ES2261226T3

ES2261226T3 - Promotores especificos de la semilla de lino.

Info

Publication number: ES2261226T3
Application number: ES00954241T
Authority: ES
Inventors: Sarita Chaudhary; Gijs Van Rooijen; Maurice M. Moloney; Surinder Singh
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; SemBioSys Genetics Inc
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; SemBioSys Genetics Inc
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2020-08-25
Also published as: NO20020932L; NO20020932D0; WO2001016340A1; KR100719629B1; MXPA02002108A; EP1212438B1; CN1376204B; EP1212438B8; DE60028053D1; KR20020057950A; CN1376204A; JP2003525030A; IL148270A0; MX248919B; AU782218B2; NZ517467A; BR0013596A; ATE326539T1; DE60028053T2; AU6679200A

Abstract

Método para la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en las semillas de lino que comprende las etapas siguientes: (a) preparar un constructo híbrido de ácido nucleico que comprende en la dirección 5¿ a 3¿ de la transcripción como componentes ligados funcionalmente: (1) un promotor específico de la semilla obtenido del lino; y (2) dicha secuencia de ácido nucleico de interés en la que dicho ácido nucleico de interés no es nativo de dicho promotor específico de la semilla de lino; (b) introducir dicho constructo híbrido de ácido nucleico en una célula vegetal de lino; y (c) cultivar dicha célula vegetal de lino en una planta de lino madura capaz de plantar la semilla, en el que dicha secuencia de ácido nucleico de interés se expresa en la semilla bajo el control de dicho promotor específico de la semilla, en el que específico de la semilla significa que un gen expresado bajo el control del promotor se expresa principalmente en las semillas de la planta con menos de 5% del nivel de expresión general en otros tejidos vegetales y en el que dicho promotor específico de la semilla es un promotor específico de la semilla de lino se selecciona de entre el grupo constituido por promotores de oleosina, promotores de la proteína de almacenamiento 2S y promotores de la proteína de almacenamiento de la semilla de tipo legúmina.

Description

Promotores específicos de la semilla de lino.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a los métodos de ingeniería genética de vegetales útiles para la alteración de los constituyentes de las semillas vegetales. Más específicamente, la invención se refiere a promotores que se han obtenido a partir del lino y que son capaces de dirigir la expresión de genes no nativos en semillas de lino así como en semillas de otras plantas.

Antecedentes de la invención

El lino o la semilla de lino (Linum usitatissimum) es un cultivo de semillas oleaginosas importante comercialmente. El aceite y la harina de lino son materias primas valiosas procedentes de la semilla de lino. Una materia prima más económicamente significativa, la fibra de lino, puede obtenerse a partir del tallo de la planta. La fracción de aceite de linaza se utiliza con fines no comestibles, por ejemplo para la preparación de barnices y pinturas y más recientemente se ha aconsejado para su utilización en la preparación de una gama de productos comestibles tales como margarinas y aceites para ensalada y salsas, en virtud de los recién producidos denominados cultivos de Linola (Green (1986) Can. J. Plant Sci., 66: 499-503). La harina de lino se utiliza principalmente como constituyente de los piensos para rumiantes mientras que las fibras de lino se utilizan para la preparación de tejidos de lino. Dada su importancia económica como fuente de materias primas, es deseable además mejorar y diversificar el catálogo disponible de cultivo de lino tanto con respecto al rendimiento agronómico, por ejemplo el rendimiento de la semilla, la resistencia a los patógenos y a las temperaturas climáticas bajas como con respecto al rendimiento y calidad de las materias primas para satisfacer las aplicaciones posteriores. Aunque es posible obtener cultivos de lino mejorados por cruce convencional de plantas, como se puso de manifiesto por el desarrollo de los cultivos de Linola, el desarrollo de una línea vegetal agronómica de élite requiere grandes inversiones en el cruce de plantas debido a la duración prolongada implicada. La tecnología de ingeniería genética vegetal permite el aislamiento de los genes directamente de las especies no afines y la transferencia de estos genes en los antecedentes agronómicos de elite, reduciendo de este modo significativamente el tiempo requerido para desarrollar nuevos cultivos. Además, la modificación genética vegetal permite la preparación de productos que no pueden obtenerse naturalmente a partir del lino, por ejemplo los agentes
terapéuticos.

Para desarrollar nuevos cultivos de lino mediante ingeniería genética vegetal, es de importancia crítica el control sobre la expresión del gen extraño o no nativo introducido. Las características de la expresión deseada para el gen no nativo, tal como el nivel de expresión del gen no nativo, el tejido u órgano vegetal concreto en el cual se expresa el gen no nativo, y la duración en concreto en el ciclo de crecimiento de la planta en la que se expresa el gen no nativo, variará dependiendo de la aplicación para la cual se desarrolla la línea vegetal. Por ejemplo, la modificación de la composición del aceite de semillas puede requerir bajos niveles de expresión específica para la semilla de una enzima implicada en el metabolismo de los ácidos grasos en una etapa inicial en el desarrollo de la semilla (véase por ejemplo la patente US nº 5.420.034). Por otra parte la expresión de una proteína farmacéutica podría requerir preferentemente altos niveles de expresión específica para la hoja en el momento de la cosecha de las hojas vegetales (véase p. ej. la patente US nº 5.929.304).

Para manipular las características de la expresión de los genes no nativos pueden estar influidos numerosos factores. Un factor es la selección del promotor de transcripción utilizado. Actualmente está disponible un amplio intervalo de promotores vegetales compatibles y algunos de los promotores mejor documentados comprenden los promotores constitutivos tal como el promotor 35-S CaMV (Rothstein et al. (1987), Gene 53: 152-161) y el promotor de ubiquitina (patente US nº 5.614.399), los promotores específicos del tejido tales como los promotores específicos de semillas, por ejemplo el promotor de faseolina (Sengupta-Gopalan et al., (1985), PNAS USA 82: 3320-3324) y los promotores inducibles, tales como los inducibles por calor (Czarnencka et al., (1989), Mol. Cell. Biol. 9 (8): 3457-3464), luz UV, provocadores y que causan daño (Lois et al. (1989) EMBO J. 8 (6): 1641-1648), o productos químicos tales como las hormonas endógenas (Skriver et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(16): 7266-7270). Otros factores que pueden manipularse para controlar las características de la expresión del gen no nativo en los vegetales incluyen los factores de modificación de la transcripción tales como los intrones, secuencias de poliadenilación y secuencias de terminación de la transcripción. Las características de la expresión del gen no nativo pueden además manipularse mediante los factores que afectan a la traducción, tales como las secuencias de unión del ribosoma y el sesgo del codón que es presentado por el huésped. Además, el propio gen no nativo puede afectar la viabilidad del vegetal transgénico, limitando de este modo particularmente los niveles de expresión que pueden alcanzarse. En algunos casos puede ser posible solucionar este problema, expresando la proteína de un modo específico para el tejido, p. ej. en las hojas o la semilla o restringiendo la acumulación de la proteína en los diferentes compartimentos subcelulares tales como por ejemplo el citoplasma, el retículo endoplásmico o las vacuolas, normalmente por la presencia o ausencia de secuencias de direccionamiento específico capaces de dirigir la proteína a estos compartimentos. Otro factor que afectará las características de la expresión es la situación en la que el propio constructo se inserta en el cromosoma del huésped. Este efecto podría proporcionar una explicación como por qué diferentes plantas, transformadas con el mismo constructo recombinante, pueden poseer niveles fluctuantes de la expresión recombinante de la
proteína.

Según el conocimiento de los inventores, la expresión de los genes no nativos en semillas de lino está documentada únicamente en la solicitud de patente PCT WO 98/18948. Esta solicitud da a conocer dos genes de portador estearoil-acil proteína desaturasa (SAD) procedentes del lino. Las secuencias del activado SAD asociadas son útiles para la modificación del lino y otras plantas para la expresión de los genes endógenos o extraños. Sin embargo los métodos dados a conocer por el documento WO 98/18948 están limitados por el hecho de que los promotores SAD no son específicos para las semillas en el lino y comunican la expresión a las hojas, tallos, flores y semillas. La expresión de los genes no nativos puede producir por lo tanto efectos secundarios indeseables en los tejidos distintos de semillas. Además la utilización de promotores SAD permite el control limitado sobre el nivel de expresión y el desarrollo cronológico de la expresión.

Existe una necesidad en la técnica de mejorar más los métodos para la expresión de genes no nativos en semillas de lino y de otras semillas vegetales.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a métodos mejorados para la expresión específica de la semilla de genes no nativos en vegetales. En particular, la invención se refiere a métodos mejorados para la expresión específica de la semilla de genes no nativos en lino.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un método para la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en las semillas de lino que comprende:

(a): preparar un constructo híbrido de ácido nucleico que comprende en la dirección 5' a 3' de la transcripción como componentes ligados funcionalmente:

(1): un promotor específico de la semilla obtenido del lino; y

(2): la secuencia de ácido nucleico de interés en la que dicho ácido nucleico de interés no es nativo de dicho promotor específico de la semilla de lino;

(b): introducir dicho constructo híbrido de ácido nucleico en una célula de planta de lino; y

(c): cultivar dicha célula de la planta de lino en una planta de lino madura capaz de plantar la semilla, en el que dicha secuencia de ácido nucleico de interés se expresa en la semilla bajo el control de dicho promotor específico de la semilla de lino, en el que específico de la semilla significa que un gen expresado bajo el control del promotor se expresa principalmente en las semillas de la planta con menos del 5% del nivel de expresión general en otros tejidos vegetales y en el que dicho promotor específico de la semilla es un promotor de oleosina, un promotor de la proteína de almacenamiento 2S o un promotor de la proteína de almacenamiento de la semilla de tipo legúmina.

En una forma de realización preferida de la invención, por lo menos una característica de la expresión, (p. ej. el desarrollo cronológico de la expresión en el ciclo vital de la planta, comunicado por el promotor a la secuencia de ácido nucleico no nativo es similar al de la expresión característica cuando se confiere a una secuencia de ácido nucleico nativo.

En otro aspecto, la presente invención proporciona semillas transgénicas de lino preparadas por un método que comprende:

(1): un promotor específico de la semilla obtenido del lino; y

(2): una secuencia de ácido nucleico de interés en la que dicho ácido nucleico de interés no es nativo de dicho promotor específico de la semilla;

(b): introducir dicho constructo híbrido de ácido nucleico en una célula vegetal de lino; y

(c): cultivar dicha célula vegetal de lino en una planta de lino madura capaz de plantar la semilla, en el que dicha secuencia de ácido nucleico de interés se expresa en la semilla bajo el control de dicho promotor específico de la semilla, en el que específico de la semilla significa que un gen expresado bajo el control del promotor se expresa principalmente en las semillas de la planta con menos del 5% del nivel de expresión general en otros tejidos vegetales y en el que dicho promotor específico de la semilla es un promotor de oleosina, un promotor de la proteína de almacenamiento 2S o un promotor de la proteína de almacenamiento de la semilla de tipo legúmina.

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En un aspecto adicional, la presente invención proporciona plantas de lino capaces de plantar semillas preparadas por un método que comprende:

(1): un promotor específico de la semilla obtenido del lino; y

En la presente memoria se dan a conocer nuevos promotores específicos para la semilla de lino útiles para la expresión de genes no nativos en semillas de lino y en las semillas de otras especies vegetales, útiles por ejemplo para la modificación de la proteína o de la composición de aceite de la semilla.

En una forma de realización preferida, el promotor específico de la semilla comprende:

(a): una secuencia de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1 a 2.023 como se muestra en la Figura 1 (SEC. ID nº: 1) en la que T puede ser asimismo U, los nucleótidos 21 a 1.852 como se muestra en la Figura 2 (SEC. ID nº: 4) en la que T puede ser asimismo U, los nucleótidos 1 a 400 como se muestra en la Figura 3 (SEC. ID nº: 6) en la que T puede ser asimismo U o los nucleótidos 1 a 2.034 como se muestra en la Figura 4 (SEC. ID nº: 8) en la que T puede ser asimismo U;

(b): una secuencia de ácido nucleico que es complementaria de una secuencia de ácido nucleico de (a);

(c): una secuencia de ácido nucleico que presenta por lo menos 65% de identidad con una secuencia de ácido nucleico de (a) o (b);

(d): una secuencia de ácido nucleico que es un análogo de una secuencia de ácido nucleico de (a), (b) o (c); o

(e): una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico de (a), (b), (c) o (d) en condiciones de hibridación severas.

En otro aspecto, la invención proporciona una secuencia aislada de ácido nucleico híbrido que comprende:

(a): una primera secuencia de ácido nucleico que comprende un promotor específico para la semilla obtenido a partir del lino que comprende:

(1): una secuencia de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1 a 2.023 como se muestra en la Figura 1 (SEC. ID nº: 1) en la que T puede ser asimismo U; una secuencia de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 21 a 1.852 como se muestra en la Figura 2 (SEC. ID nº: 4) en la que T puede ser asimismo U; una secuencia de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1 a 400 como se muestra en la Figura 3 (SEC. ID nº: 6) en la que T puede ser asimismo U; o una secuencia de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1 a 2.034 como se muestra en la Figura 4 (SEC. ID nº: 8) en la que T puede ser asimismo U;

(2): una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico de (a) en condiciones de hibridación severas;

(3): una secuencia de ácido nucleico que es complementaria de una secuencia de ácido nucleico de (a); o

(4): una secuencia de ácido nucleico que presenta por lo menos 65% de identidad con una secuencia de ácido nucleico de (a); y

(b): una segunda secuencia de ácido nucleico no nativo de dicho promotor específico para la semilla de lino; en el que específico de la semilla significa que un gen expresado bajo el control del promotor se expresa principalmente en las semillas de la planta con menos del 5% del nivel de expresión general en otros tejidos vegetales.

Otras características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que aunque la descripción detallada y los ejemplos específicos indican formas de realización preferidas de la invención se proporcionan únicamente a título de ilustración, ya que varios cambios y modificaciones de esta descripción detallada dentro del alcance de la invención serán evidentes para los expertos en la materia.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describirá a continuación haciendo referencia a los dibujos en la que:

La Figura 1 presenta la secuencia de ADN (SEC. ID nº: 1) de un clon genómico de lino que codifica una proteína oleosina de 16,0 kDa (SEC. ID nº: 2 y 3).

La Figura 2 presenta la secuencia de ADN (SEC. ID nº: 4) de un clon genómico de lino que codifica una proteína oleosina de 18,6 kDa (SEC. ID nº: 5).

La Figura 3 presenta la secuencia de ADN (SEC. ID nº: 6) de un clon genómico de lino que codifica una proteína de almacenamiento 2S (SEC. ID nº: 7).

La Figura 4 presenta la secuencia de ADN (SEC. ID nº: 8) de un clon genómico de lino que codifica una proteína de almacenamiento de tipo legúmina de 54,5 kDa (SEC. ID nº: 9 a 12).

La Figura 5 presenta el análisis por transferencia Southern del ADN genómico de lino sondado con las secuencias de ADN de oleosina de lino.

La Figura 6 presenta un análisis por transferencia Northern de la expresión específica de la semilla de oleosinas de lino.

La Figura 7 presenta un análisis por transferencia Northern de la expresión del desarrollo de las oleosinas de lino durante el desarrollo de la semilla.

La Figura 8 presenta la actividad de GUS de los embriones de lino bombardeados con constructos promotor de oleosina de lino-GUS-gen terminador del lino.

La Figura 9 presenta la expresión de GUS en el desarrollo de los embriones de lino y semillas de Arabidopsis de las plantas transformadas con una fusión de GUS con el promotor del gen de la proteína 2S.

La Figura 10 presenta la expresión específica para el tejido de GUS en plantas de lino transgénicas transformadas con un constructo promotor de linina-GUS-gen terminador de linina.

La Figura 11 presenta la expresión terminal de GUS en plantas de lino transgénicas transformadas con un constructo promotor de linina-GUS-gen terminador de linina.

La Figura 12 presenta la expresión de GUS en las plantas transgénicas de Brassica napus (L1 a L9) transformada con un constructo promotor de linina-GUS-gen terminador de linina.

La Figura 13 presenta la expresión de GUS en las plantas transgénicas de Arabidopsis transformadas con un constructo promotor de linina-GUS-gen terminador de linina en diferentes etapas del desarrollo de la semilla.

Descripción detallada de la invención

Como se mencionó en la presente memoria anteriormente, la presente invención se refiere a métodos mejorados para la expresión de genes no nativos en plantas, en particular el lino. La invención proporciona métodos que permiten la expresión específica de la semilla de los genes no nativos en el lino. Los métodos de la invención presentan ventajas porque se obtiene el control mejorado sobre la expresión de genes no nativos en semillas de lino. La expresión del gen no nativo está limitada a las semillas, limitando de este modo los efectos potenciales indeseables procedentes de la expresión en otros órganos o tejidos de la planta. Además, la metodología proporcionada permite un mejor control sobre las características de la expresión, tales como el nivel de expresión del gen no nativo y el desarrollo cronológico de la expresión del gen no nativo en el ciclo de desarrollo de la planta. Los métodos de la presente invención son particularmente útiles porque según la presente invención la composición de la semilla con respecto a las materias primas valiosas, tales como el aceite, las proteínas y los polisacáridos, pueden alterarse tanto cualitativa como cuantitativamente.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en semillas de lino que comprende:

(1): un promotor específico de la semilla obtenido del lino; y

(2): la secuencia de ácido nucleico de interés en la que dicho ácido nucleico de interés no es nativo de dicho promotor específico de la semilla;

(c): cultivar dicha célula vegetal de lino en una planta madura capaz de plantar la semilla, en el que dicha secuencia de ácido nucleico de interés se expresa en la semilla bajo el control de dicho promotor específico de la semilla de lino, en el que específico de la semilla significa que un gen expresado bajo el control del promotor se expresa principalmente en las semillas de la planta con menos del 5% del nivel de expresión general en otros tejidos vegetales y en el que dicho promotor específico de la semilla de lino es un promotor de oleosina, un promotor de la proteína de almacenamiento 2S o un promotor de la proteína de almacenamiento de la semilla de tipo legúmina.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "no nativo" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico, incluyendo cualquier secuencia de ARN o de ADN, que no esté asociada normalmente con el promotor específico de la semilla. Ésta incluye las secuencias heterólogas de ácido nucleico que se obtienen a partir de diferentes especies vegetales como el promotor así como las secuencias homólogas de ácido nucleico que se obtienen de la misma especie vegetal como promotor pero no están asociadas al promotor en la planta nativa (no transgénica).

La secuencia de ácido nucleico no nativo cuando se une a un promotor específico de la semilla obtenido del lino produce un constructo híbrido. El constructo híbrido se introduce en una célula vegetal de lino para crear una célula vegetal de lino transgénica que produce un fenotipo detectable de forma diferente de la célula vegetal de lino o de la planta de lino desarrollada a partir de ella cuando se compara con una célula vegetal de lino no transgénica o una planta de lino desarrollada a partir de ella. Una secuencia de ácido nucleico contigua idéntica a la secuencia de ácido nucleico del constructo híbrido no está presente en la célula vegetal de lino no transformada o en la planta de lino desarrollada a partir de ella. A este respecto, las secuencias híbridas de ácido nucleico incluyen las secuencias que contienen un promotor de lino unido a una secuencia de ácido nucleico obtenida a partir de otra especie vegetal o de una secuencia de ácido nucleico del lino pero normalmente no asociada con este promotor. Las secuencias de ácido nucleico como las utilizadas en la presente memoria incluyen además secuencias que comprenden un promotor de lino y una secuencia de ácido nucleico que está normalmente unida al promotor pero que contiene además una secuencia de ácido nucleico no nativo. Por ejemplo, si el promotor es un promotor de oleosina específico de la semilla de lino, las secuencias "no nativos" para el promotor de oleosina de lino incluyen asimismo una secuencia que comprende una fusión entre el gen de oleosina de lino naturalmente asociado al promotor de oleosina, y una secuencia de codificación de interés que no está asociada de forma nativa al promotor. La expresión no nativo significa también que incluye un gen de fusión como el mencionado anteriormente en la presente memoria que incluye además una secuencia de escisión que separa la secuencia de ácido nucleico que está normalmente unida a la secuencia del promotor y el gen que codifica la proteína de interés.

La expresión "secuencia de ácido nucleico" se refiere a una secuencia de monómeros de nucleótidos o de nucleósidos que está constituida por bases nativos, enlaces de azúcares e interazúcar (eje central). La expresión incluye asimismo secuencias modificadas o sustituidas que comprenden monómeros no nativos o fragmentos de los mismos, que funcionan de manera similar. Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden ser ácidos ribonucleico (ARN) o desoxirribonucleico (ADN) y pueden contener bases nativos incluyendo adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo. Las secuencias pueden contener también bases modificadas tales como xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil, 2-propil y otras alquiladeninas, 5-halouracilo, 5-halocitosina, 6-azauracilo, 6-azacitosina y 6-azatimidina, pseudouracilo, 4-tiouracilo, 8-haloadenina, 8-aminoadenina, 8-tioladenina, 8-tio-alquiladeninas, 8-hidroxiladenina y otras adeninas 8-sustituidas, 8-haloguaninas, 8-aminoguanina, 8-tiolguanina, 8-tioalquilguaninas, 8-hidroxilguanina y otras guaninas 8-sustituidas, otros aza y deaza uracilos, timidinas, citosinas, adeninas o guaninas, 5-trifluorometil uracilo y 5-trifluorcitosina.

En la presente memoria se dan a conocer nuevos promotores específicos para semillas de lino útiles para la expresión de genes no nativos en semillas de lino y semillas de otras especies vegetales. Los promotores pueden utilizarse para modificar, por ejemplo, la composición de las proteínas, aceite o polisacárido de las semillas. En una forma de realización preferida, el promotor específico de la semilla comprende:

La expresión "secuencia que presenta homología de secuencia sustancial" se refiere a las secuencias de ácido nucleico que presentan variaciones de secuencia ligeras o sin importancia de las secuencias en (a) o (b), es decir, la función de las secuencias en sustancialmente la misma manera y son capaces de dirigir la expresión específica de la semilla de secuencias de ácido nucleico no nativo. Las variaciones pueden ser atribuibles a mutaciones locales o a modificaciones estructurales. Las secuencias de ácido nucleico que presentan homología sustancial incluyen las secuencias de ácido nucleico que presentan por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos 85% y más preferentemente del 90 al 95% de identidad con las secuencias de ácido nucleico que comprenden los nucleótidos 1 a 2.023 como se muestra en la Figura 1 (SEC. ID nº: 1) en la que T puede ser asimismo U, los nucleótidos 21 a 1.852 como se muestra en la Figura 2 (SEC. ID nº: 4) en la que T puede ser asimismo U, los nucleótidos 1 a 400 como se muestra en la Figura 3 (SEC. ID nº: 6) en la que T puede ser asimismo U o los nucleótidos 1 a 2.034 como se muestra en la Figura 4 (SEC. ID nº: 8) en la que T puede ser asimismo U.

La expresión "secuencia que hibrida" hace referencia a una secuencia de ácido nucleico que puede hibridar una secuencia de (a), (b), (c) o (d) en condiciones de hibridación severas. Las "condiciones de hibridación severas" apropiadas que favorecen la hibridación del ADN son conocidas por los expertos en la materia, o pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, pueden emplearse las siguientes: 6,0 \times cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido de un lavado de 2,0 \times SSC a 50ºC. La severidad puede seleccionarse basándose en las condiciones utilizadas en la etapa de lavado. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado puede seleccionarse de entre una gran severidad de aproximadamente 0,2 \times SSC a 50ºC. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede ser en condiciones de alta severidad, de aproximadamente 65ºC.

La expresión "una secuencia de ácido nucleico que es un análogo" significa una secuencia de ácido nucleico que ha sido modificada en comparación con la secuencia de (a), (b) o (c) en la que la modificación no altera la utilidad de la secuencia (es decir, como promotor específico de la semilla) como se describe en la presente memoria. La secuencia o análogo modificado puede presentar propiedades mejoradas sobre la secuencia representada en (a), (b) o (c). Un ejemplo de una modificación para preparar un análogo consiste en sustituir una de las bases nativos (es decir, adenina, guanina, citosina o timidina) de la secuencia representada en la Figura 1, Figura 2, Figura 3 o Figura 4 por una base modificada tal como xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil, 2-propil y otras alquiladeninas, 5-halouracilo, 5-halocitosina, 6-azauracilo, 6-azacitosina y 6-azatimidina, pseudouracilo, 4-tiouracilo, 8-haloadenina, 8-aminoadenina, 8-tioladenina, 8-tiol-alquiladeninas, 8-hidroxiladenina y otras adeninas 8-sustituidas, 8-haloguaninas, 8 aminoguanina, 8-tiolguanina, 8-tioalquilguaninas, 8-hidroxilguanina y otras guaninas 8-sustituidas, otros aza y deaza uracilos, timidinas, citosinas, adeninas o guaninas, 5-trifluorometil uracilo y 5-trifluorcitosina.

Otro ejemplo de una modificación consiste en incluir heteroátomos modificados de fósforo u oxígeno en el eje central del fosfato, enlaces interazúcar de alquilo de cadena corta o cicloalquilo o enlaces interazúcar heteroatómicos de cadena corta o heterocíclico en la molécula de ácido nucleico representada en la Figura 1, Figura 2, Figura 3 o Figura 4. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico pueden contener fosforotioatos, fosfotriésteres, fosfonatos de metilo y fosforoditioatos.

Otro ejemplo de un análogo de una molécula de ácido nucleico de la invención consiste en un ácido nucleico peptídico (ANP) en el que el eje central de fosfato de desoxirribosa (o ribosa) en el ADN (o ARN), se sustituye por un eje central de poliamida que es similar al encontrado en los péptidos (P.E. Nielsen, et al. Science 1991, 254, 1497). Se ha demostrado que los análogos de APN son resistentes a la degradación por enzimas y tienen vidas prolongadas in vivo e in vitro. Los APN también se unen más fuerte a una secuencia de ADN complementario debido a la falta de repulsión de carga entre la cadena de APN y la cadena de ADN. Otros análogos de ácido nucleico pueden contener ejes centrales de polímero que contienen nucleótidos, ejes centrales cíclicos o ejes centrales acíclicos. Por ejemplo, los nucleótidos pueden presentar estructuras con eje central de morfolino (patente US nº 5.034.506). Los análogos pueden contener también grupos tales como grupos indicadores, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas de la secuencia de ácido nucleico.

Según la presente invención, las secuencias híbridas de ácido nucleico pueden incorporarse de forma conocida en un vector de expresión recombinante que asegura una buena expresión en la célula de la semilla. Por consiguiente, la presente invención incluye un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico híbrida de la presente invención adecuada para la expresión en una célula de semilla.

La expresión "adecuado para la expresión en una célula de semilla" significa que los vectores con expresión recombinante contienen la secuencia híbrida de los ácidos nucleicos de la invención, una zona reguladora y una zona de terminación, seleccionada basándose en la célula de semilla que se debe utilizar para la expresión, que está operativamente unida a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la composición de aminoácidos deseable. Operativamente unida significa que la secuencia de ácido nucleico quimérica que codifica el polipéptido está unida a una secuencia reguladora y la zona de terminación que permite la expresión en la célula de la semilla. Un constructo típico consta, en la dirección 5' a 3' de una zona reguladora completa de un promotor capaz de dirigir la expresión en una planta, una zona de codificación del polipéptido y una zona funcional de terminación de la transcripción en las células vegetales. Estos constructos pueden prepararse según la metodología bien conocida por los expertos en biología molecular (véase por ejemplo: Sambrook et al. (1990), Molecular Cloning, 2ª ed. Cold Spring Harbor Press). La preparación de los constructos puede implicar técnicas tales como la digestión con restricción, ligadura, electroforesis en gel, secuenciado de ADN y PCR. Está disponible una amplia variedad de vectores de clonación para realizar las etapas de clonación necesarias. Con este objeto son especialmente adecuados los vectores de clonación con un sistema de replicación que es operativo en Escherichia coli tal como pBR322, la serie pUC, la serie M13mp, pACYC184, pBluescript, etc. Pueden introducirse secuencias de ácido nucleico en estos vectores y pueden utilizarse vectores para transformar E. coli que puede desarrollarse en un medio apropiado. Pueden recuperarse los plásmidos de las células en la recogida y lisado de las células. Pueden introducirse constructos finales en vectores vegetales compatibles con la integración en la planta tal como los plásmidos Ti y Ri.

En las formas de realización preferidas de la presente invención, el promotor específico de la semilla de lino confiere a la secuencia de ácido nucleico no nativo por lo menos una característica de expresión que es similar o idéntica a una característica de expresión comunicada a la secuencia de ácido nucleico nativo por el promotor nativo. La expresión "característica de la expresión" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cualquier propiedad o efecto mensurable comunicado por el promotor específico de la semilla de lino a la secuencia de ácido nucleico operativamente unida al promotor específico de la semilla de lino. Por lo tanto en las formas de realización preferidas, el desarrollo cronológico de la expresión en el ciclo vital de la planta, de la secuencia de ácido nucleico no nativo es similar o idéntico al desarrollo cronológico de expresión de la secuencia de ácido nucleico nativo. En las formas de realización preferidas adicionales, el nivel de expresión de la secuencia de ácido nucleico heteróloga es similar o idéntico al nivel de expresión de la secuencia de ácido nucleico nativo. En las formas de realización específicas adicionales todavía, la respuesta del gen no nativo a las alteraciones en las condiciones de iluminación, cambios de la longitud de onda o de la intensidad de la luz por ejemplo, cambios de temperatura, dañado del tejido, cambios de concentración de agentes químicos, tal como por ejemplo fitohormonas y plaguicidas, es similar a la respuesta de la secuencia del ácido nucleico nativo a estos estímulos. Otras características de expresión deseadas comunicadas por un promotor específico de la semilla de lino pueden ser reconocidas por los expertos en la materia y por consiguiente puede seleccionarse un promotor específico de la semilla de lino.

En la presente invención, el promotor específico de la semilla utilizado es un promotor de oleosina, un promotor de la proteína de almacenamiento de la semilla de tipo legúmina o un promotor de la proteína de almacenaje 2S. En las formas de realización particularmente preferidas el promotor específico de semilla presenta la secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 2.023 representados en la Figura 1 en la que T puede ser asimismo U, los nucleótidos 21 a 1.852 como se presentan en la Figura 2 en la que T puede ser asimismo U, los nucleótidos 1 a 400 representados en la Figura 3 en la que T puede ser asimismo U o los nucleótidos 1 a 2.034 como se presentan en la Figura 4 en la que T puede también ser U o cualquiera de las secuencias de ácido nucleico obtenibles a partir del lino e hibridación hasta una cualquiera de estas cuatro secuencias de ácido nucleico en condiciones severas.

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Pueden utilizarse promotores específicos de la semilla de lino adicionales según la presente invención. Estos promotores pueden obtenerse de numerosas formas. Cuando se ha aislado una proteína de la semilla de lino, puede secuenciarse parcialmente, de modo que puede diseñarse una sonda de ácido nucleico para identificar el ARN específico para la semilla. Para aumentar más el ARN específicamente asociado con la semilla, puede prepararse ADNc a partir de células de semilla y el ADNc puede sustraerse con ARNm o ADNc de las células que no sean de semilla. El ADNc de la semilla restante puede utilizarse a continuación para sondar un banco de ADN genómico para las secuencias complementarias. Pueden obtenerse posteriormente secuencias que hibridan el ADNc y puede aislarse la zona asociada del promotor. Es posible también cribar los bancos de ADN genómico preparados a partir de tejidos de semilla de lino que utilizan conocidos genes específicos para la semilla de otras especies vegetales y posteriormente aislar sus promotores asociados. Debido a la abundancia relativa de las proteínas de almacenamiento de la semilla en semillas también es posible obtener la información de la secuencia por secuenciado al azar de los bancos de ADNc de proteínas de almacenamiento en la semilla. Estas secuencias de ADNc que corresponden a la secuencia de proteínas conocidas de almacenamiento de la semilla pudieron utilizarse para identificar el promotor asociado. Las bases de datos que contienen la información de la secuencia del secuenciado a gran escala del ejemplo de Arabidopsis y maíz pueden investigarse para las proteínas y/o promotores específicos de la semilla conocidos y la información puede utilizarse para identificar las secuencias del promotor en el lino que comparten la similitud de secuencia. Pueden utilizarse métodos alternativos para aislar promotores específicos de la semilla de lino adicionales y los expertos en la materia pueden descubrir nuevos promotores específicos de la semilla de lino y utilizarse según la presente invención.

La secuencia de ácido nucleico de interés unida al promotor puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico de interés incluyendo cualquier secuencia de ARN o ADN que codifique un péptido o proteína de interés, por ejemplo, una enzima o una secuencia complementaria a una secuencia genómica, donde la secuencia genómica puede ser por lo menos una de entre un marco de lectura abierto, un intrón, una secuencia principal no codificadora o cualquier secuencia en la que la secuencia complementaria inhiba la transcripción, el tratamiento del ARN mensajero, por ejemplo corte y empalme o traducción. La secuencia de ácido nucleico de interés puede ser sintética, derivada de forma nativa o una combinación de ésta. La secuencia de ácido nucleico de interés podría ser asimismo un fragmento de la secuencia nativa, por ejemplo incluir sólo el dominio catalítico o una estructura de particular importancia. Dependiendo de la secuencia de ácido nucleico de interés, puede ser deseable sintetizar la secuencia con codones preferidos de la planta. Los codones preferidos de la planta pueden determinarse a partir de los codones de mayor frecuencia en las proteínas expresadas en la cantidad mayor en determinadas especies vegetales de interés.

La secuencia de ácido nucleico de interés puede codificar cualquiera de las variedades de proteínas recombinantes. Ejemplos de proteínas recombinantes que pueden expresarse por los métodos de la presente invención comprenden las proteínas con una función catalítica favorable o una proteína valiosa que se acumule en grandes cantidades y se extraiga si se desea. Las proteínas con una función catalítica, incluyen, pero no se limitan a, las proteínas que confieren un nuevo fenotipo bioquímico en las semillas en desarrollo. Los nuevos fenotipos podrían incluir modificaciones tales como la proteína de la semilla alterada o la composición de aceite de la semilla o la composición de polisacárido de la semilla, el aumento de producción de los productos deseables preexistentes o propiedades y la reducción o incluso la supresión en un producto génico indeseable utilizando tecnologías de cadena complementaria, ribozimas o supresión conjunta (Izant y Weintraub (1984) Cell 26: 1007-1015, cadena complementaria; Hazelhoff y Gerlach (1988) Nature 334: 585-591, ribozimas; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2: 279-289, supresión conjunta).

Es de esperar que las proteínas deseadas se expresen en todos los tejidos embrionarios, aunque la expresión celular variable puede detectarse en diferentes tejidos embrionarios tal como el eje embrionario y los cotiledones. La secuencia de ácido nucleico de interés puede expresarse en cualquier etapa en el desarrollo de la semilla. El desarrollo cronológico de la expresión puede depender de la utilización en concreto de la invención. La expresión de enzimas implicadas en la modificación del aceite puede ser deseable inicialmente en el desarrollo de la semilla, por ejemplo antes de la acumulación de la proteína de almacenamiento de la semilla.

Además de la zona del promotor y de la secuencia de ácido nucleico de interés, una secuencia de ácido nucleico capaz de terminar la transcripción está incluida normalmente en los vectores de expresión. Los terminadores de la transcripción son preferentemente de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000 pares de bases de nucleótidos y pueden comprender cualquiera de dichas secuencias operativas en las plantas, tal como la zona de terminación de nopalina sintetasa (Bevan et al. (1983) Nucl. Acid. Res. 11: 369-385), el terminador de faseolina (van der Geest et al., (1994) Plant J. 6(3): 413-423), el terminador para el gen de octopina sintetasa de Agrobacterium tumefaciens u otros elementos que operen de manera similar. Estas zonas del terminador de transcripción pueden obtenerse tal como describe An (1987), Methods in Enzym. 153: 292 o están ya presentes en los plásmidos disponibles en fuentes comerciales tal como ClonTech, Palo Alto, California. La selección del terminador apropiado puede tener un efecto de la velocidad de transcripción.

El constructo híbrido puede comprender además potenciadores tal como el AMV principal (Jobling y Gehrke (1987), Nature 325: 622-625) o intrones. Debería entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la selección de la especie vegetal y/o el tipo de polipéptido que debe expresarse.

Los vectores de expresión normalmente contendrán además un gen marcador. Los genes marcadores comprenden todos los genes que permitan la distinción de células vegetales transformadas de las células no transformadas, incluyendo los genes marcadores seleccionables e identificables. De manera conveniente, un marcador puede ser un marcador de resistencia para un herbicida, por ejemplo, glifosato o fosfinotricina, o para un antibiótico tal como kanamicina, G418, bleomicina, higromicina, cloranfenicol y similares, que confieren un rasgo que puede seleccionarse por medios químicos. Pueden emplearse marcadores identificables para identifica los transformantes por observación. Incluyen pero no se limitan a la b-glucuronidasa o al gen uidA, a un gen de b-lactamasa o a una proteína verde fluorescente (Niedz et al. (1995) Plant Cell Rep. 14: 403).

Para introducir las secuencias de ácido nucleico en las células vegetales en general están a disposición del especialista experto varias técnicas. Se ha publicado la transformación mediada por Agrobacterium para las células vegetales de lino y pueden obtenerse transformantes de lino mediante los métodos dados a conocer por Dong y McHughen (1993) Plant Science 88: 61-77, aunque pueden utilizarse asimismo otras varias técnicas (véase a continuación) para introducir los constructos de ADN híbrido en las células de lino si así se desea.

Las plantas de lino transformadas son cultivadas según las prácticas agrícolas convencionales conocidas por un experto en la materia se deja que planten la semilla. La semilla de lino puede extraerse a continuación de las plantas de lino maduras y analizarse las propiedades alteradas deseadas con respecto a la semilla nativa.

Pueden cultivarse dos o más generaciones de plantas y cruzarse o autopolinizarse para permitir la identificación de las plantas y cepas con las características fenotípicas deseadas que incluyen la producción del polipéptido recombinante. Puede ser deseable asegurar la homozigosidad en las plantas para asegurar la herencia continua de la característica recombinante. Los métodos para seleccionar las plantas homocigóticas son bien conocidos por los expertos en materia de cultivo vegetal e incluyen la autopolinización repetida y la selección y cultivo de anteras y microsporas. Las plantas homozigóticas pueden obtenerse asimismo por transformación de células o tejidos haploides seguida de la regeneración de los plantones haploides convertidos posteriormente en plantas diploides mediante cualquiera de los numerosos medios conocidos (p. ej. tratamiento con colchicina u otros agentes microtubulares de destrucción).

La presente invención proporciona además semillas de lino transgénicas preparadas según un método que comprende:

(1): un promotor específico de la semilla obtenido del lino; y

(c): cultivar dicha célula vegetal de lino en una planta madura capaz de plantar la semilla, en el que dicha secuencia de ácido nucleico de interés se expresa en la semilla bajo el control de dicho promotor específico de la semilla, en el que específico de la semilla significa que un gen expresado bajo el control del promotor se expresa principalmente en las semillas de la planta con menos del 5% del nivel de expresión general en otros tejidos vegetales y en el que dicho promotor específico de la semilla de lino es un promotor de oleosina, un promotor de la proteína de almacenamiento 2S o un promotor de la proteína de almacenamiento de la semilla de tipo legúmina.

Las secuencias específicas del promotor comprenden los nucleótidos 1 a 2.023 representados en la Figura 1 (SEC. ID. nº: 1) en la que T puede ser asimismo U, los nucleótidos 21 a 1.852 como se presentan en la Figura 2 (SEC. ID. nº: 4) en la que T puede ser asimismo U, los nucleótidos 1 a 400 representados en la Figura 3 (SEC. ID. nº: 6) en la que T puede ser asimismo U y los nucleótidos 1 a 2.034 representados en la Figura 4 (SEC. ID. nº: 8) en la que T puede también ser U.

La presente invención proporciona además plantas de lino capaces de plantar semillas preparadas según un método que comprende:

(1): un promotor específico de la semilla obtenido del lino; y

(2): una secuencia de ácido nucleico de interés en el que dicho ácido nucleico de interés no es nativo de dicho promotor específico de la semilla;

La presente invención proporciona además métodos de utilización de nuevos promotores que comprenden los nucleótidos 1 a 2.023 representados en la Figura 1 (SEC. ID. nº: 1) en la que T puede ser asimismo U, los nucleótidos 21 a 1.852 representados en la Figura 2 (SEC. ID. nº: 4) en la que T puede ser asimismo U, los nucleótidos 1 a 400 representados en la Figura 3 (SEC. ID. nº: 6) en la que T puede ser asimismo U y los nucleótidos 1 a 2.034 representados en la Figura 4 (SEC. ID. nº: 8) en la que T puede también ser U, en otras especies vegetales aparte del lino. Por consiguiente, en la presente memoria se dan a conocer la preparación de constructos híbridos de ácido nucleico que comprenden un promotor seleccionado de entre el grupo de promotores que comprenden los nucleótidos 1 a 2.023 representados en la Figura 1 en la que T puede ser asimismo U, los nucleótidos 21 a 1.852 representados en la Figura 2 en la que T puede ser asimismo U, los nucleótidos 1 a 400 representados en la Figura 3 en la que T puede ser asimismo U y los nucleótidos 1 a 2.034 representados en la Figura 4 en la que T puede también ser U, y una secuencia de ácidos nucleicos de interés y la expresión de manera específica para la semilla de la secuencia de ácido nucleico de interés en otras especies vegetales aparte del lino y bajo el control del promotor del lino.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en las semillas vegetales que comprende:

(a): introducir la secuencia de ácido nucleico híbrida que comprende

(1): una primera secuencia de ácido nucleico que comprende un promotor específico para la semilla obtenido a partir del lino que comprende:

(i): una secuencia de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1 a 2.023 representados en la Figura 1 (SEC. ID. nº: 1) en la que T puede ser asimismo U; los nucleótidos 21 a 1.852 representados en la Figura 2 (SEC. ID. nº: 4) en la que T puede ser asimismo U; una secuencia de ácidos nucleicos que comprende los nucleótidos 1 a 400 representados en la Figura 3 (SEC. ID. nº: 6) en la que T puede ser asimismo U; o una secuencia de ácidos nucleicos que comprende los nucleótidos 1 a 2.034 representados en la Figura 4 (SEC. ID. nº: 8) en la que T puede también ser U;

(ii): una secuencia de ácido nucleico que hibrida una secuencia de ácido nucleico de (a) en condiciones de hibridación severas;

(iii): una secuencia de ácido nucleico que es complementaria con la secuencia de ácido nucleico de (a); o

(iv): una secuencia de ácido nucleico que presenta por lo menos 65% de identidad con una secuencia de ácido nucleico de (a); y

(2): una segunda secuencia de ácido nucleico no nativo de dicho promotor específico de semillas de lino; en el que el medio específico de la semilla significa que un gen expresado bajo el control del promotor está predominantemente expresado en las semillas vegetales con menos del 5% del nivel de expresión global en otros tejidos vegetales en una célula vegetal,

(b): cultivar dicha célula vegetal en una planta madura capaz de plantar la semilla, en la que dicha secuencia de ácido nucleico de interés se expresa en la semilla bajo el control de dicho promotor específico de la semilla.

Están disponibles una variedad de técnicas para la introducción de secuencias de ácido nucleico, en particular de ADN, en las células huésped vegetales en general. Por ejemplo, pueden introducirse constructos híbridos de ADN en las células huésped extraídas de plantas dicotiledóneas, tal como el tabaco, y de especies oleaginosas, tal como Brassica napus utilizando vectores normales de Agrobacterium mediante un protocolo de transformación tal como el descrito por Moloney et al. (1989), Plant Cell Rep. 8: 238-242 o Hinchee et al. (1988) Bio/Technol. 6: 915-922; u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, la utilización de T-ADN para la transformación de células vegetales ha recibido extensos estudios y está ampliamente descrita en el documento EP 0 120 516, Hoekema et al., (1985), capítulo V en: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters BV, Alblasserdam); Knauf et al. (1983), Genetic Analysis of Host Expression by Agrobacterium, pág. 245, en: Molecular Genetics of Bacteria-Plant Interaction, Puhler, A. ed. Springer-Verlag, NY); y An et al., (1985), (EMBO J., 4: 277-284). La transformación de Agrobacterium puede utilizarse también para transformar especies vegetales de monocotiledóneas (patente U.S. nº 5.591.616).

De forma conveniente, pueden cultivarse explantes con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes que permitan la transferencia del constructo de transcripción en la célula huésped. Siguiendo la transformación que utiliza Agrobacterium las células vegetales se dispersan en un medio apropiado para la selección, posteriormente se recuperan los callos, los brotes y finalmente las plantas. El huésped de Agrobacterium albergará un plásmido que comprende los genes vir necesarios para la transferencia del T-ADN a las células vegetales. Para la inyección y electroporación (véase a continuación) pueden introducirse plásmidos Ti sin brazos (que carecen de genes tumorales, particularmente la zona del T-ADN) en la célula vegetal.

La utilización de técnicas sin Agrobacterium permite la utilización de constructos descritos en la presente memoria para obtener la transformación y expresión en una amplia variedad de especies vegetales monocotiledóneas y dicotiledóneas. Estas técnicas son especialmente útiles para la transformación de especies vegetales que son intratables en un sistema de transformación con Agrobacterium. Otras técnicas para la transferencia génica comprenden el bombardeo con partículas (Sanford, (1988), Trends in Biotechn. 6: 299-302), electroporación (Fromm et al., (1985), PNAS USA, 82: 5824-5828; Riggs y Bates, (1986), PNAS USA 83: 5602-5606), absorción de ADN mediada por PEG (Potrykus et al., (1985), Mol. Gen. Genetics., 199: 169-177), microinyección (Reich et al., Bio/Tech. (1986) 4: 1001-1004) y filamentos de carburo de silicona (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Rep. 9: 415-418).

En una aplicación específica adicional tal como para B. napus, las células huésped dirigidas para recibir constructos de ADN recombinante procederán típicamente de peciolos de cotiledónea como describe Moloney et al. (1989) Plant Cell Rep. 8: 238-242. Otros ejemplos que utilizan semillas de aceite comercial incluyen la transformación del cotiledón en explantes de soja (Hinchee et al., (1988) Bio/Technol. 6: 915-922) y las transformaciones del tallo del algodón (Umbeck et al., (1987) Bio/Technol. 5: 263-266).

Después de la transformación, las células, por ejemplo discos foliares, se cultivan en medio selectivo. Una vez comienzan a salir los brotes, se escinden y se colocan en medio de enraizamiento. Una vez se han formado suficientes raíces, se transplantan las plantas al suelo. Se ha demostrado la presencia de un marcador en supuestas plantas transformadas. La transferencia Southern en ADN genómico se realiza utilizando una sonda apropiada, para mostrar la integración en el genoma de la célula huésped.

Los métodos proporcionados por la presente invención pueden utilizarse juntamente con una amplia gama de especies vegetales. Las células vegetales particularmente preferidas empleadas de acuerdo con la presente invención incluyen las células de las plantas siguientes: soja (Glycine max), semilla de colza (Brassica napus, Brassica campestris), girasol (Helianthus annuus), algodón (Gossypium hirsutum), maíz (Zea mays), tabaco (Nicotiana tobacum), alfalfa (Medicago sativa), trigo (Triticum sp.), cebada (Hordeum vulgare), avena (Avena sativa L.), sorgo (Sorghum bicolor), Arabidopsis thaliana, patata (Solanum sp.), lino/semilla de lino (Linum usitatissimum), cártamo (Carthamus tinctorius), palma de aceite (Eleais guineeis), cacahuete (Arachis hypogaea), nuez de Brasil (Bertholletia excelsa), coco (Cocus nucifera), ricino (ricinos communis), cilantro (Coriandrum sativum), calabaza (Cucurbita maxima), jojoba (Simmondsia chinensis) y arroz (Oryza sativa).

La presente invención presenta una variedad de utilizaciones que incluyen la mejora del valor intrínseco de las semillas vegetales mediante su acumulación de polipéptidos alterados o de nuevos péptidos recombinantes o mediante la incorporación o eliminación o una etapa metabólica. La utilización de la invención puede producir mejor calidad de proteína (por ejemplo, aumento de concentraciones o de aminoácidos esenciales o raros), mejor calidad del líquido mediante una modificación de la composición del ácido graso o mejora o aumento de la composición de carbohidratos. Los ejemplos incluyen la expresión de las proteínas ricas en azúcar, tales como las que se encuentran en los altramuces o en las nueces de Brasil en una semilla deficiente en aminoácidos sulfurosos. Podría también conseguirse una mejor calidad de proteína mediante la expresión de una proteína o de un fragmento de proteína que está enriquecido en aminoácidos esenciales incluyendo lisina, cisteína, metionina y triptófano. Como alternativa, podría expresarse una acilcoenzima A grasa, una enzima transferasa capaz de modificar las proporciones de ácido graso en los triglicéridos (almacenamiento de lípido). En los casos en los que se permite que se acumule en la semilla una proteína recombinante, la proteína podría ser también un péptido que presenta un valor farmacéutico o industrial. En este caso, el péptido podría extraerse de la semilla y utilizarse en bruto o purificada, según proceda, para la utilización deseada. También, los polipéptidos que se expresan en las semillas pueden ser fragmentos, derivados o la proteína nativa. Las proteínas farmacéuticamente útiles pueden incluir, pero no se limitan a, anticoagulantes, tales como hirudina, anticuerpos, incluyendo los anticuerpos monoclonales y los fragmentos de anticuerpo, vacunas, citocinas o factor de crecimiento tales como el factor de crecimiento bovino, el factor de diferenciación colinérgica (CDF), el factor neurótropo ciliar (CNTF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento de peces, gonadotropina, el factor estimulante de granulocitos-colonias (G-CSF), el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), la hormona de crecimiento humano, interferón alfa (IFN-a), interferón beta (IFN-b), interferón gamma (IFN-g), interleucina 1-alfa (IL1-a), interleucina 1-beta (IL1-b), interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL-3), interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10), factor inhibidor de leucemia (LIF), tiorredoxina, factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de crecimiento mielomonocítico, factor de crecimiento de nervios (NGF), oncostatina M, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), prolactina, factor alfa transformante del crecimiento (TGF-a), factor beta2 transformante del crecimiento (TGF-b2), factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a) y factor beta de la necrosis tumoral (TNF-b). Las proteínas farmacéuticamente útiles pueden también incluir proteínas de mamífero, por ejemplo, pero no limitadas a a-1-antitripsina, proteínas antiobesidad, proteínas de la sangre, colágeno, colagenasa, elastina, elastasa, enteropeptidasa, fibrinógeno, hemoglobina, albúmina del suero humano, insulina, lactoferrina, mioglobina y proteínas tensioactivas pulmonares.

Los péptidos útiles en la industria pueden incluir, pero no están limitados a a-amilasa u otras amilasas, amiloglucosidasa, arabinasa, catalasa, celobiohidrolasa, celulasas, quitinasas, quimiotripsina, deshidrogenasas, endo-glucanasa, quimiosina, endo-galactanasa, esterasas, b-galactosidasa, a-galactosidasa u otras galactosidasas, lipasas gástricas, glucanasas, glucosa isomerasa, hemicelulasas, hidrolasas, isomerasa, ligninasas, lipasas, liasas, lisozimas, oxidasas, oxidorreductasa, papaína, pectinasas, pectina liasa, peroxidasas, fosfatasas, fitasa, proteasas, pululanasas, reductasas, serina proteasas, tiorredoxina, transferasa, tripsina y xilanasa.

Los siguientes ejemplos no limitativos son ilustrativos de la presente invención:

Ejemplos

Ejemplo 1

Aislamiento de promotores de lino específicos de la semilla

Se aislaron clones de ADNc específicos de la semilla para formar un banco de ADNc específico de la semilla de lino. Se secuenciaron estos clones de ADNc y se utilizó la Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) para comparar estas secuencias frente a otras en las bases de datos públicas tales como Genbank. Esta comparación puso de manifiesto que la secuencia de aminoácidos deducida de varios de los ADNc aislados presentaba un grado elevado de similitud con la clase de oleosinas tanto de bajo como de alto peso molecular, proteínas de almacenamiento 2S-albúmina y de tipo legúmina. Se prepararon sondas individualmente de (fracciones de) los ADNc que codifican oleosinas, albúmina 2S y proteínas de almacenamiento de tipo legúmina y éstas se utilizaron para cribar un banco genómico preparado a partir de la línea Forge de lino que es homocigótica para cuatro genes con resistencia al enmohecimiento (Anderson et al. (1997), The Plant Cell 9: 641-651). Se identificaron varios clones lambda positivos para cada sonda después de la identificación por alta severidad. Se subclonaron las inserciones en el vector del plásmido pBluescript y se secuenciaron. La información de la secuencia puso de manifiesto que los autores habían aislado las contrapartidas genómicas a las oleosinas, albúmina 2S y ADNc de tipo legúmina de los ADNc. La información de la secuencia de los clones genómicos que contienen secuencias que codifican unas isoformas de oleosina de alto y bajo peso molecular, la albúmina 2S y el gen de tipo legúmina se presenta en las Figuras 1 a 4 respectivamente.

La Figura 1 y la SEC. ID nº: 1 presentan la secuencia de ADN de un clon genómico de lino que codifica una proteína de oleosina de 16,0 kDa (de peso molecular bajo o L-isoforma). Se identifican y se indican los supuestos elementos reguladores. Éstos incluyen las repeticiones invertidas (pares de bases 805 a 813 y 821 a 829; pares de bases 1.858 a 1.866 y 1.877 a 1.885), repeticiones directas (pares de bases 184 a 193 y 1.102 y 1.111; pares de bases 392 a 402 y 1.701 a 1.710; pares de bases 683 a 692 y 1.546 a 1.555; pares de bases 770 a 781 y 799 a 810; pares de bases 955 a 964 y 1.936 a 1.945; pares de bases 1.483 a 1.496 y 1.513 a 1.526), elemento sensible al ácido abscísico (ABRE) (pares de bases 1.859 a 1.866), secuencia CACA (pares de bases 1.933 a 1.936), secuencia TATA (pares de bases 1.925 a 1.931) y secuencia CAT (pares de bases 1.989 a 1.993). También se indica la señal de poliadenilación (pares de bases 3.020 a 3.025). El marco de lectura abierto está interrumpido por 1 intrón corto (que están marcados) y los 2 exones están traducidos e indicados en códigos de IUPAC de aminoácidos con una sola letra.

La Figura 2 y la SEC. ID nº: 4 presentan la secuencia de ADN de un clon genómico de lino que codifica una proteína de oleosina de 18,6 kDa (de peso molecular alto o isoforma H). Se identifican y se indican los supuestos elementos reguladores. Éstos incluyen las repeticiones directas (pares de bases 14 a 25 y 1427 a 1438; pares de bases 80 a 89 y 1.242 a 1.251; pares de bases 177 a 186 y 837 a 846; pares de bases 1.281 a 1.290 y 1,242 a 1.251; pares de bases 1.591 a 1.600 y 1.678 a 1.287). El marco de lectura abierto no está interrumpido por intrones y está traducido e indicado en códigos de IUPAC de aminoácidos con una sola letra.

La Figura 3 y la SEC. ID nº: 6 presentan la secuencia de ADN del clon genómico de lino que codifica una proteína de almacenamiento 2S. El secuenciado de los nucleótidos de este clon puso de manifiesto que tiene un marco de lectura abierto de 174 aminoácidos que presentaba homología con el grupo de proteínas de almacenamiento 2S de la planta. La secuencia codifica un marco de lectura abierto con el 38% de similitud global con una proteína de almacenamiento 2S de Brassica oleracea, que incluye la conservación completa de la ampliación rica en glutamina QQQGQQQGQQQ (SEC. ID nº: 13). Además, el promotor del gen de la proteína de almacenamiento 2S contenía varios elementos reguladores del promotor supuesto. Éstos comprenden repeticiones ricas en AT (pares de bases 25-36, 97-108 y 167-190), repetición de tipo RY (pares de bases 240-247), elemento de tipo secuencia G (pares de bases 274-280), motivo de tipo secuencia específica de la semilla (pares de bases 285-290) y secuencia TATA (pares de bases 327-333).

La Figura 4 y la SEC. ID nº: 8 presentan la secuencia de ADN de un clon genómico de lino que codifica una proteína de almacenamiento de semillas de tipo legúmina de lino de 54,4 kDa. Este gen de la proteína de almacenamiento de la semilla tipo legúmina también se denomina "linina". La secuencia deducida de aminoácidos del gen de linina se comparó con la proteína de tipo legúmina de R. communis, con el precursor de legúmina de M. salicifolia, vQ. robur y G. hirsutum, con el precursor de glutelina de O. sativa y con una proteína de almacenamiento de la semilla 12 S de A. thaliana. El gen de linina presenta una identidad/similitud de secuencia con las proteínas correspondientes de R. communis, M. salicifolia, Q. robur, G. hirsutum, O. sativa y A. thaliana de 59/15, 47/16, 50/17, 45/17, 43/18 y 43/18 por ciento respectivamente. Se identifican y se indican los supuestos elementos reguladores en la zona del promotor. Éstos incluyen las repeticiones invertidas (pares de bases 265 a 276 y 281 a 292; pares de bases 513 a 524 y 535 a 545), repeticiones (pares de bases 1349 a 1360 y 1.367 a 1.378; pares de bases 1.513 a 1.529 y 1.554 a 1.572), elemento sensible al ácido abscísico (ABRE) (pares de bases 1.223 y 1.231), secuencia de legúmina (repeticiones de RY), (entre los pares de bases 1.223 y 1.231) y la posible zona de la secuencia de vicilina (pares de bases 1.887 a 1.894), secuencia CAAT (pares de bases 1.782 a 1.785) y secuencia TATA (pares de bases 1.966 a 1.970). Así mismo, se indica el péptido señal para el direccionamiento a la membrana ER (pares de bases 2.034 a 2.080). El marco de lectura abierto está interrumpido por 3 intrones cortos (que están marcados) y los 4 exones están traducidos e indicados en códigos de IUPAC de aminoácidos con una sola letra.

La Figura 5 presenta el análisis de transferencia Southern del ADN genómico de lino. Se aislaron de las hojas 60 \mug de ADN genómico de lino, se digirió con EcoRI (banda I), HindIII (banda 2) y BamHI (banda 3) y se cargó en las respectivas bandas. A) Se realizaron hibridaciones con ADNc de 3T marcado con 32P cebado al azar (isoforma de oleosina de lino de alto peso molecular). B) Se realizaron hibridaciones con ADNc de 7R marcado con 32P cebado al azar (isoforma de oleosina de lino de bajo peso molecular). Los resultados demuestran que tanto los ADNc de oleosina 3T (isoforma de oleosina de alto peso molecular) como de 7R (isoforma de oleosina de bajo peso molecular) se hibridan con el ADN genómico de lino. Más específicamente los resultados indican que 3T probablemente representa un gen de 2 copias en el lino, como se observa por las dos bandas en cada banda de digestión. Asimismo, 7R representa probablemente una familia multigén en el lino ya que se detectaron bandas múltiples en cada digestión.

Ejemplo 2

Expresión específica de la semilla de los genes de oleosina de lino

La Figura 6 presenta un análisis por transferencia Northern de la expresión específica de la semilla de oleosinas de lino. La hibridación Northern de los dos ARNm de oleosina en diferentes tejidos. Se extrajeron diez mg de ARN total de diferentes tejidos, R, raíz; C, cotiledón; L, hoja; S, cápsula de la semilla; E, embrión. Se sondó la membrana con (A) ADNc que codifica la isoforma (H) de alto peso molecular (idéntica a la secuencia de codificación presentada en la Figura 2) y (B) ADNc que codifica la isoforma (L) de bajo peso molecular (idéntica a la secuencia de codificación presentada en la Figura 1). Ambos transcritos se expresan solamente en el embrión y en la cápsula de la semilla, que contiene embriones.

Ejemplo 3

Expresión del desarrollo de los genes de oleosina de lino durante el desarrollo de la semilla

La Figura 7 presenta un análisis por transferencia Northern de la expresión del desarrollo de las oleosinas de lino durante el desarrollo de la semilla. Se cargaron 15 \mug por banda del ARN total en cada banda en gel de agarosa/formaldehído y se transfirieron a una membrana HybondN+. 10J: Esta membrana se sondó utilizando el clon del ADNc de oleosina de lino marcado con 32P dCTP (isoforma de bajo peso molecular). Las etapas indicadas son el número de días después de la antesis (DPA). 3T) Se cargaron 15 \mug de ARN completo por banda en cada banda en gel de agarosa/formaldehído y se transfirieron a una membrana HybondN+. 3T: Esta membrana se sondó utilizando el clon del ADNc de oleosina de lino marcado con 32P dCTP (isoforma de alto peso molecular). Ambos transcritos se expresaron muy al principio en el desarrollo (6DPA, etapa inicial de los cotiledones). La expresión es máxima a 16 hasta 20 DPA (etapa final de cotiledones) y disminuye a 22 DPA (embriones maduros).

Ejemplo 4

Expresión temporal específica de la semilla de la b-glucuronidasa (GUS) bajo el control regulador de las secuencias reguladoras de la oleosina de lino

Se prepararon dos constructos utilizando técnicas de biología molecular normalizadas (p. ej. véase Sambrook et al. (1990), Molecular Cloning, 2ª ed., Cold Spring Harbor Press, incluyendo las digestiones con enzima de restricción, ligadura y reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Constructo pSC54: Se colocó la secuencia de codificación del indicador de \beta-glucuronidasa procedente del vector GUSN358>S (Clontech Laboratories) entre la secuencia del promotor desde el nucleótido 21 al 1.852 y la secuencia del terminador desde 2.395 a 3.501 (descritas en la Figura 2). Esta inserción se clonó en pBluescript y el vector resultante se denomina pSC54.

Constructo pSC60: Se colocó la secuencia de codificación del indicador de \beta-glucuronidasa procedente del vector GUSN358>S (Clontech Laboratories) entre la secuencia del promotor desde el nucleótido 1 al 2.023 y la secuencia del terminador desde 2.867 a 3.925 (descritas en la Figura 1). Esta inserción se clonó en pBluescript y el vector resultante se denomina pSC60.

Se introdujeron pSC54, pSC60 y un constructo GUS sin promotor (referencia) en el embrión de lino utilizando bombardeo de partículas que utiliza protocolos normalizados (p. ej. véase Abenes et al. (1997) Plant Cell informes 17: 1-7). La Figura 8 presenta la actividad de GUS del bombardeo de embriones de lino con pSC54, pSC60 y el constructo GUS sin promotor medido 48 horas después del bombardeo de partículas. Como puede observarse las secuencias reguladoras de oleosina de lino son suficientes para dirigir la expresión de GUS en los embriones de
lino.

Ejemplo 5

Expresión estable específica de la semilla de b-glucuronidasa (GUS) en el lino y Arabidopsis bajo el control regulador del promotor del gen de la proteína de almacenamiento 2S de lino

Se preparó el constructo del gen indicador GUS incorporando las zonas 5' y 3' del fragmento de ADN descrito en la Figura 3 en el vector pBI101 de GUS sin promotor de la forma siguiente.

Un amplicón de 400 bp del extremo 5' del fragmento de ADN descrito en la Figura 3 se amplió por PCR utilizando los siguientes cebadores (situación representada en la Fig. 3):

Cebador (1) en 5': \hskip0,3cm 5'-TCCACTATGTAGGTCATA-3': (SEC. ID nº: 14)

Cebador (1) en 3': \hskip0,3cm 5'-CTTTAAGGTGTGAGAGTC-3': (SEC. ID nº: 15)

Los cebadores para PCR también contenían zonas de restricción para HindIII y BamHI que se utilizaron para clonar el amplicón 5'UTR de 400 bp en las secuencias HindIII/BamHI del vector pBI101 enfrente del gen indicador GUS. Se amplió por PCR el amplicón de 736 bp de la zona 3' no traducida (3'UTR) del fragmento de ADN descrito en la Figura 3 utilizando los siguientes cebadores (posición representada en la Fig. 3):

Cebador (2) en 5': \hskip0,3cm 5'-AGGGGTGATCGATTA-3': (SEC. ID nº: 16)

Cebador (2) en 3': \hskip0,3cm 5'-GATAGAACCCACACGAGC-3': (SEC. ID nº: 17)

Los cebadores para PCR también contenían secuencias de restricción para SacI y EcoRI. La zona del terminador NOS del vector pBI101 se cortó con digestión de SacI/EcoRI y se sustituyó con el amplicón 3'UTR de 736 bp digerido igualmente del fragmento de ADN descrito en la Figura 3.

Se realizó a continuación la electroporación del constructo del indicador GUS en la cepa AGLI de Agrobacterium tumefaciens y la transformación de lino (Finnegan et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22(4): 625-633) y Arabidopsis (Valvekens et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5536-5540) se realizó según los protocolos descritos anteriormente.

Para demostrar la actividad de GUS se analizaron histológicamente varios tejidos de plantas de lino y Arabidopsis que llevan el constructo indicador GUS. En el caso del lino, el tejido de la hoja, el tejido de la raíz y los embriones de madurez media disecados de semillas en desarrollo se tiñeron para la actividad de GUS. Para Arabidopsis, se tiñeron las semillas en desarrollo para GUS in situ en sus silicuas.

Se realizó la tinción de GUS sumergiendo los tejidos en tampón histoquímico que contiene X-gluc 0,5 mM, tampón de fosfato de potasio 0,5 M (pH 7,0), EDTA 1 mM, sorbital 0,5 M, ferricianuro potásico 0,5 mM y ferrocianuro potásico 0,5 mM. La reacción de tinción se realizó durante 12 a 16 h a 37ºC y la reacción se interrumpió añadiendo etanol al 95%. Se purificaron posteriormente los tejidos de clorofila mediante lavados repetidos en etanol al 95% antes de fotografiarlos. La Figura 9 presenta pruebas evidentes de la actividad acusada de GUS en los embriones de lino en desarrollo y de semillas de Arabidopsis y ninguna prueba de la expresión del gen indicador de GUS en las raíces u hojas de lino o en las paredes de las silicuas de Arabidopsis.

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Ejemplo 6

Expresión estable específica de las semillas de b-glucuronidasa (GUS) en el lino, Arabidopsis y Brassica napus bajo el control regulador de las secuencias reguladoras del gen de la proteína de almacenamiento de tipo legúmina de lino

Se preparó un constructo utilizando técnicas de biología molecular normalizadas, que incluyen digestiones con enzima de restricción, ligadura y reacción en cadena de polimerasa (PCR). Para obtener un fragmento de ADN que contiene aproximadamente 2 kilobases en la zona de iniciación de la transcripción en 5' de la proteína de almacenamiento de la semilla de tipo legúmina de lino en una configuración adecuada para la ligadura a una secuencia de codificación de GUS, se utilizó un método basado en PCR. Éste implicaba la utilización de la reacción en cadena de polimerasa para ampliar la secuencia exacta deseada para el análisis de la expresión. Para realizar la ampliación por PCR necesaria, se sintetizaron dos cebadores de oligonucleótido (sintetizador de ADN Oligo 1000M de Beckman) que presentan las secuencias siguientes:

Cebador 5':

5'TATCTAGACTCAAGCATACGGACAAGGGT 3' (SJ-634)

(SEC. ID nº: 18)

Las bases en cursiva corresponden a las posiciones 1 a 21 de nucleótidos de la secuencia indicada en la Figura 4. Los demás nucleótidos 5' de esta secuencia en el cebador no son idénticos a la secuencia del indicador, pero se incluyeron para colocar una secuencia XbaI en el extremo 5' del producto de la ampliación. La secuencia XbaI (5'-TCTAGA-3') (SEC. ID nº: 19) está subrayada.

Se sintetizó un segundo cebador (3') que tenía la secuencia siguiente:

Cebador 3':

5'GGTTATCATTGTATGAACTGA3' (SJ-618)

(SEC. ID nº: 20)

Este cebador contiene el complemento exacto (representado en cursiva) para la secuencia indicada en la Figura 4 desde las bases 2.343 a 2.363. Este cebador no se diseñó con una secuencia de la enzima de restricción adicional debido al hecho de que la secuencia NcoI nativa (5'-CCATGG-3') (SEC. ID nº: 21) comprende el codón de iniciación entre los pares de bases 2.034 y 2.039, permitiendo de este modo la inserción del promotor de la proteína de almacenamiento en el vector de clonación apropiado.

Estos dos cebadores se utilizaron en una reacción de ampliación por PCR para producir un fragmento de ADN que contiene la secuencia entre los nucleótidos 1 y 2.342 del gen de la proteína de almacenamiento de la semilla de lino con una secuencia XbaI en el extremo 5' y una secuencia NcoI de 302 pares de bases en el extremo 3'. Se realizó la ampliación por PCR utilizando la enzima Pfu (Stratagene) que utiliza las condiciones recomendadas por el fabricante de la enzima y un programa de temperatura de 94ºC (desnaturalización) durante 1 minuto, 55ºC (hibridación) durante 1 minuto y 72ºC (elongación) durante 3,5 minutos. La plantilla era el clon genómico de la proteína de almacenamiento de la semilla de legúmina representado en la Figura 4.

El producto de la ampliación resultante se digirió posteriormente con XbaI y NcoI para eliminar la zona del promotor de 2 kb deseada. Este fragmento de promotor se clonó en las secuencias XbaI y NcoI de un plásmido denominado pGUS1318 digerido con XbaI y NcoI (plásmido pGUSN358S (Clontech Laboratories) que se cortó con NcoI y EcoRI y la inserción GUS se clonó en pBluescriptKS+ (Stratagene) que fue adaptado para contener una secuencia NcoI en la secuencia de clonación múltiple). El plásmido resultante que contiene la fusión promotor-GUS se denominó pPGUS1318. El terminador de la proteína de almacenamiento de la semilla de legúmina del lino se amplió también en el clon genómico mencionado anteriormente. Para realizar la ampliación de PCR necesaria, se sintetizaron cebadores de oligonucleótido que presentan las secuencias siguientes:

Cebador 5':

5' GCAAGCTTAATGTGACGGTGAAATAATAACGG 3' (SJ620)

(SEC. ID nº: 22)

Las bases en cursiva corresponden a las posiciones 3.780 a 3.803 de nucleótidos de la secuencia indicada en la Figura 4. Los demás nucleótidos 5' de esta secuencia en el cebador no son idénticos a la secuencia del indicador, pero se incluyeron para colocar una secuencia HindIII en el extremo 5' del producto de la ampliación. La secuencia HindIII (5'-AAGCTT-3') (SEC. ID nº: 23) está subrayada.

Se sintetizó un segundo cebador (3') que tenía la secuencia siguiente:

Cebador 3':

5'TAGGTACCTGGCAGGTAAAGACTCTGCTC3' (SJ-618)

(SEC. ID nº: 24)

Este cebador contiene el complemento exacto (representado en cursiva) para la secuencia indicada en la Figura 4 desde las bases 4.311 A 4.290. Los nucleótidos 5' adicionales de esta secuencia en el cebador no son idénticos a la secuencia del promotor, pero se incluyeron para colocar una secuencia KpnI en el extremo 5' del producto de amplificación. La secuencia KpnI (5'-GGTACC-3') (SEC. ID nº: 25) está subrayada.

Estos dos cebadores se utilizaron en una reacción de ampliación por PCR para producir un fragmento de ADN que contiene la secuencia entre los nucleótidos 3.779 y 4.311 del gen terminador de la proteína de almacenamiento de la semilla de lino con una secuencia HindIII en el extremo 5' y una secuencia KpnI en el extremo 3'. La ampliación que utiliza PCT fue la descrita anteriormente. El vector pPGUS1318 que contiene el promotor ampliado se digirió con XhoI y se trató con Klenow para crear un extremo truncado. El vector se digirió posteriormente con KpnI y la secuencia anterior del terminador ampliada se insertó de modo que se situó en 3' de la secuencia de codificación de GUS. El vector resultante que contiene el promotor de la proteína de almacenamiento de la semilla de lino, GUS y el terminador de la proteína de almacenamiento de la semilla de lino se denomina pPGUST.

La inserción XbaI-KpnI de pPGUST que contiene la secuencia promotor de linina-secuencia de codificación de GUS-secuencia del terminador de linina se ligó en las secuencias XbaI-KpnI de pSBS3000 (este vector es un derivado del plásmido pPZP221 binario de Agrobacterium (Hajdukiewicz et al., 1994, Plant Molec. Biol. 25: 989-994). En pSBS3000 el gen de resistencia a la gentamicina de la planta de pPZP221 se sustituyó por la secuencia promotor de ubiquitina del perejil-gen de fosfinotricina acetil transferasa-secuencia de terminación de ubiquitina del perejil para comunicar resistencia al glufosinato amónico del herbicida). El vector resultante se denomina pSBS2089. Además de la inserción XbaI-KpnI de pPGUST que contiene la secuencia promotor de linina-secuencia de codificación de GUS-secuencia del terminador de linina se ligó en las secuencias XbaI-KpnI del plásmido binario pCGN1559 de Agrobacterium (MacBride y Summerfield, 1990, Plant Molec. Biol. 14: 269-276, confiere resistencia al antibiótico kanamicina)). El vector resultante se denominó pSBS2083. Se realizó la electroporación de los plásmidos pSBS2089 y pSBS2083 en la cepa EHA101 de Agrobacterium. Se utilizó la cepa EHA101 (pSBS2089) de Agrobacterium para transformar el lino y se utilizó Arabidopsis, la cepa EHA101 (pSBS2083) de Agrobacterium para transformar Brassica napus. La transformación del lino se realizó esencialmente como se describe en Jordan y McHughen (1988) Plant cell informes 7: 281-284, excepto que se seleccionaron tallos transgénicos en L-fosfinotricina 10 \muM en lugar de kanamicina. Se realizó la transformación de Arabidopsis esencialmente como se describe en "Arabidopsis Protocols; Methods in Molecular Biology" vol. 82 editado por Martínez-Zapater J.M. y Salinas J. ISBN 0-89603-391-0 págs. 259-266 (1998) excepto que se seleccionaron supuestas plantas transgénicas en placas de agarosa que contienen L-fosfinotricina 80 \muM. La transformación de Brassica napus se realizó esencialmente como se describe en Moloney et al. (1989). Plant Cell informes 8: 238-242.

La Figura 10 presenta la expresión específica del tejido de GUS en plantas de lino transgénicas transformadas con un constructo del gen linina-GUS (pSBS2089). Se midió la expresión de GUS en raíces (R), tallos (S), hojas (L), brotes (B) y embrión (E). Se observó alguna expresión en los brotes y se consiguió la expresión máxima en los tejidos del embrión. No se observó ninguna expresión detectable en ninguno de los tejidos no transformados (WT).

La Figura 11 presenta la expresión temporal de GUS en plantas de lino transgénicas transformadas con un constructo del gen linina-GUS (pSBS2089). Como se puede apreciar, la expresión máxima se consigue en los embriones maduros de lino (predisecados).

La Figura 12 presenta la expresión absoluta de GUS en plantas de Brassica napus transgénicas (L1 a L9) transformadas con un constructo del gen linina-GUS (pSBS2083). Como puede apreciarse puede conseguirse un alto nivel de expresión en las plantas de Brassica napus. Cuando se comparan las plantas transgénicas individuales, puede apreciarse también una variación típica en la expresión debida al efecto de la posición.

La Figura 13 presenta la expresión de GUS en las silicuas de Arabidopsis transgénicas (transformadas con un constructo (pSBS2089) del gen de linina-GUS) durante el desarrollo de la semilla. Como puede apreciarse se puede conseguir expresión de alto nivel en los tejidos de las semillas de Arabidopsis. La máxima expresión se consigue en la etapa 4 (madura pero no totalmente disecada) del desarrollo de la semilla. No se observó ninguna expresión detectable en los tejidos distintos a los de la semilla tales como hojas, ramas, brotes y paredes de silicua (resultados no representados).

Aunque la presente invención se ha descrito haciendo referencia a los que se consideran actualmente que son los ejemplos preferidos, debe entenderse que la invención no se limita a los ejemplos expuestos. Por el contrario, la invención está destinada a cubrir varias modificaciones y disposiciones equivalentes incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

<110> Chaudhary, Sarita

\hskip1cm

van Rooijen, Gijs

\hskip1cm

Moloney, Maurice

\hskip1cm

Singh, Surinder

\hskip1cm

SemBioSys Genetics Inc.

\hskip1cm

Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation

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<120> Promotores específicos de semillas de lino

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<130> 9369-147

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<140>

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<141>

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<150> 60/151044

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<151> 1999-08-27

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<150> 60/161,722

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<151> 1999-10-27

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<160> 25

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 4305

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<212> ADN

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<213> Linum usitatissimum

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<400> 1

1

2

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<210> 2

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<211> 109

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<212> PRT

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<213> Linum usitatissimum

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<400> 2

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3

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<210> 3

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<211> 46

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<212> PRT

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<213> Linum usitatissimum

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<400> 3

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4

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<210> 4

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<211> 3501

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<212> ADN

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<213> Linum usitatissimum

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<400> 4

5

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<210> 5

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<211> 180

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<212> PRT

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<213> Linum usitatissimum

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<400> 5

7

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<210> 6

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<211> 1676

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<212> ADN

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<213> Linum usitatissimum

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<400> 6

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8

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<210> 7

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<211> 174

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<212> PRT

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<213> Linum usitatissimum

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<400> 7

9

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<210> 8

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<211> 4999

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<212> ADN

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<213> Linum usitatissimum

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<400> 8

11

12

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<210> 9

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<211> 96

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<212> PRT

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<213> Linum usitatissimum

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<400> 9

13

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<210> 10

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<211> 85

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<212> PRT

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<213> Linum usitatissimum

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<400> 10

14

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<210> 11

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<211> 165

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<212> PRT

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<213> Linum usitatissimum

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<400> 11

15

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<210> 12

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<211> 141

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<212> PRT

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<213> Linum usitatissimum

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<400> 12

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Linum usitatissimum

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln Gly Gln Gln Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccactatgt aggtcata

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctttaaggtg tgagagtc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggggtgatc gatta

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatagaaccc acacgagc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tatctagact caagcatacg gacaagggt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sitio XbaI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctaga

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttatcatt gtatgaactg a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sitio NcoI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatgg

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaagcttaa tgtgacggtg aaataataac gg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sitio HindIII

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagctt

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taggtacctg gcaggtaaag actctgctc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: sitio KpnI

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtacc

\hfill

6

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Claims

1. Método para la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en las semillas de lino que comprende las etapas siguientes:

(1): un promotor específico de la semilla obtenido del lino; y

(2): dicha secuencia de ácido nucleico de interés en la que dicho ácido nucleico de interés no es nativo de dicho promotor específico de la semilla de lino;

(c): cultivar dicha célula vegetal de lino en una planta de lino madura capaz de plantar la semilla, en el que dicha secuencia de ácido nucleico de interés se expresa en la semilla bajo el control de dicho promotor específico de la semilla, en el que específico de la semilla significa que un gen expresado bajo el control del promotor se expresa principalmente en las semillas de la planta con menos de 5% del nivel de expresión general en otros tejidos vegetales y en el que dicho promotor específico de la semilla es un promotor específico de la semilla de lino se selecciona de entre el grupo constituido por promotores de oleosina, promotores de la proteína de almacenamiento 2S y promotores de la proteína de almacenamiento de la semilla de tipo legúmina.

2. Método según la reivindicación 1, en el que por lo menos una expresión característica conferida por dicho promotor a su secuencia de ácido nucleico nativo se confiere a dicha secuencia de ácido nucleico no nativo.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicha expresión característica es el desarrollo cronológico de la expresión, el nivel de expresión, la respuesta a un cambio en las condiciones de iluminación, la respuesta a un cambio de temperatura, la respuesta a un cambio de concentración de un agente químico.

4. Método según la reivindicación 1, en el que dicho promotor de lino específico de la semilla comprende:

(a): una secuencia de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1 a 2.023 como se muestra en la Figura 1 (SEC. ID nº: 1), en la que T puede ser asimismo U;

5. Método según la reivindicación 1, en el que dicho promotor de lino específico de la semilla comprende:

(a): una secuencia de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 21 a 1.852 como se muestra en la Figura 2 (SEC. ID nº: 4), en la que T puede ser asimismo U;

6. Método según la reivindicación 1, en el que dicho promotor de lino específico de la semilla comprende:

(a): una secuencia de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1 a 400 como se muestra en la Figura 3 (SEC. ID nº: 6), en la que T puede ser asimismo U;

7. Método según la reivindicación 1, en el que dicho promotor de lino específico de la semilla comprende:

(a): una secuencia de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1 a 2.034 como se muestra en la Figura 4 (SEC. ID nº: 8), en la que T puede ser asimismo U;

8. Método según la reivindicación 1, en el que la la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico de interés produce una alteración en la composición de la proteína o del ácido graso en dicha semilla.

9. Semilla transgénica de lino preparada según un método que comprende las etapas siguientes:

(1): un promotor específico de la semilla obtenido del lino; y

(c): cultivar dicha célula vegetal de lino en una planta de lino madura capaz de plantar la semilla, en el que dicha secuencia de ácido nucleico de interés se expresa en la semilla bajo el control de dicho promotor específico de la semilla, en el que específico de la semilla significa que un gen expresado bajo el control del promotor se expresa principalmente en las semillas de la planta con menos de 5% del nivel de expresión general en otros tejidos vegetales y en el que dicho promotor es un promotor de la proteína de almacenamiento se milla, un promotor de oleosina, un promotor de la proteína de almacenamiento 2S o un promotor de la proteína de almacenamiento de la semilla de tipo legúmina.

10. Semilla transgénica de lino según la reivindicación 9, en la que por lo menos una expresión característica conferida por dicho promotor específico de la semilla a su secuencia de ácido nucleico nativo se confiere a dicha secuencia de ácido nucleico no nativo.

11. Semilla transgénica de lino según la reivindicación 10, en la que dicha expresión característica es el desarrollo cronológico de la expresión o del nivel de expresión.

12. Semilla transgénica de lino según la reivindicación 10, en la que dicho promotor específico de la semilla comprende:

13. Semilla transgénica de lino según la reivindicación 10, en la que dicho promotor específico de la semilla comprende:

14. Semilla transgénica de lino según la reivindicación 10, en la que dicho promotor específico de la semilla comprende:

15. Semilla transgénica de lino según la reivindicación 10, en la que dicho promotor específico de la semilla comprende:

16. Semilla transgénica de lino según la reivindicación 10, en la expresión de dicho gen no nativo de interés produce una alteración en la composición de la proteína o del ácido graso de la semilla.

17. Plantas transgénicas de lino capaces de plantar semillas preparadas por un método que comprende las etapas siguientes:

(1): un promotor específico de la semilla obtenido del lino; y

(c): cultivar dicha célula vegetal de lino en una planta de lino madura capaz de plantar la semilla, en la que dicha secuencia de ácido nucleico de interés se expresa en la semilla bajo el control de dicho promotor específico de la semilla, en la que específico de la semilla significa que un gen expresado bajo el control del promotor se expresa principalmente en las semillas de la planta con menos de 5% del nivel de expresión general en otros tejidos vegetales y en el que dicho promotor es un promotor de la proteína de almacenamiento de la semilla, un promotor de oleosina, un promotor de la proteína de almacenamiento 2S o un promotor de la proteína de almacenamiento de la semilla de tipo legúmina.

18. Secuencia de ácido nucleico aislada capaz de dirigir la expresión específica de la semilla en una planta, que comprende:

(e): una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico de (a), (b), (c) o (d) en condiciones de hibridación severas,

en la que expresión específica de la semilla significa que un gen expresado bajo el control de dicho ácido nucleico aislado se expresa principalmente en las semillas de la planta con menos de 5% del nivel de expresión general en otros tejidos vegetales.

19. Secuencia de ácido nucleico aislada capaz de dirigir la expresión específica de la semilla en una planta, que comprende:

(c): una secuencia de ácido nucleico que presenta por lo menos 65% de identidad con una secuencia de ácido nucleico de (a) o (b); o

(e): una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico de (a), (b), (c) o (d) en condiciones de hibridación severas;

20. Secuencia de ácido nucleico aislada capaz de dirigir la expresión específica de la semilla en una planta, que comprende:

en la que expresión específica de la semilla significa que un gen expresado bajo el control de dicho ácido nucleico aislado se expresa principalmente en las semillas de la planta con menos del 5% del nivel de expresión general en otros tejidos vegetales.

21. Secuencia de ácido nucleico aislada capaz de dirigir la expresión específica de la semilla en una planta, que comprende:

en la que expresión específica de la semilla significa que un gen expresado bajo el control de dicho ácido nucleico aisladose expresa principalmente en las semillas de la planta con menos de 5% del nivel de expresión general en otros tejidos vegetales.

22. Secuencia aislada de ácido nucleico híbrido que comprende:

(a): una primera secuencia de ácido nucleico que comprende un promotor específico para la semilla obtenido del lino que comprende:

(1): una secuencia de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1 a 2.023 como se muestra en la Figura 1 (SEC. ID nº: 1), en la que T puede ser asimismo U;

(2): una secuencia de ácido nucleico que se híbrida con una secuencia de ácido nucleico de (a) en condiciones de hibridación severas;

(b): una segunda secuencia de ácido nucleico no nativo de dicho promotor específico de la semilla de lino; en la que específica de la semilla significa que un gen expresado bajo el control del promotor se expresa principalmente en las semillas de la planta con menos de 5% del nivel de expresión general en otros tejidos vegetales.

23. Secuencia aislada de ácido nucleico híbrido que comprende:

(a): una primera secuencia de ácido nucleico que comprende un promotor específico para la semilla extraída del lino que comprende:

(1): una secuencia de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 21 a 1.852 como se muestra en la Figura 2 (SEC. ID nº: 4), en la que T puede ser asimismo U;

(b): una segunda secuencia de ácido nucleico no nativo de dicho promotor específico de la semilla de lino; en la que específico de la semilla significa que un gen expresado bajo el control del promotor se expresa principalmente en las semillas de la planta con menos de 5% del nivel de expresión general en otros tejidos vegetales.

24. Secuencia aislada de ácido nucleico híbrido, que comprende:

(a): una primera secuencia de ácido nucleico que comprende un promotor específico de la semilla extraído del lino que comprende:

(1): una secuencia de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1 a 400 como se muestra en la Figura 3 (SEC. ID nº: 6), en la que T puede ser asimismo U;

25. Secuencia aislada de ácido nucleico híbrido que comprende:

(a): una secuencia de ácido nucleico que comprende un promotor específico de la semilla extraída del lino que comprende:

(1): una secuencia de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1 a 2.034 como se muestra en la Figura 4 (SEC. ID nº: 8) en la que T puede ser asimismo U;

26. Método para la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés en una semilla vegetal, que comprende las etapas siguientes:

(a): introducir la secuencia híbrida de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 en una célula vegetal; y

(b): cultivar dicha célula vegetal en una planta madura capaz de plantar la semilla, en el que la segunda secuencia de ácido nucleico se expresa en la semilla bajo el control de dicho promotor específico de la semilla.

27. Método según la reivindicación 26, en el que dicha célula vegetal se selecciona de entre el grupo constituido por soja (Glycine max), semilla de colza (Brassica napus, Brassica campestris), girasol (Helianthus annuus), algodón (Gossypium hirsutum), maíz (Zea mays), tabaco (Nicotiana tobacum), alfalfa (Medicago sativa), trigo (Triticum sp.), cebada (Hordeum vulgare), avena (Avena sativa L.), sorgo (Sorghum bicolor), Arabidopsis thaliana, patata (Solanum sp.), lino/semilla de lino (Linum usitatissimum), cártamo (Carthamus tinctorius), palma de aceite (Eleais guineeis), cacahuete (Arachis hypogaea), nuez de Brasil (Bertholletia excelsa), coco (Cocus nucifera), ricino (ricinos communis), cilantro (Coriandrum sativum), calabaza (Cucurbita maxima), jojoba (Simmondsia chinensis) y arroz (Oryza sativa).

28. Planta preparada según el método de la reivindicación 26.

29. Célula vegetal que comprende la secuencia híbrida de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25.

30. Semilla vegetal que comprende la secuencia híbrida de ácido nucleico según las reivindicaciones 22 a 25.

31. Semilla vegetal obtenida de una planta preparada según el método de la reivindicación 26.

32. Vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico según las reivindicaciones 18 a 21.

33. Vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico según las reivindicaciones 22 a 25.