ES2263651T3 - Metodo para analidis de analogos de oligonucleotidos. - Google Patents
Metodo para analidis de analogos de oligonucleotidos.Info
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Abstract
Un método para separar una población de dobles hélices que comprenden diferentes moléculas de analito oligoméricas, comprendiendo el método: (a) aplicar un medio de separación que lleva carga a una mezcla de: (i) una población de moléculas de analito diferentes, en el que cada molécula está compuesta de subunidades unidas de las que al menos el 50% no están cargadas, y es capaz de hibridarse vía el apareamiento de bases de Watson-Crick con una molécula sonda específica que es un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico cargado, e (ii) la molécula sonda, en condiciones tal que la molécula sonda forma dobles hélices estables con una pluralidad de o todas las moléculas de analito, formándose así una mezcla de especie seleccionada a partir de la doble hélice de sonda-analito, analito monocatenario, sonda monocatenaria, y sus combinaciones, y (b) separar dichas dobles hélices entre sí y a partir de la especie monocatenaria dentro del medio.
Description
Método para análisis de análogos de
oligonucleótidos.
La presente invención se refiere a métodos para
separar, cuantificar y/o aislar análogos de oligonucleótido que
tienen una cantidad sustancial, preferiblemente 50% o más, de
subunidades no cargadas. En particular, la invención se refiere a
métodos cromatográficos o electroforéticos de separación.
Numerosos métodos de separación de cargas están
disponibles para uso con biopolímeros que llevan una carga a pH
neutro o casi neutro, tales como ácidos nucleicos y la mayoría de
las proteínas. Estos incluyen, por ejemplo, varios modos de
electrofóresis, enfoque isoeléctrico e intercambio iónico. Tales
métodos, sin embargo, no pueden ser empleados generalmente para
análogos de oligonucleótido sustancialmente no cargados sin una
ionización previa de las moléculas. Por ejemplo, los métodos
actuales de separación por intercambio iónico de oligonucleótidos
no cargados requieren la ionización de las moléculas a tanto un pH
alto (>11), en el que las bases G y T se ionizan, como a un pH
bajo (<3), en el que las bases C y A se ionizan. Algunos análogos
de oligonucleótido no cargados tales como, por ejemplo, oligómeros
fosforamidados o unidos a fosforodiamida, no son estables a estos
bajos pH. En consecuencia, hay una necesidad de métodos de
separación de tales moléculas no cargadas que puedan ser llevados a
cabo en condiciones suaves, a pH neutro o casi neutro.
El documento WO 97/12995 describe un método para
la separación o la detección de una molécula de ácido nucleico que
tiene una secuencia objetivo seleccionada a partir de una población
diversa de ácidos nucleicos, por hibridación del ácido nucleico
objetivo con una molécula sonda del ácido peptídico nucleico (APN)
complementario.
El documento WO 98/04571 se refiere a un método
para purificar moléculas de APN, por la hibridación de una
secuencia de APN deseada a un oligonucleótido que tiene un dominio
de hibridación complementario y un dominio de multimerización
separado adecuado para formar agregados.
El documento WO 98/38334 concierne a métodos de
detección de secuencias de ADN analito y usando sondas de APN, por
lo que estos métodos se usan para separar dobles hélices de una
especie monocatenaria (no hibridada). Carlsson. C, et al.,
Nature 380, página 207, (1996) se refiere a
métodos para detectar secuencias objetivo de ADN y usando sondas de
APN, en particular para distinguir al mutante de las secuencias
naturales. Los experimentos mostrados describen sólo la separación
de la especie monocatenaria (APN o ADN) a partir de un tipo de
especie de doble hélice de APN/ADN. En Orum, H., et al.
BioTechniques 19, Nº. 3, páginas
472-480, (1995) se muestra un método de
purificación de ADN por la hibridación de un ADN a un APN
complementario que tiene un dominio que puede estar unido a una
resina de afinidad. También se muestra que las secuencias no
complementarias pueden ser distinguidas; es decir, no están
hibridadas a la sonda de la secuencia nativa.
La presente invención incluye en un aspecto,
un método para separar una población de dobles
hélices que comprende moléculas de analito oligoméricas diferentes,
comprendiendo el método:
- (a)
- aplicar a un medio de separación que lleva carga una mezcla de (i) una población de moléculas de analito diferentes, en el que cada dicha molécula está compuesta de subunidades unidas de las que al menos el 50% no están cargadas, y es capaz de hibridarse vía el par de bases de Watson-Crick con una molécula sonda específica que es un ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico no cargado, e (ii) la molécula sonda,
- en condiciones tal que la molécula sonda forma dobles hélices estables con una pluralidad o todas las moléculas de analito, formándose así una mezcla de especies seleccionadas a partir de la doble hélice de sonda-analito, analito monocatenario, sonda monocatenaria, y sus combinaciones, y
- (b)
- separar dichas dobles hélices entre sí y de la especie monocatenaria dentro del medio.
Preferiblemente, la sonda tiene una longitud y
secuencia tal que sus dobles hélices con diferentes moléculas de
analito se diferencian en relación a la presencia, la longitud o la
posición de una parte no hibridada del ácido nucleico. Con
objetivos de detección, la sonda se marca, preferiblemente con un
marcador fluorescente,por ejemplo la fluoresceína. El marcador está
típicamente en un extremo de la sonda,por ejemplo, en el extremo
5'.
En una separación típica, cada molécula de
analito tiene una secuencia de nucleótidos que se selecciona a
partir del grupo que consiste en: una secuencia seleccionada,
fragmentos de longitud diferente de la secuencia seleccionada,
variantes de deleción interna o inserción de la secuencia
seleccionada, variantes de mutación de la secuencia seleccionada y
sus combinaciones. Tales variantes de deleción, inserción o mutación
generalmente contienen en mayoría una tal deleción o mutación por
cada 8 nucleótidos de la secuencia seleccionada. En una
realización, las variantes son variantes de nucleótidos simples de
la secuencia seleccionada.
La sonda puede incluir una secuencia
complementaria a la secuencia seleccionada. En una realización, la
sonda tiene una longitud igual, o no más que el 25% mayor que la
secuencia seleccionada. La sonda también puede ser más corta que la
molécula de analito más larga, pero es de una longitud eficaz para
formar una doble hélice estable con al menos una molécula de
analito en las condiciones de separación. Un ejemplo es una
separación en la que las variaciones en longitud y/o secuencia
entre las moléculas de analito ocurren dentro de una subregión
dada,por ejemplo, en o cerca de un extremo de la molécula de
analito, y la sonda es eficaz para hibridarse establemente en esta
subregión en las condiciones de análisis. Preferiblemente, la sonda
es eficaz para formar una doble hélice estable con una pluralidad
de o todas las moléculas de analito, y tales dobles hélices se
separan entre sí y de la especie monocatenaria en el medio que lleva
la carga.
Por ejemplo, la población puede contener
moléculas de analito que son variantes de deleción
N-1 de la secuencia seleccionada, y la sonda es
eficaz para hibridarse establemente a al menos una pluralidad de
tales moléculas de analito, en las condiciones de la separación, en
una región de la molécula de analito que contiene un sitio de
deleción.
En otra realización, la sonda tiene una
secuencia y longitud idéntica a la de una variante de deleción
N-1 de la secuencia seleccionada, y las condiciones
de análisis son tales que la sonda se hibrida a sólo tal variante de
deleción N-1.
En una realización más, la subregión en la que
la variación de longitud y/o secuencia ocurren está en o cerca de
un extremo de las moléculas de analito, y la sonda comprende un
resto marcador en el extremo que se hibrida a dicho extremo del
analito. El resto marcador es preferiblemente un resto fluorescente,
tal como la fluoresceína.
El soporte que lleva la carga puede ser un medio
de intercambio iónico, en el que la separación de la etapa (b)
comprende hacer pasar un eluyente por el medio, o un medio de
electrofóresis, en el que la separación de la etapa (b) comprende
aplicar un campo eléctrico entre los límites contrarios del medio.
El medio de electrofóresis puede ser un medio no separador por
tamaños. El medio también puede ser uno que incluya un gradiente
sobrepuesto de pH,es decir, para uso en enfoque isoeléctrico.
Preferiblemente, las moléculas de analito están
compuestas de subunidades unidas de las que al menos el 75% no
están cargadas; en una realización, ninguna subunidad está cargada.
Los ejemplos de moléculas de analito incluyen ácidos peptídicos
nucleicos, oligonucleótidos de fosfotriester, oligonucleótidos de
metilfosfonato, oligómeros de morfolino, y quimeras de cualquier
miembro de este grupo con otro miembro o con ADN,
2'-O-alquil-ARN o
2'-O-alil-ARN. En
una realización preferida, las moléculas de analito son oligómeros
de morfolino, preferiblemente que tienen enlaces fosforamidados y/o
de intersubunidad fosforodiamidada. La sonda es preferiblemente ADN,
ARN,
2'-O-alquil-ARN o
2'-O-alil-ARN, ADN
fosforotioato, o una quimera de cualquiera de estos, y es más
preferiblemente ADN. Al llevar a cabo la separación, la sonda
preferiblemente está presente en la mezcla a una concentración
mayor que la necesaria para hibridarse con cada molécula de analito
en la población.
En una realización, el método comprende además
la etapa de detectar y cuantificar una doble hélice de una sonda
marcada con al menos una molécula de analito objetivo en la
población. En otra realización, el método comprende además la etapa
de aislar al menos una doble hélice de sonda/analito.
Estos y otros objetos y propiedades de la
invención se harán más evidentes globalmente cuando la descripción
siguiente detallada de la invención sea leída junto con los dibujos
que acompañan.
La Figura 1 muestra varias subunidades
preferidas que tienen grupos de unión de 5 átomos (A), de seis
átomos (B) y de siete átomos (C-E) adecuados para
formar oligómeros de morfolino;
Las Figuras 2A-A a
2E-E muestran el segmento de la subunidad de
repetición de oligómeros de morfolino ejemplares, denominados de
"A-A" hasta "E-E",
construidos utilizando las subunidades "A-E",
respectivamente, de la
Figura 1;
Figura 1;
La Figura 3 ilustra la hibridación de oligómeros
analito no cargados de longitud diferente con un ácido nucleico
complementario cargado,por ejemplo, ADN, que tiene una longitud
igual a la del oligómero analito de longitud completa;
La Figura 4A ilustra la hibridación de
oligómeros analito no cargados de longitud diferente con un ácido
nucleico cargado complementario,por ejemplo, ADN, que tiene una
longitud suficiente para hibridarse establemente a un extremo
truncado de las moléculas de analito, y que contiene un segmento no
hibridante opcional (representado por NNNN);
La Figura 4B ilustra la hibridación de un
oligómero analito no cargado de variante de deleción con un ácido
nucleico cargado complementario,por ejemplo, ADN, que tiene una
longitud suficiente establemente para hibridarse a una región de la
molécula de analito en la que ocurre la deleción;
Las Figuras 5A-5B son
cromatogramas de HPLC que muestran la resolución por intercambio
aniónico de las dobles hélices de ADN con oligómeros de morfolino
de 13- a 20-unidades monoméricas;
Las Figuras 6-9 son los
sobrelapamientos de los cromatogramas de HPLC que muestran los
tiempos de retención por intercambio aniónico de las dobles hélices
de ADN con varias secuencias de deleción N-1 de un
oligómero de morfolino 20-unidades monoméricas
(Figura 6, N-A; Figura 7, N-C;
Figura 8, N-G; y Figura 9,
N-T);
La Figura 10 es una curva de calibración que
muestra el área de pico frente a la concentración de analitos de
PMO de 20-unidades monoméricas y un estándar interno
de PMO de 15-unidades monoméricas, cuya estructura
se muestra en la Figura 11; y
La Figura 12 es un cromatograma de HPLC que
muestra la detección de aprox. 10 ng de PMO objetivo en una muestra
de plasma, por resolución de su doble hélice con ADN a partir de una
doble hélice de estandar interno: DNA y ADN en exceso.
En la Figura 3, se emplean las secuencias
siguientes: La primera secuencia "no cargada" es ACG TTG AGG
GGC ATC GTC GC, representada en este documento como SEQ ID NO: 1.
(Esta secuencia es el antisentido de una secuencia humanagénica
c-myc, correspondiente a los nucleótidos
2551-2570 de la genoteca con Nº de entrada X00196.)
Todas las secuencias "cargadas" en esta Figura son las
complementarias de la SEQ ID NO: 1. Las secuencias subsecuentes
"no cargadas" en la Figura 3 son los fragmentos de SEQ ID NO:
1, representadas en este documento como SEQ ID NO: 3 (ACG TTG AGG
GGC ATC GTC), SEQ ID NO: 4 (ACG TTG AGG GGC ATC G), SEQ ID NO: 5
(ACG TTG AGG GGC AT), SEQ ID NO: 6 (GI7 GAG GGG CAT), y SEQ ID NO:
7 (TGA GGG GCA TCG TCG C).
En la Figura 4a, se emplean las secuencias
siguientes: La primera secuencia "no cargada" es ACG TTG AGG
GGC ATC GTC GC, representada en este documento como SEQ ID NO: 1.
Las secuencias subsecuentes "no cargadas" en la Figura 4A son
los fragmentos de SEQ ID NO: 1, representados en este documento como
SEQ ID NO: 3 (ACG TTG AGG GGC ATC GTC) y SEQ ID NO: 4 (ACG TTG AGG
GGC ATC G). Todas las secuencias "cargadas" en esta Figura son
fragmentos del complemento de SEQ ID NO: 1 más una secuencia
adicional NNNN, donde N es cualquier nucleótido, representado en
este documento como SEQ ID NO: 8 (NNNN GCG ACG ATG CCC, escrito de
5' a 3').
En la Figura 4B, se emplean las secuencias
siguientes: La primera secuencia "no cargada" es ACG TTG AGG
GGC ATC GTC GC, representada en este documento como SEQ ID NO: 1.
La secuencia subsecuente "no cargada" en la Figura 4B es una
variante de deleción de SEQ ID NO: 1, representada en este documento
como SEQ ID NO: 10 (ACG TTG AGG GGC ATC TCG C). Ambas secuencias
"cargadas" en esta Figura son un fragmento del complemento de
SEQ ID NO: 1, representado en este documento como SEQ ID NO: 9 (CGA
CGA TGC C, escrita de 5' a 3').
Los términos de abajo tienen los significados
siguientes, a no ser que se indique de otra manera.
Una molécula "oligomérica", según se usa en
este documento, es un análogo de oligonucleótido que tiene de
aproximadamente 8 a 100, preferiblemente de aproximadamente 10 a 50,
y más preferiblemente de aproximadamente 10 a 30, subunidades de
nucleótido.
Los oligonucleótidos o sus análogos son
descritos como "complementario" entre sí cuando la hibridación,
o la formación de la doble hélice, ocurre entre dos
oligonucleótidos monocatenarios o análogos. La complementariedad
(el grado en el que un oligonucleótido o análogo son complementarios
entre sí) es cuantificable en términos de la proporción de bases en
oposición a las cadenas que se espera que formen enlaces de
hidrógeno entre sí, de acuerdo con las reglas de acoplamiento de
bases generalmente aceptadas. En el contexto de la presente
invención, el ácido nucleico cargado o el análogo puede ser 100%
complementario con la secuencia de analito, o puede ser casi
complementario,por ejemplo incluyendo uno o varios desapareamientos
o deleciones, siempre que la doble hélice formada entre la sonda
oligomérica cargada y el analito no cargado sea lo suficientemente
estable para ser eluido del medio de separación en forma de doble
hélice. En tales casos, la sonda y el analito son "hibridados
establemente" o forman una "doble hélice estable" en las
condiciones del análisis. En particular, las secuencias de deleción
N-1 del PMO fueron encontradas que eran separables
por hibridación con el ácido nucleico cargado de
N-unidades monoméricas, como se muestra debajo.
Un segmento "no hibridado" de ADN, u otro
oligómero cargado, en una doble hélice puede referirse a una parte
monocatenaria del extremo así como a un "bucle" interno en un
sitio de deleción o de desapareamiento (por ejemplo como en la
Figura 4B).
Una "subunidad" de un oligonucleótido o
análogo de oligonucleótido se refiere a una unidad de nucleótido (o
análogo de nucleótido) del oligómero. El término puede referirse a
la unidad de nucleótido con o sin el enlace a la intersubunidad
unida, aunque, refiriéndose a una "subunidad cargada", la carga
típicamente resida dentro del enlace de la intersubunidad (por
ejemplo un fosfodiester o un enlace de fosforotioato).
Una subunidad "no cargada", según se usa en
este documento, es la que no está cargada a un pH neutro o casi
neutro, correspondiente a un intervalo de pH de aproximadamente 5 a
aproximadamente 9. Los enlaces de la subunidad también pueden
permanecer no cargados a los pH fuera de este intervalo. Sin
embargo, el pH debe ser superior al que las bases C y A se ionizan
(aproximadamente 3) e inferior al que las bases G y T se ionizan
(aproximadamente 11). Los análisis descritos en este documento
preferiblemente son llevados a cabo a un pH neutro o casi neutro,
como se define anteriormente. Cuando se usa un marcador de
fluoresceína, se prefiere un pH suavemente básico(es decir de
7 a 9).
Una subunidad "cargada" es la que está
cargada a un pH neutro o casi neutro, como se define anteriormente.
Un ejemplo es un fosfodiester (ADN nativo) o una subunidad unida a
fosforotioato.
Un "oligómero de morfolino" es un análogo
de oligonucleótido compuesto de estructuras de subunidad de
morfolino de la forma mostrada en la Figura 1, donde (i) las
estructuras están unidas juntas mediante enlaces que contienen
fósforo, de uno a tres átomos de longitud, uniendo el nitrógeno del
morfolino de una subunidad al carbono exocíclico 5' de una
subunidad adyacente, e (ii) Pi y Pj son restos de apareamiento de
base de purina o pirimidina eficaces para unirse, por unión de
hidrógeno a la base específica, a una base en un polinucleótido. El
resto de apareamiento de la base de purina o pirimidina es
típicamente adenina, citosina, guanina, uracilo o timina. La
síntesis, estructuras, y características de unión de los oligómeros
de morfolino son detallados en las Patentes de EE.UU N^{os}
5.698.685, 5.217.866, 5.142.047, 5.034.506, 5.166.315, 5.521.063 y
5.506.337.
La subunidad mostrada en la Figura 1B se usa
para estructuras de unidad de repetición de 6 átomos, como se
muestra en B-B en la Figura 2. En estas estructuras,
el átomo Y1 que une el carbono del morfolino 5' al grupo de fósforo
puede ser azufre, nitrógeno, carbono o, preferiblemente, oxígeno. El
resto X pendiente del fósforo es cualquier grupo estable que no
interfiere con la unión del hidrógeno de la base específica. Los
grupos preferidos incluyen alquilo, alcoxi, tioalcoxi y
alquilamino, incluyendo aminas cíclicas, todas las cuales pueden
ser sustituidas de forma diversa, siempre que la unión de la base
específica no sea interrumpida. Alquilo, alcoxi y tioalcoxi
preferiblemente incluyen 1-6 átomos de carbono.
Alquilamino preferiblemente se refiere a la sustitución de alquilo
inferior (de C1 a C6), y las aminas cíclicas son preferiblemente
heterociclos de nitrógeno de 5 a 7 miembros que contienen
opcionalmente 1-2 heteroátomos adicionales
seleccionados a partir de oxígeno, nitrógeno y azufre. Z es azufre
u oxígeno, y es preferiblemente oxígeno.
Un oligómero de morfolino preferido está
compuesto de estructuras de subunidad de morfolino de la forma
mostrada en la Figura 2B-B, donde las estructuras
están unidas juntas por enlaces fosforodiamidado, donde X=NH_{2},
NHR, o NR_{2} (donde R es alquilo inferior, preferiblemente
metilo), Y=O, y Z=O, uniendo el nitrógeno de morfolino de una
subunidad al carbono exocíclico 5' de una subunidad adyacente, Pi y
Pj son los restos de apareamiento de una base de purina o
pirimidina eficaces para unirse, por la unión de hidrógeno de la
base específica, a una base en un polinucleótido. También
preferidas son las estructuras que tienen un enlace fosforodiamidado
alterno, en el que, en la Figura 2B-B, X = alcoxi
inferior, tal como metoxi o etoxi, Y=NH o NR, en el que R es
alquilo inferior y Z=O.
En un "ácido peptídico nucleico", las
unidades de fosfodiester de desoxirribosa de una estructura de
oligonucleótido son sustituidas por enlaces de poliamida. El
espaciado de la estructura apropiada se logra por el uso de unidades
de 2-aminoetil-glicina, con una
base de nucleótido unida a cada grupo 2-amino vía un
grupo metilencarbonilo.
Un "oligonucleótido
2'-O-alilo (o alquilo)
modificado" es un oligorribonucleótido en el cual el
2'-hidroxilo se convierte en un éter de alilo o
alquilo, respectivamente. El éter de alquilo es típicamente un éter
de metoxietilo o metilo.
"Alquilo" se refiere a un radical
monovalente acíclico totalmente saturado que contiene carbono e
hidrógeno, que puede ser una cadena ramificada o lineal. Los
ejemplos de grupos alquilo son metilo, etilo,
n-butilo, t-butilo,
n-heptilo e isopropilo. "Alquilo inferior" se
refiere a un radical alquilo de uno a seis átomos de carbono, y
preferiblemente de uno a cuatro átomos de carbono, como se
ejemplifica por metilo, etilo, isopropilo,
n-butilo, isobutilo y t-butilo.
La invención proporciona un método de separación
y/o análisis de una población de moléculas oligoméricas
sustancialmente no cargadas, denominadas en este documento
moléculas de analito. Una molécula oligomérica "sustancialmente
no cargada", en el contexto de la invención, es una la que
ninguna subunidad está cargada (a pH neutro o casi neutro,es decir
de aproximadamente 5 a aproximadamente 9), o un número suficiente no
están cargadas, tal que las dobles hélices de las moléculas de
analito de longitud diferente con un oligómero cargado(por
ejemplo, ADN) son separables por los métodos de separación
descritos en este documento. Preferiblemente, más del 50% de las
subunidades, más preferiblemente más del 75%, y lo más
preferiblemente más del 90%, no están cargadas. En una realización,
ninguna subunidad del polímero está cargada. Las moléculas de
analito son análogos de oligonucleótido, en el sentido que incluyen
una estructura que soporta una secuencia de restos de apareamiento
de base que son eficaces para hibridar, vía el apareamiento de la
base de Watson-Crick, con bases en una sonda
complementaria.
Las moléculas de analito pueden ser de
longitudes diferentes, tal como en una mezcla de fragmentos de
longitud diferente de la misma secuencia "madre"
(N-unidades monoméricas), que pueden ser producidas
a partir de una preparación sintética o una degradación de un
polímero de cadena entero. Las variantes de deleción internas o
variantes de mutación,es decir, las variantes en las cuales un
nucleótido dado está ausente o están sustituidas con un nucleótido
diferente, respectivamente, también pueden estar presentes, así como
variantes de inserción internas. (Nótese que un fragmento
N-1 o N+1 también puede ser considerado una deleción
del extremo o inserción del extremo, respectivamente). Tales
variantes típicamente varían de la secuencia "madre" en su
mayoría por una variación de aproximadamente 8 nucleótidos. En una
realización, las variantes son variantes de nucleótidos simples de
la secuencia seleccionada. La resolución de oligómeros de la misma
longitud que se diferencian en la secuencia sólo por la deleción de
un nucleótido en varias posiciones, es decir, especies
N-1 diferentes de una secuencia seleccionada, se
ilustra en los Ejemplos siguientes. La separación de las secuencias
de variante de posición única también es contemplada.
La separación se basa en la formación de dobles
hélices entre varias moléculas no cargadas, o sustancialmente no
cargadas, oligoméricas y una sonda de oligonucleótido cargada
complementaria, que es preferiblemente una molécula de ADN. En la
discusión siguiente, la sonda de oligonucleótido cargada se refiere
al ADN; sin embargo, se entiende que el ARN o análogos de
oligonucleótido cargados también pueden ser usados como sondas.
En una realización del método, la mezcla de
analito contiene una mezcla de fragmentos de longitud diferente de
la misma secuencia (que puede incluir la secuencia de longitud
completa), y la molécula de ADN es de una longitud igual, o algo
mayor que, la longitud esperada de la molécula de analito más larga
en la población, y tiene una secuencia complementaria (o casi
complementaria) a la cadena entera de la molécula de analito más
larga. (Sondas más largas,por ejemplo hasta aproximadamente 25% más
larga que la molécula de analito más larga, también pueden ser
usadas). Dependiendo de la longitud de la molécula de analito, la
molécula: la doble hélice de ADN será o bien totalmente bicatenaria
o bien incluirá alguna longitud de ADN monocatenario, no hibridado,
como se muestra, por ejemplo, en la Figura 3.
Como un ejemplo, en una separación por HPLC por
intercambio aniónico de fragmentos de longitud diferente de un
oligómero de morfolino que tiene una secuencia dada, el oligómero
monocatenario, que no está cargado, sería retenido al menos en la
columna de intercambio aniónico. El ADN complementario posee una
estructura de fosfodiester cargada y está sin restricción en su
conformación en forma monocatenario. Por lo tanto, se retiene la más
larga en la columna, dado que es capaz de maximizar la interacción
con la fase estacionaria positivamente cargada. (Tales cargas sin
restricción son ilustradas por cargas negativas en negrita en la
Figura 3). Una doble hélice de oligómero:DNA tiene la misma carga
que el ADN no hibridado, pero algo o toda la estructura del ADN
está en su conformación unida por la estructura de doble hélice, lo
que previene la interacción óptima de las cargas de estructura con
la fase estacionaria (como se ilustra por cargas negativas en
negrita en la Figura 3). Las dobles hélices por lo tanto se eluyen
entre el PMO no unido y el ADN, a una velocidad dependiendo de la
cantidad de ADN monocatenario libre. Tal separación es demostrada en
los Ejemplos siguientes.
En el caso de secuencias de deleción internas,
un bucle no hibridado de ADN ocurrirá en posiciones diferentes en
las dobles hélices, en la posición de la deleción, como se ilustra
en la Figura 4B. Aunque la resolución no es generalmente tan grande
como para secuencias de longitud diferentes, cuando las dobles
hélices incluyen alguna longitud de ADN monocatenario, tales
secuencias de deleción también pueden ser resueltas, como se muestra
en el Ejemplo 2.
Los procesos de separación también pueden ser
llevados a cabo usando moléculas de ADN que son más cortas que la
molécula de analito más larga esperada. En este caso, la molécula de
ADN tiene una secuencia que se hibrida a una parte de las moléculas
de analito, donde la parte incluye la región de cada molécula de
analito en el que se espera la variación entre las moléculas de
analito, y es de una longitud eficaz para formar una doble hélice
estable. Por ejemplo, cuando las moléculas de analito se diferencian
entre sí por el truncamiento en un extremo dado, las dobles hélices
resultantes se diferenciarán en los extremos de la parte no
hibridada del ADN cargado, como se ilustra en la figura: 4A. Como
se muestra en la Figura 4A, el ADN también puede incluir una
secuencia terminal no hibridante corta (representada en la Figura
por NNNN).
Una ventaja de esta variación es un aumento
esperado de la resolución, particularmente de las secuencias de
deleción de N-1-unidades
monoméricas. Se espera que un ADN que se hibrida sólo a la parte de
la molécula de analito que contiene un truncamiento o una deleción,
como se muestra en las Figuras 4A-B, proporcione
mayor resolución que un ADN que se hibrida a la molécula entera, ya
que se reduce la proporción de interacciones "no específicas"
en relación con las interacciones específicas. En consecuencia, esta
variación es la más adecuada para la resolución de mezclas en las
cuales se espera que la variación en la longitud y/o la secuencia
ocurra en gran parte en un extremo solo o dentro de una región
específica del oligómero.
También se ha encontrado que la separación de la
doble hélice de una especie de variante de deleción
N-1 del oligómero "madre" de longitud completa
se realza cuando (1) la deleción ocurre en o cerca de un extremo del
oligómero (por ejemplo, el extremo 5') y (2) la sonda usada para
formar la doble hélice contiene un resto marcador,por ejemplo un
resto fluorescente tal como la fluoresceína, en el extremo de
hibridación (en este caso, el extremo 3'). Una separación similar
realzada se observa cuando la deleción N-1 ocurre en
o cerca de los extremos 3’ del oligómero del analito, y la sonda es
así marcada en el extremo 5'.
La sonda también puede ser modificada
específicamente en una especie particular N-1, que
es de la misma longitud y secuencia que aquella especie, y el
análisis puede ser llevado a cabo en condiciones de hibridación
suficientemente rigurosas (típicamente en lo que concierne a la
temperatura) tal que la sonda sea establemente hibrida a sólo tal
especie N-1. De forma alternativa, el análisis puede
ser llevado a cabo en condiciones algo menos rigurosas, tal que la
sonda pueda hibridarse establemente a N-unidades
monoméricas y alguna otra especie N-1, y las dobles
hélices pueden separarse en base a sus diferentes interacciones con
el medio de separación que lleva la carga.
Al realizar la separación o el análisis, se
forma una mezcla de la población de moléculas que se separan y la
molécula sonda cargada, preferiblemente un ADN marcado, en
condiciones de hibridación apropiadas, y la mezcla se aplica a un
medio de separación que lleva la carga, preferiblemente una columna
de intercambio aniónico. Cuando se desea que la sonda de ADN se
hibride establemente con cada molécula de analito que tenga una
región complementaria o casi complementaria, la sonda
preferiblemente se añade en exceso. Las dobles hélices entonces se
separan dentro del medio, típicamente por elución, a o cerca de un
pH neutro (entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9).
El análisis generalmente se lleva a cabo a una
temperatura suficientemente inferior a la T_{m} de las dobles
hélices de los analitos deseados para asegurarse de que permanecen
en la forma de doble hélice durante la separación. Preferiblemente,
esta temperatura es de aproximadamente 20ºC menos de la T_{m} más
baja esperada. Sin embargo, pueden usarse temperaturas más altas
para aumentar la severidad,por ejemplo, cuando se desea que la
sonda se hibride establemente a solo la especie seleccionada, como
se describe anteriormente.
El método permite la detección de niveles bajos
de un analito por la hibridación con el ADN marcado. El marcador es
preferiblemente un marcador fluorescente, tal como la fluoresceína,
y típicamente se une a un extremo de la sonda de ADN. Un estándar
interno que tiene una secuencia que incluye o que es un fragmento
del del analito, pero que es de una longitud diferente, puede
usarse para la cuantificación del analito. El ejemplo 3 demuestra
el uso de este método en la detección de niveles muy bajos (aprox.
10 ng) de un PMO particular en una muestra de plasma.
Como se indica anteriormente, una molécula
oligomérica "sustancialmente no cargada", en el contexto de la
invención, es un análogo de oligonucleótido en el cual ninguna
subunidad del nucleótido está cargada a un pH neutro o casi neutro
(de aproximadamente pH 5 a aproximadamente pH 9), o un número
suficiente no están cargadas a dicho pH tal que las dobles hélices
de moléculas de longitud diferente con un oligómero cargado, tal
como ADN, son separables por los métodos de separación descritos en
este documento.
Los ejemplos de análogos de oligonucleótido no
cargados conocidos incluyen ácidos peptídicos nucleicos,
oligonucleótidos de fosfotriester, oligonucleótidos de fosfonato de
metilo, y oligómeros de morfolino que tienen enlaces de
intersubunidad no cargados. En una realización preferida, los
oligómeros de analito son oligómeros de morfolino, que tienen
enlaces de intersubunidad no cargados. Tales enlaces se ilustran en
las Figuras 2AA-2EE. En realizaciones preferidas,
los enlaces se seleccionan a partir de un enlace fosforodiamidado
como se representa en la Figura 2B-B, donde
X=NH_{2}, NHR, o NR_{2} (donde R es alquilo inferior,
preferiblemente metilo), Y=O, y Z=O, y un enlace fosforodiamidado
alterno como se representa también por la Figura
2B-B, donde X=OR, Y=NH o NR, y Z=O, donde R es
alquilo inferior. Los oligómeros de morfolino que tienen cualquiera
de estos enlaces se denominan en este documento PMO.
Las moléculas de analito también pueden incluir
quimeras de los llamados análogos de oligonucleótido anteriores.
También se incluyen quimeras, por ejemplo alternando copolímeros,
con oligómeros cargados tales como ADN,
2-O-alquil-ARN, o
2-O-alil-ARN. Como
se dice anteriormente, se prefiere que al menos el 50% de las
subunidades de tales copolímeros sean no cargadas.
Se espera que las moléculas de analito que no
tengan ninguna región complementaria al ácido nucleico cargado
permanezcan no hibridadas y pasen por el medio cargado rápidamente,
sin separación en base a la carga. Los presentes métodos son los
más adecuados, por lo tanto, para mezclas de moléculas de analito
que representen diferentes fragmentos de la misma secuencia. Un
ejemplo es una mezcla de reacción sintética, como se ilustra en el
Ejemplo 1. Este Ejemplo ilustra el uso del método en la separación
de mezclas de varios PMO que se diferencian en la longitud por sólo
una subunidad. El Ejemplo 2 ilustra la resolución de secuencias de
deleción N-1. La división de la estructura de un
oligómero, por rutas biológicas u otras, también puede ser
determinada por el análisis de los productos de degradación.
El ácido nucleico cargado usado para la
formación de la doble hélice es lo más típicamente ADN. Sin embargo,
también podría ser usado cualquier análogo de ADN o ARN
establemente hibridante cargado. Aunque el oligómero está
preferiblemente, y más convenientemente, totalmente cargado, este
tiene que incluir sólo un número suficiente de subunidades cargadas
tal que sus dobles hélices con moléculas de analito de longitud
diferente sean separables por los métodos de separación descritos
en este documento. Para la conveniencia y la simplicidad del
análisis, preferiblemente se usa una especie simple(es
decir, una longitud y secuencia simple) del ácido nucleico cargado o
análogo.
Los análogos de ácidos nucleicos cargados que
podrían ser usados incluyen ADN modificado, ARN, ARN modificado tal
como 2'-O-alquil-ARN
o 2'-O-alil-ARN, y
el fosforotioato de ADN. "Modificado" en este sentido incluye
modificaciones del grupo de azúcar ribosa o los restos de
apareamiento de base,por ejemplo, las bases sustituídas
C-2-metilo
o-propinilo, siempre que tales modificaciones no
interfieran con la hibridación o con la resolución de las dobles
hélices cargadas:no cargadas.
Conforme a la estrategia de separación, el ADN o
el análogo cargado tienen una longitud y una secuencia tal que sus
dobles hélices se diferencian con respecto a moléculas de analito
diferentes respeto a la presencia, la longitud y/o la posición de
la parte no hibridada (es decir, monocatenario o bucle interno) que
se origina como consecuencia de la formación de la doble hélice. Es
complementaria o casi complementaria a al menos una parte de la
secuencia de la molécula de analito más larga que se desea separar.
También puede incluir una secuencia no hibridante del extremo
(véase por ejemplo, las Figuras 4A-B).
En una realización del método, el ADN tiene una
longitud igual a o mayor que la longitud esperada de la molécula de
analito más larga que se desea separar. Sin embargo, como se
describe anteriormente, puede ser usado un ADN más corto, en
particular cuando la(s) diferencia(s)
esperada(s) entre las moléculas de analito está(n)
predominantemente dentro de una subregión predicha de las moléculas
de analito.
Aunque el ADN pueda ser más largo que la
molécula de analito más larga, y/o pueda incluir una secuencia no
hibridante, al aumentar la longitud del ADN no hibridado en las
dobles hélices se dan tiempos de retención más largos e
interacciones no específicas mayores con el medio que lleva la
carga. Para la mayor parte de las aplicaciones, por lo tanto, el
ADN no es más que aproximadamente el 25% mayor que la longitud
esperada de la molécula de analito más larga.
Con objetivos de detección, la sonda se marca,
preferiblemente con un marcador fluorescente tal como la
fluoresceína, y preferiblemente en los extremos 5' o 3' de la
sonda.
Cualquier técnica de separación basada en la
carga útil para separar biopolímeros cargados puede ser usada para
separar las dobles hélices cargadas:no cargadas formadas mezclando
las moléculas de analito sustancialmente no cargadas con el ácido
nucleico cargado o el análogo, conforme a la invención. Tales
técnicas son conocidas en la técnica. En general, la mezcla se
aplica a un medio de separación que lleva la carga para la
separación, conforme a procedimientos conocidos en la técnica. La
separación se lleva a cabo a un pH neutro o casi neutro, en
condiciones tal que las dobles hélices entre el ADN y las moléculas
de analito sean mantenidas suficientemente con el objeto de la
separación. En un método preferido, el medio que lleva la carga es
una resina de intercambio iónico, específicamente una columna de
intercambio aniónico, y la elución se lleva a cabo a un pH neutro o
casi neutro, tal como en los Ejemplos siguientes.
En otras realizaciones, el medio de separación
que lleva la carga es un medio de electrofóresis. Tal medio se
carga aplicando un campo eléctrico entre los extremos contrarios, de
acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Los métodos
establecidos para separar moléculas cargadas en tal medio incluyen
la electrofóresis capilar, electrofóresis de gel, tal como PAGE
(electrofóresis de gel de poliacrilamida), y el enfoque
isoeléctrico, que emplea un gradiente sobrepuesto de pH. El
presente método puede emplear un medio no selectivo por tamaños, es
decir uno que no diferencie a las moléculas por el tamaño. Los
ejemplos son la electrofóresis de tubo capilar de no gel y el
enfoque isoeléctrico.
En un análisis representativo, una molécula de
ADN, típicamente marcada fluorescentemente, que es complementaria o
casi complementaria a al menos alguna región de la molécula de
analito más larga esperada, como se describe anteriormente, se
mezcla con una muestra que contiene las moléculas de analito. La
muestra puede ser una muestra biológica,por ejemplo una muestra de
plasma, orina o lisado de tejido, preparada para un análisis
conforme a los protocolos de aislamiento conocidos,por ejemplo,
como se describe debajo para el plasma en el Ejemplo 3. De forma
alternativa, puede ser una mezcla de un producto de una síntesis de
oligonucleótido. Un exceso grande de ADN puede ser usado, para
asegurar la formación completa de las dobles hélices, ya que el ADN
libre migra suficientemente distante de las dobles hélices que esto
no interfiere. Preferiblemente, el ADN se recupera para un uso
posterior, particularmente en el caso de las separaciones
preparatorias de mezclas de reacción.
El Ejemplo 1 siguiente ilustra la separación,
por intercambio iónico, de la especie truncada de
13-unidades monoméricas a
19-unidades monoméricas a partir de un PMO de
20-unidades monoméricas. La separación fue llevada
a cabo en una columna de intercambio iónico Dionex DNA Pac®, usando
eluentes que tienen un intervalo de pH de 7 a 9. Como se muestra en
las figuras 5A-B, las especies, que se diferencian
por un nucleótido en longitud, fueron resueltas claramente.
El Ejemplo 2 muestra la separación de varias
especies de deleción N-1 de
19-unidades monoméricas, en la cual un nucleótido
individual fue suprimido de 20-unidades monoméricas
parenteral. Se muestran las diferencias de los tiempos de retención
de las 19-unidades monoméricas diferentes en las
Figuras 6-9.
En todos estos análisis, fue observada una linea
de fondo muy pequeña de la matriz de la muestra, y pudieron ser
detectados y cuantificados niveles de analito muy bajos. La
sensibilidad del método en la detección de un PMO objetivo en una
muestra de plasma se muestra en el Ejemplo 3. Una curva de
calibración (Figura 10) fue preparada usando muestras de plasma de
200 \muL y aumentando las cantidades de un estándar de
15-unidades monoméricas, mostrado en la Figura 11.
En el análisis de la muestra de plasma, el estándar interno de
15-unidades monoméricas fue separado limpiamente
del analito de 20-unidades monoméricas, que fue
detectado en un nivel de 10 ng, o 50 ng/mL (Figura 12).
Los Ejemplos siguientes ilustran, pero no se
pretende con ellos limitar la invención.
El ADN fue comprado en Hybridon Specialty
Products. El analito, un PMO que tenía la secuencia ACG TTG AGG GGC
ATC GTC GC (SEQ ID NO: 1), y un fragmento de
15-unidades monoméricas como estándar interno
(Figura 11) que tenía la secuencia GAG GGG CAT CGT CGC (SEQ ID NO:
2), fueron preparados en AVI Bio-Pharma de acuerdo
con métodos estándar. (SEQ ID NO: 1 es el antisentido a una
secuencia humanagénica c-myc, correspondiente
a los nucleótidos 2551-2570 de la genoteca con Nº
de entrada X00196.) La espectrometría de masas de
MALDI-TOF confirmó la identidad del
15-unidades monoméricas (calc. M+H 5350,6,
encontrado 5350,0).
El HPLC fue llevado a cabo usando una bomba
Varian 9010 "inerte" equipada con un automuestreador Rainin
AI-200 y fue conectado a un detector de
fluorescencia Varian 9075. La adquisición de datos fue realizada
usando un terminal de trabajo de cromatografía de Varian Star,
versión 5.3. Las condiciones del HPLC fueron como se describe a
continuación.
Una mezcla de especies truncadas de
13-unidades monoméricas a
19-unidades monoméricas y el PMO de
20-unidades monoméricas parenteral, que tiene la
secuencia ACG TTG AGG GGC ATC GTC GC (SEQ ID NO: 1), fue resuelta
por complejación con un ADN de 20-unidades
monoméricas complementario. Las condiciones de HPLC fueron así:
- Columna: Dionex Pac® DNA PA-100 (250 x 4 mm, 15 \mu tamaño de partículas)
- Fases Móviles: A: Tris 0,025 M (pH 9); B: Tris 0,025 M (pH 9)/NaCl 1 M
- Gradiente: A:B:C 90/10 @ 0 minutos a 55/45 @ 20 minutos
- Caudal: 1,5 mL/min
- Longitud de onda: 254 nm
- Temperatura: 25ºC
Como se muestra en las Figuras
5A-B, todas las especies fueron resueltas. Como se
discute anteriormente, la variación en los tiempos de retención,
según se cree, es atribuible a las proporciones relativas de cargas
sin restricción en su conformación y con restricción en su
conformación de las dobles hélices de PMO: DNA respectivas.
En este estudio, los tiempos de retención de
dobles hélices de ADN con las especies de
19-unidades monoméricas N-1 a
partir de un PMO de 20-unidades monoméricas que
tiene la secuencia ACG TTG AGG GGC ATC GTC GC (SEQ ID NO: 1) fueron
comparados con la doble hélice de longitud completa de
20-unidades monoméricas:DNA. Fue añadida una
solución de ADN 0,1 OD/30,0 \muL a cada 100,0 \muL de alícuota
de muestra acuosa que contenía 0,1 OD del oligómero
N-1, y la solución fue mezclada a fondo. Una
alícuota de 10,0 \muL de cada solución resultante fue retirada y
analizada por HPLC (intercambio iónico) utilizando un
automuestreador. Las condiciones del HPLC fueron así:
- Columna: Dionex Pac® DNA PA-100 (250 x 4 mm, 15 \mu tamaño de partículas)
- Fases Móviles: A: agua; B: tampón Tris 0,25 M (pH 8); C: NaCl 1 M
- Gradiente: A:B:C 80/10/10 @ 0 minutos a 45/10/45 @ 20 minutos
- Caudal: 1,5 mL/min
- Temp: 25ºC
- Detección: UV, 254 nm
Los tiempos de retención se proporcionan en la
Tabla 1 debajo. Como se muestra, todas las muestras de doble hélice
N-1 eluidas después de la doble hélice de longitud
completa de 20-unidades monoméricas:DNA. Las Figuras
6-9 presentan los sobrelapamientos de los
cromatogramas mostrando los tiempos de retención para varias
especies de N-1 para cada nucleótido.
| Serie N-A | TR (min) | Serie N-C | TR (min) | Serie N-G | TR (min) | Serie N-T | TR (min) |
| doble hélice | 5,115 | doble hélice | 5,115 | doble hélice | 5,115 | doble hélice | 5,115 |
| 20:20 | 20:20 | 20:20 | 20:20 | ||||
| N-A1 | 5,410 | N-C2 | 5,311 | N-G3 | 5,483 | N-T4 | 5,416 |
| N-A7 | 5,477 | N-C12 | 5,711 | N-G6 | 5,643 | N-T14 | 5,336 |
| N-A13 | 5,262 | N-C15 | 5,551 | N-G8-11 | 5,576 | N-T17 | 5,514 |
| N-C18 | 5,797 | N-G16 | 5,422 | ||||
| N-C20 | 5,244 | N-G19 | 5,354 |
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones de HPLC:
- Columna: Dionex Pac® DNA PA-100 (250 x 4 mm, 15 \mu tamaño de partículas)
- Fases Móviles: A: Tris 0,025 M (pH 9); B: Tris 0,025 M (pH 9)/NaCl 1 M
- Gradiente: A:B:C 90/10 @ 0 minutos a 55/45 @ 20 minutos
- Caudal: 1,5 mL/min
- Longitud de onda: 494 nm de excitación; 518 de detección
- Temperatura: 25ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Les fue inyectado i.v. a macacos el
analito de PMO, y les fueron tomadas muestras de sangre en varios
intervalos de tiempo, como se muestra en la Tabla 2. En un análisis
típico, fueron combinados 200 \muL de plasma con una cantidad
conocida (por ejemplo 500 ng) de estándar interno (Figura 11) en 10
\muL de tampón Tris 0,025 M, pH 8-9. Fue añadido
metanol (200,0 \muL), y la muestra fue mezclada usando un
mezclador de vórtice. El precipitado fue eliminado con ayuda de
centrifugación de alta velocidad. El sobrenadante fue retirado y
los peletes fueron lavados con 100 \muL de tampón Tris; el lavado
fue añadido al sobrenadante. La mezcla fue calentada a 70ºC durante
un periodo de 10 minutos, y la muestra fue sometida otra vez a
centrifugación a alta velocidad. El sobrenadante fue transferido y
fue liofilizado hasta sequedad. El material seco fue reconstituido
con una alícuota de 100,0 \muL de ADN (fluoresceína
5'-marcada) en Tris 0,025 M (pH 8-9)
y fue transferido a un frasco de automuestreo, y la muestra entera
fue inyectada en la columna de HPLC y fue analizada.
Fue realizada una calibración por análisis de
estándares de plasma que contenían de 250 a 20.000 ng de
AV1-4126. Los datos fueron trazados como la
relación de analito de las intensidades de la señal del estándar
interno frente a la relación de analito a las concentraciones del
estándar interno. Se muestra el gráfico en la Figura 10, que
muestra un coeficiente de correlación de 0,999920.
Se enseña la cuantificación de las muestras,
basada en el estándar interno, en la Tabla 2. Se muestra un
cromatograma de un ensayo representativo en la Figura 12. El nivel
detectado en este ensayo era de 10,0 ng de analito, que
correspondió a 50 ng/mL. La sensibilidad de este método excede con
mucho la detección y los límites de cuantificación de los métodos
basados en UV.
| ID de mono | 10 minutos (\mug/mL) | 2 h (\mug/mL) | 6 h (\mug/mL) | 24 h (\mug/mL) |
| 29M | - | - | - | - |
| 38M | 105,37 | 68,025 | 45,33 | 14,895 |
| 39F | 105,685 | 49,755 | 32,015 | 12,645 |
| 40M | 92,505 | 49,895 | 29,81 | 17,575 |
<110> AVI BioPharma, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para análisis de análogos de
oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 50450-8038. WO00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> No Asignado aún
\vskip0.400000\baselineskip
<141> Archivado Adjunto
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento de EE.UU. 60/229.245
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-08-30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para la Versión 4.0 de
Windows
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> antisentido a nucleótidos
2551-2570 de c-myc humano de
GenbankX00196
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgttgaggg gcatcgtcgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggggcatc gtcgc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgttgaggg gcatcgtc
\hfill18
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgttgaggg gcatcg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgttgaggg gcat
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttgaggggc en
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaggggcat cgtcgc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de complemento a SEQ ID
NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)... (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A, T, C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipnnnngcgacg atgccc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> fragmento de complemento a SEQ ID
NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgacgatgcc
\hfill10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> variante de deleción de SEQ ID NO:
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgttgaggg gcatctcgc
\hfill19
Claims (6)
1. Un método para separar una población
de dobles hélices que comprenden diferentes moléculas de analito
oligoméricas, comprendiendo el método:
- (a)
- aplicar un medio de separación que lleva carga a una mezcla de (i) una población de moléculas de analito diferentes, en el que cada molécula está compuesta de subunidades unidas de las que al menos el 50% no están cargadas, y es capaz de hibridarse vía el apareamiento de bases de Watson-Crick con una molécula sonda específica que es un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico cargado, e (ii) la molécula sonda,
- en condiciones tal que la molécula sonda forma dobles hélices estables con una pluralidad de o todas las moléculas de analito, formándose así una mezcla de especie seleccionada a partir de la doble hélice de sonda-analito, analito monocatenario, sonda monocatenaria, y sus combinaciones, y
- (b)
- separar dichas dobles hélices entre sí y a partir de la especie monocatenaria dentro del medio.
2. El método de la reivindicación 1, en
el que la secuencia de nucleótidos de cada molécula de analito se
selecciona a partir del grupo que consiste en una secuencia
seleccionada, fragmentos de longitud diferente de la secuencia
seleccionada, variantes de deleción interna o inserción de la
secuencia seleccionada, variantes de mutación de la secuencia
seleccionada, y sus combinaciones.
3. El método de la reivindicación 2, en
el que dichas variantes de deleción, inserción o mutación contienen
en su mayoría una tal deleción, inserción o mutación por 8
nucleótidos de la secuencia seleccionada.
4. El método de la reivindicación 1, en
el que la sonda tiene una longitud y secuencia tal que sus dobles
hélices con moléculas de analito diferentes se diferencian con
respecto a la presencia, la longitud o la posición de una parte no
hibridada del ácido nucleico.
5. El método de la reivindicación 2, en
el que la sonda incluye una secuencia complementaria a la secuencia
seleccionada.
6. El método de la reivindicación 5, en
el que la sonda tiene una longitud igual a o no más que el 25% más
que la secuencia seleccionada.
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