ES2262662T3 - Modelo de animal transgenico que presenta desordenes neurodegenerativos. - Google Patents

Abstract

Un ratón transgénico que puede ser producido por medio de: (a) el cruce de un primer ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP695) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde el transgén se expresa, con un segundo ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 2 humana en donde el residuo de metionina en la posición 239 se sustituye por valina para producir una primera generación de descendientes; y (b) la selección de una primera generación de descendientes de un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye al menos un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP695) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y al menos un segundo transgén que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 2 humana en donde el residuo de metionina en la posición 239 se sustituye por valina y expresa a ambos de dichos primer y segundo transgenes.

Description

Modelo de animal transgénico que presenta desordenes neurodegenerativos.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con modelos transgénicos de animales no humanos que presentan desordenes degenerativos, incluida la Enfermedad de Alzheimer. Más específicamente, la presente invención está dirigida a un modelo murino que facilita la caracterización de los mecanismos patogénicos de la enfermedad de Alzheimer y el desarrollo de diagnósticos, terapias y compuestos terapéuticos.

Antecedentes de la invención

En la descripción que se hace a continuación, se hace referencia a ciertas citaciones de la literatura que se enlistan al final de la descripción, todas las cuales se incorporan aquí por referencia.

La Enfermedad de Alzheimer (AD), la causa más común de demencia, tiene una etiología compleja que involucra más probablemente determinantes genéticos y ambientales. Se caracteriza por depósitos de amiloide en el cerebro formados a partir del péptido \beta amiloide (A\beta), perdida de neuronas, y depósitos intracelulares conocidos como marañas neurofibrilares (NFT), compuestas de formas hiperfosforiladas de la proteína tau (\tau) asociada con los microtúbulos.

El análisis genético de diversos congéneres familiares con la Enfermedad de Alzheimer (FAD) indican que la biosíntesis del péptido \beta amiloide (A\beta) es un denominador común en la patogénesis de la enfermedad. En el caso de los congéneres vinculados por el cromosoma 21, las mutaciones flanquean los sitios de la endoproteasa en donde A\beta es cortado de la proteína precursora amiloide del Alzheimer (APP), puesto que se piensa que las mutaciones en las presenilinas 1 y 2 acrecientan la escisión de la APP en el límite C-terminal de A\beta, el así llamado sitio de la \gamma-secretasa. Aunque el gen tau sobre el cromosoma 17 no está mutado en la AD, las sustituciones en sentido inverso y las mutaciones en el sitio de empalme están presentes en condiciones con algunas semejanzas patológicas con la AD, tales como la demencia frontotemporal.

Los datos genéticos indican que la biogénesis del A\beta se ubica secuencia arriba en una trayectoria patogénica que culmina en la generación de las NFT. Mientras que los primeros debates se enfocaron en si el A\beta amiloide o las NFT causan pérdida neuronal y disfunción, hoy en día parece que ambos tipos de agregado de proteína son tóxicos y contribuyen al fenotipo clínico de la AD.

Aunque no existen formas animales de ocurrencia natural de la AD, los modelos de animales transgénicos de la enfermedad tienen el potencial de clarificar y ordenar los eventos patogénicos claves en la enfermedad humana. A pesar de intensos esfuerzos, sin embargo, existen pocos modelos satisfactorios.

La patente estadounidense No. 5.877.399 se relaciona con ratones transgénicos que expresan la APP_{695} humana o de ratón ya sea de tipo salvaje o soportando la mutación "Sueca", y desarrollan un desorden neurológico progresivo generalmente dentro del año desde su nacimiento. La patente estadounidense No. 6.037.521 se relaciona con un modelo animal de la Enfermedad de Alzheimer que tiene un transgén que codifica a una porción carboxi-terminal de 99 a 103 aminoácidos de APP humana. La patente estadounidense No. 5.894.078 se relaciona con un ratón transgénico cuyo genoma incluye una secuencia de ADN que codifica a los 100 aminoácidos carboxi-terminales de la \betaAPP insertada dentro del exón I del gen del neurofilamento. La patente estadounidense No. 5.850.003 se relaciona con ratones transgénicos que albergan a un transgén que codifica a la APP_{751} humana con la mutación Sueca.

La patente estadounidense No. 5.898.094 se relaciona con un modelo de animal transgénico de AD en donde el animal soporta y expresa tanto al transgén mutante presenilina 1 como al transgén de la APP_{695} que porta la mutación Sueca.

WO 96/40895 se relaciona con un modelo de animal transgénico de la enfermedad de Alzheimer y su uso para identificar terapéuticas para la enfermedad de Alzheimer, teniendo el animal transgénico un transgén que expresa las tres principales formas de la APP (APP_{695}, APP_{751}, APP_{770}) y que contienen tanto las mutaciones Hardy como la
Sueca.

Algunos de estos modelos fallan en producir APP y/o sus metabolitos por medio de trayectorias fisiológicamente adecuadas, y en los casos en donde esta advertencia no aplica, los animales transgénicos pueden mostrar solamente ciertas facetas del fenotipo de la AD. Con respecto a la neuropatología, pueden existir depósitos de amiloide que se parecen mucho a aquellos observados en la AD, perdida neuronal selectiva (en un caso) e hiperfosforilación de tau, pero no el depósito de las NFT. Adicionalmente, estas anormalidades neuropatológicas pueden no aparecer hasta los 8-9 meses de edad, o hasta los 6 meses de edad en el caso de animales bigénicos u homocigotos. Otras complicaciones encontradas en la creación de estos modelos incluyen letalidad neonatal atribuida a sobreexpresión de APP, al uso de ambientes genéticos complejos, y generalmente a la evidencia no clara de disfunción cognitiva progresiva.

Existe por lo tanto la necesidad de un modelo de animal transgénico de la AD que muestre rápidamente las facetas importantes del fenotipo de la AD humana, de tal manera que los animales no necesiten ser mantenidos por largos pedidos de tiempo y puedan investigarse y desarrollarse compuestos terapéuticos y de diagnóstico mucho más rápidamente y en forma rentable.

Resumen de la invención

La presente invención se relaciona con un nuevo modelo de animal de la AD que incluye un ratón transgénico. Se revela aquí un ratón transgénico denominado TgCRND8, que exhibe altos niveles de síntesis de A\beta y depósito de amiloide en el CNS a los tres meses de edad. Además, los ratones TgCRND8 exhiben cambios cognitivos dentro del período de tiempo en el cual comienzan los depósitos de amiloide. También se describen los métodos para la producción del modelo de animal transgénico TgCRND8 de la Enfermedad de Alzheimer.

Con el desarrollo del modelo de ratón transgénico TgCRND8 para la Enfermedad de Alzheimer, puede entenderse mejor la etiología de la enfermedad, y pueden desarrollarse y analizarse tratamientos potenciales, incluidas las terapias con drogas efectivas.

El modelo de ratón transgénico TgCRND8 se caracteriza por una gran semejanza con el fenotipo de la Enfermedad de Alzheimer de ocurrencia natural, basado en la expresión de la proteína A\beta amiloide en el CNS, así como sobre los análisis histológicos, las deficiencias neurológicas y del comportamiento.

El gen de la APP experimenta empalmes alternativos para generar tres isoformas comunes. La isoforma más larga, que contiene 770 aminoácidos (APP_{770}), y la segunda isoforma más larga que contiene 751 aminoácidos (APP_{751}), se expresan en la mayoría de los tejidos. La tercera transcripción, que contiene 695 aminoácidos (APP_{695}), se expresa predominantemente en el cerebro. Por convención, se utiliza la numeración del codón de la isoforma más larga, APP_{770}, aún cuando se refiera a las posiciones de los codones de las isoformas más cortas.

El ratón transgénico TgCRND8 contiene un transgén que expresa una forma mutante de la isoforma APP_{695} específica del cerebro; este transgén porta tanto las mutaciones "Sueca" como "Indiana" de la APP.

Se generó un ADNc de la APP_{695} conteniendo (utilizando la numeración del codón de la APP_{695}) las mutaciones K595N/M596L (la mutación Sueca) y V642F (la mutación Indiana). Estas y otras mutaciones de la APP serán generalmente mencionadas aquí, incluidas las reivindicaciones, por medio del sistema más común de numeración del codón de la APP_{770}, esto es, para estas dos mutaciones, K670N/M671L (la mutación Sueca) y V717F (la mutación Indiana).

Se insertó el casete mutante doble de ADNc de la APP_{695} dentro del vector cósmido de expresión, cosTet, que contiene al promotor del gen de la proteína prión de hámster Sirio. Se microinyectó entonces al vector dentro de un oocito de ratón para crear una línea transgénica denominada TgCRND8. Estos ratones exhiben múltiples depósitos difusos de amiloide a los tres meses de edad, en cuyo momento son evidentes las deficiencias de aprendizaje espacial.

De acuerdo con un aspecto de la invención, los ratones TgCRND8 han sido cruzados con diferentes ratones transgénicos que soportan una mutación relacionada con la AD para producir ratones bitransgénicos que muestran además una neuropatología mejorada relacionada con la AD.

Por lo tanto, la invención se relaciona con un ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína heteróloga precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde se expresa el transgén.

De acuerdo con la invención, la AP_{695} heteróloga es APP_{695} humana.

Así, la invención provee un ratón transgénico que puede producirse por medio del:

(a)

cruce de un primer ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde el transgén se expresa, con un segundo ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 2 humana en donde el residuo de metionina en la posición 239 se sustituye por valina para producir una primera generación de descendientes; y

(b)

la selección de una primera generación de descendientes de un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye al menos un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y al menos un segundo transgén que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 2 humana en donde el residuo de metionina en la posición 239 se sustituye por valina y expresa a ambos de dichos primer y segundo transgenes.

De acuerdo con una primera modalidad, la invención provee un ratón transgénico producible por medio del:

(a)

cruce de un primer ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde el transgén se expresa, con un segundo ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina para producir una primera generación de descendientes; y

(b)

la selección de una primera generación de descendientes de un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye al menos un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y al menos un segundo gen que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina y expresa a ambos de dichos primer y segundo transgenes.

De acuerdo con una primera modalidad, la invención provee un ratón transgénico producible por medio del:

(a)

cruce de un primer ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde el transgén se expresa, con un segundo ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de metionina en la posición 146 se sustituye por leucina y el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina para producir una primera generación de descendientes; y

(b)

la selección de una primera generación de descendientes de un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye al menos un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y al menos un segundo transgén que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de metionina en la posición 146 se sustituye por leucina y el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina y expresa a ambos de dichos primer y segundo transgenes.

De acuerdo con las modalidades anteriormente mencionadas de la invención, se describe un método para investigar a un compuesto candidato por su eficacia en la prevención o la demora en el desarrollo de la AD, comprendiendo el método las etapas de:

(a)

administrar el compuesto candidato a un primer ratón transgénico como se describe aquí antes del surgimiento de un rasgo fenotípico seleccionado relacionado con la AD en dicho ratón; y

(b)

comparar la edad a la cual dicho rasgo fenotípico seleccionado relacionado con la AD surge en dicho ratón, con la edad a la cual dicho rasgo aparece en un segundo ratón transgénico del mismo tipo al cual no le había sido administrado el compuesto;

en donde una mayor edad en el surgimiento del rasgo en el primer ratón comparado con aquel en el segundo ratón indica la eficacia del compuesto.

También se describe un método para investigar a un compuesto candidato por su eficacia en el mejoramiento de los síntomas de la Enfermedad de Alzheimer, comprendiendo el método las etapas de:

(a)

administrar el compuesto candidato a un primer ratón transgénico como se describe aquí;

(b)

determinar el desempeño de dicho ratón en una prueba de memoria o de aprendizaje; y

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(c)

comparar el desempeño de dicho ratón con el desempeño de un segundo ratón transgénico del mismo tipo al cual no le había sido administrado el compuesto;

en donde un mejor desempeño del primer ratón comparado con aquel en el segundo ratón indica la eficacia del compuesto.

De acuerdo con las modalidades anteriormente mencionadas, se describe un método para la producción de un mamífero transgénico no humano que muestra un depósito anormal de A\beta en su sistema nervioso central que comprende:

(a)

introducir dentro de un oocito fertilizado de dicho mamífero un transgén que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido heterólogo de la proteína precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina;

(b)

transplantar dicho oocito fertilizado dentro de un mamífero pseudopreñado,

(c)

permitir que dicho oocito fertilizado se desarrolle dentro de un descendiente nacido vivo, y

(d)

seleccionar un descendiente cuyo genoma incluya a un transgén que comprenda una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido heterólogo de la proteína precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde se expresa el transgén.

Breve descripción de los dibujos

Se describen ciertas modalidades de la invención, haciendo referencia a los dibujos que las acompañan, en donde:

La Figura 1 muestra el desempeño en el laberinto con agua de los ratones TgCRND8 analizados a las 11 semanas de edad. Los ratones TgCRND8 (n = 5) tenían latencias de escape significativamente más prolongadas (Panel A) y de trayectorias de búsqueda (Panel B) que sus compañeros sin Tg de camada (n = 8), (F(1,10) = 28.8, p < 0.001 y F(1,10) = 22.0, p < 0.01, respectivamente), y consecuentemente vivieron significativamente menos (F(1,10) = 14.9, p < 0.01) en el cuadrante objetivo (TQ) que contenía una plataforma oculta (Panel C). Las habilidades locomotoras evaluadas por medio de la velocidad de nado (Panel D) entre los ratones Tg y los sin Tg fue comparable (F(1,10) = 0.48, p > 0.05).

Los ratones TgCRND8 mostraron memoria especial menoscabada para la posición de la plataforma que la medida por medio de sus patrones de búsqueda durante 60 segundos de nado en el ensayo de prueba cuando se removió la plataforma escondida de la piscina. Ellos mostraron una tendencia a buscar menos el TQ (Panel E) y cruzaron significativamente menos a menudo el anillo exacto de la posición de la plataforma (t(10) = 2.1, p = 0.06) que los ratones sin Tg (Panel F).

La Figura 2 muestra el desempeño de los ratones bitransgénicos TgCRND8 x TgPS2(M239V)1379 en el laberinto de agua. Cuando se los analizó a los 2 meses de edad, los ratones bitransgénicos (n = 5) tenían latencias de escape significativamente mayores (F(1,11) = 8.1, p< 0.05, con el tamaño del efecto debido al genotipo (h2) = 42%) (Panel A) y la trayectoria de búsqueda (F(1,11) = 8.46, p < 0.05, h2 = 43%), (Panel B) que los solos compañeros de camada Tg PS2(M239V)1379 (n = 8). Durante la prueba inversa de aprendizaje que siguió a continuación, se movió la plataforma oculta hacia el cuadrante opuesto del TQ original, los ratones bitransgénicos mostraron una tendencia a latencias de escape más largas (F(1,11) = 3.28, p = 0.1, h2 = 23%, Panel C) pero sus trayectorias de búsqueda (Panel D) no difirieron significativamente de las de los ratones TgPS2(M239V)1379 únicamente (F(1,11) = 2.46, p > 0.05, h2 = 18%). La velocidad de nado de los ratones en ambos grupos transgénicos fue comparable durante los ensayos. Cuando se analizaron nuevamente a los 5 meses de edad, los ratones bitransgénicos mostraron latencias de escape significativamente más largas (F(1,10) = 16.6, p < 0.01, h2 = 62%, (1 ratón bitransgénico murió)) (Panel E) y de trayectorias de búsqueda significativamente mayores (F(1,10) = 20.3, p < 0.001, h2 = 66%, Panel F) que las de los compañeros de camada Tg PS2(M239V)1379 únicamente. Este empeoramiento significativo fue debido al pobre desempeño inicial de los ratones bitransgénicos en los ensayos (grupo x interacciones diarias: F(2,40) = 3.32, p < 0.05 por latencia y F(2,40) = 2.85, p = 0.07 por trayectoria). Este empeoramiento en la adquisición de aprendizaje persistió en los ensayos inversos cuando los ratones bitransgénicos aún mostraron latencias significativamente más largas (F(1,10) = 28.58, p < 0.001, h2 = 74% Panel G) y de trayectorias de búsqueda por más tiempo (F(1,10) = 27.43, p < 0.001, h2 = 73% Panel H) que los compañeros de camada únicamente Tg. Aunque los ratones eventualmente mejoraron su desempeño al final del entrenamiento inverso de aprendizaje, las interacciones diarias del grupo para ambas mediciones no alcanzaron a ser significativas con \alpha = 0.05.

La Figura 3 muestra el desempeño en el laberinto de agua de los ratones TgCRND8 (Tg(APP)8); n = 12) y de los compañeros de camada non transgénicos (sin Tg; n = 20) inmunizados con A\beta_{42} y los ratones TgCRND8 (Tg(APP)8; n = 9) y los compañeros de camada no transgénicos (sin Tg; n =19) inmunizados con el péptido IAPP. La inmunización con el péptido A\beta_{42} redujo significativamente el déficit cognoscitivo en ratones TgCRND8 de acuerdo a lo medido por su latencia de escape y la trayectoria de búsqueda comparada con la de los compañeros de camada sin Tg. Aunque los ratones TgCRND8 inmunizados con A\beta_{42} mostraron latencias de escape mayores a las de los demás (Panel A) y de trayectorias de búsqueda (Panel C), (F(1,30) = 9.71, p < 0.01; F(1,30) = 10.9, p < 0.01 para latencia y trayectoria respectivamente) que la de los ratones sin Tg, la diferencia fue debida a sus búsquedas iniciales más largas (grupo x interacciones diarias: F(4,120) = 2.83, p < 0.05 - latencia; F(3,120) = 4.73, p < 0.01 - trayectoria). Las comparaciones de su desempeño durante los últimos 3 días de entrenamiento no revelaron diferencias significativas entre los grupos (F(1,30) = 0.64, p > 0.05 - latencia; F(1,30) = 1.24, p > 0.05 - trayectoria). Los ratones Tg inmunizados con A\beta_{42} mostraron una ligera tendencia a buscar menos el TQ (F(1,30) = 3.71, p = 0.06, Panel E), pero su velocidad de nado no difirió significativamente de la de los ratones sin Tg (F(1,30) = 1.33, p > 0.05) (Panel G). Los ratones TgCRND8 inmunizados con IAPP mostraron latencias de escape significativamente mayores (Panel B) y de trayectorias de búsqueda (Panel D) que la de sus compañeros de camada sin Tg (F(1,26) = 39.9, p < 0.001 - latencia; F(1,26) = 43.9, p < 0.001 - trayectoria). Aunque ellos no difirieron en su búsqueda inicial de la de los ratones sin Tg, no mejoraron su desempeño durante el entrenamiento (grupo x interacciones diarias: F(4,104) = 6.31, p < 0.001 - latencia, F(4,104) = 5.69, p < 0.001 - trayectoria). Ellos gastaron también significativamente menos tiempo en la búsqueda del cuadrante objetivo (F(1,26) = 7.39, p < 0.05, Panel F), pero su velocidad de nado no se afectó significativamente por la inmunización (F(1,26) = 1.73, p >0.05, Panel H).

Descripción detallada de la invención

La invención provee un ratón transgénico, que muestra una deposición anormal de A\beta similar a aquella observada en ciertos desordenes humanos tales como la Enfermedad de Alzheimer (AD), la variante los Cuerpos de Lewy de la Enfermedad de Alzheimer, y ciertos tipos de la Enfermedad de Creutzfeld-Jacob (CJD), que causan demencia, y angiopatía cerebral hereditaria con el tipo Dutch de amiloidosis (HCAWA-D) y angiopatía amiloide senil que causa hemorragia cerebral.

El ratón transgénico de la invención muestra deficiencias tanto histológicas como de comportamiento como resultado de la deposición anormal de A\beta. En particular, el ratón transgénico de la invención muestra una apariencia acelerada de varias facetas de la patología relacionada con la AD y provee un modelo mejorado de animal de la AD.

Por lo tanto, la invención se relaciona con un mamífero no humano que tiene en su genoma un transgén que codifica a un polipéptido heterólogo APP_{695}, preferiblemente un polipéptido humano APP_{695}, que porta tanto a la nutación "Suiza" como a la mutación "Indiana" de la proteína precursora amiloide de la enfermedad de Alzheimer (APP). Ambas mutaciones están asociadas, en humanos, con la Enfermedad Familiar de Alzheimer (FAD).

Lo que se revela aquí es la producción de un ratón transgénico denominado TgCRND8 que tiene un transgén APP_{695} que porta tanto a la mutación "Sueca" como a las mutaciones "Indiana" de la APP.

Las construcciones transgénicas se basaron en un casete de ADNc que codifica a la isoforma principal de APP en el cerebro humano, APP_{695}. Este casete se modificó para incluir dos mutaciones FAD: la mutación "Sueca" (K670N, M671L) y la mutación "Indiana" (V717F), que se encuentran adyacentes a los límites N y C-terminales del dominio A\beta de APP. El casete se introdujo en cosTet, un vector de expresión del promotor prión que dirige la expresión del transgén en forma independiente de la posición en neuronas del CNS, y en menor medida astrocitos. Las microinyecciones se llevaron a cabo en oocitos de un ambiente genético híbrido, incluidas las cepas CH3 y C57BL6. La línea de ratón transgénico fue denominada TgCRND8.

Como lo entenderán aquellos ordinariamente entrenados en la técnica, puede utilizarse cualquier promotor que dirija la expresión neuronal o al sistema nervioso central del transgén. Estos incluyen al promotor génico de la enolasa, específico de la neurona (37); al promotor de la subunidad del factor de crecimiento B derivado de plaquetas humanas (38), al promotor Thy-1 (19) y al promotor de neurofilamentos (41).

El casete de expresión incluye preferiblemente a las secuencias de la región de control del locus y del promotor a partir de un gen que se expresa en el cerebro y preferiblemente que se expresa a un nivel en proporción con el número de copias transgénicas incorporadas dentro del genoma.

El uso de un casete del transgén doble-cis mutante de la APP_{695} no ha sido previamente reportado; otros modelos de la AD han utilizado a los transgenes (KM670/671NL + V717I)(19) o APP_{770} (KM670/671NL + V717F)(27) de la APP_{751}.

Los ratones TgCRND8 exhiben profusos depósitos amiloides en el CNS, en la forma de placas esféricas inmunoreactivas para el péptido A\beta tan pronto como a los 90 días después del nacimiento, tales placas son características de la AD humana. Los depósitos aislados de placa son visibles en ratones TgCRND8 tan pronto como a los 66 días después del nacimiento. La aparición de los depósitos amiloides en ratones TgCRND8 ocurre más pronto que en cualquier modelo de animal reportado previamente de la AD empleando transgenes únicos (ver Tabla 1).

Se ha publicado una revisión (16) de los modelos murino de la Enfermedad de Alzheimer y se enlistan algunos ejemplos en la Tabla 1. Como se observa a partir de las propiedades enlistadas, los ratones TgCRND8 representan una mejora sustancial e inesperada sobre otros modelos disponibles de animales de la AD.

Por ejemplo, el modelo transgénico doble-cis mutante de la APP descrito anteriormente, el ratón "TgAPP22", que emplea un casete doble mutante de APP_{751} (KM670/671NL + V717I), que mostró la apariencia de placas A\beta a los 18 meses de edad (19) y la línea J9, un casete doble mutante de la APP_{770} (KM670/671NL + V717F), se reportó que desarrollo placas a lo 8-10 meses (27).

El ratón bitransgénico reportado anteriormente, Tg2576 x TgPS1, tenía mínimos depósitos de placa en el corteza cingulada a partir de los 70 días de edad (39) pero eventualmente mostró depósitos bien formados a los 6 meses (22).

El ratón TgCRND8 y los ratones transgénicos de la invención son útiles para el descubrimiento y desarrollo de compuestos de diagnóstico y terapéuticos para el tratamiento de la AD, así como para la mejor elucidación de los mecanismos patogénicos de la enfermedad.

Los ratones TgCRND8 exhiben deficiencias en el aprendizaje espacial, como se evalúa por medio de la versión de la plataforma oculta del laberinto de agua de Morris. Estas deficiencias, medidas contra los compañeros de camada no transgénicos de control, pueden detectarse tan pronto como a las 11 semanas de edad (Figura 1).

Los inventores han mostrado también que la inmunización de los ratones TgCRND8 con péptido A\beta_{42} humano, utilizando el protocolo de Schenk y colaboradores (26), resulta en una mejora significativa tanto en el comportamiento como en la neuropatología a las 10-22 semanas de edad, como se describe en el Ejemplo 5. En contraste, los ratones PDAPP utilizados por Schemk y colaboradores han mostrado que solamente exhiben una mejora en la neuropatología pero no en el comportamiento (26).

El modelo TgCRND8 es por lo tanto el primer modelo de animal de la AD en el cual la modulación del depósito de A\beta (un evento de iniciación conocido y ampliamente aceptado en la Enfermedad de Alzheimer) se ha mostrado que conduce a la mejora tanto de la patología como del comportamiento, proveyendo así el modelo más apropiado hasta la fecha para probar nuevas terapias y para investigar a los candidatos para compuestos terapéuticos.

Tales terapias o compuestos pueden dirigirse a la inhibición de las funciones de la PS1 en la escisión con \gamma-secretasa de la \betaAPP o para acelerar la remoción de los derivados proteolíticos de \betaAPP. Estos derivados proteolíticos de la APP incluyen a la misma A\beta, que es conocida por ser neurotóxica en formas agregadas, así como los derivados C-terminales resultantes de la escisión con \gamma-secretasa de las cepas \alpha y \beta (C83/C99-\betaAPP) que se ha sugerido que son neurotóxicas (25).

Los ratones transgénicos de la invención también son útiles para el desarrollo de nuevos diagnósticos. Por ejemplo, los ensayos putativos de la carga cerebral de A\beta o las pruebas para lesión neuronal en respuesta a la acumulación de A\beta pueden llevarse a cabo con los ratones transgénicos descritos aquí.

Los mamíferos transgénicos no humanos descritos aquí, que tienen un transgén que codifica a la APP_{695} tanto con la mutación Sueca como con la mutación Indiana, pueden cruzarse con otras líneas del mamífero que soporta una mutación diferente, ya sea en un gen transgénico o en uno endógeno, para producir un "mamífero bitransgénico".

Un "mamífero bitransgénico" como se lo utiliza aquí significa un mamífero cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido heterólogo de la APP_{695}, preferiblemente un polipéptido humano de la APP_{695}, que porta a las mutaciones Sueca e Indiana de la APP y a un segundo gen seleccionado, preferiblemente un gen que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína que tiene al menos una mutación seleccionada.

El segundo gen puede ser un gen endógeno que soporta al menos a una mutación seleccionada, o a un transgén homólogo o heterólogo que soporta al menos a una mutación seleccionada. La mutación seleccionada puede ser, por ejemplo, una mutación relacionada con la AD o una mutación en un gen relacionado con el procesamiento de A\beta.

Alternativamente, el segundo gen seleccionado puede ser un transgén normal.

Los ratones TgCRND8 descritos aquí son útiles para la creación de los modelos de ratón de la AD de la invención, porque la trayectoria para la síntesis acelerada del péptido A\beta no se satura en estos ratones, permitiéndoles a ellos cruzarse con otros ratones transgénicos para dar los modelos bitransgénicos de la invención, con mejoras adicionales del proceso patológico relacionado con la AD de la síntesis y deposición del péptido amiloide.

Los ratones TgCRND8 pueden cruzarse, por ejemplo, con animales transgénicos que soportan un gen mutante de presenilina, un gen mutante APOE4, un gen mutante de nicastrina o un mutante diferente de un gen de la APP.

Por lo tanto, de acuerdo con la invención, se proveen ratones bitransgénicos que pueden ser producidos por medio del cruzamiento de un ratón TgCRND8 con

(a)

un ratón transgénico que incluye a un transgén que codifica a una proteína mutante presenilina 1, preferiblemente una proteína presenilina 1 PS1 (L286V);

\newpage

(b)

un ratón transgénico que incluye a un transgén que codifica a una proteína mutante presenilina 2, preferiblemente una proteína presenilina 2 PS2 (M239V), o

(c)

un ratón transgénico que incluye a un transgén que codifica a una proteína presenilina 1 que tiene dos mutaciones, preferiblemente una proteína presenilina 1 PS1 (M146L + L286V).

La primera generación de descendientes producida por cruzamiento se investiga utilizando métodos convencionales, por la presencia y expresión tanto del primero como del segundo transgenes, para seleccionar ratones bitransgénicos.

Los ratones TgCRND8 pueden cruzarse también con animales transgénicos que soportan una mutación en un gen relacionado con el procesamiento de A\beta, tal como el gen relacionado con el receptor de lipoproteína de baja densidad, un gen de \alpha2-macroglobulina o un gen de \beta-secretasa.

Los ratones TgCRND8 se cruzaron con ratones transgénicos que sobre expresan transgenes de presenilina humana mutante (PS1 o PS2) (Tabla 2). Se observó un potente incremento en la densidad de la placa en ratones TgCRND8 que coexpresan a un transgén mutante de presenilina humana denominada TgPS1(L286V)1274 (que porta una mutación de la enfermedad familiar de Alzheimer (FAD)). Por lo tanto, en los ratones TgCRND8 x TgPS1(L286V)1274, ya está presente una carga de amiloide muy parecida a la de la autopsia de un cerebro con AD, a los 62 días de edad (Figura 1A: comparar con los ratones TgCRND8 a los 117 días de edad en el Panel C).

En forma similar, el cruce de ratones TgCRND8 con ratones que portan la forma mutante de la FAD de presenilina 2 (una mutación de metionina a valina en el residuo aminoácido 239 de la región de codificación del gen de la PS2) también resulta en un potente incremento en la densidad de la placa. Una comparación a la edad de 91 días de ratones TgCRND8 y TgCRND8 x TgPS2(M239V) (en donde la línea transgénica se denomina 1379) se muestra en la Figura 2.

Se obtuvo una mejora aún mayor por medio del cruzamiento de ratones TgCRND8 con ratones que soportan un transgén humano mutante de presenilina con dos mutaciones de la FAD en cis con cada uno de los otros, denominado Tg(M146L+L286V)6500. En ratones TgCRND8 x TgPS1(M146L+L286V)6500, los depósitos de amiloide en el hipocampo se detectaron a los 30 días de edad (Figura 3), que es 5 meses más temprano que lo previamente reportado para cualquier otro de los ratones Tg con APP/PS1 doble (que típicamente desarrollan placas a, o después de los 6 meses de edad) (22, 23).

Todos estos ratones bitransgénicos de la invención mostraron una aparición aún más acelerada de placas amiloides en el hipocampo, en comparación ya sea con los padres TgCRND8 o los padres TgPS1 (Tabla 2).

Además de la aparición acelerada de características relacionadas con la AD en comparación con los ratones Tg anteriormente descritos, los análisis preliminares indican que es evidente una perdida sustancial de neuronas corticales en ratones bitransgénicos TgCRND8 x TgPS1(M146L+L286V)6500 de 43 días de edad.

También se observa un deterioro progresivo en el desempeño cognitivo que comienza a las 8-10 semanas de edad en ratones bitransgénicos generados por el cruzamiento de ratones TgCRND8 con ratones que expresan un alelo de FAD de presenilina 2 (TgPS2(M239V), línea 1379 (Figura 5).

Los ratones TgCRND8 descritos aquí, y los cruces de estos ratones con otras líneas de ratones que soportan una mutación seleccionada, por ejemplo una mutación relacionada con la AD, como se describe además aquí, son útiles para una variedad de propósitos.

Estos ratones pueden ser utilizados para investigar compuestos farmacéuticos potenciales por su eficiencia en la prevención o el retraso en el desarrollo de cualquiera de los indicios patológicos, por ejemplo los rasgos fenotípicos relacionados con la AD, observados en estos ratones. Existe por lo tanto un método previsto para investigar a los compuestos candidatos por su eficacia en la prevención o el retraso en el desarrollo de la AD. El método para la investigación incluye la administración de un compuesto candidato a un ratón transgénico de la invención antes de la aparición de un rasgo fenotípico seleccionado relacionado con la AD, y la comparación de la edad a la cual aparece el rasgo fenotípico seleccionado en los ratones tratados con la edad de aparición de aquel rasgo en ratones transgénicos no tratados. Los rasgos adecuados relacionados con la AD para el examen incluirían la apariencia de histología cerebral anormal o la aparición de deficiencias en el comportamiento. Las deficiencias en el comportamiento pueden determinarse, por ejemplo, por medio del examen del desempeño de los ratones en un ensayo de memoria o de aprendizaje tal como la prueba del laberinto en agua, como se describió aquí.

Estos ratones pueden también ser utilizados para investigar a los compuestos farmacéuticos potenciales por su eficiencia en el mejoramiento de los síntomas de la AD, por medio de la administración similar y la comparación de los efectos de los compuestos candidatos en animales transgénicos después de la aparición de un rasgo relacionado seleccionado de la AD, tal como histología anormal del cerebro o un déficit de comportamiento.

La etiología específica de la enfermedad puede ser identificada durante el crecimiento y el desarrollo del animal transgénico para estudiar el progreso de la enfermedad y los efectos tanto físicos como fisiológicos. Los ratones transgénicos de la presente invención que en corto tiempo sobre expresan rápidamente A\beta en el cerebro, pueden elaborarse y estudiarse ahora, y utilizarse como modelo para estudiar posibles terapias que incluyen intervención farmacéutica, técnicas de focalización en los genes, terapias antisentido, terapias con anticuerpos, etc. Además, pueden establecerse y estudiarse también líneas celulares transgénicas in vitro con el propósito de elucidar los sistemas de señalamiento intracelular involucrados en la enfermedad así como el ensayo y la identificación de compuestos potencialmente terapéuticos.

Además, los ratones transgénicos de la presente invención pueden también ser utilizados para examinar las situaciones o los ambientes peligrosos que se sospecha que aceleran o inician la Enfermedad de Alzheimer, tales como por ejemplo, trauma craneal o agentes ambientales tóxicos. En este caso, puede exponerse al ratón transgénico a una situación particular y luego observarlo para determinar la declinación en el comportamiento neural, la muerte prematura, gliosis, etc., como indicadores de la capacidad de la situación para provocar más y/o incrementar la AD.

Los ratones transgénicos de la presente invención son útiles para la caracterización más detallada de la Enfermedad de Alzheimer que conduzca a la elucidación de la patogénesis de la patología neurológica progresiva y la determinación de la secuencia de eventos moleculares. Los ratones transgénicos son útiles para el estudio de diferentes mecanismos propuestos de la patogénesis de la enfermedad con el propósito de conducir a mejores tratamientos de la enfermedad.

Los ratones transgénicos de la invención son también útiles pata la identificación de genes no reconocidos anteriormente que pueden también jugar un papel en la AD, ya sea en forma beneficiosa o perjudicial. Un ratón transgénico que soporta un gen candidato se cruza con un ratón transgénico de la invención y se examina el efecto de la presencia del gen candidato sobre los rasgos relacionados con la AD del transgénico. Un gen candidato se marcará como beneficioso si retrasa o diluye a los fenotipos relacionados con la AD tales como la deposición de amiloide y el empeoramiento del desempeño cognitivo. A la inversa, un gen candidato será marcado como favorecedor del desarrollo de la AD si aumenta la edad de aparición o mejora la penetrancia de los fenotipos relacionados con la AD tales como la deposición de amiloide y el empeoramiento del desempeño cognitivo.

Adicionalmente, los ratones transgénicos de la invención son útiles para ensayar las posibles terapias génicas para la AD familiar, por ejemplo la terapia génica por medio de la administración de copias adicionales de un gen normal de presenilina.

Se entenderá por aquellos entrenados en la técnica que los ratones transgénicos de la presente invención proporcionan modelos no humanos de animales de la Enfermedad humana de Alzheimer. Tales modelos permiten la identificación del papel de \betaAPP y del péptido A\beta como involucrados en la Enfermedad de Alzheimer.

Los ratones son a menudo utilizados como modelos de animales transgénicos debido a que son fáciles de alojar, relativamente baratos, y fáciles de criar. Sin embargo, también pueden elaborarse otros mamíferos transgénicos no humanos tales como, pero sin limitarse a, monos, ovejas, conejos y ratas. Los animales transgénicos son aquellos que portan un transgén, esto es, un gen clonado introducido e incorporado en forma estable que se transmite a generaciones sucesivas. En la presente invención el ADNc de la proteína APP_{695} humana fue clonado y modificado para contener dos mutaciones de la FAD, la mutación "Sueca" (K670N, M671L) y la mutación "Indiana" (V717F). Esta construcción se incorporó entonces en forma estable dentro del genoma de un ratón.

Existen varios métodos por medio de los cuales crear un modelo de animal transgénico que porte una cierta secuencia génica además de aquella específicamente descrita aquí.

La generación de una alteración/mutación específica de la secuencia génica de la APP humana es una estrategia. Las alteraciones pueden logarse por medio de una variedad de métodos enzimáticos y químicos utilizados in vitro. Uno de los métodos más comunes es la utilización de un oligonucleótido específico como un mutágeno para generar supresiones diseñadas en forma precisa, inserciones y mutaciones puntuales en una secuencia de ADN. En segundo lugar, un gen silvestre de tipo humano y/o un gen murino humanizado podrían ser insertados por medio de recombinación homóloga. También es posible insertar un gen humano mutante o alterado (sencillo o múltiple) como construcciones genómicas o de minigén utilizando elementos promotores de tipo silvestre o mutante o artificial. La desactivación de los genes endógenos murino puede logarse por inserción de fragmentos modificados artificialmente del gen endógeno por medio de recombinación homóloga. En esta técnica, los alelos mutantes se introducen por medio de recombinación homóloga dentro de células madre embrionarias. Las células madre embrionarias que contienen una mutación desactivada en un alelo del gen que está siendo estudiado, se introducen dentro de embriones tempranos de ratón. Los ratones resultantes son quimeras que contienen tejidos derivados tanto de las células ES transplantadas como de las células huésped. Se emparejó a los ratones quiméricos para evaluar si la mutación se incorpora dentro de la línea germinal. Se empareja a aquellos ratones quiméricos cada uno heterocigoto para la mutación desactivada para producir ratones homocigotos desactivados.

Los genes desactivados que producen el reconocimiento génico permiten evaluar la función in vivo de un gen que ha sido alterado y utilizado para reemplazar una copia normal. Las modificaciones incluyen la inserción de codones mutantes de detención, la supresión de secuencias de ADN, o la inclusión de elementos recombinantes (sitios lox p) reconocidos por medio de enzimas tales como la Cre recombinasa. El sistema Cre-lox permite la ablación de un gen dado o la ablación de una cierta porción de la secuencia del gen.

Para inactivar al gen, puede aplicarse mutagénesis química o por rayos X de gametos de ratón, seguido de fertilización. La descendencia del heterocigoto puede ser identificada entonces por medio de transferencias de Southern para demostrar la perdida de un alelo por medio de dosificación, o perdida para heredar un alelo parental utilizando marcadores RFLP.

Para crear un ratón transgénico, puede insertarse una versión alterada del gen humano de interés dentro de una línea germinal de ratón utilizando técnicas estándar de microinyección de oocito o transfección o microinyección dentro de células madre. Alternativamente, si se desea inactivar o reemplazar al gen endógeno, puede aplicarse recombinación homóloga utilizando células madre embrionarias como se describió anteriormente.

Para la inyección del oocito, pueden insertarse una o más copias de la secuencia génica de la APP humana alterada/mutada dentro del pronucleo de un oocito de ratón recientemente fertilizado. Este oocito se reimplanta entonces en una madre de acogida pseudopreñada. Los integrantes de los ratones que nacieron vivos pueden ser investigados entonces utilizando análisis del ADN de la cola por la presencia de las secuencias alteradas de los genes de la APP. El transgén puede ser o bien una secuencia genómica completa inyectada como un YAC o un fragmento de cromosoma, un ADNc ya sea con el promotor natural o un promotor heterólogo, o un minigén que contiene toda la región de codificación y otros elementos encontrados como necesarios para la expresión óptima.

La infección retroviral de embriones tempranos puede hacerse también para insertar al gen alterado. En este método, el gen alterado se inserta dentro de un vector retroviral que se utiliza para infectar directamente a los embriones de ratón durante las etapas tempranas de desarrollo para generar una quimera, algunas de las cuales conducirá a transmisión por línea germinal.

La recombinación homóloga utilizando células madre permite la investigación de las células por transferencia génica para identificar los raros eventos de recombinación homóloga. Una vez identificados, estos pueden ser identificados para generar quimeras por medio de inyección de blastocistos de ratón, y una proporción de los ratones resultantes mostrarán transmisión por línea germinal a partir de la línea recombinante. Esta metodología de reconocimiento génico es útil especialmente si se desea la inactivación del gen. Por ejemplo, la inactivación del gen puede hacerse por medio del diseño de un fragmento de ADN que contiene secuencias de un exón que flanquea a un marcador seleccionable. La recombinación homóloga conduce a la inserción de las secuencias del marcador en la mitad de un exón, inactivando al gen. Los análisis del ADN de los clones individuales pueden ser utilizados entonces para reconocer los eventos homólogos de recombinación.

También es posible crear mutaciones en la línea germinal del ratón por medio de la inyección de nucleótidos que contienen la mutación de interés y se investiga a las células resultantes por medio de PCR.

Alguien entrenado en la técnica comprendería fácilmente que las construcciones de ácido nucleico como las utilizadas para producir a los mamíferos transgénicos de la invención pueden contener cualquier secuencia apropiada de ácido nucleico que codifique a la proteína mutante APP_{695} que conduce a una mayor producción de A\beta en el cerebro. Tal secuencia de ácido nucleico es preferiblemente el ADNc de la APP_{695} mutada completa, pero puede abarcar otros derivados alterados de tal secuencia mientras que la forma deseada del mutante de la proteína se expresa y se incrementa marcadamente la producción de A\beta.

Ejemplos

Los ejemplos que se describen son para propósitos de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Se hace referencia a métodos de síntesis química, bioquímica de proteínas y de péptidos, biología molecular, histología e inmunología pero no se describen explícitamente en esta descripción, y los ejemplos que se reportan en la literatura científica son bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica.

Ejemplo Preparativo 1

Ratones Transgénicos TgCRND8

Un casete de ADNc de Proteína Precursora \beta-Amiloide humana (1)(\betaAPP) incluye 90 pares de bases de una región no traducida 5', una región de codificación de 695 residuos de aminoácido ("APP695"), y una región no traducida 3' de 271 pares de bases fueron mutagenizadas para introducir, en posición cis una con respecto a la otra, dos mutaciones asociadas con la Enfermedad familiar de Alzheimer (FAD). La primera mutación fue la mutación "Sueca" (2), un cambio di nucleótido afectando a dos codones adyacentes (KM670/671NL:GA\rightarrowTC en los nucleótidos 1785 y 1786, utilizando la numeración del codón/nucleótido del transcrito de la APP770 (1)). La segunda mutación fue un cambio sencillo de nucleótido para producir la sustitución V717F (3) (G\rightarrowT en el nucleótido 1924, utilizando la numeración del codón/nucleótido del transcrito de la APP770 (1)). El transcrito de la APP695, que carece de los exones 7 y 8 codifica al domino inhibidor de la Proteasa Kunitz, es el principal transcrito expresado en el cerebro. El casete de ADNc de la \betaAPP doble mutante se inserto dentro del vector de expresión del cósmido de la proteína prión cosTet. (10).

\newpage

El clon resultante del cósmido recombinante se expandió en el cultivo, se lo lisó para producir ADN súper enrollado, y el inserto de ADN de mamífero incluyendo a los elementos reguladores del gen PrP y a la región de codificación de la APP cortada desde las secuencias del vector procariota en este clon molecular por medio de digestión con la endonucleasa de restricción Not1. Después de la electroforesis sobre gel de agarosa para purificar este fragmento de ADN del transgén Not1, se microinyectó al ADN purificado dentro de los oocitos fertilizados de ratón (derivados del apareamiento de ratones (C3H x C57BL6)), utilizando protocolos estándar (29). Después del implante dentro de las madres de acogida, se investigaron a los nacimientos vivo entre los descendientes positivos del transgén por medio de análisis de hibridación del ADN de la cola, utilizando un fragmento de sonda de ADN derivado de la región no traducida 3' del gen PrP del hámster Sirio (30).

Se utilizaron anticuerpos específicos para la APP (Senetek Inc., Boehringer-Mannheim) para establecer la expresión transgénica en un descendiente positivo del transgén. Los homogenizados de cerebro al 10% elaborados en sacarosa 0,32M fueron diluidos con amortiguador Laemlli, sonicados y corrieron sobre geles de gradiente de tricina al 10-20% (Novex). Después de transferir a nitrocelulosa, se detectaron a la APP y a la PS1 humanas utilizando C y N-terminal específico de Mab y desarrollada por ECL (Amersham). Los resultados se muestran en la Figura 6. Además de la holoproteína APP completa madura e inmadura de 120 y 100 kDa, el análisis de las transcripciones de Western revelo especies de bajo peso molecular en extractos de cerebro de ratones TgCRND8, con niveles más bajos de expresión de la APP. La detección de estas especies con antisuero 6E10 (posicionado N-terminal al sitio de escisión de la \alpha-secretasa) y el anticuerpo 369 indica que estos se derivan del C-terminal de la APP. Estos fueron probablemente intermediarios en el procesamiento de la APP que se acumularon hasta altos niveles en virtud de la sobre expresión, y corresponden a fragmentos C-terminales (CTF) que comienzan en el sitio de la \beta-secretasa (llamadas cepas \beta). En ratones TgCRND8 envejecidos, pero no compañeros de camada sin Tg emparejados por edad o ratones Tg2576, se detectaron también niveles crecientes de especies de 4kDa como animales envejecidos. Las especies inmunoreactivas de 4kDa corresponden al péptido A\beta, que se acumula hasta niveles altos durante el tiempo de vida de estos animales.

La microinyección de transgenes de ADN dentro de oocitos, como se describió anteriormente, conduce a la inserción de los transgenes en forma aleatoria dentro del genoma del ratón. El mapeo de la endonucleasa de restricción de los transgenes insertados demuestra que ellos se insertan en el orden cabeza con cola, con el número de transgenes por ordenación (número de copias) alcanzando más de 100 copias transgénicas por genoma haploide (24).

Los ratones transgénicos que expresan a la APP humana deben mostrar sobre expresión de APP, preferiblemente 5 a 6 veces el nivel de expresión endógena, para amiloidogénesis óptima. La expresión de la APP en el cerebro se determina por medio del análisis de las transferencias de Western utilizando un anticuerpo dirigido a la APP tal como 22C11 (Roche Diagnostics) que reconoce tanto a la APP de ratón como a la humana.

El trabajo previo sobre el vector cos.Tet de la proteína prión a mostrado una expresión independiente de la posición de la ordenación del transgén, de tal manera que los niveles de expresión del transgén aumentan paralelamente con el número de copia (4, 40). Cuando se utiliza este vector, los ratones transgénicos con el nivel alto deseado de expresión de APP, pueden por lo tanto ser identificados primero por medio de la identificación, por análisis de hibridación (30) de ratones transgénicos positivos con un alto número de copias del transgén, preferiblemente al menos 30 copias.

Aunque los ratones que contienen el ambiente genético FVB/N son propensos a la muerte prematura en la vida temprana de adulto, atribuida a un efecto pobremente definido de la sobre expresión de APP, esta tendencia se atenúa en un ambiente genético derivado de las cepas C57 y C3H. Los ratones TgCRND8 establecen por lo tanto que los niveles del péptido A\beta pueden ser tolerados sin comprometer la viabilidad.

Cambio neuropatológicos en ratones TgCRND8

La inmunocoloración se llevó a cabo utilizando el anticuerpo específico humano 4G8, que reacciona con el fragmento proteolítico A\beta de la APP, utilizando secciones fijadas en formalina, cera parafínica en bebida con material del cerebro. Los protocolos estándar para este procedimiento inmunohistoquímico han sido descritos en otra parte (17, 20, 23). Los depósitos aislados de placase hacen visibles primero en ratones TgCRND8 tan pronto como a los 60 días después de nacimiento, con una deposición robusta de placas amiloides difusas de 90 días de edad. Las placas con núcleo denso fueron aparentemente de 4-5 meses de edad, con muchos de estos tipos de depósitos coloreados con Rojo Congo (un reactivo que se intercala dentro de las láminas \beta ricas en depósitos de amiloide) para producir birrefringencia verde/dorada bajo luz polarizada. Depósitos birrefringentes similares están presentes en muestras de cerebro humano con AD. Los depósitos de amiloide fueron prominentes en el hipocampo y en la corteza cerebral (especialmente en la corteza frontal) de ratones TgCRND8, áreas muy afectadas por la Enfermedad de Alzheimer en humanos. El cerebelo, que usualmente está libre en AD esporádica, pero que puede ser afectado en forma suave por depósitos difusos de A\beta en los casos severos tempranos de la AD, también se afecta suavemente en ratones TgCRND8 de un año de edad y en ratones TgCRND8 que coexpresan PS1 o PS2 mutante a los 6 meses de edad.

Aunque la APP se expresó sistemáticamente en ratones TgCRND8, (como en el gen PrP del hámster), los depósitos de amiloide no se manifestaron por inmunocoloración en el riñón, el músculo esqueletal y el músculo cardiaco de animales envejecidos con deposición florida sobre el CNS, aún cuando estos son sitios conocidos de la expresión de ARNm del PrP.

Cambios de comportamiento en ratones TgCRND8

Se evaluó el aprendizaje espacial en ratones TgCRND8 utilizando un paradigma bien establecido, el laberinto en agua de Morris (31) como se describió (32). El análisis de comportamientote los ratones TgCRND8 reveló una deficiencia cognitiva significativa en su adquisición de información espacial evaluada en la versión de discriminación de lugar (plataforma oculta en la misma posición espacial) de un laberinto en agua tan temprano como a las 11 semanas de edad. Durante el entrenamiento, los ratones mostraron una velocidad de aprendizaje significativamente menor reflejada en sus latencias más largas de escape y en las trayectorias de búsqueda así como la búsqueda de cambio de nivel del cuadrante que contenía a la plataforma oculta (Figura 1). Los ratones TgCRND8 también mostraron déficit en la memoria espacial cuando fueron analizados en el ensayo de prueba. Durante este ensayo, se removió la plataforma oculta y se les permitió a los ratones buscar su posición durante 60 segundos. Mientras que los ratones sin Tg mostraron una clara propensión espacial selectiva por la posición de la plataforma (Figura 1, E y F), la búsqueda de los ratones TgCRND8 fue más generalizada e incluyó a los cuadrantes adyacentes a TQ, y cruzó la corona central de la posición de la plataforma significativamente menos que los compañeros de camada sin Tg. Las habilidades de nado tanto de los ratones sin Tg como de los APP positivos fueron comparables durante el ensayo, que no segaron por lo tanto las mediciones del aprendizaje.

Ejemplo 2 Ratones bitransgénicos TgCRND8 x TgPS1 (L286V)1274

Se apareó a los ratones TgCRND8 con ratones transgénicos que soportan a un gen mutante de presenilina 1 relacionado con la FAD, designada línea TgPS1 (L286V) 1274, su progenie fue destetada, y se removieron las biopsias de la cola para la preparación de AD genómico. Los ADN purificados de la cola fueron inmovilizados en ordenamientos de "manchas puntuales" sobre una membrana de Nylon e hibridados para utilizar una sonda específica para el gen de la región de codificación de la APP humana cortada de un clon de ADNc o de un fragmento de sonda de la región de clonación de la PS1 humana cortado de un clon de ADNc. Estos fragmentos d restricción de ADNc fueron marcados por medio de la preparación aleatoria con \alpha-32p-dCTP (33). Los duplicados de las membranas de Nylon se incubaron ya sea con las sondas de hibridación de la APP o de SP1, y lavadas en una solución de dodecil sulfato de sodio al 0,1%, 0,1 de citrato de sodio en suero fisiológico a una temperatura de 65ºC (esto corresponde a un "riguroso" lavado posterior a la hibridación de tal manera que las señales que se derivan de los genes endógenos de PS1 y de APP en el genoma del ratón se minimizan). Los ratones bitransgénicos fueron identificados en virtud al hecho de que las muestras hibridas correspondientes al ADN de la cola hibridaron con ambas sondas específicas para el gen de la APP y de la PS1.

Cambios neurológicos en ratones bitransgénicos TgCRND8 x TgPS1 (L286V)1274

La deposición de amiloide se amplificó en los ratones bitransgénicos resultantes, mostrando estos ratones una carga de amiloide que se parece mucho a la autopsia del cerebro humano con la AD a los 62 días de edad.

En ratones envejecidos, la deposición de amiloide fue suficientemente florida que se extendió hasta las estructuras usualmente libres en ratones transgénicos individuales (por ejemplo, cerebelo).

Ejemplo 3 Ratones bitransgénicos TgCRND8 x TgPS2 (M239V)1379

Los ratones TgCRND8 fueron cruzados también con la línea transgénica denominada como línea TgPS2(M239V) 1379, que expresa a un alelo mutante de la presenilina 2 en el contexto del mismo vector de expresión del cósmido de la proteína prión cos.Tet. Los ratones bitransgénicos TgCRND8 x TgPS2 (M239V)1379 se genotiparon como se describió anteriormente para los ratones TgCRND8 x TgPS1 (L286V)1274, con la excepción de que se utilizó una sonda de hibridación del ADN de la región de codificación PS2, en lugar de una sonda de hibridación de la región de codificación PS1.

Estos ratones bitransgénicos exhibieron profusos depósitos amiloides en el CNS en la forma de placas inmunoreactivas esféricas para el péptido A\beta a los 91 días después del nacimiento. Estos depósitos amiloides se ubicaron en el hipocampo y en la corteza cerebral, en áreas muy afectadas por la Enfermedad de Alzheimer en humanos. El cerebelo usualmente se afecta solamente por medio de los depósitos difusos de A\beta solamente en los casos severos tempranamente libres de la Enfermedad de Alzheimer; se afecta en ratones con las cargas más pesadas de placa.

Cambios de comportamiento en ratones bitransgénicos TgCRND8 x TgPS2 (M239V)1379

Los ratones bitransgénicos TgCRND8 x TgPS2 (M239V)1379 fueron analizados a los 2 meses de edad y mostraron un defecto cognitivo significativo en la adquisición de aprendizaje espacial con el tamaño del efecto en el rango del 40% (Figura 2, paneles A & B). Durante el siguiente ensayo inverso, sin embargo, aunque inferior al comienzo, los ratones bitransgénicos mostraron un desempeño comparable hacia el final del análisis (aproximadamente 20% de variación explicada por el transgenotipo) (Figura 2, paneles C & D). Durante la nueva prueba a los 5 meses de edad, los mismos ratones bitransgénicos mostraron un déficit de aprendizaje significativamente alto durante la adquisición y el
ensayo inverso (tamaño del efecto debido al transgenotipo de 60% y 70% respectivamente) (Figura 2, Paneles E & F). Los ratones bitransgénicos tampoco difirieron de los ratones TgPS2(M239V)1379 en su velocidad de nado a cualquier edad analizada. La expresión de la APP humana mutada en presencia del gen mutado PS2 confiere un empeoramiento en el aprendizaje espacial y en la memoria como tan temprano como a los dos meses de edad, comparado con el desempeño de los ratones TgPS2(M239V)1379 que se comportaron en una forma similar a los ratones no transgénicos derivados de la misma combinación de cepas consanguíneas. Este empeoramiento en el progreso con la edad y para una edad de 5 meses, los ratones muestran una constante deficiencia en la adquisición de nueva información
espacial.

Ejemplo 4 Ratones bitransgénicos TgCRND8 x Tg(M146L + L286V)6500

Los ratones TgCRND8 fueron cruzados con ratones transgénicos que soportan dos mutaciones de PS1 (M146L + L286V) (34). Los ratones doble mutantes PS1 fueron creados por medio de procedimientos estándar, como se describió previamente (35). Los ratones bitransgénicos fueron identificados por medio del análisis del genotipo del ADN de la cola por hibridación con dos sondas independientes de ADN, como de describió anteriormente para los ratones bitransgénicos TgCRND8 x TgPS1(L286V)1274.

Los ratones bitransgénicos dobles resultantes mostraron depósitos amiloides A\beta por punción en la corteza al mes de edad, con múltiples placas difusas de amiloide A\beta presentes a los 43 días de edad. Algunas de las placas que se manifestaron a la edad de 43 días eran congofílicas (esto es, pueden ser coloreadas con el reactivo Rojo Congo).

Ejemplo Comparativo 5

La inmunización activa contra A\beta altera las deficiencias cognitivas en los ratones TgCRND8

Un grupo de ratones TgCRND8 y un grupo de compañeros de camada no transgénicos fueron inmunizados con el péptido sintético A\beta42 como lo describen Schenk y colaboradores (36). Los grupos de control de los ratones TgCRND8 y los compañeros no transgénicos de camada fueron inmunizados con un péptido amiloidogénico de control (polipéptido amiloide de isleta (IAPP), que se asocia con la patogénesis de diabetes). El desempeño de estos dos grupos transgénicos en el ensayo del laberinto con agua, como se describió anteriormente, fue comparado con el desempeño de los compañeros de camada sin Tg. Los resultados se muestran en la Figura 3.

Como se observa en la Figura 3, la inmunización con el péptido A\beta42 atenuó el empeoramiento cognitivo de los ratones TgCRND8 en etapas tempranas de la inmunización. El desempeño en el laberinto con agua de los ratones TgCRND8 inmunizados con A\beta42 o 1APP (inmunización iniciada a las 6 semanas de edad) fue analizado a las 11 semanas de edad. La inmunización con el péptido A\beta42 redujo significativamente el déficit cognitivo en ratones TgCRND8 como se midió por medio de la latencia de escape (Panel A) y la longitud de la trayectoria de búsqueda (Panel D) comparado con los compañeros de camada sin Tg. Aunque los ratones TgCRND8 inmunizados con A\beta42 mostraron latencias totales de escape más largas (Panel A) y de trayectorias de búsqueda (Panel D), (F(1,30)=9.71, p<0.01; F(1,30)=10.9, p<0.01 para latencia y trayectoria respectivamente), que los ratones sin Tg, la diferencia se debió a sus búsquedas iniciales más largas (grupo x interacciones diarias: F(4,120)-2.83, p<0.05 - latencia; F(3,120)=4.73, p<0.01 - trayectoria). La comparación de su desempeño durante los últimos 3 días de entrenamiento no reveló diferencias significativas entre los grupos (F(1,30)=0.64, p>0.05 - latencia; F(1,30)=1.24, p>0.05 - trayectoria). Los ratones TgCRND8 inmunizados con A\beta42 mostraron una ligera tendencia a buscar al TQ menor (F(1,30)=3.71, p = 0.06, panel E), pero su velocidad de nado (Panel G) no difirió significativamente de los ratones sin Tg (F(1,30)=1.33, p>0.05). Los ratones TgCRND8 inmunizados con IAPP mostraron latencias de escape significativamente más largas (Panel B) y de trayectorias de búsqueda (Panel C) que sus compañeros de camada sin Tg (F(1,26)=39.9, p<0.001- latencia; F(1,26)=43.9, p<0.001- trayectoria). Aunque los transgénicos no difieren en su búsqueda inicial de ratone sin Tg, ellos no mejoraron su desempeño durante el entrenamiento (grupo x interacciones diarias: F(4,104)=6.31, p<0.001-latencia, F(4,104)=5.69, p<0.001 - trayectoria). Ellos gastaron también significativamente menos tiempo buscando el cuadrante objetivo (F(1,26)=7.39, p<0.05, panel F), pero su velocidad de nado no se afectó por la inmunización (F(1,26)=1.73, p>0.05, panel H).

En resumen, la inmunización de los ratones TgCRND8 con péptido A\beta42 a las 6 semanas seguido por un refuerzo a las 8 semanas, mejoró significativamente las habilidades cognitivas de los ratones TgCRND8 en el paradigma del laberinto con agua administrado a las 11 semanas de edad. Por otro lado, los ratones inmunizados con IAPP mostraron un empeoramiento significativo en la adquisición de información espacial comparado con los compañeros de camada sin Tg (Figura 3), y este empeoramiento fue de naturaleza similar a aquella observada en los ratones TgCRND8 no inmunizados (no se muestran los datos).

La inmunización con los péptidos A\beta42 o IAPP no afectó las habilidades nadadoras de los ratones. Estos hallazgos indican que la inmunización con A\beta42 (pero no con el péptido de control IAPP) mejora el desempeño en el laberinto de agua, y que esta mejora puede ocurrir en un momento coincidente con la primera deposición de placas amiloides de A\beta en el hipocampo. Estos hallazgos también establecen que el empeoramiento cognitivo en TgCRND8 no es debido a un defecto congénito irreversible.

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TABLA 1 Propiedades de los ratones transgénicos mutantes con APP humana que exhiben depósitos de placa del A\beta

Línea con	Mutación	Isoforma(s)	Edad del comienzo	Edad del comienzo de las	Edad del comienzo de las
APP	con APP	con APP	de las placas de	placas de amiloide del	deficiencias en la versión
		humana	amiloide del A\beta en el	A\beta maduro (coloración	de la plataforma del
			hipocampo por medio	Rojo Congo)	laberinto con agua
			de inmunocoloración
PDAPP^{17}	V717F	695, 751,	8 meses	¶No	Sin deficiencias
		770^{\text{*}}		reportado	reportadas
Tg2576^{18}	K670N,	695	9-11 meses	¶No	Empeoramiento a los
	M671L			reportado	9-1 meses en el ambiente
					de la cepa C57xSJL
TgAPP23^{19}	K670N,	751	Depósitos raros	6 meses	Sin deficiencias
	M671L		a los 6 meses		reportadas
TgAPP22^{19}	K670N,	751	18 meses	Subconjunto de las	Sin deficiencias
	M671L más			placas presentes a	reportadas
	V717I			los 18 meses
APP/Ld/2^{20}	V717I	695	13-18 meses	¶No	Empeoramiento a los
				reportado	3-6 meses en el ambiente
					de la cepa FVB/N x C57
TgCRND8	K670N,	695	Múltiple depósitos	Un subconjunto de	Empeoramiento a los
	M671L más		a los 3 meses	placas, aparición	2.8 meses en el ambiente
	V717F			desde los 4-5 meses	de la cepa C57xC3H
				en adelante
* \begin{minipage}[t]{155mm} El casete de ADNc incluye intrones para permitir la producción de los ARNm empalmados de la APP695, 751, y 770.\end{minipage}
¶Se reportó que los depósitos de placa colorearon con Rojo Congo pero no se establecieron las edades.
La coloración con tioflavina-S se reportó a los 8 meses en ratones PDAPP y a los 354 días en ratones Tg2576

TABLA 2 Propiedades del mutante con APP x cruzamientos con el mutante con presenilina

Origen del	Origen del mutante	Edad del comienzo	Edad del comienzo de las	Edad del comienzo de las
mutante con	con presenilina	de las placas de	placas de amiloide del	deficiencias en la versión
APP		amiloide del A\beta en el	A\beta maduro (coloración	de la plataforma del
		hipocampo por medio	Rojo Congo)	laberinto con agua
		de inmunocoloración
Ninguno	Mutante PS1 o PS2	Ninguna	Ninguna	Ninguna
TgCRND8	Ninguno	3 meses	4-5 meses	2,8 meses\ddagger
TgCRND8	PS1(L286V)1274	2 meses	No se hizo	No se hizo
TgCRND8	PS2(M239V)1379	2 meses	No se hizo	2,8 meses\ddagger
TgCRND8	PS1(M146L+L286V)6500	1 mes	1,5 meses	No se hizo
Tg2576	PS1(M146L)	6 meses, ninguna a	7 meses	*No se reportó
		los 3 meses
+ \begin{minipage}[t]{155mm} Las deficiencias se reportan para estos ratones en otros paradigmas (laberinto Y) y en ratones Tg2576 con "Tg sencillo" de acuerdo con la Tabla 1.\end{minipage}
\ddagger \begin{minipage}[t]{155mm}Ratones de prueba en edades tempranas no se realizan en forma rutinaria, ya que los ratones necesitan alcanzar un peso de 25 g y dos semanas de entrenamiento previo antes del ensayo en el paradigma del laberinto con agua.\end{minipage}

Claims (9)

1. Un ratón transgénico que puede ser producido por medio de:

(a)

el cruce de un primer ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde el transgén se expresa, con un segundo ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 2 humana en donde el residuo de metionina en la posición 239 se sustituye por valina para producir una primera generación de descendientes; y

(b)

la selección de una primera generación de descendientes de un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye al menos un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y al menos un segundo transgén que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 2 humana en donde el residuo de metionina en la posición 239 se sustituye por valina y expresa a ambos de dichos primer y segundo transgenes.

2. Un ratón transgénico que puede ser producido por medio de:

(a)

el cruce de un primer ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde el transgén se expresa, con un segundo ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina para producir una primera generación de descendientes; y

(b)

la selección de una primera generación de descendientes de un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye al menos un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y al menos un segundo transgén que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina y expresa a ambos de dichos primer y segundo transgenes.

3. Un ratón transgénico que puede ser producido por medio de:

(a)

cruce de un primer ratón transgénico cuyo genoma incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en la posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y en donde el transgén se expresa, con un segundo ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de metionina en la posición 146 se sustituye por leucina y el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina para producir una primera generación de descendientes; y

(b)

la selección de una primera generación de descendientes de un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye al menos un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y al menos un segundo transgén que incluye una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de metionina en la posición 146 se sustituye por leucina y el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina y expresa a ambos de dichos primer y segundo transgenes.

4. El ratón transgénico de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en donde el ratón es un ratón (C3H X C57 BL6) X C57.

5. El ratón transgénico de la reivindicación 4 en donde el ratón muestra una deposición anormal de A\beta en su sistema nervioso central.

6. El ratón transgénico de la reivindicación 4 en donde el ratón muestra una aparición acelerada de la patología relacionada con la Enfermedad de Alzheimer.

7. Un ratón transgénico cuyo genoma incluye:

un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y un segundo transgén que incluye a un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 2 humana en donde el residuo de metionina en la posición 239 se sustituye por valina y en donde los transgenes se expresan.

8. Un ratón transgénico cuyo genoma incluye:

un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y un segundo transgén que incluye a un transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina y en donde los transgenes se expresan.

9. Un ratón transgénico cuyo genoma incluye:

un primer transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de la proteína humana precursora de amiloide 695 (APP_{695}) en donde el residuo de lisina en la posición 670 se sustituye por asparagina, el residuo de metionina en posición 671 se sustituye por leucina y el residuo de valina en la posición 717 se sustituye por fenilalanina y un segundo transgén que comprende una secuencia de nucleótidos operativamente enlazada a un promotor y que codifica a un polipéptido de presenilina 1 humana en donde el residuo de metionina en la posición 146 se sustituye por leucina y el residuo de leucina en la posición 286 se sustituye por valina y en donde los transgenes se expresan.