ES2258345T3 - Utilizacion de una xilanasa para la preparacion de un producto alimenticio. - Google Patents
Utilizacion de una xilanasa para la preparacion de un producto alimenticio.Info
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Abstract
Utilización de una secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID nº 5 para preparar un producto alimenticio o una sustancia (por ejemplo una masa) para preparar el mismo.
Description
Utilización de una xilanasa para la preparación
de un producto alimenticio.
La presente invención se refiere a proteínas.
En particular, la presente invención se refiere
al aislamiento y a la caracterización de un inhibidor endógeno de
endo-\beta-1,4-xilanasa
que se encuentra presente en la harina de trigo y a su efecto sobre
las diferentes xilanasas. La presente invención se refiere asimismo
a las xilanasas identificadas mediante un cribado con el inhibidor
y a nuevas xilanasas identificadas de esta manera.
Las xilanasas han sido utilizadas en panadería
durante varios años.
A este respecto, es sabido que la harina de trigo
contiene arabinoxilano originado en las paredes celulares del
endospermo. La cantidad de arabinoxilano en la harina difiere
dependiendo del origen de la harina, por ejemplo ver Rouau et
al., Journal of Cereal Science 19:259-272,
Effect of an Enzyme Preparation Containing Pentosanases on the
Bread-making Quality of Flour in Relation to Changes
in Pentosan Properties, 1994; Fincher y Stone, Advances in
Cereal Technology, vol. VIII (Why Pomeranz, Ed.) AACC, St. Paul,
Minnesota, 207-295, 1986; y Meuser y Suckow,
Chemistry and Physics of Baking (J.M.V. Blanchard, P.J.
Frasier y T. Gillard, editores), Royal Society of Chemistry,
London, 42-61, 1986. Típicamente, la cantidad de
arabinoxilano puede variar entre el 2% y el 5% ((p/p) basado en el
peso seco de harina).
Fincher y Stone (1986) dan a conocer que el 70%
de los polisacáridos en las paredes celulares del endospermo son
arabinoxilano. Un rasgo característico del arabinoxilano es su
capacidad de unirse al agua. Parte del arabinoxilano es pentosano
insoluble en agua (PIA) y parte es pentosano soluble en agua (PSA).
Los resultados experimentales han demostrado una correlación entre
la degradación del PIA para formar polímeros solubles en agua de
alto peso molecular (APM) y el volumen del pan.
Durante la producción de un producto de
panadería, es sabido que la utilización de una xilanasa en una dosis
apropiada puede resultar en un sistema de masa más estable (que
típicamente comprenderá sal, harina, levadura y agua) y un mejor
volumen de, por ejemplo, pan fermentado.
A este respecto, una buena xilanasa para
incrementar el volumen del pan debería solubilizar el PIA,
proporcionando una mayor viscosidad del líquido de la masa sin
degradación adicional del PSA para formar oligómeros de xilosa.
Esta degradación de PIA a PSA de bajo peso molecular (BPM) se cree
que resulta perjudicial para las propiedades de la masa y que puede
dar lugar a pegajosidad (Rouau et al. y McCleary,
International Journal of Biological Macro Molecules
8:349-354, 1986).
El documento US nº A-5306633 da a
conocer una xilanasa obtenida a partir de una cepa de Bacillus
subtilis. Aparentemente, esta xilanasa puede mejorar la
consistencia e incrementar el volumen del pan y de los productos
horneados que la contienen.
Se ha aislado y secuenciado otra xilanasa de
Bacillus subtilis (ver Paice, M.G., Bourbonnais, R.,
Desrochers, M., Jurasek, L. y Yaguchi, M. A xylanase gene from
Bacillus subtilis: nucleotide sequence and comparison with
B. pumilus gene, Arch. Microbiol.
144:201-206, 1986).
Durante cierto tiempo se ha considerado que las
xilanasas bacterianas producirían una masa muy pegajosa. Por lo
tanto, sería previsible que las xilanasas de Bacillus
subtilus, tal como la del documento US nº
A-5306633, producirían una masa de alta
pegajosidad.
Los enzimas de la técnica anterior que provocan
pegajosidad debían utilizarse en cantidades cuidadosamente
controladas de manera que la pegajosidad no afectase negativamente a
su manipulación en un grado que dificultase su manipulación
comercial efectiva. Sin embargo, la necesidad de controlar
cuidadosamente la dosificación impidió la adición de xilanasa
directamente a la harina previamente a la producción de la masa. Por
lo tanto, en los sistemas de la técnica anterior resultaba
necesario añadir la xilanasa de manera muy controlada durante la
producción de la
masa.
masa.
Hasta el momento, las xilanasas fúngicas
típicamente se han utilizado en panadería. Por ejemplo, J. Maat
et al. (Xylans and Xylanases, editado por J. Visser et
al., Xylanases and their application in bakery, páginas
349-360) dan a conocer que la
\beta-1,4-xilanasa producida por
una cepa de Aspergillus niger var. awarmori. De acuerdo con
estos autores, la xilanasa fúngica resulta efectiva en el incremento
del volumen específico del pan, sin dar lugar a efectos secundarios
negativos sobre la manipulación del pan (pegajosidad de la masa),
tal como se observa con las xilanasas derivadas de otras fuentes
fúngicas o bacterianas.
W. Debyser et al. han propuesto (J. Am.
Soc. Brew. Chem. 55(4):153-156, 1997,
Arabinoxylan Solubilization and Inhibition of the Barely Malt
Xylanolytic System by Wheat During Mashing with Wheat Wholemeal
Adjunt: Evidence for a New Class of Enzyme Inhibitors in Wheat),
que podrían encontrarse inhibidores xilanasa en el trigo. El
inhibidor discutido por W. Debyser et al no fue aislado.
Además, W. Debyser et al. no dan a conocer si el inhibidor
es endógeno o microbiológico. Adicionalmente, no presentan datos
químicos sobre este inhibidor.
La presencia de inhibidor de xilanasa en la
harina de trigo también ha sido discutida recientemente por X.
Rouau y A. Surget (Journal of Cereal Science
28:63-70, 1998, Evidence for the Presence of a
Pentosanase Inhibitor in Wheat Flours). De manera similar a Debyser
et al., Rouau y Surget creían que habían identificado la
existencia de un compuesto termolábil en la fracción soluble de las
harinas de trigo, que limitaba la acción de una pentosanasa
añadida. Asimismo, de manera similar a Debyser et al., estos
autores ni aislaron el inhibidor ni pudieron concluir si el
inhibidor era endógeno o de origen microbiano. Igualmente, no
presentaron datos químicos sobre este inhibidor.
De esta manera, un problema conocido de la
técnica es cómo preparar productos horneados a partir de una masa
que no presente propiedades de manipulación desfavorables. Un
problema más particular es cómo proporcionar una masa que no
presente pegajosidad, es decir, una masa que no sea tan pegajosa que
provoque problemas de manipulación y de procesamiento.
La presente invención pretende proporcionar una
solución a dichos problemas.
En las reivindicaciones y en el comentario
siguiente se presentan aspectos de la presente invención.
En resumen, algunos aspectos de la presente
invención se refieren a:
1. Nuevos usos de las xilanasas.
2. Productos alimenticios preparados
con xilanasas.
Entre otros aspectos referentes a la secuencia de
aminoácidos de la presente invención y/o de la secuencia de
nucleótidos de la presente invención se encuentran: un constructo
que comprende o es capaz de expresar las secuencias de la presente
invención; un vector que comprende o es capaz de expresar las
secuencias de la presente invención; un plásmido que comprende o es
capaz de expresar las secuencias de la presente invención; un
tejido que comprende o es capaz de expresar las secuencias de la
presente invención; un órgano que comprende o es capaz de expresar
las secuencias de la presente invención; un huésped transformado que
comprende o es capaz de expresar las secuencias de la presente
invención; un organismo transformado que comprende o es capaz de
expresar las secuencias de la presente invención. La presente
invención comprende asimismo procedimientos para expresar las
mismas, tales como la expresión en un microorganismo, incluyendo
procedimientos para la transferencia de las mismas.
La presente invención difiere de las enseñanzas
del documento WO nº A-98/49278 debido a que,
inter alia, la solicitud de patente PCT contiene información
mínima sobre las secuencias del inhibidor proteínico que se da a
conocer en dicho documento.
A continuación se discuten aspectos de la
presente invención bajo los títulos de sección apropiados.
Convenientemente, las enseñanzas de aplicación general de los
aspectos de la presente invención pueden encontrarse en las
secciones tituladas "Definiciones generales" y "Enseñanzas
generales". Sin embargo, las enseñanzas bajo cada sección no se
encuentran necesariamente limitadas a cada sección particular.
El término "harina de trigo" tal como se
utiliza en la presente memoria es un sinónimo de harina de trigo
finamente molida. Sin embargo, preferentemente el término significa
harina obtenida de trigo per se y no de otro cereal. De esta
manera, y a menos que se indique lo contrario, las referencias a
"harina de trigo" tal como se utiliza en la presente memoria
son referencias a harina de trigo per se, así como a harina
de trigo presente en un medio, tal como en una masa.
El término "xilanasa" se utiliza en su
sentido normal, por ejemplo un enzima que es capaz, inter
alia, de catalizar la despolimerización del arabinoxilano que
puede encontrarse presente en el trigo (por ejemplo un enzima que
es capaz, inter alia, de catalizar la solubilización de PIA y
de catalizar la despolimerización del PSA que puede encontrarse
presente en el trigo).
Posteriormente se presenta un ensayo para
determinar la actividad
endo-\beta-1,4-xilanasa.
Convenientemente, este ensayo se denomina "Ensayo de
xilanasa".
El término "secuencia de nucleótidos" en
relación a la presente invención incluye ADN genómico, ADNc, ADN
recombinante (es decir, ADN preparado mediante la utilización de
técnicas de ADN recombinante), ADN sintético y ARN, así como las
combinaciones de los mismos.
Preferentemente, el término "secuencia de
nucleótidos" se refiere a ADN.
Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención pueden ser de una o dos cadenas.
La secuencias de nucleótidos de la presente
invención pueden incluir dentro de ellas nucleótidos sintéticos o
modificados. En la técnica son conocidos varios tipos de
modificación de los oligonucleótidos. En éstos se incluyen los
esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato, la adición de acridina
o de cadenas de polilisina en los extremos 3’ y/o 5’ de la
molécula. Para los fines de la presente invención, debe entenderse
que las secuencias de nucleótidos indicadas en la presente memoria
pueden modificarse mediante cualquier procedimiento disponible en
la técnica. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo con el fin
de incrementar la actividad in vivo o la vida de las
secuencias de nucleótidos de la presente invención.
Los términos "variante" u "homólogo"
con respecto a la secuencia de nucleótidos de la presente invención
y a la secuencia de aminoácidos de la presente invención, son
sinónimos de variaciones alélicas de las secuencias.
En particular, el término "homología" tal
como se utiliza en la presente memoria puede considerarse igual al
término "identidad". En la presente memoria, la homología de
secuencias con respecto a la secuencia de nucleótidos de la
presente invención y a la secuencia de aminoácidos de la presente
invención puede determinarse mediante una simple comparación visual
(es decir, una comparación estricta) de cualquiera de las secuencias
con otra secuencia con el fin de comprobar si la otra secuencia
presenta una identidad de por lo menos el 75% con la secuencia o
secuencias. La homología relativa de secuencias (es decir, la
identidad de secuencias) también puede determinarse mediante
programas informáticos comercialmente disponibles que pueden
calcular el % de homología entre dos o más secuencias. Un ejemplo
típico de uno de estos programas es CLUSTAL.
Por lo tanto, las comparaciones de homología
pueden llevarse a cabo visualmente. Sin embargo, más habitualmente
se llevan a cabo con la ayuda de programas de comparación de
secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos
disponibles comercialmente pueden calcular el % de homología entre
dos o más secuencias.
El % de homología puede calcularse respecto a
secuencias contiguas, es decir se alinea una secuencia con otra
secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente
con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, comparando
un residuo cada vez. A esto se le denomina una alineación "sin
huecos". Típicamente, estas alineaciones sin huecos se llevan a
cabo únicamente con un número relativamente pequeño de residuos
(por ejemplo menos de 50 aminoácidos contiguos).
Aunque el procedimiento anterior es muy simple y
consistente, no tiene en cuenta que, por ejemplo en un par idéntico
de secuencias, una inserción o una deleción provocará que los
siguientes residuos aminoácidos no se encuentren alineados,
resultando potencialmente, de esta manera, en una gran reducción del
% de homología cuando se lleva a cabo una alineación global. En
consecuencia, la mayoría de los procedimientos de comparación de
secuencias se diseñan para producir alineaciones óptimas que tienen
en cuenta las posibles inserciones y deleciones sin penalizar
excesivamente la puntuación total de homología. Ello se consigue
insertando "huecos" en la alineación de secuencias para
intentar maximizar la homología local.
Sin embargo, estos procedimientos más complejos
asignan "penalizaciones por hueco" a cada hueco en la
alineación, de manera que, para el mismo número de aminoácidos
idénticos, una alineación de secuencia con el número mínimo de
huecos (que refleja una relación estrecha entre las dos secuencias
que se comparan) alcanzará una puntuación más alta que una con
muchos huecos. Típicamente se utilizan los "costes afines de
hueco", que cargan un coste relativamente elevado a la
existencia de un hueco y una penalización más pequeña para cada
residuo posterior en el hueco. Éste es el sistema de puntuación de
huecos más comúnmente utilizado. Evidentemente las penalizaciones
elevadas de los huecos producirán alineaciones optimizadas con menos
huecos. La mayor parte de los programas de alineación permiten
modificar las penalizaciones de hueco. Sin embargo, resulta
preferente utilizar valores por defecto cuando se utilicen dichos
programas para las comparaciones entre secuencias. Por ejemplo, al
utilizar el paquete GCG Wisconsin Bestfit (ver a continuación), la
penalización por defecto por hueco para las secuencias de
aminoácidos es de -12 para un hueco y de -4 para cada extensión.
El cálculo del % máximo de homología, por lo
tanto, requiere en primer lugar la producción de una alineación
óptima, teniendo en cuenta las penalizaciones de hueco. Un programa
informático adecuado para llevar a cabo esta alineación es el
paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, U.S.A.;
Devereux et al., Nucleic Acids Research 12:387, 1984). Entre
los ejemplos de otros programas que pueden llevar a cabo las
comparaciones entre secuencias se incluyen, pero sin limitarse a
ellos, el paquete BLAST (ver Ausubel et al., ibid,
capítulo 18, 1999), FASTA (Atschul et al., J. Mol. Biol.,
403-410, 1990) y el conjunto GENEWORKS de
herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA se encuentran
disponibles para las búsquedas fuera de línea y en línea (ver
Ausubel et al., ibid, páginas 7-58 a
7-60, 1999). Sin embargo, resulta preferente
utilizar el programa GCG Bestfit.
Aunque el % final de homología puede medirse en
términos de identidad, el procedimiento de alineación mismo
típicamente no se basa en una comparación
todo-o-nada entre parejas. Por el
contrario, generalmente se utiliza una matriz escalada de
puntuaciones de similitud que asigna puntuaciones a cada comparación
entre parejas basándose en la similitud química o en la distancia
evolutiva. Un ejemplo de este tipo de matriz que se utiliza
comúnmente es la matriz BLOSUM62, la matriz por defecto del conjunto
de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin generalmente
utilizan los valores por defecto públicos o una tabla personalizada
de comparación de símbolos si ésta se suministra (ver el manual del
usuario para más detalles). Resulta preferente utilizar los valores
por defecto públicos en el paquete GCG o en el caso de otros
programas, la matriz por defecto, tal como en BLOSUM62.
Tras producir el programa una alineación óptima,
resulta posible calcular el % de homología, preferentemente el % de
identidad de secuencia. El programa típicamente lleva a cabo el
cálculo como parte de la comparación de secuencias y genera un
resultado numérico.
Preferentemente, las comparaciones entre
secuencias se llevan a cabo utilizando el algoritmo de búsqueda
simple de BLAST proporcionado en la página de internet
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST utilizando los parámetros por
defecto.
La presente invención comprende asimismo las
secuencias de nucleótidos que son complementarias a las secuencias
que se presentan en la presente memoria, o cualquier derivado,
fragmento o derivado de las mismas. Si la secuencia es
complementaria a un fragmento de las mismas, dicha secuencia puede
utilizarse como sonda para identificar secuencias codificantes
similares en otros organismos, etc.
La presente invención comprende asimismo
secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridarse con
secuencias presentadas en la presente memoria o con cualquier
derivado, fragmento o derivado de las mismas.
La presente invención comprende asimismo
secuencias de nucleótidos que son capaces de hibridarse con las
secuencias complementarias a las secuencias presentadas en la
presente memoria, o con cualquier derivado, fragmento o derivado de
las mismas.
El término "complementario" se refiere
asimismo a secuencias de nucleótidos que pueden hibridarse con las
secuencias de nucleótidos de la secuencia codificante.
El término "variante" comprende asimismo las
secuencias que son complementarias a las secuencias que son capaces
de hibridarse con las secuencias de nucleótidos que se presentan en
la presente memoria.
Preferentemente, el término "variante"
comprende las secuencias que son complementarias con las secuencias
que son capaces de hibridarse bajo condiciones restrictivas (por
ejemplo 65ºC y 0,1xSSC {1xSSC = NaCl 0,15 M,
Na_{3}-citrato 0,015 M, pH 7,0}) con las
secuencias de nucleótidos que se presentan en la presente
memoria.
La presente invención se refiere asimismo a las
secuencias de nucleótidos que pueden hibridarse con las secuencias
de nucleótidos de la presente invención (incluyendo las secuencias
complementarias de las que se presentan en la presente
memoria).
La presente invención se refiere asimismo a las
secuencias de nucleótidos que son complementarias a las secuencias
que pueden hibridarse con las secuencias de nucleótidos de la
presente invención (incluyendo las secuencias complementarias a las
presentadas en la presente memoria).
El término "hibridación" tal como se utiliza
en la presente memoria incluye "el procedimiento por el que una
cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria
mediante apareamiento de bases" (Coombs, J., Dictionary of
Biotechnology, Stockton Press, New York, NY, 1994), así como el
procedimiento de amplificación tal como se lleva a cabo en las
tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa, tal como
describen Dieffenbach, C.W. y G.S. Dveksler (PCR Primer, a
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY,
1995).
Se incluyen asimismo dentro del alcance de la
presente invención las secuencias polinucleotídicas que son capaces
de hibridarse con las secuencias de nucleótidos presentadas en la
presente memoria bajo condiciones de astringencia intermedia a
máxima. Las condiciones de hibridación se basan en la temperatura de
fundido (Tm) del complejo de unión a ácido nucleico, tal como dan a
conocer Berger y Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques,
Methods in Enzymology, vol. 152, Academic Press, San Diego, CA,
1987) y proporcionan una "astringencia" definida, tal como se
explica a continuación.
La astringencia máxima típicamente se produce a
aproximadamente Tm-5ºC (5ºC por debajo de la Tm de
la sonda); la astringencia elevada, aproximadamente 5ºC a 10ºC por
debajo de la Tm; la astringencia intermedia, aproximadamente 10ºC a
20ºC por debajo de la Tm; y la astringencia baja aproximadamente
20ºC a 25ºC por debajo de la Tm. Como será evidente para el experto
en la materia, puede utilizarse una hibridación de máxima
astringencia para identificar o detectar las secuencias
polinucleotídicas idénticas, mientras que puede utilizarse una
hibridación de astringencia intermedia (o baja) para identificar o
detectar secuencias polinucleotídicas similares o relaciona-
das.
das.
En un aspecto preferido, la presente invención se
refiere a las secuencias de nucleótidos que pueden hibridarse con
la secuencia de nucleótidos de la presente invención bajo
condiciones restrictivas (por ejemplo 65ºC y 0,1xSSC).
En un aspecto, la presente invención proporciona
un inhibidor endógeno de
endo-\beta-1,4-xilanasa
que puede obtenerse a partir de la harina de trigo.
En los estudios llevados a cabo por los presentes
inventores, se ha descubierto que el inhibidor es un dipéptido que
presenta un PM de aproximadamente 40 kDa (medido mediante SDS o EM)
y que presenta un pI comprendido entre aproximadamente 8 y
aproximadamente 9,5.
En un aspecto de la presente invención, el
inhibidor se encuentra en una forma aislada y/o en una forma
sustancialmente pura. En la presente memoria, el término
"aislado" se refiere a que el inhibidor no se encuentra en su
ambiente natural.
El análisis de secuencias hasta el momento ha
revelado que el inhibidor presenta por lo menos una o más de las
secuencias presentadas como SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº
15, SEC ID nº 16, SEC ID nº 17, SEC ID nº 18 y/o SEC ID nº 19.
De esta manera, la presente invención comprende
un inhibidor de
endo-\beta-1,4-xilanasa
que comprende por lo menos una o más de las secuencias presentadas
como SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, SEC ID nº 16, SEC ID
nº 17, SEC ID nº 18 y/o SEC ID nº 19 o una variante, homólogo o
fragmento de los mismos.
Los términos "variante", "homólogo" o
"fragmento" en relación al inhibidor de la presente invención
incluyen cualquier sustitución, variación, modificación,
desplazamiento, deleción o adición de uno o más aminoácidos desde o
hacia la secuencia, con la condición de que la secuencia de
aminoácidos resultante presente acción inhibitoria de xilanasa,
preferentemente que presente por lo menos la misma actividad que un
inhibidor que presente por lo menos una o más de las secuencias
presentadas como SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, SEC ID
nº 16, SEC ID nº 17, SEC ID nº 18 y/o SEC ID nº 19. En particular,
el término "homólogo" se refiere a la homología con respecto a
la estructura y/o a la función, con la condición de que el inhibidor
resultante presente actividad inhibitoria de xilanasa,
preferentemente que presente por lo menos la misma actividad de un
inhibidor que presenta por lo menos una o más de las secuencias
presentadas como SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, SEC ID nº
16, SEC ID nº 17, SEC ID nº 18 y/o SEC ID nº 19. Con respecto a la
homología de secuencias (es decir, la similitud o identidad de
secuencias), preferentemente presenta una homología de por lo menos
el 75%, más preferentemente de por lo menos el 80%, más
preferentemente de por lo menos el 85%, más preferentemente de por
lo menos el 90%, con las secuencias mostradas en los listados de
secuencias adjuntos. Más preferentemente presenta una homología de
por lo menos el 95%, más preferentemente de por lo menos el 98%,
con la secuencia mostrada en los listados de secuencias
adjuntos.
Un ejemplo putativo de una variante del inhibidor
de la presente invención presenta por lo menos una o más de las
secuencias presentadas como SEC ID nº 1 y SEC ID nº 2.
El aspecto de inhibidor de la presente invención
resulta ventajoso por varios motivos.
A título de ejemplo, conociendo la identidad
química de un inhibidor endógeno de
endo-\beta-1,4-xilanasa,
en la actualidad se puede determinar la cantidad de inhibidor en,
por ejemplo, una harina de trigo. Convenientemente, este
procedimiento se denomina "Procedimiento de Determinación de la
Cantidad de Inhibidor".
El Procedimiento de Determinación de la Cantidad
de Inhibidor permitirá seleccionar una o más xilanasas apropiadas
para su adición a la harina de trigo y/o para seleccionar cantidades
apropiadas de una o más xilanasas para la adición a la harina de
trigo.
De esta manera, la presente invención proporciona
un procedimiento que comprende: (a) determinar la cantidad o tipo
de inhibidor en una harina de trigo; (b) seleccionar una xilanasa
adecuada para la adición a la harina de trigo y/o seleccionar una
cantidad adecuada de una xilanasa para la adición a la harina de
trigo; y (c) la adición de la xilanasa adecuada y/o de una cantidad
adecuada de la xilanasa, a la harina de trigo.
La presente invención también proporciona un
procedimiento que comprende: (a) determinar la cantidad o tipo de
inhibidor en una harina de trigo; (b) seleccionar una xilanasa
adecuada para la adición a la harina de trigo y/o seleccionar una
cantidad adecuada de un inhibidor de xilanasa para la adición a la
harina de trigo; y (c) añadir el inhibidor de xilanasa adecuado y/o
una cantidad adecuada del inhibidor de xilanasa, a la harina de
trigo.
La presente invención también proporciona un
procedimiento que comprende: (a) determinar la cantidad o tipo de
inhibidor en una harina de trigo, (b) seleccionar una xilanasa
adecuada y un inhibidor de xilanasa adecuado para la adición a la
harina de trigo y/o seleccionar una cantidad adecuada de un
inhibidor de xilanasa para la adición a la harina de trigo, y (c)
añadir la xilanasa adecuada y el inhibidor de xilanasa adecuado y/o
una cantidad adecuada del inhibidor de xilanasa a la harina de
trigo.
La detección de la cantidad de inhibidor puede
llevarse a cabo mediante técnicas químicas estándar, tales como
mediante análisis de espectros de RMN de estado sólido. La cantidad
de inhibidor puede incluso determinarse mediante la utilización de
enzimas xilanasa de las que se conozca que resultan afectadas
negativamente por el inhibidor. En este último aspecto, resultaría
posible obtener una muestra de la harina de trigo y añadirla a una
cantidad conocida de dicha xilanasa. Puede determinarse la actividad
de la xilanasa en un momento determinado, actividad que después
puede correlacionarse con una cantidad de inhibidor en la harina de
trigo.
De esta manera, la presente invención comprende
asimismo la utilización de la combinación de una xilanasa y el
inhibidor como medio para calibrar y/o para determinar la cantidad
de inhibidor en una muestra de harina de trigo.
Los anticuerpos del inhibidor pueden utilizarse
para cribar muestras de harina de trigo con el fin de detectar la
presencia del inhibidor de la presente invención. Los anticuerpos
pueden incluso utilizarse para aislar cantidades del inhibidor de
la muestra de harina de trigo.
Existe una utilización adicional importante del
inhibidor de la presente invención.
A este respecto, el inhibidor podría utilizarse
en un ensayo/cribado para identificar las xilanasas que resultan
afectadas por el inhibidor.
A título de ejemplo, en algunas circunstancias
puede resultar deseable cribar buscando una xilanasa que presenta
una resistencia baja (es decir, que no sea resistente) al
inhibidor.
En un aspecto, el inhibidor puede utilizarse en
un ensayo/cribado para identificar xilanasas que presentan bastante
resistencia (resistencia intermedia), es decir que son
razonablemente resistentes al inhibidor.
En un aspecto, el inhibidor puede utilizarse en
un ensayo/cribado para identificar xilanasas que presentan una
resistencia elevada al inhibidor.
Un Protocolo adecuado para determinar el grado de
inhibición por el inhibidor se presenta posteriormente.
Convenientemente, este protocolo se denomina "Protocolo de ensayo
de inhibidor".
De esta manera, la presente invención proporciona
un procedimiento para determinar el grado de resistencia de una
xilanasa a un inhibidor de xilanasa, en el que el procedimiento
comprende: (a) poner en contacto una xilanasa de interés con el
inhibidor; y (b) determinar si el inhibidor inhibe la actividad de
la xilanasa de interés. Convenientemente, se denominará a este
procedimiento, el "Procedimiento de Ensayo de Inhibidor".
En la presente memoria, el término
"resistente" se refiere a la actividad de la xilanasa que no
resulta totalmente inhibida por el inhibidor. En otras palabras, el
inhibidor puede utilizarse en un ensayo/cribado para identificar
las xilanasas que no resultan afectadas negativamente por el
inhibidor.
De esta manera, el término "grado de
resistencia" en relación a la xilanasa
cara-a-cara con el inhibidor de
xilanasa es sinónimo de grado de no inhibición de la actividad de
una xilanasa por parte del inhibidor de xilanasa. De esta manera,
una xilanasa que presente un grado elevado de resistencia al
inhibidor de xilanasa es similar a un grado elevado de no
inhibición de una xilanasa por el inhibidor de xilanasa.
La presente invención comprende asimismo un
procedimiento que comprende las etapas de (a) llevar a cabo el
Procedimiento de Ensayo de Inhibidor, (b) identificar una o más
xilanasas que presenten un grado elevado (o intermedio o bajo) de
resistencia al inhibidor, (c) preparar una cantidad de la xilanasa o
xilanasas identificadas.
A continuación, pueden utilizarse las xilanasas
adecuadas identificadas para preparar un producto alimenticio, en
particular una masa para preparar un producto de panadería.
Además, mediante la identificación de una
xilanasa resistente al inhibidor en algún grado (es decir, una
xilanasa que no resulte tan inhibida como otras xilanasas), resulta
posible añadir menos de la xilanasa identificada al medio para la
posterior utilización de la misma. Entre las utilizaciones finales
de las xilanasa se incluyen una o más de entre: preparación de
productos alimenticios, producción de almidón y proteínas,
producción de papel, procesamiento de pulpa, etc.
De esta manera, la presente invención comprende
asimismo un procedimiento que comprende las etapas de: (a) llevar a
cabo el Procedimiento de Ensayo de Inhibidor; (b) identificar una o
más xilanasas que presentan un grado elevado (o intermedio o bajo)
de resistencia al inhibidor; y (c) preparar una masa que comprenda
la xilanasa o xilanasas identificadas.
En el curso de los experimentos relacionados con
la presente invención, se descubrió inesperadamente que las
xilanasas bacterianas podían ser resistentes al inhibidor, en el
sentido de que su actividad no resultaba completamente eliminada.
En algunos casos, las xilanasas mostraban una resistencia muy
favorable al inhibidor.
En presencia de algunas xilanasas bacterianas
identificadas como adecuadas mediante el Procedimiento de Ensayo de
Inhibidor, en una mezcla de masa los presentes inventores
inesperadamente descubrieron que la mezcla de masa no presentaba
una pegajosidad tan elevada como la de una mezcla de masa que
comprendía una xilanasa fúngica. Estos resultados resultaron
completamente inesperados a la vista de las enseñanzas de la técnica
anterior.
De esta manera, la presente invención proporciona
un procedimiento adicional de ensayo para identificar una xilanasa
bacteriana o mutante de la misma para la utilización en la
preparación de un producto alimenticio horneado. El procedimiento
comprende (a) añadir una xilanasa bacteriana de interés a una mezcla
de masa, y (b) determinar la pegajosidad de la mezcla de masa
resultante, de manera que la xilanasa bacteriana o un mutante de la
misma resulte adecuada en la preparación de un producto alimenticio
horneado si la mezcla de masa resultante presenta una pegajosidad
inferior a la de una mezcla de masa similar que comprenda una
xilanasa fúngica. Convenientemente, se denominará a este
procedimiento el "Procedimiento de ensayo de pegajosidad".
De esta manera, la presente invención también
proporciona un procedimiento que comprende las etapas de: (a)
llevar a cabo el Procedimiento de ensayo de pegajosidad, (b)
identificar una o más xilanasas adecuadas para la utilización en la
preparación de un producto alimenticio horneado, (c) preparar una
cantidad de la xilanasa o xilanasas identificadas.
Posteriormente se presenta un protocolo adecuado
para determinar la pegajosidad de una masa. Convenientemente, se
denomina a este protocolo "Protocolo de pegajosidad". De
acuerdo con la presente invención, una masa que comprenda una
xilanasa de acuerdo con la presente invención que presente menor
pegajosidad que una masa que comprenda una xilanasa fúngica puede
denominarse, ocasionalmente, "masa no pegajosa".
Si una xilanasa bacteriana mostrase propiedades
favorables (en el aspecto de que no produzca una masa que presente
una pegajosidad comparable a la de una masa que comprenda una
xilanasa fúngica), dicha xilanasa podría utilizarse para preparar
productos alimenticios, tales como una masa para preparar un
producto de panadería.
De esta manera, la presente invención también
proporciona un procedimiento que comprende las etapas de: (a)
llevar a cabo el Procedimiento de ensayo de pegajosidad, (b)
identificar una o más xilanasas adecuadas para la utilización de un
producto alimenticio horneado, y (c) preparar una masa que comprenda
la xilanasa o xilanasas identifica-
das.
das.
En el curso de los experimentos relacionados con
la presente invención, los presentes inventores también han
descubierto que la presencia de enzimas glucanasa en determinadas
cantidades podría presentar un efecto perjudicial sobre las
xilanasas.
De esta manera, en un aspecto resulta ventajoso
no presentar niveles perjudiciales de enzimas glucanasa en la
preparación de xilanasa, tal como el medio utilizado para preparar o
extraer los enzimas xilanasa. Además, para algunos aspectos,
resulta ventajoso no presentar niveles perjudiciales de enzimas
glucanasa en un medio que deba utilizarse para preparar un producto
alimenticio cuyo medio contendrá la xilanasa. En la presente
memoria, el término "nivel perjudicial" se refiere a la
presencia de una cantidad de glucanasa suficiente para que los
beneficios de la xilanasa se vean enmascarados por el efecto
negativo de los enzimas glucanasa.
De esta manera, la presente invención proporciona
un procedimiento adicional de ensayo para identificar una
composición de xilanasa (tal como una preparación de xilanasa) o un
medio en el que deba prepararse una xilanasa o un medio al que deba
añadirse una xilanasa que resultará adecuada para la utilización en
la preparación de un producto alimenticio horneado, comprendiendo
el procedimiento (a) proporcionar una composición que contiene la
xilanasa de interés o un medio en el que se preparará la xilanasa o
un medio al que se añadirá la xilanasa, y (b) determinar la
presencia de enzima o enzimas glucanasa activos en la composición o
medio, de manera que si, como máximo, hay un nivel bajo de enzima o
enzimas glucanasa activos en la composición o medio, la composición
o medio resultarán adecuados para la preparación de un producto
alimenticio horneado. Convenientemente, se denominará a este
procedimiento el "Procedimiento de Ensayo de Glucanasas".
La presente invención también proporciona un
procedimiento que comprende las etapas de: (a) llevar a cabo el
Procedimiento de ensayo de glucanasa, (b) identificar una o más
composiciones o medios adecuados para la utilización en la
preparación de un producto alimenticio horneado, (c) preparar una
cantidad de dicha composición o composiciones o de dicho medio o
medios identificados.
Posteriormente se presenta un Protocolo adecuado
para determinar la actividad de las glucanasas. Convenientemente,
se denominará a este protocolo el "Protocolo de las
glucanasas".
Si la composición o medio muestra propiedades
favorables (en el sentido que los efectos beneficiosos asociados
con la xilanasa no estén completamente enmascarados por la presencia
de cantidades perjudiciales de enzimas glucanasa), la composición o
medio pueden utilizarse para preparar un producto alimenticio,
preferentemente masa que se utiliza para preparar un producto de
panadería.
De esta manera, la presente invención comprende
asimismo un procedimiento que comprende las etapas de: (a) llevar a
cabo el Procedimiento de Ensayo de Glucanasas, (b) identificar una o
más composiciones o medios identificados que resultan adecuados
para la utilización en la preparación de un producto alimenticio
horneado, y (c) preparar una masa que comprende una o más de las
composiciones o medios identificados.
De esta manera, la presente invención se refiere
a una preparación de xilanasa, en la que la preparación de xilanasa
se encuentra sustancialmente libre de enzimas glucanasa.
A este respecto, la preparación de xilanasa puede
prepararse a partir de una preparación inicial de la que, por lo
menos sustancialmente, se haya eliminado todo el enzima o enzimas
glucanasa que pueda haber presentes o incluso de la que la
actividad del enzima o enzimas glucanasa se haya suprimido o
eliminado. Las técnicas para conseguir lo anterior podrían incluir
la utilización de anticuerpos que reconocen y se unen al enzima o
enzimas glucanasa y que al unirse inactivan la actividad del enzima
o enzimas glucanasa. Alternativamente, los anticuerpos específicos
del enzima o enzimas glucanasa podrían unirse a un soporte de manera
que el paso de la preparación inicial por los anticuerpos unidos
resultarían en la eliminación del enzima o enzimas glucanasa del
soporte, formando de esta manera una preparación de xilanasa
sustancialmente libre de enzima o enzimas glucanasa. En una forma
de realización alternativa, o incluso en una forma de realización
adicional, la preparación de xilanasa puede prepararse a partir de
un organismo huésped que presente una actividad de enzima glucanasa
mínima o nula. En este aspecto, la actividad de los enzimas
glucanasa que se encuentran presentes en el organismo huésped
pueden inactivarse. En un aspecto alternativo, la expresión de los
genes glucanasa pueden silenciarse y/o anularse. Las técnicas para
conseguir lo anterior incluyen la utilización de secuencias
antisentido respecto a las secuencias codificantes de glucanasa. En
una forma de realización adicional, se utiliza un organismo huésped
que presenta una expresión nula, o mínima a lo sumo, de
enzimas
glucanasa.
glucanasa.
En algunos casos, puede resultar útil la medición
del valor Ki de una xilanasa (que en la presente memoria se
denominará "ensayo de Ki"). A este respecto, los presentes
inventores han descubierto que, en algunos casos, el valor de Ki
resulta indicativo de la idoneidad de la xilanasa para determinada
aplicación o aplicaciones. El conocimiento del valor de Ki podría
resultar útil por sí mismo.
La presente invención comprende asimismo las
combinaciones de los ensayos de la presente invención.
A este respecto, la presente invención incluye un
procedimiento de combinación que comprende dos o más de las etapas
siguientes: una etapa que comprenda el Procedimiento de
Determinación de la Cantidad de Inhibidor, una etapa que comprenda
el Procedimiento de Ensayo de Inhibidor, una etapa que comprenda el
Procedimiento de Ensayo de la Pegajosidad, una etapa que comprenda
el Procedimiento de Ensayo de las Glucanasas, y una etapa que
comprenda el ensayo de Ki. En el procedimiento de combinación, las
etapas pueden encontrarse en cualquier orden y no deben llevarse a
cabo necesariamente de manera simultánea o consecutiva.
Tal como se ha indicado anteriormente, la
presente invención proporciona un ensayo adecuado para identificar
las xilanasas que pueden utilizarse en la preparación de productos
alimenticios, en particular masas para la utilización en la
preparación de productos de panadería.
A este respecto, los presentes inventores han
identificado tres nuevas xilanasas que resultan adecuadas para la
preparación de productos alimenticios, en particular masas para
utilizar en la preparación de productos de panadería.
De esta manera, la presente invención también
incluye una secuencia de aminoácidos que comprende cualquiera de
las secuencias de aminoácidos presentadas como SEC ID nº 7, SEC ID
nº 9 ó SEC ID nº 11, o una variante, homólogo o fragmento de las
mismas.
Los términos "variante", "homólogo" o
"fragmento" en relación a la xilanasa de la presente invención
incluyen cualquier sustitución, variación, modificación,
sustitución, deleción o adición de uno o más aminoácidos de la
secuencia, con la condición de que la secuencia de aminoácidos
resultante presente actividad xilanasa, preferentemente que
presente por lo menos la misma actividad, que comprende cualquiera
de las secuencias de aminoácidos presentadas como SEC ID nº 7, SEC
ID nº 9 ó SEC ID nº 11. En particular, el término "homólogo"
se refiere a la homología con respecto a la estructura y/o función,
con la condición de que la proteína resultante presente actividad
xilanasa, preferentemente por lo menos la misma actividad de
cualquiera de las secuencias de aminoácidos presentadas como SEC ID
nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº 11. Con respecto a la homología de
secuencias (es decir, la similitud o identidad de secuencias),
existe preferentemente una homología de por lo menos el 75%, más
preferentemente de por lo menos el 85%, más preferentemente de por
lo menos el 90%, con la secuencia mostrada en los listados de
secuencia adjuntos. Más preferentemente existe una homología de por
lo menos el 95%, más preferentemente de por lo menos el 98%, con la
secuencia mostrada en los listados de secuencia adjuntos.
Preferentemente, la xilanasa comprende la
secuencia presentada como SEC ID nº 7 o SEC ID nº 11, o una
variante, homólogo o fragmento de los mismos.
La presente invención comprende asimismo una
secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos
de la presente invención.
Preferentemente, la secuencia de nucleótidos de
la presente invención se selecciona de entre:
(a) una secuencia de nucleótidos que
comprende cualquiera de las secuencias de nucleótidos presentadas
como SEC ID nº 8, SEC ID nº 10 o SEC ID nº 10 o SEC ID nº 12, o una
variante, homólogo o fragmento de las mismas,
(b) cualquiera de las secuencias de
nucleótidos presentadas como SEC ID nº 8, SEC ID nº 10 o SEC ID nº
12, o el complemento de las mismas,
(c) una secuencia de nucleótidos capaz de
hibridarse con cualquiera de las secuencias de nucleótidos
presentadas como SEC ID nº 8, SEC ID nº 10 o SEC ID nº 12 o un
fragmento de las mismas,
(d) una secuencia de nucleótidos capaz de
hibridarse con el complemento de cualquiera de las secuencias de
nucleótidos presentadas como SEC ID nº 8, SEC ID nº 10 o SEC ID nº
12, o a un fragmento de las mismas, y
(e) una secuencia de nucleótidos degenerada
como resultado del código genético de los nucleótidos indicados en
(a), (b), (c) o (d).
Los términos "variante", "homólogo" o
"fragmento" en relación a la secuencia de nucleótidos de la
presente invención comprenden cualquier sustitución, variación,
modificación, desplazamiento, deleción o adición de un ácido
nucleico (o más) de o hacia la secuencia, con la condición de que la
secuencia de nucleótidos resultante codifique una secuencia de
aminoácidos que presente actividad de xilanasa, presentando
preferentemente por lo menos la misma actividad, que comprende
cualquiera de las secuencias de aminoácidos presentadas como SEC ID
nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº 11. En particular, el término
"homólogo" se refiere a la homología respecto a la estructura
y/o función, con la condición de que la proteína expresada
resultante presente actividad xilanasa, preferentemente por lo
menos la misma actividad de cualquiera de las secuencias de
aminoácidos presentadas como SEC ID nº 7, SEC ID nº 9 o SEC ID nº
11. Con respecto a la homología de secuencias (es decir, la
similitud o identidad de secuencias), preferentemente la homología
a la secuencia mostrada como SEC ID nº 8, SEC ID nº 10 o SEC ID nº
12 en los listados de secuencia adjuntos preferentemente es de por
lo menos el 75%, más preferentemente de por lo menos el 85%, más
preferentemente de por lo menos el 90%. Más preferentemente la
homología con la secuencia mostrada en los listados de secuencia
adjuntos es de por lo menos el 95%, más preferentemente de por lo
menos el 98%.
Preferentemente, la secuencia de nucleótidos de
la presente invención comprende la secuencia presentada como SEC ID
nº 8 o SEC ID nº 12, o una variante, homólogo o fragmento de las
mismas.
Tal como se ha indicado anteriormente, la
presente invención también proporciona un ensayo adecuado para
identificar xilanasas que pueden utilizarse en la preparación de
masas no pegajosas (tal como se definen en la presente memoria)
para la utilización en la preparación de productos de panadería.
A este respecto, los presentes inventores han
identificado determinadas xilanasas, xilanasas bacterianas tanto
conocidas como nuevas, que resultan adecuadas para la preparación de
productos alimenticios, en particular masas para la utilización en
la preparación de productos de panadería.
De esta manera, la presente invención se refiere
a masa no pegajosa (tal como se define en la presente memoria) que
comprende una xilanasa identificable mediante el ensayo de la
presente invención. Preferentemente, la xilanasa presenta una
secuencia de aminoácidos presentada como en la secuencia SEC ID nº
5.
En contraste con los sistemas de la técnica
anterior, la presente invención proporciona la posibilidad de
añadir la xilanasa directamente a la harina previamente a la
producción de la masa. De esta manera, puede administrarse al
productor de masa un solo lote de mezcla de harina/xilanasa. Además,
el productor de masa no requiere equipos de dosificación para poder
obtener una masa fácilmente manipulable.
La presente invención proporciona un medio para
identificar xilanasas adecuadas para la utilización en la
producción de productos alimenticios. Los productos alimenticios
típicos, que comprende asimismo forrajes, productos lácteos,
productos cárnicos, productos avícolas, productos pesqueros y
productos de panadería.
Preferentemente, el producto alimenticio es un
producto de panadería. Los productos de panadería (horneados)
típicos incorporados dentro del alcance de la presente invención
incluyen pan (tal como barras de pan, panecillos, bollos, bases de
pizza, etc., pretzels, tortillas, pasteles, galletas, bizcochos,
galletas saladas, etc.
En el comentario siguiente, las referencias a la
"secuencia de nucleótidos de la presente invención" y a la
"secuencia de aminoácidos de la presente invención" hacen
referencia respectivamente a cualquiera o cualesquiera de la
secuencias de nucleótidos en la presente memoria y a cualquiera o
cualesquiera de las secuencias de aminoácidos en la presente
memoria.
La expresión "secuencia de aminoácidos de la
presente invención" es sinónima de la expresión "secuencia
polipeptídica de la presente invención". En la presente memoria,
la secuencia de aminoácidos puede ser la de la xilanasa o la del
inhibidor de xilanasa.
Los polipéptidos de la presente invención
comprenden asimismo fragmentos de la secuencia de aminoácidos
presentada y de las variantes de la misma. Los fragmentos adecuados
presentarán un tamaño de por lo menos 5, por ejemplo de por lo
menos 10, 12, 15 ó 20 aminoácidos.
Los polipéptidos de la presente invención también
pueden modificarse para que contengan una o más (por ejemplo por lo
menos 2, 3, 5 ó 10) sustituciones, deleciones o inserciones,
incluyendo las sustituciones conservadas.
Las sustituciones conservadas pueden llevarse a
cabo de acuerdo con la tabla siguiente, que indica las sustituciones
conservadoras, en las que los aminoácidos en el mismo bloque en la
segunda columna y preferentemente en la misma línea en la tercera
columna, pueden sustituirse entre sí:
| Alifático | No polar | G A P |
| I L V | ||
| Polar - sin carga | C S T M | |
| N Q | ||
| Polar - con carga | D E | |
| K R | ||
| Aromático | H F W Y | |
| Otro | N Q D E |
Los polipéptidos de la presente invención pueden
encontrarse en un forma sustancialmente aislada. Se entiende que el
polipéptido puede encontrarse en mezcla con portadores o diluyentes
que no interfieren con el fin pretendido del polipéptido y todavía
considerarse como sustancialmente aislados. Un polipéptido de la
presente invención también puede encontrarse en una forma
sustancialmente purificada, en cuyo caso generalmente comprenderá el
polipéptido en una preparación en la que más del 90%, por ejemplo
el 95%, el 98% o el 99% del polipéptido en la preparación, será un
polipéptido de la presente invención. Los polipéptidos de la
presente invención pueden modificarse, por ejemplo mediante la
adición de residuos histidina, con el fin de ayudar en la
purificación, o mediante la adición de una secuencia de señal con
el fin de estimular su secreción desde las células, tal como se
expone a continuación.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
producirse mediante medios sintéticos (por ejemplo tal como
describen Geysen et al., 1996) o recombinantemente, tal como
se expone a continuación.
La utilización de células huésped adecuadas,
tales como levaduras, hongos y células vegetales, puede proporcionar
dichas modificaciones post-traduccionales (por
ejemplo la miristolación, glicosilación, truncado, lapidación y
fosforilación de tirosinas, serinas o treoninas) según resulten
necesarias para conferir una actividad biológica óptima a los
productos de expresión recombinante de la presente invención.
La expresión "secuencia de nucleótidos de la
presente invención" es sinónima de la expresión "secuencia
polinucleotídica de la presente invención".
Los polinucleótidos de la presente invención
incluyen secuencias de ácidos nucleótidos que codifican los
polipéptidos de la presente invención. Se apreciará que un abanico
de diferentes polinucleótidos codifican una secuencia dada de
aminoácidos como consecuencia de la degeneración del código
genético.
Mediante el conocimiento de las secuencias de
aminoácidos indicadas en la presente memoria, resulta posible
diseñar secuencias parciales y de longitud completa de ácidos
nucleicos, tales como ADNc y/o clones genómicos, que codifiquen los
polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, los
polinucleótidos de la presente invención pueden obtenerse
utilizando PCR degenerados que harán uso de cebadores diseñados para
reconocer secuencias que codifican las secuencias de aminoácidos
presentadas en la presente memoria. Los cebadores contendrán
típicamente múltiples posiciones degeneradas. Sin embargo, con el
fin de minimizar la degeneración, se seleccionarán las secuencias
que codifican las regiones de las secuencias de aminoácidos
presentadas en la presente memoria que contengan aminoácidos, tales
como metionina, que se encuentran codificados por únicamente un
triplete. Además, se seleccionarán las secuencias teniendo en
cuenta la utilización de codones en el organismo cuyos ácidos
nucleicos se utilizan como molde de ADN para el procedimiento de
PCR. La PCR se utilizará en condiciones de astringencia menores a
las utilizadas para la clonación de secuencias con cebadores de una
única secuencia (no degenerados) a partir de secuencias
conocidas.
Las secuencias de ácidos nucleicos obtenidos
mediante PCR que codifican fragmentos polipeptídicos de la presente
invención pueden utilizarse a continuación para obtener secuencias
más grandes utilizando las técnicas de cribado de bibliotecas de
hibridación. Por ejemplo, puede marcarse un clon de PCR con átomos
radioactivos y utilizarse para cribar un ADNc o una biblioteca
genómica de otra especie, preferentemente de otra especie vegetal o
fúngica. Las condiciones de hibridación típicamente serán
condiciones de astringencia intermedia a alta (por ejemplo, cloruro
sódico 0,03 M y citrato sódico 0,03 M a una temperatura entre
aproximadamente 50ºC y aproximadamente 60ºC).
Las sondas de ácidos nucleicos degenerados que
codifican la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos
también pueden utilizarse para sondear el ADNc y/o las bibliotecas
genómicas de otras especies, preferentemente de otras especies
vegetales o fúngicas. Sin embargo, resulta preferente llevar a cabo
técnicas de PCR inicialmente para obtener una sola secuencia para
la utilización en procedimientos adicionales de cribado.
Las secuencias polinucleotídicas de la presente
invención obtenidas utilizando las técnicas indicadas anteriormente
pueden utilizarse para obtener secuencias homólogas y variantes
adicionales utilizando las técnicas indicadas anteriormente.
También pueden modificarse para la utilización en la expresión de
los polipéptidos de la presente invención en una diversidad de
sistemas huésped celulares, por ejemplo con el fin de optimizar las
preferencias de codón para una célula huésped particular en la que
se están expresando las secuencias polinucleotídicas. Podrían
resultar deseables otros cambios de secuencia para introducir sitios
de reconocimiento de enzimas de restricción o alterar la propiedad
o función de los polipéptidos codificados por los
polinucleótidos.
Los polinucleótidos de la presente invención
pueden utilizarse para producir un cebador, por ejemplo un cebador
de PCR, un cebador para una reacción alternativa de amplificación,
una sonda, por ejemplo marcada con una etiqueta marcadora mediante
medios convencionales utilizando marcaje radioactivo o no
radioactivo, o los polinucleótidos pueden clonarse dentro de
vectores. Dichos cebadores, sondas y otros fragmentos serán de una
longitud de por lo menos 15, preferentemente de por lo menos 20,
por ejemplo de por lo menos 25, 30 ó 40 nucleótidos, y también
quedan comprendidos por la expresión polinucleótidos de la presente
invención tal como se utiliza en la presente memoria.
Los polinucleótidos o cebadores de la presente
invención pueden incluir una etiqueta marcadora. Las etiquetas
adecuadas incluyen radioisótopos, tales como ^{32}P o ^{35}S,
etiquetas enzimáticas u otras etiquetas proteicas, tales como la
biotina. Dichas etiquetas pueden añadirse a los polinucleótidos o
cebadores de la presente invención y pueden detectarse utilizando
técnicas conocidas per se.
Los polinucleótidos tales como los
polinucleótidos de ADN y los cebadores de acuerdo con la presente
invención, pueden producirse de manera recombinante, sintética o
mediante cualquier medio disponible para un experto en la materia.
También pueden clonarse mediante técnicas convencionales.
En general, los cebadores se producirán mediante
medios sintéticos, que implican una producción por etapas de la
secuencia deseada de ácidos nucleicos añadiendo los nucleótidos uno
por uno. Las técnicas para conseguir lo anterior utilizando
técnicas automatizadas se encuentran fácilmente disponibles en la
técnica.
Los polinucleótidos de mayor longitud
generalmente se producirán utilizando medios recombinantes, por
ejemplo utilizando una técnica de clonación por PCR (reacción en
cadena de la polimerasa). Ello implicará preparar un par de
cebadores (por ejemplo de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) para
una región del gen del inhibidor
endo-\beta-1,4-xilanasa
que se desea clonar, haciendo entrar en contacto los cebadores con
el ARNm o el ADNc obtenido a partir de una célula fúngica, vegetal
o procariótica, llevando a cabo la reacción en cadena de la
polimerasa bajo condiciones que produzcan la amplificación de la
región deseada, aislando el fragmento amplificado (por ejemplo
mediante la purificación de la mezcla de reacción en un gel de
agarosa) y recuperando el ADN amplificado. Los cebadores pueden
diseñarse para contener sitios adecuados de reconocimiento de
enzimas de restricción de manera que pueda clonarse el ADN
amplificado en un vector de clonación adecuado.
Preferentemente, el polinucleótido de la presente
invención se encuentra unido funcionalmente a una secuencia
reguladora capaz de proporcionar la expresión de la secuencia
codificante, tal como la de la célula huésped seleccionada. A
título de ejemplo, la presente invención se refiere a un vector que
comprende el polinucleótido de la presente invención unido
funcionalmente a dicha secuencia reguladora, es decir, el vector es
un vector de expresión.
El término "unido funcionalmente" se refiere
a una yuxtaposición en la que los componentes descritos se
encuentran relacionados de manera que pueden funcionar de la manera
deseada. Una secuencia reguladora "unida funcionalmente" a una
secuencia codificante se encuentra ligada de tal manera que la
expresión de la secuencia codificante se consigue bajo condiciones
compatibles con las de las secuencias de control.
El término "secuencias reguladoras" incluye
los promotores e intensificadores y otras señales reguladoras de la
expresión.
El término "promotor" se utiliza en el
sentido normal utilizado en la técnica, por ejemplo un sitio de
unión de ARN polimerasa.
La expresión incrementada del polinucleótido que
codifica el polipéptido de la presente invención también puede
conseguirse mediante la selección de regiones reguladoras
heterólogas, por ejemplo regiones promotoras, de líder de secreción
y terminadoras, que sirven para incrementar la expresión y, si se
desea, los niveles de secreción de la proteína de interés del
huésped de expresión seleccionado y/o para proporcionar el control
inducible de la expresión del polipéptido de la presente
invención.
Preferentemente, la secuencia de nucleótidos de
la presente invención puede encontrarse unida funcionalmente a por
lo menos un promotor.
Aparte del promotor nativo al gen que codifica el
polipéptido de la presente invención, pueden utilizarse otros
promotores para dirigir la expresión del polipéptido de la presente
invención. El promotor puede seleccionarse por su eficiencia en la
dirección de la expresión del polipéptido de la presente invención
en el huésped de expresión desea-
do.
do.
En otra forma de realización, puede seleccionarse
un promotor constitutivo para dirigir la expresión del polipéptido
deseado de la presente invención. Dicho constructo de expresión
puede proporcionar ventajas adicionales, debido a que evita la
necesidad de cultivar los huéspedes de expresión en un medio que
contenga un sustrato inductor.
Entre los ejemplos de promotores constitutivos
y/o inducibles fuertes que resultan preferentes para la utilización
en los huéspedes fúngicos de expresión, se encuentra aquellos que
pueden obtenerse a partir de los genes fúngicos para los promotores
de la xilanasa (xlnA), fitasa, ATP-sintetasa,
subunidad 9 (oliC), triosa fosfato isomerasa (tpi),
alcohol deshidrogenasa (AdhA),
\alpha-amilasa (amy), amiloglucosidasa (AG,
del gen glaA), acetamidasa (amdS) y
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (gpd).
Entre los ejemplos de promotores fuertes de las
levaduras se encuentran los que pueden obtenerse a partir de los
genes de la alcohol deshidrogenasa, lactasa,
3-fosfoglicerato quinasa y triosafosfato
isomerasa.
Entre los ejemplos de promotores bacterianos
fuertes se encuentran los promotores
\alpha-amilasa y SP02, así como los promotores
para los genes de proteasa extracelular.
También pueden utilizarse promotores híbridos
para mejorar la regulación inducible del constructo de
expresión.
El promotor puede además incluir elementos que
aseguren o incrementen la expresión en un huésped adecuado. Por
ejemplo, entre los elementos pueden encontrarse regiones
conservadas, tales como el Pribnow Box o un TAT box. El promotor
puede incluso contener otras secuencias que afecten (que mantengan,
intensifiquen, reduzcan) los niveles de expresión de la secuencia
de nucleótidos de la presente invención. Por ejemplo, entre otras
secuencias adecuadas se incluyen el intrón Sh1 o un intrón ADH.
Entre otras secuencias se incluyen elementos inducibles, tales como
la temperatura, elementos inducibles por temperatura, compuestos
químicos, luz o estrés. Además, pueden encontrarse presentes
elementos adecuados para intensificar la transcripción o traducción.
Un ejemplo de este último elemento es la secuencia de señal TMV 5’
(ver Sleat, Gene 217:217-225, 1987; y Dawson, Plant
Mol. Biol. 23:97,
1993).
1993).
Con frecuencia resulta deseable que el
polipéptido de la presente invención se secrete desde el huésped de
expresión en un medio de cultivo del que el polipéptido de la
presente invención pueda recuperarse con mayor facilidad. De
acuerdo con la presente invención, la secuencia de líder de
secreción puede seleccionarse a partir del huésped de expresión
deseado. También pueden utilizarse en el contexto de la presente
invención las secuencias de señalización híbridas.
Entre los ejemplos típicos de secuencias
heterólogas de líder de secreción se encuentran las que se originan
en el gen de la amiloglucosidasa fúngica (AG) (glaA, las versiones
tanto de 18 como de 24 aminoácidos, por ejemplo de
Aspergillus), el gen factor-a (levaduras, por
ejemplo Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen
\alpha-amilasa (Bacillus).
El término "constructo", el cual es sinónimo
de términos tales como "conjugado", "cassette" e
"híbrido", incluye la secuencia de nucleótidos de acuerdo con
la presente invención directa o indirectamente unida a un promotor.
Un ejemplo de una unión indirecta es el suministro de un grupo
espaciador adecuado, tal como una secuencia intrón, tal como el
intrón Sh1 o el intrón ADH, en posición intermedia entre el promotor
y la secuencia de nucleótidos de la presente invención. De la misma
manera, el término "fusionado" en relación a la presente
invención, que incluye la unión directa o indirecta. En cada caso,
los términos no incluyen la combinación natural de la secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína asociada habitualmente con el
promotor génico de tipo salvaje y cuando ambas se encuentran en su
ambiente natural.
El constructo incluso puede contener o expresar
un marcador que permita la selección del constructo genético en,
por ejemplo, una bacteria, preferentemente del género
Bacillus, tal como Bacillus subtilis, o en plantas,
tales como patatas, remolacha azucarera, etc., a las que ha sido
transferido. Existen diversos marcadores que pueden utilizarse,
tales como, por ejemplo, los que codifican la
manosa-6-fosfato isomerasa
(especialmente en el caso de las plantas) o aquellos marcadores que
proporcionan resistencia a antibióticos, por ejemplo resistencia a
G418, higromicina, bleomicina, canamicina y gentamicina.
Preferentemente el constructo de la presente
invención comprende por lo menos la secuencia de nucleótidos de la
presente invención unida funcionalmente a un promotor.
El término "vector" incluye los vectores de
expresión, los vectores de transformación y los vectores
lanzadera.
El término "vector de expresión" se refiere
a un constructo capaz de la expresión in vivo o in
vitro.
El término "vector de transformación" se
refiere a un constructo capaz de ser transferido de una entidad a
otra entidad (que puede ser de la especie o puede ser de una especie
diferente). Si el constructo puede transferirse de una especie a
otra, tal como de un plásmido E. coli a una bacteria,
preferentemente del género Bacillus, el vector de
transformación en ocasiones se denomina "vector lanzadera".
Incluso puede ser un constructo capaz de transferirse desde un
plásmido E. coli a un Agrobacterium, y de éste a una
planta.
Los vectores de la presente invención pueden
transformarse en una célula huésped adecuada tal como se describe
después, para proporcionar la expresión de un polipéptido de la
presente invención. De esta manera, en un aspecto adicional, la
invención proporciona un procedimiento para la preparación de
polipéptidos de acuerdo con la presente invención que comprende
cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un
vector de expresión tal como se ha indicado anteriormente bajo
condiciones que permitan la expresión por el vector de una
secuencia codificante que codifica los polipéptidos, y recuperar los
polipéptidos expresados.
Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores
plásmido, virus o fago, provistos de un origen de replicación,
opcionalmente con un promotor para la expresión de dicho
polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor.
Los vectores de la presente invención pueden
contener uno o más genes marcadores seleccionables. Los sistemas de
selección más adecuados para los microorganismos industriales son
los formados por el grupo de marcadores de selección que no
requieren una mutación en el organismo huésped. Entre los ejemplos
de marcadores de selección fúngicos se encuentran los genes de la
acetamidasa (amdS), de la ATP sintetasa, de la subunidad 9 (oliC),
de la
orotidina-5’-fosfato-descarboxilasa
(pvrA) y de la resistencia a la fleomicina y al benomilo (benA).
Son ejemplos de marcadores de selección no fúngicos el gen de la
resistencia bacteriana a G418 (éste también puede utilizarse en
levaduras, pero no en hongos), el gen de la resistencia a la
ampicilina (E. coli), el gen de resistencia a la neomicina
(Bacillus) y el gen uidA de E. coli, que codifica la
E-glucuronidasa (GUS).
Los vectores pueden utilizarse in vitro,
por ejemplo para la producción de ARN, o utilizarse para transfectar
o transformar una célula huésped.
De esta manera, los polinucleótidos de la
presente invención pueden incorporarse en un vector recombinante
(típicamente un vector replicable), por ejemplo un vector de
clonación o de expresión. El vector puede utilizarse para replicar
el ácido nucleico en una célula huésped compatible. De esta manera,
en una forma de realización adicional, la invención proporciona un
procedimiento para la preparación de polinucleótidos de la presente
invención mediante la introducción de un polinucleótido de la
presente invención en un vector replicable, introduciendo el vector
en una célula huésped compatible y cultivando la célula huésped bajo
condiciones que den lugar a la replicación del vector. Éste puede
recuperarse de la célula huésped. Posteriormente se describen las
células huésped adecuadas en conexión a los vectores de
expresión.
El término "tejido" tal como se utiliza en
la presente memoria incluye los tejidos per se y los
órganos.
El término "célula huésped", en relación a
la presente invención incluye cualquier célula que podría comprender
la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína recombinante
de acuerdo con la presente invención y/o los productos obtenidos a
partir de la misma, en el que un promotor puede permitir la
expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente
invención cuando se encuentra presente en la célula huésped.
De esta manera, otra forma de realización de la
presente invención proporciona células huésped transformadas o
transfectadas con un polinucleótido de la presente invención.
Preferentemente, dicho polinucleótido se encuentra dentro de un
vector para la replicación y expresión de dichos polinucleótidos.
Las células se seleccionan para que sean compatibles con dicho
vector y pueden, por ejemplo, ser células procarióticas (por ejemplo
bacterianas), fúngicas, de levadura o vegetales.
La bacteria gram negativa E. coli se
utiliza ampliamente como huésped para la expresión de genes
heterólogos. Sin embargo, dentro de la célula tienden a acumularse
grandes cantidades de proteínas heterólogas. La purificación
posterior de la proteína deseada a partir del conjunto de proteínas
intracelulares de E. coli en ocasiones puede resultar
difícil.
En contraste con E. coli, las bacterias
del género Bacillus resultan muy adecuadas como huéspedes
heterólogos debido a su capacidad para secretar proteínas hacia el
medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como huéspedes son las
de los géneros Streptomyces y Pseudomonas.
Dependiendo de la naturaleza del polinucleótido
que codifica el polipéptido de la presente invención y/o de la
conveniencia del procesamiento posterior de la proteína expresada,
pueden ser preferentes los huéspedes eucarióticos, tales como las
levaduras o hongos. En general, las células de levadura son
preferentes sobre las células fúngicas debido a que resultan más
fáciles de manipular. Sin embargo, las células de levadura secretan
pobremente algunas proteínas, o en algunos casos no las procesan
bien (por ejemplo las levaduras hiperglicosilan las proteínas). En
estos casos, debe seleccionarse un organismo huésped fúngico.
Entre los ejemplos de huéspedes de expresión
preferidos dentro del alcance de la presente invención se encuentran
hongos tales como las especies de Aspergillus (tales como
las indicadas en los documentos EP nº A-0184438 y
nº A-0284603 y las especies de Trichoderma;
bacterias tales como las especies de Bacillus (tales como las
descritas en los documentos EP nº A-0134048 y nº
A-0253455), las especies de Streptomyces y
las especies de Pseudomonas; y levaduras tales como las
especies de Kluyveromyces (tales como las descritas en los
documentos EP-A-0096430 y
EP-A-00301670) y las especies de
Saccharomyces.
Los huéspedes de expresión típicos pueden
seleccionarse de entre Aspergillus niger, Aspergillus
niger var. tubigenis, Aspergillus niger var.
awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus
nidulans, Aspergillus orvzae, Trichoderma reesei,
Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus
amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis y
Saccharomyces cerevisiae.
El término "organismo" en relación a la
presente invención comprende cualquier organismo que podría
comprender la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína
recombinante de acuerdo con la presente invención y/o los productos
obtenidos de la misma, en el que un promotor puede permitir la
expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente
invención cuando se encuentra presente en el organismo. Para el
aspecto del inhibidor de xilanasa de la presente invención, entre
los organismos preferidos se incluyen un hongo, una levadura o una
planta. Para el aspecto xilanasa de la presente invención, un
organismo preferido puede ser una bacteria, preferentemente del
género Bacillus, más preferentemente Bacillus
subtilis.
El término "organismo transgénico" en
relación a la presente invención incluye cualquier organismo que
comprenda la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de
acuerdo con la presente invención y/o los productos obtenidos de la
misma, en el que el promotor puede permitir la expresión de la
secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención
dentro del organismo. Preferentemente la secuencia de nucleótidos se
introduce en el genoma del organismo.
El término "organismo transgénico" no
comprende la secuencia nativa de nucleótidos codificantes de acuerdo
con la presente invención en su ambiente natural cuando se
encuentra bajo el control de su promotor nativo, el cual también se
encuentra presente en su ambiente natural. Además, la presente
invención no comprende la proteína nativa de acuerdo con la
presente invención cuando se encuentra en su ambiente natural y
cuando ha sido expresada por su secuencia nativa de nucleótidos
codificantes, la cual también se encuentra presente en su ambiente
natural y cuando dicha secuencia de nucleótidos se encuentra bajo el
control de su promotor nativo, el cual también se encuentra en su
ambiente natural.
Por lo tanto, el organismo transgénico de la
presente invención incluye un organismo que comprende cualquier
secuencia de nucleótidos, o combinaciones de las mismas, que
codifican la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la presente
invención, los constructos de acuerdo con la presente invención
(incluyendo las combinaciones de los mismos), los vectores de
acuerdo con la presente invención, los plásmidos de acuerdo con la
presente invención, las células de acuerdo con la presente
invención, los tejidos de acuerdo con la presente invención o los
productos de los mismos. La célula u organismo transformado podría
preparar cantidades aceptables del compuesto deseado, que
resultarían fácilmente recuperables de la célula u organismo.
Tal como se ha indicado anteriormente, el
organismo huésped puede ser procariótico o eucariótico. Entre los
ejemplos de huéspedes procarióticos adecuados se incluyen E.
coli y Bacillus subtilis. Las enseñanzas sobre la
transformación de los huéspedes procarióticos se encuentran bien
documentadas en la técnica, por ejemplo ver Sambrook et al.
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989, Cold
Spring Harbor Laboratory Press) y Ausubel et al., Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.,
1995.
Si se utiliza un huésped procariótico, la
secuencia de nucleótidos podría requerir una modificación adecuada
antes de la transformación, tal como mediante la eliminación de los
intrones.
Tal como se ha indicado anteriormente, un
organismo huésped preferente es del género Bacillus, tal como
Bacillus subtilis.
En otra forma de realización, el organismo
transgénico puede ser una levadura. A este respecto, las levaduras
también han sido ampliamente utilizadas como vehículo para la
expresión génica heteróloga. La especie Saccharomyces
cerevisiae presenta una larga historia de usos industriales,
incluyendo su utilización para la expresión génica heteróloga. La
expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae ha
sido revisada por Goodey et al. (Yeast Biotechnology, D.R.
Berry et al., editores, páginas 401-429,
Allen y Unwin, London, 1987) y por King et al. (Molecular
and Cell Biology of Yeasts, E.F. Walton y G.T. Yarronton, editores,
páginas 107-133, Blackie, Glasgow,
1989).
1989).
Por varios motivos, Saccharomyces
cerevisiae resulta un organismo muy adecuado para la expresión
de genes heterólogos. En primer lugar, no es patogénico en el
hombre y es incapaz de producir determinadas endotoxinas. En
segundo lugar, presenta una larga historia de utilización segura,
tras siglos de explotación comercial con diversos fines. Ello ha
conducido a una amplia aceptación pública. En tercer lugar, la
amplia utilización comercial e investigación dedicada a este
organismo ha resultado en que se conoce profundamente la genética y
fisiología, así como las características a gran escala de la
fermentación por parte de Saccharomyces cerevisiae.
E. Hinchcliffe E. Kenny proporciona una revisión
de los principios de expresión génica heteróloga en Saccharomyces
cerevisiae y la secreción de productos génicos ("Yeast as a
vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, vol.
5, Anthony H. Rose y J. Stuart Harrison, editores, 2ª edición,
Academic Press Ltd., 1993).
Se encuentran disponibles varios tipos de
vectores levadura, incluyendo vectores integrativos, que requieren
la recombinación con el genoma del huésped para su mantenimiento, y
los vectores plásmido de replicación autónoma.
Con el fin de preparar Saccharomyces
transgénico, se preparan constructos de expresión mediante la
inserción de la secuencia de nucleótidos de la presente invención
en un constructo diseñado para la expresión en la levadura. Se han
desarrollado varios tipos de constructo que se han utilizado para la
expresión heteróloga. Los constructos contienen un promotor activo
en la levadura que se encuentra fusionado con la secuencia de
nucleótidos de la presente invención, habitualmente se utiliza un
promotor de origen en una levadura, tal como el promotor GAL1.
Habitualmente se utiliza una secuencia de señal de origen en una
levadura, tal como la secuencia que codifica el péptido de señal
SUC2. Un terminador activo en la levadura termina el sistema de
expresión.
Para la transformación de la levadura, se han
desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo,
puede prepararse un Saccharomyces transgénico de acuerdo con
la presente invención siguiendo las enseñanzas de Hinnen et
al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA
75:1929, 1978); Beggs, J.D. (Nature, London, 275:104, 1978) e Ito,
H. et al. (J. Bacteriology 153:163-168,
1983).
Las células transformadas de levadura se
seleccionan utilizando diversos marcadores selectivos. Entre los
marcadores utilizados para la transformación se encuentran varios
marcadores auxotróficos, tales como LEU2, HIS4 y TRP1, y marcadores
dominantes de resistencia a antibióticos, tales como los marcadores
de antibiótico aminoglucósido, por ejemplo G418.
Otros organismos huésped son las plantas. El
principio básico de la construcción de plantas modificadas
genéticamente es la inserción de información genética en el genoma
de la planta de manera que se mantenga establemente el material
genético insertado.
Existen varias técnicas para insertar información
genética, siendo los dos principios principales la introducción
directa de la información genética y la introducción de la
información genética mediante la utilización de un sistema vector.
Puede encontrarse una revisión de las técnicas generales en los
artículos por Potrykus (Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol.
Biol. 42:205-225, 1991) y Christou
(AgroFood-Industry Hi-Tech
marzo/abril 17-27, 1994).
De esta manera, un aspecto de la presente
invención se refiere a un sistema vector que porta una secuencia de
nucleótidos o constructo de acuerdo con la presente invención y que
es capaz de introducir la secuencia de nucleótidos o constructo en
el genoma de un organismo, tal como una planta.
El sistema vector puede comprender un vector,
aunque puede comprender dos vectores. En el caso de dos vectores,
el sistema vector normalmente se denomina sistema vector binario.
Los sistemas vector binarios se describen con mayor detalle en
Gynheung An et al., Binary Vectora, Plant Molecular Biology
Manual A3, 1-19, 1980.
Un sistema utilizado ampliamente para la
transformación de las células vegetales con una secuencia dada de
nucleótidos se basa en la utilización de un plásmido Ti procedente
de Agrobacterium tumefaciens o de un plásmido Ri procedente
de Agrobacterium rhizogenes, An et al., Plant Physiol.
81:301-305, 1986 y Butcher, D.N. et al.,
Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, editores: D.S.
Ingrams y J.P. Helgeson, 203-208, 1980.
Se han construido varios plásmido Ti y Ri
diferentes que resultan adecuados para la construcción de los
constructos de planta o célula vegetal descritos anteriormente. Un
ejemplo no limitativo de dicho plásmido Ti es pGV3850.
La secuencia de nucleótidos o constructo de la
presente invención debe insertarse preferentemente en un plásmido
Ti entre las secuencias terminales del T-ADN o
contigua a la secuencia de T-ADN, de manera que se
evita alterar las secuencias inmediatamente circundantes a los
límites del T-ADN, ya que por lo menos una de estas
regiones aparentemente resulta esencial para la inserción del
T-ADN modificado en el genoma de la planta.
Como se entenderá a partir de la explicación
anterior, si el organismo es una planta, el sistema vector de la
presente invención contendrá preferentemente las secuencias
necesarias para infectar la planta (por ejemplo la región vir) y
por lo menos una parte de límite de secuencia de
T-ADN, estando situado la parte de límite en el
mismo vector del constructo genético. Preferentemente, el sistema
vector es un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens o un
plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes o un derivado de los
mismos, debido a que estos plásmidos son bien conocidos y son
ampliamente utilizados para la construcción de plantas transgénicas,
y existen muchos sistemas de vector basados en estos plásmidos o
derivados de los mismos.
En la construcción de una planta transgénica, la
secuencia de nucleótidos o constructo de la presente invención
puede construirse en primer lugar en un microorganismo en el que el
vector pueda replicarse y que sea fácil de manipular antes de la
inserción en la planta. Un ejemplo de un microorganismo útil es
E. coli, aunque pueden utilizarse otros microorganismos con
las propiedades anteriormente indicadas. Cuando se ha construido en
E. coli un vector de un sistema de vector tal como se ha
indicado anteriormente, se transfiere, si resulta necesario, a una
cepa adecuada de Agrobacterium, por ejemplo a
Agrobacterium tumefaciens. El plásmido Ti que porta la
secuencia de nucleótidos o constructo de la presente invención, de
esta manera, se transfiere preferentemente a una cepa adecuada de
Agrobacterium, por ejemplo a Agrobacterium
tumefaciens, de manera que se obtenga una célula de
Agrobacterium que porte la secuencia de nucleótidos o el
constructo de la presente invención, cuyo ADN se transfiere a
continuación a la célula vegetal a modificar.
De esta manera, puede introducirse el nucleótido
o constructo de la presente invención en una posición de
restricción adecuada dentro del vector. El plásmido contenido se
utiliza para la transformación de E. coli. Las células de
E. coli se cultivan en un medio nutritivo adecuado y
posteriormente se recolectan y se lisan. Se recupera a continuación
el plásmido. Como procedimiento de análisis generalmente se utiliza
el análisis de secuencias, el análisis de restricción, la
electroforesis y los procedimientos biológicos
bioquímicos-moleculares adicionales. Tras cada
manipulación, la secuencia de ADN utilizada puede cortarse y
conectarse con la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia puede
clonarse en el mismo plásmido o en uno diferente.
Tras cada procedimiento de introducción de la
secuencia deseada de nucleótidos de acuerdo con la presente
invención en las plantas, puede resultar necesaria la presencia y/o
la inserción de secuencias de ADN adicionales. Por ejemplo, si se
utiliza el plásmido Ti o Ri para la transformación de las células
vegetales, por lo menos resulta posible conectar el límite derecho
y con frecuencia, no obstante, los límites derecho e izquierdo del
ADN-T del plásmido Ti y Ri, como áreas flanqueantes
de los genes introducidos. La utilización del T-ADN
para la transformación de las células vegetales ha sido estudiada
intensivamente y se describe en la patente EP nº
A-120516; Hoekema, en: The Binary Plant Vector
System Offset-drukkerij Kanters B.B., Alblasserdam,
1985, capítulo V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci.
4:1-46, y An et al., EMBO J.
4:277-284, 1985.
La infección directa de los tejidos vegetales por
Agrobacterium es una técnica sencilla que ha sido utilizada
ampliamente y que se describe en Butcher, D.N. et al., Tissue
Culture Methods for Plant Pathologists, editores: D.S. Ingrams y
J.P. Helgeson, páginas 203-208, 1980. Para
enseñanzas adicionales sobre este tema, ver Potrykus (Annu. Rev.
Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:205-225, 1991) y
Christou (Agro-Food-Industry
Hi-Tech marzo/abril de 1994, páginas
17-27). Con esta técnica, puede llevarse a cabo la
infección de una planta en una parte o tejido determinados de la
planta, es decir, en una parte de una hoja, de una raíz, de un tallo
o en otra parte de la planta.
\newpage
Típicamente, con la infección directa de los
tejidos vegetales por Agrobacterium que porta la secuencia de
nucleótidos, se lesiona una planta que se va a infectar, por
ejemplo cortando la planta con una cuchilla o perforando la planta
con una aguja o frotando la planta con un abrasivo. A continuación,
la lesión se inocula a continuación con el Agrobacterium. La
planta o parte de planta inoculada se cultiva a continuación en un
medio de cultivo adecuado y se permite que se desarrolle para formar
una planta madura.
Cuando se construyen células vegetales, las
células pueden cultivarse y mantenerse de acuerdo con procedimientos
de cultivo de tejido bien conocidos, tales como el cultivo de
células en un medio de cultivo adecuado provisto de los factores de
crecimiento necesarios, tales como aminoácidos, fitohormonas,
vitaminas, etc. La regeneración de las células transformadas en
plantas genéticamente modificadas puede conseguirse utilizando
procedimientos conocidos para la regeneración de plantas a partir
de tejidos celulares o de tejidos, por ejemplo mediante la
selección de brotes transformados utilizando un antibiótico y
mediante el subcultivo de los brotes en un medio que contenga los
nutrientes, fitohormonas, etc. apropiados.
En el documento EP nº A-0449375
se proporcionan enseñanzas adicionales sobre la transformación de
plantas.
De acuerdo con la presente invención, la
producción del polipéptido de la presente invención puede llevarse
a cabo cultivando, por ejemplo, huéspedes microbianos de expresión
que han sido transformado con uno o más polinucleótidos de la
presente invención en un medio nutritivo de fermentación
convencional. La selección del medio apropiado puede basarse en la
selección de huéspedes de expresión y/o basarse en los requisitos
regulatorios del constructo de expresión. Estos medios son bien
conocidos por el experto en la materia. El medio puede, si se
desea, contener componentes adicionales que favorezcan los huéspedes
de expresión transformados sobre otros microorganismos
potencialmente contaminantes.
La secuencia de aminoácidos de la presente
invención también puede utilizarse para producir anticuerpos (tal
como mediante la utilización de técnicas convencionales) contra la
secuencia de aminoácidos. Para la producción de anticuerpos, pueden
inmunizarse diversos huéspedes, entre ellos cabras, conejos, ratas,
ratones, etc., mediante inyección del inhibidor o cualquier parte,
variante, homólogo, fragmento o derivado del mismo u oligopéptido
que conserve propiedades inmunogénicas. Dependiendo de la especie de
huésped, pueden utilizarse diversos adyuvantes para incrementar la
respuesta inmunológica. Entre dichos adyuvantes se incluyen, pero
sin limitarse a ellos, adyuvante de Freund, geles minerales, tales
como hidróxido de aluminio y sustancias tensioactivas, tales como
la lisolecitina, los polioles plurónicos, los polianiones, los
péptidos, las emulsiones aceitosas, la hemocianina de lapa y el
dinitrofenol. El BCG (Bacilli Calmette-Guerin) y
Corynebacterium parvum son adyuvantes humanos potencialmente
útiles que pueden utilizarse.
Incluso pueden prepararse anticuerpos
monoclonales contra la secuencia de aminoácidos utilizando cualquier
técnica que permita la producción de moléculas de anticuerpo
mediante el cultivo de líneas celulares continuas. Entre éstas se
encuentran, aunque sin limitarse a ellas, la técnica del hibridoma,
originalmente descrita por Koehler y Milstein (Nature
256:495-497, 1975), la técnica del hibridoma de
células B humanas (Kosbor et al., Immunol. Today 4:72, 1983;
Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
80:2026-2030, 1983) y la técnica del
hibridoma-EBV (Cole et al., Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., páginas
77-96, 1985). Además, pueden utilizarse las
técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos
quiméricos", el corte y empalme de los genes de anticuerpos de
ratón con genes de anticuerpos humanos para obtener una molécula con
la especificidad de antígeno y actividad biológica apropiadas
(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
81:6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature
312:604-608, 1984; Takeda et al., Nature
314:452-454, 1985). Alternativamente, pueden
adaptarse las técnicas descritas para la producción de anticuerpos
de una sola cadena (documento
US-A-4946779) para producir
anticuerpos de una cadena específicos de inhibidor.
También pueden producirse anticuerpos mediante la
inducción de la producción in vivo en la población de
linfocitos o mediante el cribado de las bibliotecas de
inmunoglobulinas recombinantes o de paneles de reactivos de unión
altamente específicos, tal como dan a conocer Orlandi et al.
(Proc. Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837, 1989, y
Winter, G. y Milstein, C., Nature 349:293-299,
1991).
Protocolo
1
Las muestras de xilanasa se diluyeron en ácido
cítrico (0,1 M)-tampón dihidrógeno fosfato sódico
(0,2 M), pH 5,0, con el fin de obtener una DO = 0,7 aproximadamente
en el ensayo final. Se termostatizaron durante 5 minutos a 40ºC
tres diluciones de la muestra y un estándar interno con una
actividad definida. Hasta el tiempo = 5 minutos, se añadió un tab
de xilazima (entrecruzada, sustrato pigmentado de xilán) a la
solución de enzima. Hasta el tiempo = 15 minutos la reacción se
completó añadiendo 10 ml de TRIS al 2%. La mezcla de reacción se
centrifugó y se midió la DO del sobrenadante a 590 nm. Teniendo en
cuenta la dilución y la cantidad de xilanasa, la actividad (UTX,
unidades totales de xilanasa) de la muestra puede calcularse
respecto al estándar.
Protocolo
2
Se midió la pegajosidad de la masa en un sistema
TA-XT2 (Stable Micro Systems) utilizando una celda
SMS de pegajosidad de masa. El protocolo era una versión modificada
del procedimiento descrito por Chen y Hoseney (1995). Se preparó
una masa a partir de harina, NaCl al 2% y agua hasta alcanzar las
400 unidades Brabender (UB) medidas utilizando un farinógrafo
(procedimiento AACC 54-21). La harina y el NaCl se
mezclaron en seco durante 1 minuto. Se añadió agua y la masa se
mezcló durante 5 minutos más. La masa obtenida podía dejarse
reposar ventajosamente durante 10, 30 ó 45 minutos en recipientes
sellados a 30ºC.
Se introdujeron aproximadamente 4 gramos de masa
en la celda de pegajosidad de masa. Se extruyeron 4 mm de masa,
obteniendo una extrusión uniforme. A continuación, se llevaron a
cabo 5 mediciones de acuerdo con el protocolo de Stable Micro
Systems (estudio de aplicación TA-XT2 para la
medición de la pegajosidad de la masa). En resumen, se extruyó 1 mm
de masa. La sonda (una sonda cilíndrica de pérspex de 25 mm) se
conectó al sistema TA-XT2, se introdujo presionando
en la masa extruida a una fuerza prefijada. La sonda se levantó y se
registró la adhesión que se producía entre la masa y la sonda. Se
utilizaron los siguientes parámetros en el sistema
TA-XT2:
| Opción: | Prueba de adhesión |
| Velocidad previa al ensayo: | 2,0 mm/s |
| Velocidad durante el ensayo: | 2,0 mm/s |
| Velocidad posterior al ensayo: | 10,0 mm/s |
| Distancia: | 15 mm |
| Fuerza: | 40 g |
| Tiempo: | 0,1 s |
| Tipo de activador: | auto - 5 g |
| Tasa de adquisición de datos: | 400 pps |
Los resultados registrados en la prueba fueron:
fuerza máxima, es decir la fuerza necesaria para levantar la sonda
fuera de la masa extruida. La distancia, es decir la distancia
durante la que la masa se pega a la sonda. El área, es decir el
área bajo la curva obtenida. La pegajosidad de la masa depende de la
calidad de la harina utilizada y de la receta. Por lo tanto, una
masa no pegajosa es una masa que difiere en pegajosidad entre el
100% y el 200% (valores relativos) en comparación con una masa de
referencia, sin la xilanasa o presentando preferentemente menos del
70% (valor relativo) de la pegajosidad obtenida con una xilanasa
fúngica comercial (es decir, Pentopan mono BG, Novo Nordisk) cuando
se dosifica a niveles que proporcionan el mismo incremento de
volumen en un ensayo de horneo.
Protocolo
3
Con el fin de detectar el inhibidor durante el
aislamiento y la caracterización se utilizó el ensayo siguiente. Se
mezclaron 100 \mul de fracción de inhibidor, 250 \mul de
solución de xilanasa (que contenía 12 TXU/ml) y 650 \mul de
tampón (ácido cítrico 0,1 M-tampón dihidrógeno
fosfato sódico 0,2 M, pH 5,0). La mezcla se termostatizó durante 5
minutos a 40,0ºC. En el tiempo = 5 minutos se añadió un tab de
xilazima. En el tiempo = 15 minutos se terminó la reacción
añadiendo 10 ml de TRIS al 2%. La mezcla de reacción se centrifugó
(3.500 g, 10 minutos, temperatura ambiente) y se midió la DO del
sobrenadante a 590 nm. La inhibición se calculó como actividad
residual en comparación con el blanco. El blanco se preparó de la
misma manera, excepto en que se sustituyeron los 100 \mul de
inhibidor por 100 \mul de tampón (ácido cítrico 0,1
M-tampón dihidrógeno fosfato sódico 0,1 M, pH 5,0).
A título de ejemplo, XM-1 puede considerarse que
presenta un elevado grado de resistencia al inhibidor (ver la
figura 20). XM-2 y XM-3 puede
considerarse que presentan un grado intermedio de resistencia al
inhibidor (ver la figura 20).
\newpage
Protocolo
4
Se diluyeron muestras de glucanasa en acetato
sódico 0,1 M-tampón de ácido cítrico, pH 5,0, con el
fin de obtener una DO = 0,7 aproximadamente en el ensayo final. Se
termostatizaron tres diluciones de la muestra y un estándar interno
con una actividad definida durante 5 minutos a 40ºC. Hasta el tiempo
= 5 minutos, se añadió 1 tab de glucazima (entrecruzada, sustrato
glucán pigmentado) a la solución de enzima. Hasta el tiempo = 15
minutos se terminó la reacción añadiendo 10 ml de TRIS al 2%. La
mezcla de reacción se centrifugó y se midió la DO del sobrenadante
a 590 nm. Teniendo en cuenta las diluciones y la cantidad de
glucanasa, puede calcularse la actividad (BGU, unidades de
beta-glucanasa) de la muestra respecto al
estándar.
Protocolo
5
Con el fin de estudiar la cinética del inhibidor
se utilizó un sustrato soluble (Azoxilán, Megazyme). Se preparó una
solución al 2% (p/v) del sustrato, de acuerdo con el protocolo del
fabricante, en NaPi 20 mM, pH 6,0. El ensayo se llevó a cabo
precalentando el sustrato, xilanasa e inhibidor a 40ºC durante 5
minutos.
Para una caracterización preliminar del
inhibidor, se diluyó la xilanasa utilizada hasta 40 TXU/ml. Para las
determinaciones de K_{l}, las xilanasas se diluyeron hasta
aproximadamente 40 TXU/ml.
Se mezclaron 0,5 ml de sustrato, 0,1 ml de
xilanasa y 0,1 ml de inhibidor en el tiempo = 0 minutos, 40ºC. En
el tiempo = 125 minutos, la reacción se terminó añadiendo 2 ml de
etanol (al 95%), seguido de centrifugación con vórtex durante 10
segundos. Se retiró el sustrato no hidrolizado que había precipitado
mediante centrifugación (3.500 x g, 10 minutos, temperatura
ambiente). Se midió la DO en el sobrenadante frente al agua a 590
nm.
Se preparó un blanco de la misma manera. La única
modificación era la sustitución del inhibidor con NaPi 20 mM, pH
6,0.
Para los experimentos de cinética con una
concentración reducida de sustrato, se prepararon las siguientes
concentraciones de sustrato mediante dilución en NaPi 20 mM, pH 6,0:
al 2%, al 1%, al 0,5% y al 0,25% de azoxilán soluble (p/v).
Para las determinaciones de K_{l}, se
utilizaron las xilanasas y concentraciones de sustrato anteriormente
indicadas. Éstas se combinaron con las siguientes concentraciones
de extracto de inhibidor en el ensayo: 0, 2, 5, 10, 25, 50 y 100
\mul en el ensayo. Utilizando \mul de inhibidor y no una
concentración molar del inhibidor, K_{l} se expresa como \mul
de inhibidor.
En resumen, la presente invención proporciona,
inter alia:
- a.
- El aislamiento de un inhibidor endógeno de endo-\beta-1,4-xilanasa procedente de harina de trigo.
- b.
- La caracterización de un inhibidor endógeno de endo-\beta-1,4-xilanasa aislado a partir de harina de trigo.
- c.
- La caracterización del efecto del inhibidor endógeno de endo-\beta-1,4-xilanasa sobre diferentes xilanasas.
- d.
- Un medio para seleccionar xilanasas no afectadas negativamente por el inhibidor endógeno de endo-\beta-1,4-xilanasa.
- e.
- Un medio para seleccionar las xilanasas que no resultan afectadas negativamente por los inhibidores de endo-\beta-1,4-xilanasa.
- f.
- Xilanasas que proporcionan a la masa un volumen favorable y una pegajosidad aceptable en comparación con las masas que comprenden xilanasas fúngicas.
- g.
- Un procedimiento para cribar xilanasas y/o mutar las mismas utilizando un inhibidor endógeno endo-\beta-1,4-xilanasa y la utilización de dichas xilanasas o mutantes de las mismas en la preparación de las masas.
- h.
- Un producto alimenticio preparado con las xilanasas de la presente invención.
Las muestras siguientes se depositaron de acuerdo
con el Tratado de Budapest en el depósito reconocido The National
Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) en 23,
St. Machar Drive, Aberdeen, Escocia, Reino Unido, AB2 1RY, el 22 de
diciembre de 1998:
| Xilanasa DH5\alpha::pCR2.1_BS | número del NCIMB: NCIMB 40999 |
| BL21(DE3)::pET24A_XM1 | número del NCIMB: NCIMB 41000 |
| BL21(DE3)::pEET24A_XM3 | número del NCIMB: NCIMB 41001 |
| La xilanasa DH5\Delta::pCR2.1_BS | comprende la xilanasa de tipo salvaje. |
| BL21(DE3)::pET24A_XM1 | comprende la xilanasa XM1. |
| BL21(DE3)::pEET24A_XM3 | comprende la xilanasa XM3. |
La presente invención comprende asimismo las
secuencias derivables y/o expresables a partir de dichos depósitos
y formas de realización que comprenden los mismos.
A continuación se describe la presente invención,
únicamente a título de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos
adjuntos, en los que:
La figura 1 muestra un gráfico.
La figura 2 muestra un gráfico.
La figura 3 muestra un gráfico.
La figura 4 muestra un gráfico.
La figura 5 muestra un gráfico.
La figura 6 muestra un gráfico.
La figura 7 muestra un gráfico.
La figura 8 muestra un gráfico.
La figura 9 muestra un gráfico.
La figura 10 muestra un gráfico.
La figura 11 muestra un resultado gráfico de un
experimento de SDS PAGE.
La figura 12 muestra un gráfico.
La figura 13 muestra un gráfico.
La figura 14 muestra un gráfico.
La figura 15 muestra un gráfico.
La figura 16 muestra un gráfico.
La figura 17 muestra un resultado gráfico de un
experimento de ISE.
La figura 18 muestra un gráfico.
La figura 19 muestra un gráfico.
La figura 20 muestra un gráfico.
La figura 21 muestra un gráfico.
La figura 22 muestra un gráfico.
La figura 23 muestra un gráfico.
La figura 24 muestra un gráfico.
La figura 25 muestra un gráfico.
La figura 26 muestra un gráfico.
La figura 27 muestra un gráfico.
La figura 28 muestra un gráfico.
La figura 29 muestra un gráfico.
La figura 30 muestra un gráfico, y
la figura 31 muestra un gráfico.
Con mayor detalle:
Figura 1 - Pegajosidad en función de las
xilanasas, dosis y tiempo de reposo.
Figura 2 - Pegajosidad en función de las
xilanasas, dosis y tiempo de reposo.
Figura 3 - Cromatografía de filtración en gel de
una muestra de 75 ml de extracto de inhibidor. Columna: Superdex
G-25 F de 500 ml, caudal: 10 ml/minuto, tamaño de
fracción: 30 ml.
Figura 4 - Cromatografía de intercambio catiónico
de una muestra de 240 ml de extracto de inhibidor filtrado a través
de de gel. Columna: sefarosa SP de 50 ml, caudal: 5,0 ml/min, tamaño
de fracción: 10 ml.
Figura 5 - Cromatografía de interacción
hidrofóbica (CIH) de una muestra de 147 ml de extracto
de inhibidor intercambiado iónicamente y a la que se ha añadido
(NH_{4})_{2}SO_{4} hasta una concentración de 1,0 M.
Columna: de fenil CIH de 10 ml, caudal: 2,0 ml/min, tamaño de
fracción: 2,5 ml.
Figura 6 - Cromatografía preparativa de
filtración en gel de 2 ml de muestra concentrada de inhibidor.
Inhibidor eluido a los 176 ml. Columna: Superdex 75 PG (Pharmacia)
de 330 ml. Eluyente: NaOAc 50 mM, NaCl 200 mM, pH 5,0. Caudal: 1
ml/minuto. Tamaño de fracción: 5,5 ml.
Figura 7 - Cromatograma de intercambio catiónico
de xilanasa pura + extracto de inhibidor sometido a ebullición.
Muestra: 1 ml de 980601 desalado + extracto de inhibidor sometido a
ebullición. Columna: Source S 15 de 1 ml. Sistema tampón: A: NaOAc
50 mM, pH 4,5, B: A + NaCl 1 M. Caudal: 2 ml/minuto.
Figura 8 - Cromatograma de intercambio catiónico
de xilanasa pura tras tres horas de incubación con extracto de
inhibidor. Muestra: 1 ml de 980601 desalado + inhibidor. Columna:
Source S 15 de 1 ml. Sistema tampón: A: NaOAc 50 mM, pH 4,5, B: A +
NaCl 1 M. Caudal: 2 ml/minuto.
Figura 9 - Cromatografía analítica de filtración
en gel de 100 \mul de muestra concentrada de inhibidor. El
inhibidor se eluyó a los 10,81 ml. Columna: Superdex 75 10/30
(Pharmacia, Suecia) de 24 ml. Eluyente: NaOAc 50 mM, NaCl 100 mM,
pH 5,0, caudal: 0,5 ml/minuto. Tamaño de fracción: 2,0 ml.
Figura 10 - Log(PM) como función de Kav
para proteínas estándar corridas en una columna Superdex 75
10/30.
Figura 11 - SDS PAGE de las fracciones 31, 32 y
33 procedentes de la filtración en gel preparativa. Los carriles 1
y 3 son marcadores de PM (marcadores de BPM de Pharmacia, Suecia).
Los carriles 2 y 4 contienen fracción 32, cargadas con 10 y 25
\mul, respectivamente. Los carriles 6 y 8 contenían fracción 31,
cargados con 10 y 25 \mul. Los carriles 7 y 9 contenían fracción
33, cargados con 10 y 25 \mul.
Figura 12 - Cromatograma de fase inversa de la
fracción 33 procedente de la cromatografía de filtración en gel. El
cromatograma reveló cuatro picos diferenciados. El pico 3 era el
inhibidor de xilanasa. Se secuenciaron los picos 4, 5 y 6, los
cuales mostraban una homología muy elevada con la proteína del trigo
denominada serpina.
Figura 13 - Espectrometría de masas (EM) de la
fracción 3 procedente de la cromatografía en fase inversa. Los
espectros mostraban una molécula que presentaba un peso molecular de
39.503 Da.
Figura 14 - Cromatografía en fase inversa de la
fracción 3 carboximetilada procedente del cromatograma en fase
reversa de la fracción 33 (ver la figura 12). El cromatograma
revelaba dos picos diferenciados (fracciones 2 y 3), indicando la
presencia de un dipéptido.
Figura 15 - EM de la fracción 2 de la
cromatografía en fase inversa carboximetilada (ver la figura 14).
Los espectros indicaban la presencia de un péptido con un peso
molecular de 12.104 Da.
Figura 16 - EM de la fracción 3 procedente de la
cromatografía en fase reversa carboximetilada (ver la figura 14).
Los espectros indicaban la presencia de un péptido con un peso
molecular de 28.222 Da.
Figura 17 - Isoelectroenfoque (ISE) de las
fracciones 33 y 34 procedentes de la cromatografía preparativa de
filtración en gel. El carril 2 presentaba 3 a 10 estándares de punto
isoeléctrico (pI), el carril 3 presentaba 2,5 a 6,5 estándares de
pI, los carriles 4 y 5 contenían las fracciones 33 y 34,
respectivamente; el carril 6 contenía inhibidor de tripsina (pI
4,55), la pista 7 contenía E-lactoglobulina (pI
5,20) y los carriles 8 y 9 contenían las fracciones 33 y 34,
respectivamente. Las flechas indican bandas diferentes dentro de la
fracción 33.
Figura 18 - pH y DO relativa (del ensayo de
inhibidor) en función de las fracciones procedentes de la
cromatografía de cromatoisoenfoque del inhibidor de xilanasa. Tal
como puede observarse en la figura, la DO relativa disminuye en la
fracción 7, indicando actividad inhibitoria. Ello corresponde a pH
9,4.
Figura 19 - Actividad residual, % de las cuatro
xilanasas como función de la concentración de inhibidor. Las cuatro
xilanasas utilizadas eran
- -\blacklozenge-X1,
-\sqbullet-X3, -x-BX,
-\blacktriangle-Novo.
Figura 20 - Actividad residual de 980601
(coli-1), de 980603 (Belase) y de tres mutantes de
980601 (XM1, XM2 y XM3) tras la incubación con un extracto de
harina.
Figura 21 - Gráfico de
Line-Weaver-Burk de la xilanasa
(980601) +/- inhibidor. La concentración de sustrato se expresa
como % de azoxilán. V es la DO 590 relativa del ensayo (en el que
100 es S = 2%).
Figura 22 - K_{l} para diferentes xilanasas
expresado en microlitros de inhibidor.
Figura 23 - Inhibición de tres xilanasas (980601
= Bac. sub. wt, 980801 = X1, y 980901 = Thermomyces)
en función del pH. Los datos se obtuvieron restando los blancos
relevantes.
Figura 24 - pH óptimo para tres xilanasas (980601
= BX, 980801 = X1 y 980901 = Novo).
Figura 25 - Vol. espec. = f(xilanasa x
dosis).
Figura 26 - Incremento de vol. espec. =
f(xilanasa x dosis).
Figura 27 - Pegajosidad = f(xilanasa x
dosis).
Figura 28 - Pegajosidad como función de
diferentes preparaciones de xilanasa y del control, medido tras 10
(_10) y 45 (_45) minutos de reposo. 980603 es xilanasa purificada de
Röhm, XM1 es xilanasa mutante 1 y #2199 es el producto Veron
Special de Röhm.
Figura 29 - Incremento de pegajosidad como
función de tres preparaciones de xilanasa, tras 10 (_10) y 45 (_45)
minutos de reposo. 980603 es xilanasa purificada de Röhm, XM1 es
xilanasa mutante 1 y #2199 es producto Veron Special de Röhm.
Figura 30 - Incremento de pegajosidad como
función de dos preparaciones de xilanasa, tras 10 (_10) y 45 (_45)
minutos de reposo. XM1 es xilanasa mutante 1 y #2199 es producto
Veron Special de Röhm.
Figura 31 - Incremento de pegajosidad como
función de la
endo-\beta-1,4-glucanasa
añadida. 1: masa de control sin xilanasa, 2: 7.500 TX de xilanasa
pura de Röhm/kg de harina, 3: 7.500 TXU de xilanasa pura de Röhm/kg
de harina + 158 BGU/kg de harina, 4: 15.000 TXU de xilanasa pura de
Röhm/kg de harina, 5: 15.000 TXU de xilanasa pura de Röhm/kg de
harina + 316 BGU/kg de harina. Se midió la pegajosidad de la masa
tras 10 minutos (Stik_10) y tras 45 minutos (Stik_45).
Se sometió a ensayo la capacidad de las
siguientes xilanasas de proporcionar pegajosidad a la masa.
(ver también Chen, W.Z. y Hoseney, R.C.,
Development of an objective method for dough stickiness.
Lebensmittel Wiss u.-Technol. 28:467-473,
1995).
"X1" corresponde a una muestra purificada de
endo-\beta-1,4-xilanasa
procedente de Aspergillus niger. Esta xilanasa presenta una
actividad de 8.400 TXU (15.000 TXU/mg).
"Novo" corresponde a Novo Pentopan Mono BG
de Nordisk procedente de Thermomyces. Esta xilanasa presenta
una actividad de 350.000 TXU (56.000 TXU/mg).
"BX" corresponde a una muestra purificada de
la nueva xilanasa bacteriana. Esta muestra presenta una actividad
de 2.000 TXU (25.000 TXU/mg).
"Röhm" corresponde a la xilanasa bacteriana
de Röhm GmbH denominada Veron Special. Esta muestra presenta una
actividad de 10.500 TXU (25.000 TXU/mg).
Los ensayos de xilanasa se llevaron a cabo de
acuerdo con el Protocolo 1.
En este ensayo se utilizaron dos tipos de harina:
harina danesa, lote nº 98022 y harina alemana, lote nº 98048. Las
absorciones de agua, a 400 BU, de los dos tipos de harina eran del
58% y del 60%, respectivamente.
Se prepararon masas tal como se describe en el
Protocolo 2. Tras la mezcla, la masa se dejó reposar durante 10 y
45 minutos respectivamente a 30ºC en recipientes sellados.
Las mediciones de pegajosidad se llevaron a cabo
de acuerdo con el Protocolo 2.
Se prepararon las masas siguientes y se midió su
pegajosidad tras 10 y 45 minutos en harina 98048.
| Enzima | TXU/kg |
| Blanco | 0 |
| X1 (980801) | 1.500 |
| 10.000 | |
| Novo (#2165) | 5.000 |
| 60.000 | |
| BX (980802) | 1.500 |
| 15.000 |
La masa en la Tabla 1 proporcionó los resultados
de pegajosidad de la masa presentados en la Tabla 2 y en la figura
1.
| Masa | Pegajosidad (g x s) | Desv. Est. | Desv. est. (%) |
| Control, 10 min | 5,533 | 0,16 | 2,89 |
| Control, 45 min | 8,103 | 0,277 | 3,42 |
| 1.500 X1, 10 min | 7,275 | 0,204 | 2,80 |
| 1.500 X1, 45 min | 8,675 | 0,134 | 1,54 |
| 10.000 X1, 10 min | 9,295 | 0,802 | 8,63 |
| 10.000 X1, 45 min | 13,339 | 1,264 | 9,48 |
| 5.000 Novo, 10 min | 6,757 | 0,218 | 3,23 |
| 5.000 Novo, 45 min | 7,23 | 0,337 | 4,66 |
| 60.000 Novo, 10 min | 10,972 | 0,519 | 4,73 |
| 60.000 Novo, 45 min | 16,559 | 1,626 | 9,82 |
| 1.500 BX, 45 min | 4,372 | 0,358 | 8,19 |
| 15.000 BX, 10 min | 6,567 | 0,639 | 9,73 |
| 15.000 BX, 45 min | 5,545 | 0,518 | 9,34 |
Los datos en la Tabla 2 se ilustran en la figura
1.
Tal como puede observarse en la Tabla 2 y en la
figura 1, la xilanasa fúngica X1 y la xilanasa en el producto Novo
dan lugar a pegajosidad de la masa. La nueva xilanasa bacteriana no
da lugar a la misma pegajosidad. Además, la pegajosidad
aparentemente disminuye en comparación con el control.
Con el fin de someter a ensayo la nueva xilanasa
bacteriana en comparación con la xilanasa bacteriana en el producto
de Röhm, Veron Special, se preparó la siguiente masa (ver la Tabla
3) utilizando la harina 98022.
| Enzima | TXU/kg |
| Blanco | 0 |
| BX | 5.000 |
| 15.000 | |
| Röhm | 5.000 |
| 15.000 |
Las masas en la Tabla 3 proporcionaron los
resultados de pegajosidad de masa presentados en la Tabla 4 y en la
figura 2.
| Masa | Pegajosidad (g x s) | Desv. Est. | Desv. est. (%) |
| Control, 10 min | 5,269 | 0,16 | 3,04 |
| Control, 45 min | 5,484 | 0,277 | 5,05 |
| 5.000 BX, 10 min | 4,443 | 0,204 | 4,59 |
| 5.000 BX, 45 min | 4,474 | 0,134 | 3,00 |
| 15.000 BX, 10 min | 4,791 | 0,352 | 7,35 |
| 15.000 BX, 45 min | 6,288 | 0,599 | 9,53 |
| 5.000 Röhm, 10 min | 5,077 | 0,218 | 4,29 |
| 5.000 Röhm, 45 min | 6,757 | 0,337 | 4,99 |
| 15.000 Röhm, 10 min | 7,749 | 0,519 | 6,70 |
| 15.000 Röhm, 45 min | 10,98 | 0,907 | 8,26 |
Los datos en la Tabla 4 se ilustran en la figura
2.
Los resultados muestran que BX (la nueva xilanasa
bacteriana) da lugar a una pegajosidad mucho menor que la xilanasa
fúngica que se ha sometido a ensayo. Además, se ha descubierto que
la nueva xilanasa da lugar a una pegajosidad de la masa mucho menor
que la de la xilanasa bacteriana de Röhm.
Se utilizaron tres tipos diferentes de harina en
estos experimentos (lotes nº 98002, nº 98026 y nº 98058). Los lotes
de harina nº 98002 y nº 98058 eran de harina danesa. El lote de
harina nº 98026 era harina alemana.
El inhibidor se extrajo de la harina utilizando
agua destilada helada y agitación. Se añadió un equivalente de
harina por dos equivalentes de agua destilada helada. Se añadió una
barra magnética a la mezcla en el interior de un baño de hielo y se
agitó durante 20 minutos. Tras la agitación, la suspensión de harina
se vertió en viales de centrifugado y se centrifugó (10.000 g, 4ºC
y 10 minutos). El sobrenadante contenía el inhibidor de
xilanasa.
Los ensayos de inhibidor se llevaron a cabo de
acuerdo con el Protocolo 3.
Tras la extracción de una muestra de 100 g de
harina (98026), se purificó el inhibidor de xilanasa mediante las
técnicas cromatográficas siguientes:
Se aplicaron 75 ml de extracto a una columna
Superdex G-25 F (Pharmacia, Suecia) de 500 ml a un
caudal de 10 ml/minuto, se calibró con NaOAc 20 mM, pH 4,25. El
eluyente se recogió en fracciones de 30 ml con el mismo caudal.
Todas las fracciones se cribaron para identificar la presencia de
inhibidor.
El pico de inhibidor recogido de la filtración en
gel (240 ml) se aplicó a una columna de sefarosa SP (Pharmacia,
Suecia) de 50 ml a un caudal de 5 ml/minuto. Tras la carga, la
columna se lavó hasta la línea base con tampón A (NaOAc 20 mM, pH
4,25). El inhibidor se eluyó con un gradiente lineal desde el tampón
A hasta el tampón B (B:A + NaCl 350 mM) aplicando 10 volúmenes de
columna al mismo caudal. El eluído se recogió en fracciones de 10
ml. Cada segunda fracción se cribó para identificar la presencia de
inhibidores de xilanasa.
Se añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} hasta
1,0 M al pico de inhibidor procedente de la cromatografía de
intercambio catiónico (110 ml) y se aplicó a una columna de fenil
sefarosa de CIH de 10 ml (Pharmacia, Suecia) a un caudal de 2
ml/minuto. El inhibidor se eluyó de la columna a través de un
gradiente lineal aplicando 12 volúmenes de columna desde A (NaPi 20
mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 1 M, pH 6,0) hasta B (NaPi 20
mM, pH 6,0). El eluído se recogió en fracciones de 2,5 ml. Cada
segunda fracción se cribó para identificar la presencia de
inhibidores de xilanasa.
Se concentró el pico de 5 ml de inhibidor
procedente de la CIH hasta 2 ml utilizando un evaporador rotatorio.
Esta muestra se cargó en una columna Superdex 75 PG de 330 ml
(Pharmacia, Suecia) a un caudal de 1 ml/minuto. El sistema tampón
utilizado era NaOAc 50 mM, NaCl 0,2 M, pH 5,0. El eluído se recogió
en fracciones de 5,5 ml. Cada segunda fracción se cribó para
identificar la presencia de inhibidor de xilanasa.
Con el fin de determinar si el efecto inhibitorio
descubierto se debía a un inhibidor o a una proteasa que
hidrolizaba la xilanasa, se llevaron a cabo los experimentos
siguientes.
Se incubaron 2 ml de xilanasa pura 980601 (ver
las
endo-\beta-1,4-xilanasas)
con 0,25 ml de extracto de inhibidor durante tres horas a 40ºC.
Como control se llevó a cabo la misma incubación con extracto de
inhibidor sometido a ebullición (5 minutos). Tras la incubación, se
añadieron a las muestras NaOAc 50 mM, pH 4,5 hasta 2,5 ml y se
desalaron mediante filtración en gel en una columna
PD-10 (Pharmacia, Suecia), obteniendo muestras de
3,5 ml en NaOAc 50 mM, pH 4,5.
Se analizaron las dos muestras de xilanasa pura
procedentes de los ensayos de incubación en una columna SOURCE 15
S. Se aplicó 1 ml de la muestra filtrada en gel a la columna
(calibrada con tampón A: NaOAc 50 mM, pH 4,5) a un caudal de 2
ml/minuto. La muestra se eluyó con un gradiente lineal desde A a B
(B:A + NaCl 1 M) aplicando 20 volúmenes de columna y se recogió en
fracciones de 2 ml. La xilanasa se detectó a DO 280 nm y se cribó
para actividad de xilanasa en las fracciones (fracción de 100 \mul
+ 900 \mul de tampón (ácido cítrico 0,1 M - tampón dihidrógeno
fosfato sódico 0,2 M, pH 5,0) + 1 tab de xilazima, 10 minutos, 40ºC.
La reacción se completó con 10 ml de TRIS al 2%, color azul =
actividad de xilanasa).
Se aplicaron 100 \mul (concentrados dos veces
en un evaporador rotatorio) del pico de inhibidor procedente de la
CIH en una columna Superdex 75 10/30 de 24 ml (Pharmacia, Suecia) a
un caudal de 0,5 ml/minuto. El tampón de electroforesis utilizado
era NaOAc 50 mM, NaCl 0,1 M, pH 5,0. El eluido se recogió en
fracciones de 2 ml. Todas las fracciones se cribaron para
identificar la presencia de inhibidor.
Para determinar el tamaño del inhibidor, se
aplicó una serie de proteínas conocidas a una columna Superdex 75
10/
30 de 24 ml. Las condiciones para la electroforesis se han descrito anteriormente. Las proteínas estándar
30 de 24 ml. Las condiciones para la electroforesis se han descrito anteriormente. Las proteínas estándar
\hbox{utilizadas eran:}
| Proteína | Tamaño (kDa) | |
| BSA | 67 | |
| Ovoalbúmina | 43 | |
| Quimotripsina | 25 | |
| Ribonucleasa A | 13,7 |
Las proteínas se detectaron a 280 nm.
Se añadió tampón de muestras SDS (preparado de
acuerdo con el protocolo NOVEX) a las fracciones procedentes de la
cromatografía preparativa de filtración en gel, se sometieron a
ebullición durante tres minutos y se cargaron en un gel PAGE al
8-16% (NOVEX). El gel se tiñó de acuerdo con el
protocolo de NOVEX para la tinción con plata. Como marcadores de
peso molecular se utilizaron los marcadores de BPM de Pharmacia.
Para determinar el pI del inhibidor nativo, se
cargó una muestra de inhibidor purificado (la fracción 33 procedente
de la columna Superdex 75 PG de 330 ml) en un gel de ISE (NOVEX) a
pH 3-10. El gel se corrió de acuerdo con el
protocolo del fabricante utilizando como estándar el kit de pI Broad
de Pharmacia (Suecia) a pH 3,5-9,3. El gel se tiñó
con azul brillante de Coomassie de acuerdo con el protocolo del
fabricante.
Se filtró en gel a agua una muestra de la
fracción 33 procedente de la cromatografía preparativa de filtración
en gel. Se cargaron 100 \mul de muestra desalada en una columna
Mono P HR 5/5 (Pharmacia, Suecia). Las condiciones iniciales se
obtuvieron con etanolamina 25 mM-HCl, pH 9,4. La
columna se eluyó con tampón Poly 96:agua en una proporción de 1:10.
El pH se ajustó a 6,0 (caudal: 0,5 ml/min; tamaño de fracción: 0,5
ml). Tras la elución con tampón Poly 96, la columna se eluyó
adicionalmente con tampón Poly 74: agua en una proporción de 1:10,
el pH se ajustó a 3,80 (caudal: 0,5 ml/min; tamaño de fracción: 0,5
ml).
En todas las fracciones se midió el pH y se cribó
para identificar la presencia de inhibidor de xilanasa utilizando
el Protocolo 3.
Se utilizó una muestra (obtenida a partir de la
fracción 33 de la columna Superdex 75 PG de 330 ml) de inhibidor
puro procedente de la purificación preparativa. Se cargaron 200
\mul en una columna C4 en fase reversa (Applied Biosystems). El
sistema tampón utilizado era A: TFA al 0,1% en agua y B: TFA al 0,1%
en acetonitrilo al 100%. El pico de inhibidor de este ensayo estaba
carboximetilado y se pasó nuevamente por una columna C4. De esta
manera se obtuvieron dos péptidos inhibidores de interés. Se
secuenció el N-terminal de los dos. Además, los
péptidos se digirieron con Lys-C. Los péptidos
obtenidos se recuperaron utilizando cromatografía en fase reversa y
se secuenciaron los aminoácidos.
Con el fin de verificar las secuencias obtenidas
mediante secuenciación de aminoácidos, se analizó una fracción
pequeña de la muestra de interés mediante EM (Voyager).
Se llevaron a cabo ensayos con inhibidor de
acuerdo con el Protocolo 5. A este respecto, para los estudios de
caracterización preliminar de inhibidores, la xilanasa utilizada era
la 980601, diluida a 40 TXU/ml y el inhibidor se extrajo de harina
98002. Para las determinaciones de K_{l}, se utilizaron las
xilanasas siguientes: 980601, 980603, 980801, 980901, 980903,
980906 y 980907 diluidas a aproximadamente 40 TXU/ml. El inhibidor
utilizado para las determinaciones de K_{l} se extrajo de harina
98058.
Estos experimentos se llevaron a cabo tal como se
describe en el Protocolo 3 con las modificaciones siguientes.
Aparte de utilizar 650 \mul de tampón (ácido cítrico 0,1 M -
tampón dihidrógeno fosfato sódico 0,2 M), pH 5,0, en el ensayo,
éste también se llevó a cabo utilizando el mismo sistema tampón a pH
4, 6 y 7.
Se utilizaron las siguientes preparaciones de
xilanasa:
980601 (BX): preparación purificada de la nueva
xilanasa bacteriana de Danisco expresada en E. coli (1.225
TXU/ml).
980603 (Röhm): preparación purificada de xilanasa
Belase de Frimond (idéntica a la de Röhm) (1.050 TXU/ml).
980801 (X1): X1 purificada procedente de
Aspergillus niger (8.400 TXU/g).
980802 (Röhm): preparación purificada de xilanasa
Belase de Frimond (idéntica a la de Röhm) (265 TXU/ml).
980901 (Novo): preparación purificada de xilanasa
de Thermomyces procedente de Pentopan mono BG de Novo (2.900
TXU/ml).
980903 (XM1): mutante purificado de xilanasa de
B. subtilis de tipo salvaje expresado en E. coli
(1.375 TXU/ml).
980906 (XM3): mutante purificado de xilanasa de
B. subtilis de tipo salvaje expresado en E. coli
(1.775 TXU/ml).
980907 (XM2): mutante purificado de xilanasa de
B. subtilis de tipo salvaje expresado en E. coli (100
TXU/ml).
9535 (X3): xilanasa purificada, X3 procedente de
Aspergillus niger (6.490 TXU/ml).
Se extrajeron 100 g de harina (98026). Tras la
centrifugación, se obtuvo un sobrenadante de 150 ml. Se analizó la
presencia de inhibidor en este extracto (Tabla 5) y se comprobó que
era positiva.
| -inhibidor | +inhibidor | Actividad residual (%) | |
| DO 590 | 0,675 | 0,165 | 24,44 |
Se cargaron 75 ml del extracto de inhibidor en
una columna de filtración en gel de 500 ml (figura 3). En un
cribado se identificó la presencia de inhibidor en las fracciones
[>4-11] (Tabla 6).
| Fracción nº | DO 1 | DO 2 |
| 1 | 0,674 | |
| 2 | 0,665 | |
| 3 | 0,652 | |
| 4 | 0,618 | 0,476 |
| 5 | 0,388 | 0,166 |
| 6 | 0,186 | 0,126 |
| 7 | 0,188 | 0,18 |
| 8 | 0,277 | 0,217 |
| 9 | 0,381 | 0,231 |
| 10 | 0,406 | 0,246 |
| 11 | 0,395 | 0,435 |
| 12 | 0,725 | |
| 13 | 0,683 | |
| 14 | 0,762 | |
| 15 | 0,737 |
La concentración de picos de inhibidor de ambas
corridas de la columna de filtración en gel dio lugar a un volumen
aproximado de 240 ml.
Se aplicó por duplicado en el intercambiador
catiónico la concentración de 240 ml procedente de la filtración en
gel. Se observó que el eluído no contenía inhibidor. Tal como puede
observarse en la figura 4 y en la Tabla 7, el inhibidor se
encontraba unido a la columna y resultaba eluído a una concentración
de NaCl de aproximadamente 750 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
| Fracción nº | DO 1 | DO 2 |
| 40 | 0,476 | 0,624 |
| 42 | 0,407 | 0,58 |
| 44 | 0,404 | 0,398 |
| 46 | 0,22 | 0,137 |
| 48 | 0,144 | 0,107 |
| 50 | 0,198 | 0,126 |
| 52 | 0,302 | 0,208 |
| 54 | 0,395 | 0,435 |
| 56 | 0,457 | 0,495 |
| 58 | 0,463 | 0,606 |
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de inhibidor procedente de las
corridas de intercambio iónico era de 110 ml en cada corrida. Se
añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} hasta 1,0 M a estas dos
fracciones agrupadas y las dos se aplicaron a la columna de CIH en
dos corridas. Se analizó la presencia de inhibidor en el eluído,
comprobándose que no se hallaba presente. Tal como puede observarse
en la figura 5 y en la Tabla 8, todo el inhibidor se encuentra
unido a la columna y se obtiene una buena separación.
En la Tabla 8 se muestra el análisis de las
fracciones procedentes de la cromatografía CIH.
\vskip1.000000\baselineskip
| Fracción nº | DO 1 | DO 2 |
| Blanco | 0,469 | 0,659 |
| 12 | 0,462 | 0,622 |
| 14 | 0,486 | 0,555 |
| 16 | 0,202 | 0,188 |
| 18 | 0,1 | 0,118 |
TABLA 8
(continuación)
| Fracción nº | DO 1 | DO 2 |
| 20 | 0,102 | 0,146 |
| 22 | 0,242 | 0,193 |
| 24 | 0,392 | 0,502 |
| 26 | 0,485 | 0,6 |
Las fracciones 17 y 18 de la cromatografía CIH se
concentraron aproximadamente dos veces y se aplicaron a una columna
preparativa de filtración en gel (figura 6).
En la Tabla 9 se muestra el análisis de las
fracciones procedentes de la filtración en gel preparativa.
| Fracción nº | DO 590 nm |
| 26 | 0,738 |
| 28 | 0,774 |
| 30 | 0,645 |
| 32 | 0,117 |
| 34 | 0,705 |
| 36 | 0,749 |
| 38 | 0,754 |
| 40 | 0,761 |
| 42 | 0,769 |
Basados en el ensayo anterior de inhibidor de
xilanasa, no puede descartarse que la reducción de actividad
xilanasa, cuando se encuentra en mezcla con el extracto de harina,
no se deba a la hidrólisis proteolítica de la xilanasa. Por lo
tanto, se incubó una xilanasa purificada con un extracto de
"inhibidor". Tal como puede observarse en las figuras 7 y 8,
aparentemente no se produce hidrólisis. Se produce algo más de ruido
de fondo en el cromatograma con inhibidor activo (figura 8). Sin
embargo, este ruido de fondo corresponde al cromatograma del
inhibidor solo (cromatograma del inhibidor no mostrado). La
diferencia de ruido debe de estar provocada por la precipitación en
la muestra de inhibidor que ha sido sometida a ebullición.
Se aplicaron dos veces 100 \mul de muestra
concentrada de inhibidor procedente de la fracción 18 de la segunda
corrida de CIH a una columna analítica Superdex 75 10/30 (Pharmacia,
Suecia) de 24 ml (figura 9). Se recogió el eluido en fracciones de
2 ml. Estas fracciones se sometieron a ensayo para detectar la
presencia de inhibidor de xilanasa (Tabla 10).
| Fracción nº | DO 590 nm |
| Blanco | 0,613 |
| 6 | 0,233 |
| 7 | 0,304 |
| 8 | 0,51 |
| 9 | 0,569 |
| 10 | 0,565 |
| 11 | 0,652 |
Tras la filtración en gel de la muestra
concentrada de inhibidor, se aplicó a la columna una mezcla de
cuatro proteínas de peso molecular estándar utilizando exactamente
el mismo procedimiento (cromatograma no representado). En la Tabla
11 se resumen los pesos moleculares y tiempos de elución para las
proteínas.
| Proteína estándar | Ve (ml) | Kav* | PM (kDa) | log(PM) |
| BSA | 9,46 | 0,059508 | 67 | 1,826075 |
| Ovoalbúmina | 10,38 | 0,119017 | 43 | 1,633468 |
| Quimotripsina | 12,49 | 0,255498 | 25 | 1,39794 |
| Ribonucleasa A | 13,49 | 0,320181 | 13,7 | 1,136721 |
| *) Kav = (Ve-Vo)/(Vt-Vo) | ||||
| en la que: \hskip0,6cm Ve | = tiempo de ret., ml = | |||
| Vo | = vol. vacío, ml = 8,54 | |||
| Vt | = 24 ml = 24 |
En el gráfico de log(PM) en función de Kav
resulta posible obtener una ecuación y estimar el peso molecular de
una molécula desconocida (figura 10).
Utilizando la ecuación obtenida en la figura 10 y
el tiempo de retención del inhibidor, resulta posible calcular el
peso molecular del inhibidor:
| PM (kDa) = | 10 | (-2,4485 x kav + 1,9602) |
| = | 10 | (-2,4485 x 0,173559 + 1,9602) |
| = | 10 | 1,5352 |
| = | 34,29 |
El peso molecular encontrado para el inhibidor
era más elevado de lo esperado de acuerdo con Rouau y Surget
(Evidence for the presence of a Pentosanase Inhibitor in Wheat
Flour, Journal of Cereal Science 28:63-70, 1998);
el PM de la molécula era de aproximadamente 8 kDa. El PM obtenido
mediante filtración en gel podía explicarse por la agregación de
varias moléculas inhibidoras. Con el fin de estudiar esta cuestión
adicionalmente se llevó a cabo un gel SDS PAGE de las fracciones
31, 32 y 33 procedentes de la cromatografía preparativa de
filtración en gel (figura 11). Tal como puede observarse en este
gel, las tres bandas aparecen en los carriles con muestra de
inhibidor purificado. Estas bandas corresponden a proteínas con PM
de aproximadamente 40, 30 y 10 kDa.
Se desaló una muestra de la fracción 33
procedente de la filtración en gel preparativa del inhibidor
utilizando el sistema Presorb y 5 volúmenes de ácido acético 20 mM.
Se cargaron 200 \mul en una columna C4 en fase reversa (Applied
Biosystems). De esta prueba se obtuvieron tres picos. Uno de ellos
(el pico 3) dominaba claramente y se cree que era el inhibidor
(figura 12). Los demás picos de la prueba también se secuenciaron.
De la secuencia obtenida puede concluirse que todos se originan de
la misma proteína del trigo, la serpina, y que no son idénticos al
inhibidor (pico 3). Por lo tanto, se concluye que el pico 3 es el
inhibidor de xilanasa de interés. Este pico se caracterizó
adicionalmente mediante EM (Voyager).
El análisis de espectros de EM reveló una señal
correspondiente a una proteína de 39.503 Da utilizando ácido
sinápico como matriz (figura 13).
Tal como se ha indicado anteriormente, el gel SDS
PAGE indicó la presencia de tres bandas. Una banda en
aproximadamente 10 kDa, una en aproximadamente 30 kDa y una banda
en aproximadamente 40 kDa. Para explicar estos resultados
observados en el SDS-PAGE, se recogió la fracción
pura dominante, se liofilizó y se carboximetiló y a continuación se
volvió a correr en la columna C4 utilizando las mismas condiciones
indicadas anteriormente.
La fracción obtenida en dicho ensayo realizado
nuevamente (figura 14) se analizó mediante EM. Tal como puede
observarse en las figuras 15 y 16, el PM de estos polipéptidos era
de 12.104 y de 28.222 Da.
Sin pretender limitarse a ninguna teoría, los
presentes inventores opinan que el inhibidor de xilanasa es un
dipéptido nativo (PM = 39.503 Da) o que ha sido desnaturalizado y
reducido (dos péptidos con PM de 12.104 y 28.222 Da,
respectivamente) durante el procedimiento analítico.
El gel de ISE mostraba tres bandas en el área
alcalina (aproximadamente en 9,3, 8,6 y 8,2, respectivamente) y
tres bandas en el área ácida (aproximadamente en 5,1, 5,3 y 5,5,
respectivamente) (figura 17). Basándose únicamente en estos
resultados, podría no resultar viable la determinación del pI del
inhibidor nativo de xilanasa. A este respecto, los presentes
inventores conocían a partir de los resultados de secuenciación que
la muestra únicamente contenía el inhibidor de xilanasa y los tres
fragmentos de serpina de aproximadamente 4.500 Da. Un cálculo
teórico del pI para la serpina proporcionó el valor 5,58, mientras
que el pI calculado para el fragmento obtenido mediante
secuenciación proporcionaba un valor de pI de 5,46 (utilizando los
programas Swiss-Prot). Ello podría indicar que las
tres bandas ácidas observadas en el gel representan los tres picos
de la serpina observados con la cromatografía en fase reversa
(figura 12) y que las tres bandas alcalinas representan tres formas
diferentes del inhibidor de xilanasa, es decir, la forma dipéptido
nativa y los dos péptidos (tal como indica la secuenciación).
Tal como puede observarse a partir de los
resultados de la cromatografía de cromatoenfoque presentados en la
figura 18, el inhibidor de xilanasa no se une a la columna bajo las
condiciones proporcionadas. Ello podría implicar que el inhibidor
nativo de xilanasa presenta un pI de 8,5 o incluso más alto. Por lo
tanto, aparentemente podrían resultar correctas las hipótesis
presentadas anteriormente, es decir, que existen tres bandas
alcalinas en el gel de ISE y por lo tanto que podría haber tres
formas posibles de inhibidor de xilanasa.
En conclusión, los presentes inventores
consideran que el inhibidor nativo de xilanasa presenta un pI
comprendido en el intervalo entre 8,0 y 9,5. Dentro de este
intervalo existen tres bandas. Estas tres bandas corresponden
probablemente al inhibidor de xilanasa, el cual es posible que
exista en tres formas (ver los resultados determinados mediante
IEF). A este respecto, al utilizar IEF, la proteína corre como una
proteína nativa aunque la técnica podría dañar parcialmente algunos
dipéptidos, resultando de esta manera en que se produce más de una
banda.
Se secuenciaron los dos péptidos que forman el
inhibidor, dando lugar a la secuencia N-terminal y
secuencias internas. Los resultados se presentan en los listados de
secuencia adjuntos como SEC ID nº 13-19.
Las secuencias que constituyen la primera cadena
(cadena A) son las secuencias SEC ID nº 13 y 14. Las secuencias que
constituyen la segunda cadena (cadena B) son las SEC ID nº 15 y
19.
La búsqueda en la base de datos para detectar
homología con los polipéptidos secuenciados resultó negativa.
Ninguno de los polipéptidos ha sido secuenciado o descrito
anteriormente.
Se han llevado a cabo varias pruebas con el fin
de estudiar la inhibición de diferentes xilanasas. En primer lugar,
los presentes inventores opinaban que la reducción de la actividad
xilanasa se debía a una actividad proteolítica en el extracto. Por
lo tanto, se incubaron diferentes xilanasas con diferentes volúmenes
de extracto de "inhibidor" (figura 19). Se descubrió que las
xilanasas resultaban inhibidas en diferentes grados. También se
descubrió que se producía aparentemente un incremento de la
inhibición como función de la concentración de
"inhibidor".
Los resultados ilustrados en la figura 19 podrían
indicar que la reducción se debía a proteolisis o a inhibición. Sin
embargo, los experimentos de curso temporal con concentraciones
constantes de xilanasa y de inhibidor y los resultados
anteriormente indicados bajo el título "Análisis de detección de
actividad proteasa" no mostraron una reducción de la actividad
con el tiempo. Para poder diferenciar entre proteasa e inhibidor,
resulta necesario recrear la cinética real (ver la sección titulada
"Cinética del inhibidor").
Se han estudiado dos xilanasas de Bacillus
subtilis muy detalladamente respecto a sus rendimiento en
panadería. Estas xilanasas diferían poco en su funcionalidad,
implicando que una proporcionaba un volumen específicamente
ligeramente mayor que la otra cuando se horneaban en dosis iguales.
Una explicación podría ser el diferente grado de inhibición de su
actividad en la harina. Por lo tanto, se llevó a cabo un experimento
para examinar esta cuestión. El experimento se repitió utilizando
dos tipos diferentes de harina como fuente del inhibidor (Tabla
14).
| Harina | 1 | 98002 | 98026 | ||
| Inhibición (%) | 980601 | 67,03 | 75,04 | ||
| 980603 | 60,76 | 61,33 | |||
| 98002 | 98026 | Media | |||
| Act. Resid. (%) | 980601 | 32,97 | 24,96 | 28,96 | |
| 980603 | 39,24 | 38,67 | 38,96 | ||
| Diferencia (%) | 25,65 |
El ensayo demostró que las dos xilanasas
resultaban inhibidas en diferentes grados por el inhibidor. Las
xilanasas diferían en únicamente seis aminoácidos.
Basados en 980601, se crearon tres xilanasas
mutantes (XM1, XM2 y XM3). Estos mutantes se analizaron respecto a
su inhibición (figura 20).
Tal como puede observarse en la figura 20, los
tres mutantes diferían en su actividad residual, implicando que
resultaban inhibidas en grados diferentes por el inhibidor de
xilanasa. Cuatro (BX, Röhm, XM1 y XM3) de las cinco xilanasas
presentaban la misma actividad específica (aproximadamente 25.000
TXU/mg de proteína). Resulta previsible que XM2 presente la misma
actividad específica.
La diferencia de inhibición entre XM1 y XM2 era
de aproximadamente el 250% (la actividad residual de XM1 era 2,5
veces superior a la de XM2). Esta diferencia se debe a un
aminoácido. El aminoácido nº 122 en XM2 ha sido modificado de
arginina a asparagina, introduciendo una menor carga positiva cerca
del sitio activo.
Se estudió preliminarmente la cinética simple con
el único propósito de saber si el inhibidor era competitivo o no
competitivo.
Se incubaron diferentes cantidades de sustrato
con una concentración constante de xilanasa y de inhibidor (figura
21).
Tal como puede observarse en la figura 21, la
V_{max} para la xilanasa tanto con inhibidor como sin él era de
aproximadamente 1,19. Ello indica que la inhibición era
competitiva.
Debido a que los experimentos preliminares con el
inhibidor descritos anteriormente indicaban diferencias en los
K_{l} de las xilanasas estudiadas, se determinaron las K_{l}
reales para varias xilanasas. Tal como puede observarse a partir de
los datos en la figura 22, los valores de K_{l} no presentan
diferencias significativas entre xilanasas. Ello confirma los
resultados indicados por la caracterización preliminar simple del
inhibidor.
Un cribado simple del inhibidor de xilanasa a
diferentes pH reveló que aparentemente existía un efecto del pH
sobre la inhibición de las xilanasas. Por lo tanto, se diseñó un
experimento para examinar este efecto. Tal como puede observarse en
la figura 23, la inhibición de las xilanasas se ve influida por el
pH. La figura 24 ilustra los pH óptimos para las xilanasas. Si se
comparan estas dos curvas, se observa la inhibición más alta al pH
óptimo para la xilanasa, excepto para la medición a pH 4 para la
xilanasa de Novo (980901).
Con el fin de determinar si las proporciones de
inhibición medidas en los ensayos que se dan a conocer en la
presente memoria resultan relevantes en la masa, se pueden llevar a
cabo algunos cálculos:
| Extracción de inhibidor | |
| Gramos de harina: | 6 |
| ml de agua: | 12 |
| g harina/ml: | 0,5 |
| g harina en el ensayo: | 0,05 |
| Solución de xilanasa | |
| TXU/ml: | 12 |
| TXU/ml en el ensayo: | 3 |
| Proporciones de inhibidor: | xilanasa | |
| TXU/kg de harina: | 60.000 | en el ensayo de inhibidor |
| TXU/kg de harina: | 3.000 | en aplicaciones de panadería |
A partir de los cálculos anteriores, puede
estimarse que la proporción de inhibidor:xilanasa en el ensayo era
20 veces inferior en el ensayo que en la masa. Ello sólo puede
implicar que la xilanasa debe encontrarse mucho más inhibida en la
masa. Sin embargo, la movilidad y actividad en agua es mucho más
baja en la masa y ello podría influir sobre la inhibición.
La harina de trigo contiene inhibidor endógeno
endo-\beta-1,4-xilanasa.
El inhibidor puede extraerse de la harina de trigo mediante una
simple extracción utilizando agua, implicando que el inhibidor es
soluble en agua. El inhibidor se purificó mediante técnicas
cromatográficas de filtración en gel, intercambio iónico e
interacción hidrofóbica.
La caracterización del inhibidor purificado
utilizando cromatografía analítica de filtración en gel, SDS PAGE,
cromatografía en fase reversa y EM reveló un polipéptido de
aproximadamente 40 kDa. Este polipéptido resulto ser un dipéptido
que contenía dos péptidos con pesos moleculares de 12.104 y 28.222
Da, respectivamente. Se secuenció el N-terminal del
inhibidor purificado (más precisamente, de los dos péptidos),
seguido de la digestión y secuenciación de los péptidos
obtenidos.
El experimento preliminar con el inhibidor indicó
que la reducción de la actividad xilanasa podría deberse a
proteolisis. Sin embargo, el análisis de los ensayos de incubación
(xilanasa + inhibidor) y la cinética sobre el inhibidor indicó que
la reducción observada en la actividad xilanasa se debía a un
inhibidor competitivo.
Los experimentos con inhibidor utilizando varias
xilanasas indicaban diferencias de sensibilidad hacia el inhibidor.
Algunas xilanasas resultaban inhibidas casi al 100% por el inhibidor
(a una proporción de inhibidor:xilanasa más baja que la presente en
la harina). Mediante la variación del pH en el ensayo del inhibidor
resultaba que la inhibición era altamente dependiente del pH en el
ensayo. El examen de los mutantes de xilanasa reveló que el cambio
de un aminoácido podía implicar una reducción del 250% en el grado
de inhibición.
Con el fin de confirmar los resultados
anteriormente descritos, se determinaron los valores de K_{l} para
varias xilanasas. Los resultados mostraron K_{l} diferentes
dependiendo de la xilanasa utilizada, confirmando las diferencias
de resistencia hacia el inhibidor de las diferentes xilanasas
observadas en los resultados preliminares.
Los datos proporcionados después proceden de un
ensayo de horneo con el mutante XM1. Los datos muestran que este
nuevo mutante de xilanasa es claramente superior a BX (Bacillus
subtilis tipo salvaje) basándose en el volumen. Basándose en
mediciones de pegajosidad, no se observaron diferencias
significativas entre las dos xilanasas.
980902 (BX): Xilanasa purificada de B.
subtilis tipo salvaje expresada en E. coli (2.000
TXU/ml)
980903 (XM1): Xilanasa mutante purificada de
B. subtilis tipo salvaje expresada en E. coli (1.375
TXU/ml)
Harina danesa, lote 98022
Se amasaron 2.000 g de harina, 40 g de levadura
seca, 32 g de azúcar, 32 g de sal, 4 g de GRINDSTEN^{TM} Panodan
A2020, 400 unidades Brabender de agua +4%, en un mezclador Hobart de
tipo gancho durante 2 minutos a velocidad reducida y 9 minutos a
velocidad rápida. La temperatura de la masa era de 260ºC. Se pesó en
una balanza una cantidad de masa de 1.350 gramos. Tras un tiempo de
reposo de 10 minutos a 30ºC se moldeo en un moldeador Fortuna.
Periodo de reposo: 45 minutos a 34ºC, HR del 85%. Se horneó en un
horno Bago durante 18 minutos a 220ºC y se coció al vapor durante
12 segundos.
Tras enfriar los panecillos, se pesaron en una
balanza y se midió su volumen mediante el procedimiento de
desplazamiento de semillas de colza.
Volumen específico = volumen del
pan (ml)/peso del pan
(g)
Se llevó a cabo la medición de la pegajosidad de
acuerdo con el Protocolo 2.
Tal como puede observarse en la Tabla 15, el
nuevo mutante de xilanasa (XM1) dio lugar a un incremento
significativamente mayor del volumen del pan que BX.
| Muestra | Dosis (TXU/kg) | Pegajosidad (g x s) | Volumen específico (ml/g) | Incremento de volumen específico (%) |
| BX | 2.000 | 6,00 | 6,03 | 2,55 |
| BX | 5.000 | 6,60 | 6,49 | 10,37 |
| BX | 8.000 | 5,00 | 6,77 | 15,14 |
| BX | 12.000 | 7,00 | 6,72 | 14,29 |
| XM1 | 2.000 | 4,30 | 6,60 | 12,24 |
| XM1 | 5.000 | 6,20 | 6,88 | 17,01 |
| XM1 | 8.000 | 6,20 | 7,06 | 20,07 |
| XM1 | 12.000 | 6,90 | 7,32 | 24,49 |
| Control | 0 | 4,50 | 5,88 | - |
Se representan los datos en las figuras 25, 26 y
27.
Con el fin de determinar si la nueva xilanasa,
XM1, proporcionaba una masa más o menos pegajosa que la xilanasa
Veron Special de Röhm (y que una versión purificada de la misma), se
prepararon masas y se determinaron sus pegajosidades en función de
la xilanasa utilizada.
Se utilizó harina danesa, lote 98022.
Las masas se prepararon tal como se describe en
el Protocolo 2. Tras mezclar, la masa se dejó reposar durante 10 y
45 minutos, respectivamente, en recipientes sellados previamente a
la medición de la pegajosidad.
Las mediciones de pegajosidad se llevaron a cabo
de acuerdo con el Protocolo 2.
980903 (XM1): mutante purificado de la xilanasa
de B. subtilis tipo salvaje expresada en E. coli
(1.375 TXU/ml).
#2199: xilanasa Veron Special de Röhm (10.500
TXU/g).
980603 (Röhm): preparación purificada de la
xilanasa Belase de Frimond (idéntica a la de Röhm) (1.050
TXU/ml).
Se prepararon las masas siguientes (Tabla
16):
\vskip1.000000\baselineskip
| Xilanasa | Dosis (TXU/kg harina) |
| 980603 (xilanasa de Röhm purificada) | 15.000 |
| Control | 0 |
| XM1 | 15.000 |
| #2199 (Veron Special de Röhm) | 15.000 |
\vskip1.000000\baselineskip
La masa en la Tabla 16 proporcionó los resultados
de pegajosidad que se muestran en la Tabla 17.
\vskip1.000000\baselineskip
| Xilanasa | TXU/kg de harina | Tiempo de fermentación | Pegajosidad | Incremento de pegajosidad |
| (min) | (g x s) | (g x s) | ||
| 980603 | 15.000 | 10 | 7,22 | 2,22 |
| 980603 | 15.000 | 45 | 10,15 | 4,08 |
| Control | 0 | 10 | 5,00 | 0 |
| Xilanasa | TXU/kg de harina | Tiempo de fermentación | Pegajosidad | Incremento de pegajosidad |
| (min) | (g x s) | (g x s) | ||
| Control | 0 | 45 | 6,09 | 0 |
| XM1 | 15.000 | 10 | 6,61 | 1,61 |
| XM1 | 15.000 | 45 | 9,64 | 3,55 |
| #2199 | 15.000 | 10 | 8,57 | 3,57 |
| #2199 | 15.000 | 45 | 12,14 | 6,05 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se muestran los datos en las figuras 28, 29 y
30.
El incremento de pegajosidad con XM1 era menor
que el incremento de pegajosidad con la xilanasa de Röhm purificada.
El incremento de pegajosidad obtenido utilizando la xilanasa de
Röhm no purificada era mucho mayor.
Los resultados a continuación proceden de un
experimento diseñado para estudiar la capacidad de la
endo-\beta-1,4-glucanasa
bacteriana de proporcionar pegajosidad.
981102-1 (Xyl): correspondiente a
una preparación purificada de xilanasa bacteriana de Röhm procedente
del producto Veron Special. La preparación era de xilanasa pura y
no contenía
endo-\beta-1,4-glucanasa
(350 TXU/ml).
981102-2 (Xyl + Gluc):
correspondiente a una preparación purificada de xilanasa bacteriana
de Röhm procedente del producto Veron Special, que contenía
endo-\beta-1,4-glucanasa
(900 TXU/ml + 19 BGU/ml).
Se llevaron a cabo ensayos de xilanasa de acuerdo
con el Protocolo 1.
Se llevaron a cabo ensayos de glucanasa de
acuerdo con el protocolo 4.
Se utilizó harina danesa, lote nº 98058. La
absorción de agua a 400 BU era del 60%.
Se prepararon masas tal como se describe en el
Protocolo 2. Tras mezclar las masas, se dejaron reposar durante 10
y 45 minutos, respectivamente, a 30ºC en recipientes sellados.
Las mediciones de pegajosidad se llevaron a cabo
de acuerdo con el Protocolo 2.
Las masas indicadas en la Tabla 18 se prepararon
y se examinaron para la pegajosidad.
| nº de masa | Masa | TXU/kg de harina | BGU/kg de harina |
| 1 | Control | 0 | 0 |
| 2 | TXU | 7.500 | 0 |
| 3 | TXU + BGU | 7.500 | 158 |
| 4 | TXU | 15.000 | 0 |
| 5 | TXU + BGU | 15.000 | 316 |
Las masas indicadas en la Tabla 18 proporcionaron
los resultados de pegajosidad que se indican en la Tabla 19.
\vskip1.000000\baselineskip
| nº de masa | Stik_10 (g x s) | Desv. Est. | Stik_45 (g x s) | Des. est. |
| 1 | 4,5 | 0,342 | 5,11 | 0,552 |
| 2 | 5,29 | 0,619 | 8,62 | 0,607 |
| 3 | 5,47 | 0,663 | 9,38 | 0,832 |
| 4 | 8,61 | 0,408 | 9,15 | 0,418 |
| 5 | 8,73 | 0,35 | 10,19 | 0,857 |
Tal como puede observarse en la Tabla 19, la
adición de
endo-\beta-1,4-glucanasa
a la masa incrementa la pegajosidad de la misma. Los resultados de
la Tabla 19 se ilustran en la figura 31.
En resumen, la presente invención proporciona, y
los Ejemplos muestran, inter alia:
- a.
- El aislamiento de un inhibidor endógeno de endo-\beta-1,4-xilanasa de harina de trigo.
- b.
- La caracterización de un inhibidor endógeno de endo-\beta-1,4-xilanasa aislado a partir de la harina de trigo.
- c.
- La caracterización del efecto del inhibidor endógeno de endo-\beta-1,4-xilanasa sobre diferentes xilanasas.
- d.
- Un medio para seleccionar las xilanasas no afectadas negativamente por el inhibidor endógeno de endo-\beta-1,4-xilanasa.
- e.
- Un medio para seleccionar las xilanasas que no resultan afectadas negativamente por los inhibidores de endo-\beta-1,4-xilanasa.
- f.
- Xilanasas que proporcionan masas que muestran un volumen favorable y una pegajosidad aceptable en comparación con las masas que comprenden xilanasas fúngicas.
- g.
- Un procedimiento para cribar las xilanasas y/o mutar las mismas utilizando un inhibidor endógeno de endo-\beta-1,4-xilanasa, y la utilización de dichas xilanasas o mutantes de las mismas en la producción de masas.
- h.
- Un producto alimenticio preparado con las xilanasas de la presente invención.
Todas las publicaciones indicadas en la
descripción anterior se incorporan en la presente memoria en su
totalidad como referencia. Resultarán evidentes para los expertos
en la materia diversas modificaciones y variaciones de los
procedimientos y sistema descritos de la presente invención sin
apartarse del ámbito y espíritu de la presente invención. Aunque la
presente invención ha sido descrita haciendo referencia a las formas
de realización preferidas específicas, debe entenderse que la
invención tal y como está definida por las reivindicaciones
adjuntas no debe limitarse a dichas formas de realización
específicas. En efecto, se pretende que las diversas modificaciones
de las formas de realización de la invención descritas y que
resultarán evidentes para los expertos en bioquímica y
biotecnología o en campos afines, no se aparten del alcance de las
reivindicaciones siguientes.
Las páginas siguientes presentan una serie de
listados de secuencias, las cuales incluyen las secuencias
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
| SEC ID nº 1 - secuencia de aminoácidos del inhibidor | |
| SEC ID nº 2 - secuencia de aminoácidos del inhibidor | |
| SEC ID nº 3 - secuencia de aminoácidos de una xilanasa de tipo salvaje | (R) |
| SEC ID nº 4 - secuencia de nucleótidos de una xilanasa de tipo salvaje | (R) |
| SEC ID nº 5 - secuencia de aminoácidos de una xilanasa de tipo salvaje | (D) |
| SEC ID nº 6 - secuencia de nucleótidos de una xilanasa de tipo salvaje | (D) |
| SEC ID nº 7 - secuencia de aminoácidos de una xilanasa mutante | (XM1) |
| SEC ID nº 8 - secuencia de nucleótidos de una xilanasa mutante | (XM1) |
| SEC ID nº 9 - secuencia de aminoácidos de una xilanasa mutante | (XM2) |
| SEC ID nº 10 - secuencia de nucleótidos de una xilanasa mutante | (XM2) |
| SEC ID nº 11 - secuencia de aminoácidos de una xilanasa mutante | (XM3) |
| SEC ID nº 12 - secuencia de nucleótidos de una xilanasa mutante | (XM3) |
| SEC ID nº 13 - secuencia de aminoácidos del inhibidor | |
| SEC ID nº 14 - secuencia de aminoácidos del inhibidor | |
| SEC ID nº 15 - secuencia de aminoácidos del inhibidor | |
| SEC ID nº 16 - secuencia de aminoácidos del inhibidor | |
| SEC ID nº 17 - secuencia de aminoácidos del inhibidor | |
| SEC ID nº 18 - secuencia de aminoácidos del inhibidor | |
| SEC ID nº 19 - secuencia de aminoácidos del inhibidor |
\vskip1.000000\baselineskip
Notas:
\vskip1.000000\baselineskip
Para XM1, XM2 y XM3 los presentes
inventores introdujeron cambios (tal como se ha representado) en la
secuencia de nucleótidos y en la secuencia de aminoácidos a través
de la mutación sitio-dirigida del gen. El gen mutado
puede expresarse en E. coli, en Bacillus o en
cualquier organismo de
elección.
SEC ID nº 3
\vskip1.000000\baselineskip
AA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 4
\vskip1.000000\baselineskip
DNA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 5
\vskip1.000000\baselineskip
Xilanasa de Bacillus subtilis de tipo
salvaje
\vskip1.000000\baselineskip
AA:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
SEC ID nº 6
\vskip1.000000\baselineskip
ADN
Mutante
xM1
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 7
\vskip1.000000\baselineskip
AA:
SEC ID nº 8
\vskip1.000000\baselineskip
ADN:
Mutante
XM2:
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 9
\vskip1.000000\baselineskip
AA:
SEC ID nº 10
\vskip1.000000\baselineskip
ADN
\vskip1.000000\baselineskip
Mutante
XM3:
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 11
\vskip1.000000\baselineskip
AA:
\vskip1.000000\baselineskip
SEC ID nº 12
\vskip1.000000\baselineskip
ADN:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
| CADENA A del inhibidor |
| \hskip1cm Origen de la secuencia: inhibidor de xilanasa de harina de trigo. |
| \hskip1cm Extremo N-terminal: |
| \hskip2cm GAPVARAVEAVAPFGVCYDTKTLGNNLGGYAVPNV (35aa) SEC ID nº 13 |
| \hskip1cm Extremo C-terminal: |
| \hskip4cm KRLGFSRLPHFTGCGGL (17aa) SEC ID nº 14 |
\vskip1.000000\baselineskip
| CADENA B del inhibidor |
| \hskip1cm Origen de la secuencia: inhibidor de xilanasa de harina de trigo |
| \hskip1cm Extremo N-terminal: |
| \hskip3,5cm LPVPAPVTKDPATSLYTIPFH (21aa) SEC ID nº 15 |
| \hskip1cm Cadena B digerida con Lys-C: |
| \hskip2,7cm LLASLPRGSTGVAGLANSGLALPAQVASAQK (31aa) SEC ID nº 16 |
| \hskip3,2cm GGSPAHYISARFIEVGDTRVPSVE (24aa) SEC ID nº 17 |
| \hskip4,3cm VNVGVLAACAPSK (13aa) SEC ID nº 18 |
| \hskip1,75cm VANRFLLCLPTGGPGVAIFGGGPVPWPQFTQSMPYTLVVVK SEC ID nº 19 |
<110> Danisco A/S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteínas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Nº de solicitud: PCT/IB99/02071
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
inhibidor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: inhibidor
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: xilanasa de tipo salvaje
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 642
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
xilanasa de tipo salvaje
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
xilanasa de tipo salvaje
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 642
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
xilanasa de tipo salvaje
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
xilanasa mutante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 642
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
xilanasa mutante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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Val Ala Gly Leu Ala}
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Ser Ala Gln Lys}
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Gly Gly Pro Gly Val}
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Gln Phe Thr Gln Ser}
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Claims (3)
1. Utilización de una secuencia de aminoácidos
presentada como SEC ID nº 5 para preparar un producto alimenticio o
una sustancia (por ejemplo una masa) para preparar el mismo.
2. Producto de panadería que comprende o que
se prepara a partir de una secuencia de aminoácidos presentada como
SEC ID nº 5.
3. Utilización de una secuencia de aminoácidos
que comprende la secuencia de aminoácidos presentada como SEC ID nº
5 para preparar una masa que es menos pegajosa que una masa que
comprende una xilanasa fúngica, en la que dicha pegajosidad puede
determinarse mediante el Procedimiento de Determinación de la
Pegajosidad presentado en la presente memoria como protocolo 2.
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