ES2260763T3 - Nuevos polipeptidos de actividad toxica frente a insectos de la familia de los dipteros. - Google Patents
Nuevos polipeptidos de actividad toxica frente a insectos de la familia de los dipteros.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS CARACTERIZADO PORQUE CORRESPONDE AL FRAGMENTO HINDIII DE APROXIMADAMENTE 4,3 KB QUE PUEDE OBTENERSE, A PARTIR DEL PLASMIDO PJEG80.1 REGISTRADO EN LA CNCM EL 23 DE AGOSTO DE 1994 CON EL NUMERO I-1469 O CAPAZ DE HIBRIDAR EN CONDICIONES ESTRINGENTES CON ESTE PLASMIDO. SE REFIERE TAMBIEN A LOS POLIPETIDOS QUE RESULTAN DE LA EXPRESION DE ESTA SECUENCIA Y SU UTILIZACION EN COMPOSICIONES TOXICAS PARA INSECTOS.
Description
Nuevos polipéptidos de actividad tóxica frente a
insectos de la familia de los dípteros.
La lucha biológica contra los insectos de la
familia de los Dípteros, que comprende, por ejemplo, los mosquitos y
los simúlidos vectores de enfermedades tropicales, se efectúa
principalmente con ayuda de la bacteria Bacillus
thuringiensis ser. israelensis (Bti) del serotipo H14 o
con ayuda de Bacillus sphaericus. Estas dos bacterias
sintetizan durante la esporulación proteínas ensambladas en forma de
cristales, tóxicas por ingestión para las larvas de insectos. Los
cristales de B. thuringiensis ser. israelensis se
componen de 4 polipéptidos mayores CryIV A (125 kDa), CryIV B (135
kDa), CryIV D (68 kDa) y Cyt A (28 kDa), (Höfte H y col.,1989
Microbiol. Rev. 53:242-255). Los cristales de B.
sphaericus están constituidos por 2 polipéptidos de 51 y 42 kDa.
Estas proteínas tienen especificidades diferentes y cada una de
ellas contribuye a la toxicidad total, actuando en su caso
sinérgicamente. Con el fin de paliar la aparición posible de
insectos resistentes a las toxinas de Bti, se ha emprendido
la investigación de nuevas cepas que presentan una actividad en los
mosquitos.
Las cepas de B. thuringiensis activas en
mosquitos pueden clasificarse en cuatro grupos según su actividad
larvicida, su composición en proteínas del cristal y la presencia de
genes emparentados con los de la cepa B. thuringiensis ser.
israelensis:
(1) el grupo 1 contiene las seis cepas de B.
thuringiensis designadas respectivamente por morrisoni
PG14 (H8a8b), canadensis 11S2-1 (H5a5c),
thompsoni B175 (H12), malaysiensis IMR81.1 (H36), K6
(autoaglutinante) y B51
(autoaglutinante) que tienen una actividad larvicida similar y polipéptidos del cristal semejantes a los de B. thuringiensis ser. israelensis,
(autoaglutinante) que tienen una actividad larvicida similar y polipéptidos del cristal semejantes a los de B. thuringiensis ser. israelensis,
(2) el grupo 2 incluye las dos cepas de B.
thuringiensis medellin 163-131 (H30) y
jegathesan 367 (H28a28c) que son casi tan tóxicas como la
cepa B. thuringiensis ser. israelensis pero que
producen polipéptidos diferentes,
(3) el grupo 3 comprende la cepa
darmstadiensis 73E10-2 (H10a10b) que
sintetiza polipéptidos diferentes a los encontrados en los cristales
de B. thuringiensis ser. israelensis pero que está
activa en sólo una especie de mosquitos, y
(4) el grupo 4 que incluye las dos cepas
fukuokaensis (H3a3d3e) y Kyushuensis 74
F6-18 (H11a11c) que son sólo débilmente tóxicas.
Dada la débil toxicidad de las cepas de los
grupos 3 y 4, estas cepas no se han estudiado en profundidad.
Entre todas las cepas aisladas, la cepa de
Bacillus thuringiensis ser. jegathesan 367
(Btjeg), del serotipo H28a28c, parece interesante tanto desde
el punto de vista de su actividad como de la composición
polipeptídica de sus cristales. Esta bacteria produce como
Bti en el curso de la esporulación cristales tóxicos por
ingestión para las larvas de mosquitos. Esta cepa ha sido aislada en
Malasia por L. LEE e identificada como perteneciente a un nuevo
subtipo.
Los cristales de B. thuringiensis ser.
jegathesan contienen 7 polipéptidos mayores que tienen un
peso molecular de 80, 72-70, 65, 37, 26 y 16 kDa
respectivamente. La proteína de 37 kDa está emparentada
inmunológicamente con un componente del cristal de B.
thuringiensis ser. israelensis, mientras que las otras
proteínas dan sólo reacciones cruzadas débiles y variables. No se ha
detectado ningún gen emparentado con los de B. thuringiensis
ser. israelensis en esta cepa, lo que indica que las
proteínas del cristal podrían codificarse por una nueva clase de
genes de toxinas.
Los autores de la invención han identificado en
el ADN total de una cepa Btjeg 367 secuencias que codifican
polipéptidos susceptibles de inducir y/o de participar en la
actividad tóxica de la cepa frente a insectos de la familia de los
Dípteros en particular.
La invención tiene, por tanto, como objeto
secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de actividad
tóxica frente a insectos. Los insectos diana son, por ejemplo,
insectos de la familia de los Dípteros, sobre todo mosquitos o
simúlidos, y en particular las larvas de estos insectos. Sin
embargo, no se excluye que los polipéptidos obtenidos a partir de
las secuencias de la invención puedan presentar una actividad frente
a insectos de otras familias.
La solicitud se refiere igualmente a
polipéptidos que tengan una actividad larvicida frente a insectos, o
polipéptidos capaces de participar en una actividad tóxica
semejante, en su caso actuando sinérgicamente con polipéptidos que
determinan esta actividad.
Así, los polipéptidos de la invención son
susceptibles bien de inducir la actividad tóxica o bien de aumentar
el nivel de la toxicidad, frente a una diana dada.
En el marco de la invención entran igualmente
composiciones larvicidas que comprenden como principio activo los
polipéptidos de la invención u organismos recombinantes capaces de
expresar dichos polipéptidos, asociados en su caso a otros
constituyentes como, por ejemplo, de otros polipéptidos o células
recombinantes capaces de aumentar la actividad tóxica investigada,
obtenidos en su caso de otros organismos como, por ejemplo,
Bacillus thuringiensis, Bacillus sphaericus,
Clostridium bifermentans.
Un primer grupo de secuencias contiene una
primera secuencia de nucleótidos caracterizada porque corresponde al
fragmento HindIII de 4,3 kb aproximadamente, que puede obtenerse a
partir del plásmido pJEG80.1 presentado en la CNCM con el número
I-1.469, el 23 de agosto de 1994 o que puede
hibridar en condiciones estrictas con este plásmido.
En la figura 3 se representa el mapa de
restricción de la secuencia de Btjeg contenido en el plásmido
recombinante pJEG80.1 y se muestra la posición del inicio del gen
jeg80, así como su sentido de transcripción.
Según una forma de realización particular de la
presente invención, una secuencia de nucleótidos de este primer
grupo está comprendida en el fragmento HindIII de 4,3 kb
aproximadamente representado en la figura 3, tal que puede aislarse
a partir del plásmido pJEG80.1 presentado en la CNCM. Un fragmento
interesante es, por ejemplo, el fragmento
HindIII-Ndel de 2,2 kb aproximadamente. Este
fragmento contiene el origen del gen jeg80.
Según otra forma de realización particular de la
invención, la secuencia de nucleótidos que responde a la definición
precedente se caracteriza además porque comprende la cadena de
nucleótidos representada en la figura 4.
La invención se refiere también al gen jeg80
representado en la figura 5A cuya secuencia de codificación está
comprendida entre los nucleótidos 64 y 2.238.
La invención apunta también la secuencia no
codificadora por delante de la secuencia de codificación del gen
jeg80, que contiene las secuencias reguladoras de la expresión del
gen. En particular, la invención apunta el fragmento comprendido
entre los nucleótidos 1 y 124 de la cadena representada en la figura
4.
La invención se refiere igualmente a secuencias
de nucleótidos modificadas con respecto a las secuencias definidas
anteriormente, por ejemplo, por deleción, adición o sustitución de
nucleótidos, caracterizadas porque se hibridan en condiciones
estrictas con una de las secuencias identificadas anteriormente, y
porque codifican además un polipéptido que tiene una actividad
tóxica frente a insectos de la familia de los Dípteros o participa
en esta actividad.
Según la presente descripción, por polipéptidos
se entiende péptidos, polipéptidos o proteínas, o toda secuencia de
aminoácidos, que tienen las propiedades requeridas.
La actividad constatada de toxicidad frente a
insectos de la familia de los Dípteros no debe en ningún caso
considerarse limitativa para la definición de las secuencias de la
invención. Al contrario, esta referencia a los Dípteros constituye
únicamente un criterio de evaluación del interés de una secuencia
dada, sabiendo sin embargo que los insectos diana, tratándose de la
actividad tóxica, pueden pertenecer a otras familias.
La actividad tóxica evaluada con respecto a
insectos de la familia de los Dípteros puede, por ejemplo, probarse
en mosquitos o Simúlidos o en las larvas de estos insectos.
La actividad tóxica del producto de expresión de
una secuencia de nucleótidos de la invención puede evaluarse
midiendo la dosis letal necesaria para matar el 50% de una muestra
de larvas de insectos sometidos a ensayo (LC_{50}), cuando la
prueba se realiza en 150 ml de agua con 25 larvas por pocillo,
siendo estas larvas de estadio L4 para Aedes aegypti y
Culex pipiens y de estadio L3 para Anopheles
stephensi. Se añaden en los pocillos cantidades variables de
toxinas. Las larvas de Culex y de Anopheles se alimentan con
levadura de cerveza, a razón de 50 mg/1. La lectura de la prueba se
realiza a las 24 h y 48 h.
Una secuencia de nucleótidos que codifican un
polipéptido que tiene una actividad tóxica frente a insectos de la
familia de los Dípteros según la invención es, por ejemplo, una
secuencia que codifica un polipéptido que tiene un peso molecular de
80 kDa aproximadamente.
La invención tiene asimismo por objeto todo
fragmento obtenido de una secuencia de nucleótidos que responde a
uno de los criterios precedentes y se híbrida en condiciones
estrictas con una de estas secuencias, teniendo este fragmento al
menos 9 nucleótidos. Dichos fragmentos están destinados sobre todo a
usarse como sondas de hibridación o como cebos de oligonucleótidos
para la realización de reacciones de amplificación en cadena como
PCR. A modo de ejemplo, una secuencia de nucleótidos interesante es
la secuencia j80, que responde a la cadena siguiente:
AATAATATGATIAATTTTCCIATGTA (26
mer).
La presente solicitud tiene asimismo por objeto
un segundo grupo de secuencias de nucleótidos cuyo representante es,
por ejemplo, una secuencia de nucleótidos caracterizada porque
codifica un polipéptido que, en asociación con un polipéptido
codificado por una secuencia nucleotídica del primer grupo
presentada anteriormente, es capaz de participar en la actividad
tóxica de este último frente a insectos de la familia de los
Dípteros, hibridándose esta secuencia además con el oligonucleótido
j66 que tiene la secuencia siguiente:
ATGCATTATTATGGIAATIGIAATGA
La definición de esta secuencia nucleotídica con
respecto a su capacidad de participar en la actividad tóxica del
polipéptido codificado por una de las secuencias del primer grupo no
excluye la posibilidad de que esta secuencia nucleotídica codifique
un péptido que tiene de forma aislada una actividad tóxica frente a
insectos de la familia de los Dípteros.
El interés de este segundo grupo de secuencias
nucleotídicas puede, por ejemplo, obtenerse como resultado de que su
asociación con polipéptidos codificados por el primer grupo de
secuencias definido anteriormente puede conducir a una sinergia tal
que la actividad tóxica de la asociación de polipéptidos sea
superior a la suma de las actividades individuales de cada uno de
los polipéptidos de la asociación. Una secuencia de nucleótidos
particular de este segundo grupo codifica un polipéptido de 66 kDa
aproximadamente.
Un tercer grupo de secuencias nucleotídicas se
caracteriza porque éstas codifican polipéptidos que, en asociación
con un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos del
primer grupo o del segundo grupo, son capaces de participar en la
actividad tóxica de estos polipéptidos frente a insectos de la
familia de los Dípteros, estando estas secuencias nucleotídicas
caracterizadas además porque se hibridan con el oligonucleótido j37
que tiene la secuencia siguiente:
AATATIGAAATIGCIACAAGAGATTA
Una secuencia nucleotídica preferida de este
tercer grupo se caracteriza porque codifica un polipéptido de 37 kDa
aproximadamente.
La invención tiene por objeto un cuarto grupo de
secuencias nucleotídicas, que codifica un polipéptido que, en
asociación con al menos uno de los anteriores, es capaz igualmente
de participar en la actividad tóxica observada frente a insectos de
la familia de los Dípteros, codificando las secuencias de este
cuarto grupo un polipéptido que tiene un peso molecular de 70 kDa
aproximadamente o produciendo una reacción inmunológica con este
péptido.
Las condiciones de hibridación con los
oligonucléótidos son las condiciones de hibridación estrictas
descritas en el kit "ECL 3' oligo-labelling
detection kit" de Amersham, cuya temperatura de hibridación es de
42ºC y haciéndose el segundo lavado después de hibridación en 1 x
SSC - SDS al 0,1%.
La invención tiene también por objeto las
secuencias que rodean a la del gen jeg80, que corresponden a ISjeg
entre los nucleótidos 2.812 y 3.618 de la secuencia de la figura 6 y
de la región intergénica entre los nucleótidos 1.604 y 284 de la
figura 6.
La invención tiene asimismo por objeto un vector
de clonación o de expresión, caracterizado porque comprende una
secuencia de nucleótidos que responde a las definiciones dadas
anteriormente.
Un vector preferido en particular es el plásmido
pJEG80.1 presentado a la CNCM el 23 de agosto de 1994 con el nº
I-1.469.
La presente solicitud tiene asimismo por objeto
polipéptidos caracterizados porque constituyen el producto de
expresión en una célula recombinante, de al menos una de las
secuencias de nucleótidos de los grupos primero, segundo, tercero o
cuarto según se han definido en las páginas precedentes.
En particular, la invención se refiere al
polipéptido Jeg80 codificado por el gen jeg80 representado en la
figura 5A.
Son polipéptidos preferidos, por ejemplo, el
polipéptido de 80 kDa aproximadamente que comprende la secuencia de
aminoácidos representada en la figura 4, o el polipéptido de 80 kDa
aproximadamente que responde a la secuencia de aminoácidos
representada en la figura 5B, o todo fragmento de este polipéptido
que reacciona con anticuerpos dirigidos contra la proteína de 80 kDa
que responde a la secuencia de la figura 5B y/o que presenta una
actividad tóxica frente a larvas de insectos de la familia de los
Dípteros.
Los polipéptidos de la invención pueden usarse
solos o en combinación. Estas combinaciones (o mezclas) pueden
comprender diferentes polipéptidos de los grupos I, II, III o IV
según se han descrito anteriormente y/o una mezcla de uno o varios
de estos polipéptidos con otros polipéptidos obtenidos de organismos
diferentes y en particular de cepas de Bti, de B.
sphaericus o de C. bifermentans que tienen igualmente una
actividad tóxica frente a insec-
tos.
tos.
En el marco de la presente solicitud entran
igualmente células recombinantes modificadas por una secuencia de
nucleótidos como los definidos en las páginas precedentes o por un
vector que contiene una de estas secuencias.
Estas células hospedadoras recombinantes son de
células procariotas o eucariotas, y puede tratarse, por ejemplo, de
células de bacterias como, por ejemplo, de cepas de Bacillus
thuringiensis cepa Bti o de Bacillus sphaericus,
ver Clostridium bifermantans.
Cuando se trate de B. thuringiensis, se
hará referencia a la publicación de Lereclus D. y col. (1989), FEMS
Microbiology Letters 60, 211-218, en la que se
describe la técnica de transformación (por introducción de genes de
toxinas en Bt) de B. thuringiensis.
Cuando se trate de B. sphaericus, se
referirá, por ejemplo, a la publicación de Taylor L.D. y col. (1990)
FEMS Microbiology Letters 66, 125-128.
Otra célula según la invención puede ser una
célula eucariota como, por ejemplo, una célula vegetal.
Las células recombinantes pueden usarse para
producir los polipéptidos de la invención, pero pueden usarse
igualmente en composiciones tóxicas frente a insectos.
La solicitud tiene asimismo por objeto
anticuerpos policlonales dirigidos contra uno de los polipéptidos
definidos anteriormente, o incluso un suero policlonal dirigido
contra una mezcla de varios de ellos.
En los ejemplos y las figuras que se ofrecen a
continuación aparecen otras características y ventajas de la
invención.
Figura
1A
Se han purificado y depositado cristales de
cepas naturales Bti y Btjeg, y de la cepa recombinante
407 (pJEG80.1) en gel de poliacrilamida al 10%-SDS. Después de
electroforesis, se ha coloreado el gel con azul de Coomassie. A la
derecha se representa la masa molecular (en kDa) de proteínas
estándar. A la izquierda se indican las masas moleculares de
proteínas de Btjeg. Pocillos: 1, Bti; 2, Btjeg;
3, 407 (pJEG80.1).
A: Inclusiones purificadas correspondientes a 10
\mug de proteínas sometidas a electroforesis y coloreadas con azul
de Coomassie.
B: Inclusiones purificadas correspondientes a
1\mug de proteína sometida a electroforesis y transferidas en
filtro de nitrocelulosa. El filtro se ha incubado con el antisuero
(diluido 5.000 veces) frente a los cristales totales de Bt
ser. jeqathesan (a), ser. medellin (b), ser.
darmstadiensis (c), ser. israelensis (d) o contra las
inclusiones purificadas solubilizadas compuestas por CryIVA (e),
CryIVB (f), CryIVD (g) o CytA (h). Los polipéptidos inmunorreactivos
se han revelado con un segundo anticuerpo conjugado en peroxidasa
(diluido 20.000 veces). Las flechas entre A y B dan la posición de
Jeg80. Los nombres de la izquierda dan los pesos moleculares (kDa)
de las proteínas estándar; línea 1: inclusiones purificadas de la
cepa Btjeg 407: línea 2: inclusiones purificadas de la cepa 407
(pJEG80.1).
Figura
2
Figura
3
Vector pHT315
Fragmento que se híbrida con el oligonucleótido
j80
Inicio del gen jeg80 y sentido de
transcripción
Fragmento de ADN de Btjeg clonado en el
sitio HindIII del plásmido pHT315
Sitio de restricción del poliligador
No se ha encontrado ningún sitio de restricción
para las enzimas siguientes: BamHI, BglII, ClaI, EcoRV, KpnI, NcoI,
SacI, SacII, SmaI, SphI, XbaI y XhoI H = HindIII; E = EcoRI; K =
KpnI; Hp = HpaI; B = BamHI; N = NsiI;
Nd = NdeI; P = PstI; Pv = PvuII; Sm = SmaI; Sp = SphI; Ss = SstI; SI = SalI; Sy = StyI; X = XbaI.
Nd = NdeI; P = PstI; Pv = PvuII; Sm = SmaI; Sp = SphI; Ss = SstI; SI = SalI; Sy = StyI; X = XbaI.
Figura
4
Secuencia nucleotídica de una parte del gen
jeg80 y secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de
codificación: la secuencia en recuadro representa la secuencia de
aminoácidos determinada por microsecuenciación.
Figura
5
A: Gen jeg80. El sitio potencial de unión al
ribosoma está subrayado. Se indican los codones de inicio y de
parada de traducción. Las secuencias invertidas repetidas están
marcadas por flechas.
B: Secuencia de aminoácidos de la proteína
JEG80.
Figura
6
Secuencia nucleotídica del gen jeg80 (secuencia
de codificación comprendida entre los nucleótidos 1.352 y 3.526) y
de la ISjeg (Inverted repeat Sequence) (nucleótidos 58 a 864). Los
codones de inicio y de parada de la traducción están subrayados. El
terminador potencial de transcripción del gen jeg80 se indica
mediante flechas. Las secuencias repetidas en orientación inversa
que delimitan la ISjeg aparecen en recuadro.
Figura
7
Los aminoácidos idénticos con correspondencia
están en recuadro. Los residuos idénticos en el plan funcional se
indican mediante puntos (las sustituciones conservadoras son I, L, V
y M; D y E; Q y N; K y R; T y S; G y A; y F y Y). Se indican las
regiones similares a los bloques 1 y 4 presentes en todas las
proteínas CryI, CryIII y ciertas CryIV. Las flechas verticales
representan los sitios de escisión para las proteasas en la toxina
CryIVD solubilizada (ref. 11). Los números indican el último residuo
de cada línea para cada proteína.
E. coli TG1 [K12,
\Delta(lac-proAB) supE thi hdsD F'
(traD36 proA \pm proB\pm
lacZ\Delta lacI^{g} I lacZ\DeltaM15)] y
pHT315 (Arantès, O. y col. (1991) Gene 108:115-119)
se han usado como hospedadores de donación y vectores,
respectivamente. B. thuringiensis ser. jegathesan 367
se ha usado para purificar los cristales de tipo silvestre y el ADN
para los experimentos de donación. B. thuringiensis ser.
thuringiensis SPL407 (Lereclus, D. y col. (1989) FEMS
Microbiol. Lett. 60:211-218) se ha usado como cepa
receptora para los experimentos de transformación. La cepa B.
thuringiensis ser. israelensis 4Q2-81
(pHT640) se ha usado como fuente de inclusiones CryIVD (Poncet, S. y
col. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59:
3928-3930).
B. thuringiensis SPL407 se ha
transformado por electroporación según la técnica descrita en la
publicación citada anteriormente (Lereclus, D. y col.) y E.
coli se ha transformado según la descripción dada anteriormente
en la publicación de Lederberg, E.M. y col. (1974) J. Bacteriol.
119:1072-1074. Las concentraciones en antibióticos
para la selección bacteriana eran de 25 \mug de eritromicina por
ml y 100 \mug de ampicilina por ml.
Se han usado enzimas de restricción, la ligasa
T4 de la ADN y la fosfatasa alcalina intestinal de ternera según la
descripción de Sambrook y col. (Sambrook, J. y col. (1989) A
laboratory manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, N.Y.) y según las instrucciones de los fabricantes.
El ADN total se ha aislado de B.
thuringiensis ser. jegathesan según la descripción de
Delécluse, A. y col. (1991) J. Bacteriol.
173:3374-3381. El ADN del plásmido se ha extraído a
partir de E. coli por un procedimiento de lisis alcalina
estándar como la descrita por Birnboim H.C. y col. (1979) Nucleic
Acids Res. 7:1513-1523 y se ha purificado de
manera suplementaria usando el kit Qiagen (Qiagen GmbH, Alemania).
Se han purificado fragmentos de ADN en gel de agarosa con el kit de
purificación de ADN Prep A Gene (BioRad, Hercules, California).
Los experimentos de hibridación se han realizado
en filtros Hybond N^{+} (Amersham, Buckingamshire, Reino Unido).
Los oligonucleótidos se marcaron con fluoresceína usando el sistema
de marcaje de oligonucleótidos ECL 3' oligolabeling (Amersham).
Las secuencias de ADN se han determinado a
partir de plásmidos desnaturalizados en medio alcalino usando el
procedimiento de terminación de cadenas didesoxi (Sanger, F. y col.
(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467) con
el kit Sequenase versión 2.0 (U.S. Biochemical Corp., Cleveland,
Ohio) y el \alpha-^{35}S-dATP
(>37 TBq/mmol; Amersham). Se ha usado una serie de
oligonucleótidos sintéticos (Eurogentec, Bélgica) para determinar la
secuencia de las dos cadenas.
Se han usado los programas informáticos de
análisis de secuencias de Genetics Computer Group (Universidad de
Wisconsin, Madison).
Se ha cultivado la cepa Btjeg 367 en
medio habitual glucosado a 30ºC con agitación durante 72 horas
aproximadamente hasta la lisis de bacterias esporulantes. Se han
recogido las mezclas de esporas-cristales por
centrifugado y se han purificado los cristales en gradiente de
sacarosa, según la técnica descrita por THOMAS y ELLAR
(THOMAS and ELLAR, 1983, J. Cell. Sci., 60, 181-197). El análisis de la composición polipeptídica de estos cristales se ha realizado por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS seguido de una coloración con azul de Coomassie. Los resultados obtenidos, representados en la figura 1, muestran que los cristales de la cepa Btjeg están constituidos por varios polipéptidos de 80, 72, 70, 66, 50, 37 y 28 kDa (de los que varios podrían ser productos de degradación).
(THOMAS and ELLAR, 1983, J. Cell. Sci., 60, 181-197). El análisis de la composición polipeptídica de estos cristales se ha realizado por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS seguido de una coloración con azul de Coomassie. Los resultados obtenidos, representados en la figura 1, muestran que los cristales de la cepa Btjeg están constituidos por varios polipéptidos de 80, 72, 70, 66, 50, 37 y 28 kDa (de los que varios podrían ser productos de degradación).
Experimentos de inmunodetección realizados con
ayuda de un suero dirigido contra las proteínas de Bti han
permitido demostrar que la proteína de 37 kDa está emparentada
inmunológicamente con las toxinas de Bti; con este suero
reacciona asimismo una proteína de 100 kDa aproximadamente, no
detectada en gel después de coloración con azul de Coomassie.
Los cristales de esta cepa presentan, en larvas
de Aedes aegypti, Anopheles stephensi y Culex
pipiens, una toxicidad inferior a la obtenida con los cristales
de Bti pero que, no obstante, es importante, como se indica
en la tabla siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
| Cristales | CL_{50} en ng/ml a 24 h (intervalo de confianza) en: | ||
| Aedes aegypti | Anopheles stephensi | Culex pipiens | |
| Bti 1884 | 20 (16-24) | 39 (29-49) | 20 (14-26) |
| Btjeg 367 | 240 (174-306) | 165 (119-211) | 77 (65-89) |
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha aislado el ADN total de la cepa
Btjeg 367 según la técnica descrita anteriormente (DELECLUSE
y col., 1991, J. Bacteriol., 173, 3374-3381), y
después se ha hidrolizado mediante la enzima EcoRI. Los
fragmentos obtenidos se han separado por electroforesis en gel de
agarosa al 0,6%, y después se han transferido a una membrana de
nailon (Hibond N+, Amersham).
Además, los genes CryIVA, CryIVD y
CytA de Bti se han obtenido después de hidrólisis de
plásmidos recombinantes pHT606, pHT611 y pCB4, como se indica en la
figura 2. Los fragmentos de ADN que contienen los genes de
Bti se han purificado después de separación en gel de agarosa
y después se han marcado con peroxidasa con ayuda del kit "ELC
direct nucleic acid" labelling (Amersham), y se han usado en
experimentos de hibridación con el ADN total hidrolizado de la cepa
Btjeg.
No se ha obtenido ninguna hibridación entre el
ADN de la cepa Btjeg y los genes de Bti, al menos en
las condiciones de hibridación usadas (80% de homologías).
Se han determinado las secuencias
amino-terminales de las proteínas de 80, 66 y 37 kDa
en el laboratorio de microsecuenciación del Instituto Pasteur usando
un secuenciador automático (Applied Biosystems) después de
transferencia de la proteína a las membranas Problot (Applied
Biosystems); la cadena así obtenida se muestra en la tabla a
continuación.
Se han sintetizado oligonucleótidos
correspondientes a las proteínas JEG80, JEG66 y JEG37 (secuencias
subrayadas), usando el código genético determinado para varios genes
de B. thuringiensis e incorporando inosina en cada
ambigüedad. La secuencia de estos oligonucleótidos se representa en
la tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
| Secuencias aminoterminales | Secuencias oligonucleotídicas |
| JEG80:MQNNNFNTTEINNMINFPMY | j80:AATAATATGATIAATTTTCCIATGTA (26 mer) |
| JEG70: M/XFASYG/XR/DNEY/L | |
| JEG66:MHYYGNRNEYDILNA | j66:ATGCATTATTATGGIAATIGIAATGA (26 mer) |
| JEG37:TITNIEIATRDYTNXDXTGE | j37:AATATIGAAATIGCIACIIGIGATTA (26 mer) |
\vskip1.000000\baselineskip
En estas secuencias, "I" representa a la
desoxiinosina, usada como base neutra para todas las posiciones que
pueden corresponder a tres o cuatro nucleótidos.
Se han realizado experimentos de hibridación
entre los oligonucleótidos marcados con fluoresceína y el ADN total
de la cepa Btjeg, hidrolizado por EcoRI,
HindIII, XbaI o PstI. Se ha usado la técnica de
sondas frías (3' oligonucleótido labelling system, Amersham). Los
resultados obtenidos se indican en la tabla a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
| Oligonucleótidos | Temperatura de hibridación | Tamaño de los fragmentos | |||
| EcoRI | HindIII | XbaI | PstI | ||
| j80 | 42ºC | 2 kb | 4 kb | 12 kb | 12 kb |
| j66 | 47ºC | 7 kb | 14 kb | 10 kb | 14 kb |
\vskip1.000000\baselineskip
La sonda se ha hibridado específicamente a 42ºC
en un fragmento de restricción HindIII único de 4 kb aproximadamente
y en un fragmento de restricción EcoRI único de 2 kb
aproximadamente.
Se ha construido un banco de ADN de la cepa
Btjeg con E. coli TGI usando el plásmido bifuncional
pHT315 (ARANTES y LERECLUS, 1991, Gene, 108,
115-119) como vector de clonación. Se ha hidrolizado
el ADN total de la cepa Btjeg mediante HindIII, y
después se ha sometido a una electroforesis en gel de agarosa. Se
han purificado fragmentos de 2 a 6 kb aproximadamente y se han
clonado en este vector. Se han insertado fragmentos HindIII
de 3 a 5 kb en el sitio HindIII del vector lanzadera pHT315
tratado con fosfatasa alcalina. Se han sometido a prueba los clones
recombinantes obtenidos después de transformación de la cepa de
E. coli TGI con las mezclas de ligado obtenidas para su
hibridación con el oligonucleótido j80 marcado. De 1.000 clones
recombinantes obtenidos, 5 presentaban una reacción positiva. Se ha
seleccionado y analizado un clon recombinante, JEG80.1. Este clon
contiene un plásmido recombinante (pJEG80.1) de 10,9 kb; el
fragmento HindIII de ADN insertado tiene un tamaño de 4,3 kb.
Se ha determinado el mapa de restricción del
plásmido pJEG80.1 y se representa en la figura 3. Los experimentos
de hibridación realizados con el oligonucleótido j80 han permitido
localizar la posición de este oligonucleótido en el fragmento
HindIII de 4,3 kB. Además, los experimentos de PCR, realizados con
las combinaciones de oligonucleótidos j80 + universal y j80 +
invertido han permitido localizar con más precisión el inicio del
gen que codifica la proteína JEG80 (jeg80), así como su sentido de
transcripción (figura 3).
Se realiza la secuencia nucleotídica del gen
jeg80 mediante la técnica de SANGER en el plásmido pJEG80.1
previamente desnaturalizado con sosa. Los cebos usados son el
oligonucleótido j80, el oligonucleótido invertido u oligonucleótidos
deducidos de las secuencias leídas. En la figura 4 se representa una
secuencia parcial (933 pb a partir del extremo 5' del gen), con la
secuencia de aminoácidos correspondiente.
Se ha determinado la secuencia pJEG80.1 en la
región que contiene el gen para la proteína de 80 kDa (designada
jeg80) en las dos cadenas (figura 5). Se ha encontrado un marco
abierto de lectura que codifica un polipéptido de 724 residuos con
una masa molecular calculada de 81.293 Da. Se ha examinado la
secuencia para determinar toda región que podría emparentarse con
estructuras de promotor de B. thuringiensis. No se ha
encontrado ninguna secuencia de promotor la secuencia que comporta
50 nucleótidos aproximadamente por delante del codón de inicio. Por
detrás del codón de parada (posición 2.249 a 2.282, Figura 5), se
han identificado secuencias invertidas y repetidas, secuencias
capaces de formar una estructura en bucle con un \DeltaG = -76,9
kJ/mol calculado según reglas definidas por Tinoco y col. (Tinoco,
I.J y col. (1973) Nature (Londres) New Biol.
246:40-41).
Esta estructura puede actuar como terminador de
transcripción. Se han identificado doce nucleótidos por delante del
codón de inicio, que constituyen una secuencia AAAGAAGAGGG, como
constituyente de un sitio de enlace en el ribosoma (figura 5).
Se ha comparado la secuencia en aminoácidos
deducida de la secuencia nucleotídica obtenida con las secuencias de
otras proteínas presentes en el banco de datos Swiss Prot. Este
análisis ha permitido demostrar que la proteína Jeg80 presenta una
similitud del orden de 67% con la parte N-terminal
de la proteína CryIVD de Bti; en la totalidad de la secuencia
de aminoácidos, la similitud es del 58% aproximadamente (figura 7) y
de grado menor (36%) con las proteínas CryII de Bt
kurstaki.
Se conservan cinco bloques entre las toxinas
CryI, CryIII y la mayor parte de las toxinas CryIV (Höfte, H. y col.
(1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Sin embargo, en
Jeg80 sólo se ha encontrado el bloque 1 (figura 7), con una región
de arginina alterna reminiscente del bloque 4 y, sin embargo,
similar (figura 7). Jeg80 presenta una cadena de 82 aminoácidos que
comprenden cinco residuos cisteína en su parte
COOH-terminal, ausente de CryIVD. La región sensible
a la actividad de la proteasa de CryIVD (Dai, S.-M. y col. (1993)
Insect. Biochem. Molec. Biol. 23:273-283) localizada
en el medio de la proteína (aminoácidos 348-357,
figura 7) no se conserva en Jeg80.
Se ha introducido el plásmido pJEG80.1 en la
cepa de Bt 407 cry- por electroporación según la técnica
descrita por LERECLUS y col. (LERECLUS y col. 1989, FEMS Microbiol.
Lett. 60, 211-218). Se ha seleccionado un
transformante, 407 (pJEG80.1), para análisis complementario. Este
clon se produce durante la esporulación de inclusiones visibles en
microscopía óptica. No había ninguna inclusión de este tipo presente
en las células que contenían el vector pHT315 en solitario. Se ha
analizado el producto de expresión de jeg80 por SDS PAGE y después
de coloración con azul de Coomassie brillante (figura 1). El
polipéptido principal de las inclusiones, purificado a partir de la
cepa recombinante 407 (pJEG80.1), tenía un peso molecular de 80 kDa
aproximadamente (figura 1, línea 3), el mismo que el del mayor
polipéptido de los cristales de la cepa silvestre 367 (figura 1,
línea 2). Estas inclusiones se han purificado en gradiente de
sacarosa: están constituidas únicamente por la proteína Jeg80
(figura 1). Se han sometido a prueba reacciones inmunológicas entre
el polipéptido Jeg80 y las proteínas del cristal de B.
thuringiensis ser jegathesan, B. thuringiensis
ser israelensis, B. thuringiensis ser medellin
y darmstadiensis. Los resultados de la reacción inmunológica
se recogen en la figura 1 B. Esta proteína reacciona con anticuerpos
dirigidos contra los cristales totales de Btjeg, así como con
el suero anticristales de Bti, y anticristales totales de la cepa
Bt medellin (otra cepa activa en mosquitos, de un nuevo
serotipo, H30, identificado recientemente).
Se han sometido a prueba los cristales
purificados de la cepa 407 (pJEG80.1) con respecto a su actividad en
larvas de mosquitos, en comparación con los cristales provenientes
de la cepa Btjeg que contienen todas las proteínas. También
se han realizado pruebas con la cepa 4Q2-81 (pHT
640) que produce solamente la proteína CryIVD. Los resultados
preliminares indican que la proteína Jeg80 es activa en las tres
especies de mosquitos sometidas a prueba: A. aegypti, A.
stephensi y C. pipiens. La toxicidad de la proteína Jeg80
es más elevada en C. pipiens (tabla 1). Además, el nivel de
toxicidad obtenido para la proteína Jeg80 sólo es comparable en
A. stephensi al observado con los cristales de
Btjeg.
La proteína Jeg80 es más tóxica que la cepa
silvestre frente a A. aegypti y también tóxica frente a C.
pipiens y A. stephensi. Además, y pese a las similitudes
con CryIVD, la proteína Jeg80 es más tóxica que CryIVD: 10 veces
más, aproximadamente, ante A. aegypti y A. stephensi,
y 40 veces más ante C. pipiens.
Se ha sometido a prueba la actividad tóxica en
las condiciones siguientes: los mosquitos usados se han mantenido en
laboratorio a 26ºC, en una atmósfera húmeda a 80% y durante un
período día-noche de 14 h-10 h. Las
larvas se han sometido a un tratamiento con agua declorada y se han
alimentado con galletas para gatos comerciales. Se han diluido las
inclusiones purificadas en cápsulas de plástico que contenían 150 ml
de agua desionizada y se han probado en doble frente a 25 larvas de
A. aegypti y C. pipiens de estadio cuatro y A.
stephensi de estadio tres. Cada prueba se ha repetido al menos
cinco veces. Se ha registrado la mortalidad de las larvas después de
48 horas y se han determinado las dosis letales (LC_{50S}) por
análisis Probit.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Anteriormente se han descrito la clonación y la
caracterización de un nuevo gen de B. thuringiensis, el gen
jeg80 de la cepa jegathesan 367. El gen jeg80 codifica una proteína
de peso molecular 81.293 Da.
La proteína Jeg80 es similar a la toxina
larvicida frente a mosquitos CryIVD de B. thuringiensis ser.
israelensis. Se trata de la única proteína conocida que
presenta similitudes con CryIVD, lo que sugiere que estas dos
proteínas han evolucionado a partir de un ancestro común. La
proteína Jeg80 comparte igualmente una débil similitud con las
proteínas CryII, comparable a la semejanza existente entre CryIV y
CryII. Sin embargo, existen diferencias esenciales entre Jeg80 y
CryIVD, en particular en el nivel de la parte
carboxi-terminal de la proteína. Jeg80 comporta una
secuencia de 82 aminoácidos que incluye 5 residuos de cisteína,
secuencia que está ausente en CryIVD. Bietlot y col. (Bietlot, H.P.
y col. (1990) Biochem. J. 267:309-315) han descrito
la importancia dichos residuos, con estabilidad de varias
\delta-endotoxinas, producidas por diferentes
cepas de B. thuringiensis. Esta estructura podría ser
esencial para la formación del cristal y la actividad insecticida.
La mutagénesis podría usarse para identificar el papel de esta parte
carboxi-terminal original de Jeg80. Existen
igualmente diferencias importantes entre las regiones que flanquean
los genes CryIVD y jeg80. El gen CryIVD es el segundo gen de un
operón que contiene otros dos genes, p19 y p20 (Adams, L.F. y col.
(1989) J. Bacteriol. 171:521-530 y Dervyn, E. y col.
(1995) J. Bacteriol. 177:2283-2291). Aunque los
péptidos correspondientes, P19 y P20 no sean esenciales para la
expresión de CryIVD, podrían actuar como proteína chaperona para
estabilizar ciertos componentes del cristal de B.
thuringiensis ser. israeliensis (Chang, C. y col. (1993)
Appl. Environ. Microbiol. 59:815-821; Denryn, E. y
col. (1995) J. Bacteriol.177:2283-2291 y Wu, D. y
col. (1994) Mol. Microbiol. 13:965-972). No se ha
reconocido ningún ambiente de este tipo para el gen jeg80: no se ha
encontrado ningún homólogo a p20 por detrás de jeg80. Sin embargo,
el fragmento de clon de ADN en el plásmido Jeg80.1 podría ser
demasiado pequeño para contener el punto de inicio de otro gen. De
forma similar, no se ha encontrado ningún gen emparentado a p19 en
el fragmento de 1 kb por delante de Jeg80. Por el contrario, a una
distancia de 550 pb por delante del gen jeg80, se ha identificado un
marco abierto de lectura orientado en la dirección opuesta. Las
comparaciones de la secuencia de aminoácidos deducida con otras con
ayuda del banco de datos Swiss Prot han revelado similitudes con la
transposasa de la secuencia de inserción IS240 de B.
thuringiensis ser. israeliensis (Delécluse, A. (1989)
Plasmid 21:71-78). Dos copias de IS240 flanquean al
gen cryIVA en la variedad israeliensis (Bourgouin, C. y col.
(1988) J. Bacteriol. 170:3575-3583), pero no se ha
encontrado ninguna en la proximidad del gen cryIVD, por más que se
haya encontrado una variante IS231 por detrás del gen p20 (Adams,
L.F. y col. (1989) J. Bacteriol. 171:521-530). Los
elementos de inserción pueden dar cuenta de la dispersión de los
genes de toxinas entre las diferentes cepas de B.
thuringiensis. El gen cryIVD se transcribe a partir de dos
promotores, reconocidos por la ARN polimerasa asociada con los
factores \sigma35 o \sigma28 de B. thuringiensis (Dervyn,
E. y col. (1995) J. Bacteriol. 177:2283-2291). El
análisis de la secuencia de la región por delante del gen jeg80 no
ha revelado promotor de consenso de B. thuringiensis. Es
posible que jeg80 se transcriba a partir de un promotor reconocido
por los factores \sigma, diferentes de \sigma35 y \sigma28, o
que el promotor se localice muy por delante del gen jeg80, es decir,
por delante de la secuencia emparentada con la secuencia IS240. La
proteína Jeg80 reacciona de forma cruzada con anticuerpos dirigidos
contra CryIVD y CryIVA. Aunque los genes jeg80 y cryIVA no presentan
similitudes importantes, las proteínas pueden, no obstante,
compartir dominios similares. La proteína Jeg80 ha reaccionado
asimismo con un suero contra las proteínas totales de B.
thuringiensis ser. medellin. Los experimentos previos no
habían revelado polipéptidos análogos al polipéptido CryIVD en esta
cepa (Orduz, D. y col. (1994) Microbiol. Biotechnol. 40:
794-799 y Ragni, A. y col. (remitido para
publicación)).
Las inclusiones compuestas de la proteína Jeg80
en solitario eran tan tóxicas como las inclusiones de la cepa
silvestre B. thuringiensis ser. jegathesan frente a
las larvas de las cepas C. pipiens y A. stephensis y
más tóxicas que la cepa silvestre en las larvas de A.
aegypti. Éste es el primer resultado de la existencia de una
proteína que tiene una actividad tóxica frente a las larvas de
mosquito, capaz en forma aislada de presentar una actividad similar
a la de una mezcla de diferentes polipéptidos. En el caso de B.
thuringiensis ser. israeliensis, los polipéptidos
aislados e incluso las combinaciones de dos o tres componentes del
cristal son menos tóxicos que los cristales de tipo silvestre
(Angsuthanasombat, C. y col. (1987) Mol. Gen. Genet.
208:384-389; Delécluse, A. y col. (1993) Appl.
Environ. Microbiol. 177:2283-2291; Poncet, S. y col.
(J. Invertebr. Pathol.: in press) y Wu, D. y col. (1994) Mol.
Microbiol. 13:965-972). La fuerte actividad de la
cepa israeliensis se debe a interacciones sinérgicas entre
diferentes polipéptidos del cristal. En la cepa jegathesan no
se excluyen dichas interacciones, aunque la proteína Jeg80 aparece
como un contribuidor predominante de la toxicidad. Sin embargo,
Jeg80 no es el componente principal de los cristales de
jegathesan. Otros polipéptidos de los cristales,
probablemente proteínas de 65 kDa o 37 kDa o las dos, son
responsables de la actividad complementaria.
Jeg80 es mucho más tóxica (de 6 a 40 veces más
tóxica, según las especies de mosquitos sometidos a prueba) que
CryIVD, pese a su fuerte similitud. Esta diferencia de actividad
podría reflejar modos de acción diferentes de las dos toxinas. Esta
diferencia podría aprovecharse en el desarrollo de
insecticidas.
<110> INSTITUTO PASTEUR
\vskip0.400000\baselineskip
<120> NUEVOS POLIPÉPTIDOS DE ACTIVIDAD
TÓXICA FRENTE A INSECTOS DE LA FAMILIA DE LOS DÍPTEROS
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<130> B2571AA - I. PASTEUR
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1994-08-25
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1995-08-24
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<160> 13
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido j80
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = inosina (i)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaataatatga tnaattttcc natgta
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido j66
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = inosina (i)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgcattatt atggnaatng naatga
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido j37
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).. (26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = inosina (i)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatatngaaa tngcnacaag agatta
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia aminoterminal de JEG80
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Gln Asn Asn Asn Phe Asn Thr Thr Glu Ile
Asn Asn Met Ile Asn}
\sac{Phe Pro Met Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia aminoterminal de JEG66
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met His Tyr Tyr Gly Asn Arg Asn Glu Tyr Asp
Ile Leu Asn Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia aminoterminal de JEG37
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<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ile Thr Asn Ile Glu Ile Ala Thr Arg Asp
Tyr Thr Asn Xaa Asp}
\sac{Xaa Thr Gly Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido j37
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (1).. (26)
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<223> n = inosina (i)
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatatngaaa tngcnacnng ngatta
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1254
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus thuringiensis
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (325).. (1254)
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 310
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<210> 10
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<211> 2434
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus thuringiensis
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<400> 10
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<211> 3675
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<212> ADN
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<213> Bacillus thuringiensis
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<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 724
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus thuringiensis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 643
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus thuringiensis
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. Polinucleótido caracterizado porque
corresponde al fragmento HindIII de 4,3 kb aproximadamente que puede
obtenerse a partir del plásmido pJEG80.1 presentado en la CNCM el 23
de agosto de 1994 con el número I-1.469 o porque es
capaz de hibridar en condiciones estrictas con el fragmento
HindIII de este plásmido.
2. Polinucleótido según la reivindicación 1,
caracterizado porque está comprendido en el fragmento
HindIII de 4,3 kb aproximadamente y porque codifica un
polipéptido que tiene una actividad tóxica frente a insectos de la
familia de los Dípteros.
3. Polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque comprende la cadena de nucleótidos
siguiente o la cadena contenida en la siguiente, comprendido entre
los nucleótidos 325 y 1.260:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
4. Polinucleótido, caracterizado porque
responde a la secuencia del gen jeg80 representada en la figura 5A
entre los nucleótidos 64 y 2.238.
5. Polinucleótido, caracterizado porque
se hibrida en condiciones estrictas con un polinucleótido según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y porque codifica un
polipéptido que tiene una actividad tóxica frente a insectos de la
familia de los Dípteros.
6. Polinucleótido según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque codifica un
polipéptido que tiene una actividad tóxica frente a insectos de la
familia de los Dípteros y que tiene un peso molecular de 80 kDa
aproximadamente.
7. Polinucleótido de B. thuringiensis
jegathesan, caracterizado porque se híbrida en
condiciones estrictas, a una temperatura de 42ºC y con un segundo
lavado después de hibridación en 1 x SSC - SDS al 0,1%, con el
oligonucleótido j66 que tiene la secuencia siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
ATGCATTATTATGGIAATIGIAATGA
\vskip1.000000\baselineskip
y porque codifica un polipéptido de
66 kDa aproximadamente que comprende la secuencia MHYYGNRNEYDILNA
que, cuando se asocia con un polipéptido codificado por un
polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,
participa con este último en la actividad tóxica frente a insectos
de la familia de los
Dípteros.
8. Polinucleótido de B. thuringiensis
jegathesan, caracterizado porque se hibrida en
condiciones estrictas, a una temperatura de 42ºC y con un segundo
lavado después de hibridación en 1 x SSC - SDS al 0,1%, con el
oligonucleótido j37 que tiene la secuencia siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
AATATIGAAATIGCIACAAGAGATTA
\vskip1.000000\baselineskip
y porque codifica un polipéptido de
37 kDa aproximadamente que comprende la secuencia NIEIATRDY que,
cuando se asocia con un polipéptido codificado por un polinucleótido
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, participa con
este último en la actividad tóxica frente a insectos de la familia
de los
Dípteros.
9. Vector de clonación o de expresión,
caracterizado porque comprende un polinucleótido según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Vector según la reivindicación 9,
caracterizado porque se trata del plásmido pJEG80.1
presentado en la CNCM el 23 de agosto de 1994 con el número
I-1.469.
11. Polipéptido caracterizado porque se
trata del producto de expresión de un polinucleótido según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
12. Polipéptido según la reivindicación 11,
caracterizado porque es codificado por el gen jeg80
representado en la figura 5A.
13. Polipéptido que tiene una actividad tóxica
frente a insectos de la familia de los Dípteros,
caracterizado porque responde a la secuencia de aminoácidos
presentada en la figura 5B.
14. Polipéptido según la reivindicación 12 ó 13,
caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos
siguiente, porque tiene un peso molecular de 80 kDa aproximadamente
y porque tiene una actividad tóxica frente a insectos de la familia
de los Dípteros.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
15. Composición que tiene una actividad tóxica
frente a insectos de la familia de los Dípteros,
caracterizada porque comprende a modo de principio activo al
menos un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 11
a 14.
16. Célula recombinante procariota o eucariota,
caracterizada porque contiene un vector de clonación o de
expresión según la reivindicación 9 ó 10.
17. Uso como sonda o cebo de un
polinucleótido, que se hibrida en condiciones estrictas con
un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
6, y elegido en el grupo constituido por:
- -
- el fragmento HindIII de 4,3 kb aproximadamente que puede obtenerse a partir del plásmido pJEG80.1 presentado en la CNCM el 23 de agosto de 1994 con el número I-1.469,
- -
- el fragmento HindIII-NdeI de 2,2 kb aproximadamente que puede obtenerse a partir del plásmido pJEG80.1,
- -
- el fragmento comprendido entre los nucleótidos 1 y 124 de la cadena representada en la figura 4, y
- -
- el fragmento jeg 80 que responde a la cadena AATAATATGATTAATTTTCCTATGTA.
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