ES2261187T3

ES2261187T3 - Composiciones y metodos para modular el colesterol serico.

Info

Publication number: ES2261187T3
Application number: ES00910316T
Authority: ES
Inventors: Subroto Chatterjee
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 1999-02-24
Filing date: 2000-02-23
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2020-02-23
Also published as: DE60027551D1; DE60027551T2; EP1155121A1; JP2002537407A; CA2362549A1; ATE324106T1; EP1155121B1; AU3242900A; EP1155121A4; WO2000050574A1; AU776785B2

Abstract

Un fármaco antilipémico que comprende ceramida, que es un efector de la proteína de unión al elemento regulador de esteroles 1 (SREBP-1), y un inhibidor del colesterol sérico, que es un inhibidor de HMG CoA reductasa.

Description

Composiciones y métodos para modular el colesterol sérico.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y a usos de las composiciones para preparar composiciones farmacéuticas para modular el colesterol sérico. En un aspecto, la invención presenta nuevos fármacos antilipémicos que incluyen al menos un efector identificado, una ceramida del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL) y al menos un inhibidor del colesterol sérico identificado. En un aspecto particular, el fármaco antilipémico incluye ceramida conectada al inhibidor del colesterol sérico. Adicionalmente, se proporcionan usos como los descritos anteriormente para estabilizar o reducir significativamente niveles de colesterol sérico en un sujeto mamífero y particularmente un paciente humano.

Antecedentes de la invención

Existe un acuerdo casi universal de que el colesterol es un constituyente lipídico clave de las membranas celulares. Se entiende generalmente que el colesterol es esencial para el crecimiento y la viabilidad normales de la mayoría de los organismos superiores. Demasiado colesterol sérico se ha correlacionado con enfermedades relacionadas con lípidos que amenazan la vida, incluyendo hiperlipoproteinemia, apoplejía, enfermedad cardíaca coronaria y especialmente aterosclerosis y estados relacionados. Véanse generalmente Stryer, L. (1988) en Biochemistry, 3ª Ed. W. H. Freeman and Co. Nueva York, pp. 547-574; y Brown, M. S. y Goldstein, J. L. (1993) en The Pharmacological Basisof Therapeutics (8ª Ed.) Gilman, A. G. y otros, eds. McGraw Hill/Nueva York, pp. 874-896.

La regulación del colesterol sérico en mamíferos y particularmente primates ha atraído una atención significativa. A menudo se presenta que la regulación de la homeostasis del colesterol en seres humanos y otros mamíferos implica la regulación de la producción de colesterol, la biosíntesis de ácidos biliares y el catabolismo de portadores de colesterol sérico específicos. Importantes portadores del colesterol sérico se denominan partículas de LDL (lipoproteína de baja densidad). Se ha presentado que el receptor de LDL facilita la internalización de la partícula de LDL en aquellas células que necesitan colesterol. Véanse, por ejemplo, Brown, M. S. y Goldstein, J. L. (1986) Science 232: 34-47; y Goldstein, J. L. y Brown, (1986) Nature, 348: 425; y las referencias citadas allí.

Se ha descrito que el receptor de LDL impacta en los niveles de colesterol sérico en seres humanos. Por ejemplo ha habido un reconocimiento de que las células con bastante colesterol no forman suficientes receptores de LDL, reduciendo o incluso bloqueando de ese modo la captación de colesterol por la célula. En este caso, los niveles de colesterol sérico aumentan substancialmente, lo que puede contribuir al desarrollo o la gravedad de la enfermedad. A la inversa, las células que necesitan colesterol a menudo tienen capacidad de formar más receptores de LDL, facilitando de ese modo una disminución en el colesterol sérico. De acuerdo con esto, se ha enfocado una atención especial a regular el receptor de LDL como un sistema terapéutico para estabilizar o reducir los niveles de colesterol sérico en pacientes humanos.

En particular, se ha presentado que la transcripción del gen de receptor de LDL se suprime cuando se acumulan esteroles y se induce cuando se agotan los esteroles. Se cree que la sensibilidad a los esteroles es conferida por una secuencia de 10 pares de bases (pb) aguas arriba del gen de LDLr conocido como el elemento regulador de esteroles (SRE). Se ha presentado que la forma madura de la proteína que se une al elemento regulador de esteroles 1 (SREBP-1) se une al SRE y promueve la transcripción.

Han existido informes adicionales de que la actividad de la SREBP-1 está influenciada por la proteolisis inducida por esteroles. Existe un reconocimiento de que la proteolisis de SREBP-1 está afectada en algunos entornos por un receptor celular denominado "citoquina factor de necrosis tumoral" (TNF-\alpha).

En particular, se ha presentado que el receptor TNF-\alpha influye en una amplia gama de efectos biológicos. Sin embargo, el receptor TNF-\alpha sigue estando incompletamente caracterizado. La elucidación de las rutas de TNF-\alpha es a veces complicada por la presencia de al menos dos receptores TNF. Los receptores comparten algunos efectores comunes aguas abajo pero también la señal a través de rutas específicas del receptor. Véanse las referencias citadas posteriormente para una descripción adicional que se refiere al receptor TNF-\alpha.

Se ha sabido que una consecuencia de la señalización de TNF es la activación de esfingomielinasa neutra (N-SMasa). La esfingomielinasa neutra es una enzima unida a la membrana que cataliza la hidrólisis de esfingomielina en ceramida y fosfocolina a un óptimo de pH de 7,4. El papel de la esfingomielinasa neutra en la traducción de señales se ha relacionado en primer lugar con la capacidad para generar el segundo mensajero lipídico ceramida. Además de TNF-\alpha, se ha mostrado que el ligando receptor de Fas, la vitamina D_{3}, la interleuquina-1\beta, el factor de crecimiento nervioso, anticuerpos anti-CD28 y \gamma-interferón incrementan todos los niveles de ceramida.

En particular, las esfingomielinasas tipo-C (E.C. 3.1.4.12) son un grupo de fosfolipasas que catalizan la segmentación hidrolítica de esfingomielina a través de la siguiente reacción (1).

(1)Esfingomielina \rightarrow Ceramida + Fosfocolina

Véanse Chatterjee, Adv. Lipid Res., 26:25-48 (1993); S. Chatterjee y otros, J. Biol. Chem., 264:12, 534-12, 561 (1989) y S. Chatterjee y otros, Methods in Enzymology, Phospholipase, 197:540-547 (1991).

Además de los papeles biológicos de la esfingomielina y la ceramida en rutas de transducción de señales que implican regulación celular, ha surgido una evidencia más reciente que sugiere que las esfingomielinasas pueden estar implicadas en la homeostasis del colesterol y particularmente en la inducción de la actividad del receptor de LDL. Véase S. Chatterjee, Advances in Lipid Research, 26:25-48 (1993). Un trabajo adicional apoya un posible papel de la ceramida en la muerte celular programada y/o "apoptosis" y la activación del gen para el factor nuclear (NF)-\kappaB. Véase A. Alessenko y S. Chatterjee, Mol. Cell. Biochem., 143:169 (1995).

En la solicitud de patente francesa Nº 27477307 se sugiere el uso de ceramida sola o en combinación con un metal o vitamina E para el tratamiento de enfermedades asociadas con un alto nivel de colesterol.

Se ha sugerido que ciertas enzimas implicadas en la elaboración de colesterol ejercen un efecto significativo sobre la homeostasis del colesterol. De acuerdo con esto, ha habido un interés substancial en identificar fármacos con capacidad para modular estas enzimas, especialmente para estabilizar o reducir colesterol sérico hasta intervalos tolerables. Agentes ilustrativos incluyen inhibidores del colesterol sérico disponibles comercialmente tales como fluvastatina, simvastatina, lovastatina, pravastatina y atorvastatina. Véase Brown, M. S. y Goldstein, J. L. (1993), anteriormente, para una descripción adicional que se refiere a estos y otros agentes tales como mevinolina (compactina).

También se han realizado experimentos en los que el inhibidor del colesterol sérico lovastatina se combina con otros agentes que se sabe que disminuyen el colesterol, tales como la resina que se une a ácidos biliares colestipol, y neomicina. Véase Frishman, W.H. y Rapier, R.C., (1989) Med. Clinics. of North America 73:437-448.

Aunque se ha presentado que resultan algunos beneficios clínicos del uso de estos y otros agentes de disminución en suero, han existido informes de efectos secundarios significativos. Véanse, por ejemplo, Brown, M.S. y Goldstein, J.L. (1993), anteriormente, y Physicians' Desk Reference 1997 (51ª ed.) Medical Economics Co. De acuerdo con esto, existe una necesidad de tener fármacos que exhiban características más deseables tales como potencia mejorada y mejor tolerancia para el paciente. Existe una necesidad específica de reducir los niveles de agentes que disminuyen el colesterol administrados para algunos pacientes.

También existe una necesidad de identificar fármacos que puedan modular la proteína SREBP-1 y especialmente el receptor de LDL. Por otra parte, los métodos para identificar fármacos de interés mediante rastreo de fármacos de alto rendimiento automatizado se han basado crecientemente en una variedad de programas de desarrollo de fármacos farmacéuticos y biotecnológicos. Desgraciadamente, los fármacos requeridos para tales ensayos de rastreo de alto rendimiento no están muy extendidos. Una razón significativa de la falta de avance en esta área es el conocimiento insuficiente de las moléculas (es decir, los efectores) que afectan a la SREP-1 y al receptor de LDL.

Así, sería deseable tener fármacos antilipémicos con capacidad doble para modular el receptor de LDL y niveles de colesterol sérico. Sería particularmente deseable que tales fármacos antilipémicos pudieran administrarse a sujetos mamíferos en dosis cercanas o por debajo de las usadas actualmente con muchos inhibidores del colesterol sérico. También sería deseable tener ensayos eficaces in vitro e in vivo para identificar fármacos con potencial para modular el receptor de LDL, que impliquen particularmente la maduración de la proteína SREP-1.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere generalmente a composiciones y a usos de composiciones para preparar composiciones farmacéuticas para modular el colesterol sérico en un sujeto mamífero, más específicamente, la invención se refiere a un fármaco antilipémico que comprende ceramida, que es un efector de la proteína de unión al elemento regulador de esteroles (SREBP-1) y un inhibidor del colesterol sérico, que es un inhibidor de HMC CoA reductasa. En un aspecto particular, los fármacos incluyen una ceramida identificada conectada a un inhibidor del colesterol sérico identificado. Adicionalmente, se proporcionan métodos para identificar fármacos antilipémicos capaces de modular el receptor de LDL y específicamente la maduración de SREBP-1, incluyendo ensayos diseñados para identificar fármacos ca-
paces de estabilizar o reducir los niveles de colesterol sérico en un mamífero y particularmente un paciente humano.

De acuerdo con esto, en un aspecto específico, la invención se refiere a un método ex vivo para determinar la capacidad terapéutica de un fármaco antilipémico como el definido anteriormente para tratar una enfermedad relacionada con el colesterol en un mamífero, comprendiendo el método:

a): proporcionar una población de células capaces de expresar SREBP-1,

b): poner en contacto las células con el fármaco antilipémico en una cantidad suficiente para inducir la maduración de la SREBP-1,

c): cultivar las células en medio; y

d): detectar la maduración de la SREBP-1 como indicativa de la capacidad terapéutica del fármaco antilipémico para tratar la enfermedad.

Se ha descubierto un amplio espectro de composiciones y métodos para tratar o prevenir trastornos modulados por colesterol. A veces, los trastornos se denominarán aquí "trastornos relacionados con el colesterol" o un término similar. Más específicamente, se han identificado fármacos antilipémicos que incluyen al menos una ceramida identificada y al menos un inhibidor del colesterol sérico identificado. Los fármacos antilipémicos particulares de esta invención tienen habitualmente uno de cada componente, aunque se contemplan fármacos que tienen múltiples efectores e inhibidores (por ejemplo, entre aproximadamente 2 y 5 de cada uno). Los fármacos antilipémicos preferidos presentan características definidas específicamente tales como capacidad para estabilizar o reducir los niveles de colesterol sérico en un sujeto mamífero según se determina mediante ensayos in vitro o in vivo descritos posteriormente.

Más específicamente, la presente invención proporciona una variedad de fármacos antilipémicos específicos y el uso de los mismos para la preparación de una composición farmacéutica para modular el nivel de colesterol sérico en un mamífero y/o para tratar un trastorno en un mamífero asociado con altos niveles de colesterol sérico. Trastornos ilustrativos son conocidos en la especialidad e incluyen hiperlipoproteinemia incluyendo hipercolesterolemia, apoplejía, obesidad, trastornos compulsivos de la alimentación, enfermedad cardíaca incluyendo aterosclerosis, aterosclerosis cerebral, trastorno del almacenamiento de éster colesterílico, enfermedad hepática incluyendo fallo de trasplante del órgano y cirrosis, enfermedades del sistema biliar e infección viral, particularmente las infecciones que facilitan la encefalitis o trastornos relacionados.

Fármacos antilipémicos particulares de acuerdo con esta invención incluyen la ceramida, que es un efector de SREBP-1, y una estatina sintética o semisintética como inhibidor de 3-hidroxi-3-metilglutaril (HMG) CoA reductasa.

La molécula de ceramida preferiblemente está presente en la naturaleza (es decir, puede aislarse en forma substancialmente pura de una fuente biológica). Una ceramida más preferida para usar en el fármaco es una cualquiera de la ceramida C-2, C-4, C-6 o C-8. En una modalidad preferida la ceramida es ceramida C-2.

El fármaco antilipémico incluye además una estatina como inhibidor de HMG CoA reductasa. Generalmente, se prefiere que el efector y el inhibidor estén combinados de un modo que se facilite la función para la que está destinado el fármaco. Una función preferida es estabilizar o reducir el colesterol sérico según se determina mediante ensayos in vivo convencionales definidos posteriormente. En la mayoría de los casos, se preferirá la ligazón covalente entre el efector y el inhibidor aunque otras asociaciones serán adecuadas para algunas aplicaciones. Los inhibidores de colesterol preferidos tienen una capacidad reconocida para inhibir la reductasa, disminuyendo de ese modo el colesterol sérico. Inhibidores ilustrativos incluyen inhibidores del colesterol sérico disponibles comercialmente aceptables para uso en seres humanos, por ejemplo fluvastatina, simvastatina, lovastatina, pravastatina, mevinolina (compactina), atorvastatina o un derivado clínicamente aceptable de las mismas.

La ceramida está asociada preferiblemente con el inhibidor de HMG CoA reductasa. Por el término "asociada" o un termino relacionado se entiende que la ceramida y el inhibidor están ligados mediante al menos un enlace, preferiblemente al menos un enlace covalente. Ejemplos particulares de unión se describen posteriormente. En algunos casos, la asociación puede estar proporcionada por una combinación adecuada de enlaces químicos covalentes y no covalentes. Alternativamente, la asociación entre la ceramida y el inhibidor puede proporcionarse mediante la coadministración esencial de la ceramida y el inhibidor a un sujeto mamífero deseado. Métodos más específicos para elaborar y usar los fármacos de esta invención se proporcionan en el análisis y los ejemplos que siguen.

En una modalidad, el fármaco antilipémico incluye la ceramida ligada al inhibidor mediante al menos un enlace covalente. Según se apunta, se reconocen inhibidores de colesterol preferidos tales como fluvastatina, simvastatina, lovastatina, pravastatina, mevinolina (compactina) y atorvastatina. En esta ilustración, la ceramida es particularmente una cualquiera de las ceramidas preferidas descritas previamente, ceramida que está covalentemente conectada a un grupo hidroxilo reactivo en la molécula inhibidora. También en este ejemplo, el grupo hidroxilo del inhibidor habitualmente está conectado covalentemente a un átomo de carbono reactivo de la ceramida tal como el carbono
C-3.

Fármacos antilipémicos adicionales de esta invención incluyen al menos un grupo espaciador bifuncional, típicamente un grupo espaciador heterobifuncional, grupo que separa la ceramida del inhibidor u otro resto de fármaco. Un ejemplo particular de este tipo de fármaco antilipémico incluye una ceramida conectada covalentemente a un grupo espaciador heterobifuncional. Ese grupo espaciador preferiblemente está conectado covalentemente al inhibidor del colesterol sérico. Típicamente, el espaciador bifuncional está conectado a un grupo químico adecuadamente reactivo en la ceramida y el inhibidor, habitualmente, de forma específica, átomos de carbono y grupos hidroxilo reactivos, respectivamente.

Los fármacos antilipémicos preferidos de esta invención se formulan generalmente para adaptarse al uso pretendido e incluyen específicamente los fármacos formados para uso tópico o relacionado. Adicionalmente, la invención incluye fármacos antilipémicos que incluyen componentes suficientes para proporcionar el fármaco como una formulación liposómica adecuada para el uso in vitro o in vivo. Métodos para elaborar y usar tales fármacos preferidos se describen posteriormente.

En general, métodos terapéuticos de acuerdo con esta invención incluyen administrar a un sujeto, particularmente un mamífero tal como un primate, especialmente un ser humano, una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un fármaco antilipémico de interés. Ese fármaco puede administrarse como un único agente activo. Alternativamente, el fármaco antilipémico puede administrarse en combinación con otros fármacos o agentes que exhiben una actividad farmacológica deseada. En la mayoría de los casos, la cantidad de uso de fármaco antilipémico será una que exhiba buena actividad en un ensayo in vitro o in vivo estándar descrito posteriormente.

Según se analiza, los fármacos antilipémicos de esta invención proporcionan ventajosamente doble actividad "anticolesterolémica", es decir, incrementando la actividad del receptor de LDL, particularmente potenciando los niveles de receptor de LDL, y reduciendo los niveles de colesterol sérico. Ensayos in vitro e in vivo particulares para detectar y cuantificar estas actividades se proporcionan posteriormente y en el análisis y los ejemplos que siguen.

Como una ilustración, los fármacos antilipémicos preferidos de esta invención son capaces de estimular la producción de la forma madura de SREBP-1 (maduración) en al menos aproximadamente 2 veces, según se determina mediante un ensayo de proteolisis (maduración) de SREBP-1 estándar. Ese ensayo se proporciona posteriormente e implica generalmente verificar de una manera dependiente del tiempo y la dosis la maduración de la proteína SREBP-1. Se cree que la proteína SREBP-1 madura se mueve hacia el núcleo y estimula la producción de receptor
de LDL.

Adicionalmente, los fármacos antilipémicos preferidos de esta invención son capaces de incrementar los niveles de mRNA de receptor de LDL en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% y 90%, según se determina mediante transferencia Northern o un ensayo de detección de mRNA relacionado. Un ensayo de transferencia Northern ejemplar para detectar y opcionalmente cuantificar niveles de mRNA de receptor de LDL se proporciona posteriormente.

Además, los fármacos antilipémicos preferidos de esta invención exhiben una ID_{50} de entre de aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70% hasta aproximadamente 90%, según se determina en un ensayo de HMG CoA reductasa estándar. En este ensayo, la actividad de la enzima reductasa se verifica en presencia y ausencia (control) del agente antilipémico. Un ejemplo del ensayo de HMG CoA reductasa estándar se proporciona posteriormente.

Por otra parte, los fármacos antilipémicos preferidos son capaces de reducir significativamente el colesterol sérico según se determina mediante un ensayo de colesterol sérico estándar. Preferiblemente, un fármaco antilipémico administrado es capaz de reducir el colesterol sérico en un mamífero en al menos aproximadamente 5%, 10% a 20% o 30%, 40%, 50%, 60% o 70%. Un ejemplo del ensayo se describe posteriormente. Típicamente, la reducción en el colesterol sérico se verifica con respecto a un sujeto de control adecuado. Los ensayos de colesterol sérico se realizan óptimamente in vivo y preferiblemente incluyen el uso de un modelo animal reconocido tal como las cepas de conejo y ratón específicas proporcionadas posteriormente.

Modelos animales preferidos para usar en el ensayo del colesterol sérico u otro ensayo adecuado descrito aquí son generalmente sistemas de prueba reconocidos para una enfermedad relacionada con el colesterol identificada. Típicamente, tales modelos animales incluyen cepas endógamas disponibles comercialmente de conejos o ratones, por ejemplo el conejo hiperlipidémico hereditario de Watanabe y el ratón negativo a apolipoproteína E. En este ejemplo, la reducción en el colesterol sérico puede evaluarse usando estrategias de prueba bien conocidas adoptadas para el uso con el modelo animal específico. Sin embargo, para algunas aplicaciones, puede ser útil probar un fármaco antilipémico deseado sobre un animal normal ("silvestre") tal como aquellas cepas animales silvestres definidas genéticamente (por ejemplo, isogénicas) conocidas en la especialidad.

Los fármacos antilipémicos de esta invención preferiblemente se prueban mediante al menos uno y preferiblemente todos los ensayos estándar resumidos anteriormente. Se prefieren fármacos antilipémicos que demuestren aproximadamente los intervalos de actividad indicados en uno o más de los ensayos.

Significativamente, el uso de múltiples estrategias de prueba (por ejemplo, una combinación de ensayos in vitro y/o in vivo) con un solo fármaco antilipémico puede extender la sensibilidad y la eficacia de la prueba según sea necesario. Esto es, la estrategia de prueba puede adaptarse para el tratamiento o la prevención de una enfermedad relacionada con colesterol particular o un grupo de pacientes si se requiere.

Tal prueba de amplio espectro proporciona ventajas adicionales. Por ejemplo, los fármacos antilipémicos preferidos tienen capacidad para potenciar la actividad del receptor de LDL (típicamente potenciando la producción del receptor de LDL) y proporcionar una reducción en el nivel de colesterol sérico. Así, proporcionando tal actividad "anticolesterolémica" doble, la invención es un avance significativo sobre terapias y agentes anteriores que se ha presentado que reducen el colesterol sérico de un modo, habitualmente dirigiéndose a la biosíntesis de colesterol. De acuerdo con esto, los fármacos antilipémicos preferidos de esta invención presentan mejor actividad, pueden administrarse en dosis inferiores que los agentes anteriores. La tolerancia para los pacientes de los fármacos antilipémicos también estará afectada positivamente.

La presente invención se refiere al uso de un fármaco antilipémico como el descrito aquí para la preparación de una composición farmacéutica para modular y particularmente reducir el nivel de colesterol sérico en un animal.

También se proporciona el uso de un fármaco antilipémico como el descrito aquí para la preparación de una composición farmacéutica para modular los niveles de receptor de LDL en un mamífero.

La presente invención también proporciona el uso de un fármaco antilipémico como el descrito aquí para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un trastorno en un mamífero que tiene o se sospecha que tiene altos niveles de colesterol sérico. Un mamífero preferido es un primate y especialmente un paciente humano, por ejemplo los susceptibles de enfermedad cardíaca coronaria, obesidad, trastornos de la alimentación u otros trastornos relacionados con el colesterol descritos aquí. De acuerdo con esto, los usos son especialmente aplicables a un mamífero tal como un paciente humano del que se ha diagnosticado que tiene, se sospecha que tiene o es susceptible de un alto nivel de colesterol sérico, por ejemplo a través de influencias genéticas o dietéticas adversas.

También se contemplan métodos para modular el nivel de colesterol sérico en un mamífero, en donde el método incluye administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos uno de los fármacos antilipémicos descritos aquí. En esta modalidad, el efector de SREBP-1 es ceramida. Métodos preferidos emplean un primate tal como un paciente humano. Los agentes antilipémicos preferidos para usar en los métodos se prueban típicamente con respecto a la actividad usando un modelo animal reconocido para un trastorno relacionado con el colesterol y especialmente la aterosclerosis, por ejemplo el conejo hiperlipidémico hereditario de Watanabe o un ratón negativo a apolipoproteína E analizados previamente.

Adicionalmente, se contemplan métodos para modular el receptor de LDL en un mamífero, en donde los métodos incluyen administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos uno de los fármacos antilipémicos descritos aquí. La modulación es preferiblemente un incremento en la síntesis (o a veces una disminución en la degradación) del receptor de LDL. En ese ejemplo, el efector de SREBP-1 es ceramida neutra. Métodos para evaluar un incremento o una disminución en los niveles de receptor de LDL son conocidos en la especialidad e implican, por ejemplo, sistemas moleculares e inmunológicos que usan anticuerpos anti-LDL capaces de detectar y cuantificar el receptor de LDL in vitro o in vivo.

Usos particulares que se describen anteriormente implican el uso de al menos un fármaco antilipémico adecuado que incluye un efector de SREBP-1 asociado con un inhibidor identificado del colesterol sérico según se describe aquí. En este ejemplo, ese efector es ceramida. Ejemplos preferidos de ceramida incluyen ceramida presente en la naturaleza y otras formas de ceramida como las analizadas previamente. Según se analiza, los métodos preferidos se efectúan usando un mamífero tal como un primate y especialmente un paciente humano que se ha diagnosticado que tiene, se sospecha que tiene o es susceptible de un trastorno relacionado con el colesterol, según se describe.

En una modalidad de los usos descritos aquí, el fármaco antilipémico está dispuesto preferiblemente como una formulación liposómica. En este ejemplo, la formación liposómica puede ser compatible con la administración hepática de acuerdo con la práctica estándar. También en este ejemplo, la formulación liposómica puede administrarse al hígado o un órgano asociado en un paciente humano de acuerdo con técnicas médicas estándar que implican, por ejemplo, la administración oral, intarmuscular, intraperitoneal, a través de un expansor ("stent") o una realización relacionada. Rutas particulares de administración se proporcionan posteriormente.

Otros aspectos de la invención se analizan posteriormente.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una gráfica que muestra el efecto de TNF-\alpha sobre la actividad de esfingomielinasa neutra (N-SMasa).

Las Figuras 2A y 2B son gráficas que ilustran efectos de TNF-\alpha, esfingomielinasa y ceramida C_{2} sobre la cinética de la maduración de SREBP-1. 2A) cinética de la maduración de SREBP-1, 2B) relación de SREBP-1 inmadura/madura frente al tiempo.

La Figura 2C es una representación de una inmunotransferencia Western que muestra la expresión de TNF-\alpha, esfingomielinasa y ceramida C_{2}.

Las Figuras 3A-C son gráficas que muestran los efectos de TNF-\alpha (3A), esfingomielinasa (3B) y ceramida C_{2} (3C) sobre la maduración de SREBP-1.

La Figura 4 es una representación de una inmunotransferencia Western que muestra el efecto de anticuerpos anti-N-SMasa sobre la maduración de SREBP-1 inducida por TNF-\alpha.

Las Figuras 5A-D son representaciones de micrografías de inmunofluorescencia indirectas que muestran la expresión de SREBP-1 en células.

Las Figuras 6A-6D son representaciones de geles que muestran resultados de ensayos de cambio de movilidad electroforética.

La Figura 7 es un modelo que muestra cómo el TNF-\alpha induce la proteolisis (maduración) de SREBP-1 y moviliza el colesterol de la membrana en hepatocitos humanos. Los efectores del receptor de LDL y particularmente la SREBP-1 se muestran esquemáticamente.

La Figura 8 es una representación de una inmunotransferencia Western que muestra la proteína de N-SMasa en células que expresan cantidades crecientes de un vector recombinante que codifica la N-SMasa (PHH1 carriles 3-6; PHH11 carril 9).

La Figura 9 es una representación de una transferencia Northern que muestra la expresión de los vectores que codifican la proteína de N-SMasa (carril 2 PHH1; carril 3 PHH11).

La Figura 10 es una representación de una inmunotransferencia Western que ilustra la expresión y la maduración de SREBP-1 en células.

La Figura 11 es un dibujo que muestra una secuencia de nucleótidos (Nº ID SEC: 1) de cDNA aislado que codifica N-SMasa humana.

La Figura 12 es un dibujo que ilustra la secuencia de aminoácidos deducida (Nº ID SEC: 2) de N-SMasa humana.

La Figura 13 es un dibujo que muestra ejemplos de fármacos antilipémicos particulares, órganos diana y acciones particulares de los fármacos.

La Figura 14 es un dibujo que muestra las estructuras químicas para los inhibidores de colesterol sérico específicos mevastatina, fluvastatina, pravastatina, lovastatina y simvastatina. Los inhibidores son inhibidores de HMG-CoA reductasa. La fluvastatina es un derivado de mevalonolactona totalmente sintético. Los restantes inhibidores de reductasa son derivados de compactina fúngica basados en un anillo de hidronaftaleno.

Las Figuras 15A-B son dibujos que muestran (15A) esfingomielina y (15B) ceramida C-2 y dihidroceramida C-2. El grupo hidroxilo en 3 y el doble enlace carbono-carbono trans 4,5 en la cadena principal de la esfingosina se indican mediante flechas.

Descripción detallada de la invención

Según se analiza, la invención se refiere a fármacos antilipémicos y a usos de los mismos para estabilizar o reducir el nivel de colesterol sérico en un paciente humano u otro mamífero. Los fármacos antilipémicos preferidos incluyen generalmente un efector identificado de la proteína SREBP-1 y una ceramida asociada con un inhibidor del colesterol sérico identificado. Se prefieren más los fármacos antilipémicos en los que los componentes efector e inhibidor están específicamente conectados covalentemente entre sí como una sola formulación.

El término "fármaco antilipémico" se usa aquí para referirse genéricamente a una composición de esta invención, preferiblemente un fármaco sintético o semisintético específico, que tiene doble capacidad para modular niveles de colesterol sérico, es decir, modular el receptor de LDL y estabilizar o reducir los niveles de colesterol sérico en el mamífero. Se prefiere un fármaco antilipémico con capacidad demostrada para incrementar niveles del receptor de LDL y para reducir los niveles de colesterol sérico según se determina mediante ensayos in vitro e in vivo específicos descritos posteriormente. Según se analiza posteriormente, la capacidad para reducir los niveles de colesterol sérico mediante el componente inhibidor generalmente está mediada por la modulación de HMG CoA reductasa, típicamente inhibiendo esa enzima suficientemente para reducir el colesterol sérico. Como también se analiza, la porción efectora incrementa preferiblemente la producción del receptor de LDL.

Los fármacos antilipémicos descritos aquí pueden elaborarse mediante métodos reconocidos identificados en la especialidad. Por ejemplo, métodos para elaborar compuestos de ceramida y relacionados con ceramida específicos se han descrito en la Solicitud de Patente de EE.UU. en tramitación junto con la presente Nº de Serie 08/998.262, titulada "Métodos para el Tratamiento de Estados Asociados con Lactosilceramida", presentada el 24 de Diciembre de 1997, ahora expedida como Patente de EE.UU. 5.972.928 el 26 de Octubre de 1999. Véanse además Abe, A. y otros, (1992) J. Biochem. 111:191-196; Inokuchi, J. y otros (1987) J. Lipid Res. 28:565-571; Shukla, A. y otros (1991) J. Lipid Res. 32:73; Vunnam, R. R. y otros, (1980) Chem. and Physics of Lipids 26:265; Carson, K. y otros, (1994) Tetrahedron Lets. 35:2659 y Akira, A. y otros, (1995) J. Lipid Research 36:611.

Fármacos antilipémicos más específicos de esta invención incluyen como componentes conectados covalentemente el efector y el inhibidor de colesterol sérico. Sin embargo, para algunas aplicaciones, pueden ser apropiados otros fármacos antilipémicos, tales como los que incluyen componentes no conectados covalentemente. Ejemplos incluyen los fármacos proporcionados como formulaciones esencialmente coadministradas.

El peso molecular de un fármaco antilipémico particular variará dependiendo, por ejemplo, de la ceramida y el inhibidor del colesterol sérico específicos elegidos y el número de ceramidas e inhibidores que constituyen el fármaco. Sin embargo, en la mayoría de los casos, el fármaco antilipémico tendrá un peso molecular de menos de aproximadamente 10.000 kD a 35.000 kD. Los pesos moleculares generalmente serán significativamente inferiores, por ejemplo entre aproximadamente 100 kD y 1000 kD, preferiblemente entre aproximadamente 200 kD y 500 kD. Métodos para determinar el peso molecular son conocidos e incluyen métodos de dimensionamiento de pesos moleculares estándares tales como electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS.

\newpage

Ejemplos ilustrativos de fármacos antilipémicos específicos se muestran en la Figura 13. La Figura 13 muestra particularmente el uso de combinaciones de reguladores al alza (efectores) de la maduración de SREBP-1, ceramida, N-SMasa y diversas moléculas que disminuyen los lípidos; inhibidores de HMG CoA-reductasa (estatinas) en diversas patologías humanas.

Un "efector" del receptor de LDL y particularmente la proteína SREBP-1 es una ceramida con capacidad demostrada para modular el receptor de LDL y específicamente la maduración de la proteína SREBP-1, según se determina mediante el ensayo de maduración de SREBP-1 estándar descrito posteriormente. Efectos ilustrativos se proporcionan en los Ejemplos y la Figura 7.

Un "inhibidor del colesterol sérico", cuando se usa aquí ese término, se refiere generalmente a un compuesto reconocido capaz de reducir los niveles de colesterol sérico en un mamífero y especialmente un paciente humano. Inhibidores del colesterol sérico preferidos son estatinas que interfieren con la biosíntesis de colesterol y especialmente la actividad de HMG CoA-reductasa, por ejemplo en el hígado. Inhibidores del colesterol sérico más preferidos están disponibles comercialmente fácilmente e incluyen mevastatina, fluvastatina, pravastatina, lovastatina y simvastatina. Véase la Figura 14 y el análisis posterior.

Se ha encontrado inesperadamente que el TNF-\alpha estimula significativamente la maduración de SREBP-1 en células a través de la acción de la N-SMasa. Esto es, se ha encontrado que el TNF-\alpha es capaz de inducir la maduración de SREBP-1 de una manera dependiente del tiempo y la dosis. Esta inducción estaba de acuerdo con la cinética de la activación mediada por TNF-\alpha de esfingomielinasa neutra (N-SMasa). Los anticuerpos para N-SMasa inhibían la maduración de SREBP-1 inducida por TNF-\alpha sugiriendo que la N-SMasa es un componente necesario de esta ruta de transducción de señales. También se encontró que la ceramida, un producto de la hidrólisis de esfingomielina, era capaz de inducir la maduración de SREBP-1. Sin querer limitarse a una teoría, parece que la forma madura de SREBP-1 generada mediante el tratamiento con TNF-\alpha, esfingomielinasa o ceramida se trasloca al núcleo y se une al elemento regulador de esteroles (SRE). Se cree que esto promueve la transcripción del gen aguas arriba del SRE. Véase la Figura 7 para un esbozo esquemático de estos hallazgos. Parece también que los efectores de la SREBP-1 estimulan el receptor de LDL, particularmente potenciando la maduración de SREBP-1, estabilizando o reduciendo de ese modo el colesterol sérico en el mamífero.

Los métodos terapéuticos comprenden generalmente la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un, y típicamente un, fármaco antilipémico como el descrito aquí a un mamífero tal como un primate y especialmente un paciente humano en tal tratamiento. Los métodos de tratamiento terapéuticos incluyen más específicamente la administración de una cantidad eficaz del fármaco antilipémico a un sujeto, particularmente, un mamífero tal como un ser humano, que necesite tal tratamiento para una indicación descrita aquí.

Sujetos típicos de interés incluyen los que sufren de, se sospecha que sufren de o son susceptibles de los estados, trastornos o enfermedades descritos aquí, por ejemplo hiperlipoproteinemia, incluyendo hipercolesterolemia, apoplejía, obesidad incluyendo trastornos compulsivos de la alimentación, enfermedad cardíaca incluyendo aterosclerosis, aterosclerosis cerebral, trastorno del almacenamiento de éster colesterílico, enfermedad hepática incluyendo fallo del trasplante del órgano y cirrosis; enfermedades del sistema biliar e infección viral, particularmente las infecciones que facilitan la encefalitis y trastornos relacionados. Se ha presentado una descripción más específica que se refiere a estas y otras enfermedades relacionadas con el colesterol, que incluye métodos aceptados para rastrear y diagnosticar estos trastornos. Véase, por ejemplo Brown, M.S. y Goldstein, J.L. (1993), anteriormente, y las referencias citadas
allí.

Una variedad de fármacos antilipémicos específicos puede emplearse en la presente invención y particularmente en los usos y los métodos de tratamiento descritos. Una prueba habitual, por ejemplo en un ensayo in vitro estándar opcionalmente combinado con otro ensayo in vitro y/o in vivo, en la mayoría de los casos puede identificar fácilmente fármacos antilipémicos adecuados que exhiben selectividad y actividad deseadas con respecto al trastorno o la enfermedad elegidos. Según se apunta, los fármacos antilipémicos preferidos presentan un efector específico de la proteína SERBP-1 tal como ceramida.

Por ejemplo, un fármaco antilipémico de esta invención incluye conectados covalentemente en secuencia: 1) una ceramida que comprende un grupo típicamente reactivo; y 2) un inhibidor del colesterol sérico, tal como los descritos aquí, que incluye otro grupo químicamente reactivo capaz de unirse específicamente, generalmente mediante conexión covalente, al grupo reactivo del efector. Opcionalmente, el fármaco antilipémico incluye además un espaciador bifuncional, por ejemplo un espaciador heterobifuncional, conectado covalentemente entre 1) y 2).

Un fármaco antilipémico más preferido incluye conectados covalentemente en secuencia: 1) una ceramida; y 2) un inhibidor del colesterol sérico específico según se describe aquí. En esta modalidad, la ceramida preferiblemente está presente en la naturaleza y puede ser una cualquiera de ceramida C-2, C4, C-6 o C-8. El grupo reactivo será típicamente el grupo C-3 de la ceramida. Se prefieren inhibidores del colesterol sérico que incluyen un grupo hidroxilo (-OH) adecuadamente reactivo químicamente, por ejemplo fluvastatina, simvastatina, lovastatina, pravastatina, mevinolina (compactina) o artorvastatina. Opcionalmente, el fármaco antilipémico puede incluir un espaciador bifuncional conectado covalentemente entre 1) y 2), es decir, que proporciona un enlace covalente entre el grupo C-3 y el grupo hidroxilo.

Estructuras químicas para esfingomielina y ceramidas específicas (ceramida C-2, dihidro-ceramida C-2) se muestran en las Figuras 15A y 15B.

Según se analiza, los fármacos antilipémicos preferidos de esta invención exhiben actividad significativa en un ensayo de maduración de SRBEP-1 estándar. Preferiblemente, el fármaco exhibe un aumento de al menos dos veces, preferiblemente entre aproximadamente 2 y 10 veces y más preferiblemente de aproximadamente 2 a 5 veces según se determina mediante el ensayo. Un ensayo preferido implica generalmente:

a) cultivar células adecuadas, por ejemplo células HH-25, en medio y añadir el fármaco antilipémico durante entre aproximadamente 2 y 60 minutos, preferiblemente entre aproximadamente 10 y 30 minutos, prefiriéndose generalmente aproximadamente 15 minutos, típicamente seguido por lavado; y

b) detectar SREBP-1 madura (es decir segmentada proteolíticamente) y SREBP-1 precursora realizando inmunotransferencia Western con un anticuerpo anti-SREBP-1 tal como los descritos posteriormente. En general, la masa de la forma madura de SREBP-1 puede determinarse cuantitativamente frente a la forma precursora. La presencia de esa forma madura es indicativa de maduración y proteolisis de SREBP-1. Métodos más específicos para realizar el ensayo se proporcionan en los ejemplos que siguen. Células de control típicamente adecuadas se incluyen como una referencia, células que no se exponen al fármaco.

Como también se analiza, los fármacos antilipémicos preferidos de esta invención exhiben buena actividad en un ensayo de transferencia Northern para detectar y preferiblemente cuantificar mRNA del receptor de LDL. Adicionalmente, los fármacos antilipémicos preferidos son capaces de incrementar los niveles de mRNA del receptor de LDL en al menos aproximadamente 10% y preferiblemente al menos entre aproximadamente 20% y 50%, según se determina mediante el ensayo de transferencia Northern o un ensayo de detección de mRNA relacionado. Métodos para realizar ensayos de transferencia Northern se conocen generalmente y se han descrito, por ejemplo, en Sambrook y otros en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed. 1989) y Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1989.

Sondas adecuadas para detectar mRNA de LDL están disponibles generalmente e incluyen secuencias clonadas del receptor de LDL humano o una secuencia de mamífero relacionada disponible de Genbank. La información acerca de Genbank puede obtenerse de the National Library of Medicine, 38A, 8N05, Rockville Pike, Bethesda, MD 20894. Genbank también está disponible en internet en http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Véase, generalmente, D.A. y otros (1997) Nucl. Acids. Res. 25: 1, para una descripción más completa de Genbank.

Un ensayo de transferencia Northern ejemplar para detectar y opcionalmente cuantificar niveles de mRNA del receptor de LDL se analiza posteriormente.

Los inhibidores preferidos de la HMG CoA reductasa generalmente reducen o bloquean la síntesis de colesterol en el hígado, facilitando de ese modo reacciones compensatorias que pueden conducir a una reducción en el LDL plasmático. Un ensayo preferido para medir este fenómeno es el ensayo de HMG CoA reductasa estándar. Según se menciona previamente, los fármacos antilipémicos preferidos de esta invención exhiben una ID_{50} de entre aproximadamente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% hasta aproximadamente 90%, preferiblemente entre aproximadamente 30% y 50% según se determina en el ensayo de HMG CoA reductasa. El ensayo de HMG CoA reductasa ha sido descrito por Brown y otros (1978) J. Biol. Chem. 253:1121. En este ensayo, fibroblastos humanos cultivados responden a una inhibición de la reductasa acumulando cantidades incrementadas de la enzima en comparación con un control adecuado.

Como también se analiza adicionalmente, los fármacos antilipémicos preferidos son capaces de reducir el colesterol sérico según se determina mediante un ensayo de colesterol estándar. El fármaco registra preferiblemente al menos de aproximadamente 5% o 10% a 20%, 30%, 40% o 50% de disminución, preferiblemente al menos de aproximadamente 30% a 50% de disminución según se determina mediante el ensayo. Un ensayo preferido para medir el colesterol LDL está disponible comercialmente de Sigma (St. Louis, Mo) e implica separaciones inmunológicas. Véase además the National Cholesterol Education Program (NCEP) para información relativa a niveles de colesterol aceptables en seres humanos.

Un nivel de colesterol "alto" o "de alto riesgo" o un término relacionado se define aquí como entre aproximadamente 200 y 240 mg/dl (mM) de colesterol, entendiéndose más generalmente que un nivel mayor o igual a 240 mg/dl (mM) de colesterol es indicativo de alto colesterol sérico. Un nivel de colesterol sérico normal se define aquí como menor de aproximadamente 200 mg/dl (mM). Para una descripción específica relativa a efectuar las pruebas de coles-
terol, véase Brown, M.S. y Goldstein, J.L., anteriormente, que analiza las directrices del informe del NCEP de 1988.

De acuerdo con esto, se entenderá que "estabilización" o "reducción" de colesterol sérico, según se usan aquí estos términos, significan la manifestación de un nivel de colesterol sérico normal o casi normal en el mamífero. Además, un mamífero de control adecuado de acuerdo con esta invención tendrá preferiblemente un nivel de colesterol sérico normal o casi normal según se determina mediante pruebas de colesterol sérico estándar.

Se describen aquí usos adicionales de un fármaco antilipémico para la preparación de una composición farmacéutica para modular niveles de SREBP-1 en un mamífero administrando al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos uno, y típicamente uno, de los fármacos antilipémicos descritos aquí. Típicamente, la modulación de la SREBP-1 se evalúa determinando la maduración de la proteína según se determina mediante las pruebas de maduración de SREBP-1 descritas en los Ejemplos posteriores. Un ensayo preferido es el ensayo de proteolisis de SREBP-1 descrito en los Ejemplos.

Los métodos de esta invención pueden realizarse in vitro o in vivo usando células primarias, cultivadas o inmortalizadas aceptables tales como las descritas aquí. Generalmente, estas células serán capaces de exhibir maduración de SREBP-1 según se define aquí, incluyendo los hepatocitos humanos HH-25 descritos posteriormente. Los métodos para probar fármacos antilipémicos de interés y especialmente para el uso en un paciente humano se efectuarán preferiblemente in vivo y pueden implicar el uso de un modelo animal adecuado dependiendo del método usado. En este ejemplo, el modelo puede ser un modelo animal adecuado tal como los analizados previamente. Alternativamente, los métodos pueden realizarse sobre un primate adecuado tal como un paciente humano. Se prefiere es un paciente humano que se ha diagnosticado que tiene, se sospecha que tiene o es susceptible de un trastorno relacionado con el colesterol según se define anteriormente.

En modalidades en las que el paciente humano es susceptible de uno o más trastornos relacionados con el colesterol, esa susceptibilidad puede relacionarse con una predisposición genética o ambiental al trastorno relacionado con el colesterol. Métodos para determinar tal predisposición son conocidos en la especialidad e incluyen pruebas genéticas. Véase Brown, M.S. y Goldstein, J.L. (1993) anteriormente.

La invención proporciona así usos de fármacos antilipémicos como los descritos aquí para la preparación de composiciones farmacéuticas para tratar niveles de colesterol sérico inapropiados (es decir, altos) así como un trastorno o estado asociado con los mismos. Se contempla adicionalmente el uso de los presentes compuestos antilipémicos como fármacos profilácticos para prevenir el desarrollo de o reducir la gravedad de niveles de colesterol sérico inapropiados.

Los compuestos de la invención serán especialmente útiles para un paciente humano que tenga o se sospeche que tenga una enfermedad, un trastorno o un estado relacionado con el colesterol, según se define aquí. Los compuestos de la invención serán particularmente útiles para disminuir el colesterol sérico hasta niveles normales o casi normales en pacientes humanos. Ejemplos específicos de enfermedades que pueden tratarse de acuerdo con la invención incluyen hiperlipoproteinemia, apoplejía, enfermedad cardiovascular y especialmente aterosclerosis, así como otros trastornos o estados específicos mencionados aquí.

Sin querer limitarse por una teoría, se cree que los compuestos conectados covalentemente múltiples y distintos de esta invención (es decir al menos un fármaco antilipémico identificado en combinación con al menos una ceramida) pueden mejorar significativamente la eficacia del fármaco antilipémico, por ejemplo, incrementando la síntesis de receptor de LDL en células del sujeto.

Por otra parte, en virtud de la conexión covalente, los conjugados de la invención presentan el fármaco antilipémico y la ceramida a la célula del sujeto de forma esencialmente simultánea, un efecto que no puede alcanzarse fácilmente administrando los mismos compuestos en una formulación de "cóctel" de fármacos sin conectar covalentemente los compuestos.

También se ha presentado que el tratamiento con un fármaco puede volver sensible a un paciente a otro fármaco. De acuerdo con esto, la presentación esencialmente simultánea a la célula del sujeto de un fármaco antilipémico y ceramida a través de un conjugado de la invención puede mejorar la actividad de los fármacos, por ejemplo, proporcionando resultados sinérgicos y/o potenciando la producción de receptores de LDL.

La administración de compuestos de la invención puede realizarse mediante una variedad de rutas adecuadas, incluyendo oral, tópica (incluyendo transdérmica, bucal o sublingual), nasal y parenteral (incluyendo inyección intraperitoneal, subcutánea, intravenosa, intradérmica o intramuscular), prefiriéndose generalmente oral o parenteral. También se apreciará que el método preferido de administración y la cantidad de dosificación pueden variar con, por ejemplo, el estado y la edad del receptor.

Los compuestos de la invención pueden usarse en terapia junto con otros medicamentos tales como aquellos con actividad farmacológica reconocida para disminuir concentraciones de lipoproteínas plasmáticas. Véase Brown, M.S. y Goldstein, J.L., anteriormente. Medicamentos ejemplares son inhibidores del colesterol sérico reconocidos (es decir, que se cree que inhiben HMG CoA reductasa) tales como Lescol™ (fluvastatina de Sandoz Pharmaceuticals), Mevacor™ y Zocor™ (simvastatina y lovastatina, respectivamente, de Merck & Co.), Pravachol™ (pravastatina de Bristol-Myers Squibb Co.) y mevinolina (compactina).

Los compuestos de esta invención pueden usarse solos o en combinación con otras terapias antilipémicas aceptadas incluyendo aquellas que establecen el uso de ácidos fíbricos, por ejemplo gembibrozil, clofibrato, fenofibrato, ciprofibrato o bezafibrato, resinas que se unen a ácidos biliares tales como colestiramina o colestipol; y probucol. Los compuestos de esta invención pueden administrarse antes, durante o después de tales terapias según sea necesario.

Aunque uno o más compuestos de la invención pueden administrarse solos, también pueden estar presentes como parte de una composición farmacéutica mezclados con un excipiente convencional, es decir substancias portadores orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para la administración parenteral, oral u otra deseada y que no reaccionan perjudicialmente con los compuestos activos y no son perjudiciales para el receptor de los mismos. Portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcohol, aceites vegetales, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato magnésico, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite esenciales, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácido graso petroetéricos, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc. Las preparaciones farmacéuticas pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, saboreantes y/o substancias aromáticas y similares, que no reaccionan perjudicialmente con los compuestos activos.

Para la aplicación parenteral, son particularmente adecuadas las soluciones, preferiblemente soluciones oleosas o acuosas así como suspensiones, emulsiones o implantes, incluyendo supositorios. Las ampollas son dosificaciones unitarias convenientes.

Para la aplicación enteral, son particularmente adecuadas las tabletas, grageas o cápsulas que tienen talco y/o un aglutinante portador de carbohidrato o similares, siendo preferiblemente el portador lactosa y/o almidón de maíz y/o almidón de patata. Puede usarse un jarabe, elixir o similares en los que se emplea un vehículo edulcorado. Pueden formularse composiciones de liberación sostenida incluyendo aquellas en las que el componente activo está protegido con revestimientos diferencialmente degradables, por ejemplo mediante microencapsulación, revestimiento múltiple, etc.

Los compuestos terapéuticos de la invención también pueden incorporarse en liposomas. La incorporación puede llevarse a cabo de acuerdo con procedimientos de preparación de liposomas conocidos, por ejemplo sonicación y extrusión. Métodos convencionales adecuados de preparación de liposomas también se describe en, por ejemplo, Bangham y otros, J. Mol. Biol., 23:238-252 (1965); F. Olson y otros, Biochim. Biophys. Acta, 557:9-23 (1979); F. Szoka y otros, Proc. Nat. Acad. Sci., 75:4194-4198 (1978); S. Kim y otros, Biochim. Biophys. Acta, 728:339-348 (1983) y Mayer y otros, Biochim. Biophys. Acta, 858:161-168 (1986).

El liposoma puede estar formado por uno o más de los conjugados analizados anteriormente solos o, más preferiblemente, en combinación con cualquiera de los materiales liposómicos fosfolipídicos sintéticos o naturales convencionales, incluyendo fosfolípidos de fuentes naturales tales como fuentes de huevo, planta o animal, tales como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, esfingomielina, fosfatidilserina o fosfatidilinositol. También pueden usarse fosfolípidos sintéticos, por ejemplo, dimiristoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina y fosfatidiletanolaminas y fosfatidilgliceroles sintéticos correspondientes. Colesterol u otros esteroles, hemosuccinato de colesterol, glicolípidos, 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), cloruro de N-[1-(2,3-dioleoil)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) y otros lípidos catiónicos pueden incorporarse en los liposomas. Las cantidades relativas del uno o más compuestos y aditivos usados en los liposomas pueden variar ampliamente. Los liposomas de la invención contienen adecuadamente de aproximadamente 60 a 90 por ciento en moles de fosfolípido natural o sintético; pueden usarse colesterol, hemisuccinato de colesterol, ácidos grasos o lípidos catiónicos en cantidades que varían de 0 a 50 por ciento en moles; y el uno o más compuestos terapéuticos de la invención pueden estar presentes adecuadamente en cantidades de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50 por ciento en moles.

Se apreciará que las cantidades preferidas reales de compuestos activos usadas en una terapia dada variarán de acuerdo con el compuesto específico que se utilice, las composiciones particulares formuladas, el modo de aplicación, el sitio particular de administración, etc. Los grados de administración óptimos para un protocolo de administración dado pueden ser determinados fácilmente por los expertos en la técnica usando pruebas de determinación de la dosificación convencionales efectuadas con respecto a las directrices precedentes.

En general, para el tratamiento de una enfermedad relacionada con lípidos, según se describe aquí, y particularmente hiperlipoproteinemia, apoplejía, enfermedad cardíaca coronaria y especialmente aterosclerosis, una dosis eficaz adecuada de uno o más compuestos de esta invención está en el intervalo de 0,01 a 100 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor al día, preferiblemente en el intervalo de 0,1 a 50 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor al día, más preferiblemente en el intervalo de 1 a 20 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor al día. La dosis deseada se administra adecuadamente una vez al día, o varias subdosis, por ejemplo de 2 a 5 subdosis, se administran a intervalos apropiados a lo largo del día, u otro esquema apropiado.

Una dosis preferida para muchos compuestos de esta invención está en el intervalo de las dosificaciones aceptadas para inhibidores de HMG CoA reductasa identificados, prefiriéndose menos de ese intervalo para muchos pacientes. Véase the Physicians' Desk Reference, anteriormente, para una información más específica relativa a dosis recomendadas de inhibidores de HMG CoA reductasa con actividad antilipémica.

La presente invención también proporciona métodos para determinar la capacidad terapéutica del fármaco antilipémico descrito aquí para tratar una enfermedad relacionada con el colesterol en un mamífero. En una modalidad, el método incluye:

a): proporcionar una población de células capaces de expresar SREBP-1,

c): cultivar las células en medio; y

También se proporcionan aquí métodos para determinar la capacidad terapéutica de uno o más de los fármacos antilipémicos descritos aquí usando un conejo hiperlipidémico hereditario de Watanabe o un ratón negativo a apolipoproteína como un modelo animal. En una modalidad, el método incluye:

a): administrar al menos uno de los fármacos antilipémicos al conejo o al ratón en una cantidad suficiente para reducir los niveles de colesterol sérico en al menos de aproximadamente 10 a 20%, según se determina mediante un ensayo de colesterol estándar; y

b): detectar la reducción en el colesterol sérico en el conejo o el ratón como indicativa de la capacidad terapéutica del fármaco antilipémico para tratar la enfermedad relacionada con el colesterol.

Los métodos de esta invención pueden incluir opcionalmente verificar la actividad del receptor de LDL como indicativa del efector de SREBP-1. En esta modalidad, la actividad del receptor puede verificarse y cuantificarse adecuadamente, si se desea, mediante una o una combinación de estrategias estándar. Por ejemplo, se ha presentado una variedad de métodos específicos para verificar la actividad del receptor de LDL y particularmente para detectar incrementos o disminuciones en el nivel de receptores de LDL. Véase Brown, M. S. y Goldstein, J. L. (1993), anteriormente y las referencias citadas allí con respecto a varios sistemas inmunológicos y moleculares. Un método preferido es el ensayo de transferencia Northern del receptor de LDL estándar descrito aquí.

Células adecuadas para usar en los métodos de esta invención se describen en los ejemplos que siguen.

Se prefieren células que incluyen SREBP-1 y son capaces de maduración de SREBP-1 según se determina mediante el ensayo estándar descrito aquí. Se prefieren más las células que son sensibles a un incremento o una disminución en la ceramida o un compuesto relacionado, tales como hepatocitos humanos, según se proporciona en los ejemplos siguientes.

Se prefiere que los fármacos antilipémicos así como los componentes de los mismos (por ejemplo, la ceramida) sean substancialmente puros. Esto es, los fármacos estarán presentes en al menos de 90 a 95% de homogeneidad (p/p). Los fármacos antilipémicos que tienen al menos de 98 a 99% de homogeneidad (p/p) son los más preferidos para muchas aplicaciones farmacéuticas, clínicas y de investigación. Una vez substancialmente purificado, el fármaco debe estar substancialmente libre de contaminantes para aplicaciones terapéuticas. Una vez purificados parcialmente o hasta una pureza substancial, los fármacos pueden usarse terapéuticamente, o para realizar ensayos in vitro o in vivo preferidos como los descritos aquí. La pureza substancial puede determinarse mediante una variedad de técnicas estándar tales como cromatografía y electroforesis en gel.

Los Ejemplos 1-8 posteriores ilustran que el TNF-\alpha es capaz de inducir proteolisis de SREBP-1 independientemente de la presencia de esteroles. Esfingomielinasa y ceramida suministradas exógenamente también son capaces de inducir proteolisis de SREBP-1 de una manera dependiente del tiempo y la dosis. La cinética de la maduración de SREBP-1 está de acuerdo con las de la activación de esfingomielinasa neutra por TNF-\alpha. Además, la maduración de SREBP-1 puede bloquearse con anticuerpos anti-N-SMasa indicando que la esfingomielinasa neutra es necesaria para la segmentación de SREBP-1 independiente de esteroles inducida por TNF-\alpha. El producto de la proteolisis de SREBP-1 independiente de esteroles es capaz de traslocación nuclear y se une al elemento regulador de esteroles.

Las siguientes abreviaturas se usan a lo largo de esta descripción incluyendo los siguientes ejemplos, según sea necesario: N-SMasa, esfingomielinasa neutra; LDLr, receptor de lipoproteína de baja densidad; SREBP-1, proteína que se une al elemento regulador de esteroles 1. Las citas numeradas se listan en orden numérico posteriormente.

Ejemplo 1 El efecto de TNF-\alpha sobre la actividad de esfingomielinasa neutra

La actividad de esfingomielinasa neutra se incrementaba rápidamente con la adición de TNF-\alpha. Véase la Figura 1. Se observaba un incremento máximo de 2,5 veces en la actividad 15 minutos después de que se añadiera TNF-\alpha a las células. El retorno gradual de la actividad de N-SMasa a niveles de control en 1 hora contrastaba con el rápido comienzo de la activación y se refleja en el perfil cinético asimétrico observado.

La Figura 1 ilustra el efecto de TNF-\alpha sobre la actividad de esfingomielinasa neutra y se explica con más detalle como sigue: Cultivos confluentes de células HH-25 se lavaron una vez con PBS y se incubaron en medio libre de suero durante 30 minutos antes de la adición de TNF-\alpha (10 ng/ml). En el momento indicado, las células se recogieron en PBS, se nodulizaron y se congelaron. Las células se sometieron a lisis subsiguientemente según se describe en Materiales y Métodos. Los ensayos de N-SMasa se realizaron por duplicado según se describe. Las barras de error representan \pm una desviación estándar de la media.

Ejemplo 2 Cinética de la proteolisis de SREBP-1

La maduración de SREBP-1 independiente de esteroles en respuesta a TNF-\alpha se correlaciona estrechamente con la cinética de la activación de N-SMasa inducida por TNF-\alpha. Se encontró que la masa de la forma madura de SREBP-1 se incrementaba 2 veces después de 5 minutos y 3 veces después de 15 minutos de incubación con TNF-\alpha. Véase la Figura 2A. La cantidad de SREBP-1 madura volvía a niveles de control en una hora. Este efecto no podía recapilutarse con el tratamiento con EFG o PDGF. El incremento en los niveles de SREBP-1 madura estaba acompañado por una disminución concomitante en la intensidad de la banda correspondiente a la forma precursora de SREBP-1. Véase la Figura 2B. Después de 60 minutos de tratamiento, era visible significativamente menos SREBP-1 precursora.

Para incorporar el incremento observado en SREBP-1 madura y la disminución concomitante en SREBP-1 precursora en una sola variable, se representó la relación de SREBP-1 precursora a madura. Véase la Figura 2B. Se producía una disminución máxima de 1,5 veces en la relación de precursora a madura 45 minutos después de que el TNF-\alpha se añadiera al medio. La disminución en la relación de precursora a madura era más pronunciada en los 30 minutos iniciales de tratamiento. Esto también está de acuerdo con la cinética de la activación de N-SMasa inducida por
TNF-\alpha.

Para explorar la posibilidad de que la esfingomielinasa de membrana plasmática estuviera implicada en la ruta de transducción de señales que conduce a la proteolisis de SREBP-1, las células se trataron con esfingomielinasa bacteriana suministrada exógenamente. La esfingomielinasa inducía un cambio drástico en las cantidades relativas de SREBP-1 precursora y madura. Como se ve en las Figuras 2A-2B, se observaba un incremento de 2,5 veces en los niveles de SREBP-1 madura después de 15 minutos de tratamiento. A diferencia del TNF-\alpha, el incremento en SREBP-1 madura inducido por esfingomielinasa persistía después de 60 minutos. La esfingomielinasa también era capaz de reducir el nivel de la forma precursora de SREBP-1. Véanse las Figuras 2A-B. El tratamiento con esfingomielinasa humana recombinante purificada producía resultados similares.

Mucha de la capacidad de transducción de señales de la N-SMasa se ha atribuido a su capacidad para generar el segundo mensajero lipídico ceramida. De acuerdo con esto, la capacidad de un análogo de ceramida permeable a las células, ceramida C_{2} (N-acetilesfingosina), se probó para inducir la maduración de SREBP-1. La ceramida C_{2} también induce la maduración de SREBP-1 de una manera independiente de esteroles con mayor magnitud que la observada con TNF-\alpha o esfingomielinasa. La ceramida C_{2} incrementaba el nivel de SREBP-1 madura 4 veces después de 30 minutos de tratamiento. Véanse las Figuras 2A-2B. La elevación persistente de los niveles de SREBP-1 madura observada con tratamiento con esfingomielinasa también acompañaba al tratamiento con ceramida C_{2}. El incremento en la SREBP-1 madura se reproducirse con la adición de ceramidas cerebrales bovinas pero no podía inducirse con tratamiento con dihidroceramida C_{2}, PL-A_{2} o fosfolípido D.

La cinética de maduración de SREBP-1 presentada en este ejemplo sugeriría que la proteolisis de SREBP-1 es un episodio suficientemente temprano para estar implicado en el suministro del colesterol a células apoptóticas. Sin embargo, no existía evidencia de apoptosis en la línea celular de hepatocitos humanos HH-25 usada en este estudio. Sin querer limitarse a una teoría, puede concebirse que la inducción independiente de esteroles de la maduración de SREBP-1 en hepatocitos es un proceso fisiológico que no requiere que se induzca la apoptosis. Alternativamente, las dos rutas pueden diverger antes de que la célula se haya sometido a apoptosis, sugiriendo una manera en la que la proteolisis de SREBP-1 independiente de esteroles podría emplearse independientemente de la inducción de la apoptosis.

La segmentación independiente de esteroles de SREBP-1 observada con hepatocitos humanos también podría producirse por ceramida generada por la activación de N-SMasa inducida por TNF-\alpha. Este fenómeno puede reconstituirse mediante la adición exógena de N-SMasa y/o ceramida C_{2} a los hepatocitos.

Las Figuras 2A-2C ilustran los efectos de TNF-\alpha, esfingomielinasa y ceramida C_{2} sobre la cinética de la maduración de SREBP-1. Las Figuras 2A-2C se explican con más detalle como sigue: Las células se mantuvieron en medios complementados con 1 \mug/ml de 25-hidroxicolesterol y 15 \mum/ml de colesterol durante 24 horas antes del experimento. Las células se trataron durante el tiempo indicado como se describe en Materiales y Métodos. Las células se recogieron a continuación en PBS, se nodulizaron y se congelaron. La lisis y la fraccionación nuclear se realizaron como se describe. Las fracciones nucleares (50 \mug de proteína) se sometieron a electroforesis sobre un gel de poliacrilamida al 7,5% y se transfirieron a una membrana de PVDF. La transferencia Western se realizó como se describe. La intensidad delas bandas se cuantificó a través de un densitómetro. Las barras de error representan \pm una desviación estándar de la media. 2A) Se representa la cinética de la maduración de SREBP según se mide mediante el incremento en la SREBP-1 madura. El incremento en veces se calculó comparando cada punto temporal con el valor de control correspondiente (el TNF-\alpha se representa mediante barras punteadas, la esfingomielinasa bacteriana se representa mediante barras de color gris claro y la ceramida C_{2} mediante las barras oscuras). 2B) Las células se trataron con TNF-\alpha (10 ng/ml) y se prepararon como se describe anteriormente. Las bandas correspondientes a las formas precursora y madura de SREBP-1 se cuantificaron y sus relaciones se representaron. 2C) Transferencias Western representativas de las que se derivaban datos numéricos. El tiempo de incubación se indica anteriormente y se aplica a todas las condiciones. Las membranas se expusieron a película durante 15 segundos. P y M indican las formas precursora y madura de SREBP-1, respectivamente.

Ejemplo 3 Efectos de TNF-\alpha, esfingomielinasa y ceramida C_{2} sobre la apoptosis en hepatocitos

Para demostrar que la maduración observada de SREBP-1 no era un artefacto del fenómeno más general de la proteolisis inducida por apoptosis, se realizaron ensayos de fragmentación en escalera ("laddering") de DNA. La escalera de DNA de 160 pb y característica de células que sufren apoptosis no se observó en ninguna de las
muestras.

El TNF-\alpha, la ceramida C_{2} y la esfingomielinasa no inducían la apoptosis demostrando que en los hepatocitos, la maduración de SREBP-1 no es parte del fenómeno más general de hidrólisis apoptótica de proteínas.

Ejemplo 4 Efectos de la concentración de TNF-\alpha, esfingomielinasa y ceramida C_{2} sobre la maduración de SREBP-1

La extensión de la maduración de SREBP-1 inducida por TNF-\alpha no variaba apreciablemente con la concentración. Se observó un efecto máximo con 10 ng/ml de TNF-\alpha. Véanse las Figuras 3A-C. 250 miliunidades de actividad de esfingomielinasa inducían una disminución de 80% en la relación de precursora a madura. Tan poco como 1 \muM de ceramida C_{2} era eficaz para producir un efecto máximo de 81%. Sin embargo, el efecto máximo se obtenía con una concentración de ceramida C_{2} de 50 M. Véanse las Figuras 3A-C.

Las Figuras 3A-3C muestran los efectos de la concentración de TNF-\alpha, esfingomielinasa y ceramida C_{2} sobre la maduración de SREBP-1. Las Figuras 3A-3C se explican con más detalle como sigue. Las células se trataron con TNF-\alpha, esfingomielinasa o ceramida C_{2} a las concentraciones indicadas. Se prepararon nódulos nucleares y se sometieron a electroforesis (50 \mug de proteína). Las bandas correspondientes a las formas precursora y madura de SREBP-1 se cuantificaron. Las relaciones de precursora a madura se normalizaron con un solo control para facilitar la comparación. A la relación de control se le atribuyó arbitrariamente un valor de 1. Una unidad de actividad de esfingomielinasa hidroliza 1,0 \mumol de esfingomielinasa por minuto a 37ºC. Figura 3A (ng/ml de TNF-\alpha); Figura 3B (mUnidades de esfingomielinasa); Figura 3C (ceramida C_{2} micromolar).

Ejemplo 5 El efecto de anticuerpos anti-N-SMasa sobre la maduración de SREBP-1 mediada por TNF-\alpha

La disponibilidad de anticuerpos anti-N-SMasa permitía examinar los efectos del TNF-\alpha en esta ruta independientemente de la activación de N-SMasa (10). Anticuerpos anti-N-SMasa policlonales con una dilución de 1:200 bloqueaban completamente la maduración de SREBP-1 inducida por TNF-\alpha. Véase la Figura 4. La supresión de la maduración de SREBP-1 mediada por TNF-\alpha se aliviaba con una dilución de anticuerpo creciente. La preincubación con suero preinmune a la misma dilución no tenía un efecto apreciable.

Este ejemplo muestra que la preincubación con anticuerpo anti-N-SMasa bloqueaba eficazmente la maduración de SREBP-1 inducida por TNF-\alpha. No se observaba inhibición con tratamiento con suero preinmune y se aliviaba con la dilución de anticuerpo creciente. Tales hallazgos son confirmados por otros estudios tales como los que muestran la capacidad del anticuerpo para inhibir incrementos inducidos por TNF-\alpha en la síntesis de éster de colesterol y los incrementos inducidos por N-SMasa en la unión a ^{[125]}I-LDL, la internalización y la degradación en fibroblastos humanos (15, 16).

La Figura 4 muestra el efecto de anticuerpos anti-N-SMasa sobre la maduración de SREBP-1 inducida por TNF-\alpha. La Figura 4 se explica con más detalle como sigue. Las células se mantuvieron en medios complementados con 1 \mug/ml de 25-hidroxicolesterol y 15 g/ml de colesterol durante 24 horas antes del experimento. Las células se cambiaron a medio libre de suero durante 15 minutos y a continuación se incubaron con anticuerpos anti-N-SMasa o suero preinmune de conejo a la dilución indicada durante 30 minutos antes de la adición de TNF-\alpha (10 ng/ml). Las células se recogieron a continuación, se nodulizaron y se sometieron a lisis según se describe. Las muestras se sometieron a electroforesis sobre un gel de poliacrilamida al 7,5% y se transfirieron a una membrana de PVDF. Las bandas se visualizaron como se describe. La película se expuso durante 15 segundos.

Ejemplo 6 Efectos de TNF-\alpha, ceramida C_{2} y esfingomielinasa sobre la localización subcelular de SREBP-1

Para determinar si el fragmento de SREBP-1 generado mediante tratamiento con TNF-\alpha, ceramida C_{2} o esfingomielinasa era capaz de traslocación nuclear, se realizaron estudios de inmunofluorescencia. Estudios de inmunofluorescencia previos se han basado en la sobreexpresión de formas precursora y madura de SREBP-1 (14). Se pudo visualizar SREBP-1 endógena en células tratadas y no tratadas con anticuerpos policlonales dirigidos contra el dominio que se une a DNA de SREBP-1. Puesto que el dominio que se une a DNA es común a las formas tanto precursora como madura, era posible el examen de la distribución total de SREBP-1 endógena.

El TNF-\alpha, la ceramida C_{2} y la esfingomielinasa son todos capaces de inducir cambios en la localización subcelular de SREBP-1. Véase la Figura 5A. Las células no tratadas presentan un patrón de tinción uniforme a lo largo de sus cuerpos celulares. Esto está de acuerdo con la localización de la SREBP-1 precursora en membranas intracelulares (14). Sin embargo, las células tratadas con TNF-\alpha, ceramida C_{2} o esfingomielinasa exhibían todas una tinción nuclear intensa y poca tinción extranuclear. Véanse las Figuras 5B-5D. El cambio rápido en la localización subcelular de SREBP-1 está de acuerdo con una relación precursor/producto entre las dos formas y proporciona una evidencia adicional de que el fragmento de SREBP-1 madura generado mediante tratamiento es capaz de traslocación nuclear.

Las Figuras 5A-5D muestran la inmunofluorescencia indirecta de SREBP-1. Las Figuras 5A-5D se analizan con más detalle como sigue. Se visualizó SREBP-1 con anticuerpos policlonales de conejo dirigidos hacia el dominio de unión a DNA N-terminal que es común a las formas tanto precursora como madura. Las células se mantuvieron en medios complementados con 1 \mug/ml de 25-hidroxicolesterol y 15 \mug/ml de colesterol durante 24 horas antes del experimento. La inmunofluorescencia se realizó como se describe. Todas las ampliaciones son de 40 veces y todas las fotografías fueron tomadas de muestras que se fijaron 30 minutos después del tratamiento de iniciación. Figura 5A) Células de control, Figura 5B) Células tratadas con TNF-\alpha (10 ng/ml), Figura 5C) Células tratadas con esfingomielinasa (100 mUnidades), Figura 5D) Células tratadas con ceramida C_{2} (10 \muM).

Ejemplo 7 Ensayos de Cambio de Movilidad Electroforética

Se realizaron ensayos de cambio de movilidad electoforética para demostrar que el fragmento de SREBP-1 madura es capaz adicionalmente de unirse a su secuencia de consenso. La cantidad de sonda retardada electroforéticamente se incrementa con el tiempo después del tratamiento con TNF-\alpha. Véase la Figura 6A. La cinética de este proceso está de acuerdo con la activación de N-MSasa. La cantidad de sonda unida se incrementa con el tratamiento con esfingomielinasa y ceramida. Según se esperaba, la ceramida C_{2} induce una acumulación más rápida de SREBP-1 nuclear activa que el TNF-\alpha o la esfingomielinasa. Véanse las Figuras 6A-6C. Los anticuerpos dirigidos hacia el dominio que se une a DNA de SREBP compiten satisfactoriamente con la sonda oligonucleotídica con respecto a la unión. Véase la Figura 6D. La unión de la sonda no es valorada por un oligonucleótido no relacionado sino que se disminuye con la adición de una sonda competitiva no radiactiva.

Las Figuras 6A-6D muestran ensayos de cambio de la movilidad electroforética. Las Figuras 6A-D se explican con más detalle como sigue. Las células se mantuvieron en medio complementado con esterol. Los nódulos nucleares se prepararon y ensayaron como se describe en Materiales y Métodos. La sonda que se ha unido a SREBP-1 madura se indica como "Unida". La sonda no unida se indica como "Libre". La cinética (en minutos) de la unión de SREBP-1 a la sonda en respuesta al tratamiento con (Figura 6A) TNF-\alpha (10 mg/ml), (Figura 6B) esfingomielinasa (100 mUnidades) y (Figura 6C) ceramida C_{2} (10 M) (Figura 6D). Las células se trataron con TNF-\alpha (10 ng/ml), esfingomielinasa (100 mUnidades) o ceramida C_{2} (10 \muM) durante 15 minutos. Los ensayos de supercambio se realizaron a continuación con anticuerpos producidos contra el dominio de unión a DNA de SREBP-1. La presencia o ausencia de anticuerpo está indicada por (+) y (-), respectivamente. Se usó IgG preinmune como control.

Los experimentos de cambio de movilidad en gel en las Figuras 6A-D indican claramente que TNF-\alpha, N-SMasa y ceramida C_{2} inducen todos niveles de SREBP-1 en hepatocitos. Se sabe que el TNF-\alpha induce el metabolismo de esteroles en fibroblastos humanos cultivados (15) y receptores de LDL (16, 17). Los presentes datos indican que en efecto el TNF-\alpha induce el nivel de mRNA del receptor de LDL en hepatocitos humanos. Un resultado es que el incremento inducido por TNF-\alpha en el nivel de SREBP-1 madura está acompañado por receptores de LDL y metabolismo de esteroles incrementados.

Ejemplo 8 Efectos de la Sobreexpresión de Esfingomielinasa Neutra (N-SMasa) y N-SMasa Recombinante sobre la Maduración de Proteína que se une al Elemento Regulador de Esteroles 1 y la Expresión de Receptor de Lipoproteína de Baja Densidad en Hepatocitos Humanos Cultivados

El presente ejemplo se efectuó para consignar si la sobreexpresión de N-SMasa empleando dos DNA plasmídicos de N-SMasa separados (PHH-1, que representa toda la secuencia de nucleótidos en cDNA de N-SMasa, y PHH-11, que representa la secuencia de nucleótidos 862-1414) incrementaría la maduración de SREBP-1 y la expresión de mRNA del receptor de LDL en la línea celular de hepatocitos humanos HH-11. Las células transfectadas con cDNA plasmídico simulado (PSV-SPOT) servían como un control y las células incubadas con ceramida C-2 mostradas previamente para inducir la maduración de SREBP-1 servían como un control positivo.

Brevemente, hepatocitos humanos (1x10^{4}) se sembraron en 100 mm^{2} estériles en medio que contenía suero bovino fetal inactivado térmicamente dializado al 10%, sin antibióticos. Veinticuatro horas más tarde el medio se reemplazó por 9 ml de medio libre de suero reciente. Después de la incubación durante 30 minutos a 37ºC se añadieron 5-40 \mug del DNA plasmídico en 1 ml de una solución de CaCl_{2} (mezclada con un volumen igual de solución de CaCl_{2} 0,25-2,5 M en tampón de HEPES y tampón de HEPES, pH 6,95). Después de la mezcladura suave, la incubación de las células se continuó durante 5-24 horas a 37ºC. La reacción de transfección se terminó retirando el medio y lavando las células con medio libre de suero. A continuación, se añadió medio complementado con suero reciente y la incubación se continuó durante 24 horas adicionales y las células se recogieron en tampón apropiado, se centrifugaron y se almacenaron congeladas hasta el análisis adicional. Los nódulos celulares se homogeneizaron y partes alícuotas adecuadas se sometieron a análisis de inmunotransferencia Western según se describe posteriormente y en los Ejemplos 1-7 anteriormente. El RNA total se aisló de otra partida de células transfectadas como anteriormente y se sometió a análisis Northern empleando una secuencia de consenso del receptor de LDL marcada con ^{32}P. Las autorradiografías se revelaron y se fotografiaron.

Células transfectadas con 0,2 \mug/ml de PHH1 o PHH11 mostraban un incremento de 2 veces en la actividad de N-SMasa en comparación con células transfectadas con cDNA simulado. Esto estaba acompañado por un incremento dependiente de la concentración de PHH1 y PHH11 en la maduración de SREBP-1 en hepatocitos humanos. Véase la Figura 7. Como se muestra en los carrilles 3-6, la transfección de células con 5, 10, 20, 40 \mug de DNA del plásmido PHH1/plato daba como resultado un incremento gradual pero notable en la maduración de SREBP-1 en comparación con células transfectadas con cDNA simulado (carril 1, Figura 7). En contraste, se apreció un incremento notable en la maduración de SREBP-1 en células transfectadas con 20 \mug/plato de DNA del plásmido PHH11 (carril 9, Figura 7) pero remitía a una concentración superior. Según se espera de los Ejemplos 1-7 anteriores, las células incubadas con ceramida C-2 (\muM) incrementaban notablemente la maduración de SREBP-1 (carril 2, Figura 7). En experimentos adicionales se observó que incrementar el tiempo de transfección de 8 horas a 24 horas disminuía la maduración de SREBP-1 en hepatocitos. Por otra parte, disminuir la concentración de CaCl_{2} de 2,5 M a 0,25 M era ineficaz.

El análisis en gel Northern revelaba que la transfección con PHH1 y PHH11 (carriles 2, 3, respectivamente, en la Figura 8) incrementaba significativamente el nivel de mRNA del receptor de LDL en comparación con células transfectadas con cDNA simulado (carril 1, Figura 8).

En otro experimento los hepatocitos se incubaron con N-SMasa recombinante bacteriana purificada. Métodos preferidos para elaborar y usar la N-SMasa recombinante se describen en la Solicitud de Patente de EE.UU. en tramitación junto con la presente Nº de Serie 08/774.104, ahora expedida como Patente de EE.UU. 5.919.687. Esta N-SMasa se sometió a análisis de inmunotransferencia Western empleando anticuerpo contra SREBP-1. Según se muestra en la Figura 9, las células incubadas con ceramida C-2 incrementaban notablemente la maduración de SREBP-1 (carril 1). En comparación, la r-N-SMasa ejercía un incremento dependiente de la concentración en la maduración de SREBP-1 (carril 2, 3, 4, 5 que representa 0,4, 0,8, 2 y 4 \mug/ml de r-N-SMasa, respectivamente).

Este ejemplo muestra que la sobreexpresión de N-SMasa o alimentar r-N-SMasa a hepatocitos estimula la maduración de SREBP-1 y por consiguiente un incremento en los niveles de mRNA del receptor de LDL.

Los Ejemplos 1-8 anteriores destacan una nueva ruta por la que la maduración de SREBP-1 podría efectuarse de una manera independiente de los esteroles. Se encontró que el TNF-\alpha es capaz de inducir la maduración de SREBP-1 de una manera independiente de los esteroles en hepatocitos humanos. Estos hallazgos no son una respuesta general a factores de crecimiento, ya que no podían reproducirse con EGF o PDGF. La maduración, la translocación nuclear y la actividad de unión a SRE de SREBP-1 en respuesta a TNF-\alpha es estrechamente paralela a la cinética de activación de N-SMasa. El efecto de TNF-\alpha sobre la maduración de SREBP-1 podía repetirse con la esfingomielinasa ceramida C_{2} bacteriana humana suministrada exógenamente pero no podría reproducirse con dihidroceramida, PL-A2 o PL-D.

En particular, los Ejemplos 1-7 muestran que la adición de ceramida C_{2}, un análogo de ceramida soluble en agua, o esfingomielinasa bacteriana imitaban el efecto del TNF-\alpha sobre la maduración de SREBP-1. La ceramida C_{2} y la esfingomielinasa inducían una maduración de SREBP-1 más intensiva que el TNF-\alpha. Sin querer limitarse a una teoría, esta observación puede reflejar la presencia de un episodio regulador aguas arriba de la generación de ceramida que es evitado eficazmente con ceramida o esfingomielinasa exógena. Además, la falta de dependencia con la dosis aparente observada con el tratamiento con TNF-\alpha podría atribuirse a una unión saturable de los receptores de TNF-\alpha o un episodio regulador interno que reduce la capacidad de señalización de los receptores de TNF-\alpha.

Los datos y el análisis presentes indican un modelo en el que el TNF-\alpha inicia la proteolisis de SREBP-1, el modelo (Figura 7) en el que se muestra la unión de TNF-\alpha a uno o más de sus receptores de la superficie celular y al hacer esto promueve la activación de N-SMasa. La N-SMasa hidroliza la esfingomielinasa de membrana en ceramida y fosfocolina. La ceramida, a su vez, activa una proteasa, quizás CPP32, que media en la maduración de SREBP-1. De acuerdo con el modelo, la SREBP-1 madura migra a continuación al núcleo según se muestra y conduce la transcripción de genes con un elemento regulador de esteroles aguas arriba.

El modelo ilustrado en la Figura 7 clarifica cómo puede producirse la homeostasis de esteroles en presencia de esteroles citosólicos incrementados, lo que podría predecirse que suprime la maduración de SREBP-1. Una ventaja conferida por la participación de esfingomielinasa neutra en la homeostasis de colesterol es que es capaz de proporcionar una solución a corto plazo al agotamiento de colesterol a través de la movilización de colesterol de la membrana plasmática y puede facilitar mecanismos compensatorios a largo plazo promoviendo la maduración de
SREBP-1.

El modelo mostrado en la Figura 7 también muestra que el TNF-\alpha es capaz de inducir la proteolisis de SREBP-1 independientemente de la presencia de esteroles. Esfingomielinasa y ceramidas suministradas exógenamente también son capaces de inducir la proteolisis de SREBP-1 de una manera dependiente del tiempo y la dosis. La cinética de la maduración de SREBP-1 está de acuerdo con la activación de esfingomielinasa neutra por TNF-\alpha. Por otra parte, la N-SMasa humana recombinante también puede ejercer una inducción dependiente del tiempo y la concentración de la maduración de SREBP-1. Además, los anticuerpos anti-N-SMasa bloquean la maduración de SREBP-1. Estos hallazgos indican que la esfingomielinasa neutra es necesaria para la segmentación de SREBP-1 independiente de esteroles inducida por TNF-\alpha.

Los ejemplos y el análisis presentes identifican la N-SMasa en la ruta de transducción de señales iniciada por TNF-\alpha que conduce a la maduración de SREBP-1 y proporcionan una evidencia de que la ceramida es el segundo mensajero empleado. También se muestra un papel importante para el TNF-\alpha en la regulación de la homeostasis de colesterol.

Los presentes hallazgos se resumen como sigue. El papel del TNF-\alpha como un mediador de la maduración de SREBP-1 se investigó en hepatocitos humanos.

Un aspecto significativo de los ejemplos y el análisis anteriores es que la ceramida estimulaba la maduración de SREBP-1 incluso en presencia de colesterol y 25-hidroxicolesterol, ambos de los cuales son supresores conocidos de la maduración de SREBP-1. Esto indica que la maduración mediada por ceramida de SREBP-1 es un nuevo mecanismo independiente de esteroles por el que puede regularse la homeostasis de colesterol.

Los siguientes materiales y métodos se usaban según fuera necesario en los Ejemplos 1-8 anteriores.

1. Materiales - Una línea continua de hepatocitos humanos denominada HH-25 se preparó a partir de tejido humano normal (18). Medio esencial mínimo modificado alfa se adquirió de Mediatech (Herndon, VA). El suero bovino fetal se adquirió de Hyclone, Salt Lake City, Utah. El medio F10 y el complemento de insulina-transferrina-selenio se adquirieron de Gibco-BRL (Gaithersburg, MD). El EGF, PDGF y TNF-\alpha recombinantes humanos eran de Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY). La ceramida C_{2} (N-acetilesfingosina) se obtuvo de Matreya (Pleasant Gap, PA). La [^{14}C]-esfingomielina (actividad específica 50 mCi/mmol) era de American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, MO). El anticuerpo anti-SREBP-1 se adquirió de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). La esfingomielinasa de especies de Streptomyces y todos los otros profármacos se obtuvieron de Sigma.

2. Cultivo Celular - Células HH-25 se hicieron crecer en medio esencial mínimo alfa complementado con 100 unidades/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, 10 g/ml de insulina, selenio 0,1 \muM, 5,5 \mug/ml de transferrina, 0,5 \mug/ml de ácido linoleico y suero bovino fetal al 10% (medio A). Las células se incubaron en medio F10 libre de suero durante 30 a 60 minutos antes de iniciar el tratamiento con TNF-\alpha, ceramida C_{2} o esfingomielinasa.

3. Fraccionación de Células - Después del tratamiento, las células se lavaron con 5 ml de PBS y se nodulizaron a 1500 x g durante 10 minutos a 4ºC. El nódulo se almacenó a -70ºC y se sometió a lisis en 0,5 ml de tampón A (HEPES 10 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM, EGTA 0,25 mM, NaF 50 mM, \beta-mercaptoetanol 7 mM, sacarosa 0,35 M, NP-40 al 0,1% e inhibidores de proteasa PMSF 1 mM, 2 \mug/ml de aprotinina, 10 \mug/ml de leupeptina y 5 \mug/ml de pepstatina). El lisado se centrifugó a 12.000 x g durante 15 minutos a 4ºC para preparar una fracción nuclear. La concentración de proteína de estas muestras se determinó mediante el método de Lowry y otros (19).

4. Ensayo de Esfingomielinasa Neutra - Después de la estimulación con TNF-\alpha durante los intervalos de tiempo indicados, las células se lavaron una vez con 5 ml de PBS y se recogieron. El nódulo se almacenó congelado a -70ºC y se resuspendió en 0,5 ml de tampón B (Tris-HCl 100 mM, pH 7,4, Triton X-100 al 0,1%, EDTA 1 mM e inhibidores de proteasa). La suspensión de células se sonicó 3 veces (impulsos de 3 segundos) usando un sonicador de sonda y se centrifugó a 500 x g a 4ºC durante 5 minutos. El sobrenadante se usó como la fuente de enzima.

Se ensayaron 100 \mug de proteína con respecto a la actividad de esfingomielinasa neutra en un tampón que consistía en Tris HCl 50 mM, pH 7,4, Triton X-100 al 0,1%, 0,1 mg de BSA, MgCl_{2} 5 mM y 50 mmoles de [^{14}C]-esfingomielina (12.000 dpm). El ensayo se incubó a 37ºC durante 1,5 horas y se terminó con la adición de 1 ml de TCA al 10%. El precipitado se nodulizó (1000 x g a 4ºC durante 10 minutos) y 1 ml del sobrenadante se extrajo con 1 ml de éter dietílico anhidro. Se retiraron 0,5 ml de la fase acuosa para conteo por centelleo de líquidos.

5. Inmunotransferencia - Se separaron 50 \mug de proteína nuclear mediante electroforesis en gel sobre un gel de poliacrilamida al 7,5%. Los geles se calibraron con marcadores de peso molecular de alto intervalo (producto Bio-Rad Nº 161-0303, Nueva York, NY) que se transfirieron a una membrana de poli(difluoruro de vinilo) (PVDF) y se visualizaron con tinción de Coomassie. Se usaron anticuerpos policlonales de conejo contra SREBP-1 a 0,5 mg/ml de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo se visualizó con anti-(IgG de conejo) elaborada en burro, conjugada con peroxidasa de rábano picante (Amersham), usando the Enhanced Chemiluminescence (ECL) Western Blotting Detection System Kit (Amersham). Las membranas de PVDF se expusieron a Hyperfilm ECL (Amersham) durante el tiempo indicado. Las inmunotransferencias se cuantificaron a través de densitometría realizada sobre un explorador densitométrico PDI (modelo 20J7) acoplado a una estación de trabajo SPARC IRC.

5. Inmunofluorescencia Indirecta - Células HH-25 cultivadas se hicieron crecer sobre cubreobjetos y se trataron como se describe. Después del tratamiento, las células se lavaron 3 x 5 minutos con PBS que contenía MgCl_{2} 1 mM y CaCl_{2} 0,1 mM (solución A). Las células se fijaron con paraformaldehído al 3% en solución A durante 10 minutos y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5% en solución A durante 6 minutos a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se lavaron a continuación 3 x 5 minutos con solución A.

Se usó anticuerpo primario (anti-SERBP1) a una dilución de 0,5 g/ml en PBS y se aplicó durante 1 hora con remoción suave. Las células se lavaron como anteriormente y un anticuerpo secundario anti-(IgG de conejo) conjugado a FITC se aplicó durante 1/2 horas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cubreobjetos se lavaron, se montaron sobre portaobjetos de microscopio y se observaron y fotografiaron con los aumentos indicados sobre un microscopio de fluorescencia Zeiss Axiovert 25.

6. Ensayo de Fragmentación en Escalera de DNA - Las células se trataron con TNF-\alpha, esfingomielinasa o ceramida C_{2} durante 1 hora a concentraciones idénticas a las usadas en los estudios de maduración de SERBP-1. Las células se lavaron a continuación dos veces con medio esencial mínimo y se volvieron a alimentar con medio A durante 6 horas. Las células se recogieron y se preparó DNA genómico como se describe (22). El DNA genómico se sometió a electroforesis y se tiñó con bromuro de etilo.

7. Ensayos de Cambio de Movilidad Electroforética - Los ensayos de cambio de movilidad en gel se realizaron como sigue. Cada 20 \mul de mezcla de reacción contenían 8-10 \mug de proteína nuclear más una sonda oligonucleotídica de 25 pares de bases marcada con \alpha-[^{32}P] que contenía el sitio de unión a SERBP (14) en tampón de unión (Hepes 10 mM, pH 7,5, espermidina 0,5 mM, EDTA 0,15 mM, ditiotreitol 10 mM, sacarosa 0,35 mM). La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos y se cargó directamente en un gel de poliacrilamida al 6,5% (acrilamida/bisacrilamida 96:0,6) en un tampón de borato de Tris 25 mM (pH 8,0), EDTA 0,25 mM. En algunos experimentos, antisueros específicos para SERBP o sueros preinmunes se añadieron a las mezclas de reacción para determinar la composición de los complejos proteína-sonda. Para estos ensayos de "supercambio", los extractos se incubaron con 1 \mul de suero preinmune o un volumen igual de antisuero anti-SERBP a 4ºC durante 30 minutos antes de la adición de sonda marcada con \alpha-[^{32}P]. En todos los experimentos, las proteínas se separaron mediante electroforesis a 200 V durante 2 horas a temperatura ambiente. Los geles se secaron y se expusieron a película Kodak XAR con pantallas intensificadoras. Los ensayos se repitieron con extractos nucleares obtenidos de tres experimentos únicos y se evaluaron mediante análisis de fosfoimágenes para asegurar la reproducibilidad de los
resultados.

Referencias

1) Goeddel, D. V., Aggarwal, B. B., Gray, P. W., Leung, D. W., Nedwin, G. E., Palladino, M. A., Patton, J. S., Pennica, D., Shepard, H. M., Sugarman, B. J. y Wong, G. H. W. (1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597-609.

2) Baringa, M., (1996) Science 273,735-737. Bazzoni, F. y Beutler, B. (1996) NEJM 334, 1717-1725.

3) Chatterjee, S., (1993) Adv. Lipid Res. 26, 25-48.

4) Tepper, C. G., Jayadev, S., Liu, B., Bielawska, A., Wolff, R., Yonehara, S., Hannun, Y. A. y Seldin, M. F. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8443-8447.

5) Cifone, M. G., DeMaria, R., Roncaioli, P., Rippo, M. R. Azuma, M. Lanier, L. L., Santoni, A. y Testi, R. (1994) J. Exp. Med. 180, 1547-1552.

6) Okazaki, T., Bell, R. M. y Hannun, Y. A. (1995) J. Biol. Chem. 264, 19076-19080.

7) Mathias, S., Younes, A., Kan, C. C., Orlow, I., Joseph, C. y Kolesnick, R. N., (1993) Science 259, 519-522.

8) Dobrowsky, R. T., Werner, M. H., Castellino, A. M., Chao, M. V. y Hannun, Y. A. (1994) Science 265,1596-1599.

9) Chan, C. G. y Ochi, A. (1995) Eur. J. Immunol. 25, 1999-2004.

10) Kim, M. Y., Linardic, C. y Hannun, Y. A. (1991) J. Biol. Chem. 266,484-489.

11) Cuvillier, O., Pirianov, G., Kleuser, B., Vanek, P. G., Coso, O. A., Gutkind, J. S. y Spiegel, S., Nature 381, 800-803.

12) Goldstein, J. L. y Brown, M. S. (1986) Nature 343, 425-430.

13) Dawson, P. A.,Hofmann, S. L., van der Westhhuyzen, D. R., Brown, M. S. y Goldstein, J. L. (1988) J. Biol. Chem. 263, 3372-3379.

14) Wang, X., Sato, R., Brown, M. S. y Goldstein, J. L. (1994) Cell 77, 53-62.

15) Chatterjee, S., (1994) J. Biol. Chem. 269, 879-882.

16) Chatterjee, S. (1993) J. Biol. Chem. 268, 3401-3406.

17) Hamanaka, R., Kohno, K., Seguchi, T., Okamura, K., Morimoto, A., Ono, M., Ogata, J. y Kuwano, M. (1992) J. Biol. Chem. 267, 13160-13165.

18) Wang, X., Zelenski, N. G., Yang, J., Sakai, J., Brown, M. S. y Goldstein, J. L. (1996) EMBO 15, 1012-1020.

19) Mizushima, N., Koike, R., Kohsaka, H., Kushi, Y., Handa, S., Yagita, H., Miyasaka N. (1996) FEBS Lett. 395, 267-271.

20) Bittman, R., Kasireddy, C. R., Mattjus, P. y Slotte, J. P. (1994) Biochemistry 33, 11776-11781.

21) Kan, C., Ruan, Z. y Bittman, R., (1991) Biochemistry 30, 10746-10754.

22) Clejan, S. y Bittman, R., (1984) J. Biol. Chem. 259, 10823-10826.

23) Adam-Klages, S., Adam, D., Weigmann, K., Struve, S., Kolanus, W., Schneider-Mergener, J. y Kronke, M. (1996) Cell, 86, 937-947.

24) Lawler, F. J. y otros (1998) J. Biol. Chem. 273: 5058.

25) Shimomura, I. y otros (1998) J. Biol. Chem. 273: 35299.

26) Brown, M. S. y J. L. Goldstein (1997) Cell 89: 331.

27) Frishman, W. H. y Rapier, R. C. (1989) Med. Clinics of North America 73: 437-448.

La invención se ha descrito con referencia a modalidades preferidas de la misma. Sin embargo, se apreciará que los expertos en la técnica, al considerar esta descripción, pueden realizar modificaciones y mejoras.

<110> Johns Hopkins University

\hskip1cm

Chatterjee, Subroto

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Composiciones y métodos para modular el colesterol sérico.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> P00012 EP01

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> 00910316.9-2105/1155121

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2000-02-23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> PCT/US00/04657

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-02-23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210>

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1197

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1197)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 398

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

4

5

Claims

1. Un fármaco antilipémico que comprende ceramida, que es un efector de la proteína de unión al elemento regulador de esteroles 1 (SREBP-1), y un inhibidor del colesterol sérico, que es un inhibidor de HMG CoA reductasa.

2. Fármaco antilipémico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la ceramida es ceramida C-2.

3. Fármaco antilipémico de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el inhibidor del colesterol sérico se selecciona del grupo que comprende fluvastatina, simvastatina, lovastatina, pravastatina, mevinolina y atorvastatina.

4. Uso de un fármaco antilipémico de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, para la preparación de una composición farmacéutica para modular el nivel de colesterol sérico en un mamífero y/o para tratar un trastorno en un mamífero asociado con altos niveles de colesterol sérico.

5. Un método ex vivo para determinar la capacidad terapéutica de un fármaco antilipémico de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, para tratar una enfermedad relacionada con el colesterol en un mamífero, comprendiendo el método:

a) proporcionar una población de células capaces de expresar SREBP-1,

b) poner en contacto las células con el fármaco antilipémico en una cantidad suficiente para inducir la maduración de la SREBP-1,

c) cultivar las células en medio; y

d) detectar la maduración de la SREBP-1 como indicativa de la capacidad terapéutica del fármaco antilipémico para tratar la enfermedad.