ES2259914B1 - Nanoparticulas de quitosano y polietilenglicol como sistema de administracion de moleculas biologicamente activas. - Google Patents
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Abstract
La presente invención describe sistemas nanoparticulados para la liberación de moléculas biológicamente activas constituidos por el polímero quitosano o sus derivados modificado químicamente con polietilenglicol y reticulado con un agente reticulante. El empleo de estos sistemas se dirige a la obtención de composiciones farmacéuticas, vacunas y formulaciones cosméticas.
Description
Nanopartículas de quitosano y polientilenglicol
como sistema de administración de moléculas biológicamente
activas.
La invención se dirige a sistemas
nanoparticulados para la liberación de moléculas biológicamente
activas. En concreto se dirige a sistemas nanoparticulados,
constituidos por un conjugado de
quitosano-polietilenglicol reticulado iónicamente en
el cual se puede ubicar una molécula biológicamente activa, así
como a procedimientos para su obtención.
Los sistemas para la liberación de agentes
biológicamente activos constituyen un campo de investigación en
continuo desarrollo. Es conocido que la administración de
ingredientes activos al cuerpo humano y animal por diferentes vías
de administración presenta dificultades. Algunos fármacos, entre
los que se encuentran péptidos, proteínas y polisacáridos no se
absorben de manera efectiva a través de superficies mucosas dada la
limitada permeabilidad de las barreras epiteliales. Por ejemplo la
insulina, cuya administración actualmente es por vía subcutánea y
por lo tanto indeseable para el paciente, es uno de esos
ingredientes activos con una pobre capacidad para traspasar
barreras mucosas como la nasal o la intestinal, lo que hace
necesario el desarrollo de sistemas de administración que permitan
una mejor absorción de esta molécula activa si se quieren encontrar
vías alternativas a la subcutánea.
De entre las posibilidades propuestas
recientemente para superar las barreras biológicas a las que se
enfrentan los fármacos, destaca la incorporación de los ingredientes
activos en partículas de pequeño tamaño. La interacción de dichas
partículas con las mucosas se ve afectada entre otros factores por
el tamaño de estas partículas, aumentando dicha interacción con la
disminución del tamaño de las partículas.
Así, la solicitud de patente US2004138095
describe una suspensión acuosa de nanopartículas para la liberación
de insulina, entre otros principios activos, basadas en copolímeros
tribloque polietilenglicol/poliaminoácido
hidrofílico/poliaminoácido hidrofóbico. Por su parte, la patente
US5,641,515 describe una formulación farmacéutica para la
liberación controlada de insulina que comprende nanopartículas
formadas por policianoacrilato biodegradable en el cual la insulina
queda atrapada formando un complejo.
Asimismo, se han desarrollado sistemas
nanoparticulados a base de polímeros hidrofílicos para su
aplicación como sistemas de liberación de fármacos. Así lo demuestra
la abundante literatura existente en este campo. Se han publicado
numerosos trabajos que describen diversos métodos de elaboración de
nanopartículas hidrofílicas a base de macromoléculas de origen
natural como son las nanopartículas de albúmina (W. Lin et
al., Pharm. Res., 11, 1994) y gelatina (H.J. Watzke et
al., Adv. Colloid Interface Sci., 50, 1-14,
1994) y a base de polisacáridos como el alginato (M. Rajaonarivonvy
et al., J. Pharm. Sci., 82, 912-7, 1993).
Sin embargo la mayoría de estos métodos requieren el uso de
disolventes orgánicos, aceites y elevadas temperaturas, aspectos
que limitan enormemente la explotación de estos sistemas. Dentro de
estos métodos, el más inocuo ha sido el propuesto para la
elaboración de nanopartículas de alginato, basado en un proceso de
gelificación iónica en presencia de calcio y posterior
endurecimiento en presencia de polielectrolito catiónico
poli-L-lisina. Estas nanopartículas
presentan sin embargo los problemas relativos a la toxicidad
sistémica y elevado coste de la
poli-L-lisina.
Una alternativa a estos sistemas ha sido el
desarrollo de nanopartículas de quitosano, existiendo en el estado
de la técnica publicaciones que describen su utilidad para la
administración de ingredientes activos así como a su procedimiento
de obtención (J. Appl. Polym. Sci. 1997, 63,
125-132; Pharm. Res. 14, 1997b,
1431-6; Pharm. Res. 16, 1991a,
1576-81; S.T.P. Pharm. Sci. 9, 1999b,
429-36, Pharm. Res. 16, 1999,
1830-5; J. Control Release 74, 2001,
317-23 y US5,843,509). Estas nanopartículas tienen
el inconveniente de su limitada estabilidad en determinadas
condiciones de pH y fuerza iónica.
El documento
WO-A-01/32751 se refiere a un
procedimiento para la elaboración de quitosanos o derivados de
quitosano en forma de nanopartículas, consistente en la disolución
del quitosano o derivados en un medio acuoso y elevando
posteriormente el pH en presencia de un agente modificador de
superficie, hasta tal punto que se llega a la precipitación del
quitosano.
El documento
WO-A-99/47130 se refiere a
nanopartículas que presentan un complejo de polielectrolito
biocompatible y biodegradable, a partir de al menos un policatión
(que puede ser el quitosano) y al menos un polianión, así como un
ingrediente activo, siendo las nanopartículas obtenibles tratando
adicionalmente el complejo de polielectrolito durante o después de
su formación con al menos un agente reticulante (glioxal, TSTU o
EDAP).
Es conocido también la obtención de
nanopartículas de quitosano en combinación con polioxietileno (ES
2098188 y ES 2114502), además del ingrediente activo que puede ser
una macromolécula terapéutica o antigénica. La formación de estas
nanopartículas tiene lugar debido a un proceso de precipitación
conjunta del quitosano y de la macromolécula activa en forma de
nanoagregados poliméricos, causado por la adición de un agente de
carácter básico como es el tripolifosfato.
Por otra parte, el quitosano puede ser
modificado por la unión covalente con polietilenglicol a través de
la función amino, lo que se conoce como proceso de pegilación. Las
patentes EP 1304346 y US 6,730,735 describen una composición para la
administración de fármacos por vías mucosas que comprende un
conjugado de quitosano y PEG, estando ambos unidos covalentemente a
través del grupo amino del quitosano.
La solicitud US2004/0156904 describe un sistema
de liberación de agentes farmacéuticos, en el cual el agente activo
se incorpora a una matriz preparada a partir de una composición que
incluye quitosano-PEG y un polímero insoluble en
agua como el ácido
poliláctico-co-glicólico (PLGA).
La solicitud WO01/32751 describe la obtención de
nanopartículas de quitosano que precipitan en presencia de un
tensioactivo, entre ellos el polietilenglicol, al aumentar el pH de
la disolución donde se encuentran. Sin embargo, el PEG no se une
covalentemente al quitosano.
A pesar de las numerosas publicaciones dirigidas
al desarrollo de sistemas para la liberación de fármacos, existe
aún una necesidad de proporcionar un tipo de sistema
nanoparticulado que presente una gran capacidad de asociación con
una molécula biológicamente activa y que permita su liberación a
una velocidad controlada.
Los inventores han encontrado que un sistema
constituido por nanopartículas de quitosano modificado con PEG
obtenidas mediante un procedimiento de gelificación iónica en
presencia de un agente que provoca la reticulación del quitosano,
permite una eficaz asociación de moléculas biológicamente activas
así como su posterior liberación en un entorno biológico adecuado.
Las nanopartículas de quitosano modificado con PEG presentan
notables propiedades respecto a las nanopartículas de quitosano sin
pegilar, por ejemplo en administración nasal de insulina o en
inmunogenicidad como respuesta a la administración nasal de toxoide
diftérico.
Así, un objeto de la presente invención se
dirige a un sistema que comprende nanopartículas para la liberación
de una molécula biológicamente activa, donde las nanopartículas
comprenden un conjugado que comprende a) al menos un 50% en peso de
quitosano o un derivado del mismo y b) menos de un 50% en peso de
polietilenglicol (PEG) o un derivado del mismo, donde ambos
componentes a) y b) están unidos covalentemente a través de los
grupos amino del quitosano, y caracterizado porque dichas
nanopartículas se encuentran reticuladas mediante un agente
reticulante.
La expresión "molécula biológicamente
activa" tiene un sentido amplio y comprende moléculas tales como
fármacos de bajo peso molecular, polisacáridos, proteínas,
péptidos, lípidos, oligonucleótidos y ácidos nucleicos y
combinaciones de las mismas. En una variante de la invención la
molécula biológicamente activa tiene como función prevenir, paliar,
curar o diagnosticar enfermedades. En otra variante de la invención
la molécula biológicamente activa tiene una función cosmética.
Un segundo aspecto de la presente invención se
refiere a una composición farmacéutica o vacuna que comprende las
nanopartículas definidas anteriormente. En un aspecto preferente,
la composición o vacuna es para administración por vía mucosa.
En otro aspecto la invención se dirige a una
composición cosmética que comprende las nanopartículas definidas
anteriormente.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una composición que comprende las nanopartículas de
quitosano-PEG en cuyo seno puede estar retenida una
o más moléculas biológicamente activas como puede ser un fármaco,
una vacuna, o material genético. Asimismo, atrapados en la
nanoestructura se pueden encontrar péptidos, proteínas o
polisacáridos que no son considerados moléculas biológicas activas
"per se" pero que pueden contribuir a la eficacia del
sistema de administración.
Un último aspecto de la invención lo constituye
un procedimiento de obtención de un sistema para la liberación de
una molécula biológicamente activa tal como se ha definido, que
comprende:
- a)
- preparación de una disolución acuosa del conjugado quitosano-PEG;
- b)
- preparación de una disolución acuosa del agente reticulante; y
- c)
- mezclado, bajo agitación, de las disoluciones de las etapas a) y b), de modo que se obtienen espontáneamente las nanopartículas de quitosano-PEG mediante gelificación iónica y consiguiente precipitación.
En una variante del procedimiento el ingrediente
activo se incorpora bien a la solución acuosa del quitosano o a la
solución acuosa del agente reticulante, previamente al mezclado de
ambas fases.
Figura 1A: Efecto del grado de pegilación del
quitosano, del pH de la disolución del polímero y de la relación
quitosano-PEG/TTP sobre el tamaño de las
nanopartículas.
Figura 1B: Efecto del grado de pegilación del
quitosano, del pH de la disolución del polímero y de la relación
quitosano-PEG/TTP sobre la polidispersidad en el
tamaño de las nanopartículas.
Figura 2A: Análisis de electroforesis en gel de
agarosa de ADN plasmídico asociado a nanopartículas de quitosano y
quitosano-PEG después de 1 día de incubación en
tampón acetato (pH: 4 y 7.4) y en agua purificada (MQ).
Figura 2B: Análisis de electroforesis en gel de
agarosa de ADN plasmídico asociado a nanopartículas de quitosano y
quitosano-PEG después de 4 semanas de incubación en
tampón acetato (pH: 4 y 7.4) y en agua purificada (MQ).
Figura 3: Análisis de electroforesis en gel de
agarosa de ADN plasmídico asociado a nanopartículas de quitosano y
quitosano-PEG en presencia de quitosanasa.
Figura 4A: Efecto del grado de pegilación sobre
la eficacia en la transfección de nanopartículas de quitosano (CS)
de alto peso molecular.
Figura 4B: Efecto de la carga de pADN sobre la
eficacia en la transfección de nanopartículas de quitosano (CS) de
alto peso molecular.
Figura 5A: Efecto de la carga de pADN sobre la
eficacia en la transfección de nanopartículas de quitosano (CS) de
bajo peso molecular.
Figura 5B: Efecto del grado de pegilación sobre
la eficacia en la transfección de nanopartículas de quitosano (CS)
de bajo peso molecular.
Figura 6: Glicemia después de la administración
intranasal de 10 U/kg de insulina contenida en diferentes
formulaciones o tampón acetato (control). La glicemia viene
expresada en % con respecto a los valores base, en valor medio \pm
S.E.M. Los valores base antes de las diferentes administraciones
son los siguientes: tampón acetato (\sqbullet): 423\pm16 mg/dl
(n=7); insulina (\Box): 430\pm15 mg/dl (n=7); insulina en
disolución de quitosano (\bullet): 439\pm12 mg/dl (n=8);
nanopartículas de quitosano (\blacklozenge): 469\pm14 mg/dl
(n=7); nanopartículas de quitosano-PEG (\circ):
458\pm21 mg/dl (n=8).
Figura 7: Tests de tolerancia a la glucosa
realizados después de la administración intranasal de las
formulaciones que contienen insulina o tampón acetato en ratas
diabéticas sometidas a ayuno durante la noche. La glucosa (2 g por
kg de masa corporal) se administró intragástricamente a tiempo 0 y
una hora después de las administraciones intranasales: tampón
acetato (\sqbullet) (n=10); insulina (\Box) (n=6); insulina en
disolución de quitosano (\bullet) (n=6); nanopatículas de
quitosano (\blacklozenge) (n=6); nanopartículas de
quitosano-PEG (\circ) (n=6).
Figura 8: Títulos finales de IgG
anti-TD en suero de ratón después de la
administración intranasal de 10 \mug de TD incorporado en
diferentes formulaciones de nanopartículas de quitosano y
quitosano-PEG en los días 0,7 y 14 (n=6). IN:
Intranasal; IP: Intraperitoneal.
* Diferencias significativas estadísticamente
(\alpha<0.5).
El sistema que comprende nanopartículas para la
liberación de una molécula biológicamente activa que se ha definido
más arriba tiene un contenido de quitosano en el conjugado superior
al 50%, preferentemente superior al 75% en peso. Por su parte el
contenido de PEG en el conjugado es inferior al 50%, preferentemente
inferior al 25%.
El quitosano es un material polimérico que
comprende la repetición de unidades monoméricas de fórmula (I):
donde p es un número entero y
representa el grado de polimerización, es decir, el número de
unidades monoméricas en la cadena de
quitosano.
Además de estas unidades monoméricas, el
quitosano generalmente contiene una proporción de unidades
monoméricas en las que el grupo amino está acetilado. De hecho el
quitosano se obtiene por desacetilación de la quitina (100%
acetilado). Por lo general dicho grado de desacetilación se
encuentra en un rango comprendido entre 30 y 95, preferentemente
entre 60 y 95, lo que indica que entre un 5 y un 40% de los grupos
amino están aceti-
lados.
lados.
El quitosano empleado para la obtención de los
conjugados quitosano-PEG de la presente invención
tiene un peso molecular comprendido entre 5 y 2000 kDa,
preferentemente entre 10 y 500 kDa, más preferentemente entre 10 y
100 kDa.
El número de unidades monoméricas que comprenden
el quitosano empleado en la obtención de los conjugados
quitosano-PEG está comprendido entre 30 y 3000
monómeros, preferentemente entre 60 y 600.
En la presente invención el quitosano
comprendido en el conjugado quitosano-PEG puede ser
también un derivado de quitosano, entendiéndose como tal un
quitosano en el que se ha modificado el grupo hidroxilo. Estos
derivados incluyen, entre otros, quitosanos
O-acetilados, O-alquilados u
O-sulfonatados, tal como se describe en Chitin
Chemistry, Macmillan, 1992, 166.
Hasta el momento se han sintetizado diversos
derivados covalentes del quitosano tales como el trimetilquitosano,
cuyo objetivo ha sido el de elevar la solubilidad del quitosano en
medios de pH superior a 6.5. Asimismo existen derivados tiolados del
quitosano, producidos con la finalidad de incrementar el carácter
mucoadhesivo del quitosano. En ambos casos, la funcionalización del
quitosano se ha realizado a través del grupo amino.
Por su parte, el polietilenglicol (PEG), en su
forma más común, es un polímero de fórmula (II):
(II)H-(O-CH_{2}-CH_{2})_{n}-O-H
donde n es un número entero que
representa el grado de polimerización del PEG. En la presente
invención el grado de polimerización del PEG se encuentra en el
rango comprendido entre 50 y 500, lo que corresponde a un peso
molecular de entre 2 y 20 kDa, preferentemente de entre 5 y 10
kDa.
Para la formación del complejo
quitosano-PEG ha de emplearse un PEG modificado en
el cual uno o los dos grupos hidroxilo terminales se encuentran
modificados. Entre los PEG modificados que pueden emplearse para la
obtención de los conjugados quitosano-PEG se
encuentran aquellos que presentan la fórmula (III):
(III)X_{1}-(O-CH_{2}-CH_{2})_{n}-O-X_{2}
donde:
X_{1} es un grupo protector de radicales
hidroxilo que bloquea la función OH para reacciones posteriores.
Los grupos protectores de hidroxilo son bien conocidos en la
técnica, grupos protectores representativos (ya incluyendo el
oxígeno a proteger) son los silil éteres tales como trimetilsilil
éter, trietilsilil éter, terc-butildimetilsilil
éter, ter-butildifenilsilil éter,
tri-isopropilsilil éter, dietilisopropilsilil éter,
texildimetilsilil éter, trifenilsilil éter,
di-terc-butilmetilsilil éter; alquil
éteres tales como metil éter, terc-butil éter,
bencil éter, p-metoxibencil éter,
3,4-dimetoxibencil éter, tritil éter; alil éter;
alcoximetil éter tal como metoximetil éter,
2-metoxietoximetil éter, benciloximetil éter,
p-metoxibenciloximetil éter,
2-(trimetilsilil)etoximetil éter; tetrahidropiranil éter y
éteres relacionados; metiltiometil éter; ésteres tales como éster
acetato, éster benzoato; éster pivalato; éster metoxiacetato; éster
cloroacetato; éster levulinato; carbonatos tales como carbonato de
bencilo, carbonato de p-nitrobencilo, carbonato de
terc-butilo, carbonato de
2,2,2-tricloroetilo, carbonato de
2-(trimetilsilil)etilo, carbonato de alilo. Ejemplos
adicionales de grupos protectores de hidroxilo pueden hallarse en
libros de referencia tales como "Protective Groups in Organic
Synthesis" de Greene y Wuts, John Wiley & Sons, Inc., Nueva
York, 1999. En una realización preferente el grupo protector es un
alquil éter, más preferentemente es metil éter.
X_{2} puede ser un hidrógeno o bien un grupo
puente que permita el anclaje a los grupos amino del quitosano. De
entre las moléculas puente utilizadas la forma preferente, pero no
exclusiva, es una succinimida o un derivado de la misma.
De forma alternativa Xi puede ser igualmente un
grupo que permita el anclaje con otros grupos distintos del grupo
amino. Por ejemplo, para lograr la unión con grupos SH se utiliza
como molécula puente la maleimida.
El número de grupos amino del quitosano que
reaccionan con el PEG, o lo que es lo mismo, la funcionalización de
los grupos amino del quitosano con el PEG, conocido como
PEGilación, está comprendido entre 0.1% y 5%, preferentemente entre
el 0.5% y 1%.
El conjugado de quitosano-PEG
resultante tiene un peso molecular comprendido entre 5 y 3000 kDa,
preferentemente entre 10 y 500 kDa.
El sistema de nanopartículas de la invención se
caracteriza porque se han formado mediante reticulación iónica del
quitosano-PEG en presencia de la molécula
biológicamente activa. El agente reticulante es una sal aniónica
que permite la reticulación del conjugado
quitosano-PEG mediante gelificación iónica,
favoreciendo la formación espontánea de las nanopartículas. En la
presente invención el agente reticulante es una sal de polifosfato,
siendo preferente el empleo de tripolifosfato de sodio (TTP).
Las nanopartículas descritas en la presente
invención se caracterizan por presentar un tamaño medio de
partícula inferior a 1 \mum, preferentemente tienen un tamaño
medio comprendido entre 1 y 1000 nm, preferentemente entre 50 y 800
nm, y aún más preferentemente entre 50 nm y 500 nm. El tamaño medio
de las partículas se ve influenciado principalmente por la
proporción de quitosano con respecto al PEG, por el grado de
desacetilación del quitosano y también por las condiciones de
formación de las partículas (concentración de
quitosano-PEG, concentración de agente reticulante y
relación de ambos). La presencia del PEG reduce el tamaño medio de
las partículas respecto a sistemas formados por quitosano sin
pegilar.
Por otra parte, las nanoparticulas pueden
presentar una carga eléctrica (medida mediante el potencial Z),
cuya magnitud puede variar desde + 0.1 mV hasta + 50 mV,
preferentemente entre 1 y 40 mV, dependiendo de las variables
mencionadas y de forma particular del grado de funcionalización del
quitosano con el PEG. La carga positiva de las nanopartículas puede
ser de interés para favorecer la interacción de las mismas con
superficies mucosas. No obstante la carga neutra puede resultar más
interesante para la administración parenteral de las mismas.
Un segundo aspecto de la presente invención lo
constituye una composición farmacéutica que comprende las
nanopartículas previamente definidas. Ejemplos de composiciones
farmacéuticas incluyen cualquier composición líquida (suspensión de
nanopartículas) o sólida (nanopartículas liofilizadas o atomizadas
formando un polvo que se puede utilizar para elaborar granulados,
comprimidos o cápsulas) para su administración bien por vía oral,
bucal o sublingual, bien tópica, o bien en forma líquida o
semisólida para su administración por vía transdérmica, ocular,
nasal, vaginal o bien parenteral. En el caso de las vías no
parenterales el contacto de las nanopartículas con la piel o mucosas
podrá mejorarse dotando a las partículas de una importante carga
positiva, lo que favorecerá su interacción con las citadas
superficies cargadas negativamente. En el caso de las vías
parenterales, más en concreto para la administración intravenosa,
estos sistemas ofrecen la posibilidad de modular la distribución
in vivo de los fármacos o moléculas que puedan llevar
asociadas.
En un aspecto preferente la formulación se
administra por vía mucosa. La carga positiva que presenta el
conjugado quitosano-PEG proporciona una mejor
absorción de los fármacos sobre la superficie mucosa a través de su
interacción con la mucosa y las superficies de las células
epiteliales que están cargadas negativamente.
Las nanopartículas de
quitosano-PEG son sistemas que presentan una alta
capacidad de asociación de moléculas bioactivas. Esta capacidad de
asociación depende del tipo de molécula incorporada así como de los
parámetros de formulación señalados. Por tanto, otro aspecto de la
presente invención lo constituye una composición que comprende
nanopartículas de quitosano-PEG como las definidas
previamente y al menos una molécula biológicamente activa.
El término "molécula biológicamente activa"
se refiere a cualquier sustancia que se emplea en el tratamiento,
cura, prevención o diagnosis de una enfermedad o que es empleada
para mejorar el bienestar físico y mental de humanos y animales.
Estas moléculas biológicamente activas pueden incluir desde
fármacos de bajo peso molecular hasta moléculas del tipo de
polisacáridos, proteínas, péptidos, lípidos, oligonucleótidos y
ácidos nucleicos y combinaciones de las mismas. Ejemplos de
moléculas asociadas a estas nanopartículas incluyen proteínas como
el toxoide tetánico y el toxoide diftérico, polisacáridos como la
heparina, péptidos como la insulina, así como plásmidos
codificadores de diversas proteínas.
En una realización preferente la molécula
biológicamente activa es la insulina. En otra realización
preferente la molécula biológicamente activa es el toxoide diftérico
o tetánico. En otra realización preferente la molécula
biológicamente activa es la heparina. En otra realización
preferente la molécula biológicamente activa es un plásmido ADN.
Los sistemas nanoparticulados de la presente
invención también pueden incorporar otras moléculas activas que no
presentan efecto terapéutico pero que dan lugar a composiciones
cosméticas. Estas composiciones cosméticas incluyen cualquier
composición líquida (suspensión de nanopartículas) o emulsión para
su administración por vía tópica. Entre las moléculas activas que
pueden incorporarse a las nanopartículas cabe citar agentes
anti-acné, antifúngicos, antioxidantes,
desodorantes, antitranspirantes, anticaspa, blanqueadores de piel,
bronceadores, absorbentes de luz UV, enzimas, biocidas cosméticos,
entre otros.
Otro aspecto de la presente invención lo
constituye una vacuna que comprende las nanopartículas previamente
definidas y un antígeno. La administración de un antígeno por parte
del sistema constituido por las nanopartículas permite conseguir una
respuesta inmune. La vacuna puede comprender una proteína,
polisacárido o bien puede ser una vacuna ADN. Estrictamente
hablando, una vacuna ADN es una molécula de ADN que codifica la
expresión de un antígeno que dará lugar a una respuesta inmune. En
una realización preferente el antígeno es el toxoide tetánico y el
toxoide diftérico.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un procedimiento para la preparación de nanopartículas de
quitosano-PEG como las definidas previamente, que
comprende:
- a)
- preparación de una disolución acuosa del conjugado quitosano-PEG;
- b)
- preparación de una disolución acuosa del agente reticulante; y
- c)
- mezclado, bajo agitación, de las disoluciones de las etapas a) y b), de modo que se obtienen espontáneamente las nanopartículas de quitosano-PEG mediante gelificación iónica y consiguiente precipitación.
El pH de la disolución inicial del conjugado
quitosano-PEG se modifica hasta alcanzar valores
comprendidos entre 4.5 y 6.5 mediante la adición de hidróxido sódico
previamente al mezclado de ambas disoluciones.
En una variante del procedimiento la relación
quitosano-PEG/agente reticulante resultante está
comprendida entre 2/1 y 8/1, siendo preferente la relación 3/1, la
cual proporciona formulaciones con una polidispersidad
relativamente baja. No obstante, el empleo de relaciones mayores
quitosano-PEG/agente reticulante así como la
preparación de partículas en medios más ácidos también es
posible.
La presencia del agente reticulante permite el
entrecruzamiento del conjugado quitosano-PEG de tal
manera que se forma una malla entre la cual puede quedar insertada
una molécula biológicamente activa que posteriormente puede ser
liberada. Además, el agente reticulante confiere a las
nanopartículas las características de tamaño, potencial y
estructura que las hace adecuadas como sistema de administración de
moléculas biológicamente activas.
La molécula biológicamente activa se puede
incorporar directamente a las disoluciones de las etapas a) ó b), o
previa disolución en una fase acuosa u orgánica, de modo que se
obtienen espontáneamente las nanopartículas de
quitosano-PEG conteniendo la molécula
biológicamente activa mediante gelificación iónica y consiguiente
precipitación.
Por lo tanto la incorporación de la molécula
biológicamente activa se puede realizar según los siguientes
métodos:
- a)
- la molécula activa es disuelta directamente en las disoluciones del agente reticulante o de quitosano-PEG
- b)
- la molécula activa es disuelta en una disolución acuosa ácida o básica, previamente a su incorporación a las disoluciones de agente reticulante o de quitosano-PEG
- c)
- la molécula activa es disuelta en un disolvente orgánico polar, miscible con el agua, previamente a su incorporación a las disoluciones de agente reticulante o de quitosano-PEG.
El procedimiento de elaboración de las
nanopartículas de quitosano-PEG puede comprender
además una etapa adicional, en la cual dichas nanopartículas son
liofilizadas. Desde un punto de vista farmacéutico es importante
poder disponer de las nanopartículas en forma liofilizada ya que
así se mejora su estabilidad durante el almacenamiento. Las
nanopartículas de quitosano-PEG (con diferentes
grados de PEGilación) pueden ser liofilizadas en presencia de un
crioprotector como puede ser la glucosa en una concentración del
5%. De hecho, la determinación del tamaño de partícula antes y
después de su liofilización no se ve modificada significativamente.
Es decir, que las nanopartículas pueden ser liofilizadas y
resuspendidas sin que se produzca una variación en las mismas
(tabla I).
| Formulación | tamaño (nm) | P.I.* | tamaño (nm) | P.I. |
| antes de liofilización | \; \; liofilizadas con 5% de glucosa | |||
| quitosano-PEG 0.5% | 74.7 \pm 9.5 | 0.231 | 78.6 \pm 18.3 | 0.224 |
| quitosano-PEG 1% | 76.9 \pm 6.0 | 0.500 | 87.7 \pm 22.3 | 0.418 |
| *P.I.: índice de polidispersidad |
A continuación, se describen algunos ejemplos
ilustrativos que ponen de manifiesto las características y ventajas
de la invención, no se deben interpretar como limitativos del
objeto de la invención.
Las nanopartículas de
quitosano-PEG se prepararon según la técnica de
gelificación iónica descrita para quitosano por ejemplo en WO
9804244. En concreto, el quitosano con un 0.5% ó 1% de grado de
pegilación (porcentaje de grupos amino que están funcionalizados
con PEG) se disolvió inicialmente en agua ultrapura a una
concentración de 1 mg/mL. Con el fin de estudiar su posible efecto
sobre la formación de las nanopartículas, el pH inicial de la
disolución de quitosano-PEG se modificó hasta
alcanzar valores comprendidos entre 4.5 y 6.5 mediante la adición
de NaOH antes de la preparación de las partículas. El
tripolifosfato sódico (TTP) también se disolvió en agua a diferentes
concentraciones con el objetivo de obtener relaciones de
quitosano-PEG/TTP de 2/1, 3/1 y 4/1. La formación
de las nanopartículas ocurre espontáneamente tras la adición de un
volumen fijo de disolución de TTP (0.6 mL) a un volumen fijo de
disolución de quitosano-PEG (1.5 mL) bajo agitación
magnética.
El efecto que el grado de pegilación del
quitosano, el pH de la disolución del polímero y la relación
quitosano-PEG/TTP provocan sobre el tamaño y
polidispersidad de las nanopartículas se muestra en las figuras 1 A
y 1 B. A partir de los resultados obtenidos se puede concluir que
las nanopartículas de quitosano-PEG con un grado de
pegilación del 0.5-1% pueden prepararse fácilmente
con un amplio rango de condiciones experimentales, siendo el pH el
parámetro más influyente en el tamaño de las nanopartículas. Más
aún, el efecto del pH llega a ser más remarcado a medida que el
grado de pegilación aumenta de 0.5 a 1%.
Por otra parte, la distribución de tamaños de
las nanopartículas también se ve afectada por el grado de
pegilación del quitosano así como por el pH de la solución de
quitosano-PEG. Aparentemente, la relación óptima
quitosano-PEG/TTP es de 3/1 para obtener
formulaciones con una dispersidad relativamente baja.
El tamaño de las nanopartículas se determina
mediante espectroscopia de correlación fotónica, empleando para
ello un Zetasizer III (Malvern Instruments, Malvern, UK). El tamaño
de las nanopartículas de quitosano-PEG osciló entre
70 y 310 nm.
Como puede observarse a partir de la Tabla II,
la pegilación cambia la solubilidad del quitosano. Esto tiene
influencia sobre la formación de las nanopartículas. La relación
óptima quitosano/TTP típicamente situada entre 6/1 y 4/1 se desplaza
en el caso del quitosano-PEG a valores menores,
típicamente entre 4/1 y 2/1. Estas diferencias se deben
probablemente a la modificación química del quitosano, que
experimenta un cambio de los grupos disponibles que pueden
interaccionar pudiendo alterar las condiciones de gelación
ionotrópica.
\vskip1.000000\baselineskip
| quitosano | quitosano-PEG 0.5% | quitosano-PEG 1% | |
| pH inicial | 4.7-4.8 | 4.6-4.7 | 4.6-4.7 |
| límite de solubilidad | 6.4-6.5 | 6.9-7.1 | 7.1-7.2 |
\vskip1.000000\baselineskip
Con relación a las nanopartículas, se puede
observar que las nanopartículas preparadas a partir de quitosano
pegilado son significativamente diferentes a las constituidas por
quitosano puro. Esto se ilustra en la tabla III, donde se muestran
las características de las nanopartículas formadas por quitosano,
quitosano-PEG con grados de pegilación del 0.5% y
1% (al valor del pH inicial, en su relación óptima de polímero).
La pegilación provoca un descenso marcado en el
tamaño de las nanopartículas y en la carga de la superficie. En
este último caso, el grado de pegilación también tiene una gran
influencia ya que la carga de la superficie disminuye aún más cuando
el grado de pegilación aumenta de 0.5% a 1%.
\vskip1.000000\baselineskip
| tamaño (nm) | P.I. | potencial (mV) | |
| quitosano, 4/1 | 265\pm10 | 0.363 | +29.1\pm1.1 |
| quitosano-PEG 0.5%, 3/1 | 74\pm9 | 0.231 | +12.1\pm1.8 |
| quitosano-PEG 1%, 3/1 | 77\pm6 | 0.500 | +1.6\pm0.6 |
| P.I.=índice de polidispersidad |
Para su encapsulación, ADN plasmídico se
incorporó a la disolución de TTP previamente a la formación de las
nanopartículas. Esta disolución de TTP conteniendo el ADN se
adicionó posteriormente a la disolución de
quitosano-PEG y se mantuvo bajo agitación
magnética. Las cargas teóricas de ADN fueron de 5, 10 o 20% respecto
a la cantidad total de quitosano-PEG empleado para
la preparación de las nanopartículas (1 mg). La eficiencia de la
encapsulación del ADN plasmídico fue siempre superior al 90% como
así lo confirman los ensayos de fluorescencia (colorante Pico Green
dsDNA) y electroforesis en gel de agarosa.
Las tablas IV, V y VI muestran las
características de las diferentes nanopartículas de quitosano y
quitosano-PEG. Similarmente a las nanopartículas sin
cargar, las formulaciones cargadas de ADN que contienen PEG son
mucho más pequeñas y presentan menos carga positiva en su
superficie que las formulaciones sin PEG.
En todos los casos, la presencia de ADN también
causa cambios en las características de los vehículos,
especialmente a altos porcentajes de ADN, donde la carga de la
superficie generalmente disminuye. Con relación al tamaño de la
nanopartícula, cargas grandes de ADN permiten inducir la formación
de estructuras más reticuladas, lo que provoca un descenso del
tamaño de la partícula. Esto se puede observar en el caso de
vehículos no pegilados, donde el tamaño disminuye desde
aproximadamente 270-300 nm a 220 nm.
Sin embargo, el tamaño de los vehículos
pegilados aumenta con la carga de ADN, especialmente cuando se
emplea quitosano-PEG con un grado de pegilación de
0.5%.
| quitosano sin PEG, 4/1 | tamaño (nm) | P.I. | potencial (mV) |
| blanco | 265\pm10 | 0.363 | 29.1\pm1.1 |
| +5% ADN | 278\pm17 | 0.340 | 40.5\pm5.6 |
| +10%ADN | 309\pm2 | 0.378 | 41.6\pm0.8 |
| +20%ADN | 216\pm7 | 0.363 | 35.2\pm1.8 |
| quitosano-PEG 0.5%, 3/1 | tamaño (nm) | P.I. | potencial (mV) |
| blanco | 74\pm9 | 0.231 | +121\pm1.8 |
| +5% ADN | 115\pm14 | 0.227 | +13.4\pm2.1 |
| +10%ADN | 131\pm13 | 0.207 | +11.3\pm3.9 |
| +20%ADN | 181\pm8 | 0.209 | +5.7\pm1.6 |
| quitosano-PEG 1%, 3/1 | tamaño (nm) | P.I. | potencial (mV) |
| blanco | 77\pm6 | 0.500 | +1.6\pm0.6 |
| +5% ADN | 78\pm7 | 0.485 | +3.7\pm0.4 |
| +10%ADN | 78\pm10 | 0.256 | +1.3\pm2.1 |
| +20%ADN | 105\pm2 | 0.229 | -0.6\pm0.4 |
ADN plasmídico fue eficazmente asociado tanto a
partículas de quitosano como de quitosano-PEG. Como
se muestra en las figuras 2A y 2B, no se detecta liberación de ADN
plasmídico (según análisis de electroforesis en gel de agarosa)
cuando se incuban nanopartículas cargadas con ADN plasmídico
durante más de un mes, tanto en tampón acetato (pH:4, pH:7.4) como
en agua purificada (MQ).
Como puede observarse a partir del análisis de
electroforesis (Figura 3), el ADN plasmídico puede liberarse de las
nanoparticulas de quitosano y quitosano-PEG cuando
se incuban las nanopartículas cargadas de ADN plasmídico en tampón
acetato a pH 6 en presencia de quitosanasa (0.6 mg/mL).
Estos resultados ponen de manifiesto que el ADN
plasmídico ha sido eficazmente asociado a las nanopartículas, sin
embargo, no está irreversiblemente enlazado a ellas ya que puede
ser liberado cuando el vehículo polimérico se degrada
enzimáticamente.
La eficacia de la transfección mediante
nanopartículas de quitosano y quitosano-PEG ha sido
evaluada para la codificación del plásmido GFP en un modelo de línea
celular HEK 293.
La figura 4 muestra el efecto que el grado de
pegilación del quitosano (0.5% y 1%) provoca sobre la eficacia en
la transfección de nanopartículas de quitosano de alto peso
molecular (125 kDa, HMW CS NP) que contienen una carga de un 20% de
ADN plasmídico (pDNA). La dosis de plásmido por pocillo fue de 1
\mug. Los resultados indican que un grado de pegilación de 0.5%
tiene un efecto positivo en la capacidad de transfección de estas
nanopartículas. Este grado de pegilación se eligió para los
experimentos posteriores. Los resultados mostrados en la figura 4b
indican que la eficacia de la transfección aumenta con la carga de
pDNA de las nanopartículas. Esta observación es interesante ya que
la dosis de plásmido fue constante (1 \mug) y por tanto, la dosis
de nanopartículas disminuye a medida que la carga de pDNA
aumenta.
El efecto de la carga de plásmido sobre la
eficacia en la transfección también fue evaluada para
nanoparticulas de quitosano-PEG de bajo peso
molecular (10 kDa, LMW CS-PEG NP) En este caso, el
nivel mayor de expresión se observó para la carga menor (5%) (Figura
5a). Por otra parte, para esta carga baja (5% pDNA) se observó que
la pegilación tenía un efecto negativo en la eficacia de
transfección (Figura 5b).
La conclusión principal de estos experimentos es
que la pegilación del quitosano tiene un efecto positivo (HMW
CS-PEG NP) o negativo (LMW CS-PEG
NP) dependiendo del peso molecular del quitosano.
Para realizar la encapsulación de la insulina en
las nanopartículas de quitosano, se disolvieron previamente 2.4 mg
de insulina en una disolución de NaOH a la cual se incorporaron
posteriormente 1.2 mL de TTP. Esta mezcla se adicionó después a 3 mL
de quitosano. Transcurridos 5 min bajo agitación magnética, la
preparación se centrifugó a 10.000 g por 40 min. El sobrenadante se
retiró y el precipitado se disolvió en tampón. Por su parte, para
la preparación de las nanopartículas de
quitosano-PEG se llevó a cabo el mismo
procedimiento pero adicionando 10 mg/mL de PEG 400 a 2mg/mL de
quitosano.
El tamaño final de las nanopartículas de
quitosano, determinado mediante espectroscopia de correlación
fotónica, fue de 605\pm15 nm mientras que el de las
nanopartículas de quitosano-PEG fue de 590\pm6
nm.
Inicialmente, la diabetes es inducida en ratas
Wistar machos, que pesan entre 200 y 220 g, mediante una inyección
de estreptozotocina (65 mg/kg i.v.) en un tampón citrato a pH 4.5.
Se consideraban diabéticas cuando la concentración de glicemia era
mayor de 400 mg/dl transcurridas tres semanas del tratamiento con
estreptozotocina.
Para realizar este experimento se emplearon
ratas sometidas a ayuno. Se dividieron en diferentes grupos
dependiendo de la formulación que les fuera a ser administrada. Las
diferentes formulaciones consistían en: una disolución control
(tampón acetato, pH 4.3), insulina disuelta en tampón acetato,
insulina disuelta en disolución de quitosano, insulina asociada a
nanopartículas de quitosano e insulina asociada a nanopartículas de
quitosano-PEG), siendo la concentración de insulina
de 10 U por kg de masa corporal. La administración de estas
formulaciones se realizó colocando un pequeño volumen de las mismas
(10-20 \mul) en cada orificio nasal utilizando una
pipeta Eppendorf, estando las ratas anestesiadas con éter en
posición supina. Posteriormente, los animales se mantuvieron
conscientes durante todo el experimento con el fin de evitar
cualquier influencia que la anestesia pudiera provocar en los
niveles de glucosa en sangre.
Para determinar los niveles de glucosa en
sangre, se recogieron muestras de sangre procedentes de la vena de
la cola, antes de la administración nasal y cada cuarto de hora
después hasta cumplidos 90 minutos. Posteriormente, se recogieron
cada hora durante 2 a 7 horas y por último transcurridas 24 horas
desde la administración nasal. El nivel de glucosa en sangre se
determinó inmediatamente empleando un analizador de glucosa
(Prestige from Chronolyss). Durante el experimento, las ratas se
mantuvieron en ayuno.
Como se muestra en la figura 6, la
administración nasal de tampón acetato, pH 4.3, provoca la
disminución lenta y progresiva de la glicemia en función del tiempo,
siendo el descenso máximo del 28% con respecto a los valores
control, trascurridas 6 horas desde la administración. La
administración nasal de 10 U/kg de insulina en disolución de tampón
acetato no cambió significativamente el resultado anterior. Sin
embargo, cuando la insulina se encuentra asociada a nanoparticulas
de quitosano-PEG, los niveles de glicemia
disminuyen un 18% (p<0.01) en sólo 15 minutos después de la
administración, llegando a alcanzar un descenso máximo del
45-50% (p<0.01 y p<0.001 respectivamente) a
los 45 minutos de dicha administración. Destacar que, este descenso
se mantiene al menos transcurridas 7 horas desde la administración
nasal. Asimismo, se observa un acusado descenso en los niveles de
glicemia cuando se administra, por vía intranasal, insulina
asociada a nanopartículas de quitosano. En este caso, la glicemia
disminuye significativamente desde los 30 minutos, en concreto un
16% (p<0.01) siendo el máximo descenso un 32% (p<0.001)
observado tras 2 horas desde la administración intranasal. Cuando
la insulina se disuelve en una disolución de quitosano también se
reduce la glicemia pero en un grado significativamente menor que
cuando la insulina está asociada a nanopartículas de
quitosano-PEG.
Para realizar este experimento se emplearon
ratas diabéticas sometidas a ayuno durante la noche. Se les
administró por vía nasal cada una de las preparaciones descritas en
el ejemplo 7. Transcurrida una hora, cada grupo de ratas recibió por
vía oral una administración de glucosa de 2 g por cada kg de masa
corporal. Se midió la glicemia en sangre procedente de muestras
recogidas de la vena del rabo antes de la administración de glucosa
y después de 10, 20, 30, 60, 90 y 120 minutos.
La figura 7 muestra el efecto de las
nanopartículas que contienen insulina sobre la respuesta glicémica
a la administración oral de glucosa. En ratones control que han
recibido tampón acetato, la administración oral de glucosa estuvo
seguida de un aumento de la glicemia cuyo valor máximo, 105%
(p<0.001), se alcanzó 30 minutos después. Posteriormente, la
glicemia descendió suavemente durante 2 horas. Por su parte, la
insulina disuelta en tampón acetato (10 U/kg) no cambió
significativamente este resultado.
Sin embargo, la misma cantidad de insulina en
disolución de quitosano aumentó la respuesta glicémica a la glucosa
en un 189% (p<0.05) mientras que la insulina asociada a
nanopartículas de quitosano o quitosano-PEG la
aumentó en un 193% (p<0.01) y un 225% (p<0.01)
respectivamente.
Por lo tanto, comparando los A.U.C. (área bajo
la curva) a partir de las diferentes fotinulaciones analizadas, la
preparación más efectiva fue la correspondiente a insulina asociada
a nanopartículas de quitosano-PEG, seguido de la
insulina asociada a nanopartículas de quitosano y por último la
correspondiente a insulina en disolución de quitosano.
Estos resultados ponen de manifiesto que el
empleo de nanopartículas de quitosano-PEG descritas
en la presente invención aumenta la absorción nasal de insulina en
ratas diabéticas. Los resultados experimentales muestran que la
insulina (10 U/kg de peso corporal) asociada a nanopartículas de
quitosano-PEG reduce considerablemente la glicemia
desde 15 minutos hasta al menos 7 horas después de la liberación
intranasal y mejora la respuesta glicémica cuando se produce una
carga oral de glucosa. Un efecto menos marcado se detecta con 4
U/kg de insulina asociada a dichas nanopartículas.
Cuando la insulina se asocia a nanoparticulas
únicamente constituidas por quitosano o cuando la insulina se
encuentra en disolución con quitosano la eficiencia es menor que
cuando está asociada a nanopartículas quitosano-PEG,
mientras que la insulina libre no presenta ningún efecto
significativo sobre parámetros biológicos después de su liberación
intranasal en ratas diabéticas.
La asociación del toxoide diftérico (TD) a las
nanoparticulas de quitosano o quitosano-PEG se
realiza por incorporación del TD a una disolución acuosa de TTP (300
\mug de TD). Las nanoparticulas se forman espontáneamente bajo
adición de diferentes volúmenes de la disolución acuosa de TTP (1
mg/mL) a 3 mL de una disolución de quitosano ó
quitosano-PEG (1 mg/mL) con agitación magnética. Los
volúmenes de la disolución de TTP se calcularon con el fin de
conseguir relaciones quitosano:TTP de 8:1 y 2:1. El quitosano se
comercializa en forma de su sal de hidrocloruro, Protosan Cl® 113 y
Protosan Cl® 213 con un grado de desacetilación del 86%. Las
nanoparticulas de quitosano se aíslan por centrifugación a 10.000 g
por 40 minutos a 5ºC. En el caso de quitosano-PEG,
las nanoparticulas se recogen sobre un ultrafiltro de centrifugación
(Amicon® ultra-4 100000 NMWL, Millipore) a 3800 g
por 30 minutos. El sobrenadante se elimina y las nanoparticulas se
resuspenden en tampón fosfato salino de pH 7.4 para su
administración en ratones.
La inmunogenicidad de las formulaciones de
quitosano y quitosano-PEG se realizó con ratones
mediante inmunización intranasal. Se emplearon ratones macho BALB/c
de 6 semanas de vida y 22-25 gr de peso. Los
ratones se dividieron en 5 grupos. Dos grupos se trataron con
nanoparticulas de quitosano cargadas con TD (CS-113
Cl, CS-213 Cl) y un grupo con nanoparticulas de
quitosano-PEG cargadas con TD. La dosis empleada fue
de 10 \mug de TD incorporados en 100 de nanoparticulas y llevados
a 10 \muL de tampón fosfato de pH 7.4, administrándose 5 \muL
en cada orificio nasal. Otro grupo se trató con toxoide libre (10
\mug/ratón) en tampón fosfato salino de pH 7.4. Además, como
control, un grupo recibió una vacuna de DTP (difteria, tétanos y
pertussis) intraperitonealmente, adsorbida en fosfato de aluminio
(10 \mug/ratón). Las dosis se administraron los días 0, 7 y 14 a
ratones conscientes.
Para realizar los ensayos de respuesta inmune
in vivo, se tomaron muestras de sangre de la cola de los
ratones los días 14, 28, 42, 56 y 70 después de la administración de
la primera dosis. Por su parte, se recogieron también muestras de
lavado de saliva, bronco-alveolar e intestinal el
día 70. La salivación se indujo mediante inyección
intraperitonealmente de pilocarpina (50 \muL, 1 mg/mL). Se recogió
una alícuota de 100 \muL del flujo inicial de saliva de cada
ratón. Posteriormente los ratones se anestesiaron con pentobarbital
y se sacrificaron. Los lavados bronco-alveolares se
obtuvieron inyectando y aspirando 5 mL de medio de lavado en la
traquea para inflar los pulmones mediante una cánula intravenosa.
Por su parte, los segmentos intestinales (duodeno, yeyuno, íleon) se
eliminaron asépticamente y se homogeneizaron en 4 mL de una
disolución de 1 mM PMSF, 1 mM de ácido yodoacético y 10 mM de EDTA.
Las muestras se aclararon mediante centrifugación y azida sódica,
PMSF y suero bovino se adicionó como conservante. Todas las
muestras se almacenaron a -20ºC hasta realizar los ensayos de
concentración de anticuerpos.
La evaluación de las respuestas del anticuerpo
en suero y en tejidos mucosos se llevó a cabo mediante un test
ELISA. En primer lugar, las microplacas (DYNEX, immulon®) se
recubrieron con 100 \muL de TD (4\mug/pocillo) en 0.05 M de
tampón carbonato de p 9.6 y se incubaron durante la noche a 4ºC.
Entre etapa y etapa los pocillos se lavaron tres veces con PBST de
pH 7.4 (0.01 M PBS, o tampón fosfato, que contiene 5% v/v de Tween®
20). Con el fin de minimizar las reacciones no específicas, se
adicionó a todos los pocillos 100 \muL de PBSTM (PBST que
contiene 5% p/v de leche desnatada en polvo y 0.1% p/v de azida
sódica como conservante) y se incubaron durante 1 hora a 37ºC.
Después del lavado con PBST, las muestras se diluyeron en serie en
dos etapas en PBSTM y las placas se incubaron por otras 2 horas a
37ºC. Posteriormente, se diluyeron 100 \muL de conjugado de
peroxidasa de inmunoglobulina lgG anti-ratón de
cabra en 1:2000 en PBSTM, se adicionaron a los pocillos y se
incubaron a 37ºC durante 2 h. Las placas se lavaron y se
adicionaron a los pocillos 50 \muL de
o-fenilendiamina dihidrocloruro (0.45 mg/mL) en
0.05 M de tampón citrato-fosfato de pH 5.0 como
sustrato. Siguiendo el desarrollo del color (30 minutos a 37ºC) las
placas se leyeron a 450 nm sobre un lector de microplacas
(3350-UV, Biorad).
Los niveles de anti-difteria IgG
provocados por las nanopartículas cargadas con TD y la disolución
control de TD siguiendo una inmunización intranasal se muestran en
la figura 8. En esta figura, se representan también los resultados
correspondientes a la formulación comercial (TD adsorbido en
fosfato de aluminio) administrada intraperitonealmente. En términos
generales, los resultados indican que, transcurrido el primer mes,
los niveles de IgG observados para nanopartículas cargadas con TD
fueron significativamente mejores que los correspondientes a la
vacuna fluida (p<0.05). De hecho, estos valores son comparables
con aquellos obtenidos para la formulación utilizada como adyuvante
(TD adsorbida en fosfato de aluminio) administrada parenteralmente.
Consecuentemente, estos resultados claramente reflejan el efecto
adyuvante de las formulaciones que contienen las nanopartículas.
Otra observación a remarcar fue la creciente y duradera respuesta
inmune a lo largo del tiempo. Finalmente, con respecto a la
influencia de la composición de las nanoparticulas, es interesante
señalar que el peso molecular del quitosano no tiene ningún efecto
sobre la respuesta inmune alcanzada por las nanopartículas de
quitosano, sin embargo, la PEGilación del quitosano tiene una
consecuencia remarcada en la eficacia de las nanoparticulas. De
hecho, transcurrido un mes, los niveles de IgG fueron
significativamente mayores para las nanopartículas de
quitosano-PEG que para las nanopartículas de
quitosano.
Claims (28)
1. Un sistema que comprende nanopartículas para
la liberación de moléculas biológicamente activas, donde las
nanopartículas comprenden un conjugado que comprende a) al menos un
50% en peso de quitosano o un derivado del mismo y b) menos de un
50% en peso de polietilenglicol (PEG) o un derivado del mismo,
donde ambos componentes a) y b) están unidos
covalentemente a través de los grupos amino del quitosano, y
caracterizado porque dichas nanopartículas se encuentran
reticuladas mediante un agente reticulante.
2. Sistema según reivindicación 1 donde la
proporción de quitosano o un derivado del mismo respecto al
polietilénglicol es preferentemente superior al 75% en peso.
3. Sistema según reivindicación 1 donde la
proporción de polietilenglicol es preferentemente inferior al 25%
en peso.
4. Sistema según reivindicaciones 1 a 3 donde el
grado de polimerización del quitosano o número de unidades
monoméricas que comprenden el quitosano o un derivado del mismo
está comprendido entre 30 y 3000, preferentemente entre 60 y
600.
5. Sistema según reivindicaciones 1 a 4 donde el
quitosano o su derivado tiene un peso molecular comprendido entre 5
y 2000 kDa, preferentemente entre 10 y 500 kDa, más preferentemente
entre 10 y 100 kDa.
6. Sistema según reivindicaciones 1 a 5 donde el
quitosan o su derivado tiene un grado de desacetilación comprendido
entre 30% y 95%, preferentemente entre 60% y 95%.
7. Sistema según reivindicaciones 1 a 6 donde el
PEG es un PEG modificado que presenta una fórmula (III):
X_{1}-(O-CH_{2}-CH_{2})_{n}-O-X_{2}
donde X_{1} es un grupo protector
de radicales hidroxilo y X_{2} es un hidrógeno o un grupo puente
que permita el anclaje a los grupos amino del
quitosano.
8. Sistema según la reivindicación 7 donde
X_{1} es un grupo alquilo, preferentemente metilo.
9. Sistema según reivindicaciones 1 a 8 donde el
PEG tiene un grado de polimerización comprendido entre 50 y
500.
10. Sistema según reivindicaciones 1 a 9 donde
el PEG tiene un peso molecular comprendido entre 2 y 20 kDa,
preferentemente entre 5 y 10 kDa.
11. Sistema según reivindicaciones 1 a 10 donde
la funcionalización de los grupos amino del quitosano o su derivado
con el PEG está comprendida entre 0.1% y 5%, preferentemente entre
0.5% y 1%.
12. Un sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 que además comprende una molécula
biológicamente activa seleccionada del grupo consistente en fármacos
de bajo peso molecular, polisacáridos, proteínas, péptidos,
lípidos, oligonucleótidos y ácidos nucleicos y combinaciones de las
mismas.
13. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12 donde el agente reticulante es una sal de
polifosfato, preferentemente tripolifosfato sódico.
14. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13 donde el tamaño medio de las nanopartículas
está comprendido entre 1 y 1000 nanómetros, preferentemente entre 50
y 800 nm.
15. Sistema según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14 donde la carga eléctrica (potencial Z) está
comprendida entre + 0.1 mV y 50 mV, preferentemente entre 1 y 40
mV.
16. Una composición farmacéutica que comprende
un sistema como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1
a 15 y una molécula biológicamente activa capaz de prevenir, paliar
o curar enfermedades.
17. Composición según la reivindicación 16 para
administración por vía oral, bucal, sublingual, tópica,
transdérmica, ocular, nasal, vaginal o parenteral.
18. Composición según reivindicación 16 o 17
donde la molécula biológicamente activa se selecciona de entre
polisacáridos, proteínas, péptidos, lípidos, oligonucleótidos,
ácidos nucleicos y combinaciones de las mismas.
19. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18 donde la molécula biológicamente activa es
insulina, heparina, antígenos proteicos ó plásmidos ADN.
20. Composición cosmética que comprende un
sistema para la liberación de una molécula biológicamente activa
como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
21. Composición cosmética según reivindicación
20 donde la molécula activa se selecciona de entre agentes
anti-acné, antifúngicos, antioxidantes,
desodorantes, antitranspirantes, anticaspa, blanqueadores de piel,
bronceadores, absorbentes de luz UV, enzimas y biocidas
cosméticos.
22. Una vacuna que comprende un sistema para la
liberación de una molécula biológicamente activa como el definido
en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y un antígeno.
23. Vacuna según reivindicación 22 donde el
antígeno se selecciona de entre proteínas, polisacáridos y
moléculas de ADN.
24. Vacuna según la reivindicación 22 o 23 donde
el antígeno es el toxoide tetánico ó el toxoide diftérico.
25. Procedimiento de obtención de un sistema
para la liberación controlada de molécula biológicamente activa
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que comprende:
- a)
- preparación de una disolución acuosa del conjugado quitosano-PEG;
- b)
- preparación de una disolución acuosa del agente reticulante; y
- c)
- mezclado, bajo agitación, de las disoluciones de las etapas a) y b), de modo que se obtienen espontáneamente las nanoparticulas de quitosano-PEG mediante gelificación iónica y consiguiente precipitación.
26. Procedimiento para la obtención de
nanopartículas según reivindicación 25, donde el agente reticulante
es un tripolifosfato, preferentemente tripolifosfato sódico.
27. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 25 y 26 donde la molécula biológicamente activa se
disuelve previamente en a) o en b) o en otra fase acuosa u orgánica
que se adiciona sobre a) o b).
28. Procedimiento según la reivindicación 27,
donde la molécula biológicamente activa se selecciona de entre
insulina, heparina, plásmido ADN, toxoide tetánico y toxoide
diftérico.
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