ES2258295T3 - Receptor de la neurturina. - Google Patents

Abstract

Polipéptido que comprende una secuencia que es: (a) una secuencia de aminoácidos del dominio extracelular (ECD) del receptor alfa de neurturina humana (NTNRalfa) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC ID NO: 3 entre los residuos de aminoácidos 23 y 447,ambos inclusive; (b) una variante alélica u homólogo de mamífero de (a) que tiene por lo menos un 60% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de NTNRalfa establecida en la SEC ID No: 3, teniendo la variante u homólogo la actividad biológica de mediación de la actividad de Ret por NTN; (c) una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibrida en condiciones severas (42ºC en formamida al 20%) a un ácido nucleico que codifica (a) o (b), teniendo la secuencia la actividad biológica de mediación de la actividad de Ret por NTN; o (d) una secuencia de aminoácidos derivada de (a) por sustitución, eliminación o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de (a), teniendo la secuencia por lo menos un 60% de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácidos de NTNRalfa establecida en la SEC ID No: 3 y teniendo la actividad biológica de mediación de la actividad de Ret por NTN.

Description

Receptor de la Neurturina.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un receptor de Neurturina ("NTN") designado como NTNR\alpha (también referido como GFR\alpha2), y proporciona secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos que codifican el NTNR\alpha. En particular, la invención se refiere a NTNR\alpha de secuencia nativa, variantes de NTNR\alpha, variantes de NTNR\alpha solubles que incluyen el dominio extracelular de NTNR\alpha, NTNR\alpha quimérico y anticuerpos que se unen al NTNR\alpha (incluyendo anticuerpos agonistas y neutralizantes), así como varios usos para estas moléculas. También se refiere a sistemas de ensayo para detectar ligandos de NTNR\alpha, sistemas para estudiar el papel fisiológico de la NTN, las técnicas de diagnóstico para identificar las condiciones relacionadas, y técnicas terapéuticas para el tratamiento de las condiciones relacionadas con la NTN y el NTNR\alpha.

Antecedentes

Se han propuesto factores neurotróficos tales como los factores de crecimiento similares a la insulina, factores de crecimiento nervioso, factor neurotrófico derivado del cerebro, neurotrofina-3, -4/5 y -6, factor neurotrófico ciliar, GDNF, y neurturina como medios potenciales para aumentar la supervivencia de células neuronales específicas, por ejemplo, como tratamiento para enfermedades neurodegenerativas, tales como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, infarto, epilepsia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, y neuropatía periférica. Sería deseable proporcionar una terapia adicional para este objetivo. Se cree que los factores neurotróficos de proteínas, o neurotrofinas, que tienen influencia en el crecimiento y desarrollo del sistema nervioso de los vertebrados, juegan un papel importante en el impulso de la diferenciación, supervivencia, y función de diversos grupos de neuronas en el cerebro y periferia. Se cree que los factores neurotróficos tienen funciones importantes de señalización en tejidos neuronales, basado en parte en el precedente establecido con el factor de crecimiento nervioso (NGF). El NGF apoya la supervivencia de neuronas simpáticas, sensoriales, y del prosencéfalo basal tanto in vitro como in vivo. La administración de NGF exógeno rescata neuronas de la muerte celular durante el desarrollo. En cambio, la eliminación o secuestro de NGF endógeno mediante la administración de anticuerpos anti-NGF provoca dicha muerte celular (Heumann, J Exp. Biol., 132:133-150 (1987); Hefti, J. Neurosci., 6:2155-2162 (1986); Thoenen y otros, Annu. Rev. Physiol., 60:284-335 (1980)).

Desde entonces se han identificado factores neutróficos adicionales relacionados con el NGF. Entre estos se incluyen el factor neutrófico derivado del cerebro (BDNF) (Leibrock, y otros, Nature, 341:149-152 (1989)), neurotrofina-3 (NT-3) (Kaisho, y otros, FEBS Lett., 266:187 (1990); Maisonpierre, y otros, Science, 247:1446 (1990); Rosenthal, y otros, Neuron, 4:767 (1990)), y neurotrofina 4/5 (NT-4/5) (Berkineier, y otros, Neuron, 7:857-866 (1991)).

Las neurotrofinas, similares a otros factores de crecimiento de polipéptidos, afectan sus células diana a través de las interacciones con los receptores de la superficie de las células. Según lo que se conoce actualmente, dos tipos de glicoproteínas transmembrana actúan como receptores para las neurotrofinas conocidas. Los estudios de unión en equilibrio han mostrado que las células neuronales sensibles a neurotrofinas poseen un peso molecular habitualmente bajo (65000-8000 Daltons), un receptor de baja afinidad habitualmente referida como p75^{LNGFR} o p75, y un receptor de peso molecular elevado (130.000-150.000 Daltons). Los receptores de afinidad elevada son miembros de la familia trk de las tirosina quinasas receptoras.

Se conoce que las tirosina quinasas receptoras sirven como receptores para una variedad de factores de proteínas que provocan la proliferación, diferenciación y supervivencia celular. Además de los receptores trk, entre los ejemplos de otras tirosina quinasas receptoras se incluyen los receptores para el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). Habitualmente, estos receptores abarcan la membrana celular, siendo una parte del receptor intracelular y estando en contacto con el citoplasma, y siendo otra parte del receptor extracelular. La unión de un ligando a la parte extracelular del receptor induce la actividad de la tirosina quinasa en la parte intracelular del receptor, con la consiguiente fosforilación de varias proteínas intracelulares implicadas en los mecanismos de señalización celular.

El factor neurotrófico derivado de líneas de células gliales ("GDNF") y la Neurturina ("NTN") son dos factores de supervivencia potentes recientemente identificados y relacionados estructuralmente para las neuronas del sistema sensorial simpático y del sistema nervioso central (Lin y otros Science 260:1130-1132 (1993); Henderson y otros Science 266:1062-1064 (1994): Buj-Bello y otros, Neuron 15:821-828 (1995); Kotzbauer y otros Nature 384:467-470 (1996)). Recientemente, se observó que el GDNF mediaba sus acciones a través de un sistema receptor multicomponente compuesto de un ligando que se une a glicosil-fosfatidil inositol (GPI) unido a proteína (denominado GDNFR\alpha; también denominado GFR-alfa-1) y la tirosina quinasa receptora transmembrana Ret (Treanor y otros, Nature 382:80-83 (1996); Jing y otros, Cell 85:1113-1124 (1996); Trupp y otros, Nature 381:785-789 (1996); Durbec y otros, Nature 381:789-793 (1996)). No se ha elucidado el mecanismo por el cual se transmite la señal de la NTN.

La expresión aberrante de las tirosina quinasas receptoras ("RTK") se correlaciona con la capacidad de transformación. Por ejemplo, los carcinomas de hígado, pulmón, mama y colon muestran una expresión elevada de Eph RTK. A diferencia de muchas otras tirosina quinasas, esta expresión elevada puede tener lugar en ausencia de amplificación o reajustamiento de genes. Además, se ha identificado Hek, un RTK humano, como un marcador específico de leucemia presente en la superficie de una línea celular de pre-células B de la leucemia. Al igual que con Eph, Hek también se sobreexpresó en ausencia de amplificación o reajustamiento de genes en, por ejemplo, líneas celulares de tumores hemopoyéticos y tumores linfoides. Se observó que la sobreexpresión de Myk-1 (un homólogo murino de Htk humano (Bennett y otros, J. Biol. Chem. 269(19):14211-8 (1994)) en tumores mamarios no diferenciados e invasivos de ratones transgénicos que expresan el oncógeno Ha-ras. (Andres y otros, Oncogene, 9(5):1461-7 (1994) y Andres y otros, Oncogene, 9(8):2431 (1994)). Ret, el producto del proto-oncógeno c-ret, es un miembro de la superfamilia de tirosina quinasas receptoras.

Además de sus funciones en la carciogénesis, se ha descrito que un conjunto de tirosina quinasas transmembrana juegan papeles clave durante el desarrollo. Algunas tirosina quinasas receptoras se regulan desarrolladamente y se expresa predominantemente en tejidos embrionarios. Entre los ejemplos se incluyen las tirosina quinasas Cek1, que pertenece a la subclase FGF, Cek4 y Cek5 (Pasquale y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 86:5449-5453 (1989); Sajjadi y otros, New. Biol., 3(8):769-78 (1991); y Pasquale, Cell Regulation, 2:523-534 (1991)). Los miembros de la familia Eph se expresan en muchos tejidos adultos diferentes, con varios miembros de la familia expresados en el sistema nervioso o específicamente en neuronas (Maisonpierre y otros, Oncogene, 8:3277-3288 (1993); Lai y otros, Neuron, 6:691-704 (1991)).

La expresión aberrante o la regulación incontrolada de cualquiera de estas tirosina quinasas receptoras pueden dar lugar a diferentes tumores y trastornos patológicos. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar medios para regular, controlar y manipular tirosina quinasas receptoras ("RTK") y sus ligandos asociados o receptores unidos a GPI, para proporcionar medios nuevos y adicionales para la diagnosis y terapia de trastornos y procesos celulares relacionados con el mecanismo de las tirosina quinasas receptoras. La presente aplicación proporciona al clínico y al investigador dichos medios proporcionando nuevas moléculas que son específicas para interaccionar con ciertos receptores RTK. Estos compuestos y sus métodos de utilización, tal como se proporcionan en la presente, permiten un control y especificidad terapéutica exquisita. Por consiguiente, es objeto de la presente invención proporcionar una terapia mejorada para la prevención y/o tratamiento de condiciones neurológicas y otras condiciones en las que ciertos mecanismos de señalización neurotrófica juegan un papel.

Estos y otros objetos de la invención serán evidentes para un experto en la materia tras la consideración global de la publicación.

Descripción resumida de la invención

En la presente invención se describen un receptor de NTN denominado NTNR\alpha, una forma soluble del receptor, y un dominio extracelular del NTNR\alpha ("ECD"). También se describen polipéptidos de NTNR\alpha, opcionalmente conjugados con o fusionados a moléculas que incrementan la vida media de los mismos en el suero, y opcionalmente, formulados como composiciones farmacéuticas con un vehículo fisiológicamente aceptable.

Se puede utilizar el NTNR\alpha soluble, incluyendo moléculas de NTNR\alpha quiméricas, tales como las inmunoadhesinas de ECD de NTNR\alpha (que tienen vidas medias en el suero largas) y el ECD del NTNR\alpha con el epítopo tag, que retiene ambas uniones de ligando, preferiblemente la unión de NTN, y la función de señalización del receptor (a través de la tirosina quinasa receptora Ret), para transmitir, recuperar, o mejorar la sensibilidad de NTNR\alpha-ligando (preferiblemente NTN) a las células. Esta sensibilidad incluye la unión a ligando, la fosforilación de la tirosina Ret y la actividad de recuperación mediada por Ret, que puede dar lugar a la regulación de la actividad celular, tal como la supervivencia o el crecimiento. Las realizaciones encuentran una utilización in vivo, in vitro o ex vivo. Las formas solubles de NTNR\alpha que unen el NTN pero que no consiguen interaccionar con y activar Ret se pueden utilizar como antagonistas al ligando de NTN (uniendo y secuestrando el NTN) para reducir la activación de NTNR\alpha endógeno. Esto es útil en condiciones caracterizadas por niveles superiores de ligando de NTN y/o la activación de NTNR\alpha en exceso en un mamífero. Las inmunoadhesinas biespecíficas (por ejemplo, que combinan la actividad de unión NTNR\alpha-ligando con un dominio de unión a ligando de otro receptor de citocina o factor neurotrófico) pueden formar complejos de unión de afinidad elevada para ligandos-NTNR\alpha y otros factores, proporcionando una actividad antagonista (cuando no se encuentra la función de activación de Ret) o bien, un medio para potenciar la liberación de ligandos
unidos.

Las composiciones farmacéuticas de NTNR\alpha soluble, preferiblemente ECD, pueden incluir además opcionalmente un ligando de NTNR\alpha, preferiblemente NTN. Dichas composiciones son útiles allí donde se desea prolongar la vida media del ligando, proporcionar una liberación lenta y controlada del ligando, transmitir la respuesta ligando-NTNR\alpha a una célula diana, y/o activar o potenciar directamente la actividad de NTNR\alpha o Ret celular endógeno. Opcionalmente, la composición comprende además una o más citocinas, factores neurotróficos o sus anticuerpos agonistas.

También se proporcionan métodos para identificar una molécula que se une a y/o activa el NTNR\alpha. De este modo, se proporcionan ensayos para cribar o identificar moléculas NTNR\alpha-ligando (tales como péptidos, anticuerpos, y pequeñas moléculas) que son agonistas o antagonistas de NTNR\alpha. Dichos métodos implican generalmente la exposición de un NTNR\alpha inmovilizado a una molécula sospechosa de unirse al mismo y la determinación de la unión de la molécula al NTNR\alpha inmovilizado y/o la evaluación de si la molécula activa o no (o bloquea la activación) del NTNR\alpha. Para identificar dichos ligandos de NTN, el NTNR\alpha puede expresarse en la superficie de una célula y utilizarse para cribar bibliotecas de compuestos candidatos sintéticos o compuestos naturales (por ejemplo, a partir de fuentes endógenas, tales como suero o células). El NTNR\alpha también se puede utilizar como herramienta de diagnóstico para medir los niveles en suero de NTNR\alpha-ligando endógeno o exógeno.

En una realización adicional, se proporciona un método para purificar un NTNR\alpha-ligando. Esto encuentra utilización en la producción comercial y la purificación de moléculas terapéuticamente activas que se unen a este receptor. En una realización, la molécula de interés (generalmente en una composición que comprende uno o más contaminantes) se adsorbe a NTNR\alpha inmovilizado (por ejemplo, inmunoadhesina de NTNR\alpha inmovilizada sobre una resina de proteína A). Los contaminantes, en virtud de su incapacidad de unirse al NTNR\alpha, generalmente no se unirán a la resina. Por consiguiente, a continuación es posible recuperar la molécula de interés de la resina mediante el cambio de las condiciones de elusión, de manera que la molécula ligando se libera del receptor inmovilizado.

Los anticuerpos se proporcionan de forma que se unen específicamente a NTNR\alpha. Los anticuerpos preferidos son anticuerpos monoclonales que no son inmunogénicos en un humano y que se unen a un epítopo en el dominio extracelular del receptor. Los anticuerpos preferidos se unen al NTNR\alpha con una afinidad de, como mínimo, aproximadamente 10^{6} Umol, más preferiblemente 10^{7} Umol. Los anticuerpos preferidos son anticuerpos agonistas.

Los anticuerpos, que se unen a NTNR\alpha, se pueden fusionar opcionalmente a un polipéptido heterólogo. El anticuerpo o la fusión encuentran un uso concreto en el asilamiento y purificación del NTNR\alpha de una fuente del receptor.

En un aspecto adicional se proporciona un método para detectar NTNR\alpha que incluye las etapas de poner en contacto un anticuerpo con NTNR\alpha con una muestra sospechosa de contener el receptor, y la detección de si la unión ha tenido lugar.

Para ciertas aplicaciones es deseable tener un anticuerpo agonista. Dichos anticuerpos agonista son útiles para activar el NTNR\alpha tal como se describe para los ligandos de NTNR\alpha, tales como NTN. Además, estos anticuerpos son útiles para tratar condiciones en las que una cantidad efectiva de activación de NTNR\alpha conduce a un beneficio terapéutico en el mamífero. Por ejemplo, el anticuerpo agonista se puede utilizar para obtener una respuesta de la NTN en una celda que comprende NTNR\alpha y, preferiblemente, Ret. Para aplicaciones terapéuticas, es deseable para preparar una composición que tenga el anticuerpo del agonista y un vehículo fisiológicamente aceptable. Opcionalmente, la composición contiene además una o más citocinas, factores neurotróficos, o sus anticuerpos de agonista.

En otras realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante. Dichas moléculas se pueden utilizar para tratar condiciones caracterizadas por una activación no deseada o excesiva de NTNR\alpha.

Además de lo dicho anteriormente, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico, vectores de expresión y células huésped aisladas que codifican el NTNR\alpha que se pueden utilizar en la producción recombinante de NTNR\alpha, tal y como se ha descrito en la presente invención. Las moléculas de ácidos nucleicos y vectores aislados también son útiles para preparar animales transgénicos, para aplicaciones en terapia génica en el tratamiento de pacientes con defectos en el NTNR\alpha o un aumento de la respuesta de la célula a ligandos de NTNR\alpha, o alternativamente para disminuir la actividad del NTNR\alpha (mediante el uso de ácido nucleico antisentido).

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A-1B representan la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO.: 1) de la cadena de sentido del ADNc que codifica el NTNR\alpha humano de longitud completa, la secuencia que codifica el hNTNR\alpha (SEQ ID NO.:2), y la secuencia de aminoácidos deducida del hNTNR\alpha de longitud completa (SEQ ID NO.:3). Los nucleótidos se numeran en el inicio de la cadena sentido. Los residuos de aminoácidos se numeran en el inicio de la secuencia de aminoácidos.

Las figuras 2A-2B representan la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO.: 4) de la cadena de sentido del ADNc que codifica el NTNR\alpha de rata de longitud completa, la secuencia que codifica el rNTNR\alpha (SEQ ID NO.: 5), y la secuencia de aminoácidos deducida del hNTNR\alpha de longitud completa (SEQ ID NO.: 6). Los nucleótidos se numeran en el inicio de la cadena sentido. Los residuos de aminoácidos se numeran en el inicio de la secuencia de aminoácidos.

Las figuras 3A-3B comparan los ácidos nucleicos que codifican hNTNR\alpha, rNTNR\alpha y rGDNFR\alpha.

La figura 4 es una comparación de las proteínas hNTNR\alpha, rNTNR\alpha y rGDNFR\alpha con las características indicadas. Los péptidos señal se indican mediante una línea contínua. Los sitios de división por la señal están marcados con flechas. Los sitios potenciales de glicosilación están sombreados. El dominio hidrofóbico del sitio de unión a GPI está doblemente subrayado. Los residuos de aminoácidos pequeños que constituyen un sitio de división/unión para las proteínas unidas a GPI están marcados con asteriscos. Los residuos de cisteína de consenso se indican mediante un círculo negro. El dominio extracelular ("ECD") está rodeado por el péptido señal y el sitio de unión a GPI.

La figura 5 es una comparación de las secuencias de aminoácidos de hNTNR\alpha y hGDNFR\alpha.

Las figuras 6A-6D representan la unión de NTN y GDNF con I^{125} a células que expresan NTNR\alpha o GDNFR\alpha y el desplazamiento por NTN no marcado. Las figuras 6A y 6C muestran la unión de NTN de ratón con ^{125}I (^{125}I-mNTN) a GDNFR\alpha de rata ("rGDNFR\alpha") o NTNR\alpha de rata ("rNTNR\alpha"), respectivamente. Las figuras 6B y 6D muestran la unión de rGDNF con ^{125}I (^{125}I-rGDNF) a GDNFR\alpha de rata ("rGDNFR\alpha") o NTNR\alpha de rata ("rNTNR\alpha"), respectivamente. Tal y como se representa mediante el análisis de Scatchard, mostrado en la inserción de la figura 6B, el GDNF se une a GDNFR\alpha con un valor de K_{d} de 3 pM. Se observó un valor similar de K_{d} en un ensayo basado en células (Ping y otros, Cell 85:1113-1124 (1996)). La NTN de ratón se une a NTNR\alpha con un valor de K_{d} de 10 pM (ver inserción en la figura 6C). El NTNR\alpha humano mostró una especificidad de unión similar al NTNR\alpha de rata (datos no mostrados). A pesar de que en estos experimentos no se detectó la unión de NTN con ^{125}I a GDNFR\alpha (figura 6A) y del rGDNF con ^{125}I a NTNR\alpha (figura 6D), los experimentos realizados con NTN y GDNF biotinilados revelaron una unión con baja afinidad (K_{d} por encima de 1 mM) de NTN a GDNFR\alpha, y viceversa.

Las figuras 7A-7F representan la interacción entre NTN, NTNR\alpha y Ret. La figura 7A representa la unión de NTN con ^{125}I a células que expresan NTNR\alpha. En concordancia con la predicción de que el NTNR\alpha es una proteína unida a GPI, la unión de NTN con ^{125}I a células que expresan NTNR\alpha se redujo en un 50-70% siguiendo el tratamiento con PIPLC. La figura 7B representa la respuesta de supervivencia de motoneuronas espinales embrionarias de rata a GDNF o NTN. De acuerdo con su distribución de receptor, el NTN es un factor de supervivencia potente para motoneuronas espinales. La figura 7C representa la respuesta de supervivencia de motoneuronas espinales embrionarias de rata a NTN o BDNF en presencia de PIPLC y un NTNR\alpha soluble. El tratamiento con PIPLC redujo la respuesta de supervivencia a NTN en un 50-90% sin cambiar la respuesta a BDNF. El NTNR\alpha soluble (sR\alpha) recupera la respuesta de las motoneuronas tratadas con PIPLC a la NTN. La figura 7D representa la inducción por NTN de la fosforilación de tirosina de Ret en células de neuroblastomas TGW-1. La figura 7E representa la inducción por NTN de la fosforilación de ERK en TGW-1. La figura 7F representa la sensibilidad del NTN (por ejemplo, fosforilación de Ret) comunicada por un complejo de NTNR\alpha soluble en NTN a células que expresan Ret. Leyenda: (Con) = células no transfectadas. (Ret) = células transfectadas con Ret solo. (R\alpha + Ret) = células transfectadas con Ret y NTNR\alpha. En todos los casos, las células se expusieron a NTN (100 ng/ml) y, a continuación, se procesó la inmunoprecipitación con NTN
antisuero.

Las figuras 8A a 8C representan la respuesta de supervivencia de neuronas dopaminérgicas a formas solubles de NTNR\alpha activadoras de Ret y dominios extracelulares de GFNFR\alpha.

La figura 9 representa la proporción de DOPAC con respecto a dopamina (expresada como la parte inyectada como un porcentaje de la parte no inyectada, media \pm sem) en varias regiones del cerebro, particularmente el estriado, de ratas inyectadas en un estriado con NTN, una forma soluble de NTNR\alpha, tanto NTN como NTNR\alpha, o vehículo.

Descripción detallada

En la descripción de la presente invención, se utilizarán los siguientes términos y se pretenden definir tal y como se indican a continuación.

Los términos "NTNR\alpha" (también denominado GFR-alfa-2) o "polipétido NTNR\alpha" cuando se utiliza en la presente invención abarca la secuencia nativa de NTNR\alpha; variantes de NTNR\alpha; dominio extracelular de NTNR\alpha, y NTNR\alpha quimérico (cada uno de ellos se define en la presente invención). Opcionalmente, el NTNR\alpha no está asociado con la glicosilación nativa. La "glicosilación nativa" se refiere a partes de hidrocarburos que están unidos covalentemente a NTNR\alpha cuando se produce en la célula de un mamífero de la que se deriva en la naturaleza. Por consiguiente, el NTNR\alpha humano producido en una célula no humana es un ejemplo de un NTNR\alpha que puede "no estar asociado con glicosilación nativa". Algunas veces, el NTNR\alpha no está glicosilado (por ejemplo, como resultado de producirse de forma recombinada en una célula procariota).

Una "secuencia nativa de NTNR\alpha" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un NTNR\alpha derivado de la naturaleza. De este modo, una secuencia nativa de NTNR\alpha puede tener la secuencia de aminoácidos de NTNR\alpha de rata, NTNR\alpha murino, NTNR\alpha humano, o NTNR\alpha de cualquier otra especie de mamíferos natural. Dichos polipéptidos de secuencia de nativa de NTNR\alpha se pueden aislar de la naturaleza o se pueden producir mediante medios recombinantes o sintéticos. El término "secuencia nativa de NTNR\alpha" abarca específicamente formas truncadas naturales del NTNR\alpha, formas variantes naturales (por ejemplo, alternativamente formas de corte y empalme "spliced"), y variantes alélicas naturales del NTNR\alpha. La secuencia nativa de NTNR\alpha preferida es una secuencia nativa de NTNR\alpha madura. En las figuras 1A-1B y 2A-2B se muestra la secuencia de NTNR\alpha para humanos y ratas. Las moléculas preferidas son aquéllas que comprenden una molécula de ácido nucleico que es capaz de hibridar en condiciones moderadas y más preferiblemente en condiciones de hibridación severas, con la secuencia de ADN que codifica el receptor de NTN humano mostrado en la figura 1A-1B. En una realización, el ácido nucleico del NTNR\alpha se hibrida a 42ºC en formamida al 20% con la secuencia de ADN que codifica el receptor de NTN mostrado en la figura 1A-1B. En otra realización, una molécula de ácido nucleico es capaz de hibridarse a 42ºC en formamida al 20% con una secuencia de ADN de, como mínimo, 10 bases contiguas, y preferiblemente, como mínimo, 20 bases contiguas, más preferiblemente con, como mínimo, 45 bases, e incluso más preferiblemente con, como mínimo, 60 bases que codifican una parte del receptor de NTN completo mostrado en las figuras 1A-1B o 2A-2B. Las secuencias preferidas no hibridan las secuencias de GDNFR\alpha en condiciones similares.

El "dominio extracelular de NTNR\alpha" (ECD) es una forma del NTNR\alpha que esencialmente no tiene los dominios transmembrana y citoplásmicos de NTNR\alpha, es decir, con menos de un 1% de dichos dominios, preferiblemente de un 0,5% a un 0% de dichos dominios, y más preferiblemente de un 0,1 a un 0% de dichos dominios. Habitualmente, el ECD del NTNR\alpha tendrá una secuencia de aminoácidos que tendrá, como mínimo, aproximadamente un 60% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del ECD de un NTNR\alpha, por ejemplo, tal y como se indica en las figuras 1A-1B o 2A-2B para NTNR\alpha o las secuencias correspondientes proporcionadas en la presente invención, por ejemplo, las secuencias de ratones, preferiblemente, como mínimo, aproximadamente un 65%, más preferiblemente, como mínimo, aproximadamente un 75%, incluso más preferiblemente, como mínimo, un 80%, incluso más preferiblemente, como mínimo, un 90%, con una preferencia creciente de un 95%, hasta, como mínimo, un 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos, y finalmente hasta un 100% de identidad, y de este modo, incluye las variantes de NTNR\alpha, tal y como se han definido anteriormente. Las secuencias preferidas tendrán, como mínimo, 16 aminoácidos, preferiblemente, como mínimo, 20 aminoácidos, e incluso más preferiblemente, como mínimo, 40 aminoácidos.

La "variante de NTNR\alpha" significa un NTNR\alpha biológicamente activo, tal y como se define a continuación, que tiene menos de un 100% de identidad en la secuencia (pero, como mínimo, un 60% de identidad) con un NTNR\alpha, por ejemplo, que tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en las figuras 1A-1B o 2A-2B para NTNR\alpha o con las secuencias proporcionadas en la presente invención. Entre dichas variantes de NTNR\alpha se incluyen polipéptidos de NTNR\alpha en los que uno o más residuos de aminoácidos se añaden al N- o C-terminal de, o dentro de, una secuencia de NTNR\alpha; se eliminan de aproximadamente uno a treinta residuos de aminoácidos, y opcionalmente, se sustituyen por uno o más residuos de aminoácidos; y derivados de los polipéptidos anteriores, en los que un residuo de aminoácido ha sido modificado covalentemente, de manera que el producto resultante tiene un aminoácido no natural. Habitualmente, una variante de NTNR\alpha biológicamente activa tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene aproximadamente un 60% de identidad en la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de un NTNR\alpha natural (por ejemplo, tal y como se muestra en las figuras 1A-1B o 2A-2B o las secuencias correspondientes proporcionadas en la presente invención), preferiblemente, como mínimo, aproximadamente un 65%, más preferiblemente, como mínimo, aproximadamente un 75%, incluso más preferiblemente, como mínimo, un 80%, incluso más preferiblemente, como mínimo, un 90%, con una preferencia creciente de un 95%, hasta, como mínimo, un 99% de identidad en la secuencia de aminoácidos, y finalmente hasta un 100% de identidad.

Un "NTNR\alpha quimérico" es un polipéptido que comprende un NTNR\alpha de longitud completa o uno o más dominios del mismo (por ejemplo, el dominio extracelular) fusionado u unido a un polipéptido heterólogo. El NTNR\alpha quimérico compartirá generalmente, como mínimo, una propiedad biológica en común con el NTNR\alpha. Entre los ejemplos de NTNR\alphas quiméricos se incluyen inmunoadhesinas y NTNR\alpha marcados en el epítopo.

El término "inmunoadhesina" se utiliza de forma intercambiable con la expresión "quimera de inmunoglobulina-NTNR\alpha" y se refiere a una molécula quimérica que combina una parte del NTNR\alpha (generalmente el dominio extracelular del mismo) con una secuencia de inmunoglobulina. La secuencia de inmunoglobulina preferiblemente, pero no necesariamente, es un dominio constante de inmunoglobulina. La parte de inmunoglobulina en las quimeras de la presente invención se puede obtener de los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD o IgM, pero preferiblemente IgG1 o IgG3.

El término "con tag en el epítopo" cuando se utiliza en la presente invención se refiere a un polipéptido quimérico que comprende NTNR\alpha fusionado a un "polipéptido tag". El polipéptido tag tiene suficiente residuos para proporcionar un epítopo frente al cual se puede fabricar un anticuerpo contra el mismo, aunque es suficientemente corto, de manera que no interfiere con la actividad biológica del NTNR\alpha. El polipéptido tag preferiblemente también es bastante único, de manera que el anticuerpo contra el mismo no reacciona sustancialmente de forma cruzada con otros epítopos. Los polipéptidos tag adecuados generalmente tienen como mínimo seis residuos de aminoácidos y habitualmente entre, aproximadamente, 8-50 residuos de aminoácidos (preferiblemente entre, aproximadamente, 9-30 residuos). Se prefieren las secuencias de poli-histidina que se unen a níquel, permitiendo el aislamiento de la proteína con tag por cromatografía de Ni-NTA tal como se ha descrito (Lindsay y otros, Neuron 17:571-574 (1996)), por ejemplo.

"NTNR\alpha aislado" significa NTRN\alpha que ha sido purificado a partir de una fuente de NTRN\alpha o se ha preparado mediante métodos recombinantes o sintéticos y está suficientemente libre de otros péptidos o proteínas (1) para obtener como mínimo 15 y preferiblemente 20 residuos de aminoácidos del N-terminal o de una secuencia de aminoácidos internos mediante la utilización de un secuenciador de copa giratoria o del mejor secuenciador de aminoácidos disponible comercialmente comercializado o modificado mediante los métodos publicados en la fecha de presentación de esta solicitud, o (2) para homogeneizar mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. La homogeneidad significa en la presente menos de, aproximadamente, un 5% de contaminación con otras proteínas originales.

Una proteína "esencialmente pura" significa una composición que comprende como mínimo, aproximadamente, un 90% en peso. Una proteína "esencialmente homogénea" significa una composición que comprende, como mínimo, aproximadamente, un 99% en peso de proteína, basado en el peso total de la composición.

"Propiedad biológica" cuando se utiliza junto con "NTNR\alpha" o "NTNR\alpha aislado" significa tener una función o actividad efectora o antigénica que está directa o indirectamente provocada o llevada a cabo por NTNR\alpha de secuencia nativa (tanto en su conformación nativa como desnaturalizado). Entre las funciones efectoras se incluyen la unión de ligando, y la mejora de la supervivencia, diferenciación y/o proliferación de células (especialmente la proliferación de células). Sin embargo, las funciones efectoras no incluyen la posesión de un epítopo o un sitio antigénico que sea capaz de reaccionar de forma cruzada con anticuerpos desarrollados para el NTNR\alpha de secuencia nativa.

Una "función antigénica" significa la posesión de un epítopo o sitio antigénico que es capaz reaccionar de forma cruzada con anticuerpos desarrollados para el NTNR\alpha de secuencia nativa. La función antigénica principal de un polipéptido de NTNR\alpha es que se une con una afinidad de, como mínimo, aproximadamente, 10^{6} L/mol a un anticuerpo desarrollado para el NTNR\alpha de secuencia nativa. Habitualmente, el polipéptido se une con una afinidad de, como mínimo, aproximadamente, 10^{7} L/mol. Los anticuerpos utilizados para definir la "función antigénica" son anticuerpos policlonales de conejo desarrollados mediante la formulación del NTNR\alpha en el adyuvante completo de Freund, la inyección subcutánea de la formulación, y la estimulación de la respuesta inmune mediante inyección intraperitoneal de la formulación hasta la concentración del anticuerpo anti-NTNR\alpha plateaus.

"Biológicamente activo" cuando se utiliza junto con "NTNR\alpha" o "NTNR\alpha aislado" significa un polipéptido de NTNR\alpha que muestra o comparte una función efectora de NTNR\alpha de secuencia nativa y que puede poseer, además, (pero no necesita), una función antigénica. Una función efectora principal del NTNR\alpha es su capacidad para unirse a NTN. Otra función efectora principal del NTNR\alpha es la activación de la tirosina quinasa Ret (que da lugar a la autofosforilación de Ret) para activar los mecanismos de recuperación mediados por la función de señalización de Ret.

Un NTNR\alpha "antigénicamente activo" se define como un polipéptido que posee una función antigénica del NTNR\alpha y que puede poseer, además, (pero no necesita), una función efectora.

El "porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos" con respecto a la secuencia del NTNR\alpha se define en la presente invención como el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos con los residuos en la secuencia de NTNR\alpha, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de la secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de la secuencia. Ninguna de las extensiones, deleciones o inserciones N-terminal, C-terminal o internas en la secuencia del NTNR\alpha candidata se interpretará que afecta a la identidad u homología de la secuencia.

Un "ligando de NTN" es una molécula que se une a, y preferiblemente, activa el NTNR\alpha de secuencia nativa. La capacidad de una molécula para unirse a NTNR\alpha se puede determinar, por ejemplo, mediante la capacidad del ligando putativo a unirse a inmunoadhesina de NTNR\alpha recubierta sobre una placa de ensayo, por ejemplo. La especificidad de la unión se puede determinar por comparación con la unión a GDNFR\alpha. La unión competitiva de la NTN al NTNR\alpha es una propiedad preferida del ligando. El ensayo de incorporación de timidina proporciona otro medio para cribar los ligandos que activan la función del NTNR\alpha.

Un "ensayo de incorporación de timidina" se puede utilizar para cribar moléculas que activan el NTNR\alpha. Para realizar este ensayo, las células Baf3 dependientes de IL-3 (Palacios y otros, Cell, 41:727-734 (1985)) se transfectan de forma estable con NTNR\alpha de secuencia nativa de longitud completa, tal como ha descrito en la presente invención, y Ret. Las células NTNR\alpha/Ret/Baf3 generadas de esta manera se privan de IL-3 durante 24 horas en un incubador humidificad a 37ºC en 5% de CO_{2} y aire. Tras la privación de IL-3 las células se colocan en platos de cultivo de 96 pocillos con, o sin, muestra de prueba que contienen un agonista potencial (dichas muestras de prueba opcionalmente se diluyen) y se cultivan durante 24 horas en un incubador de cultivo de células. Se añaden 20 \mul de suero sin medio RPMI que contiene 1 \muCi de ^{3}H timidina cada pocillo durante las últimas 6-8 horas. A continuación, las células se recogen en placas de filtro de 96 pocillos y se lavan con agua. A continuación, se cuentan los filtros mediante, por ejemplo, un Packard Top Count Microplate Scintillation Counter. Se espera que los agonistas induzcan a un incremento estadísticamente significativo (hasta un valor P de 0,05) en la ingesta de ^{3}H, en relación con el control. Los agonistas preferidos conducen a un incremento en la ingesta de ^{3}H que es, como mínimo, dos veces la del control. En la presente invención se describen otros ensayos.

Una molécula de ácido nucleico de NTNR\alpha "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de, como mínimo, una molécula de ácido nucleico contaminante con la que se asocia habitualmente en la fuente natural del ácido nucleico de NTNR\alpha. Una molécula de ácido nucleico de NTNR\alpha aislada es cualquiera que no esté en forma o tenga la configuración que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico de NTNR\alpha aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico de NTNR\alpha tal y como existen en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico de NTNR\alpha aislada incluye moléculas de ácido nucleico de NTNR\alpha contenidas en células que habitualmente expresan NTNR\alpha allí donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en un punto cromosómico diferente del de las células naturales.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación unida funcionalmente en un organismo huésped particular. Entre las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, se incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, un sitio de unión de ribosomas, y posiblemente, otras secuencias aún poco entendidas. Se conoce que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y potenciadores.

El ácido nucleico "está unido funcionalmente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o el secretor principal está unido funcionalmente a ADN por un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido funcionalmente a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está unido operablemente a una secuencia codificadora si se posiciona para facilitar la traducción. Generalmente, "unido operablemente" significa que las secuencias de ADN que se unen están contiguas y, en el caso de un secretor principal, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se lleva a cabo por ligadura en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan según la práctica habitual.

Tal y como se utiliza en la presente invención, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan de forma intercambiable y todas estas designaciones incluyen progenia. De este modo, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen células de sujeto primarias y cultivos derivados de las mismas independientemente del número de transferencias. También se entiende que toda la progenia puede que no sea precisamente idéntica en el contenido de ADN debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la progenia mutante que tiene la misma función o actividad biológica tal como se criba en la célula originalmente transformada. Allí donde se pretendan diferenciar las designaciones ya se entenderá por el contexto.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclonales, composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos biespecíficos, diabodies, y moléculas de cadena única, así como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2} y Fv), siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada.

El término "anticuerpo monoclonal", tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que se pueden presentar en cantidades pequeñas. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos (policlonales) habituales que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en que se sintetizan mediante cultivo de hibridoma, no contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo según se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se considera como una producción necesaria del anticuerpo por ningún método concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar según la presente invención se pueden fabricar mediante el primer método de hibridoma descrito por Kohler y otros, Nature, 256:495 (1975), o se pueden fabricar mediante métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 4.816.567 (Cabilly y otros)). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos en fagos utilizando técnicas descritas en Clackson y otros, 624-628 (1991) y Marks y otros, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales en la presente invención incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase concreta de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre y cuando muestren la actividad biológica deseada (Cabilly y otros, ver anteriormente: Morrison y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 81:6851-6855 (1984)).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas o fragmentos de inmunoglobulinas de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpo de unión a antígeno) que contienen las secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulinas no humanas. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata o conejo, que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o las secuencias del marco. Estas modificaciones se realizan para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de, como mínimo, uno, y habitualmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado de forma óptima también comprenderá, como mínimo, una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, habitualmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, ver Jones y otros, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann y otros, Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo Primatizado^{TM} en el que la región de unión a antígeno del anticuerpo deriva de un anticuerpo producido por inmunización de monos macacos con el antígeno de interés.

"No inmugénico en un humano" significa que tras el contacto del polipéptido de interés en un vehículo fisiológicamente aceptable y en una cantidad terapéuticamente efectiva con el tejido apropiado humano, no es demostrable ningún estado de sensibilidad o resistencia al polipéptido de interés tras la segunda administración del polipéptido de interés tras un periodo latente apropiado (por ejemplo, 8 a 14 días).

Por "anticuerpo agonista" se entiende un anticuerpo que es un ligando de NTNR\alpha, capaz de activar el NTNR\alpha de secuencia nativa.

Un "anticuerpo neutralizante" es uno que es capaz de bloquear o reducir significativamente una función efectora de NTNR\alpha de secuencia nativa. Por ejemplo, un anticuerpo neutralizante puede inhibir o reducir la activación del NTNR\alpha mediante un ligando de NTN, tal como se ha determinado, por ejemplo, en ensayos de supervivencia de neuritas, un ensayo de unión a NTN, u otros ensayos mostrados en la presente invención o conocidos en la técnica.

La frase "potenciar la proliferación de una célula" comprende la etapa de incrementar la extensión del crecimiento y/o reproducción de la célula en relación a una célula no tratada in vitro o in vivo. Un incremento de la proliferación en el cultivo celular se puede detectar mediante el recuento del número de células antes y después de la exposición a una molécula de interés. La extensión de la proliferación se puede cuantificar a través del examen microscópico del grado de confluencia. La proliferación celular también se puede cuantificar utilizando el ensayo de incorporación de timidina descrito en la presente invención.

Por "potenciar la diferenciación de una célula" se entiende el acto de incrementar la extensión de la adquisición o posesión de una o más características o funciones que difieren de las de la células original (es decir, especialización celular). Esto se puede detectar mediante el cribado de un cambio en el fenotipo de la célula (por ejemplo, la identificación de cambios morfológicos en la célula).

Vehículos, excipientes o estabilizadores "fisiológicamente aceptable" son aquéllos que no son tóxicos a la célula o al mamífero cuando se exponen a los mismos en las dosis y concentraciones utilizadas. Frecuentemente, el vehículo fisiológicamente aceptable es una solución acuosa tamponada de pH. Entre los ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables se incluyen soluciones tampón, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico; polipéptidos de peso molecular bajo (menos de, aproximadamente, 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos, tales como Tween, Pluronics o polietilenglicol (PEG).

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "epítopo de unión al receptor natural" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) que es responsable del incremento de la vida media en el suero in vivo de la molécula de IgG. Entre los ejemplos de secuencias de epítopo de unión al receptor natural se incluyen HQNLSDGK; HQNISDGK; HQSLGTQ; VISSHLGQ; y PKNSSMISNTP.

El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población de células que actúan en otra célula como mediadoras intercelulares. Entre los ejemplos de dichas citocinas están las linfocinas, las monocinas y las hormonas de polipéptidos habituales. Entre estas citocinas se incluyen hormonas del crecimiento, tales como la hormona del crecimiento humano, la hormona del crecimiento humano N-metionilo, y la hormona de crecimiento bovino; la hormona paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas de glicoproteínas, tales como la hormona estimulante del folículo (FSH), la hormona estimulante de la tiroides (TSH), y la hormona luteinizante (LH), el factor de crecimiento hepático; el factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placental; factor \alpha y \beta de la necrosis tumoral; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a la gonadotropina de ratón: inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores neurotróficos o factores de crecimiento nervioso, tales como NGF-\beta, NT-3, NT-4, NT-6, BDNF, CNTF, GDNF, AL-1 y otros ligandos de la familia de receptores eph; factor de crecimiento de plaquetas; factores transformadores del crecimiento (TGFs), tales como TGF-\alpha y TGF-\beta; factor de crecimiento similar a la insulina tipo I y II; eritropoyetina (EPO), factores osteoinductores: interferones, tales como interferón-\alpha, -\beta, y -\gamma; factores estimulantes de colonias (CSFs), tales como macrófago-CSF (M-CSF); granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF); y granulocito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs), tales como IL-1, IL-1\alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; y otros factores de polipéptidos que incluyen LIF y ligando kit (KL). Tal y como se utiliza en la presente invención, el término citocina incluye proteínas de origen natural o de cultivos celulares recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa. También se incluyen moléculas manipuladas genéticamente con actividad de citocina, tales como TrkA-IgG u otras quimeras de receptores solubles.

El "tratamiento" se refiere tanto a un tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Las personas que tengan necesidad de tratamiento incluyen aquéllas que ya tienen el trastorno así como aquéllas en las que debe evitarse el trastorno.

"Mamífero" para los objetivos de la presente invención se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, animales de zoológico, deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, el mamífero es humano.

Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la que se puede adherir un reactivo de interés (por ejemplo, el NTNR\alpha o un anticuerpo del mismo). Entre los ejemplos de fases sólidas comprendidas en la presente invención se incluyen las formadas parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), pliacrilamidas, poliestireno, polivinil alcohol y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras es una purificación en columna (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como aquéllas descritas en la Patente de Estados Unidos No. 4.275.149.

En la presente se presentan modos para llevar a cabo la invención. El factor neurotrófico derivado de líneas de células gliales ("GDNF") y la Neurturina ("NTN") son dos factores de supervivencia potentes estructuralmente relacionados para las neuronas del sistema sensorial simpático y del nervioso central (Lin y otros, Science 260:1130-1132 (1993); Henderson y otros, Science 266:1062-1064 (1994); Buj-Bello y otros, Neuron 15:821-828 (1995); Kotzbauer y otros, Nature 384:467-470 (1996)). Mientras que el GDNF se observó que mediaba sus acciones a través de sistema receptor multicomponente compuesto de un ligando que se unía a una proteína unida a glicosil fosfatidil inositol (GPI) (denominada GDNFR\alpha) y la tirosina quinasa transmembrana Ret (Treanor y otros, Nature 382:80-83 (1996); Jing y otros, Cell 85:1113-1124 (1996); Trupp y otros, Nature 381:785-789 (1996); Durbec y otros, Nature 381:789-793 (1996)), el mecanismo mediante el cual se transmite la señal de la NTN no se había elucidado previamente. En la presente se describen el aislamiento, la secuencia y la distribución en el tejido de una proteína unida a GPI y su gen, designada como NTNR\alpha, que se observa que regula la respuesta a NTN, pero no a GDNF. En la presente se observa que está estructuralmente relacionada con GDNFR\alpha. Utilizando proteínas recombinantes en un sistema sin células, se observa que el NTNR\alpha se une a NTN (Kd \sim 10 pM) pero no a GDNF, y que NTN no se une a GDNFR\alpha con una afinidad elevada. También se muestra que las respuestas celulares a NTN requieren la presencia de NTNR\alpha. El ligando unido a NTNR\alpha induce la fosforilación del receptor tirosina quinasa Ret. Estos descubrimientos identifican Ret y NTNR\alpha, respectivamente, como componentes de señalización y de unión a ligando de un receptor para NTN y ligandos relacionados. Esto define una familia de receptores de factores neurotróficos y de diferenciación novedosa de receptores que contienen una proteína transmembrana compartida tirosina quinasa (Ret) y una proteína específica de ligando unida a GPI (NTNR\alpha).

El factor neurotrófico derivado de líneas de células gliales ("GDNF") (Lin y otros, Science, 260:1130-1132 (1993); WO 93/06116), es un factor potente de supervivencia para neuronas dopaminérgicas del cerebro medio (Lin y otros, Science, 260:1130-1132 (1993); Strömberg y otros, Exp. Neurol., 124:401-412 (1993); Beck y otros, Nature, 373:339-341 (1995); Kearns y otros, Brain Res., 672:104-111 (1995); Tomac y otros, Nature, 373:335-339 (1995)) motor espinal (Henderson y otros, Science, 266:1062-1064 (1994); Oppenheim y otros, Nature, 373:344-346 (1995); Yan y otros, Nature, 373:341-344 (1995)) y noradrenérgicas (Arenas y otros, Neuron, 15:1465-1473 (1995)), que degeneran en la enfermedad de Parkinson (Hirsch y otros, Nature, 334:345-348 (1988); Homykiewicz, Mt. Sinai J. Med., 55:11-20 (1988)), esclerosis lateral amiotrófica (Hirano, Amyotrophic Lateral Sclerosis and Other Motor Neuron Diseases, P. Rowland, ed. (Nueva York: Raven Press, Inc.) pp. 91-101 (1991)), y la enfermedad de Alzheimer (Marcynuik y otros, J. Neurol. Sci., 76:335-345 (1986); Cash y otros, Neurology, 37:42-46 (1987); Chan-Palay y otros, Comp. Neurol., 287:373-392 (1989)) respectivamente. Basados en los ratones manipulados genéticamente por la falta de GDNF, se han observado funciones biológicas adicionales para el GDNF: el desarrollo y/o supervivencia de neuronas entéricas, simpáticas y sensoriales y el sistema renal, pero no para neuronas catecolaminérgicas en el sistema nervioso central (CNS) (Moore y otros, Nature 382:76-79 (1996); Pichel y otros, Nature, 382:73-76 (1996); Sanchez y otros, Nature, 382:70-73 (1996)). A pesar de la importancia fisiológica y clínica del GDNF, poco se sabe de su mecanismo de
acción.

Los receptores de citocina se juntan frecuentemente en complejos de multisubunidades. Algunas veces, la subunidad \alpha de este complejo está implicada en la unión del factor de crecimiento cognado y la subunidad \beta puede contener una capacidad para transducir una señal a la célula. Sin limitarse a la teoría, estos receptores se han asignados a tres subfamilias dependiendo de los complejos formados. La subfamilia 1 incluye los receptores para EPO, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), interleucina-4 (IL-4), interleucina-7 (IL-7), hormona de crecimiento (GH), y prolactina (PRL). Se cree que la unión de ligando a receptores que pertenecen a esta subfamilia da lugar a la homodimerización del receptor. La subfamilia 2 incluye receptores para IL-3, factor estimulante de colonias de granulocito-macrófago (GM-CSF), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), factor inhibidor de la leucemia (LIF), oncostatina M (OSM), y factor neurotrófico ciliar (CNTF). Los receptores de la subfamilia 2 son heterodímeros que tienen una subunidad \alpha para la unión de ligando, y una subunidad \beta (la subunidad \beta compartida de los receptores de IL-3, GM-CSF, y IL-5 o bien, la subunidad gp130 de los receptores de IL-6, LIF, OSM y CNTF) para la transducción de la señal. La subfamilia 3 sólo contiene el receptor de la interleucina-2 (IL-2). Las subunidades \beta y \gamma del complejo receptor de IL-2 son polipéptidos receptores de citocina que se asocian con la subunidad \alpha del antígeno Tac no relacionado.

La presente invención se basa en el descubrimiento del NTNR\alpha, una proteína que se une a NTN con una afinidad elevada. Los experimentos descritos en la presente invención demuestran que esta molécula es un receptor que parece que juega un papel en la mediación de respuestas al NTN. En particular, se ha observado que este receptor está presente en un conjunto de poblaciones de tejidos y células, incluyendo neuronas, indicando así que los ligandos de NTN, tales como anticuerpos agonistas, se pueden utilizar para estimular la proliferación, crecimiento, supervivencia, diferenciación, metabolismo, o regeneración de células que contienen NTNR\alpha y Ret.

Las técnicas adecuadas para la producción del NTNR\alpha son bien conocidas en la técnica e incluyen el aislamiento de NTNR\alpha de una fuente endógena del polipéptido, la síntesis de péptidos (utilizando un sintetizador de péptidos) y técnicas recombinantes (o cualquier combinación de estas técnicas). La técnica preferida para la producción de NTNR\alpha es una técnica recombinante que se describirá a continuación.

La mayor parte de la siguiente descripción pertenece a la producción recombinante de NTNR\alpha mediante el cultivo de células transformadas con un vector que contiene ácido nucleico de NTNR\alpha y la recuperación de polipéptido a partir del cultivo celular. Se prevé además que el NTNR\alpha de la presente invención se pueda producir mediante recombinación homóloga, tal como se proporciona en WO 91/06667, publicada el 16 de mayo de 1991.

Brevemente, este método implica la transformación de células humanas primarias que contienen un gen que codifica el NTNR\alpha con una construcción (es decir, un vector) que comprende un gen amplificable (tal como dihidrofolato reductasa (DHFR) u otros descritos a continuación) y, como mínimo, una región flanqueante de una longitud de, como mínimo, aproximadamente, 150 pares de bases que es homólogo con una secuencia de ADN en el locus de la región codificadora del gen de NTNR\alpha para proporcionar la amplificación del gen de NTNR\alpha. El gen amplificable debe estar en un sitio que no interfiera con la expresión del gen del NTNR\alpha. La transformación se realiza de manera que la construcción se integra de forma homóloga en el genoma de las células primarias para definir una región amplificable.

A continuación, las células primarias que comprenden la construcción se seleccionan por medio del gen amplificable u otros marcadores presentes en la construcción. La presencia del gen marcador establece la presencia e integración de la construcción en el genoma huésped. No es necesario realizar una selección adicional de las células primarias, ya que la selección se realizará en el segundo huésped. Si se desea, la aparición de la recombinación homóloga se puede determinar mediante el empleo de PCR y o bien, secuenciando las secuencias de ADN amplificadas resultantes o bien, determinando la longitud apropiada del fragmento de la PCR cuando el ADN de los integrantes homólogos correctos se presentes y se expanden sólo aquellas células que contienen dichos fragmentos. También si se desea, las células seleccionadas se pueden amplificar en este punto mediante el estrés de las células con el agente de amplificación adecuado (tal como metotrexato si el gen amplificable es DHFR), de manera que se obtienen copias múltiples del gen diana. Preferiblemente, sin embargo, la etapa de amplificación no se realiza hasta después de la segunda transformación descrita a continuación.

Después de la etapa de selección, las partes de ADN del genoma, suficientemente amplia para incluir toda la región amplificable, se aíslan de las células primarias seleccionadas. A continuación, las células huésped de expresión secundaria de mamíferos se transforman con estas partes de ADN genómico y se clonan, y los clones se seleccionan de manera que contienen la región amplificable. A continuación, la región amplificable se amplifica por medio de un agente amplificante si no está ya amplificada en las células primarias. Finalmente, las células huésped de expresión secundaria que comprenden ahora copias múltiples de la región amplificable que contiene NTNR\alpha se desarrollan para expresar el gen y producir la proteína.

La conservación de la estructura y la secuencia del NTNR\alpha de mamífero y la elucidación de la secuencia de ADNc que codifica el receptor de rata y ratón, así como secuencias humanas descritas en la presente, posibilitan la clonación de secuencias de genes de otros mamíferos que codifican el NTNR\alpha. De particular interés para la presente invención es la capacidad para clonar moléculas de NTNR\alpha humanas que utilizan las secuencias descritas en la presente. El ADN que codifica el NTNR\alpha se puede obtener de cualquier biblioteca de ADNc preparada de tejido que se cree que posee el ARNm de NTNR\alpha y que lo expresa a un nivel detectable, tal y como se muestra en la presente en los Ejemplos. Por consiguiente, el ADN de NTNR\alpha se puede obtener de forma práctica de una biblioteca de ADNc preparada, por ejemplo, a partir de hígado, cerebro, músculo, intestino y nervios periféricos de feto de mamífero. El gen que codifica NTNR\alpha también se puede obtener de una biblioteca genómica o mediante síntesis de oligonucleótidos.

Las bibliotecas se criban con sondas (tales como anticuerpos al NTNR\alpha u oligonucleótidos de aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por ella. Se puede realizar el cribado de la biblioteca de ADNc o genómica con la sonda seleccionada utilizando procedimientos estándar, tal y como se describe en los capítulos 10-12 de Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el NTNR\alpha es utilizar la metodología PCR, tal y como se describe en la sección 14 de Sambrook y otros, ver anteriormente.

Un procedimiento preferido para realizar esta invención es utilizar cuidadosamente secuencias de oligonucleótidos seleccionadas para cribar bibliotecas de ADNc de varios tejidos humanos, preferiblemente hígado de feto humano. Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberían tener la suficiente longitud y ser suficientemente inequívocas que se minimizan los falsos positivos. Las secuencias preferidas se obtienen del NTNR\alpha natural descrito en la presente.

El oligonucleótido debe marcarse de manera que se puede detectar tras la hibridación a ADN en la biblioteca que se criba. El procedimiento preferido de marcaje es la utilización de ATP marcado con ^{32}P con polinucleótido quinasa, tal y como es conocido en la técnica, para radiomarcar el oligonucleótido. Sin embargo, se pueden utilizar otros procedimientos para marcar el oligonucleótido, que incluye, pero no se limita a, biotinilación o marcaje con enzimas.

Las variantes de las secuencias de aminoácidos de NTNR\alpha se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN de NTNR\alpha, o mediante la síntesis del polipéptido de NTNR\alpha deseado. Dichas variantes representan inserciones, sustituciones, y/o deleciones específicas de residuos en el interior o en uno o ambos extremos de la secuencia de aminoácidos de un NTNR\alpha natural, tal como el NTNR\alpha mostrado en las figuras 1A-1B o 2A-2B o secuencias descritas en la presente. Preferiblemente, estas variantes representan inserciones y/o sustituciones en el interior o en uno o ambos extremos de la secuencia madura, y/o inserciones, sustituciones y/o deleciones específicas en el interior o en uno o ambos extremos de la secuencia señal del NTNR\alpha. Se realiza cualquier combinación de inserción, sustitución, y/o deleción específica para llegar a la construcción final, con la condición de que la construcción final posea la actividad biológica deseada tal y como se define en la presente. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos post-translacionales del NTNR\alpha, tales como el cambio en el número o la posición de los sitios de glicosilación, la alteración de las características de anclaje a las membranas, y/o la alteración de la localización celular del NTNR\alpha mediante la inserción, deleción, o, de otra manera, afectar la secuencia principal del NTNR\alpha.

Las variaciones en la secuencia nativa, tal y como se ha descrito anteriormente, se puede realizar utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservativas y no conservativas establecidas en la Patente de Estados Unidos No. 5.364.934. Éstas incluyen mutagénesis (sitio-dirigida) mediada por oligonucleótidos, barrido de alanina, y mutagénesis por PCR. Véase también, por ejemplo, La Tabla 1 de la misma y los comentarios referidos a la tabla para guiar en la selección de los aminoácidos a cambiar, añadir o eliminar.

El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica el NTNR\alpha se inserta en un vector replicable para la posterior clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Hay muchos vectores disponibles. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción.

Los NTNR\alphas de esta invención se pueden producir de forma recombinante no sólo de forma directa, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de división específico en el N-terminal de la proteína o el polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN de NTNR\alpha que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es una que es reconocida y procesada (es decir, dividida por una peptidasa señal) mediante la célula huésped. Para células huésped procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal del NTNR\alpha nativo, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina II estable al calor principales. Para la secreción de levadura, la secuencia señal nativa se puede sustituir por, por ejemplo, la la invertasa de la levadura principal, factor a principal (incluyendo los factores a principales de Saccharomyces y Kluyveromyces, el último descrito en la Patente de Estados Unidos No. 5.010.182, registradas en 23 de abril de 1991), o fosfatasa ácida principal, la C. Albicans glucoamilasa principal (EP 362.179 publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en WO 90/13646 publicada el 15 de noviembre de 1990. En la expresión de células de mamíferos la secuencia señal nativa (por ejemplo, la presecuencia de NTNR\alpha que normalmente dirige la secreción de NTNR\alpha de células humanas in vivo) es satisfactoria, a pesar de que otras secuencias señal de mamíferos pueden ser adecuadas, tales como secuencias señal de NTNR\alphas de otros animales, y las secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma o especies relacionadas, así como los secretores virales principales, por ejemplo, la señal gD del herpes simples.

El ADN para la región del precursor está unido en marco de lectura al ADN que codifica el NTNR\alpha maduro o una variante soluble del mismo.

Los vectores de expresión y clonación contiene una secuencia de ácido nucleico que permite la replicación del vector en una o más de las células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomas. Dichas secuencias son conocidas para un conjunto de bacterias, levaduras y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativa, el origen del plásmido 2 \mu es adecuado para levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos. Generalmente, el origen del componente de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamíferos (el origen SV40 se puede utilizar habitualmente sólo porque contiene el promotor inicial).

La mayoría de vectores de expresión son vectores "lanzadera", es decir, son capaces de replicarse en por lo menos una clase de organismos pero se puede transfectar en otro organismo para la expresión. Por ejemplo, un vector se clona en E. coli y, a continuación, el mismo vector se transfecta en células de levadura o mamíferos para la expresión aunque no es capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula huésped.

El ADN también se puede amplificar mediante la inserción en el genoma huésped. Esto se realiza fácilmente utilizando especies Bacillus como huéspedes, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de ADN que es complementaria a una secuencia del ADN genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector da lugar a una recombinación homóloga con el genoma y la inserción de ADN del NTNR\alpha. Sin embargo, la recuperación de ADN genómico que codifica el NTNR\alpha es más compleja que la de un vector replicado de forma exógena porque la digestión del enzima de restricción es necesaria para eliminar el ADN del NTNR\alpha.

Los vectores de expresión y clonación deberían contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células huésped transformadas desarrolladas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección habituales que codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complemento de deficiencias auxotróficas o (c) suministrar nutrientes críticos no disponibles de los medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para parar el crecimiento de una célula huésped. Estas células que se transforman satisfactoriamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere una resistencia a fármacos y sobrevive así a la pauta de selección. Entre los ejemplos de dicha selección dominante se utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son las que permiten la identificación de células competentes para adquirir el ácido nucleico del NTNR\alpha, tal como DHFR o timidina quinasa. Los trasnformantes de células de mamíferos se colocan bajo presión de selección que sólo los transformantes se pueden adaptar para sobrevivir por el hecho de adquirir el marcador. La presión de selección se impone mediante el cultivo de los transformantes en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio se cambia satisfactoriamente, conduciendo así a una amplificación del gen de selección y el ADN que codifica el NTNR\alpha. La amplificación es el proceso por el cual los genes con una mayor demanda para a producción de una proteína crítica para el crecimiento se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Se sintetizan cantidades crecientes de NTNR\alpha a partir del ADN amplificado. Otros ejemplos de genes amplificables incluyen metalotioneina I y II, preferiblemente genes de metalotionenina, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc. Un sistema de vector preferido se proporciona en la Patente de Estados Unidos No. 5.561.053.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotreaxto (Mtx), una antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea de células de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR preparada y propagada tal y como se describe en Urlaub y otros, Proc. Natl, Acad. Sci. USA 88:4216 (1980). Las células transformadas se exponen a niveles crecientes de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen de DHFR, y concomitantemente, copias múltiples de otro ADN que comprende los vectores de expresión, tales como el ADN que codifica NTNR\alpha. Esta técnica de amplificación se puede utilizar con cualquier otro huésped adecuado, por ejemplo, ATCC No. CCL61 CHO-K1, a pesar de la presencia de DHFR endógeno si, por ejemplo, se utiliza un gen de DHFR mutante que altamente resistente a Mtx (EP 117.060).

Alternativamente, las células huésped (particularmente los huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican NTNR\alpha, proteína de DHFR de tipo salvaje, y otro marcador seleccionable, tal como aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH) se pueden seleccionar mediante el crecimiento celular en un medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, canamicina, neomicina o G418. Ver Patente de Estados Unidos No.4.965.199

Un gen de selección adecuado para su utilización en levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRrp (Stinchcomb y otros, Nature, 282:39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que no tiene la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones. Genetics, 85:12 (1977). La presencia de lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona a continuación un ambiente eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura deficientes de Leu2 (ATCC 20,622 ó 38,626) están complementados por plásmidos conocidos que llevan el gen Leu2.

Además, los vectores derivados del plásmido circular de 1,6 \mum pKD1 se puede utilizar para la transformación de levaduras de Kluyveromyces. Bianchi y otros, Curr. Genet., 12:185 (1987). Más recientemente, se describió un sistema de expresión para la fabricación a gran escala de quimosina de ternera recombinante para K. lactis. Van den Berg, Biol. Technology, 8:135 (1990). También se han descrito vectores de expresión multicopias estables para la secreción de albúmina de suero humano maduro recombinante mediante cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer y otros, Biol. Technology, 9:968-975 (1991).

Los vectores de expresión y clonación contienen habitualmente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está unido operablemente al ácido nucleico de NTNR\alpha. Los promotores son secuencias no traducidas localizadas en dirección 5' con respecto al codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pares de bases) que controlan la transcripción y la traducción de la secuencia particular de ácidos nucleicos, tal como la secuencia de ácidos nucleicos de NTNR\alpha, a la que están operablemente unidos. Dichos promotores se dividen habitualmente en dos clases, inducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician mayores niveles de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algunos cambios en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Actualmente se conocen un gran número de promotores reconocidos por un conjunto de células huésped potenciales. Estos promotores se unen operablemente al ADN que codifica el NTNR\alpha eliminando del promotor de la fuente de ADN mediante la digestión de la enzima de restricción e insertando la secuencia del promotor aislado en el vector. La secuencia del promotor de NTNR\alpha nativo y muchos promotores heterólogos se pueden utilizar para la amplificación directa y/o expresión del ADN de NTNR\alpha. Sin embargo, se prefieren los promotores heterólogos, ya que generalmente permiten una mayor transcripción y rendimientos más elevados de NTNR\alpha en comparación con el promotor de NTNR\alpha nativo.

Entre los promotores adecuados para su utilización con huéspedes procarióticos se incluyen los sistemas de promotores de \beta-lactamasa y lactosa (Chang y otros, Nature, 275:615 (1978); Goeddel y otros, Nature, 281:544 (1979)), fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776), y promotores híbridos, tales como el promotor tac, deBoer y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 80:21-25 (1983). Sin embargo, otros promotores bacterianos conocidos son adecuados. Se han publicado sus secuencias de nucleótidos, permitiendo así a un trabajador experto ligarlo operablemente a ADN que codifica el NTNR\alpha (Siebenlist y otros, Cell, 29:269 (1980)) utilizando enlazadores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Delgamo (S.D.) unida operablemente al ADN que codifica el NTNR\alpha.

Las secuencias de promotores son conocidas para los eucariotas. Prácticamente todos los genes eucarióticos en la región rica en AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases en dirección 5' desde el sitio en el que se inicia la transcripción. Se observó que otra secuencia de 70 a 80 bases en dirección 5' desde el inicio de la transcripción de muchos genes es una región CXCAAT en la que X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucarióticos es una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola de poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en los vectores de expresión eucarióticos.

Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su utilización con huéspedes de levadura se incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y otros, J. Biol. Chem. 255:2073 (1980)) u otras enzimas glicolíticas (Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), tales como enolasa, gliceeraldehido-3-fosfato deshidrogenada, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones de promotores para alcohol deshidrogenada 2, isocitocromo C, ácido fosfatasa, enzimas degradativas asociados con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenada, y enzimas responsables para la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su utilización en la expresión de la levadura se describen adicionalmente en EP 73.657. Los potenciadores de la levadura se utilizan ventajosamente con promotores de levadura.

La transcripción de NTNR\alpha desde vectores en células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus, tales como virus polioma, virus fowlpox (Reino Unido 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como, Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y más preferiblemente Simian Virus 40 (SV40), de los promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulinas, de los promotores de los golpes de calor, y de los promotores asociados normalmente con la secuencia para el NTNR\alpha, con la condición que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Los promotores iniciales y finales del virus SV40 se obtienen de forma práctica como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen viral SV40 de replicación. Fiers y otros, Nature, 273:113 (1978); Mulligan y otros, Science, 209:1422-1427 (1980); Pavlakis y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 78:7398-7402 (1981. El promotor inicial inmediato del citomegalovirus humano se obtiene de forma práctica como un fragmento de restricción Hindi E. Greenaway y otros, Gene, 18:355-360 (1982). En la Patente de Estados Unidos No. 4.419.446 se da a conocer un sistema para la expresión de ADN en huéspedes de mamíferos utilizando el virus del papiloma bovino como un vector. En la Patente de Estados Unidos No. 4.601.978 se describe una modificación de este sistema. Ver también Gray y otros, Nature, 295:503-508 (1982) en la expresión de ADNc que codifica el interferón inmune en células de mono; Reyes y otros, Nature, 297:598-601 (1982) en la expresión de ADNc de interferón \beta humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus de herpes simples; Canaani y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 79:5166-5170 (1982) en la expresión del gen del interferón \beta1 humano en células cultivadas de ratón y conejo; y Gorman y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 79:6777-6781 (1982) en la expresión de secuencias de CAT bacteriana en células de riñón de mono CV-1, fibroblastos de embriones de pollo, células de ovario de hámster chino, células HeLa, y células NIH-3T3 de ratón utilizando la repetición terminal larga del virus de sarcoma Rous como promotor.

La transcripción de un ADN que codifica el NTNR\alpha de esta invención por eucariotas superiores aumenta frecuentemente mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en cis del ADN, habitualmente aproximadamente de 10 a 300 pares de bases, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientación y la posición, encontrándose en dirección 5' (Laimins y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 78:993 (1981)) y dirección 3' (Lusky y otros, Mol. Cell. Bio., 3:1108 (1983)) con respecto a la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji y otros, Cell, 33:729 (1983)), así como dentro de la propia secuencia de codina. Osborne y otros, Mol. Cell. Bio., 4:1293 (1984). Muchas secuencias potenciadotas se conocen actualmente a partir de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Habitualmente, sin embargo, se utilizará un potenciador de un virus de célula eucariótica. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador de SV40 en la cara final del origen de la replicación (pares de bases 100-270), el potenciador del promotor inicial de citomegalovirus, el potenciador de polioma en la cara final del origen de la replicación y potenciadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) en elementos potenciadores para la activación de eucarióticos localizados preferiblemente en el sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Dichas secuencias están disponibles habitualmente a partir de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente, 3' de ADNs o ADNcs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica el NTNR\alpha.

\newpage

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más componentes enumerados anteriormente utiliza técnicas de unión estándar. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se dividen, se adaptan y se reúnen en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para los análisis de confirmación de las secuencias correctas en plásmidos construidos, se utilizan la mezcla de uniones para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31.446) y transformantes satisfactorios seleccionados por la resistencia a ampicilina o tetraciclina según el caso. Los plásmidos de los transformantes se preparan, se analizan mediante la digestión de endonucleasa de restricción, y/o se secuencian mediante el método de Messing y otros, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981) o mediante el método de Maxam y otros, Methods in Enzymology, 65:499 (1980).

En la práctica de la presente invención son particularmente útiles los vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria en células de mamíferos de ADN que codifica NTNR\alpha. En general, la expresión transitoria implica la utilización de un vector de expresión que es capaz de replicarse de forma eficaz en una célula huésped, de manera que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Sambrook y otros, ver anteriormente, pp. 16.17-16.22. Los sistemas de expresión transitorios, que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula huésped, permiten la identificación positiva conveniente de polipéptidos codificados por ADNs clonados, así como el cribado rápido de dichos polipéptidos para propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. De este modo, los sistemas de expresión transitorios son particularmente útiles en la invención con el objetivo de identificar análogos y variantes de NTNR\alpha que son NTNR\alpha biológicamente activos.

Otros métodos, vectores y células huésped adecuadas para su adaptación a la síntesis de NTNR\alpha en el cultivo de células de vertebrados recombinante se describen en Gething y otros, Nature, 293:620-625 (1981); Mantel y otros, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117.060; y EP 117.058. Un plásmido particularmente útil para la expresión de NTNR\alpha en el cultivo de células de mamíferos es pRK5 (EP 307.247) o pSV16B. WO 91/08291, publicada el 13 de junio de 1991.

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de la presente invención son células procariotas, levaduras o células eucariotas superiores descritas anteriormente. Entre las procariotas adecuadas para este objetivo se incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativo o Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriaceas, tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia morcescans, y Shigella, así como Bacilli, tal como B. subtilis y B. licheniformes (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266.710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Un E. coli preferido que clona el huésped es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque son adecuadas otras cepas, tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC27.325). Estos ejemplos son más ilustrativos que limitantes. La cepa W3110 es un huésped o huésped original particularmente preferido porque es una cepa de huésped común para fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para realizar una mutación genética en los genes que codifican proteínas, con ejemplos de dichos huéspedes que incluyen la cepa 27C7 de E. coli W3110. El genotipo completo de 27C7 es tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15 \Delta(argF-Iac)169 ompT\Delta degP41kan^{r}. La cepa 27C7 se depositó el 30 de octubre de 1991 en la American Type Culture Collection como ATCC No. 55.244. Alternativamente, se puede utilizar la cepa de E. coli que tiene una proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente de Estados Unidos No. 4.946.783 publicada el 7 de agosto de 1990. Aún alternativamente, son adecuados procedimientos de clonación, por ejemplo, PCR u otras reacciones de polimerasa de ácidos nucleicos.

Además de las procariotas, los microbios eucarióticos, tales como los hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión para vectores que codifican NTNR\alpha. La Saccharomyces cerevisae, o levadura de panadero común, es el más utilizado habitualmente entre los organismos huésped eucarióticos inferiores. Sin embargo, un cierto número de otros géneros, especies, y cepas están disponibles habitualmente y son útiles en la presente invención, tales como Schizosaccharomyces pombe (Beach y otros, Nature, 290:140 (1981); EP 139.383, publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes de Kluyveromyces (Patente de Estados Unidos No. 4.943.529, Fleer y otros, ver anteriormente), tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt y otros, J Bacterial., 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg y otros, ver anteriormente), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna y otros, J. Basic Microbiol. 28:265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)); Schwanniomyces, tales como Schwanniomyces occidentales (EP 394.538 publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus, tales como A. nidulans (Ballance y otros, Biochem. Biophys. Res. Común., 112:284-289 (1983); Tilburn y otros, Gene, 26:205-221 (1983); Yelton y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)) y A. Níger, Nelly y otros, EMBO J., 4:475-479 (1985).

Las células huésped para la expresión de NTNR\alpha glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Dichas células huésped son capaces de actividades de procesado y glicosilación complejas. En principio, se puede trabajar con cualquier cultivo celular eucariótico superior, ya sea un cultivo de vertebrados o invertebrados. Entre los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas baculovirales y variantes y las correspondientes células huésped de insectos permisivas de huéspedes, tales como Spodoptera frugiperda (óruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bómbix mori. Ver, por ejemplo, Luckow y otros, Biol. Technology, 6:47-55 (1988); Millar y otros, en Genetic Engineering, Setlow y otros, eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; y Maeda y otros, Nature, 315:592-594 (1985). Un conjunto de cepas virales para la transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bómbix mori NPV, y se pueden utilizar dichos virus como los virus de la presente según la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células de plantas de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco se pueden utilizar como huéspedes. Habitualmente, las células de plantas se transfectan mediante incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que se ha manipulado previamente para que contenga el ADN que codifica el NTNR\alpha. Durante la incubación del cultivo de las células de plantas con A. tumefaciens, el ADN que codifica el NTNR\alpha se transfiere a la célula huésped de la planta de manera que es transfectado y expresará, en condiciones adecuadas, el ADN que codifica el NTNR\alpha. Además, están disponibles las secuencias reguladoras y de señal compatibles con las células de las plantas, tales como las secuencias del promotor de la nopalina sintasa y de señal de poliadenilación. Depicker y otros, J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982). Además, los segmentos de ADN aislados se la región en dirección 5' del gen T-ADN 780 son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de los genes expresables en plantas en tejido de planta que contiene ADN recombinante. EP 321.196 publicada el 21 de junio de 1989.

Sin embargo, ha habido un mayor interés en células de vertebrados, y la propagación de las células de vertebrados en cultivos (tejido de cultivo) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Ver, por ejemplo, Tissue Culture. Academia Press, Kruse y Patterson, editores (1973). Algunos ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, Gram. y otros, J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK. ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino-DHFR (CHO, Urlaub y otros, Proc. NAtl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod, 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono africano verde (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, aTCC CCl2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCl34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, aTCC CCl75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562. ATCC CCL51); células TRI (Mather y otros, Annais N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (9182)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hematoma humano (Hep G2).

Las células huésped se transfectan y preferiblemente se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de NTNR\alpha y se cultiva en un medio nutriente habitual modificado para que sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

La transfección se refiere a la captación de un vector de expresión por una célula huésped tanto si en realidad se expresa o no cualquier secuencia de codificación. Los expertos en la materia conocen numerosos procedimientos de transfección, por ejemplo, CaPO_{4} y electroporación. Una transfección satisfactoria se reconoce generalmente cuando aparece cualquier indicación de la operación de este vector en el interior de la célula huésped.

La transformación significa la introducción de ADN en un organismo de manera que el ADN es replicable, como un elemento extracromsómico o mediante un integrante cromosómico. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se realiza utilizando técnicas estándar apropiadas para dichas células. El tratamiento con calcio que utiliza cloruro cálcico, tal y como se describe en la sección 1.82 de Sambrook y otros, ver anteriormente, o la electroporación se utilizan generalmente para la transformación de ciertas células de plantas, tal y como se describe en Shaw y otros, Gene, 23:315 (1983) y la WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Además, las plantas se pueden transfectar utilizando un tratamiento con ultrasonidos tal y como se describe en la WO 91/00358 publicada el 10 de enero de 1991.

Para las células de mamíferos sin dichas paredes celulares, se prefiere el método de precipitación con fosfato cálcico de Graham y otros, Virology, 52:456-457 (1978). En la Patente de Estados Unidos No. 4.399.216 registrada el 16 de agosto de 1983 se han descrito los aspectos generales de las transformaciones de las células huésped de mamíferos. Las transformaciones en levaduras se llevan a cabo según el método de Van Solingen y otros, J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979). Sin embargo, también se pueden utilizar otros métodos para introducir el ADN en células, tales como mediante microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacteriales con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina, etc. Para varias técnicas para transformar células de mamíferos, ver Keown y otros, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Manssur y otros, Nature, 336:348-352 (1988).

Las células procarióticas utilizadas para producir el polipéptido NTNR\alpha de esta invención se cultivan en un medio adecuado tal y como se describe generalmente en Sambrook y otros, ver anteriormente.

Las células huésped de mamíferos utilizadas para producir el NTNR\alpha de esta invención se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles, tales como F10 de Ham (Sigma), Medio Esencial Medio ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio del Águila Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma), son adecuados para el cultivo de células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y otros, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes y otros, Anal. Biochem., 102:255 (1980), Patente de Estados Unidos Nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655 ó 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; o la Patente de Estados Unidos Re. 30.985 se puede utilizar como medio de cultivo para células huésped. Cualquiera de estos medios se puede complementar si es necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como, cloruro sódico, y fosfato cálcico, magnésico), soluciones tampón (tal como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes el concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro complemento necesario también se puede incluir en concentraciones adecuadas que serían conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH, y similares, son las utilizados previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán evidente para el técnico habitual en la materia.

En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos de células de mamíferos se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991).

Las células huésped descritas en esta invención abarcan células en cultivos así como células que están en el interior de una animal huésped.

La amplificación y/o expresión de genes se puede medir en una muestra de una manera directa, por ejemplo, mediante un "Southern blotting", "Northern blotting" convencionales para cuantificar la transcripción de ARNm
(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), "dot blotting" (análisis de ADN), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada apropiada, basada en las secuencias proporcionadas en la presente. Se pueden utilizar varios marcadores, más habitualmente radioisótopos, particularmente ^{32}P. Sin embargo, también se pueden utilizar otras técnicas, tales como la utilización de nucleótidos modificados por biotina para la introducción en un polinucleótido. A continuación, la biotina sirve como el sitio para la unión a avidina o anticuerpos, que pueden estar marcados con una gran variedad de marcadores, tales como radionúcleos, fluorescentes, enzimas y similares. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, dúplex de híbridos de ADN-ARN o dúplex de ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden estar marcados y el ensayo se puede llevar a cabo cuando el dúplex está unido a una superficie de manera que, tras la formación del dúplex en la superficie, se puede detectar la presencia de un anticuerpo unido al dúplex.

La expresión de genes, alternativamente, se puede medir mediante métodos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y el ensayo de cultivos celulares o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del gen producto. Con las técnicas de tinción inmunohistoquímica, se prepara una muestra de células, habitualmente por deshidratación y fijación, seguido de la reacción con anticuerpos específicos marcados para el gen producto acoplado, donde los marcadores son habitualmente detectables de forma visible, tales como marcadores enzimáticos, marcadores fluorescentes, marcadores luminiscentes, y similares. Una técnica de tinción particularmente sensible adecuada para la utilización en la presente invención se describe por Hsu y otros, Am. J. Clin. Path., 75:734-738 (1980).

Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de fluidos de muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden preparar tal y como se describen en la presente.

El NTNR\alpha (por ejemplo, NTNR\alpha ECD) preferiblemente se recubre del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque se puede recubrir a partir de lisatos de células huésped. Si el NTNR\alpha está unido a membrana, se puede liberar de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo, Triton-X 100).

Cuando se produce el NTNR\alpha en una célula recombinante diferente de la de origen humano, el NTNR\alpha está completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar el NTNR\alpha de proteínas o polipéptidos de células recombinantes para obtener preparaciones que son sustancialmente homogéneas a las de NTNR\alpha. Como primera etapa, el medio de cultivo o lisato se puede centrifugar para eliminar los detritos de células particuladas. A continuación, el NTNR\alpha se puede purificar a partir de proteínas o polipéptidos solubles contaminantes con los siguientes procedimientos, que son ejemplos de procedimientos de purificación adecuados: por fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice; "cromatofocusing"; inmunoafinidad; resina de unión a epítopo-tag; SDS-PAGE; precipitación con sulfato amónico; filtración con gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; y columnas de proteína A Sepharosa para eliminar contaminantes, tales como IgG.

Las variantes de NTNR\alpha en las que se ha eliminado, insertado o sustituidos residuos se recuperan de la misma manera que el NTNR\alpha de secuencia nativa, teniendo en cuenta cualquier cambio sustancial en las propiedades ocasionado por la variación. Las resinas de inmunoafinidad, tales como una resina anti-NTNR\alpha monoclonal, se pueden utilizar para absorber la variante de NTNR\alpha mediante su unión a por lo menos un epítopo remanente.

También se puede utilizar un inhibidor de proteasa, tal como fluoruro de fenol metil sulfonilo (PMSF), para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes accidentales.

Las modificaciones covalentes de los polipéptidos NTNR\alpha se incluyen en el alcance de la presente invención. Tanto el NTNR\alpha de secuencia nativa como las variantes en la secuencia de aminoácidos de NTNR\alpha se pueden modificar covalentemente. Un tipo de modificación covalente del NTNR\alpha se introduce en la molécula mediante la reacción de residuos de aminoácidos del NTNR\alpha marcados con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con el residuo N-terminal, el residuo C-terminal o con cadenas laterales seleccionadas.

Los residuos de cisteinilo reaccionan más habitualmente con \alpha-haloacetatos (y las correspondientes aminas), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para obtener derivados de carboximetilo o catboxiamidometilo. Los residuos de cisteína también se derivatizan mediante la reacción con bromotrifluoroacetona, ácido \alpha-bromo-\beta-(5-imidozoil) propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilamidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de metil-2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuro-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos de histidilo se derivatizan mediante la reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. También es útil es el bromuro de para-bromofenacilo; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos lisinilo y amino terminales reaccionan anhídridos de ácido succínico u otros ácidos carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Entre otros agentes adecuados para la derivatización de residuos que contienen \alpha-aminos se incluyen imidoésteres, tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea, 2,4-pentanodiona y la reacción catalizada por transaminasas con glioxilato.

Los residuos de arginilo se modifican mediante la reacción con uno o varios agentes convencionales, entre ellos el fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La redivatización de residuos de arginina requiere que la reacción se lleve a cabo bajo condiciones alcalinas debido al elevado pK_{a} del grupo funcional guanidina. Además, estos agentes pueden reaccionar con los grupos de lisina así como con el grupo epsilón-amino de arginina.

La modificación específica de residuos de tirosilo se puede realizar, con particular interés en la introducción de marcadores espectrales en residuos de tirosilo mediante la reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Más habitualmente, el N-acetilimidazaol y el tetranitrometano se utilizan para formar especies O-acetil tirosilo y 3-nitro derivados, respectivamente. Los residuos de tirosilo se yodan utilizando ^{125}I o ^{131}I para preparar proteínas marcadas para su utilización en radioinmunoensayos, siendo adecuado el método de la cloramina T.

Los grupos laterales de carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente mediante la reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R'), en las que R y R' son grupos alquilo diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten en residuos de asparaginilo y glutaminilo mediante la reacción con iones amonio.

La derivatización con agentes bifuncionales es útil para reticular NTNR\alpha con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su utilización en el procedimiento para purificar anticuerpos anti-NTNR\alpha, y viceversa. Entre los agentes de reticulación utilizados habitualmente se incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo, tales como 3,3'-ditiobis(succinimilpropionato), y maleimidas bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes derivatizantes, tales como metil-3-((p-azidofenil)ditio)propioimidato, producen intermedios fotoactivables que son capaces de formar reticulaciones en presencia de la luz. Alternativamente, para la inmovilización de proteínas se utilizan matrices reactivas insolubles en agua, tales como carbohidratos activados por bromuro de cianógeno y los sustratos reactivos descritos en las Patentes de Estados Unidos Nos. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537 y 4.330.440.

Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan frecuentemente hasta los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente. Estos residuos de desamidan en condiciones básicas o neutras. La forma desanidada de estos residuos entra dentro del alcance la presente invención.

Entre otras modificaciones se incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co. San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido NTNR\alpha incluido dentro del alcance de la presente invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativo del polipéptido. La alteración significa eliminar uno o más partes de carbohidratos que se encuentran en el NTNR\alpha nativo y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el NTNR\alpha nativo.

La glicosilación de péptidos es habitualmente por unión a N o a O. La unión a N se refiere a la unión de la parte de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de los tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en los que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la parte de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De este modo, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación por unión a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido hidroxilamino, más habitualmente serina o treonina, aunque también se pueden utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al polipéptido NTNR\alpha se realiza convenientemente mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos de manera que contiene uno o más de las secuencias de tripéptidos mencionadas anteriormente (para los sitios de glicosilación por unión a N). La alteración también se puede realizar mediante la adición de, o sustitución mediante, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia nativa de NTNR\alpha (para los sitios de glicosilación de unión a O). Por facilidad, las secuencias de aminoácidos de NTNR\alpha se alteran preferiblemente a través de cambios a nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido NTNR\alpha en las bases preseleccionadas de manera que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados. La mutación o mutaciones de ADN se pueden realizar utilizando procedimientos descritos anteriormente y en la Patente de Estados Unidos No. 5.364.934, ver anteriormente.

Otro medio para incrementar el número de partes de carbohidrato en el polipéptido NTNR\alpha es mediante acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Estos procedimientos son ventajosos en tanto en cuanto no requieren de la producción del polipéptido en una célula huésped que tiene capacidad de glicosilación para la glicosilación por unión a N u O. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el azúcar o azúcares se pueden unir a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres, tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres, tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos, tales como los del fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos procedimientos se describen en WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987 y en Aplin y otros, CRC. Crit. Rev. Biochem., 259-306 (1981).

La eliminación de partes de carbohidratos presentes en el polipéptido NTNR\alpha se puede llevar a cabo de forma química o enzimática. La desglicosilación química requiere la exposición del polipéptido al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da lugar a la división de la mayoría o todos los azúcares excepto del azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando el polipéptido intacto. La desglicosilación química se describe en Hakimuddin y otros, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y en Edge y otros, Anal. Biochem., 118:131 (1981). La división enzimática de partes de carbohidratos en polipéptidos se pueden conseguir mediante la utilización de una variedad de endo- y exo-glicosidasas tal y como se describe en Thotakura y otros, Meth. Enzymol., 138:350 (1987).

La glicosilación en los puntos de glicosilación potenciales se pueden evitar mediante la utilización del compuesto tunicamicina tal y como se describe en Duskin y otros, J. Biol. Chem., 257:3105 (1982). La tunicamicina bloquea la formación de las uniones proteína-N-glicósido.

Otro tipo de modificación covalente de NTNR\alpha comprende la unión del polipéptido NTNR\alpha a uno de una variedad polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, o polioxialquilenos, en la manera establecida en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4,670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.

Se pueden ensayar variantes tal y como se enseña en la presente. Un cambio en el carácter inmunológico de la molécula NTNR\alpha, tal como la afinidad por un anticuerpo determinado, se puede medir mediante un inmunoensayo del tipo competitivo. Otras modificaciones potenciales de las propiedades de la proteína o polipéptido, tales como la estabilidad redox o térmica, hidrofobicidad, susceptibilidad a degradación proteolítica, o la tendencia a agregarse con portadores o en multímeros se ensayan mediante métodos conocidos en la técnica.

Esta invención abarca polipéptidos quiméricos que comprenden NTNR\alpha fusionado a un polipéptido heterólogo. Un NTNR\alpha quimérico es un tipo de variante de NTNR\alpha tal y como se ha definido en la presente. En una realización preferida, el polipéptido quimérico comprende una fusión del NTNR\alpha con polipéptido "tag" que proporciona un epítopo al que se puede unir selectivamente un anticuerpo o molécula anti-tag. El epítopo-tag se proporciona generalmente en los extremos amino o carboxilo del NTNR\alpha. Dichas formas de epítopo-tag del NTNR\alpha son deseables, ya que la presencia de las mismas se puede detectar utilizando un anticuerpo marcado contra el polipéptido "tag". Además, la disposición de epítopo-tag permite que se pueda purificar fácilmente el NTNR\alpha mediante purificación por afinidad utilizando el anticuerpo anti-tag. Las técnicas de purificación por afinidad y diagnósticos de ensayo que implican anticuerpos se describen posteriormente en la presente.

Los polipéptidos "tag" y sus respectivos anticuerpos son conocidos en la técnica. Entre los ejemplos se incluyen el polipéptido "tag" HA de la gripe y su anticuerpo 12CA5 (Field y otros, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)); el tag c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E19 del mismo (Evan y otros, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)); y el tag de la gliproteína G (gD) del virus del Herpes Simples y su anticuerpo. Paborsky y otros, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990). Se han descrito otros polipéptidos "tag". Entre los ejemplos se incluyen péptido Flag (Hopp y otros, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)); el péptido con epítopo de KT3 (Martin y otros, Science, 255:192-194 (1992)); un péptido con epítopo de \alpha-tubulina (Skinner y otros, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)); y el tag del péptido de la proteína 10 del gen T7. Lutz-Freyermuth y otros, Proc. Natl. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990). Una vez se ha seleccionado el polipéptido "tag", se puede generar un anticuerpo al mismo utilizando las técnicas descritas en la presente. Se prefiere un tag de secuencia de poli-histidina C-terminal. Las secuencias de poli-histidina permiten el aislamiento de la proteína con tag mediante cromatografía Ni-NTA tal y como se describe (Lindsay y otros, Neuron 17:571-574 (1996)), por ejemplo.

Los procedimientos generales adecuados para la construcción y producción de NTNR\alpha con tag en el epítopo son los mismos que los descritos anteriormente en la presente. Las fusiones NTNR\alpha-polipéptido "tag" se construyen de forma más conveniente mediante la fusión de la secuencia de ANDc que codifica la parte de NTNR\alpha en el marco a la secuencia de ADN de polipéptido "tag" y la expresión de la construcción de fusión con ADN resultante en células huésped apropiadas. Habitualmente, cuando se prepararan las quimeras de NTNR\alpha-polipéptido "tag" de la presente invención, el ácido nucleico que codifica el NTNR\alpha se fusionará en su extremo 3' al ácido nucleico que codifica el N-terminal del polipéptido "tag", aunque también son posibles las fusiones 5'.

El NTNR\alpha etiquetado en el epítopo se puede purificar convenientemente mediante cromatografía de afinidad utilizando el anticuerpo anti-tag. La matriz a la que se une el anticuerpo de afinidad se frecuentemente agarosa, pero hay otras matrices disponibles (por ejemplo, vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno). El NTNR\alpha etiquetado en el epítopo se puede eluir de la columna de afinidad variando el pH tampón o la fuerza iónica o mediante la adición de agentes caotrópicos, por ejemplo.

Las quimeras construidas a partir de la secuencia de un receptor unida a una secuencia de dominio constante de una inmunoglobulina apropiada (inmunoadhesinas) son conocidas en la técnica. Entre las inmunoadhesinas descritas en la literatura se incluyen fusiones del receptor* de células T (Gascoigne y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. US, 84:2936-2940 (1987)); CD4* (Capon y otros, Nature 337:525-531 (1989); Traunecker y otros, Nature, 339:68-70 (1989); Zettmeissl y otros, DNA Cell Biol. USA, 9:347-353 (1990); Byrn y otros, Nature, 344:667-670 (1990)); L-selectina (receptor "homing") ((Watson y otros, J. Cell Biol., 110:2221-2229 (1990); Watson y otros, Nature, 349:164-167 (1991)); CD44* (Arufflo y otros, Cell, 61:1303-1313 (1990)); CD28* y B7* (Linsley y otros, J. Exp. Med., 173:721-730 (1991)); CTLA-4* (Lisley y otros, J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)); CD22*(Stamenkovic y otros, Cell, 66:1133-1144 (1991)); receptor de TNF (Ashkenazi y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10535-10539 (1991); Lesslauer y otros, eur. J. Inmunol., 27:2883-2886 (1991); Peppel y otros, J. Exp. Med., 174:1483-1489 (1991)); receptores de NP (Bennett y otros, J. Biol. Chem. 266:23060-23067 (1991)); y receptor a* de IgE (Ridgway y otros, J. Cell. Biol. 115:resumen 1448 (1991)), en las que el asterisco (*) indica que el receptor es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas.

El diseño de inmunoadhesina más simple y más sencillo combina la unión de la región o regiones de la proteína "adhesina" con las regiones de la bisagra (hinge) y Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina. Habitualmente, cuando se preparan las quimeras de NTNR\alpha-inmunoglobulina de la presente invención, el ácido nucleico que codifica el dominio extracelular del NTNR\alpha se fusionará por el C-terminal al ácido nucleico que codifica el N-terminal de una secuencia de dominio constante de la inmunoglobulina, aunque también son posibles las fusiones por N-terminal.

Habitualmente, en dichas fusiones el polipéptido quimérico codificado retendrá por lo menos los dominios de bisagra y CH2 y CH3 funcionalmente activos de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Las fusiones también se realizan al C-terminal de la parte FC de un dominio constante, o inmediatamente al N-terminal del CH1 de la cadena pesada o la correspondiente región de la cadena ligera.

El sitio preciso en el que se realiza la fusión no es crítico; se conocen sitios concretos y se pueden seleccionar para optimizar las características de la actividad biológica, la secreción o la unión de las quimeras NTNR\alpha-inmunoglobulina.

En algunas realizaciones, las quimeras NTNR\alpha-inmunoglobulinas se ensamblan como monómeros, o hetero- o homo-multímeros, y particularmente como dímeros o tetrámeros, esencialmente tal y como se ilustra en WO 91/08298.

En una realización preferida, la secuencia del dominio extracelular del NTNR\alpha se fusiona al N-terminal de la parte C-terminal de un anticuerpo (en particular el dominio Fc), que contiene las funciones efectoras de una inmunoglobulina, por ejemplo la inmunoglobulina G_{1} (IgG1). Es posible fusionar toda la región constante de la cadena pesada a la secuencia del dominio extracelular del NTNR\alpha. Sin embargo, más preferiblemente, en la fusión se utiliza una secuencia que empieza en la región de la bisagra justo en dirección 5' del sitio de escisión de la papaína (que define químicamente el Fc de IgG; residuo 216, tomando como el primer residuo de la región constante de la cadena pesada el 114, o sitios análogos de otras inmunoglobulinas). En una realización particularmente preferida, la secuencia de aminoácidos de NTNR\alpha se fusiona a la región de bisagra y CH2 y CH3, o a los dominios de CH1, bisagra, CH2 y CH3 de una cadena pesada de IgG1, IgG2 o IgG3. El sitio preciso en el que se realiza la fusión no es crítico y el sitio óptimo se puede determinar mediante experimentación rutinaria.

En algunas realizaciones, las quimeras NTNR\alpha-inmunoglobulina se ensamblan como multímeros, y particularmente como homo-dímeros o –tetrámeros. Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán unidades estructurales conocidas. Una unidad estructural básica de 4 cadenas es la forma en la que existen IgG, IgD e IgE. Una unidad de cuatro se repite en las inmunoglobulinas de peso molecular más elevado; IgM generalmente existe como un pentámero de cuatro unidades básicas mantenidas juntas mediante puentes disulfuro. La globulina IgA, y ocasionalmente la globulina IgG, puede también existir en forma multimérica en el suero. En el caso de multímero, cada unidad de cuatro puede ser igual o diferente.

Alternativamente, la secuencia del dominio extracelular de NTNR\alpha se puede insertar entre las secuencias de la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina, de manera que se obtiene una inmunoglobulina comprende una cadena pesada quimérica. En esta realización, la secuencia de NTNR\alpha se fusiona al extremo 3' de una cadena pesada de la inmunoglobulina en cada brazo de una inmunoglobulina, entre el dominio de la bisagra y el CH2, o entre los dominios del CH'' y CH\cdot. Se han descrito construcciones similares en Hoogenboom y otros, Mol. Immmunol., 28:1027-1037 (1991).

Aunque no se requiere la presencia de una cadena ligera de la inmunoglobulina en las inmunoadhesinas de la presente invención, una cadena ligera de la inmunoglobulina puede estar presente asociada covalentemente a un polipéptido de fusión de NTNR\alpha-cadena pesada de inmunoglobulina, o fusionada directamente al dominio extracelular del NTNR\alpha. En el primer caso, el ADN que codifica una cadena ligera de la inmunoglobulina se coexpresa habitualmente con el ADN que codifica la proteína de fusión el NTNR\alpha-cadena pesada de inmunoglobulina. Tras la secreción, el híbrido de la cadena pesada y la cadena ligera se asociará covalentemente para proporcionar una estructura similar a la inmunoglobulina que comprende parejas de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina unidas por dos puentes disulfuro. Los procedimientos adecuados para la preparación de dichas estructuras se describen por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 4.816.567 registrada el 28 de marzo de 1989.

En una realización preferida, las secuencias de inmunoglobulina utilizadas en las construcción de inmunoadhesinas de la presente invención son de un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulinas IgG. Para inmunoadhesinas humanas, se prefiere la utilización de secuencias de las inmunoglobulinas IgG1 e IgG3 humanas. La ventaja principal de utilizar IgG1 es que las inmunoadhesinas de IgG1 se pueden purificar de forma eficaz en proteína a inmovilizada. En cambio, la purificación de IgG3 requiere proteína G, un medio significativamente menos versátil. Sin embargo, se deberían considerar otras propiedades estructurales y funcionales de las inmunoglobulinas a la hora de la elección del compañero de fusión de la Ig para una construcción de inmunoadhesina concreta. Por ejemplo, la bisagra IgG3 es más larga y más flexible, de manera que puede acomodar dominios de adhesina más largos que no se pueden doblar o no funcionan correctamente cuando se fusiona a IgG1. Otra consideración puede ser la valencia; las inmunoadhesinas de IgG son homodímeros bivalentes, mientras que los subtipos 1g como IgA e IgM pueden dar lugar a estructuras diméricas y pentaméricas, respectivamente, de la unidad homodimérica de Ig básica. Para las inmunoadhesinas de NTNR\alpha diseñadas para la aplicación in vivo, también son importantes las propiedades farmacocinéticas y las funciones efectoras especificadas por la región Fc. A pesar de que las IgG1, IgG2 y IgG4 tienen todas vidas medias in vivo de 21 días, sus potencias relativas en la activación del sistema de complemento es diferente. La IgG4 no activa el complemento, e IgG2 es significativamente más débil en la activación del complemento que IgG1. Además, a diferencia de IgG1, IgG2 no se une a los receptores de Fc en células mononucleares o neutrófilos. Mientras que IgG3 es óptima para la activación del complemento, su vida media in vivo es aproximadamente un tercio de los otros isótopos de IgG. Otra consideración importante para las inmunoadhesinas diseñadas para ser utilizadas como productos terapéuticos humanos es el número de variantes alotípicas del isótopo concreto. En general, se prefieren los isotipos de IgG con menos alotipos definidos de forma serológica. Por ejemplo, la IgG1 tiene sólo cuatro sitios alotípicos, dos de los cuales (G1m y 2) se localizan en la región Fc; y uno de estos sitios G1m1 no es inmunogénico. En cambio, existen 12 alotipos definidos de forma sexológica en IgG3, todos ellos en la región Fc; sólo tres de estos sitios (G3m5, 11 y 21) tienen un alotipo que no es inmunogénico. De este modo, la inmunogenicidad potencial de una inmunoadhesina \gamma3 es mayor que la de la inmunoadhesina \gamma1.

Con respecto a la inmunoglobulina parental, un punto de unión útil está justo en dirección 5' de las cisteínas de la bisagra que forman los puentes disulfuros entre las dos cadenas pesadas. En un diseño utilizado frecuentemente, el codón para el residuo C-terminal de la parte NTNR\alpha de la molécula se coloca directamente en dirección 5' de los codones para la secuencia DKTHTCPPCP de la región de bisagra de IgG1.

Los procedimientos generales adecuados para la construcción y expresión de las inmunoadhesinas son las mismas que las descritas anteriormente en la presente con respecto a NTNR\alpha. Las inmunoadhesinas con NTNR\alpha se construyen de forma más convenientemente mediante la fusión de la secuencia de ADNc que codifica la parte de NTNR\alpha en marco a una secuencia de ADNc de Ig. Sin embargo, también se pueden utilizar la fusión a fragmentos genómicos de Ig (ver, por ejemplo, Gascoigne y otros, Proc. NAtl. Acad. Sci. USA, 84:2936-2940 (1987); Aruffo y otros, Cell, 61:1303-1313 (1990); Stamenkovic y otros, Cell, 66:1133-1144 (1991)). El último tipo de fusión requiere la presencia de secuencia reguladoras de Ig para la expresión, se pueden aislar ADNcs que codifican regiones constantes de cadena pesada de IgG en base a la secuencia publicada de las bibliotecas de ADNc derivadas de linfocitos de bazo o sangre periférica, mediante técnicas de hibridación o mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los ADNCs que codifican las partes de NTNR\alpha e Ig de la inmunoadhesina se insertan en tándem en un vector plásmido que dirige la expresión eficiente en las células huésped seleccionadas. Para la expresión en células de mamíferos, se pueden utilizar los vectores basados en pRK5 (Schall y otros, Cell, 61:361-370 (1990)) y los vectores basados en CDM8 (Seed, Nature, 329:840 (1989)). La unión exacta se puede crear mediante la eliminación de secuencias extras entre los codones de unión diseñados utilizando mutagénesis de eliminación dirigida por oligonucleótidos (Zoller y otros, Nucleic Acids Res. 10:6487 (1982); Capon y otros, Nature, 337:525-531 (1989)). Se pueden utilizar oligonucleótidos sintéticos, en los que cada mitad es complementario a la secuencia en cada parte de la unión deseada; idealmente, son de 36 a 48 mers. Alternativamente, se pueden utilizar técnicas de PCR para unir las dos partes de la molécula en marco con un vector apropiado.

La elección de la línea celular huésped para la expresión de inmunoadhesinas con NTNR\alpha depende principalmente del vector de expresión. Otra consideración es la cantidad de proteína que se necesita. Se pueden producir frecuentemente cantidades de miligramos mediante transfecciones transitorias. Por ejemplo, la línea celular de riñón embrionario humano 293 transformada por el adenovirus EIA se puede transfectar de forma transitoria con los vectores basados en pRK5 mediante una modificación del procedimiento del fosfato cálcico para permitir la expresión eficaz de la inmunoadhesina. Se pueden utilizar los vectores basados en CDM8 para transfectar células COS mediante el procedimiento de DEAE-dextrano (Aruffo y otros, Cell, 61:1303-1313 (1990); Zettmeissl y otros, DNA Cell Biol. US. 9:347-353 (1990)). Si se desean mayores cantidades de proteína, la inmunoadhesina se puede expresar después de la transfección estable de una línea celular huésped. Por ejemplo, un vector basado en pRK5 se puede introducir en células de ovario de hámster chino (CHO) en presencia de un plásmido adicional que codifica dihidrofolato recuctasa (DHFR) y confiere resistencia a G418. Los clones resistentes a G418 se pueden seleccionar en el cultivo; estos clones crecen en presencia de niveles crecientes de inhibidor de DHFR metotrexato; se seleccionan los clones, en los que se coamplifica el número de copias de genes que codifican las secuencias de DHFR e inmunoadhesina. Si la inmunoadhesina contiene una secuencia hidrofóbica principal en su N terminal, es probable que sea procesada y secretada mediante las células transfectadas. La expresión de inmunoadhesinas con estructuras más complejas puede requerir únicamente células huésped adecuadas (Gascoigne y otros, 1987, ver anteriormente, Martin y otros, J. Virol., 67:3561-3568 (1993)).

Las inmunoadhesinas se pueden purificar convenientemente mediante cromatografía de afinidad. La proteína A como ligando de afinidad es adecuada dependiendo de la especie y el isotipo del dominio Fc de la inmunoglobulina que es utiliza en la quimera. La proteína A se puede utilizar para purificar inmunoadhesinas que se basan en las cadenas pesadas \gamma1, \gamma2, o \gamma4 (Lindmark y otros, J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para \gamma3 humano (Guss y otros, EMBO J., 5:1567-1575 (1986)) La matriz a la que se une el ligando de afinidad es frecuentemente agarosa, pero se disponen de otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno, permiten unas velocidades de flujo superiores y menores tiempos de procesado que los se pueden conseguir con agarosa. Las condiciones para unir una inmunoadhesina a la columna de afinidad de proteína A o G están dictadas completamente por las características del dominio Fc;es decir, su especie e isotipo. Generalmente, cuando se elige el ligando correcto, tiene lugar una unión eficaz directamente del fluido de cultivo no condicionado. Una característica distintiva de las inmunoadhesinas es que, para las moléculas de \gamma1 humanas, la capacidad de unión para la proteína A es algo más baja en relación a un anticuerpo del mismo tipo de Fc. La inmunoadhesina unida se puede eluir eficazmente a pH ácido (3,0 o superior) o en un tampón de pH neutro que contiene una sal ligeramente caotrópica. Esta etapa de la cromatografía de afinidad puede dar lugar a la preparación de una inmunoadhesina que tiene más de un 95% de pureza.

Se pueden utilizar otros procedimientos conocidos en la técnica en lugar de, o adicionalmente a, la cromatografía de afinidad a la proteína A o G para purificar inmunoadhesinas. Las inmunoadhesinas se comportan de forma similar a los anticuerpos en cromatografía en gel tiofílico (Hutchens y otros, Anal. Biochem., 159:217-226(1986)) y cromatografía de quelatos metálicos inmovilizados (Al-Mashiki y otros, J. Dairy Sci. 71:1756-1763 (1988)). A diferencia de los anticuerpos, sin embargo, su comportamiento en columnas de intercambio iónico está dictado no sólo por sus puntos isoeléctricos, sino también por un dipolo con carga que puede existir en las moléculas debido a su naturaleza
dimérica.

Si se desea, las inmunoadhesinas pueden realizarse de manera que sean biespecíficas. De este modo, las inmunoadhesinas de la presente invención pueden combinar un dominio extracelular de NTNR\alpha y un dominio, tal como el dominio extracelular, de otra subunidad del receptor de citocina o del factor neurotrófico. Entre los ejemplos de receptores de citocina a partir de los cuales se pueden realizar moléculas de inmunoadhesinas biespecíficas, se incluyen receptores TPO (o ligando mpl), EPO, G-CSF, IL-4, IL-7, GH, PRL. IL-3, GM-CSF, IL-5, IL-6, LIF, OSM, CNTF, GDNF e IL-2. Para moléculas biespecíficas, debido a su facilidad de purificación, son ventajosas moléculas triméricas, compuestas de una cadena pesada de anticuerpo quimérico en un brazo y una pareja de cadena ligera-cadena pesada de anticuerpo quimérico en el otro brazo de su estructura similar a anticuerpo. A diferencia de los cuadromas productores de anticuerpos utilizados habitualmente para la producción de inmunoadhesinas específicas, que producen una mezcla de diez tetrámeros, las células transfectadas con ácido nucleico que codifica las tres cadenas de una estructura trimérica de inmunoadhesina producen una mezcla de sólo tres moléculas, y la purificación del producto deseado a partir de esta mezcla es correspondientemente más sencilla.

Se cree que la proteína NTNR\alpha y el gen de NTNR\alpha encuentran un uso terapéutico ex vivo e in vivo para la administración a un mamífero, particularmente humanos, en el tratamiento de enfermedades o trastornos, relacionados con la actividad de neurturina o beneficiados de la respuesta de la neurturina. Ver Kotzbauer y otros, Nature 384:467-470 (1996). Las condiciones particularmente susceptibles para el tratamiento con las realizaciones de la invención son las relacionadas con la expresión de Ret o que se benefician por la activación de Ret, particularmente en los mecanismos de recuperación mediados por Ret. Ver Treanor y otros, Nature 382:80-83 (1996); Jing y otros, Cell, 85:1113-1124 (1996); Trupp y otros, Nature, 381:785-789 (1996); y Durbec y otros, Nature 381:789-793 (1996), que se incorporan específicamente en la presente por referencia. Particularmente preferidos son los trastornos neurológicos, preferiblemente los trastornos del sistema nervioso central, trastornos del riñón, trastornos hematopoyéticos relacionados con el bazo, y trastornos del sistema nervioso entérico. Al paciente se administra una cantidad eficaz de proteína, fragmento de péptido o variante de NTNR\alpha de la invención. Los procedimientos terapéuticos que comprenden la administración de NTNR\alpha, agonistas de NTNR\alpha (por ejemplo, NTN), antagonistas de NTNR\alpha (que compiten con y se unen a NTN endógeno, pero que no consiguen activar Ret), o anticuerpos anti-NTNR\alpha están dentro del alcance de la presente invención. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden proteína, fragmento de péptido o derivado de NTNR\alpha en un portador farmacológico adecuado. La proteína, fragmento de péptido o variante de NTNR\alpha se puede administrar sistemáticamente o localmente. Aplicables a los procedimientos mostrados en la presente, la proteína receptora se puede administrar opcionalmente antes, después o preferiblemente concomitantemente con (o en complejo con) NTN u otro ligando de NTNR\alpha. Tal como se muestra en la presente, se puede proporcionar NTNR\alpha para marcar células en ausencia de NTN para incrementar la respuesta de estas células a NTN o agonista de NTN administrado posteriormente.

Ciertas condiciones se pueden beneficiar de un incremento en la respuesta de NTN (u otro ligando de NTNR\alpha). Por lo tanto, puede ser beneficioso incrementar el número de o la afinidad de unión de NTNR\alpha en células de pacientes que sufren de dichas condiciones. Esto se puede conseguir a través de la administración de NTNR\alpha soluble, opcionalmente complejado con ligando de NTNR\alpha, preferiblemente NTN, o por terapia génica utilizando ácido nucleico que codifica NTNR\alpha. La expresión selectiva de NTNR\alpha recombinante en células apropiadas se podría conseguir utilizando genes de NTNR\alpha controlados por promotores específicos de tejido o inducibles o mediante la producción de una infección localizada con la replicación de virus defectuosos que transportan un gen de NTNR\alpha recombinante. Entre las condiciones que se pueden beneficiar de la mayor sensibilidad a NTN incluyen, pero no se limitan a, trastornos de motoneuronas que incluyen esclerosis amiotrófica lateral, la enfermedad de Werdning-Hoffmann, la atrofia muscular crónica espinal proximal y el síndrome de Guillain-Barre. Entre las condiciones adicionales se incluyen aquéllas que implican neuronas simpáticas, particularmente donde se desea una mayor supervivencia o respuesta de NTN. Las condiciones donde se desea una mayor supervivencia o respuesta de NTN de neuronas sensoriales, incluyendo las neuronas sensoriales periféricas, y neuronas del sistema nervioso central, incluyendo neuronas dopaminérgicas, también se tratan de forma adecuada con realizaciones de la invención. Por consiguiente, en la presente se proporciona el tratamiento de trastornos neurológicos asociados con la diabetes, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, y la corea de Huntington. La NTN encuentra un uso particular en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Los procedimientos de la presente también se pueden aplicar a condiciones relacionadas con células no neuronales que expresan el NTNR\alpha. De hecho, dado que el NTNR\alpha sirve para activar Ret, las condiciones asociadas con las células que expresan Ret se pueden tratar con las realizaciones de la invención.

Se considera que una enfermedad o trastorno médico es dañino para los nervios si se compromete a la supervivencia o la función de células nerviosas y/o sus procesos axonales. Dicho daño neuronal tiene lugar como las condiciones resultantes que incluyen (a) lesión física, que provoca la degeneración de los procesos axonales y/o cuerpos de células nerviosas cerca del lugar de la lesión; (b) isquemia como apoplejía; (c) exposición a neurotoxinas, tales como agentes quimioterapéuticos del cáncer y el SIDA, tales como cisplatino y didesoxicitidina (ddC), respectivamente; (d) enfermedades metabólicas crónicas, tales como la diabetes o disfunción renal; y (e) enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, y la Esclerosis Amiotrófica Lateral (ALS), que provocan la degeneración de poblaciones neuronales específicas. Entre las condiciones que implican un daño neuronal se incluyen la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la Esclerosis Amiotrófica Lateral, apoplejía, polineuropatía diabética, neuropatía tóxica, y daño físico al sistema nervioso, tal como el causado por una lesión física del cerebro y médula espinal o lesiones por golpe o corte en el brazo y la mano u otras partes del cuerpo, incluyendo el cese temporal o permanente del flujo sanguíneo a partes del sistema nervioso, como en la apoplejía.

El gen de NTNR\alpha se expresa en células musculares y neuronas asociadas. Por consiguiente, la presente invención proporciona procedimientos de tratamiento de trastornos de células musculares que comprenden la administración a un paciente que necesita dicho tratamiento de los compuestos de la invención. Entre los trastornos en las células musculares que se pueden beneficiar de dicho tratamiento se incluyen, pero no se limitan a, las siguientes distrofias musculares progresivas: Duchenne, Becker, Emery-Dreifuss, Landouzy-Dejerine, escapulo-humeral, faja-miembro, Von Graefe-Fuchs, oculofaringeal, miotónica y congénita. Además, dichas moléculas se pueden utilizar en el tratamiento de miopatías congénitas (núcleo central, nemalina, desproporción del tipo fibra centronuclear y congénita) y miopatía adquirida (tóxica, inflamatoria). La presente invención proporciona además un procedimiento de tratamiento de un trastorno de las células musculares que comprende la administración al paciente de una cantidad eficaz de proteína NTNR\alpha o una parte activa de la misma.

En una realización adicional de la invención, los pacientes que sufren de un exceso de NTNR, hipersensibilidad a NTN, NTN en exceso, etc. se pueden tratar mediante la administración de una cantidad eficaz de ARN antisentido u oligodesoxiribonucleótidos antisentido correspondientes a la región de codificación del gen de NTNR\alpha disminuyendo así la expresión de NTNR.

Los compuestos y procedimientos de la invención se pueden utilizar en condiciones asociadas con un descenso en células hematopoyéticas. Entre los ejemplos de estas enfermedades se incluyen: anemia (incluyendo anemia macrocítica y aplástica); trombocitopenia; hipoplasia; coagulación intravascular diseminada (DIC); mielodisplasia; púrpura trombocitopénica inmune (autoinmune) (ITP); ITP inducida por VIH. Adicionalmente, estas moléculas de NTNR\alpha pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades trombocitóticas mieloproliferativas así como trombocitosis de condiciones inflamatorias y en la deficiencia de hierro. El polipéptido de NTNR\alpha y el gen de NTNR\alpha que conducen a un incremento en la proliferación de células hematopoyéticas también se pueden utilizar para aumentar la repoblación de linajes de células sanguíneas maduras en células en las que se ha realizado quimioterapia o terapia por radiación o terapia de transplante de médula ósea. Generalmente, se espera que las moléculas de NTNR\alpha conduzcan a un aumento de la proliferación y/o diferenciación (pero especialmente proliferación) de células hematopoyéticas. Las realizaciones preferidas proporcionan tratamiento para aumentar la hematopoyesis que tiene lugar en el bazo.

Entre otras aplicaciones terapéuticas potenciales para NTNR\alpha y el gen de NTNR\alpha se incluyen el tratamiento para impulsar el crecimiento, supervivencia y reparación de las células de riñón o hígado. Por ejemplo, un fallo renal agudo se refiere a la interrupción repentina de la función previamente normal del riñón. Esta condición clínica seria es debida a una gran variedad de mecanismos que incluyen fallos circulatorios (shock), bloqueo vascular, glomerulonefritis y la obstrucción del flujo urinario. El fallo renal agudo aparece frecuentemente como una complicación de cirugía abdominal o vascular. Además, neonatos de alto riesgo con un bajo peso al nacer pueden ahora sobrevivir a problemas de pulmón y corazón debido a las continuas mejoras en el cuidado prenatal, y sólo morir de complicaciones de fallo renal agudo causado por infección o toxicidad por fármaco. De particular importancia clínica son los casos de fallo renal agudo asociados con traumas, sepsis, complicaciones postoperativas, o medicación, particularmente antibióticos. En particular, los compuestos de la invención encuentran un uso en etiologías, directa o indirectamente, relacionadas con la disfunción del sistema nervioso entérico o sistema renal. Entre las condiciones que afectan la G1 se incluyen, pero no se limitan a, Achalasia, espasmo de Esófago, Escleroderma (relacionado con la atrofia muscular de la parte de músculo liso del esófago, debilidad de contracción de los dos tercios inferiores del cuerpo del esófago y la incompetencia del esfínter del esófago inferior, pero también causado por el tratamiento con agentes inmunodepresivos), trastornos, tales como úlcera duodenal, Síndrome de Zollinger-Ellison (hipersecreción de ácido causado por factores que incluyen factores genéticos, fumar, influencias neurales), hipersecreción de ácido gástrico, trastorno de mala absorción, por ejemplo, en diabetes (e hipoparatiroidismo, hipertiroidismo e insuficiencia adrenal) en la que la atonía gástrica, náuseas, vómitos, etc. están por lo menos en parte relacionadas con la disfunción del sistema nervioso simpático/parasimpático. Entre los trastornos adicionales se incluyen trastornos de motilidad intestinal, que incluyen: diverticulosis/diverticulitis, enfermedad de Hirschprung (un trastorno congénito causado por la ausencia de células de los ganglios (plexos de Meissner y Auerbach) en un pequeño segmento del colon distal, habitualmente cerca del ano, normalmente presentado en bebés, pero en casos menos severos, no se puede diagnosticar hasta la adolescencia o adultez inicial, Megacolon u otros tipos (de Hirschprung es un tipo de megacolon); pseudo-obstrucción intestinal, aguda o crónica, que es una dismotilidad severa debida a anormalidades de las inervaciones simpáticas de las capas de músculo del intestino, o de forma secundaria puede resultar de escleroderma, diabetes amiloidosis, otras enfermedades neurológicas, fármacos, o sepsis; estreñimiento crónico, que es un problema serio en pacientes con retraso mental o enfermedades neurológicas, en el que un factor de contribución es la motilidad de los intestinos alterada, también se incluyen tratamientos para enfermedades y trastornos renales. Entre las condiciones adicionales se incluyen, pero no se limitan a: disfunción de la médula espinal, debido aun interrupción obvia del sistema nervioso entérico; síndrome de Guillain Barre; Esclerosis múltiple; Pandisautonomía (disfunción del sistema nervioso autonómico); parkinsonismo (frecuentemente asociado con la motilidad gastrointerstinal alterada); Atrofia Múltiple del Sistema (Síndrome de Shy Drager), que ha sido descrita como una característica de la motilidad de los intestinos alterada; y porfiria y amiloidosis que son enfermedades difusas manifestadas mediante la neuropatía y acompañadas frecuentemente con trastornos de motilidad de GI.

La necrosis o daño de tejido que expresa NTNR o de respuesta a NTN incluye una necrosis debida a una infección microbiológica, tal como hepatitis vital, tuberculosis, fiebre tifoidea, tularemia, brucelosis, fiebre amarilla, y similares, o necrosis debida a lesión isquémica resultante de un ataque, fallo cardiaco, y similares, o necrosis debida a reacción aguda o crónica con fármacos o sustancias tóxicas, tales como cloroformo, tetracloruro de carbono, fósforo venenoso, y similares. Tal como se muestra en la presente, el mayor crecimiento celular, incluyendo células renales, tales como células epiteliales renales y neuronas que inervan el riñón, es útil en el tratamiento de la enfermedad renal. Los compuestos y procedimientos de la presente invención proporcionan la reparación del daño renal. Sin estar unido a la teoría, se cree que esto se puede realizar, directa o indirectamente, mediante la estimulación de células renales, incluyendo la inervación de neuronas, para crecer y dividir. Por consiguiente, se proporciona un procedimiento para regenerar tejido de riñón que incluye las etapas de preparación de un agonista de NTNR\alpha (por ejemplo, NTNR\alpha soluble, opcionalmente complejado con NTN) tal y como se describe en la presente, opcionalmente combinado con un portador farmacológicamente aceptable o factor de crecimiento adicional o citocina, y poner en contacto el tejido renal con la composición. Se administra una cantidad terapéutica de la composición. Las inyecciones o implantes localizados son un procedimiento de liberación preferido. Alternativamente, los riñones dañados se podrían extraer, tratar ex vivo y devolver al huésped después de reparar el riñón.

Los agonistas de NTNR\alpha, incluyendo NTN, se pueden administrar durante la hemodiálisis. La hemodiálisis se define como la extracción temporal de sangre de un paciente con el objetivo de extraer o separar toxinas de la misma y el retorno de la sangre limpiada al mismo paciente. La hemodiálisis está indicada en pacientes en los que existe daño o fallo renal, es decir, en casos en los que la sangre no es limpiada correcta o suficientemente, (particularmente para eliminar agua) por los riñones. En el caso de daño o fallo renal crónico, la hemodiálisis se debe llevar a cabo en una base repetitiva. Por ejemplo, en una enfermedad renal en la etapa final en la que el transplante de riñones no es posible o por razones médicas está contraindicado, el paciente tendrá que ser dializado de 100 a 150 veces al año. Esto puede dar lugar a varios miles de accesos a la corriente sanguínea para permitir la hemodiálisis activa a llevar a cabo durante el resto de la vida del paciente.

La invención encuentra uso en algunas terapias inmunodepresivas en las que existe efectos secundarios del daño renal. Por ejemplo, la terapia de IDDM en humanos mediante procedimientos diseñados para suprimir la respuesta autoinmune. La terapia que utiliza ciclosporina A en la diabetes puede dar lugar al daño renal. La invención encuentra uso en trastornos o condiciones que pueden dar lugar a daño renal. Por ejemplo, la diabetes puede dar lugar a daños posteriores habituales de los vasos sanguíneos de los riñones.

Otros ejemplos incluyen enfermedades renales causadas de forma inmunológica o no inmunológica, tales como, por ejemplo, glomerulonefritis, fallo renal agudo, rechazo del transplante y daño renal causado por sustancias nefróticas, transplantes de riñón, daño tóxico en los riñones. Además, la presente invención encuentra uso en el transplante de órganos, incluyendo el transporte de órganos para almacenar cualquier órgano enucleado de un donante para asegurar la protección del órgano en el tiempo de su transporte, minimizando cualquier problema que pueda ocurrir hasta la operación de transplante, y para asegurar la conservación de dicho órgano en buenas condiciones. Un órgano preferido es uno que tiene células con NTNR o de respuesta a NTN. En una realización específica el órgano es el riñón. La utilización o intervención con agonista de NTNR\alpha, incluyendo NTN, prometen el éxito con respecto al mantenimiento de la función del riñón.

Tal y como se ha discutido en la presente, un objeto de la invención es proporcionar procedimientos para el tratamiento de mamíferos con músculo gastrointestinal disfuncional o trastornos de músculos lisos en cualquier otra parte del cuerpo. El músculo gastrointestinal se organiza y regula de forma muy diferente que el músculo de cualquier otra parte. El músculo esquelético y liso en el tracto gastrointestinal están bajo el control del sistema nervioso entérico que es una red de nervios y músculos extremadamente compleja, que reside en el interior de la pared gastrointestinal y orquesta todo el proceso digestivo incluyendo la motilidad, la secreción y la absorción. Los nervios entéricos también están organizados en redes interconectadas llamadas plexos. De éstos, el plexo mientérico, situado entre las capas de músculo circular y longitudinal, es el regulador principal de motilidad gastrointestinal. Recibe la entrada desde el sistema nervioso central (a través de vagal y mecanismos simpáticos) así como de mecanismos reflejos locales. Su salida consiste en señales inhibitorias y excitativas al músculo adyacente. El mecanismo neural final regula la actividad del músculo en el tracto gastrointestinal está, por lo tanto, representada por las neuronas del plexo mientérico. Un concepto útil, si bien algo simple, es visualizar el tono muscular neto en el tracto gastrointestinal como el resultado del equilibrio entre los efectos opuestos de dos sistemas neuronales en el plexo mientérico: uno que provoca que el músculo se contraiga (principalmente a través de acetilcolina) y el otro que provoca la relajación del mismo. Ambos tipos de neuronas, sin embargo, se activan mediante acetilcolina dentro del plexo mientérico. El papel de la acetilcolina en la regulación del tono muscular gastrointestinal es por lo tanto compleja. La acetilcolina liberada directamente por los nervios efectores cerca del músculo provoca la contracción; sin embargo, dentro del plexo, puede dar lugar a inhibición o excitación. Esto contrasta con el músculo esquelético fuera del tracto gastrointestinal que está inervado directamente por los nervios que emanan del sistema nervioso central. La interacción entre el nervio y el músculo en el músculo esquelético fuera del tracto gastrointestinal es mucho más sencilla: los nervios liberan acetilcolina que provocan que se contraiga el músculo. Finalmente, el plexo mientérico es probablemente el más importante pero no el único determinante del tono muscular en el tracto gastrointestinal. De hecho, el tono muscular liso basal se puede visualizar como resultado de la suma de muchos factores diferentes que incluyen el tono intrínseco (miogénico), y hormonas circulantes, además de la actividad nerviosa. Debería ser evidente, por tanto, que la regulación de la motilidad muscular del tracto gastrointestinal es mucho más compleja que la del músculo esquelético fuera del tracto gastrointestinal. Mientras hay informes aislados de los efectos de la toxina botulinum en preparaciones in vitro de músculo liso gastrointestinal, la regulación del músculo gastrointestinal es tan compleja que las consecuencias fisiológicas de bloquear la liberación de neurotransmisores (utilizando toxina, tal como botulinum) en humanos o animales vivos que no eran predecibles antes de la presente invención. La presente invención proporciona composiciones, procedimientos, y dispositivos para el tratamiento de trastornos gastrointestinales que incluyen achalasia, otros trastornos del esfínter del esófago inferior, esfínter de disfunción de Oddi, síndrome de intestino irritable, y otros trastornos tal y como se han descrito en la presente.

Por ejemplo, se proporciona un procedimiento para tratar el Síndrome de Intestino Irritable (IBS), que es un trastorno motor que consiste en los hábitos del intestino alterados, dolor abdominal, y la ausencia de patología detectable. El IBS se reconoce por sus síntomas, que están influenciados de forma destacada por factores psicológicos y situaciones de vida estresante. El IBS es uno de los trastornos gastrointestinales que se encuentran más habitualmente. Entre el 20% y el 50% de los pacientes con problemas gastrointestinales sufren de IBS. Los síntomas de IBS aparecen en aproximadamente un 14% de la gente aparentemente saludable. Es un síndrome compuesto de un número de condiciones con manifestaciones similares. Los síntomas principales de IBS (hábitos intestinales alterados, dolor abdominal e hinchazón) son manifestaciones de una mayor motilidad en los intestinos e hipersecreción de ácido gástrico. La actividad del tracto GI está regulada neuronalmente por el sistema nervioso central (CNS) a través de la inervación parasimpática y simpática y por el sistema nervioso entérico localizado de forma periférica (ENS) que reside dentro del propio tracto GI.

En otro aspecto se proporciona la administración de NTNR\alpha a un mamífero que tiene niveles disminuidos de NTNR\alpha endógeno o un gen de NTNR\alpha defectuoso, preferiblemente en la situación en la que los niveles disminuidos conducen a un trastorno patológico, o donde hay una falta de activación del NTNR\alpha y Ret. En estas realizaciones, en las que se administra al paciente el NTNR\alpha de longitud completa, se contempla que el gen que codifica el receptor se puede administrar al paciente a través de la tecnología de terapia génica.

En las aplicaciones de terapia génica, los genes se introducen en células para conseguir síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente eficaz, por ejemplo, para la sustitución de un gen defectuoso. La "terapia génica" incluye la terapia génica convencional en la que se consigue un efecto permanente mediante un único tratamiento y la administración de agentes terapéuticos génicos, que implica la administración de una vez o repetida de un ADN o ARNm terapéuticamente eficaz. Los ADNs o ARNs antisentido se pueden utilizar como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Ya se ha observado que los oligonucleótidos antisentido cortos se pueden importar en células en las que actúan como inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares provocadas por su captación resntringida por la membrana celular (Zamecnik y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:4143-4146 (1986)). Los oligonucleótidos se pueden modificar para mejorar su captación, por ejemplo, sustituyendo sus grupos fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados.

\newpage

Existen una serie de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vitro, ex vivo o in vivo en las células del huésped deseado. Entre las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vitro se incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico, etc. Entre las técnicas de transferencia de genes in vivo preferidas actuales se incluyen la transfección con vectores virales (habitualmente retroviral) y la transfección mediada por liposoma-proteína con cubierta viral (Dzau y otros, Trends in Biotechnology, 11:205-210 (1993)). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácidos nucleicos con un agente que marca las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de la superficie de la célula o la célula diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando se usan liposomas, se pueden utilizar proteínas que se unen a una proteína de membrana de la superficie de la célula asociada con endocitosis para marcar y/o facilitar la captación, por ejemplo, de proteínas de la cápside o fragmentos de la misma trópicos para un tipo de célula concreto, anticuerpos para proteínas que realizan la internalización en el ciclado, y proteínas que marcan la localización intracelular y aumentan la vida media intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por un receptor se describe, por ejemplo, en Wu y otros, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987); y Wagner y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414 (1990). Para una revisión de los protocolos del marcaje de genes y la terapia génica actualmente conocidos, ver Anderson y otros, Science, 256:808-813 (1992).

La invención también proporciona antagonistas de la activación de NTNR\alpha (por ejemplo, ácido nucleico antisentido de NTNR\alpha, anticuerpos neutralizantes). Se contempla la administración del antagonista de NTNR\alpha a un mamífero que tiene niveles aumentados o excesivos de activación de NTNR\alpha endógeno, preferiblemente en la situación en la que dichos niveles incrementados de activación de NTNR\alpha o Ret conducen a un trastorno patológico.

En una realización, las moléculas antagonistas de NTNR\alpha se pueden utilizar para unir ligandos endógenos en el cuerpo, provocando así que el NTNR\alpha desensibilizado responda a un ligando de NTN, especialmente cuando los niveles de ligando de NTN en el suero supera los niveles fisiológicos normales. Además, puede ser beneficioso unir ligando de NTN endógeno que activa respuestas celulares no deseadas (tales como la proliferación de células tumorales).

Las composiciones farmacéuticas del NTNR\alpha soluble pueden incluir además un agonista de NTN u otro NTNR\alpha. Dicha composición dual puede ser beneficiosa cuando es terapéuticamente útil para prolongar la vida media de NTN, proporcionar un depósito de liberación lenta de NTN, activar el NTNR\alpha o Ret endógeno, y/o complementar la falta de NTNR\alpha en una célula diana que expresa Ret, haciendo así que la célula sea sensible a NTN.

Las formulaciones terapéuticas de NTNR\alpha se preparan para su almacenamiento mediante la mezcla de NTNR\alpha que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Edición, Osol, A., Ed. (1980)), en forma de pastilla liofilizada o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes, o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen soluciones tampón, tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; péptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; contrapones formadores de sal, tales como sodio; y/o tensoactivos no iónicos, tales como Tween, Pluronics o polietilenglicol (PEG).

El NTNR\alpha también se puede atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente), en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, ver anteriormente.

El NTNR\alpha a utilizar para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se realiza fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o después de la liofilización y reconstitución. El NTNR\alpha normalmente se almacenará en forma liofilizada o en solución.

Las composiciones terapéuticas de NTNR\alpha es colocan generalmente en un recipiente que tiene una parte de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica.

La ruta de administración de NTNR\alpha concuerda con los procedimientos conocidos, por ejemplo, aquellas rutas establecidas anteriormente para las indicaciones específicas, así como las rutas generales de inyección o infusión por un medio intravenoso, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional, o sistemas de liberación controlada como se indica a continuación. El NTNR\alpha se administra de forma continua mediante infusión o inyección en bolo. Generalmente, cuando el trastorno lo permite, se debería formular y dosificar el NTNR\alpha para una liberación específica en un sitio. La administración puede ser continua o periódica. La administración se puede realizar mediante una bomba implantable de flujo constante o programable o mediante inyecciones periódicas.

Entre los ejemplos de preparaciones de liberación controlada se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la proteína, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) tal y como se describe en Langer y otros, J. biomed. Mater. Res., 15:167-227 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982) o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (Patente de Estados Unidos No. 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato (Sidman y otros, Biopolymers, 22:547-556 (1983)), etileno-vinil acetato no degradable (Langer y otros, ver anteriormente), copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como Lupron Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988).

Mientras polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un periodo largo de tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, dando lugar a una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden idear estrategias racionales para la estabilización de proteínas dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es la formación de puentes S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, se puede conseguir la estabilización mediante la modificación de residuos sulfhidrilos, la liofilización a partir de soluciones ácidas, el control del contenido de humedad, la utilización de aditivos apropiados, y el desarrollo de composiciones con matriz de polímero específica.

Entre las composiciones de NTNR\alpha de liberación controlada también se incluyen NTNR\alpha atrapado liposomalmente. Los liposomas que contienen NTNR\alpha se preparan mediante procedimientos conocidos per se: DE 3.218.121; Epstein y otros, Proc. NAtl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); Hwang y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; solicitud de patente de Japón 83-118008; Patente de Estados Unidos Nos. 4.485.045 y 4.544.545; y EP 102.324. Normalmente los liposomas son del tipo unilamelar pequeños (aproximadamente de 200-800 Angstroms) en los que el contenido de lípidos es superior a aproximadamente un 30% molar de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia de NTNR\alpha óptima.

Cuando se aplica tópicamente, el NTNR\alpha se combina de forma adecuada con otros ingredientes, tales como portadores y/o adyuvantes. No existen limitaciones en la naturaleza de dichos otros ingredientes, excepto que deben ser fisiológicamente aceptables y eficaces para su administración deseada, y no pueden degradar la actividad de los principios activos de la composición. Entre los ejemplos de vehículos adecuados se incluyen pomadas, cremas, geles, o suspensiones, con o sin colágeno purificado. Las composiciones también se pueden impregnar en parches transdérmicos, tiritas, vendajes, preferiblemente en forma líquida o semilíquida.

Para obtener una formulación de gel, el NTNR\alpha formulado en una composición líquida se puede mezclar con una cantidad eficaz de un polisacárido soluble en agua o polímero sintético, tal como PEG para formar un gel de la viscosidad adecuada par aplicar tópicamente. El polisacárido que se puede utilizar incluye, por ejemplo, derivados de celulosa, tales como derivados de celulosa eterificados, incluyendo alquil celulosas, hidroxialquil celulosas, y alquilhidroxialquilcelulosas, por ejemplo, metilcelulosa, hidroxietil celulosa, carboximetil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, e hidroxipropil celulosa; almidón y almidón fraccionado; agar; ácido algínico y alginatos; goma arábiga; pululano; agarosa; carragenano; dextranos; dextrinas; fructanos; inulina; mananos; xilanos; arabinanos; quitosanos; glicógenos; glucanos; y biopolímeros sintéticos; así como gomas, tales como goma de xantano; goma guar; goma de alagarrobo; goma arábiga; goma de tragacanto; goma de Baraya; y derivados y mezclas de las mismas. El agente gelificante preferido en la presente es uno que es inerte a los sistemas biológicos, no es tóxico, es fácil de preparar, y no es demasiado líquido o viscoso, y no desestabilizará el NTNR\alpha contenido con el mismo.

Preferiblemente, el polisacárido es un derivado de celulosa eterificado, más preferiblemente uno que está bien definido, purificado, y en la lista de USP, por ejemplo, metilcelulosa y los derivados de hidroxialquil celulosa, tales como hidroxipropil celulosa, hidroxietil celulosa e hidroxipropil metilcelulosa. En la presente el más preferido es metilcelulosa.

El polietilenglicol útil para melificar es habitualmente una mezcla de PEGs de peso molecular bajo y elevado para obtener la viscosidad correcta. Por ejemplo, una mezcla de un PEG de peso molecular 400-600 con uno de peso molecular 1500 sería eficaz para este objetivo cuando se mezclan en las propiedades adecuadas para obtener esta pasta.

El término "soluble en agua" aplicado a los polisacáridos y PEGs pretende incluir soluciones coloidales y dispersiones. En general, la solubilidad de los derivados de celulosa se determina por el grado de sustitución de los grupos éter, y los derivados estabilizantes útiles en la presente deberían tener una cantidad suficiente de dichos grupos éter por unidad de anhidroglucosa en la cadena de celulosa para hacer que los derivados sean solubles en agua. Un grado de sustitución de éter de por lo menos 0,35 grupos éter por unidad de anhidroglucosa es generalmente suficiente. Adicionalmente, los derivados de celulosa pueden estar en forma de sales de metales alcalinos, por ejemplo, las sales de Li, Na, K, o Cs.

Si se utiliza metilcelulosa en el gel, preferiblemente comprende aproximadamente un 2-5%, más preferiblemente aproximadamente un 3%, del gel y el NTNR\alpha está presente en una cantidad de aproximadamente 300-1000 mg por ml de gel.

Los dispositivos de membrana semipermeable e implantables son útiles como medios para la liberación de fármacos en ciertas circunstancias. Por ejemplo, las células que segregan NTNR\alpha soluble o quimeras se pueden encapsular, y dichos dispositivos se pueden implantar a un paciente. Por ejemplo, en el cerebro de los pacientes que sufren de la enfermedad de Parkinson. Ver, Patente de Estados Unidos No. 4.892.538 de Aebischer y otros; Patente de Estados Unidos No. 5.011.472 de Aebischer y otros; Patente de Estados Unidos No. 5.106.627 de Aebischer y otros; Solicitud PCT WO 91/10425; solicitud PCT WO 91/10470; Winn y otros, Exper. Neurology, 113:322-329 (1991); Aebischer y otros, Exper. Neurology, 111:269-275 (1991); y Tresco y otros, ASAIO, 38:17-23 (1992). Por consiguiente, también se incluye un procedimiento para prevenir o tratar el daño a un nervio o daño a otras células que expresan NTNR\alpha o son sensibles a NTN, por ejemplo, riñón, tal como se muestra en la presente, que comprende implantar células que secretan NTNR\alpha, sus agonistas o antagonistas según se necesite para la condición concreta, en el cuerpo de los pacientes con necesidad de las mismas. Finalmente, la presente invención incluye un dispositivo para prevenir o tratar daño neuronal o daño a otras células, tal y como se muestra en la presente, mediante la implantación en un paciente que comprende una membrana semipermeable, y una célula que secreta NTNR\alpha (o sus agonistas o antagonistas según se necesite para la condición concreta) encapsulada en dicha membrana y siendo dicha membrana permeable a NTNR\alpha (o sus agonistas o antagonistas) e impermeable a factores del paciente perjudiciales para las células. Las propias células del paciente, transformadas para producir NTN o NTNR\alpha ex vivo, se podrían implantar directamente en el paciente, opcionalmente sin dicha encapsulación. La metodología para la encapsulación de la membrana de células vivas es familiar para los expertos en la materia, y la preparación de las células encapsuladas y su implantación en paciente se puede realizar sin experimentación.

La presente invención incluye, por lo tanto, un procedimiento para prevenir o tratar el daño neuronal mediante la implantación de células, en el cuerpo del paciente con necesidad de las mismas, seleccionadas por su capacidad natural por generar NTNR\alpha o diseñadas para secretar NTNR\alpha. Preferiblemente, el NTNR\alpha secretado si es soluble, el NTNR\alpha humano maduro cuando el paciente es humano. Los implantes son preferiblemente no inmunogénicos y/o previenen el reconocimiento de las células implantadas inmunogénicas por parte del sistema inmunitario. Para la liberación de CNS, un lugar preferido para el implante es el fluido espinal cerebral de la médula espinal.

Una cantidad eficaz de NTNR\alpha para utilizarse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la ruta de administración, y la condición del paciente. Por consiguiente, será necesario para el terapeuta calcular la dosis y modificar la ruta de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Habitualmente, el profesional sanitario administrará el NTNR\alpha hasta alcanzar una dosis que consiga el efecto deseado. Una dosis diaria habitual para el tratamiento sistémico puede variar entre aproximadamente 1 \mug/kg hasta 10 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Como una proposición general alternativa, el NTNR\alpha se formula y se libera al sitio o tejido diana en una dosis capaz de establecer en el tejido un nivel de NTNR\alpha superior de aproximadamente 0,1 ng/cc hasta una dosis máxima que es eficaz pero no excesivamente tóxica. Esta concentración en el interior de tejido se debería mantener si es posible mediante una infusión, liberación controlada, aplicación tópica, implante de células que expresan NTNR\alpha o inyección continuas a frecuencias determinadas empíricamente. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales. Cuando se administra complejado o concomitantemente con NTN, una proporción de 100:1 a 1:100 de NTNR\alpha con respecto a dímero NTN es útil. Preferiblemente, la proporción es 10:1 a 1:10, más preferiblemente 1:1 e incluso más preferiblemente 2:1, que puede reflejar la proporción de unión natural de NTNR\alpha con respecto a NTN. Se administra una cantidad de NTN eficaz para producir el efecto deseado. Una dosis diaria habitual para el tratamiento sistémico también podría variar de 1 \mug/kg hasta 10 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente.

El ácido nucleico de NTNR\alpha es útil para la preparación de polipéptido de NTNR\alpha mediante técnicas recombinantes ejemplificadas en la presente que se pueden utilizar para la producción de anticuerpos anti-NTNR\alpha que tienen varias utilidades descritas posteriormente.

El NTNR\alpha (polipéptido o ácido nucleico) se puede utilizar para incrementar la sensibilidad a NTN (y de este modo incrementar la supervivencia celular y regular los mecanismos de recuperación mediados por Ret) de células in vitro. Dichas células deben contener o modificarse para contener Ret en la superficie celular. Cultivadas ex vivo, estas células se pueden exponer simultáneamente a otros factores neurotróficos conocidos o citocinas, tales como las descritas en la presente.

En aún otro aspecto de la invención, el NTNR\alpha se puede utilizar para la purificación por afinidad de ligandos que se unen a NTNR\alpha, ya sean ligandos naturales o sintéticos. La NTN es un ligando preferido para la purificación. Brevemente, esta técnica implica: (a) poner en contacto una fuente de ligandos de NTN con un NTNR\alpha inmovilizado en condiciones en las que el ligando de NTN a purificar se adsorbe selectivamente sobre el receptor inmovilizado; (b) lavar el NTNR\alpha inmovilizado y su soporte para eliminar el material no adsorbido, y (c) eluir las moléculas de ligando de NTN del NTNR\alpha inmovilizado al que se adsorben con un tampón de elución. En una realización particularmente preferida de purificación por afinidad, el NTNR\alpha se une covalentemente a una matriz o resina inerte y porosa (por ejemplo, agarosa reaccionada con bromuro de cianógeno). Especialmente preferida es una inmunoadhesina de NTNR\alpha inmovilizada sobre una columna de proteína A. A continuación, se pasa una solución que contiene ligando de NTN a través del material cromatográfico. El ligando de NTN se adsorbe a la columna y se libera posteriormente cambiando las condiciones de elusión (por ejemplo, cambiando el pH o la fuerza iónica). Los ligandos novedosos se pueden detectar mediante la monitorización del desplazamiento de un ligando de NTNR\alpha marcado conocido, tal como I^{125}-NTN o NTN biotinilado.

El NTNR\alpha se puede utilizar para el cribado competitivo de agonistas o antagonistas potenciales para la unión al NTNR\alpha. Dichos agonistas o antagonistas pueden constituir productos terapéuticos potenciales para tratar condiciones caracterizadas por una activación de NTNR\alpha insuficiente o excesiva, respectivamente.

La técnica preferida para identificar moléculas que se unen al NTNR\alpha utiliza un receptor quimérico (por ejemplo, NTNR\alpha etiquetado en el epítopo o inmunoadhesina de NTNR\alpha) unido a una fase sólida, tal como el pocillo de una placa de ensayo. Se puede medir la unión de las moléculas candidatas, que están opcionalmente marcadas (por ejemplo, radiomarcadas), al receptor inmovilizado. Alternativamente, se puede medir la competición por la unión de un ligando de NTNR\alpha marcado conocido, tal como I^{125}-NTN. Para el cribado de antagonistas, el NTNR\alpha se puede exponer a un ligando de NTN seguido por un antagonista putativo, o el ligando de NTN y antagonista se pueden añadir simultáneamente al NTNR\alpha, y se puede evaluar la capacidad del antagonista para bloquear la activación de receptor.

La presente invención también proporciona sistemas de ensayo para detectar la actividad de NTN, que comprenden células que expresan niveles elevados de NTNR\alpha, y que son, por lo tanto, extremadamente sensibles incluso a muy bajas concentraciones de NTN o moléculas similares a NTN. La presente invención proporciona sistemas de ensayo en los que la actividad de NTN o actividades similares a la actividad de NTN resultantes de la exposición a un péptido o compuesto no peptídico se pueden detectar midiendo una respuesta fisiológica a NTN en una célula o línea celular sensible a NTN que expresa las moléculas de NTNR\alpha de la invención. Una respuesta fisiológica puede comprender cualquier efecto biológico de NTN, incluyendo pero sin limitarse a, los descritos en la presente, así como la activación transcripcional de ciertas secuencias de ácidos nucleicos (por ejemplo, promotor/elementos potenciadores, así como genes estructurales), procesos relacionados con NTN, traducción, o fosforilación, la inducción de procesos secundarios en respuesta a procesos directa o indirectamente inducidos por NTN, incluyendo efectos mediados por Ret, y cambios morfológicos, tales como colaterización de neuritas, o la capacidad de soportar la supervivencia de las células, por ejemplo, células ganglionales de la espina dorsal o nodose, motoneuronas, neuronas dopaminérgicas, neuronas sensoriales, células de Purkinje, o neuronas del hipocampo.

En una realización de la invención, la interacción funcional entre NTN y el NTNR\alpha se puede observar detectando un incremento en la producción de proteína Ret autofosforilada, o alternativamente, homólogos de ERK-1 o ERK-2 fosforilados (Ver Kotzbauer y otros, ver anteriormente).

La presente invención proporciona el desarrollo de sistemas de ensayo noveles que se pueden utilizar en el cribado de compuestos por la actividad de NTN o similar a NTN. Las células diana que se pueden unir a NTN se pueden producir mediante transfección con ácido nucleico que codifica NTNR\alpha o se pueden identificar o segregar mediante, por ejemplo, la clasificación de células activadas por fluorescentes, sedimentación de rosetas, o dilución limitante. Una vez se producen o identifican líneas celulares diana, puede ser deseable seleccionar células que son excepcionalmente sensibles a NTN. Dichas células diana pueden transportar un gran número de moléculas NTNR\alpha; las células diana que transportan una abundancia relativa de NTNR\alpha se pueden identificar mediante la selección de células diana que se unen a niveles elevados de NTN, por ejemplo, marcando expresores superiores con NTN etiquetado con fluoróforo seguido de detección por inmunofluorescencia y clasificación celular. Alternativamente, las células que son excepcionalmente sensibles a NTN pueden mostrar una respuesta biológica relativamente intensa en respuesta a la unión de NTN, de manera que un incremento fino en los efectos mediados por Ret o en los productos de genes inmediatamente tempranos, tales como c-fos o c-jun. Mediante el desarrollo de sistemas de ensayo que utilizan células diana que son extremadamente sensibles a NTN, la presente invención proporciona procedimientos de cribado de la actividad de NTN o similares a NTN que son capaces de detectar niveles bajos de actividad de NTN.

En particular, utilizando técnicas de ADN recombinantes, la presente invención proporciona células diana de NTN que se diseñan para que sean altamente sensibles a NTN. Por ejemplo, el gen del receptor de NTN se puede insertar en células que son sensibles a NTN de forma natural de manera que el gen de NTNR\alpha recombinante se expresa a niveles elevados y las células dianas diseñadas resultantes expresan un número elevado de NTNRs en sus superficies celulares. Alternativamente, o adicionalmente, las células diana se pueden diseñar para comprender un gen recombinante que se expresa a niveles elevados en respuesta a la unión de NTN/receptor. Dicho gen recombinante se puede asociar preferiblemente con un producto fácilmente detectable. Por ejemplo, y sin intención de limitar, las regiones de control transcripcionales (es decir, regiones de promotor/potenciador) de un gen inmediato temprano se puede utilizar para controlar la expresión de un gen reportero en una construcción que se puede introducir en las células diana. El gen inmediatamente temprano/construcción de gen reportero, cuando se expresa a niveles elevados en las células diana por el hecho de su promotor/potenciador intenso o alto número de copias, se puede utilizar para producir una respuesta amplificada a la unión de NTNR\alpha. Por ejemplo, y sin intención de limitar, un promotor sensible a NTN se puede utilizar para controlar la expresión de genes reporteros detectables que incluyen \beta-galactosidasa, hormona de crecimiento, cloroamfenicol acetil transferasa, neomicin fosfotransferasa, luciferasa, o \beta-glucuronidasa. La detección de los productos de estos genes reporteros, conocidos por un experto en la materia, pueden servir como un indicador sensible de la actividad de NTN o similares de NTN de compuestos farmacéuticos.

Las construcciones de genes que codifican NTNR\alpha o genes reporteros descritos en la presente (por ejemplo, ECD soluble) se pueden insertar en células diana utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, la transfección, la electroporación, los procedimientos del fosfato cálcico/DEAE dextrano, y pistola celular. Las construcciones y células dianas diseñadas se pueden utilizar para la producción de animales transgénicos que llevan las construcciones mencionadas anteriormente como transgenes, a partir de los cuales se pueden seleccionar las células diana que expresan NTNR\alpha utilizando procedimientos descritos.

Los ácidos nucleicos que codifican NTNR, preferiblemente de especies no humanas, tales como proteína de murino o rata, se pueden utilizar para generar animales transgénicos o animales "knock out" que, a su vez, son útiles en el desarrollo y cribado de reactivos terapéuticamente útiles. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón) es un animal que tiene células que contienen un transgén, el cual se introdujo en el animal o un antecesor del animal en una fase prenatal, por ejemplo, embrionaria. Un transgén es un ADN que se integra en el genoma de una célula desde el cual se desarrolla un animal transgénico. En una realización, el ADNc de humano y/o rata que codifica el NTNR\alpha, o una secuencia apropiada del mismo, se pueden utilizar para clonar ADN genómico que codifica NTNR\alpha según técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para generar animales transgénicos que contienen células que expresan ADN que codifica NTNR. Los procedimientos para generar animales trasngénicos, particularmente animales, tales como ratones, se han convertido en habituales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.736.866 y 4.870.009. Habitualmente, se marcarían células concretas para la incorporación del transgén de NTNR\alpha con potenciadores específicos de tejido, que podrían dar lugar al efecto deseado del tratamiento. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgén que codifica el NTNR\alpha introducido en la línea germinal del animal en una fase embrionaria se pueden utilizar para examinar el efecto del aumento de la expresión de ADN que codifica el NTNR\alpha. Dichos animales se pueden utilizar como animales de prueba para reactivos pensados para conferir una protección frente a, por ejemplo, enfermedades relacionadas con la NTN. Según este aspecto de la invención, se trata un animal con el reactivo y una incidencia baja de la enfermedad, en comparación con animales no tratados que llevan el transgén, indicaría una intervención terapéutica potencial para la
enfermedad.

Actualmente se prefieren ratones transgénicos que llevan minigenes. En primer lugar, se crea una construcción para la expresión de la enzima de fusión y se selecciona en base a la expresión en el cultivo celular, tal y como se describe en los Ejemplos. A continuación, utilizando técnicas conocidas se construye un minigén capaz de expresar la enzima de fusión. Los huéspedes particularmente preferidos son los que llevan construcciones de minigenes que comprenden un elemento transcripcional regulador que es específico de tejido para la expresión.

Los ratones transgénicos que expresan el minigen de NTNR\alpha se consiguen utilizando técnicas conocidas, que implican, por ejemplo, la recuperación de un óvulo fertilizado, la microinyección de la construcción de ADN en los pronúcleos masculino, y la reinserción del óvulo transgénico fertilizado en el útero de las madres adoptivas pseudopreñadas manipuladas hormonalmente. Alternativamente, se fabrican quimeras utilizan técnicas conocidas que usan, por ejemplo, células madre embrionarias (Rossant y otros, Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. 339:207-215 (1993)) o células germinales primordiales (Vick y otros, Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. 251:179-182 (1993)) de las especies huésped. La inserción del transgén se puede evaluar por "Southern blotting" del ADN preparado a partir de las colas de ratones hijos. A continuación, dichos ratones transgénicos se cruzan para obtener los homocigotos.

Actualmente está bien establecido que los transgenes se expresan más eficazmente si contienen intrones en el extremo 5' y si éstos son intrones naturales (Brinster y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836 (1988); Yokode y otros, Science 250:1273 (1990)).

Los ratones transgénicos que expresan el minigén de NTNR\alpha se crean utilizando procedimientos establecidos para crear ratones transgénicos. Los ratones transgénicos se construyen utilizando métodos estándar actuales (Brinster y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:836 (1988); Yokode y otros, Science 250:1273 (1990); Rubin y otros, Proc. NAtl. Acad. Sci. USA 88:434 (1991); Rubin y otros, Nature 353:265 (1991)). Los óvulos fertilizados de apareamientos a tiempo fijo se recogen del oviducto mediante un enjuagado suave con PBS y se microinyectan con hasta 100 nanolitros de una solución de ADN, liberando aproximadamente 10^{4} moléculas de ADN en los pronúcleos masculinos. A continuación, los óvulos inyectados de forma satisfactoria se reimplantan en madres de adopción pseudopreñadas mediante la transferencia en el oviducto. Menos de un 5% de los óvulos microinyectados producen crías transgénicas y sólo aproximadamente 1/3 de éstas expresan de forma activa el transgén: este número está influenciado presumiblemente por el sitio en el que el transgén entra en el genoma.

Las crías transgénicas se identifican mediante la demostración de la incorporación del transgén microinyectado en sus genomas, preferiblemente mediante la preparación ADN de secciones cortas de cola y el análisis por "Southern blotting" de la presencia del transgén ("Blots de cola"). Una sonda preferida es un segmento de una construcción de fusión de minigén que está presente únicamente en el transgén y no en el genoma del ratón. Alternativamente, la sustitución de una secuencia natural de codones en el transgén con una secuencia diferente que aún codifica el mismo péptido produce una única región identificable en el análisis de ADN y ARN. Los ratones trasngénicos "fundadores" identificados de esta forma se crían con ratones normales para producir heterocigotos, que se cruzan para crear una línea de ratones transgénicos. Los "blots de cola" de cada ratón de cada generación se examinan hasta que se establece la cepa y es homocigótica. Cada ratón fundador creado de manera satisfactoria y su cepa varían respecto a otras cepas en la localización y el número de copias de transgenes insertados en el genoma del ratón y, por lo tanto, tienen niveles ampliamente variables de expresión del transgén. Los animales seleccionados de cada línea establecida se sacrifican a los 2 meses de edad y la expresión del transgén se analiza mediante "Northern blotting" de ARN de hígado, músculo, grasa, riñón, cerebro, pulmón, corazón, bazo, gónada, glándulas adrenales e intestino.

Alternativamente, los homólogos no humanos NTNR\alpha se pueden utilizar para construir un animal "knock-out" con NTNR\alpha, es decir, que tienen un gen defectuoso o alterado que codifica NTNR, como resultado de la recombinación homóloga entre el gen de NTNR\alpha endógeno y un ADN de NTNR\alpha genómico alterado introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, el ADNC de NTNR\alpha murino se puede utilizar para clonar ADN de NTNR\alpha genómico según técnicas establecidas. Una parte del ADN de NTNR\alpha genómico (por ejemplo, tal como un exón que codifica, por ejemplo, un dominio extracelular) se puede eliminar o sustituir por otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que se puede utilizar para monitorizar la integración. Habitualmente, en el vector se incluyen varias kilobases de ADN flanqueante no alterado (en los extremos 5' y 3') (ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell 51:503 (1987) para la descripción de vectores homólogos de recombinación). El vector se introduce en línea de células madre embrionarias (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno (ver, por ejemplo, Li y otros, Cell 69:215 (1992)). Las células seleccionadas se inyectan a continuación en un blastocito de un animal (por ejemplo, un ratón) para formar quimeras de agregación (ver, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonis Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152). A continuación, se implanta un embrión quimérico en un animal adoptivo hembra pseudopreñada adecuada y el embrión se lleva a término para crear un animal "knock out". La progenie que esconde el ADN recombinado homólogamente en sus células germinales se puede identificar mediante técnicas estándar y se puede utilizar para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado homólogamente. Los animales knock out se pueden caracterizar por su capacidad para aceptar injertos, rechazar tumores y defenderse frente a enfermedades infecciosas y se pueden utilizar en el estudio de inmunobiología básica.

Además de los procedimientos anteriores, que se pueden utilizar para preparar las moléculas de ADN recombinante y transformar los animales huésped según la práctica de la presente invención, se pueden utilizar otras técnicas y modificaciones conocidas de los mismos a la hora de llevar a cabo la presente invención. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 4.736.866 describe vectores y procedimientos para la producción de un animal eucariótico transgénico no humano cuyas células germinales y células somáticas contienen una secuencia de genes introducida en el animal, o un antecesor del animal, en una etapa embrionaria. La Patente de Estados Unidos No. 5.087.571 describe un procedimiento de suministro de un cultivo de células que comprende (1) proporcionar un mamífero transgénico no humano, en el que todas todas las células germinales y células somáticas contiene una secuencia de gen recombinante introducida en una etapa embrionaria; y (2) cultivar una o más de dichas células somáticas. La Patente de Estados Unidos No. 5.175.385 describe vectores y procedimientos para la producción de un ratón transgénico cuyas células somáticas y germinales contienen y expresan un gen en niveles suficientes para proporcionar el fenotipo deseado en el ratón, habiéndose introducido el gen en dicho ratón o en un antecesor de dicho ratón en una etapa embrionaria, preferiblemente mediante microinyección. Se utilizó un promotor parcialmente constitutivo, el promotor de metalotioneina, para dirigir la expresión del gen heterólogo. La Patente de Estados Unidos No. 5.175.384 describe un procedimiento de introducción de un transgén en un embrión mediante la infección del embrión con un retrovirus que contiene el transgén. La Patente de Estados Unidos No. 5.175.383 describe construcciones de ADN que tienen un gen, homólogo a la célula huésped, unido operativamente a un promotor heterólogo e inducible eficaz para la expresión del gen en el tejido urogenital de un ratón, introduciendo el transgén en el ratón en una etapa embrionaria para producir un ratón transgénico. Aunque se introduce un gen homólogo, el gen se puede integrar en un cromosoma del ratón en un sitio diferente de la localización de la secuencia de codificación endógena. El promotor MMTV vital se describió como un promotor inducible adecuado. La Patente de Estados Unidos No. 5.162.215 describe procedimientos y vectores para la transferencia de genes en especias aviarias, incluyendo especies de ganado, tales como pollos, pavos, codornices o patos, utilizando células madre pluripotentes de embriones para producir animales transgénicos. La Patente de Estados Unidos No. 5.082.779 describe promotores de expresión específica de la pituitaria para su utilización en la producción de animales transgénicos capaces de la expresión de un gen específico de tejido. La Patente de Estados Unidos No. 5.075.229 describe vectores y procedimientos para producir animales transgénicos quiméricos cuyas células hematopoyéticas del hígado contienen y expresan un gen funcional conducido por un promotor específico de hígado, mediante la inyección en la cavidad peritoneal de un feto huésped de los vectores descritos, de manera que el vector se integra en el genoma de las células hematopoéticas del hígado fetal.

A pesar de que algunas de las patentes y publicaciones mencionadas anteriormente están dirigidas a la producción o utilización de un producto o material génico concreto que no están dentro del alcance de la presente invención, los procedimientos descritos en las mismas se pueden modificar fácilmente para la práctica de la invención descrita en esta memoria por lo expertos en la fermentación e ingeniería genética.

Los sistemas de ensayo de la presente invención permiten el cribado eficaz de compuestos farmacéuticos para su utilización en el tratamiento de enfermedades asociadas con NTN. Por ejemplo, y sin pretender limitar, puede ser deseable cribar un agente farmacéutico para la actividad de NTN y la eficacia terapéutica en la degeneración cerebelar. En una realización de la invención, las células sensibles a NTN se pueden identificar y aislar, y a continuación, cultivar en micropocillos en una placa de cultivo de multipocillos. El medio de cultivo con agente de prueba añadido, o NTN añadida, se puede añadir en numerosas diluciones a los pocillos, junto con los controles adecuados. A continuación, las células se pueden examinar por la mejor supervivencia, colateralización de neuritas, y similares, y se puede determinar la actividad del agente de prueba y la NTN, así como sus actividades relativas. Por ejemplo, actualmente se pueden identificar compuestos similares a NTN que pueden, como la NTN, prevenir la muerte celular por motoneuronas en respuesta a un ataque tóxico o axotomía, por ejemplo, las motoneuronas sensibles a NTN se pueden utilizar en sistemas de ensayo para identificar compuestos útiles en el tratamiento de enfermedades de las motoneuronas. Si se encuentra que una enfermedad concreta está asociada con una respuesta de NTN defectuosa en un tejido particular, se suministraría al paciente un tratamiento racional para la enfermedad con NTN exógena. Sin embargo, puede ser deseable desarrollar moléculas que tengan una vida media más larga que la NTN endógena, o que actúen como agonistas de NTN, o que están dirigidos a un tejido concreto. Por consiguiente, los procedimientos de la invención se pueden utilizar para producir sistemas de cribado eficaces y sensibles que se pueden utilizar para identificar moléculas con las propiedades deseadas. Se podrían utilizar sistemas de ensayo similares para identificar los antagonistas de la NTN.

Además, la presente invención proporciona sistemas de modelos experimentales para estudiar la función fisiológica de la NTN y su receptor. Entre dichos sistemas se incluyen modelos de animales, tales como (i) animales expuestos a péptidos de NTNR\alpha circulantes que compiten con el receptor celular para la unión a NTN y produce así una condición de eliminación de NTN, (ii) animales inmunizados con NTNR; (iii) animales transgénicos que expresan niveles elevados de NTNR\alpha y, por lo tanto, son hipersensibles a NTN; y (iv) animales derivados utilizando la tecnología de células madres embrionarias en los que los genes de NTNR\alpha endógenos se eliminaron del genoma.

La presente invención también proporciona sistemas modelos experimentales para estudiar la función fisiológica de NTN y su receptor. En estos sistemas modelos la proteína NTNR\alpha, fragmento de péptido, o un derivado de los mismos, se pueden suministrar al sistema o producir dentro del sistema. Dichos sistemas modelos se podrían utilizar para estudiar los efectos del exceso de NTN o eliminación de NTN. Los sistemas modelos experimentales se pueden utilizar para estudiar los efectos de la mayor o menor respuesta a NTN en los cultivos de células o tejidos, en todos los animales, en células o tejidos concretos dentro de todos los animales o en sistemas de cultivo de tejidos, o sobre intervalos de tiempo especificados (incluyendo durante la embriogénesis) en realizaciones en las que la expresión de NTNR\alpha está controlada por un promotor inducible o desarrolladamente regulado. En una realización particular de la invención, se puede utilizar el promotor CMV para controlar la expresión del NTNR\alpha en animales transgénicos. Los animales transgénicos, tal y como se describe en la presente, se producen por cualquier procedimientos conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, la microinyección, fusión celular, transfección y electroporación.

La presente invención también proporciona sistemas modelo para una enfermedad autoinmune en la que una respuesta autoinmune está dirigida a NTNR\alpha. Dichos modelos comprenden animales que han sido inmunizados con cantidades inmunogénicas de NTNR\alpha y se encuentra que preferiblemente producen anticuerpos anti-NTNR\alpha y/o una inmunidad mediada por células. Para producir dicho sistema modelo, puede ser deseable administrar el NTNR\alpha junto con un adyuvante inmune.

Por ejemplo, y sin pretender limitar, se puede crear un sistema modelo experimental que se puede utilizar para estudiar los efectos de la actividad de NTN en exceso. En dicho sistema, la respuesta a NTN se puede incrementar mediante el diseño de un mayor número de NTNRs en células del sistema modelo en relación con las células que no se han diseñado de esta manera. Estas células deberían expresar también Ret u otra molécula de señalización capaz de interaccionar con NTNR\alpha y mediar una señal de NTN. Puede ser preferible proporcionar un mayor número de NTNRs selectivamente en células que normalmente expresan NTNRs. Las células se pueden diseñar para producir mayores cantidades de NTNR\alpha mediante infección con un virus que transporta un gen de NTNR\alpha de la invención. Alternativamente, el gen de NTNR\alpha se puede suministrar a las células por transfección. Si el sistema modelo es un animal, se puede introducir un gen de NTNR\alpha recombinante en las células del animal mediante la infección con un virus que transporta el gen de NTNR\alpha u otros medios tal y como se describe en la presente. Por ejemplo, un animal transgénico se puede crear de manera que transporta el gen de NTNR\alpha como transgén. Para asegurar la expresión de NTNR, el gen de NTNR\alpha se debería situar bajo control de una secuencia de promotor adecuada. Puede ser deseable poner el gen de NTNR\alpha bajo el control de un promotor constitutivo y/o específico de tejido. Mediante el incremento del número de NTNRs celulares, se puede incrementar la respuesta a NTN endógena. Si el sistema modelo contiene poca o ninguna NTN, se puede añadir NTN al sistema. También puede ser deseable añadir NTN adicional al sistema modelo para evaluar los efectos de la actividad de NTN en exceso. La sobreexpresión de NTN (o NTN secretada) puede ser el procedimiento preferible para estudiar los efectos o niveles elevados de NTN en células que ya expresan NTNR. Más preferiblemente sería expresar NTNR\alpha en todas las células (expresión general) y determinar qué células están entonces dotadas con la sensibilidad funcional a NTN, permitiendo así la potencial identificación de un segundo componente del receptor, si existe alguno.

Se puede crear un sistema modelo experimental que se puede utilizar para estudiar los efectos de la actividad de NTN disminuida. Este sistema puede permitir la identificación de procesos o neuronas que requieren la NTN, y que pueden representar dianas terapéuticas potenciales. En dicho sistema, la respuesta a NTN se puede disminuir proporcionando NTNRs recombinantes que no están asociados con una superficie celular o que están diseñados para que sean ineficaces en la transducción de una respuesta a NTN. Por ejemplo, la proteína, péptido o derivado de NTNR\alpha se puede suministrar al sistema, de manera que el receptor suministrado puede competir con el NTNR\alpha endógeno para la unión de NTN, disminuyendo así la respuesta a NTN. El NTNR\alpha puede ser un receptor libre de la célula que es añadido al sistema o producido por el sistema. Por ejemplo, se puede producir una proteína NTNR\alpha que le falta el dominio transmembrana por células del interior del sistema, tal como un NTNR\alpha no establecido que se puede secretar a partir de la célula productora. Alternativamente, la proteína, péptido o derivado de NTNR\alpha se puede añadir a un espacio extracelular en el interior del sistema. En realizaciones adicionales de la invención, se puede utilizar un gen de NTNR\alpha recombinante para inactivar o "knock out" el gen endógeno mediante recombinación homóloga, y crear así una célula, animal o tejido deficiente en NTNR\alpha. Por ejemplo, y sin intención de limitar, se puede diseñar un gen de NTNR\alpha recombinante para contener una mutación por inserción, por ejemplo, el nuevo gen, que inactiva el NTNR. Dicha construcción, bajo el control de un promotor adecuado, se puede introducir en una célula, tal como una célula madre embrionaria, mediante una técnica, tal como transfección, transducción, inyección, etc. Las células que contienen la construcción, a continuación, se pueden seleccionar por la resistencia a G418. A continuación, se pueden identificar las células que tienen una falta de gen de NTNR\alpha intacto, por ejemplo, mediante "Southern blotting" o "Northern blotting" o un ensayo de expresión. A continuación, las células que tienen una falta de gen de NTNR\alpha intacto se pueden fusionar a células embrionarias primarias para generar animales transgénicos deficientes en NTNR. Una comparación de dicho animal con un animal que no expresa NTN endógeno revelaría que o los dos fenotipos concuerdan completamente o que no lo hacen, implicando la presencia de factores o receptores similares a NTN adicionales. Dicho animal se puede utilizar para definir las poblaciones celulares específicas, por ejemplo, las poblaciones neuronales, o cualquier otro proceso in vivo, normalmente dependiente de NTN o su receptor. De este modo, se puede esperar que estas poblaciones o procesos se puedan llevar a cabo si el animal no expresaba el NTNR\alpha y, por lo tanto, no podía responder a la NTN. Alternativamente, una proteína, péptido o derivado de NTNR\alpha que compite con el receptor endógeno por NTN se puede expresar en la superficie de las células en el interior del sistema, pero se puede diseñar para que no transduzca una respuesta a la unión de NTN. Las proteínas, péptidos o derivados de NTNR\alpha recombinantes descritos anteriormente se pueden unir a NTN con una afinidad que es similar o diferente de la afinidad de NTNR\alpha endógeno a NTN. Para disminuir de manera más eficaz la respuesta a NTN, la proteína, péptido o derivado de NTNR\alpha se puede unir deseablemente a NTN con una mayor afinidad que la exhibida por el receptor nativo. Si la proteína, péptido o derivado de NTNR\alpha se produce dentro del sistema modelo, el ácido nucleico que codifica la proteína, péptido o derivado de NTNR\alpha se puede suministrar al sistema mediante infección, transducción, transfección, etc. o como un transgén. Tal y como se ha descrito anteriormente, el gen de NTNR\alpha se puede colocar bajo el control de un promotor adecuado, que puede ser, por ejemplo, un promotor específico de tejido o un promotor inducible o un promotor desarrolladamente regulado. En una realización específica de la invención el gen de NTNR\alpha endógeno de una célula se puede sustituir por un gen de NTNR\alpha mutante mediante recombinación homóloga. En una realización adicional de la invención, la expresión de NTNR\alpha se puede reducir mediante la disposición de células que expresan NTNR\alpha con una cantidad de ARN o ADN antisentido de NTNR\alpha eficaz para reducir la expresión de la proteína NTNR\alpha.

Los polipéptidos de la invención también encuentran uso como aditivos de alimentación para animales. Los ácidos nucleicos de la invención encuentran uso en la preparación de estos polipéptidos.

Los polipéptidos de NTNR\alpha también son útiles como marcadores del peso molecular. Para utilizar un polipéptido de NTNR\alpha como marcador del peso molecular, se utilizará una cromatografía de filtración por gel o SDS-PAGE, por ejemplo, para separar proteína o preoteínas para las que se desea determinar sus pesos pesos moleculares en sustancialmente el camino normal. El NTNR\alpha, preferiblemente un NTNR soluble, y otros marcadores de peso molecular se utilizarán como patrones para proporcionar un intervalo de pesos moleculares. Por ejemplo, la fosforilasa b (peso molecular = 97.400), albúmina de suero bovino (peso molecular = 68.000), ovalbúmina (peso molecular = 46.000), inhibidor de tripsina (peso molecular = 20.100) y lisozima (peso molecular = 14.400) se pueden utilizar como marcadores del peso molecular. Los otros marcadores del peso molecular mencionados en la presente se pueden adquirir comercialmente de Amersham Corporation, Arlington Heights, IL. Los marcadores de peso molecular están generalmente marcados para facilitar la detección de los mismos. Por ejemplo, los marcadores se pueden biotinilar y tras la separación, se pueden incubar con estreptavidina-peroxidasa de rábano picante, de manera que se pueden detectar varios marcadores mediante detección con luz.

El NTNR\alpha purificado, y el ácido nucleico que lo codifica, también se pueden vender como reactivos para los estudios del mecanismo del NTNR\alpha y sus ligandos, para estudiar la función del NTNR\alpha y el ligando de NTN en el crecimiento y desarrollo normal, así como en el crecimiento y desarrollo anormal, por ejemplo, en tumores. Las sondas de NTNR\alpha se pueden utilizar para identificar las células y tejidos que son sensibles a NTN en estados normales o enfermos. Por ejemplo, un paciente que sufre de un trastorno relacionado con NTN puede mostrar una aberración en la expresión de NTNR\alpha. La presente invención proporciona procedimientos para identificar células que son sensibles a NTN que comprenden la detección de la expresión de NTNR\alpha en dichas células. La expresión de NTNR\alpha se puede evidenciar mediante la transcripción de ARNm de NTNR\alpha o la producción de la proteína NTNR\alpha. La expresión de NTNR\alpha se puede detectar utilizando sondas que identifican el ácido nucleico de NTNR\alpha o la proteína NTNR\alpha. Una variedad de sonda que se puede utilizar para detectar la expresión de NTNR\alpha es una sonda de ácido nucleico que se puede utilizar para detectar el ARN que codifica en NTNR mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, hibridación in situ, análisis por "Northern blot", o técnicas relacionadas con la PCR. Otra variedad de sonda que se puede utilizar en la NTN con tag, tal y como se describe en la presente.

Según la presente invención, la NTN con tag se puede incubar con células en condiciones que impulsarían la unión o acoplamiento de NTN a dichas células. En la mayoría de los casos, esto se puede conseguir bajo condiciones de cultivo estándar. Por ejemplo, en una realización de la invención, las células se pueden incubar durante aproximadamente 30 minutos en presencia de NTN con tag. Si la tages una molécula de anticuerpo, puede ser preferible permitir que la NTN se una primero a las células y posteriormente se laven las células para eliminar el ligando no unido y, a continuación, añadir una tagde anticuerpo anti-NTN. En otra realización de la invención, la NTN con tag en la superficie de las células sensibles a NTN, denominadas a partir de ahora células diana, se pueden detectar mediante ensayos de formación de rosetas en los que las células indicadoras que son capaces de unirse a la tagse incuban con células que transportan la NTN con tag, de manera que se adhieren a NTN con tag en las células diana y las células indicadoras unidas forman clústers parecidos a rosetas alrededor de las células que transportan NTN con tag. Estas rosetas se pueden visualizar mediante técnicas estándar de microscopía o células en placa o, alternativamente, pueden permitir la separación de células con rosetas y sin rosetas por centrifugación por gradiente de densidad. En una realización específica preferida de la invención, las células diana, tales como células neuronales. En realizaciones alternativas de la invención, la NTN con tag en la superficie de las células diana se puede detectar utilizando técnicas inmunofluorescentes en las que una molécula que reacciona con la etiqueta, preferiblemente un anticuerpo, produce directa o indirectamente luz fluorescente. La fluorescencia se puede observar con un microscopio o se puede utilizar para segregar células que transportan NTN con tag mediante técnicas de clasificación de células activadas por fluorescencia. La presente invención también proporciona procedimientos para detectar otras formas de etiquetas, tales como etiquetas cromogénicas y etiquetas catalíticas. Un anticuerpo anti-NTNR\alpha también se puede utilizar como sonda. Los procedimientos de detección para cualquier tagparticular dependerán de las condiciones necesarias para producir una señal de la etiqueta, pero deberían ser fácilmente perceptibles por un experto en la materia.

Las variantes de NTNR\alpha son útiles como patrones o controles en ensayos para el NTNR\alpha, por ejemplo, ELISA, RIA o RRA, siempre y cuando se reconozcan mediante el sistema analítico utilizado, por ejemplo, un anticuerpo anti-NTNR\alpha.

Los anticuerpos policlonales generalmente se desarrollan en animales mediante inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno pertinente y un adyuvante. En el que el epítopo preferido está en el ECD del NTNR\alpha, es deseable utilizar ECD de NTNR\alpha o una molécula que comprende ECD (por ejemplo, inmunoadhesina de NTNR\alpha) como el antígeno para la generación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Puede ser útil conjugar el antígeno pertinente a una proteína que es inmunogénica en las especies a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de la lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soja, utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de los residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de los residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R^{1}N=C=NR, donde R y R^{1} son grupos alquilo diferentes.

Los animales se inmunizan frente al antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados mediante la combinación de 1 mg ó 1 \mug del péptido o conjugado (para ratones o conejos, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund y la inyección de la solución de forma intradermal en múltiples puntos. Un mes más tarde, los animales se estimularon con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en el adyuvante completo de Freund mediante la inyección subcutánea en múltiples puntos. De siete a 14 días después, los animales sangraron y el suero se ensayó para saber la concentración de anticuerpo. Los animales se estimularon hasta el plateau de concentración. Preferiblemente, el animal se estimula con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también se pueden producir en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteínas. Además, los agentes de agregación, tales como el alumbre se utilizan de forma adecuada para aumentar la respuesta inmunológica.

Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. De este modo, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo en tanto en cuanto no es una mezcla de anticuerpos diferenciados.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir utilizando el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y otros, Nature, 256:495 (1975) o se pueden producir mediante procedimientos de ADN recombinante (Cabilly y otros, ver anteriormente).

En el procedimiento del hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, tal y como se ha descrito anteriormente en la presente para obtener linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. A continuación, los linfocitos se fusionan a las células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press. 1986)).

Las células de hibridoma preparadas de esta manera se siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma parentales no fusionadas. Por ejemplo, si a las células de mieloma parentales les falta la enzima hipozantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o PRET), el medio de cultivo para los hibridomas habitualmente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT), cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes de HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son las que se fusionan de manera eficaz, soportan una producción estable a alto nivel de anticuerpo mediante células seleccionadas productoras de anticuerpos y son sensibles a un medio, tal como un medio HAT. Entre éstas, las líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma de murino, tales como las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles el Salk Institute Cell Distribution Center, San diego, California USA, y células SP-2 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Las líneas celulares de mieloma humana y heteromieloma de humano-ratón también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y otros, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva york, 1987)).

Se ensaya el medio de cultivo en el que las células del hibridoma crecen para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA).

\newpage

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, mediante el análisis Scatchard de Munson y otros, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después de identificar las células del hibridoma que producen los anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante los procedimientos de dilución limitante y se pueden desarrollar mediante procedimientos estándar (Goding, ver anteriormente). Entre los medios de cultivo adecuados para este objetivo se incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células del hibridoma se pueden desarrollar in vivo como tumores en ascitos en un animal.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de manera adecuada del medio de cultivo, fluido de ascites, o suero mediante procedimientos de purificación con inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, cromatografía con proteína A-Sefarosa, cromatografía con hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

La capacidad de los MAbs de bloquear la unión de NTN a su receptor se puede evaluar mediante ELISA y bioensayos que utilizan reactivos disponibles (rhNTNr-IgG: una línea celular de CHO transfectada estable que expresa NTNR\alpha). Las actividades neutralizantes también se pueden evaluar mediante un ensayo o ensayos de supervivencia neuronal.

Los MAbs específicos de NTNR se pueden desarrollar tal y como se ha descrito anteriormente utilizando, por ejemplo, la inmunoadhesina receptora y la línea celular transfectada, para iniciar nuevos protocolos de inmunización para generar MAbs específicos de NTNR para su uso como potenciales agonistas o antagonistas, así como para la inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, y desarrollo del ensayo. Los MAbs generados de la fusión de los animales inmunizados se puede cribar para las actividades de agonistas y antagonistas mediante un bioensayo (por ejemplo, ensayos de supervivencia de neuronas, transducción de señal/fosforilación, ensayos de supervivencia de células renales), así como mediante ELISA y FACS (bloqueo funcional de la unión NTN-NTNR\alpha). Las técnicas adecuadas se disponen en, por ejemplo, Lucas y otros, J. Immunol. 145:1415-1422 (1990); Hoogenraad y otros, J. Immunol. Methods 6:317-320 (1983); Moks y otros, Eur. J. Biochem. 85:1205-1210 (1986); Laemmli, Nature (London) 227:680-685 (1970); y Towbin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 76:4350-4354 (1979).

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de nucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que, a continuación, se transfectan en células huésped, tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otra manera proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Entre los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo se incluyen Skerra y otros, Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992).

En una realización adicional, se pueden aislar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de las bibliotecas de fagos de anticuerpos generados utilizando las técnicas descritas en McCafferty y otros, Nature, 348:552-554 (1990). Clacksan y otros, Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y otros, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos de alta afinidad (rango nM) mediante el reordenamiento de la cadena (Mark y otros, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia para la construcción de bibliotecas de fagos muy amplias (Waterhouse y otros, Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). De este modo, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridomas de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación para los dominios constantes de cadena pesada y ligera en humanos en lugar de las secuencias homólogas de murino (Cabilly y otros, ver anteriormente; Morrison y otros; Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), o mediante la unión covalente a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina de toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido que no es inmunoglobulina.

Habitualmente, dichos polipéptidos que no son inmunoglobulinas están sustituidos por los dominios constantes de un anticuerpo, o están sustituidos por los dominios variables de un sitio de combinación a antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico, que comprende un sitio de combinación a antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación a antígeno que tienen especificidad por otro antígeno diferente.

Los anticuerpos quiméricos o híbridos también se pueden preparar in vitro utilizando procedimientos conocidos en la química sintética de proteína, incluyendo los que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir utilizando una reacción de intercambio de puentes disulfuro o mediante la formación de enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este objetivo se incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato.

\newpage

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo desde una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se les denomina frecuentemente como residuos "importados", que se toman habitualmente de un dominio variable "importado". La humanización se puede llevar a cabo esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Jones y otros, Nature, 321:522.525 (1986); Riechmann y otros, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y otros, Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las secuencias de CDR o CDRs de roedor por las correspondientes secuencias de anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Cabilly y otros, ver anteriormente), en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la correspondiente secuencia de una especie no humana. A la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR están sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a utilizar en la fabricación de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir antigenicidad. Según el procedimiento denominado "mejor-ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de un roedor se criba frente la biblioteca completa de secuencias de dominios variables humanos conocidas. La secuencia humana que está más próxima a la del roedor es entonces aceptada como el marco (FR) humano para el anticuerpo humanizado (Sims y otros, J. Immunol., 151:2296 (1993); Clothia y otros, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro procedimiento utiliza un marco concreto derivado de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. El mismo marco se puede utilizar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta y otros, J. Immunol., 151:2623 (1993)).

También es importante que los anticuerpos se humanicen con la retención de una afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, según un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulinas tridimensionales están disponibles habitualmente y son familiares para los expertos en la materia. Hay programas informáticos disponibles que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas imágenes permite el análisis de la probable función de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar de las secuencias de consenso e importadas, de manera que se consigue la característica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad por el antígeno o antígenos diana. En general, los residuos de CDR están directamente y muy sustancialmente implicados en la influencia de la unión del antígeno.

Alternativamente, actualmente es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un completo repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (J_{H}) en ratones mutantes quiméricos y en la línea germinal, da lugar a la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulinas de la línea germinal humana a dicho ratón mutante en la línea germinal dará lugar a la producción de anticuerpos humanos tras el reto del antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits y otros, Proc. Natl. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits y otros, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y otros, Year in Immuno., 7:33 (1993). Los anticuerpos humanos también se pueden producir en bibliotecas de exhibición de fagos (Hoogenboom y otros, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks y otros, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)).

Los anticuerpos biespecíficos (BsAbs) son anticuerpos que tienen especificidades de unión por por lo menos dos antígenos diferentes. Los BsAbs se pueden utilizar como agentes marcadores o de imagen de tumores y se pueden utilizar para dirigir enzimas o toxinas a una célula que posee el NTNR\alpha. Dichos anticuerpos se pueden derivar de anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}). Según la presente invención, el BsAb puede poseer un brazo que une el NTNR\alpha y otro brazo que se une a una citocina u otro receptor de citocina (o una subunidad del mismo), tales como los receptores para TPO, EPO, G-CSF, IL-4, IL-7, GH, PRL; las subunidades \alpha o \beta de los receptores IL-3, Gm-CSF, IL-5, IL-6, LIF, OSM y CNTF; o las subunidades \alpha, \beta, o \gamma del complejo receptor IL-2. Por ejemplo, el BsAb se puede unir a NTNR\alpha y gp130.

Los procedimientos para fabricar anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein y otros, Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de las cadenas ligera y pesada de las inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadrotas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas diferentes de anticuerpo, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza habitualmente por etapas de cromatografía de afinidad, es bastante incómoda, y los rendimientos del producto son bajos. Se describen procedimientos similares en WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker y otros, EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

\newpage

Según una aproximación diferente y más preferida, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulinas. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra, CH2, y regiones CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión a cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en realizaciones cuando las proporciones desiguales de las cadenas de los tres polipéptidos utilizados en la construcción proporcionan rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación de dos o todas las cadenas de los tres polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptidos en proporciones iguales da lugar a rendimientos elevados o cuando las proporciones no tienen una particular significación.

En una realización preferida de esta aproximación, los anticuerpos biespecíficos de componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y una pareja de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma fácil de separación. Esta aproximación se describe en WO 94/04690 publicada el 3 de marzo de 1994. Para mayores detalles de la generación anticuerpos biespecíficos, ver, por ejemplo, Suresh y otros, Methods in Enzimology, 121:210 (1986).

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidita, el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir las células del sistema inmunológico a células no deseadas (Patente de Estados Unidos No. 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Los anticuerpos de heteroconjugado se pueden fabricar utilizando cualquier procedimiento de reticulación adecuado. Los agentes de reticulación adecuados son conocidos en la técnica, y se describen en la Patente de Estados Unidos No. 4.676.980, junto con un grupo de técnicas de reticulación.

En la literatura también se han descrito técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Las siguientes técnicas también se pueden utilizar para la producción de fragmentos de anticuerpo bivalente que no son necesariamente biespecíficos. Según estas técnicas, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar de E. coli, los cuales se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos bivalentes. Shalaby y otros, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula de BsAB F(ab')_{2} completamente humanizada. Cada fragmento de Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió a un acoplamiento químico dirigido in vitro para formar BsAb. El BsAb formado de esta manera era capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor HER2 y células T humanas normales, así como desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos frente a marcadores de tumores de mama humanos. Ver también Rodríguez y otros, Int. J. Cancers (Suppl) 7:45-50 (1992).

También se han descrito varias técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos bivalentes aislantes directamente de cultivos celulares recombinantes. Por ejemplo, se han producido heterodímeros bivalentes utilizando zippers de leucina. Kostelny y otros, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de zipper de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región de la bisagra para formar monómeros y, a continuación, se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. La tecnología "diabody" descrita por Hollinger y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de BsAb. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los 5 dominios de V_{H} y V_{L} de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios V_{L} y V_{H} complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. También se ha descrito otra estrategia para fabricar fragmentos de BsAb mediante la utilización de dímeros de cadenas únicas Fv (sFv). Ver Gruber y otros, J. Immunol., 152:5368 (1994).

Los agonistas de NTNT\alpha (incluyendo NTN) y anticuerpos de NTNT\alpha agonistas de la presente invención se pueden utilizar para aumentar la hematopoyesis esplénica, permitiendo la repoblación parcial de linajes de células sanguíneas en paciente que han experimentado quimioterapia o terapia por radiación y transplante. Generalmente, los anticuerpos actuarán para aumentar la proliferación y/o diferenciación (pero especialmente la proliferación) de células hematopoyéticas en el bazo. Sin limitarse a la teoría, los agonistas de NTNT\alpha pueden actuar directamente como un factor de crecimiento, supervivencia o diferenciación para células hematopoyéticas en el bazo y/o pueden actuar indirectamente en un medio estromal esplénico (posiblemente neuronas implicadas en la inervación esplénica) para producir otro factor que es responsable del mantenimiento de los linajes hematopoyéticos. En cualquier caso, tal y como se muestra en la presente, el agonista de NTNT\alpha, incluyendo NTN, tienen un beneficio terapéutico en el facilitamiento del prendimiento esplénico de transplantes de médula ósea tras la irradiación o quimioterapia o para la estimulación de hematopoyesis extramedular en el bazo (que es normal en roedores, pero no se observa normalmente en el hombre) en las condiciones en las que existe una mayor demanda de producción de células sanguíneas debido a anemia (glóbulos rojos), infección crónica (neutrófilos), fallo en la médula ósea (todos los linajes), y deficiencia inmunológica (linfocitos). Los agonistas se pueden utilizar de forma similar para tratar enfermedades caracterizadas por un descenso en las células sanguíneas. Entre los ejemplos de estas enfermedades se incluyes: anemia (incluyendo anemia macrocítica y aplástica); trombocitopenia; hipoplasia; púrpura trombocitopénica inmune (autoinmune) (ITP); ITP inducida por VIH. Además, los agonistas se pueden utilizar para tratar un paciente que ha sufrido una hemorragia.

Entre las aplicaciones terapéuticas para anticuerpos neutralizantes de NTNR\alpha se incluyen el tratamiento de trastornos metabólicos y tumores celulares en sitios de expresión de NTNR\alpha, especialmente los tumores caracterizados por la sobreexpresión de NTNR\alpha.

Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos de NTNR\alpha de la invención se administran a un mamífero, preferiblemente a un humano, en una forma de dosificación fisiológicamente aceptable, incluyendo aquéllas que se pueden administrar a una humano intravenosamente como un bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, mediante una ruta intramuscular, intraperitoneal, intra-cerebroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinuvial, intratecal, oral, tópica o inhalación. Los anticuerpos de NTNR\alpha también se administran de forma adecuada mediante una ruta intratumoral, peritumoral, intralesional, o perilesional o a la linfa, para ejercer efector terapéuticos locales así como sistémicos.

Dichas formas de dosificación comprenden portadores fisiológicamente aceptables que son inherentemente no tóxicos y no terapéuticos. Entre los ejemplos de dichos portadores se incluyen intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas de suero, tales como albúmina de suero humano, sustancias tamponadoras, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos saturados de vegetales, agua, sales, o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrógeno fosfato disódico, hidrógeno fosfato potásico, cloruro sódico, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato magnésico, polivinil pirrilidona, sustancias basadas en celulosa, y PEG. Entre los portadores para formas tópicas o en base de gel de anticuerpos de NTNR\alpha se incluyen polisacáridos, tales comocarboximetilcelulosa o metilcelulosa sódica, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, polímeros de bloque polioxietileno-polioxipropileno, PEG, y alcoholes de cera de madera. Para todas las administraciones, las formas de de depósito convencionales se utilizan de forma adecuada. Entre dichas formas se incluyen, por ejemplo, microcápsulas, nanocápsulas, liposomas, tiritas, formas de inhalación, pulverizadores nasales, comprimidos sublinguales y preparaciones de liberación controlada. El anticuerpo de NTNR\alpha se formulará habitualmente en dichos vehículos a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml.

Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo de NTNR\alpha, las cuales están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) tal y como se describe por Langer y otros, ver anteriormente, y Langer, ver anteriormente, o poli(vinilalcohol), poliláctidos (Patente de Estados Unidos No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato (Sidman y otros, ver anteriormente), etileno-acetato de vinilo no degradable (Langer y otros, ver anteriormente), copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como Lupron Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide), y ácido de poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros, tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico, permiten la liberación de moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos de NTNR\alpha encapsulados permanecen en el cuerpo durante un periodo largo de tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, dando lugar a una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden idear estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuros, se puede conseguir la estabilización mediante la modificación de residuos de sulfhidrilo, la liofilización de soluciones ácidas, el control del contenido de la humedad, la utilización de aditivos apropiados, y el desarrollo de composiciones de matriz de polímeros específicas.

Las composiciones de anticuerpos de NTNR\alpha de liberación controlada también incluyen anticuerpos liposomalmente atrapados. Los liposomas que contienen los anticuerpos de NTNR\alpha se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang y otros, Proc. NAtl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); y las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.485.045 y 4.544.545. Normalmente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeños (aproximadamente de 200-800 Angstroms) en los que el contenido de lípidos es superior a aproximadamente un 30% molar de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia óptima de anticuerpos de NTNR\alpha. Los liposomas con un mayor tiempo de circulación se describen en la Patente de Estados Unidos No. 5.013.556.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de anticuerpo de NTNR\alpha dependerá del tipo de enfermedad a tratar, tal y como se ha definido anteriormente, la gravedad y curso de la enfermedad, si los anticuerpos de administran con objetivos preventivos o terapéuticos, terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo de NTNR\alpha, y la discreción del profesional sanitario al cargo. El anticuerpo de NTNR\alpha se administra de forma adecuada al paciente de una vez o en una serie de tratamientos.

Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad, aproximadamente de 1 \mug/kg a 15 mg/kg de anticuerpo de NTNR\alpha es una dosis candidata inicial para la administración al paciente, tanto, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosis diaria habitual podría variar entre aproximadamente 1 \mug/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantiene hasta que tiene lugar la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas de dosificación. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

Los modelos de animales están disponibles para evaluar los efectos de los compuestos y el procedimiento de la invención. Por ejemplo, para evaluar los efectos del tratamiento de riñones dañados con composiciones que afectan al crecimiento (Toback, 1977, Toback y otros, 1977), se administra una inyección intravenosa de 1,0 a 1,1 mg de mercurio por kg de peso corporal como HgCl_{2} a ratas para inducir un síndrome reversible de fallo renal agudo no oligúrico agudo. Después de un día, hay incrementos destacados en la concentración de nitrógeno de urea en el suero (SUN), la excreción urinaria de sodio y proteína, y la necrosis de células del tubular proximal. Por el día 2, los incrementos en la síntesis de fosfólipidos, ADN y ARN, y el índice mitótico indican que la regeneración celular está en proceso. Por el día tres, la SUN alcanza un máximo, y aparecen células epiteliales escamoides en la membrana basal tubular. En el día cinco, la SUN regresa a sus valores normales, se alcanza la velocidad máxima de la síntesis de fosfolípidos, y los túmulos se repoblan con más células maduras. Los efectos de la infusión de una composición de factores de crecimiento autocrino en la estructura renal se compara con ratas no tratadas y animales administrados con un vehículo solo durante el transcurso del síndrome de la necrosis tubular aguda inducida por cloruro mercúrico descrito anteriormente.

Los anticuerpos de NTNR\alpha de la invención también son útiles como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos contra NTNR\alpha se inmovilizan en un soporte adecuado, tal como resina de Sephadex o papel del filtro, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. A continuación, el anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el NTNR\alpha a purificar, y a continuación, se lava el soporte con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material en la muestra a excepción del NTNR\alpha, que está unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado, tal como tampón de glicina, pH 5,0, que liberará el NTNR\alpha del anticuerpo.

Los anticuerpos de NTNR\alpha también pueden ser útiles en los ensayos de diagnóstico para NTNR\alpha, por ejemplo, la detección de su expresión en células, tejidos o suero específicos. Para aplicaciones diagnósticas, los anticuerpos se marcarán habitualmente con una parte detectable. La parte detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la parte detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I; un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante.

Se puede utilizar cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar de forma separada la variante de polipéptido a la parte detectable, incluyendo los procedimientos descritos en Hunter y otros, Nature, 144:945 (1962); David y otros, Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain y otros, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).

Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar en cualquier procedimiento de ensayo, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directo e indirecto, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press Inc, 1987).

Los ensayos competitivos dependen de la capacidad de un patrón marcado para competir con el analito de muestra de prueba para unirse con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de NTNR\alpha en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de patrón que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de patrón que se une, los anticuerpos están generalmente insolubilizados antes o después de la competición, de manera que el patrón y el analito que están unidos a los anticuerpos se pueden separa de forma conveniente del patrón y analito que permanecen no unidos.

Los ensayos de sándwich implican la utilización de dos anticuerpos, cada uno capaz de unirse a una parte inmunogénica diferente, o epítopo, de la proteína a detectar. En un ensayo de sándwich, el analito de la muestra de prueba se une mediante un primer anticuerpo que está inmovilizado en un soporte sólido, y a continuación, se une un segundo anticuerpo al analito, formando así un complejo insoluble de tres partes. Ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 4.376.110. El segundo anticuerpo se puede marcar con una parte detectable (ensayos de sándwich directo) o se puede medir utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que está marcado con una parte detectable (ensayo de sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo de sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso la parte detectable es una enzima.

Los siguientes ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención se ofrecen solamente con objetivos ilustrativos y no se pretende limitar de ningún modo el alcance de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación de NTNR\alpha humano

Se identificaron ocho ADNcs parciales humanos (números de acceso en el Banco de Genes: R02249 (SEC ID No.: 7), H12981 (SEC ID No.: 8), W73681 (SEC ID No.: 9), W73633 (SEC ID No.: 10), H05619 (SEC ID No.: 11), R02135 (SEC ID No.: 12), T03342 (SEC ID No.: 13), y HSC1KA111 (SEC ID No.: 14) que tenían similaridad con el componente a del receptor GDNF (Ling y otros, Cell 85:1113-1124 (1996); Treanor y otros, Nature, 382:80-83 (1996)), pero no eran idénticas a las secuencias de GDNFR. Una secuencia de ADN, determinada mediante la alineación de estas secuencias de Adnc de tag-secuencia-expresada ("EST"), se extendió utilizando reacciones Marathon RACE en 5' y 3' (Clonetech Inc.) en ARNm de bazo humano, utilizando las condiciones suministradas por el fabricante, para obtener un grupo inicial de clones de ADNc humanos. Los clones de ADNc humanos adicionales se identificaron mediante el cribado de una biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano (Stratagene) utilizando los protocoles estándar. Las bibliotecas de ADNc lambda se colocaron en placas utilizando protocoles estándar y se hibridizó a la biblioteca una sonda de región de codificación, obtenida mediante amplificación por PCR del gen de NTNR\alpha que utiliza la información de RACE en 3' y 5'. A partir de una alineación de las secuencias clonadas de ADNc humano, se obtuvo una secuencia de ADNc de longitud completa (Sec ID NO: 1), que se denominó como la secuencia de ADNc del receptor \alpha de Neurturina humana ("hNTNR\alpha"). Esta secuencia contenía una secuencia de marco de lectura abierto (SEC ID NO: 2) que codificaba una secuencia única de proteína de 464 aminoácidos (SEC ID NO: 3), que se designó como receptor \alpha de Neurturina humana ("hNTNR\alpha").

El NTNR\alpha humano ("hNTNR\alpha") muestra una similaridad global del 47% a nivel de aminoácidos con respecto a hGDNFR\alpha y rGDNFR\alpha.

El hNTNR\alpha, como el hGDNFR\alpha, es una proteína extracelular que está unida a la membrana externa de la célula a través de una modificación de glicosil-fosfatidil inositol ("GPI"). Tiene un péptido señal con amino terminal para la secreción, 3 puntos potenciales de glicosilación, y un tramo de 17 aminoácidos hidrofóbicos con carboxi terminal precedido por un grupo de 3 aminoácidos pequeños (Gly, Ser, Asn) que definen un sitio de división/unión para el enlace a GPI (figura 4; Micanovic y otros, Proc. Natl. Acad. SCi. USA, 87:157-161 (1990); Moran y otros, J. Biol. Chem., 266:1250-1257 (1991)). La posición de sus 30 residuos de cisteína se conservan completamente entre el NTNR\alpha y el GDNFR\alpha (figura 5). El dominio extracelular ("ECD") está flanqueado por el péptido señal y el sitio de unión a GPI.

Ejemplo 2 Clonación de NTNR\alpha de rata ("rNTNR\alpha")

El NTNR\alpha de rata ("rNTNR\alpha") se clonó mediante cribado de una biblioteca de ADNc de cerebro de rata (Clonetech) utilizando protocolos estándar. Se híbrido una sonda de NTNR\alpha humano de longitud completa a la biblioteca de ADNc de rata con una severidad moderada (por ejemplo, formamida al 30% a 42ºC, lavar en 0,1 x SSC a 55ºC). El ADNc, que tiene (SEC ID NO: 4) y contiene el marco de lectura abierto (SEC ID NO: 5) se designó como ADNc de rNTNR\alpha. La secuencia de marco de lectura abierto codificó una única secuencia de proteína de 464 aminoácidos (SEC ID NO: 6), que se designó como receptor \alpha de Neurturina de rata ("rNTNR\alpha").

El NTNR\alpha de rata y el NTNR\alpha humano muestran una similitud total del 94% a nivel de aminoácidos. A nivel de ADN, se observó una identidad del 79%. El NTNR\alpha de rata es idéntico en un 46% al GDNFR\alpha de rata y al GDNFR\alpha humano a nivel de proteína. El NTNR\alpha de rata es idéntico en un 53% al GDNFR\alpha de rata a nivel de ADN.

El rNTNR\alpha, como el rGDNFR\alpha, hGDNFR\alpha y hNTNR\alpha, es una proteína extracelular que está unida a la membrana externa de la célula a través de una modificación de glicosil-fosfatidil inositol ("GPI"). Tiene un péptido señal con amino terminal para la secreción, 3 puntos potenciales de glicosilación, y un tramo de 17 aminoácidos hidrofóbicos con carboxi terminal precedido por un grupo de 3 aminoácidos pequeños (Gly, Ser, Asn) que definen un sitio de división/unión para el enlace a GPI (figura 4). Sorprendentemente, la posición de los 30 residuos de cisteína, que se conservan entre el GDNFR\alpha humano y de rata, se conservan entre el NTNR\alpha humano y de rata (figura 5). Estos residuos de cisteína se conservan completamente entre NTNR\alpha y GDNFR\alpha (figura 5). El dominio extracelular ("ECD") está flanqueado por el péptido señal y el sitio de unión a GPI.

Ejemplo 3 Vectores para la expresión de NTNR\alpha soluble y unido a membrana

Para la expresión de proteínas de mamíferos, se amplificó el marco de lectura abierto completo de NTNR\alpha humano utilizando PCR y se clonó en un vector de expresión basado en CMV, pRK5 o pRK7. EL plásmido se designó como pRK-hNTNT\alpha para el NTNR humano.

Para construir formas solubles de NTNR\alpha humano y de rata, se fabricó la construcción de la expresión de NTNR\alpha-IgG humana y de rata mediante la clonación de los primeros 432 aminoácidos de cada receptor (que les falta un sitio de unión a GPI) frente a la secuencia de Fc humano. Por ejemplo, la construcción de la expresión de NTNR\alpha-IgG se realizó mediante la clonación de los primeros 432 aminoácidos del receptor (que le falta un sitio de unión a GPI) frente a la secuencia de Fc (IfF2a) humano. Los plásmidos se designaron como pRK-hNTNR\alpha-IgG para la fusión de hNTNR\alpha y pRK-rNTNR\alpha-IgG para la fusión de NTNR\alpha de rata. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la fusión del gen humano es SEC ID NO: 15, que codifica la proteína de fusión humana SEC ID NO: 16. Las localizaciones adecuadas para la unión de la estructura al ECD están dentro, o preferiblemente en C-terminal a, la secuencia CFTELTTNIIPG de ECD de NTNR\alpha. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica la fusión del gen de rata es SEC ID NO: 17, que codifica la proteína de fusión de rata SEC ID NO: 18.

Ejemplo 4 Distribución de NTNR\alpha en el tejido

La distribución en el tejido del ARNm de NTNR\alpha se examinó utilizando análisis de hibridación in situ. Su distribución se comparó con la del GDNFR\alpha.

Para la hibridación in situ, se fijaron por inmersión embriones de rata E 15.5 durante toda la noche a 4ºC en paraformaldehído al 4%, y a continuación, se crioprotegió durante toda la noche en sacarosa al 15%. Los cerebros y médulas espinales de rata adulta de congelaron frescas. Todos los tejidos se seccionaron a 16 \mum, y se procesaron para su hibridación in situ utilizando sondas de ARN marcadas con ^{33}P-UTP tal y como se describe (Davis y otros, Science 259:1736-1739 (1993)). Las sondas de sentido y antisentido se derivaron de la región N-terminal de GDNFR\alpha utilizando T7 polimerasa. El ARN de NTNR\alpha se detectó con una sonda, derivada de hNTNR\alpha, designado como sonda hNTNR\alpha T7 in situ (SEc ID NO: 19).

En el sistema nervioso embrionario y adulto de rata, se observó que el ARNm para el NTNR\alpha en el ventral del cerebro medio, donde se localizan las neuronas dopaminérgicas, en partes del ventral de la médula espinal donde se localizan las motoneuronas, y en el ganglio de la raíz dorsal (DRG) eran neuronas sensoriales residentes. Además, se observaron niveles elevados de transcripciones de NTNR\alpha en tejidos, tales como el intestino embrionario, la vejiga, el sistema conductor cardiaco y el diafragma. En el cerebro de rata adulta se observó NTNR\alpha principalmente en la substantia nigra, córtex y bulbo olfativo, así como en el cuerno dorsal de la médula espinal. A pesar de que se encontró ocasionalmente NTNR\alpha en tejidos que expresan GDNFR\alpha, las dos transcripciones estaban mayoritariamente presentes adyacentes entre sí. Por ejemplo, en los miembros, el GDNFR\alpha se expresa en células musculares, mientras que el NTNR\alpha se encuentra en el nervio del plexo braquial que inerva el músculo. Asimismo, en la vejiga embrionaria, el NTNR\alpha se expresa en la capa muscular, mientras que el GDNFR\alpha se expresa en el epitelio subyacente. Finalmente, en el intestino, el NTNR\alpha se expresa en el epitelio de la mucosa, mientras que el GDNFR\alpha se expresa sólo en los músculos lisos adyacentes. Este patrón de expresión concuerda con la idea de que el NTNR\alpha media las señales interiores, así como las exteriores, el sistema nervioso, y sugiere funciones biológicas diferentes, complementarias para NTNR\alpha y GDNFR\alpha.

Ejemplo 5 NTNR\alpha se une específicamente a NTN

Los experimentos de unión en equilibrio se realizaron para determinar la unión de NTNR\alpha a NTN. El medio condicionado de 293 células transfectadas transitoriamente con las construcciones pRK-hNTNR\alpha-IgG o pRK-rNTNR\alpha-IgG proporcionó el receptor soluble. El medio condicionado se incubó con aproximadamente 5 pM de Neurturina humana, Neurturina de ratón o rGDNF ^{125}I, junto con concentraciones diferentes del ligando frío apropiado en PBS que contenía 2 mg/ml de BSA (Sigma) y Brij 96 al 0,05% (Fluka) durante 4 horas a temperatura ambiente. El ligando está en exceso sobre el receptor. A continuación, los complejos receptor/ligando se incubaron con proteína A Sefarosa Cl-4B (Pharmacia) durante 1 hora adicional a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS que contiene 0,2 mg/ml de BSA, se midieron los recuentos perceptibles específicos. Se utilizó el programa IGOR para determinar Kd. Se observó que la ^{125}I-NTN humana y de ratón se pueden unir a NTNR\alpha humana soluble recombinante (no se muestran los datos) o proteína rNTNR\alpha soluble, específica y reversiblemente con una K_{d} aproximada de 10 pM (insertado en la figura 6C). En cambio, ni la NTN humana (no se muestran los datos) ni la NTN de ratón eran capaces de desplazar el ^{125}I-rGDNF de rGDNFR\alpha (figura 6B) y no se detectó una unión de afinidad elevada de ^{125}I-NTN humana o de ratón a rGDNFR\alpha (figura 6A). Por consiguiente, la NTN se une específicamente a NTNR\alpha, interaccionando con una afinidad elevada con NTNR\alpha pero no con rGDNFR\alpha. Para confirmar adicionalmente que el NTNR\alpha es un receptor específico para NTN, los experimentos de unión por competición se realizaron utilizando ^{125}I-rGDNF. Se observó fácilmente un desplazamiento de una unión de afinidad elevada de ^{125}I-rGDNF a rGDNFR\alpha soluble recombinante (K_{d} de 3 pM) (inserción en figura 3B); sin embargo, no se detectó la unión de ^{125}I-rGDNF (yodado en tirosina por el procedimiento de Bolton Hunter o en lisina utilizando lactoperoxidasa) a NTNR\alpha. El GDNF interacciona con una afinidad elevada con GDNFR\alpha pero no con NTNR\alpha. Y, la NTN se une específicamente a NTNR\alpha. Aunque no se detectó una elevada interacción de afinidad entre NTN y GDNFR\alpha, se observó una interacción baja (Kd > 1 nM) cuando mayores concentraciones de NTN no marcada (10 nM) desplazaron rGDNF marcada de GDNFR\alpha.

El análisis de unión en equilibrio basado en las células, realizado tal como se describe (Treanor y otros, Nature 382:80-83 (1996)), confirmó la especificidad de GDNFR\alpha y NTNR\alpha para GDNF y Neurturina, respectivamente. 293 células, que se transfectaron transitoriamente con la construcción de la expresión de NTNR\alpha de longitud completa (o GDNFR\alpha) o una construcción irrelevante (control), proporcionaron un receptor unido a membrana. Las asociaciones específicas observadas entre GDNF y GDNFR\alpha y entre NTN y NTNR\alpha utilizando la unión competitiva a las células que expresan receptores no modificados estaban de acuerdo con los datos del receptor soluble (no se muestran los datos).

Se determinó el efecto de unión de ligando del tratamiento de la fosfolipasa C específica de fosfoinositida
("PIPLC") del receptor unido a membrana. La PIPLC es una enzima que divide específicamente la unión de GPI (Koke y otros, Proc. Express. Purification 2:51-58 (1991); Shukia Life Sci. 10:1323-1335 (1982); Rhee y otros, Science, 244:546-559 (1989)). Se incubaron 293 células, que se transfectaron transitoriamente con la construcción de la expresión de NTNR\alpha de longitud completa (o GDNFR\alpha) o una construcción irrelevante (control), con \sim20.000 cpm de NTN humana con ^{125}I en presencia de las cantidades indicadas de PIPLC durante 90 minutos a temperatura ambiente (figura 7A). Las células se lavaron con PBS enfriado con hielo que contenía 0,2 mg/ml de BSA, después de lo cual se midieron las células asociadas a ^{125}I. En concordancia con la predicción de que el NTNR\alpha está anclado a la superficie celular mediante una unión a GPI, la unión de ^{125}I-NTN a las células que expresan NTNR\alpha se redujo significativamente siguiendo el tratamiento con (figura 7). Por consiguiente, el NTNR\alpha es un receptor unido a GPI específico de afinidad elevada para NTN.

Ejemplo 6 El NTNR\alpha media la respuesta biológica a NTN

Para confirmar que el NTNR\alpha media la respuesta biológica a NTN, se determinó el efecto de la NTN en la supervivencia de las células que expresan NTNR\alpha. Para los ensayos de supervivencia se aislaron motoneuronas de rata E14, se pusieron en placas y se dejaron crecer en pocillos por triplicado, tal y como se describe. Tras la adición de los factores de crecimiento indicados, se determinó el número de neuronas supervivientes 72 horas después (figura 7B). Se observó que la NTN puede evitar la muerte de motoneuronas primarias (figura 7B) que expresan NTNR\alpha (tal y como se determina mediante hibridación in situ). Además, según el descubrimiento de que la NTN y el GDNF utilizan receptores diferentes, se detectaron diferencias cuantitativas en la respuesta de supervivencia de las motoneuronas a los dos factores: el GDNF a concentraciones de saturación provocó la supervivencia del 100% de las motoneuronas sensibles a BDNF; la NTN, cuyo receptor está escasamente distribuido en el cuerno ventral embrionario donde residen las motoneuronas, evitó la muerte de sólo el 50% de estas células (figura 7B). También se observó que la NTN puede evitar la muerte de neuronas dopaminérgicas embrionarias primarias que expresan NTNR\alpha.

Para confirmar adicionalmente que el NTNR\alpha es un mediador necesario de la señal de NTN, se trataron motoneuronas embrionarias con PIPLC y se monitorizó en el cultivo su supervivencia en presencia de NTN o BDNF. Se aislaron motoneuronas de rata E14, se pusieron en placas, y se dejaron crecer en pocillos por triplicado. Se añadió PIPLC (2-4 \mug/ml) a las muestras indicadas 1-2 horas antes de, así como 12 horas y 24 horas después, de la adición de los factores de crecimiento indicados, y se determinó el número de neuronas supervivientes 72 horas después (figura 7C). El número de motoneuronas espinales de rata embrionaria que permanecían vivas a las concentraciones de saturación de NTN se redujo en un 70-90% tras el tratamiento con PIPLC, mientras que no se observó un descenso en la respuesta de neuronas tratadas con PIPLC al factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). Además, cuando la NTN se añadió a estas motoneuronas junto con NTNR\alpha soluble (fusión a IgG), se recuperó la respuesta a NTN (figura 7C). Por consiguiente, el NTNR\alpha parece ser un componente esencial de la cascada de señalización de NTN y tiene las propiedades esperadas de la subunidad de unión a ligando de un receptor de NTN funcional. Además, el receptor NTNR\alpha soluble puede transmitir una sensibilidad a NTN en células que no tienen NTNR\alpha en la superficie celular, pero que expresan la proteína transmembrana complementaria Ret.

Ejemplo 7 El NTNR\alpha puede actuar vía Ret

Dado que el NTNR\alpha, como el GDNFR\alpha, no tiene un dominio citoplasmático y parece estar anclado a la superficie exterior de la célula a través de GPI, la transmisión de las señales de NTN al interior de la célula debe implicar proteínas adicionales. Debido a que el receptor tirosina quinasa, Ret, que por sí mismo no se une a GDNF o NTN con una afinidad elevada (Jing y otros Cell 85:1113-1124 (1996)); Treanor y otros Nature 382:80-83 (1996); no se muestran los datos), parece ser un componente de señalización del receptor de GDNF, se determinó la transducción de Ret de la respuesta de NTN tras la unión de NTN a NTNR\alpha. Para ensayar la fosforilación de tirosina, se incubaron células durante 1 hora a 37ºC con o sin PIPLC y, a continuación, se expusieron a varias concentraciones de NTN. A continuación, se extrajeron las células de las placas con EDTA 2 mM en PBS y se lisaron con solución tampón enfriada con hielo (fosfato sódico 10 mM (pH 7,0), NaCl 100 mM, NP al 1%, EDTA 40,5 mM, vanadato sódico 100 mM, PMSF 2 mM, y 0,2 unidades de aprotinina), y se utilizaron para inmunoprecipitación con antisuero desarrollado frente a 19 aminoácidos carboxi terminales de Ret, seguido por la unión a proteína A Sefarosa. Las proteínas inmunoprecipitadas se liberaron por ebullición en una solución tampón de muestra de SDS, se separaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 8%, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, y se hicieron reaccionar con anticuerpo anti-fosfotirosina (Upstate Biotechnology, Inc); la detección fue con un sistema de detección ECL Western blotting (Amersham Life Science). La línea celular de neuroblastoma humana, TGW-1, que expresa c-ret endógeno (Ikeda y otros, Oncogene 5:1291 (1990); Takahashi y otros, Oncogene 6:297 (1991)), se expuso a NTN durante 5 minutos, y se determinó el nivel de fosforilación de tirosina de Ret. La NTN indujo claramente la fosforilación de Ret (figura 7D), así como la sensibilidad del receptor de tirosina quinasa, la quinasa citoplásmica ERK (es decir, MAPK) en esta línea celular (figura 7E), pero no en otras 4 líneas de neuroblastomas que se examinaron (no se muestran los datos). Además, en concordancia con la hipótesis de que el NTNR\alpha es un mediador esencial entre NTN y Ret, la NTN no indujo una fosforilación significativa de quinasa sobre Ret en células que se trataron con PIPLC (figura 7C). Se obtuvo un resultado similar con GDNF. La proteína RET fosforilada en tirosina se detectó fácilmente en células TGW-1 tratadas con PIPLC cuando se añadió NTN junto con un NTNR\alpha soluble.

Dado que estos descubrimientos de la presente sugerían que Ret participa en la transmisión de la señal de NTN, se determinó si Ret es parte de un complejo receptor de NTN putativo. Para examinar la formación de complejos de proteínas tras la exposición a NTN, se realizaron experimentos de coinmunoprecipitación con células TGW-1 que expresan NTNR\alpha expuestas a 500 ng/ml de NTN. Tras la exposición, las células se lisaron en un detergente suave brij 96 (Sigma) (Davis y otros, 1993). Para la expresión de proteínas de mamíferos, se amplificó el marco de lectura abierto completo utilizando PCR y se clonó en un vector de expresión basado en CMV. Para experimentos de coprecipitación, se insertó una tagepítopo ente el péptido señal y la secuencia de codificación de NTNR\alpha maduro. Cuando se inmunoprecipitaron los complejos de proteínas con un anticuerpo policlonal a Ret y, a continuación, se analizaron en un "western blot" utilizando un anticuerpo policlonal a NTN, la NTN se coinmunoprecipitó fácilmente mediante los anticuerpos de Ret, lo cual es concordante con la idea de que la NTN y el Ret interaccionan físicamente en la superficie celular. Para confirmar que el NTNR\alpha es una parte del complejo de proteínas NTN/Ret, se transfectaron transitoriamente 293 células de riñón embrionario humano con vectores de expresión, Ret solo o con una combinación de vectores de expresión para c-ret y NTNR\alpha etiquetado en el epítopo, se expusieron a NTN y se lisaron en un detergente suave brij 96 (Sigma) (Davis y otros, 1993). Los complejos inmunes putativos se inmunoprecipitaron con un anticuerpo policlonal frente a Ret, se transfirieron sobre un filtro de nitrocelulosa, y se analizaron con una anticuerpo policlonal frente a NTNR\alpha etiquetado en el epítopo. De acuerdo con la idea de que el NTNR\alpha y el Ret se pueden encontrar en un complejo de proteínas, el NTNR\alpha, en presencia, pero no en ausencia de NTN, se coinmunoprecipitó fácilmente mediante los anticuerpos de Ret. Estos descubrimientos demostraron que la NTN, NTNR\alpha y Ret pueden formar un complejo en la superficie celular, que Ret y NTNR\alpha son componentes de un receptor de NTN funcional, en que NTNR\alpha es un intermediario en la interacción entre NTN y Ret.

Para asegurar la función potencial del NTNR\alpha en las respuestas de supervivencia del desarrollo de neuronas a factores neurotróficos y comparar su función con la del GDNFR\alpha, se utilizó una microinyección para introducir plásmidos de expresión que codifican NTNR\alpha y GDNFR\alpha en neuronas cultivadas que normalmente no sobreviven en respuesta a GDNF o neurturina. Aunque la neurturina provoca la supervivencia de neuronas simpáticas de rata fetal tardías (Kotzbauer, 1986), a partir de una investigación de varias poblaciones diferentes de neuronas, se observó en la presente que las neuronas simpáticas del ganglio simpático cervical superior (SCG) de ratones postnatales del día 4 (P4) no estaban soportadas por neurturina o GDNF en el cultivo. Dado que estas neuronas son también relativamente fáciles de microinyectar y mueren rápidamente en un medio definido sin factores neurotróficos, son muy útiles para examinar la implicación del NTNR\alpha en la supervivencia neuronal y la sensibilidad de los factores neutróficos. La expresión ectópica de NTNR\alpha o GDNFR\alpha solos en neuronas de SCG tuvo un efecto negligible en la respuesta de supervivencia de estas neuronas a GDNF o neurturina (menos de un 5% de supervivencia en un medio que contenía estos factores tras la inyección con plásmidos de expresión de NTNR\alpha o GDNFR\alpha). Esto sugiere que ni el GDNFR\alpha ni el NTNR\alpha solos son capaces de mediar en las respuestas de supervivencia a GDNF y neurturina. Esto concuerda con la idea de que los receptores unidos a GPI no pueden mediar respuestas a sus ligandos sin las proteínas transmembrana de señalización apropiadas como Ret en el caso de GDNFR\alpha (Treanor y otros, 1996); Jing y otros, 1996) y gp 130 y LIFR\beta en el caso de CNTFR\alpha (Davis y otros, 1993).

Se describió que Ret era un componente esencial de señalización del complejo receptor de GDNF (Treanor y otros, 1996; Jing y otros, 1996; Trupp y otros, 1996; Durbec y otros, 1996; Vega, 1996). Para ver si las neuronas que expresan estos dos componentes del receptor mostrarían respuestas de supervivencia específicas a GDNF y neurturina, se coinyectaron neuronas con plásmidos de expresión para Ret y NTNR\alpha o GDNFR\alpha. La expresión ectópica de Ret solo sólo tuvo un pequeño efecto en el número de neuronas de SCG que sobreviven en presencia de neurturina o GDNF (entre un 10 y un 15%). Sin embargo, las neuronas que coexpresan NTNR\alpha más Ret tuvieron una respuesta de supervivencia sustancialmente mayor a neurturina que fue significativamente mayor que la de la neuronas que expresan Ret solo (p = 0,003, t-test, n = 6). Así mismo, las neuronas que coexpresan GDNFR\alpha más Ret tuvieron una respuesta de supervivencia sustancialmente mayor a GDNF que también fue significativamente mayor que la de la neuronas que expresan Ret solo (p = 0,002, t-test, n = 9). En cambio, las neuronas que coexpresan el GDNFR\alpha más Ret no mostraron una mayor respuesta de supervivencia a la neurturina; no había más neuronas que expresan Ret/DNFR\alpha sobreviviendo con neurturina que las neuronas que expresan Ret. Asímismo, el número de neuronas que expresan Ret/NTNR\alpha sobreviviendo con GDNF no era significativamente diferente del número de neuronas que expresan Ret sobreviviendo con este factor ((p = 0,2, t-test, n = 9). Estos datos confirman los resultados descritos anteriormente.

Ejemplo 8 NTN es un factor de supervivencia neuronal in vivo

Para determinar si la NTN puede actuar para provocar la supervivencia de las neuronas DA del cerebro medio, se investigaron cultivos de ventral del cerebro medio de rata E14, enriquecidos por neuronas DA. El sistema de cultivo reveló que, como el GDNF, la NTN puede ejercer potentes acciones en la supervivencia de células que expresan tirosina hidroxilasa del cerebro medio en desarrollo. La potencia y eficacia de NTN era similar a la del GDNF, con NTN mostrando una tendencia hacia la provocación de la supervivencia de mayores números de células que las vistas con dosis maximalmente eficaces de GDNF.

La capacidad del NTN para provocar la supervivencia in vitro de neuronas DA del cerebro medio de rata embrionaria sugiere que la NTN puede ser eficaz en la provocación de la supervivencia de neuronas DA en el cerebro adulto intacto. Tal y como se indica en la presente, la tirosina quinasa Ret es un componente crítico de los complejos de receptores GDNF y NTN y se expresa en neuronas DA de cerebro medio de rata adulta. Para determinar si el NTNR\alpha se expresa en neuronas DA nigral de adulto, se utilizó una hibridación in situ. Mientras las secciones de ventral de cerebro medio de rata adulta mostraba una fuerte señal para GDNFR\alpha, que estaba ampliamente confinado a la pars compacta de la substantia nigra en el área tegmental del ventral, se observó una señal más difusa y modesta para NTNR\alpha en el ventral del cerebro medio. En las secciones teñidas por tirosina hidroxilasa, la mayoría de las células TH+ nigral mostraron una señal débil y equívoca para NTNR\alpha, mientras que se observó una hibridación intensa para GDNFR\alpha junto con células TH+ de la substantia nigra. Sin embargo, la fuerte señal para NTNR\alpha se observó en regiones inmediatamente adyacentes a las neuronas DA del cerebro medio, incluyendo células que bordean el aspecto dorsolateral de la pars compacta de la substantia nigra, los núcleos medios y laterales del tracto óptico accesorio y los núcleos interpedunculares. Considerado con la capacidad de la expresión de NTNR\alpha soluble en y cerca de neuronas DA nigrales adultas, estos resultados sugieren que la NTN está actuando sobre neuronas nigrales adultas.

En la presente se determinó que la inyección intranigral de NTN puede provocar la supervivencia y expresión TH de neuronas DA tras la administración de 6-OHDA estriatal, y que la potencia y eficacia de la NTN es similar a la del GDNF. Para evaluar independientemente la viabilidad y la expresión fenotípica de neuronas DA nigrales, se contaron las células utilizando un marcador fluorescente retrógrado, "flurogold", y por inmunocitoquímica por tirosina hidroxilasa. Una única inyección intranigral de 1 ó 10 \mug de NTN administrada una semana después de la administración de 6-OHDA condujo a una viabilidad celular casi 3 veces superior (evaluado mediante el marcador fluorescente retrógrado) un mes después de la lesión que la observada en animales tratados con vehículos. El examen del número de células que expresan la tirosina hidroxilasa reveló un incremento significativo en la protección en ratas tratadas con 10, pero no con 1 microgramo de NTN. Los efectos de las inyecciones únicas de NTN en la supervivencia celular y la expresión de TH eran indistinguibles de los observados con dosis comparables de GDNF. Tanto la NTN como el GDNF pueden provocar la supervivencia de las neuronas DA nigrales tras la lesión neurotóxica o traumática.

Tal y como se muestra en la presente, la NTN se expresa en el desarrollo y el sistema nigroestriatal adulto y puede ejercer potentes influencias en la supervivencia y expresión fenotípica de neuronas dopaminérgicas nigrales. Las acciones de la NTN para proteger las neuronas DA y provocar la expresión de TH tras la administración de 6-OHDA indican que este factor puede ser un agente útil en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

Ejemplo 9 Dominios extracelulares de NTNR\alpha y GDNFR\alpha actúan como agonistas receptores

Los efectos de los dominios extracelulares de GDNFR\alpha y NTNR\alpha como agonistas receptores se determinaron observando la supervivencia de neuronas dopaminérgicas en el ventral mesencefálica de rata embrionaria tratadas con dominio extracelular añadido de forma exógena de cualquier receptor. Los cultivos enriquecidos por neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo ventral se diseccionaron de ratas E14, en los que el Día 0 fue el día de la primera aparición de tapón vaginal. El tejido se trató con enzima, se trituró hasta una única suspensión de células, y se colocó en placas tal y como se ha descrito previamente (Poulsen y otros, Neuron 13(5):1245-52 (1994)) con algunas excepciones. Las células se colocaron en placas sobre cubreojetos de vidrio, y todos los factores de crecimiento se diluyeron primero en una solución concentrada 20X de HCl 1 mM antes de la dilución final (dando lugar a una concentración final de 20 \muM de HCl en el medio). Todos los factores se añadieron de golpe en el momento de la colocación en las placas. La concentración de insulina en el medio disminuyó desde 5 \mug/ml a 2,5 \mug/ml. Los cultivos se pusieron en placas por triplicado. Se añadió GDNFR\alpha o NTNR\alpha en una concentración de 1 \mug/ml a los cultivos dos horas después de la colocación de las células en placa. Al mismo tiempo, cultivos paralelos recibieron GDNFR\alpha o NTNR\alpha más 50 ng/ml de GDNF o NTN o recibieron 50 ng/ml de GDNF o NTN sin receptor añadido de forma exógena. Después de 4 días en el cultivo, las células se fijaron y se tiñeron por tirosina hidroxilasa (TH), un marcador para neuronas dopaminérgicas, y se contó el número de células TH+ en cada condición y se comparó con los cultivos de control (cultivos paralelos desarrollados en presencia de factores no añadidos). Los dominios extracelulares de tanto GDNFR\alpha como NTNR\alpha contenían un tag de histidina (6 residuos de histidina) en el C-terminal, que proporcionó una manipulación conveniente para la purificación de los dominios extracelulares. El C-terminal de ECD de GDNFR\alpha con el tag de histidina es DGLAGASSH HHHHH, donde uno de los residuos de His normalmente presente en la secuencia de GDNFR se utilizó para proporcionar parte de la secuencia del tag. Las moléculas se produjeron en 293 células (mediante transfección transitoria, se recogió el sobrenadante 96 horas después la transfección), se purificó sobre una columna de Ni-NTA utilizando el procedimiento de purificación IMAC. Los ECDs aislados se dializaron en PBS y posteriormente se guardaron a 4ºC.

En tres experimentos separados, los dominios extracelulares de GDNFR\alpha y NTNR\alpha, en presencia y ausencia de ligando añadido de forma exógena, provocaron la supervivencia de neuronas dopaminérgicas que era significativamente superior que los cultivos de control (figuras 8A a 8C). En cada caso, la cantidad de supervivientes era igual o ligeramente mejor que la cantidad de superviviente con ligando (GDNF o NTN) solo. La supervivencia aumentó adicionalmente cuando ambos ligandos y sus dominios extracelulares del receptor concreto (por ejemplo, NTN + NTNR\alpha, GDNF + GDNFR\alpha) se añadieron juntos. El anticuerpo monoclonal anti-NTN añadido a un cultivo de control (con factores no añadidos) no dio lugar a un descenso en el nivel base observado del crecimiento celular, indicando que el crecimiento base durante el periodo de prueba no fue debido a NTN endógena, si está presente. Estos resultados indican que la adición del dominio extracelular del receptor de esta familia de receptores, sin ligando, provoca un efecto de supervivencia neuronal significativa sobre el control.

Ejemplo 10 NTNR\alpha y NTN aumentan la utilización de dopamina in vivo

Se determinó que el NTNR\alpha soluble aumenta los efectos de NTN en el sistema dopaminérgico nigroestriatal de rata adulta intacta. La administración de NTNR\alpha junto con NTN aumenta la proporción de DOPAC (ácido dihidroxifenilacético, el principal metabolito de dopamina en rata) con respecto a dopamina, que es indicativo de la sobrerregulación funcional de neuronas dopaminérgicas. A ratas de Sprague-Dawley adultas (295-345 g, n = 23) se administró una inyección única de 2 \mul de hNTN (0,1 \mug), hNTNR\alpha con tag de His soluble (0,6 \mug), hNTN (0,1 \mug) y hNTNR\alpha con tag de His soluble (0,6 \mug) o vehículo (manitol al 4%, HEPES 10 mM) en el stratium derecho en 0,5 mm anterior en coordinaciones estereotáxicas, 3,0 mm lateral a bregma y 4,5 mm ventral a la dura utilizando una jeringa de Hamilton de 10 \mul con una aguja de calibre 26s. Siete días después de la cirugía, el tejido seleccionado de las regiones del cerebro se recogió para el análisis del contenido de dopamina y metabolito de dopamina. Tras la decapitación de las ratas, se extrajeron rápidamente los cerebros y se sumergieron en tampón salido de fosfato enfriado con hielo durante 30 segundos. Se cortaron secciones coronales de 1 mm con la ayuda de matriz para cerebro de un metal enfriado, y las punciones de tejido de tres regiones del striatum (anterior, central y posterior), nucleus accumbens y susbtantia nigra se recogieron utilizando agujas de calibre 11, 13 y 16, respectivamente. Las punciones de tejido se homogeneizaron en 200 \mul de ácido perclórico 0,1 M que contenía DHBA como patrón interno. Los homogenatos se centrifugaron a 23.000-28.000 x g durante 20 minutos y los sobrenadantes se analizaron por el contenido de dopamina y DOPAC utilizando HPLC de fase inversa de par iónico con detección electroquímica. La proporción de DOPAC/dopamina se calculó en las caras inyectadas y no inyectadas, y se expresó como la cara inyectada como un porcentaje de la cara no inyectada. Tal y como se muestra en la figura 9, la combinación de NTN y NTNR\alpha aumentó la proporción de DOPAC/dopamina en el stratium en comparación con el vehículo, que es útil en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

En la presente se presenta una secuencia novedosa que codifica un receptor novedoso para neurturina, un miembro recientemente descubierto de la familia de proteínas de GDNF. Los resultados presentados en la presente revelan la existencia de una familia novedosa de receptores multi-componentes para factores de crecimiento y diferenciación. El complejo receptor está compuesto de una subunidad de señalización compartida- -la subunidad de unión de ligando específico de receptor unido a receptor tirosina quinasa transmembrana Ret y GPI- -NTNR\alpha en el caso de NTN, y GDNFR\alpha en el caso de GDNF. En vista de estos descubrimientos, se pueden determinar detalles adicionales en el mecanismo de acción de NTN y GDNF a nivel molecular. Además, actualmente está claro que las diferentes actividades biológicas de la familia de proteínas GDNF/NTN se determinan mediante la distribución de tejido diferente de sus respectivos componentes de ligando unido a receptor más que mediante la capacidad de activar diferentes sistemas de señalización. Finalmente, los datos presentados en la presente proporcionan una idea racional biológica simple y de contraste para la implicación de lo que previamente parecía ser innecesariamente una manera compleja de activar un receptor tirosina quinasa (revisado en Lindsay y Yancopoulos. Neuron 17:571-574 (1996)). Actualmente es evidente que el cambio de la molécula de acceso de unión a ligando es una forma más económica de recrutar el mismo sistema de señalización para su uso mediante factores de crecimiento múltiples, y que las proteínas unidas a GPI son moléculas de acceso de unión a ligando económicas. La utilización de un único sistema de señalización transmembrana mediante factores de crecimiento múltiples parece ser usada por citocinas (Stahl y Yancopulos Ann. Rev. Biophys. Biomol. Strcut. 24:269-291 (1993)) así como por miembros de la familia de proteínas de factores de crecimiento trasnformantes (Wrana y otros, Nature 370:341-347 (1994)). Asimismo, las proteínas unidas a GPI se utilizan como moléculas de acceso de unión a ligando en varios receptores multi-componentes, tales como el receptor de endotoxina bacteriana (Lee y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9930-9934 (1993); Pugin y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2744-2748 (1993) y el receptor para el factor neurotrófico ciliar (Davies y otros, Science 259: 1736-1739 (1993)). El descubrimiento del receptor y del sistema asociado al receptor aquí presentado define un paradigma novedoso en la transducción de señales, destacan las diversas estrategias que se utilizan para transmitir señales extracelulares en el sistema nervioso de vertebrados, y proporciona métodos de regulación y control de la actividad y supervivencia celular que amplia las modalidades de tratamiento al alcance del personal clínico.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Genentech, Inc.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Receptor de Neurturina

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 19

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Genentech, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: DNA Way, 1

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: San Francisco Sur

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EEUU

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CP: 94080

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO MEDIO: 3'5 pulgadas, disquete de 1'44 Mb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: compatible con PC IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: WinPatin (Genetech)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD PRIORITARIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/871913

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 9-Jun-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD PRIORITARIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 06/802805

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 18-Feb-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD PRIORITARIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/957063

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 24-Oct-1997

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Torchis, PhD., Timothy E.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36.700

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: P1086R3PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 650/225-8674

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 650/952-9881

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2600 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 1:

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1392 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 2:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 464 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 3:

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3358 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1392 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 464 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 229 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 7:

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 521 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 8:

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 478 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 9:

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 433 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 10:

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 418 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 11:

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 364 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 12:

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 319 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 13:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 309 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 14:

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1995 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 15:

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 664 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1995 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 17:

28

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 664 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 670 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

32

Claims (33)

1. Polipéptido que comprende una secuencia que es:

(a) una secuencia de aminoácidos del dominio extracelular (ECD) del receptor \alpha de neurturina humana (NTNR\alpha) que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEC ID NO: 3 entre los residuos de aminoácidos 23 y 447, ambos inclusive;

(b) una variante alélica u homólogo de mamífero de (a) que tiene por lo menos un 60% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de NTNR\alpha establecida en la SEC ID No: 3, teniendo la variante u homólogo la actividad biológica de mediación de la actividad de Ret por NTN;

(c) una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibrida en condiciones severas (42ºC en formamida al 20%) a un ácido nucleico que codifica (a) o (b), teniendo la secuencia la actividad biológica de mediación de la actividad de Ret por NTN; o

(d) una secuencia de aminoácidos derivada de (a) por sustitución, eliminación o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de (a), teniendo la secuencia por lo menos un 60% de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácidos de NTNR\alpha establecida en la SEC ID No: 3 y teniendo la actividad biológica de mediación de la actividad de Ret por NTN.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular (ECD) de NTNR\alpha de la SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 6 entre los residuos de aminoácidos 23 y 447, ambos inclusive.

3. Polipéptido según la reivindicación 2, que comprende la secuencia de aminoácidos de NTNR\alpha maduro de la SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 6.

4. Polipéptido según la reivindicación 3, que se une específicamente a neurturina.

5. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la secuencia de aminoácidos de NTNR\alpha está unida a un polímero no proteináceo.

6. Polipétido según la reivindicación 5, donde el polímero no proteináceo es polietilenglicol, polipropilenglicol, o un polioxialquileno.

7. Polipéptido según la reivindicación 1 que es NTNR\alpha soluble.

8. NTNR\alpha según la reivindicación 1 que es NTNR\alpha quimérico.

9. NTNR\alpha quimérico según la reivindicación 8, que comprende una secuencia de aminoácidos de NTNR\alpha fusionada a una secuencia de inmunoglobulina.

10. NTNR\alpha quimérico según la reivindicación 8, que comprende una secuencia de aminoácidos de NTNR\alpha fusionada a un epítopo tag.

11. Composición que comprende el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un portador fisiológicamente aceptable.

12. Procedimiento para identificar una molécula que se une al NTNR\alpha, que comprende la exposición del NTNR\alpha según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 a la molécula sospechosa de unirse al mismo y la determinación de la unión de la molécula al NTNR\alpha.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, donde el NTNR\alpha es NTNR\alpha soluble.

14. Procedimiento para identificar una molécula que activa el NTNR\alpha para la activación de tirosina quinasa Ret, que comprende la exposición del NTNR\alpha según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 a la molécula sospechosa de ser capaz de activar NTNR\alpha y medir la activación de NTNR\alpha.

15. Procedimiento para purificar una molécula que se une al NTNR\alpha según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende la absorción de la molécula a NTNR\alpha inmovilizado en una fase sólida y la recuperación de la molécula desde el NTNR\alpha inmovilizado.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, donde el NTNR\alpha es NTNR\alpha quimérico, que comprende una fusión de una secuencia de dominio extracelular de NTNR\alpha a una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina.

17. Anticuerpo que específicamente se une a NTNR\alpha según la reivindicación 1.

18. Anticuerpo según la reivindicación 17, que es un anticuerpo monoclonal.

19. Composición que comprende el anticuerpo según la reivindicación 17 ó 18 y un portador fisiológicamente aceptable.

20. Composición según la reivindicación 19 que comprende además una citocina o un factor neurotrófico.

21. Anticuerpo agonista según la reivindicación 17 ó 18 para su uso como medicamento.

22. Receptor \alpha de neurturina (NTNR\alpha) según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para su uso como medicamento.

23. Receptor \alpha de neurturina (NTNR\alpha) soluble según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para su uso como medicamento.

24. Receptor \alpha de neurturina (NTNR\alpha) soluble según cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para su uso como medicamento.

25. Procedimiento para determinar la presencia de NTNR\alpha, que comprende la exposición de una muestra de prueba sospechosa de contener el NTNR\alpha al anticuerpo según la reivindicación 17 ó 18 y la determinación de la unión de dicho anticuerpo a la muestra de prueba.

26. Molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

27. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 26, que comprende además un promotor unido funcionalmente a la molécula de ácido nucleico.

28. Vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 26 unida funcionalmente a secuencia de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.

29. Células huésped que comprende el vector según la reivindicación 28.

30. Proceso de utilización de una molécula de ácido nucleico que codifica NTNR\alpha para llevar a cabo la producción de NTNR\alpha, que comprende el cultivo de la célula huésped según la reivindicación 29 en las condiciones que permiten la expresión de NTNR\alpha.

31. Proceso según la reivindicación 30 que comprende además la recuperación del NTNR\alpha del cultivo de la célula huésped.

32. Animal transgénico no humano que es transformado con el vector según la reivindicación 28 y contiene células que expresan ácidos nucleicos que codifican el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

33. Animal según la reivindicación 32 que es un ratón.