Tablas 27 y 28, respectivamente.
| Temperaturas (°F) en los días después de la vacunación | ||||||
| Perro | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Vacunados - dosis completa | ||||||
| 746 | 100,4 | 100,6 | 100,2 | 100,2 | 100,3 | 100,3 |
| 758 | 101,4 | 101,6 | 100,6 | 101,1 | 101,7 | 100,2 |
| 768 | 100,4 | 101,1 | 100,9 | 100,8 | 101,2 | 100,4 |
| 782 | 100,8 | 100,5 | 100,7 | 101,1 | 100,2 | 100,6 |
| 835 | 101,2 | 101,1 | 100,6 | 100,9 | 100,9 | 100,6 |
| 847 | 101,8 | 100,5 | 101,6 | 101,1 | 100,1 | 100,5 |
| 851 | 100,8 | 100,9 | 100,8 | 100,6 | 101,2 | 100,2 |
| 855 | 100,8 | 101,4 | 101,7 | 100,6 | 101,3 | 100,9 |
| 863 | 100,8 | 100,1 | 101,2 | 100,8 | 101,1 | 100,5 |
| 879 | 101,1 | 101,6 | 101,9 | 101,2 | 101,2 | 102,2 |
| Vacunados - dosis reducida | ||||||
| 760 | 101,3 | 101,4 | 101,1 | 100,1 | 101,1 | 101,1 |
| 774 | 101,2 | 100,9 | 100,7 | 100,1 | 100,6 | 100,4 |
| 786 | 100,9 | 100,2 | 100,9 | 102,1 | 101,1 | 101,0 |
| 831 | 100,7 | 100,7 | 100,1 | 101,1 | 100,5 | 101,9 |
| 843 | 101,6 | 100,6 | 101,2 | 100,4 | 100,7 | 100,0 |
| 849 | 100,7 | 100,7 | 100,4 | 100,3 | 100,2 | 100,4 |
| 853 | 101,5 | 100,3 | 100,4 | 101,6 | 100,6 | 101,2 |
| 859 | 101,9 | 100,5 | 101,4 | 101,3 | 101,1 | 102,0 |
| 871 | 100,5 | 100,1 | 101,1 | 101,6 | 100,7 | 101,1 |
| 881 | 101,1 | 101,7 | 100,8 | 101,1 | 101,4 | 101,7 |
| Temperaturas (°F) en los días después de la vacunación | ||||||
| Perro | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Vacunados - dosis completa | ||||||
| 746 | 102,6 | 102,1 | 103,0 | 102,2 | 102,7 | 103,0 |
| 758 | 102,2 | 102,0 | 102,8 | 101,6 | 102,7 | 102,1 |
| 768 | 101,5 | 101,9 | 102,4 | 101,8 | 102,6 | 101,8 |
| 782 | 101,9 | 101,6 | 102,0 | 102,0 | 102,3 | 102,0 |
| 835 | 102,6 | 101,7 | 103,0 | 102,2 | 102,5 | 102,2 |
| 847 | 102,0 | 102,4 | 101,7 | 101,4 | 101,9 | 101,3 |
| 851 | 102,5 | 102,1 | 102,3 | 101,7 | 102,8 | 102,1 |
| 855 | 102,1 | 102,8 | 102,4 | 101,8 | 102,3 | 102,1 |
| 863 | 101,7 | 102,0 | 101,8 | 101,7 | 102,4 | 101,9 |
| 879 | 102,0 | 102,3 | 101,9 | 101,6 | 101,7 | 101,6 |
| Vacunados - dosis reducida | ||||||
| 760 | 101,3 | 101,4 | 101,1 | 100,1 | 101,1 | 101,1 |
| 774 | 101,2 | 100,9 | 100,7 | 100,1 | 100,6 | 100,4 |
| 786 | 100,9 | 100,2 | 100,9 | 102,1 | 101,1 | 101,0 |
| 831 | 100,7 | 100,7 | 100,1 | 101,1 | 100,5 | 101,9 |
| 843 | 101,6 | 100,6 | 101,2 | 100,4 | 100,7 | 100,0 |
| 849 | 100,7 | 100,7 | 100,4 | 100,3 | 100,2 | 100,4 |
| 853 | 101,5 | 100,3 | 100,4 | 101,6 | 100,6 | 101,2 |
| 859 | 101,9 | 100,5 | 101,4 | 101,3 | 101,1 | 102,0 |
| 871 | 100,5 | 100,1 | 101,1 | 101,6 | 100,7 | 101,1 |
| 881 | 101,1 | 101,7 | 100,8 | 101,1 | 101,4 | 101,7 |
Se utilizó una prueba de ELISA que empleaba
células enteras de B. burgdorferi para demostrar la respuesta
serológica de perros vacunados y expuestos a antígenos de la
superficie de B. burgdorferi. Antes de la vacunación todos
los perros eran seronegativos. A las cuatro semanas después de la
segunda vacunación, los perros vacunados con la dosis completa de
bacterina tenían una MGT de anticuerpos de 788 contra
C-1-11 y una MGT de 520 contra
S-1-10 (Tabla 29). Los perros
vacunados con la bacterina a dosis reducida tenían una MGT
ligeramente menor, de 485, contra
C-1-11 y una MGT idéntica, de 520,
contra S-1-10. Tras la exposición,
los títulos de anticuerpos contra
C-1-11 y
S-1-10 en ambos grupos de bacterina
habían disminuido hasta casi el mismo nivel. A las 12 semanas tras
la exposición, la MGT de anticuerpos contra células enteras de los
perros testigo no vacunados fue mayor que la MGT de anticuerpos
contra células enteras de los perros vacunados. La MGT en los
testigos no vacunados fue 1502 y 2301 contra
C-1-11 y
S-1-10, respectivamente. Un perro
testigo no vacunado permaneció seronegativo 12 semanas después de
la exposición.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}
Se analizaron sueros de perros vacunados y de
perros testigo no vacunados antes y después de la vacunación y de
la exposición, para determinar la reactividad del anticuerpo con
antígenos específicos de B. burgdorferi. Todos los perros
eran seronegativos antes de la vacunación. Las respuestas de
anticuerpos contra las cepas C-1-11
y S-1-10 de B. burgdorferi en
perros vacunados con la dosis completa de bacterina se presentan en
las Figuras 1 y 2. La respuesta de anticuerpos se dirigió
principalmente contra las proteínas OspA y OspB de
C-1-11 y
S-1-10. Los perros vacunados con la
dosis completa de bacterina presentaban casi el mismo grado de
reacción contra las proteínas de pesos moleculares de 31 y 34
kilodaltons de OspA y OspB, respectivamente, de
C-1-11 y
S-1-10. Las diferencias en las
pautas de tinción de las proteínas OspA de
C-1-11 y
S-1-10 indican que hay una clara
diferencia antigénica entre las dos cepas aisladas. En algunos
perros se observó una ligera reactividad contra otras proteínas de
la espiroqueta. Los perros vacunados con la bacterina a dosis
reducida también generaron anticuerpos contra las proteínas OspA y
OspB de C- 1-11 y
S-1-10 (Figuras 3 y 4). La
intensidad de la tinción del perfil de anticuerpos en perros
vacunados con la bacterina a dosis reducida indicaba que el nivel de
respuesta contra OspA fue el mismo que el de perros que había
recibido la dosis completa de bacterina. A las 12 semanas tras la
exposición el perfil de anticuerpos permaneció esencialmente
invariable en perros de los grupos con la dosis completa y con la
dosis reducida de bacterina. La reactividad contra OspA y OspB
siguió siendo la principal respuesta de anticuerpos detectada. Sin
embargo, apenas hubo respuesta de anticuerpos contra otras
proteínas de Borrelia tras la exposición. Tras la exposición
se observó una disminución en la intensidad de la tinción contra
OspA y OspB en algunos animales vacunados, pero tuvo lugar en perros
de ambos grupos de bacterinas. Aunque se observó tinción no
específica en algunos perros, todos los perros testigo no vacunados
eran seronegativos a B. burgdorferi antes de la vacunación, y
los perros testigo vacunados eran seronegativos a B.
burgdorferi antes de la vacunación. No se detectó reactividad
contra OspA y OspB en ninguno de los perros testigo no vacunados
(Figuras 5 y 6). El perfil de anticuerpos en los perros testigo tras
la exposición presentaba diferencias extraordinarias con el perfil
de anticuerpos observado en los perros vacunados tras la exposición.
Los perros testigo no vacunados apenas generaron respuesta contra
las proteínas OspA y OspB tras la exposición, pero generaron
anticuerpos contra diversos antígenos diferentes de B.
burgdorferi.
Se utilizó una prueba de ELISA con Osp A
recombinante para determinar la respuesta de anticuerpos contra uno
de los principales antígenos protectores en perros vacunados con las
dosis completa y reducida de bacterinas. No hubo diferencias
significativas en la MGT de anticuerpos contra la OspA de las cepas
aisladas C-1-11 o
S-1-10 de B. burgdorferi
entre perros que habían recibido la dosis completa y la dosis
reducida de bacterinas. Los perros vacunados con la dosis completa
de bacterina generaron una MGT de anticuerpos contra OspA de 452
para C-1-11, en comparación con una
MGT de 368 contra la cepa C-1-11 en
perros que habían recibido la bacterina a dosis reducida (Tabla
30). Las MGT de anticuerpos contra OspA en los grupos con la dosis
completa y la dosis reducida de bacterina contra
S-1-10 fueron 299 y 394,
respectivamente. El hecho de que no se detectasen anticuerpos
contra OspA de C-1-11 y
S-1-10 mediante ELISA en ninguno de
los perros testigo no vacunados tras la exposición a garrapatas
correlaciona con la falta de detección del anticuerpo contra OspA
por inmunoelectrotransferencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}
La actividad funcional de los anticuerpos
generados contra B. burgdorferi como consecuencia de la
vacunación con la bacterina fue medida con el ensayo de anticuerpos
borrelicidas. La presencia de anticuerpos borrelicidas se demostró
mediante la inhibición del crecimiento de B. burgdorferi
debida a la lisis del microorganismo mediada por los anticuerpos.
Los perros vacunados con bacterina a dosis completa o reducida
generaron elevados títulos de anticuerpos borrelicidas contra
S-1-10 y
C-1-11 (Tabla 31). La MGT de
anticuerpos borrelicidas en perros que recibieron la dosis completa
de bacterina fue 970 contra C-1-11,
en comparación con una MGT de 640 contra
C-1-11 en perros que recibieron la
bacterina a dosis reducida. La MGT de anticuerpos borrelicidas
contra S-1-10 fue 597 en ambos
grupos con bacterina.
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Se utilizaron un total de 660 garrapatas de
I. scapularis (360 hembras y 300 machos) para someter a los
perros a exposición. Se comprobó que la tasa de infección con B.
burgdorferi en las garrapatas era 45%, determinada por análisis
de FA de los intestinos medios de garrapatas machos. Esta tasa de
infección es similar a la tasa de infección de 47% descrita en el
Ejemplo 14 anterior, y, una vez más, similar a la tasa de infección
de 47% descrita por Lacombe y colaboradores (Lacowbe et al.
(1993). En general, las garrapatas se fijaban en el plazo de 24
horas y la mayoría de las garrapatas se alimentaban hasta hincharse
completamente o casi completamente durante el período de exposición
de una semana. Las garrapatas que se habían desprendido del perro se
mantuvieron en la placa. Al final del período de fijación de la
garrapata de una semana, se analizaron las garrapatas recuperadas
mediante FA para detectar la presencia de B. burgdorferi. Se
recuperaron garrapatas de 10 de 10 animales vacunados con la dosis
completa, y se recuperó por lo menos una garrapata infectada con
B. burgdorferi de 3 de los 10 (30%) animales. En el grupo
con dosis reducida, se recuperaron garrapatas de 10 de 10 animales
vacunados y el 40% tenía por lo menos una garrapata infectada con
B. burgdorferi. Se recuperaron garrapatas en 14 de 14 perros
no vacunados, y 12 de 14 (86%) tenían por lo menos una garrapata
infectada con B. burgdorferi. La observación de que se
recuperan menos garrapatas infectadas de animales vacunados que de
animales no vacunados fue descrita anteriormente en el Informe de
investigación de la prueba de la capacidad inmunógena y del estudio
de la duración de la inmunidad, de 28 de diciembre de 1993, y ha
sido publicada en Fikrig et al. (1992).
Se ha comprobado que la piel de los perros es
una buena fuente para la recuperación de B. burgdorferi tras
la exposición a garrapatas infectadas (Informe de investigación de
la prueba de la capacidad inmunógena y del estudio de la duración
de la inmunidad, 28 diciembre 1993). Por tanto, puede utilizarse el
aislamiento de B. burgdorferi a partir de biopsias de la
piel de los perros para comprobar la infección por B.
burgdorferi y como indicador de la desaparición de las
espiroquetas de los perros. A los 21 días después de la exposición
a garrapatas, se anestesiaron los perros y se realizaron biopsias
cutáneas de todos los perros vacunados y no vacunados. No se aisló
B. burgdorferi en las biopsias cutáneas de ninguno de los 10
perros en el grupo con la dosis completa de bacterina. En el grupo
con dosis reducida se recuperó B. burgdorferi de 1 de 10
perros (Tabla 32). En contraposición, las biopsias cutáneas
realizadas a 12 de 14 (86%) perros testigo no vacunados a los 21
días tras la exposición resultaron positivas para B.
burgdorferi. Es interesante señalar que el único perro testigo
no vacunado que fue seronegativo tras la exposición según la prueba
de ELISA de células enteras fue uno de los dos perros testigo cuyas
biopsias cutáneas fueron negativas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los signos clínicos de la enfermedad de Lyme en
los perros utilizados para valorar el nivel de protección conferido
por las bacterinas fueron cojera, letargo y fiebre. Ocho meses
después de la exposición a garrapatas, un perro (10%) en el grupo
con bacterina a dosis completa presentó cojera y dos perros (20%) en
el grupo con bacterina a dosis reducida presentaron cojera (Tabla
32). De forma similar al estudio de la capacidad
inmunógena/duración, los perros que habían recibido la dosis
completa o la dosis reducida de bacterinas no presentaron cojera
después de cuatro meses tras la exposición. Se ha observado cojera
en 8 de 14 perros (57%) en el grupo testigo no vacunado, lo que
indica un índice de protección del 83% para el grupo con bacterina
a dosis completa y un índice de protección del 65% para el grupo con
la bacterina a dosis reducida. Se observó cojera que afectaba a una
pata en los animales vacunados y en los testigos no vacunados. Como
se ha descrito en el estudio de la capacidad inmunógena/duración,
la aparición de cojera en perros con el modelo de exposición
natural a garrapatas tuvo lugar durante un período de tiempo
prolongado. El curso temporal de la observación de cojera de los
perros en el estudio con dosis reducida se presenta en la Figura 7.
En comparación con el estudio de la capacidad inmunógena/duración,
la aparición de cojera en los perros testigo no vacunados en el
estudio con dosis reducida tuvo lugar durante un período de tiempo
ligeramente más prolongado. Los perros fueron sometidos a
observación para detectar otros signos clínicos de la enfermedad de
Lyme, incluidos fiebre y letargo. El único perro cojo en el grupo
con bacterina a dosis completa no presentó fiebre \geq 103,5°F
(39,7ºC) ni tampoco se observó letargo en el perro. Uno de los dos
perros cojos en el grupo con dosis reducida tuvo fiebre de 103,7ºF
(39,8ºC) durante un día. Todos los perros testigo no vacunados
tenían temperaturas de \geq 103,5ºF (39,7ºC) en el momento en el
que se observó la cojera. No se observó letargo en ninguno de los
perros cojos.
Se realizaron las autopsias de los perros en el
plazo de tres a cuatro días del episodio de cojera y se cultivaron
muestras de la piel, las articulaciones y los órganos para aislar
B. burgdorferi. No se aisló B. burgdorferi de los
animales cojos vacunados en los grupos con la dosis completa y la
dosis reducida de bacterina (Tabla 32). En contraposición, se aisló
B. burgdorferi de la piel y de las articulaciones de todos
los testigos cojos no vacunados y del bazo de un perro testigo
cojo. En todos los perros testigo, se recuperó la espiroqueta de
muestras de biopsias cutáneas tomadas en lugares alejados del sitio
de la picadura de la garrapata. En el estudio de la capacidad
inmunógena/duración se describieron resultados que muestran la
recuperación de B. burgdorferi a partir perros testigo cojos
no vacunados, pero no de animales cojos vacunados.
La dosis completa de bacterina utilizada en el
estudio contenía 5 x 10^{8} células de cada una de las cepas
aisladas de B. burgdorferi pertenecientes a dos grupos
seroprotectores distintos. Los resultados demuestran que los perros
vacunados generaron anticuerpos borrelicidas dirigidos contra los
principales antígenos protectores de B. burgdorferi. Se
estableció un modelo de exposición a garrapatas y se utilizó para
evaluar la capacidad de la bacterina para proteger a los perros
contra las manifestaciones clínicas de la enfermedad de Lyme. A los
siete meses después de la segunda vacunación, los perros fueron
sometidos a exposición con garrapatas infectadas con B.
burgdorferi y fueron sometidos a observación durante otros siete
meses. La bacterina protegió a los perros contra los signos
clínicos de la enfermedad de Lyme, incluidos cojera, fiebre y
letargo. La observación de que B. burgdorferi no fue
recuperada a partir de animales cojos vacunados pero sí fue
recuperada a partir de todos los perros testigo cojos indica un
aumento en la eliminación de las espiroquetas en los perros
vacunados. Los datos del estudio fueron aceptados por el APHIS
(siglas inglesas del Servicio de Inspección Sanitaria de Animales y
Plantas) como demostración de la capacidad inmunógena y de la
duración de la inmunidad de la bacterina. El modelo de exposición a
garrapatas fue incorporado en las pruebas de eficacia de la
bacterina en una etapa relativamente tardía del desarrollo de la
bacterina descrita anteriormente. Por consiguiente, no se
realizaron estudios con dosis mínimas de inmunización. Este Ejemplo
presenta la vacunación de los perros con una bacterina que contenía
una reducción de 10 veces en los números de cada cepa aislada de
B. burgdorferi. Para que sirvieran de comparación con el
grupo con bacterina a dosis reducida, se vacunaron más perros con
la bacterina que contenía la dosis completa original de B.
burgdorferi. Debido a que se había demostrado anteriormente la
duración de la inmunidad, los perros en el estudio con dosis
reducida de antígeno fueron sometidos a exposición a las 4 semanas
después de la segunda vacunación. Se utilizó una vez más el modelo
de exposición a garrapatas en el estudio con dosis reducida de
antígeno debido a que el modelo de exposición es la prueba principal
de la eficacia de la vacuna.
Como primer paso para determinar si la reducción
en los números de células de B. burgdorferi afectaban a la
eficacia de la bacterina, se evaluó la respuesta de inmunidad
humoral de los perros. Se midieron los títulos de anticuerpos
borrelicidas contra células enteras y contra OspA de los perros en
el grupo con dosis reducida. En general, los títulos de anticuerpos
en perros vacunados con la dosis completa de bacterina fueron
ligeramente mayores que los títulos en perros vacunados con la
bacterina a dosis reducida. Sin embargo, los títulos de anticuerpos
entre los grupos con bacterina no diferían en más de dos veces, y no
eran estadísticamente diferentes. Los títulos de anticuerpos en el
estudio con dosis reducida fueron comparables a los títulos
descritos en el estudio de la capacidad inmunógena y la duración
(Tabla 33). El hecho de que las bacterinas utilizadas en el estudio
con dosis reducida hayan sido almacenadas un año más a 4ºC sirve de
prueba de la estabilidad de la bacterina. Aún más importante, los
resultados demostraron la reproducibilidad de las condiciones
experimentales y la capacidad de la dosis reducida y la dosis
completa de bacterina de generar de forma sistemática respuestas
similares de inmunidad humoral contra B. burgdorferi.
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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
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Se ha utilizado el aislamiento de B.
burgdorferi a partir de muestras de tejido de los perros como
indicador de la infección por la espiroqueta. El Ejemplo 14, que
utiliza la dosis completa de bacterina, demuestra que tras la
exposición a garrapatas infectadas con B. burgdorferi, se
recupera la espiroqueta de la piel de menos perros vacunados que de
perros testigos no vacunados. Este Ejemplo también demuestra que
B. burgdorferi se recuperó a partir de biopsias cutáneas de
menos perros vacunados que de perros testigo tras la exposición a
garrapatas. No hubo diferencias significativas entre los grupos con
dosis reducida y dosis completa de bacterina en lo referente a la
recuperación de B. burgdorferi a partir de biopsias cutáneas
tras la exposición. La diferencia entre perros vacunados y perros
testigo en lo referente al aislamiento de B. burgdorferi a
partir de muestras de tejido fue observada asimismo en el momento
de la autopsia de los perros cojos. No se recuperó B.
burgdorferi de ningún tejido del único perro cojo en el grupo
con bacterina a dosis completa o de ninguno de los dos perros en el
grupo con dosis reducida. Estos resultados son idénticos a los
resultados del estudio de la capacidad inmunógena y la duración. En
contraposición, se aisló B. burgdorferi de todos los perros
testigo cojos no vacunados tanto en el estudio de la capacidad
inmunógena/duración como en el estudio de dosis reducida. Aunque no
se han definido los mecanismos, estos resultados indican que la
dosis completa y la dosis reducida de bacterinas presentaron una
capacidad similar de reducir la carga de espiroquetas de los perros
en el momento de la infección y/o de generar una respuesta
inmunitaria que dio lugar a un aumento de la eliminación de la
espiroqueta.
Los principales signos clínicos de la enfermedad
de Lyme en el perro son la cojera y, en menor medida, la fiebre y
el letargo. El estudio de la capacidad inmunógena/duración llevado a
cabo con la dosis completa de bacterina en el Ejemplo 14 demostró
que la cojera y otros signos clínicos se observaban en el 12% de los
animales vacunados, en comparación con el 83% de los testigos no
vacunados. En este estudio con dosis reducida se observaron
resultados similares, con cojera descrita en el 10% de los animales
en el grupo con la dosis completa y en el 20% de los animales en el
grupo con la dosis reducida. En ambos estudios, la cojera de los
perros testigo no vacunados empezó a manifestarse al comienzo de los
dos meses tras la exposición y después a intervalos periódicos. Al
final del estudio de la capacidad inmunógena/duración, a los ocho
meses tras la exposición, se describió cojera en aproximadamente
80% de los perros testigo no vacunados. En el estudio con dosis
reducida, a los ocho meses después de la exposición a garrapatas, se
había descrito cojera en aproximadamente 60% de los testigos no
vacunados. La naturaleza crónica de la enfermedad y el comienzo
retrasado de los signos clínicos no son características inesperadas
al utilizar un modelo de exposición que remeda de forma tan estrecha
la exposición natural sobre el terreno. En Appel et al.
(1993) se describe que las manifestaciones clínicas de la
enfermedad de Lyme, incluida la cojera, se observaban hasta cinco
meses después de la exposición de los perros a garrapatas
infectadas. No se conoce el motivo de dicho intervalo temporal
prolongado para la manifestación de la enfermedad clínica en el
estudio con dosis reducida. En el presente estudio con dosis
reducida, los parámetros de la exposición a garrapatas tales como el
número de garrapatas infectadas/perro y las tasas de infección de
las garrapatas fueron similares a los parámetros utilizados en el
estudio de la capacidad inmunógena/duración del Ejemplo 14. Aunque
el modelo de exposición a garrapatas representa la vía de
exposición, dosis y virulencia naturales de B. burgdorferi
encontradas por el perro, son éstos mismos parámetros los que
afectan de forma más directa al resultado de la exposición.
Los datos presentados en este Ejemplo demuestran
que una bacterina formulada con un nivel de dosis reducida de
antígeno presenta la misma eficacia que la dosis completa de la
bacterina para generar una respuesta de anticuerpos protectores
contra B. burgdorferi y para reducir la infección por la
espiroqueta después de la exposición a garrapatas. Tanto la dosis
completa como la dosis reducida de bacterinas protegieron a los
perros contra los signos clínicos de la enfermedad de Lyme.
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Claims (32)
1. Bacterina que comprende en cada dosis una
cantidad, eficaz para la inmunización, de por lo menos dos cepas
aisladas, sin protección cruzada, de Borrelia burgdorferi
inactivada, un adyuvante en una cantidad eficaz para potenciar la
capacidad inmunógena de las cepas aisladas de Borrelia
burgdorferi inactivada, y un excipiente adecuado.
2. Bacterina según la reivindicación 1, que
comprende dos cepas aisladas, sin protección cruzada, de Borrelia
burgdorferi inactivada.
3. Bacterina según la reivindicación 2, que
comprende además una cantidad, eficaz para la inmunización, de una
tercera cepa aislada, sin protección cruzada, de Borrelia
burgdorferi inactivada.
4. Bacterina que comprende en cada dosis una
cantidad, eficaz para la inmunización, de por lo menos una
subunidad antigénica procedente de por lo menos dos cepas aisladas,
sin protección cruzada, de Borrelia burgdorferi, un
adyuvante en una cantidad eficaz para potenciar la capacidad
inmunógena de las subunidades antigénicas, y un excipiente
adecuado
5. Bacterina según la reivindicación 4, que
comprende en cada dosis una cantidad, eficaz para la inmunización,
de una subunidad antigénica procedente de una primera cepa aislada
de Borrelia burgdorferi, una cantidad, eficaz para la
inmunización, de una subunidad antigénica procedente de una segunda
cepa aislada, sin protección cruzada, de Borrelia
burgdorferi, un adyuvante en una cantidad eficaz para potenciar
la capacidad inmunógena de las subunidades antigénicas y un
excipiente adecuado.
6. Bacterina según la reivindicación 5, que
comprende además una cantidad, eficaz para la inmunización, de una
subunidad antigénica procedente de una tercera cepa aislada de
Borrelia burgdorferi.
7. Bacterina que comprende en cada dosis una
cantidad, eficaz para la inmunización, de por lo menos dos cepas
aisladas, sin protección cruzada, de Borrelia burgdorferi
inactivada, y una o más subunidades antigénicas procedentes de
cepas aisladas, sin protección cruzada, un adyuvante en una cantidad
eficaz para potenciar la capacidad inmunógena de las cepas aisladas
de Borrelia burgdorferi inactivada y las subunidades
antigénicas, y un excipiente adecuado.
8. Bacterina según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 ó 7, en la que la cantidad, eficaz para la
inmunización, de las cepas aisladas, sin protección cruzada, de
Borrelia burgdorferi inactivada es una cantidad comprendida
entre aproximadamente 10^{4} microorganismos y aproximadamente
10^{10} microorganismos de cada cepa aislada.
9. Bacterina según la reivindicación 8, en la
que la cantidad, eficaz para la inmunización, de las cepas
aisladas, sin reactividad cruzada, de Borrelia burgdorferi
inactivada es una cantidad comprendida entre aproximadamente
10^{4} microorganismos y aproximadamente 10^{9} microorganismos
de cada cepa aislada.
10. Bacterina según la reivindicación 9, en la
que la cantidad, eficaz para la inmunización, de las cepas
aisladas, sin reactividad cruzada, de Borrelia burgdorferi
inactivada es una cantidad comprendida entre aproximadamente
10^{4} microorganismos y aproximadamente 10^{8} microorganismos
de cada cepa aislada.
11. Bacterina según la reivindicación 8 ó 9, en
la que la cantidad, eficaz para la inmunización, de las cepas
aisladas, sin reactividad cruzada, de Borrelia burgdorferi
inactivada es aproximadamente 10^{7} microorganismos de cada cepa
aislada, aproximadamente 5 x 10^{7} microorganismos de cada cepa
aislada, o aproximadamente 5 x 10^{8} microorganismos de cada
cepa aislada.
12. Bacterina según cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 7, en la que la cantidad, eficaz para la
inmunización, de las subunidades antigénicas procedentes de cada
una de las cepas aisladas, sin protección cruzada, de Borrelia
burgdorferi es una cantidad comprendida entre aproximadamente
diez microgramos y aproximadamente 10.000 microgramos.
13. Bacterina según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 ó 7 a 11, en la que las cepas aisladas, sin
protección cruzada, de Borrelia burgdorferi se inactivan
mediante un agente seleccionado de entre el grupo constituido por
etilenimina binaria, formol o B
\beta-propriolactona.
14. Bacterina según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, 7 a 11 ó 13, en la que las cepas aisladas,
sin protección cruzada, de Borrelia burgdorferi se
seleccionan de entre los grupos seroprotectores A, B o C de cepas
aisladas de Borrelia burgdorferi.
15. Bacterina según la reivindicación 14, en la
que la cepa aislada de Borrelia burgdorferi del grupo
seroprotector A es la cepa aislada
S-1-10, 297 ó B31.
16. Bacterina según la reivindicación 14, en la
que la cepa aislada de Borrelia burgdorferi del grupo
seroprotector A es la cepa aislada
C-1-11.
17. Bacterina según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en la que el adyuvante se selecciona de
entre el grupo constituido por hidróxido de aluminio, saponina,
fosfato de aluminio, Carbopol, lipopolisacárido y derivados de
lipopolisacárido.
18. Bacterina según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en la que la cantidad eficaz de adyuvante
es una cantidad comprendida entre aproximadamente 1% en volumen y
aproximadamente 15% en volumen.
19. Bacterina según la reivindicación 18, en la
que la cantidad eficaz de adyuvante de hidróxido de aluminio es una
cantidad comprendida entre aproximadamente 5% en volumen y
aproximadamente 10% en volumen.
20. Bacterina según la reivindicación 18, en la
que la cantidad eficaz de adyuvante es aproximadamente 7,5% en
volumen.
21. Bacterina según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en la que el excipiente adecuado comprende
un tampón acuoso y conservantes.
22. Bacterina según la reivindicación 21, en la
que el tampón acuoso es solución salina fisiológica.
23. Bacterina según la reivindicación 21, en la
que los conservantes comprenden gentamicina y nistatina.
24. Composición farmacéutica que comprende una
bacterina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.
25. Vacuna que comprende una bacterina según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.
26. Utilización de una bacterina según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 para la preparación de una
composición farmacéutica destinada a inmunizar a un animal contra
la infección por B. burgdorferi.
27. Utilización según la reivindicación 26, en
la que el animal es un mamífero.
28. Utilización según la reivindicación 26, en
la que el animal es un ser humano o un perro.
29. Utilización según la reivindicación 28, en
la que el perro tiene por lo menos seis semanas de edad.
30. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 26 a 29, en la que la composición farmacéutica está
concebida de tal forma que puede administrarse una dosis adicional
a un intervalo de tiempo adecuado tras la administración de la
dosis anterior.
31. Utilización según la reivindicación 30, en
la que el intervalo de tiempo adecuado está comprendido entre
aproximadamente dos semanas y aproximadamente cinco semanas.
32. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 26 a 31, en la que la composición farmacéutica debe
administrarse por inyección intramuscular o por inyección
subcutánea.
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