ES2257879T3 - Productos de recombinacion de acido nucleico para inmunizacion genetica. - Google Patents

Abstract

La utilización de un vector de expresión, el cual comprende una secuencia promotora y, ligada operativamente al mismo, una secuencia de ácido nucleico recombinante, comprendiendo: una primera secuencia de ácido nucleico codificando un antígeno central del virus de la Hepatitis B, la cual incluye una región de epítope central inmunodominante primario (ICE), o de la cual toda la región ICE, o parte de ella, ha sido eliminada; y una segunda secuencia de ácido nucleico heteróloga codificando un epítope de célula de linfocito T citolítico (CTL) procedente de un antígeno de interés, en donde dicha segunda secuencia de ácido nucleico es insertada dentro de la región ICE de la primera secuencia de ácido nucleico o reemplaza la región ICE, o parte de la misma, de la primera secuencia de ácido nucleico que ha sido eliminada, en donde dicha utilización lo es para la fabricación de un medicamento para su uso en la inmunización por ácido nucleico de un sujeto.

Description

Productos de recombinación de ácido nucleico para inmunización genética.

Campo técnico

La invención está relacionada con los campos generales de la biología molecular y de la inmunología y, en general, está relacionada con reactivos útiles en las técnicas de inmunización por ácido nucleico. Más específicamente, la invención está relacionada con constructos híbridos de ácido nucleico antígeno/portador, vectores de expresión conteniendo tales constructos, y con estrategias de inmunización por ácido nucleico empleando tales reactivos.

Antecedentes

Han sido descritas en este campo técnicas para la inyección de ADN y ARNm en tejido de mamíferos a efectos de la inmunización contra un producto de expresión. Ver, por ejemplo, la Especificación de Patente Europea EP 0 500 799 y la Patente americana nº 5.589.466. Las técnicas, aquí llamadas "inmunización por ácido nucleico", han demostrado que provocan tanto la respuesta inmune mediada por células como la humoral. Por ejemplo, los sueros procedentes de ratones inmunizados con un constructo de ADN codificando la glicoproteína de envoltura gp160, demostraron que reaccionaban con la gp160 recombinante en los inmunoensayos, y los linfocitos procedentes de los ratones inyectados demostraron que proliferaban en respuesta a la gp120 recombinante. Wang et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4156-4160. De forma similar, los ratones inmunizados con un gen de hormona del crecimiento humana (GHh) demostraron una respuesta inmune basada en los anticuerpos. Tang et al. (1992) Nature 356:152-154. Inyecciones intramusculares de ADN codificando la nucleoproteína de la gripe llevada por un promotor mamífero han demostrado que provocan una respuesta CTL de CD8+, que puede proteger a los ratones contra el ulterior reto letal que representa el virus. Ulmer et al. (1993) Science 259:1745-1749. Estudios inmunohistoquímicos del área de la inyección revelaron que el ADN fue tomado por los mieloblastos, y pudo ser demostrada la producción citoplásmica de la proteína viral durante, al menos, 6 meses.

Resumen de la invención

Es un objetivo primario de la invención el proporcionar una molécula de ácido nucleico recombinante, la cual incluye una secuencia codificando un antígeno de la nucleocápside del virus de la hepatitis B (HBcAg) y una secuencia codificando un epítope de linfocito T citolítico (CTL) de interés. La secuencia codificando el epítope es insertada dentro del epítope central inmunodominante (ICE), el cual se encuentra presente en una región lazo, accesible externamente, de la molécula del HBcAg, y la molécula de ácido nucleico recombinante es utilizada como un reactivo en varias estrategias de inmunización por ácido nucleico. La secuencia insertada puede incluir también uno o más epítopes de célula B de interés.

El producto de expresión HBcAg se autoensambla para formar una partícula, la cual es altamente inmunogénica en humanos, así como en sistemas experimentales de modelo animal (Milich, D.R. (1988) Immunol. Today 9:380). Por esta razón, las partículas de HBcAg han sido utilizadas como un resto portador para epítopes peptídicos acoplados químicamente, o recombinantes fusionados translacionalmente (Clarke et al. (1987) Nature 330:381). A este respecto, han sido construidas moléculas híbridas de HBcAg, las cuales contienen inserciones N-terminal o internas del epítope peptídico, no interfiriendo ninguno de estos métodos con la habilidad del antígeno central para formar partículas. Isaguliants et al. (1996) Immunology Letters 52:37-44; Schödel et al. (1994) J. Exper. Med. 180:1037-1046. Las partículas peptídicas híbridas resultantes han sido utilizadas como reactivos de vacuna de subunidad con distintos grados de éxito, particularmente para provocar una respuesta de anticuerpo contra un antígeno de interés.

La presente invención representa una novedad significativa en relación a estos esfuerzos previos. Es decir, se ha descubierto sorprendentemente que los reactivos de ácido nucleico que codifican moléculas híbridas de HBcAg proporcionan una frecuencia de respuesta inmune celular extremadamente alta contra uno o más epítopes CTL de interés contenidos dentro de las moléculas híbridas, particularmente cuando los reactivos son utilizados en un esquema de reinmunización por vector viral recombinante de sensibilización por ADN. Se ha descubierto también sorprendentemente que esta respuesta celular de alta frecuencia es causada por el constructo de ácido nucleico híbrido HBcAg per se y, de esta forma, no es reproducible con otros reactivos de ácido nucleico.

Por consiguiente, la invención proporciona la utilización de un vector de expresión, el cual comprende una secuencia promotora y, ligada operativamente a la misma, una secuencia de ácido nucleico recombinante comprendiendo: una primera secuencia de ácido nucleico codificando un antígeno central del virus de la hepatitis B, la cual incluye una región del epítope central inmunodominante primario (ICE), o de la cual ha sido eliminada toda la región ICE, o parte de ella; y una segunda secuencia de ácido nucleico heteróloga, codificando un epítope de célula linfocito T citolítico (CTL) procedente de un antígeno de interés, en donde dicha segunda secuencia de ácido nucleico es insertada dentro de la región ICE de la primera secuencia de ácido nucleico, o reemplaza la región ICE, o parte de la misma, de la primera secuencia de ácido nucleico que ha sido eliminada, en donde dicha utilización se da en la fabricación de un medicamento para su uso en la inmunización por ácido nucleico de un sujeto.

Adicionalmente, la invención proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia promotora y, ligada operativamente a la misma, una secuencia de ácido nucleico recombinante para su utilización en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal por medio de terapia, en donde el ácido nucleico recombinante y la secuencia comprenden: una primera secuencia de ácido nucleico codificando un antígeno central del virus de la hepatitis B, la cual incluye una región del epítope central inmunodominante primario (ICE), o de la cual ha sido eliminada toda la región ICE, o parte de ella; y una segunda secuencia de ácido nucleico heteróloga, codificando el epítope CTL procedente de un antígeno de interés, en donde dicha segunda secuencia de ácido nucleico es insertada dentro de la región ICE de la primera secuencia de ácido nucleico que ha sido eliminada.

La invención proporciona también un vector de expresión, el cual comprende una secuencia promotora y, ligada operativamente a la misma, una secuencia de ácido nucleico recombinante comprendiendo: una primera secuencia de ácido nucleico codificando un antígeno central del virus de la hepatitis B, la cual incluye una región del epítope central inmunodominante primario (ICE), o de la cual ha sido eliminada toda la región ICE, o parte de ella; y una segunda secuencia de ácido nucleico heteróloga codificando un epítope de linfocito T citolítico (CTL) procedente de un antígeno de interés, en donde dicha segunda secuencia de ácido nucleico es insertada dentro de la región ICE de la primera secuencia de ácido nucleico, o reemplaza la región ICE, o parte de la misma, de la primera secuencia de ácido nucleico que ha sido eliminada.

En un aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante comprendiendo: una primera secuencia de ácido nucleico codificando un antígeno central del virus de la hepatitis B, la cual incluye una región del epítope central inmunodominante primario (ICE), o de la cual ha sido eliminada toda la región ICE, o parte de ella; y una segunda secuencia de ácido nucleico heteróloga codificando un epítope de linfocito T citolítico (CTL) procedente de un antígeno de interés, en donde dicha segunda secuencia de ácido nucleico es insertada dentro de la región ICE de la primera secuencia de ácido nucleico, o reemplaza la región ICE, o parte de la misma, de la primera secuencia de ácido nucleico que ha sido eliminada. Se cree que la colocación de la segunda secuencia directamente dentro de la región codificadora del lazo ICE interrumpe al epítope central inmunodominante, disminuyendo posiblemente la habilidad de un sujeto para montar una respuesta inmune contra el componente portador de HBcAg del producto de expresión de molécula híbrida resultante. La molécula sujeto de ácido nucleico recombinante es un reactivo particularmente superior para su utilización en inmunizaciones por ácido nucleico, y puede ser usada para provocar una respuesta CTL de alta frecuencia contra el antígeno de interés en un sujeto inmunizado.

El hecho de que esta molécula sea tan efectiva a la hora de provocar una respuesta CTL de alta frecuencia contra un antígeno colocado dentro de la región lazo ICE (región del epítope inmunodominante de célula B) es inherentemente contraintuitivo. Esto es debido a que es de sobra aceptado en este campo que, para las respuestas humorales, los epítopes efectivos de células B son encontrados generalmente en una situación externamente accesible (por ejemplo, la región lazo ICE del HBcAg) de la molécula antigénica, lo cual permite una exposición adecuada a las células B que responden. Por otro lado, para respuestas celulares, los antígenos peptídicos deben ser procesados en pequeños fragmentos (epítopes) dentro de las células de un sujeto huésped. Estos fragmentos procesados pueden entrar entonces en las rutas clásicas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) para su asociación con las moléculas MHC clase I y clase II sobre la superficie celular, permitiendo la presentación adecuada a los linfocitos T CD8^{+} y CD4^{+}, respectivamente. Por esta razón, entonces, es aceptado de forma general que los epítopes de célula T dominantes pueden ser encontrados en cualquier parte de la molécula antigénica (no necesariamente en lugares accesibles externamente) y, a menudo, tienen lugar en sitios totalmente diferentes a los de los epítopes dominantes de células B en la misma molécula.

En una realización es proporcionada una molécula de ácido nucleico recombinante, la cual incluye una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula portadora de HBcAg, de la cual ha sido eliminada la región ICE. La molécula de ácido nucleico recombinante incluye también una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno de interés, la cual contiene, al menos, un epítope CTL. La segunda secuencia de ácido nucleico es heteróloga en relación a la primera secuencia de ácido nucleico, y las secuencias de ácido nucleico primera y segunda se encuentran enlazadas juntas para formar una secuencia híbrida. En determinadas realizaciones la secuencia codificando la región lazo ICE es reemplazada por la segunda secuencia de ácido nucleico, de tal forma que el antígeno de interés será situado dentro de la parte del lazo de la molécula híbrida portadora HBcAg expresada. En otras realizaciones la segunda secuencia de ácido nucleico es posicionada dentro de la molécula de ácido nucleico, de tal forma que ésta se enrolla en una región N-terminal, C-terminal o en una parte interna de la molécula portadora central híbrida resultante. En estas distintas realizaciones se prefiere que la segunda secuencia esté situada dentro de la molécula en una posición donde no interfiera con la formación de partículas del producto de expresión. Aquí de nuevo, la preferencia de que la molécula de ácido nucleico recombinante codifique un portador HBcAg híbrido que sea autoensamblable en un antígeno particulado es ligeramente contraintuitiva, ya que la respuesta CTL de alta frecuencia contra el antígeno de interés es causada por el procesamiento intercelular de los fragmentos peptídicos y la presentación del MHC clase I. Aunque no se desea estar constreñido por ninguna teoría en particular, una posible razón para favorecer a aquellas moléculas híbridas que retienen la habilidad de formar partículas, es que las partículas son secretadas más eficientemente por las células de un huésped, permitiendo una exposición más amplia y sostenida del antígeno a las células procesadoras inmunes en un huésped. Otra posible razón es que las partículas híbridas razonablemente estables tendrán acceso a la ruta exógena de la clase I.

En otro aspecto más relacionado con la invención, las moléculas de ácido nucleico recombinantes de la presente invención incluyen una tercera secuencia de ácido nucleico, la cual codifica una secuencia peptídica líder. La tercera secuencia está situada dentro de la molécula en una posición 5' aguas arriba respecto a las secuencias segunda y primera de ácido nucleico, y se encuentra ligada a estas otras secuencias para formar una secuencia híbrida. La secuencia líder codificada proporciona una secreción eficiente de las moléculas portadoras HBcAg híbridas codificadas procedentes de células transfectadas con las moléculas sujeto de ácido nucleico recombinante. En otro aspecto más relacionado con la invención, la molécula de ácido nucleico recombinante incluye una primera secuencia codificando un HBcAg, en la cual ha sido eliminada la región C-terminal rica en arginina. Todas las moléculas de ácido nucleico recombinante de la presente invención son proporcionadas usualmente en forma de un casete de expresión, el cual contiene las secuencias necesarias para controlar la expresión de las moléculas de ácido nucleico. Estos casetes de expresión, a su vez, son proporcionados usualmente dentro de vectores (por ejemplo, vectores virales plásmidos o recombinantes), los cuales son adecuados para su utilización como reactivos para inmunización por ácido nucleico.

La invención proporciona también la utilización de una célula que ha sido transfectada con un vector de expresión de la invención para la fabricación de un medicamento para la inmunización de un sujeto. Los casetes y/o vectores de expresión, incluyendo cualquiera de las moléculas de ácido nucleico recombinantes de la presente invención, pueden ser utilizados para transfectar las células, y la transfección es llevada a cabo bajo condiciones que permitan la expresión de la molécula híbrida dentro del sujeto. Puede ser llevada a cabo una segunda fase de inmunización, o reinmunización, comprendiendo una o más fases de administración al sujeto de una segunda composición, en donde la segunda composición comprende, al menos, un epítope procedente del antígeno diana. La combinación de las fases de inmunización primera y segunda es suficiente como para provocar una respuesta celular contra el antígeno diana.

El procedimiento de transfección puede ser realizado ex vivo (por ejemplo, para obtener células transfectadas, las cuales son introducidas seguidamente en el sujeto con anterioridad a llevar a cabo la segunda fase de inmunización). La composición segunda puede incluir el antígeno de interés en la forma de cualquier composición de vacuna adecuada, por ejemplo, en forma de una composición peptídica de vacuna de subunidad, en forma de partículas de HBcAg híbrido, en forma de una composición adicional de vacuna de ácido nucleico (por ejemplo, conteniendo únicamente el antígeno, o conteniendo la secuencia génica completa que incluye al antígeno), o en forma de un vector viral recombinante, el cual contiene una secuencia codificadora para el antígeno de interés. En determinadas realizaciones la composición segunda incluye un vector viral de vacuna recombinante, por ejemplo un vector viral de la vacuna Ankara modificada (MVA), el cual contiene una secuencia codificando, al menos, un epítope CTL procedente del antígeno diana.

El ácido nucleico recombinante codificando una molécula híbrida poseyendo un componente portador del HBcAg y un componente de antígeno diana comprendiendo, al menos, un epítope CTL de interés, pueden ser utilizados también como un agente de recuerdo, como en una estrategia de vacunación donde un individuo es sensibilizado con cualquier composición de vacuna adecuada que contenga un antígeno de interés, por ejemplo, en forma de una composición peptídica de vacuna de subunidad, una composición de vacuna de organismo completo o partido (por ejemplo, un virus completo, un virus atenuado o desactivado, etc.), una composición de vacuna de ácido nucleico, una composición de vacuna viral recombinante, o similares.

Es una ventaja de la invención el que las moléculas de ácido nucleico recombinantes puedan ser utilizadas como reactivos en estrategias de inmunización por ácido nucleico, con el fin de conseguir una respuesta CTL de alta frecuencia contra uno o más antígenos de interés. Es una ventaja adicional de la invención el que estas respuestas CTL de alta frecuencia sean útiles en contextos tanto de vacuna profiláctica como de vacuna terapéutica.

Estos y otros objetivos, aspectos, realizaciones y ventajas de la presente invención serán entendidos fácilmente por aquéllos con un conocimiento ordinario en este campo, en vista de la información aquí referida.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa un mapa del plásmido, identificando los componentes mayores de un vector plásmido construido conforme a la presente invención. Las cajas, en orden de aparición, son: promotor CMV; Intrón A; péptido señal TPA; región central N-terminal; epítope insertado; y región central C-terminal.

Las Figuras 2A y 2B representan los resultados de los ensayos llevados a cabo en el Ejemplo 2, y muestran la inducción de la especificidad epitópica CD8^{+} de los linfocitos T en un mono infectado con SIV y en tres monos vacunados con ADN. Las respuestas de célula T CD8^{+} fueron medidas después de cada una de las 5 inoculaciones con ADN para los monos 95058 y 95045, y de cada una de las 3 inoculaciones con ADN para el mono 96031. Fueron estimuladas las PBMC durante 2 semanas in vitro y, a continuación, tintadas con complejos tetraméricos (Panel A), o analizadas en ensayos estándar de liberación de Cr^{51} (Panel B).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Antes de describir en detalle la presente invención ha de entenderse que esta invención no se limita a los parámetros de moléculas o de procesos particularmente ejemplificados, ya que los mismos, desde luego, pueden variar. Ha de entenderse también que la terminología aquí utilizada lo es únicamente con el propósito de describir realizaciones determinadas de la invención, y su intención no es limitadora. Además, la práctica de la presente invención utilizará, a no ser que sea indicado de otra manera, métodos convencionales de virología, microbiología, biología molecular, técnicas de ADN recombinante e inmunología, todos los cuales se encuentran dentro del conocimiento ordinario en este campo. Tales técnicas se encuentran explicadas completamente en la literatura existente. Ver, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); y Fundamental Virology, 2ª edición, vol I & II (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds.).

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente aquí citadas, tanto supra como infra, son incorporadas aquí en su totalidad como referencia.

Debe ser observado que, conforme es utilizado en esta especificación y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un" y "el" incluyen referentes en plural, a menos que el contenido indique claramente otra cosa. De esta forma, la referencia a "un epítope CTL" incluye dos o más de tales epítopes, la referencia a "un antígeno" incluye dos o más de tales antígenos, y similares.

A. Definiciones

A menos que sea definido de otra manera, todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen el mismo significado por el que son usualmente entendidos por una persona con conocimientos ordinarios en el campo al cual pertenece la invención. Aunque pueden ser utilizados en la práctica de la presente invención un número de métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos, los materiales y métodos preferidos son los aquí
descritos.

A la hora de describir la presente invención serán utilizados los siguientes términos, y la intención es que sean definidos conforme es indicado más abajo.

El término "inmunización por ácido nucleico" es utilizado aquí para referirse a la introducción de una molécula de ácido nucleico, codificando uno o más antígenos seleccionados, dentro de una célula huésped para la expresión in vivo del antígeno o antígenos. La molécula de ácido nucleico puede ser introducida directamente dentro del sujeto receptor, por medio de inyección estándar intramuscular o intradérmica; suministro de partícula transdérmico; inhalación; tópicamente, o por modos de administración oral, intranasal o mucosal. Alternativamente, la molécula puede ser introducida ex vivo dentro de células que han sido retiradas de un sujeto. En este último caso, las células que contienen la molécula de ácido nucleico de interés son introducidas dentro del sujeto, de tal forma que pueda ser montada una respuesta inmune contra el antígeno codificado por la molécula de ácido nucleico.

Un "antígeno" se refiere a cualquier agente, generalmente una macromolécula, que pueda provocar una respuesta inmunológica en un individuo. El término puede ser utilizado para referirse a una macromolécula individual o a una población homogénea o heterogénea de macromoléculas antigénicas. Conforme es utilizado aquí, "antígeno" es utilizado generalmente para referirse a una molécula proteínica, o a una parte de la misma, la cual contiene uno o más epítopes. Para los propósitos de la presente invención, los antígenos pueden ser obtenidos o derivados de cualquier patógeno vírico, bacteriano, parasitario o fúngico conocido. El término está pensado también para cualquiera de los distintos antígenos tumorales específicos y antígenos asociados a enfermedades autoinmunes. Además, para los propósitos de la presente invención, un "antígeno" incluye una proteína que posee modificaciones, tales como deleciones, adiciones y substituciones (por lo general de naturaleza conservadora) de la secuencia original, siempre y cuando la proteína mantenga inmunogenicidad suficiente. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo por medio de mutagénesis dirigida a sitio específico, o pueden ser accidentales, tales como por medio de mutaciones de huéspedes, lo cual produce los antígenos.

En distintos aspectos de la invención el antígeno contiene uno o más epítopes de células T. Un "epítope de célula T" se refiere, por lo general, a aquéllas características de una estructura peptídica que son capaces de inducir una respuesta de célula T. A este respecto, es aceptado en este campo que los epítopes de célula T comprenden determinantes peptídicos lineales que asumen conformaciones alargadas dentro de la hendidura de unión peptídica de las moléculas MHC. Unanue et al. (1987) Science 236:551-557. Conforme es aquí utilizado, un epítope de célula T es, por lo general, un péptido poseyendo, al menos, alrededor de 3 a 5 residuos aminoacídicos y, preferiblemente, al menos de 5 a 10 o más residuos aminoacídicos. El término comprende cualquier péptido restringido a MHC clase I ó MHC clase II. La habilidad de un epítope particular de estimular una respuesta inmunológica mediada por célula puede ser determinada por medio de un número de ensayos de sobra conocidos, tales como los ensayos de linfoproliferación (activación linfocitaria), ensayos de célula citotóxica CTL, o ensayando para determinar los linfocitos T específicos para el epítope en un sujeto sensibilizado. Ver, por ejemplo, Erickson et al. (1993) J. Immunol. 151:4189-4199; y Doe et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:2369-2376.

En otros aspectos de la invención el antígeno contiene uno o más epítopes de célula B. Un "epítope de célula B" se refiere, por lo general, al sitio en un antígeno al cual se une una molécula de anticuerpo específica. La identificación de los epítopes que son capaces de provocar una respuesta de anticuerpo es fácilmente conseguida, utilizando técnicas de sobra conocidas en este campo. Ver, por ejemplo, Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 81:3998-4002 (método general de sintetización rápida de péptidos para determinar la situación de epítopes inmunogénicos en un antígeno dado); Patente americana nº 4.708.871 (procedimientos para la identificación y sintetización química de epítopes de antígenos); y Geysen et al. (1986) Molecular Immunology 23:709-715 (técnica para la identificación de péptidos con alta afinidad por un anticuerpo dado).

Una "respuesta inmune" contra un antígeno de interés es el desarrollo en un individuo de una respuesta inmune humoral y/o celular a ese antígeno. Para los propósitos de la presente invención, una "respuesta inmune humoral" se refiere a una respuesta inmune mediada por moléculas de anticuerpo, mientras que una "respuesta inmune celular" es una mediada por linfocitos T y/o otras células blancas sanguíneas.

Cuando un individuo es inmunizado con un complejo de proteína-antígeno poseyendo determinantes múltiples (epítopes), en muchos casos la mayoría de los linfocitos T que responden serán específicos para una, o para unas pocas secuencias aminoacídicas lineales (epítopes) procedentes de ese antígeno, y/o una mayoría de los linfocitos B que responden serán específicos para uno, o para unos pocos epítopes lineales o conformacionales procedentes de ese antígeno. Entonces, para los propósitos de la presente invención, tales epítopes son denominados "epítopes inmunodominantes". En un antígeno poseyendo varios epítopes inmunodominantes, un único epítope puede ser el más dominante en términos de ordenar una respuesta específica de células T o B. De esta forma, para los propósitos de la presente invención, el término "epítope primario inmunodominante" es utilizado para referirse al epítope inmunodominante más dominante de un antígeno poseyendo una pluralidad de tales epítopes, y el resto de los epítopes inmunodominantes son denominados "epítope(s) inmunodominante secundario". El antígeno de la nucleocápside del virus de la hepatitis B (HBcAg) contiene un epítope CTL inmunodominante N-terminal que tiene lugar alrededor de los residuos 18 a 27 de la secuencia aminoacídica de tipo salvaje. El HBcAg posee también un epítope de célula B dominante que tiene lugar en una posición interna dentro de la partícula de HBcAg (teniendo lugar alrededor de los residuos 74 a 81 de la secuencia aminoacídica de tipo salvaje). Este epítope dominante de célula B del HBcAg es aquí denominado como la región lazo del "epítope central inmunodominante", o la región lazo "ICE", ya que se encuentra expuesto como una estructura lazo accesible en la superficie (un lazo "accesible al solvente") en la partícula antígeno central formada.

Una "secuencia codificadora", o una secuencia que "codifica" un antígeno seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que es transcrita (en el caso del ADN) y traducida (en el caso del ARNm) en un polipéptido in vivo cuando es colocada bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora son determinados por un codón de inicio en la porción terminal 5' (amino) y un codón de terminación de traducción en la porción terminal 3' (carboxi). Para los propósitos de la invención, una secuencia codificadora puede incluir, aunque sin estar limitada a los mismos, ADNc viral, ARNm procariótico o eucariótico, secuencias de ADN genómico procedentes de ADN viral o procariótico, e incluso secuencias de ADN sintético. Una secuencia de terminación de transcripción puede estar situada en la porción 3' de la secuencia codificadora.

Una molécula de "ácido nucleico" puede incluir, aunque sin estar limitada a los mismos, secuencias procarióticas, ARNm eucariótico, ADNc procedente de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico procedentes de ADN eucariótico (por ejemplo, mamífero), e incluso secuencias de ADN sintético. El término captura también secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de base conocidos del ADN y del ARN.

"Ligado operativamente" se refiere a una colocación de elementos, en donde los componentes así descritos están configurados de tal forma que realizan su función usual. De esta forma, un promotor dado, ligado operativamente a una secuencia codificadora, es capaz de efectuar la expresión de la secuencia codificadora cuando se encuentran presentes las enzimas adecuadas. No es necesario que el promotor se encuentre contiguo a la secuencia codificadora, siempre y cuando éste funcione para dirigir la expresión de la misma. De esta forma, por ejemplo, pueden estar presentes entre la secuencia promotora y la secuencia codificadora secuencias intervinientes no traducidas aunque transcritas y, sin embargo, la secuencia promotora puede seguir siendo considerada como "ligada operativamente" a la secuencia codificadora.

"Recombinante" es utilizado aquí para describir una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) de ADNc genómico, semisintético o sintético en cuanto a su origen, la cual en virtud de su origen o manipulación no se encuentra asociada con todo, o con parte del polinucleótido con el cual se encuentra asociada en la naturaleza, y/o se encuentra ligada a un polinucleótido distinto al que se encontraría unida en la naturaleza. Dos secuencias de ácido nucleico que se encuentran dentro de una única molécula de ácido nucleico recombinante son "heterólogas" entre sí cuando normalmente no se encuentran asociadas entre sí en la naturaleza.

Dos secuencias de ácido nucleico son "substancialmente homólogas" cuando, al menos, alrededor del 70%, preferiblemente, al menos, alrededor del 80 al 90% y, más preferiblemente, al menos, alrededor del 95% de los nuleótidos son iguales sobre una longitud definida de la molécula. Conforme es aquí utilizado, substancialmente homólogas se refiere también a secuencias que muestran identidad con el ácido nucleico especificado. Las secuencias de ácido nucleico que son substancialmente homólogas pueden ser identificadas en un experimento de hibridación de Southern, por ejemplo, bajo condiciones rigurosas, conforme es definido para ese sistema en particular. El definir las condiciones de hibridación adecuadas se encuentra dentro de los conocimientos de este campo. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra; DNA Cloning, vols. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. Tales secuencias pueden ser confirmadas también, y caracterizadas adicionalmente, por medio de secuenciación directa de productos PCR.

Los términos "individuo" y "sujeto" son utilizados aquí intercambiablemente para referirse a cualquier miembro de la subfamilia de los cordados, incluyendo, sin limitación, a los humanos y a otros primates, incluyendo a los primates no humanos, tales como chimpancés y otros simios y familias de monos; animales de granja como ganado, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas y cerdos de guinea; pájaros, incluyendo los domésticos, pájaros salves y de caza, tales como gallinas, pavos y otras aves gallináceas, patos, gansos y similares. Los términos no denotan una edad en particular. De esta forma, la intención es que el término cubra tanto a los individuos adultos como a los recién nacidos. Los métodos aquí descritos están pensados para su uso en cualquiera de las especies de vertebrados anteriormente citadas, ya que los sistemas inmunes de todos estos vertebrados operan de forma similar.

B. Métodos Generales

En una realización es proporcionada una molécula de ácido nucleico recombinante. La molécula recombinante incluye una secuencia codificando un antígeno de la nucleocápside del virus de la hepatitis B (HBcAg) y una secuencia codificando un epítope de linfocito T citolítico (CTL) de interés. La secuencia codificando el epítope CTL puede ser insertada dentro de la región lazo del epítope central inmunodominante (ICE) de la molécula de HBcAg. Alternativamente, la región ICE puede ser borrada de la molécula, y la secuencia codificando el epítope CTL puede ser insertada en lugar de la región ICE, o ser insertada dentro de cualquier otra posición N-terminal, C-terminal o posición interna de la parte HBcAg de la molécula. Es preferido que la inserción de la secuencia codificando el epítope CTL dentro de la parte HBcAg de la molécula híbrida no interfiera con la habilidad del producto de expresión de autoensamblarse en una partícula portadora central híbrida. Cuando es transfectada en una célula huésped adecuada, la molécula de ácido nucleico recombinante codifica un resto portador HBcAg híbrido, en donde la parte HBcAg sirve como un portador, y la parte del epítope CTL sirve como el inmunogen. Las moléculas de ácido nucleico recombinantes de la presente invención pueden ser utilizadas como reactivos en distintas estrategias de inmunización por ácido nucleico.

La parte HBcAg de la molécula de ácido nucleico recombinante puede ser obtenida de fuentes conocidas. A este respecto, el virus de la hepatitis B (HBV) es un virus encapsulado pequeño, con un genoma de ADN de cadena doble. La secuencia del genoma del HBV (por ejemplo, particularmente de los subtipos adw y ayw) es conocida y se encuentra bien caracterizada. Tiollais et al. (1985) Nature 317:489, Chisari et al (1989) Microb. Pathog. 6:311. El HBcAg es un polipéptido compuesto de 180 residuos aminoacídicos y posee varias partes inmunodominantes, las cuales han sido muy estudiadas (por ejemplo, la región lazo ICE). El HBcAg puede ser expresado fácilmente en el Escherichia coli y en otros procariotas, donde se autoensambla en partículas. Por esta razón, han sido fusionados numerosos antígenos peptídicos con el HBcAg, con el fin de proporcionar partículas portadoras centrales híbridas que muestren una inmunogenicidad mejorada de las células B. Schödel et al. (1994) J. Exper. Med. 180:1037; Clarke et al. (1987) Nature 330:381; Borisova et al. (1989) FEBS Lett. 259:121; Stahl et al. (1989) Proc. natl. Acad. Sci. USA 86:6283. La secuencia de ácido nucleico codificando el HBcAg es conocida también, y han sido descritos constructos plásmidos conteniendo la secuencia de HBcAg. Schödel et al., supra. En el producto de expresión la región lazo inmunodominante se extiende por los residuos 72 a 85 de la molécula de HBcAg de 180 residuos, con el ICE teniendo lugar alrededor de los residuos 74 a 81.

De manera similar, la secuencia de ácido nucleico codificando el antígeno de interés puede ser obtenida también de fuentes conocidas. A este respecto, el antígeno de interés será preferiblemente asociado con un patógeno, como un patógeno viral, bacteriano o parasitario, o el antígeno puede ser un antígeno tumoral específico, o un antígeno útil a la hora de romper la auto-tolerancia en desórdenes autoinmunes, como en la diabetes, el lupus, la artritis, la MS y la alergia.

Los antígenos tumorales específicos incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, cualquiera de los distintos MAGEs (antígeno E asociado a melanoma), incluyendo MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3 (péptido HLA-A1), MAGE 4, etc.; cualquiera de las distintas tirosinasas (péptido HLA-A2); ras mutante, p53 mutante, y antígeno de melanoma p97. Otros antígenos tumorales específicos incluyen el péptido Ras y el péptido p53 asociados a cánceres en estado avanzado, los antígenos HPV 16/18 y E6/E7 asociados a cánceres cervicales, el antígeno MUC1-KLH asociado al carcinoma de pecho, el CEA (antígeno carcinoembriónico) asociado al cáncer colorectal, los antígenos gp100 o MART1 asociados al melanoma, y el antígeno PSA asociado al cáncer de próstata. La secuencia génica p53 es conocida (ver, por ejemplo, Harris et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:4650-4656) y se encuentra depositada en el GenBank bajo el número de acceso M14694.

Antígenos virales adecuados incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, secuencias polinucleótidas codificando antígenos procedentes de virus de la familia de la hepatitis, incluyendo virus de la hepatitis A (HAV), virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV), el virus de la hepatitis delta (HDV), el virus de la hepatitis E (HEV) y el virus de la hepatitis G (HGV). A modo de ejemplo, y sin ser limitador en la presente invención, es conocida la secuencia genómica del HCV, así como métodos para la obtención de la secuencia. Ver, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales núms. WO 89/04669; WO 90/11089; y WO 90/14436. De forma similar, es conocida la secuencia codificadora del antígeno \delta del HDV (ver, por ejemplo, la Patente americana nº 5.378.814).

Pueden ser utilizadas también en la práctica de la presente invención secuencias codificando una amplia variedad de antígenos proteínicos procedentes de la familia de los virus herpes, incluyendo antígenos derivados del virus del herpes simple (HSV) tipos 1 y 2, tales como glicoproteínas gB, gD y gH del HSV-1 y del HSV-2; antígenos procedentes del virus varicela zóster (VZV), virus Epstein-Barr (EBV) y citomegalovirus (CMV), incluyendo gB y gH del CMV; y antígenos procedentes de otros virus herpes humanos, tales como el HHV6 y el HHV7. (Ver, por ejemplo, Chee et al. (1990) Cytomegaloviruses (J.K. McDougall, ed., Springer-Verlag, pp. 125-169); McGeoch et al. (1988) J. Gen. Virol. 69:1531-1574; Patente americana nº 5.171.568; Baer et al. (1984) Nature 310:207-211; y Davison et al. (1986) J. Gen. Virol. 67:1759-1816).

Son conocidos, y se ha informado sobre ellos, los antígenos del HIV, tales como la secuencias gp120 para una multitud de aislados del HIV-1 y del HIV-2, incluyendo miembros de los distintos subtipos genéticos del HIV (ver, por ejemplo, Myers et al., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico (1992); y Modrow et al. (1987) J. Virol. 61:570-578), y encontrarán uso en los presentes métodos los antígenos derivados de cualquiera de estos aislados. Además, la invención es igualmente aplicable a otros restos inmunogénicos derivados de cualquiera de los distintos aislados del HIV, incluyendo cualquiera de las diferentes proteínas de envoltura, tales como la gp160 y la gp 41, los antígenos gag tales como el p24gag y el p55gag, así como las proteínas derivadas de las regiones pol, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu y LTR del HIV.

Los antígenos del virus de la gripe, en particular las glicoproteínas de envoltura HA y NA de la gripe A, son también muy conocidas y se encuentran ampliamente caracterizadas. A este respecto, han sido identificados numerosos subtipos HA de la gripe A (Kawaoka et al. (1990) Virology 179:759; Webster et al., "Antigenic variation among type A influenza viruses", p. 127-168. In: P. Palese y D.W. Kingsbury (ed.), Genetics of influenza viruses. Springer-Verlag, New York).

Secuencias codificando antígenos derivados u obtenidos de otros virus también encontrarán su uso en la práctica de la invención incluyendo, sin limitación, secuencias procedentes de miembros de las familias Picornaviridae (por ejemplo, poliovirus, FMDV, etc.); Caliciviridae; Togaviridae (por ejemplo, el virus de la rubeola, el virus del dengue, etc.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae; Birnaviridae; Rhabodoviridae (por ejemplo, el virus de la rabia, etc.); Filoviridae; Paramyxoviridae (por ejemplo, el virus de las paperas, el virus del sarampión, el virus respiratorio sincitial, etc.); Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviridae (por ejemplo, el HTLV-I; HTLV-II; HIV-1 (también conocido como HTLV-III, LAV, ARV, TLRh, etc.)), incluyendo, aunque sin estar limitados a los mismos, antígenos procedentes de los aislados HIV_{IIIb}, HIV_{SF2}, HIV_{LAV}, HIV_{LAI}, HIV_{MN}); HIV-1_{CM235}, HIV-1_{US4}; HIV-2, entre otros. Ver, por ejemplo, Virology, 3ª edición (W.K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2ª edición (B.N. Fields y D.M. Knipe, eds. 1991) para una descripción de estos y otros virus.

Las secuencias codificando antígenos adecuados bacterianos y parasitarios pueden ser obtenidas o derivadas de agentes causantes conocidos, responsables de enfermedades tales como la difteria, la pertussis, el tétano, la tuberculosis, la neumonía bacteriana o fúngica, el cólera, el tifus, la peste, la sigelosis o salmonelosis, la enfermedad del legionario, la enfermedad de Lyme, la lepra, la malaria, las lombrices, la oncocerciasis, la esquistosomiasis, la tripanosomiasis, la leishmaniasis, la giardia, la amebiasis, la filariasis, la borrelia y la triquinosis. Otras secuencias antigénicas adicionales pueden ser obtenidas o derivadas de virus no convencionales o priones, tales como los agentes causantes del kuru, de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), del escrapie, de la encefalopatía transmisible del visón, y enfermedades crónicas de desgaste, o de partículas infecciosas proteináceas tales como los priones que se encuentran asociados con la enfermedad de las vacas locas.

La secuencia antigénica seleccionada puede ser utilizada como un antígeno discreto, por ejemplo, como una secuencia codificando un péptido corto, o un minigén (Yu et al.), o pueden ser utilizadas porciones mayores de una molécula o genoma en cuestión, por ejemplo, un ADN proviral que incluya casi la totalidad de un genoma viral particular. Pueden ser utilizados también múltiples antígenos, tanto de la misma entidad como de una entidad sin ninguna relación. Sin embargo, cada antígeno de interés -el cual es incluido dentro de las moléculas de ácido nucleico recombinantes de la presente invención- contendrá, al menos, un epítope CTL. La presencia de un epítope de célula T en una secuencia antigénica en particular puede ser determinado fácilmente por aquéllos expertos en este campo. Por ejemplo, pueden ser utilizados paquetes de software informático comunes y técnicas de simulación de péptidos, con el fin de escanear una secuencia dada para determinar la presencia de motivos ideales de unión específicos de alelo del MHC. Rothbard et al. (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:527; Rotzschke et al. (1991) Immunol. Today 12:447; Bertoletti et al. (1993) J. Virol. 67:2376; Flak et al. (1991) Nature 351:290.

En algunas moléculas puede ser incluida una tercera secuencia ancilar, lo cual proporciona la secreción de una molécula híbrida unida de antígeno-HBcAg procedente de una célula de mamífero. Tales secuencias líder secretoras son conocidas por aquéllos expertos en este campo, e incluyen, por ejemplo, la secuencia señal líder activadora del plasminogeno tisular (tpa).

Las secuencias para el portador HBcAg, el líder ancilar y el antígeno(s) de interés pueden ser obtenidas y/o preparadas utilizando métodos conocidos. Por ejemplo, las preparaciones de antígeno substancialmente puras pueden ser obtenidas utilizando herramientas biológicas moleculares estándar. Es decir, las secuencias polinucleótidas codificando para los restos anteriormente descritos pueden ser obtenidas utilizando métodos recombinantes, tales como el escrutinio de librerías de ADNc y genómicas procedentes de células expresoras de un antígeno, o derivando la secuencia codificadora para el HBcAg de un vector del que se sabe que incluye el mismo. Además, las secuencias deseadas pueden ser aisladas directamente de células y tejidos conteniendo la misma, utilizando técnicas estándar, tales como la extracción por fenol y por PCR del ADNc o ADN genómico. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra, para una descripción de técnicas utilizadas para la obtención de un ADN aislado. Las secuencias polinucleótidas pueden ser producidas también sintéticamente, mejor que clonadas.

Otro método conveniente más para el aislamiento de moléculas de ácido nucleico específicas es por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Mullis et al. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350. Esta técnica utiliza polimerasa de ADN, usualmente una polimerasa de ADN termoestable, para replicar una región deseada del ADN. La región del ADN a ser replicada es identificada por medio de oligonucleótidos de secuencia especificada, complementarios de los extremos opuestos y de las cadenas opuestas del ADN deseado para iniciar la reacción de replicado. El producto de la primera tanda de replicado es, por si mismo, un templete para el subsiguiente replicado. De esta forma, ciclos sucesivos de replicado dan como resultado la amplificación geométrica del fragmento de ADN delimitado por el par iniciador utilizado.

Una vez que las secuencias para el portador HBcAg y el antígeno(s) de interés han sido obtenidas, son ligadas entre sí para proporcionar una molécula de ácido nucleico, utilizando técnicas estándar de clonaje o de biología molecular. Más en particular, después de que es obtenida la información de secuencia para el portador HBcAg, la secuencia codificando el antígeno de interés es combinada con la secuencia portadora, con el fin de formar la molécula híbrida. Conforme es descrito aquí más arriba, la secuencia del antígeno puede ser simplemente colocada dentro de la región lazo ICE, interrumpiendo de esta forma esa región, o la región lazo ICE puede ser suprimida de la parte portadora de la molécula y, o bien ser reemplazada por la secuencia del antígeno, o la secuencia antígeno puede ser colocada en un sitio diferente dentro de la secuencia del HBcAg. La secuencia del antígeno que codifica, al menos, un epítope CTL codificará, por lo general, un mínimo de alrededor de cinco aminoácidos, más usualmente un mínimo de alrededor de ocho aminoácidos, y aún más usualmente, un mínimo de alrededor de 9 a 10 aminoácidos. Si se encuentra presente más de un epítope, la secuencia del antígeno será, al menos, tan grande como las secuencias combinadas de los epítopes. Sin embargo, ya que los epítopes de célula T pueden solaparse, la secuencia aminoacídica mínima para la secuencia antígeno puede ser inferior que la suma de los epítopes individuales.

Aunque puede ser utilizado cualquier número de técnicas rutinarias de biología molecular para construir tales moléculas de ácido nucleico recombinantes, un método conveniente conlleva la utilización de uno o más sitios de restricción únicos en la secuencia del HBcAg (o la inserción de uno o más sitios de restricción únicos dentro de la secuencia del HBcAg) y de técnicas estándar de clonado para dirigir la secuencia del antígeno hacia un sitio diana en particular dentro de la secuencia portadora. A este respecto, el diseño de sitios de restricción únicos es fácilmente conseguido bien analizando la secuencia del HBcAg para determinar los sitios de restricción existentes, o sometiendo a la secuencia del HBcAg a una batería de diferentes endonucleasas de restricción y determinando qué enzimas clivan la secuencia y el sitio de cada clivado. Las secuencias ya presentes en la molécula del HBcAg, que flanquean un determinado sitio de inserción diana, pueden ser mutadas para producir un sitio de restricción único. Si no, pueden ser insertados fácilmente (por ejemplo, fabricados) sitios de restricción adecuados dentro de la secuencia del HBcAg, con el fin de proporcionar uno o más sitios de inserción diana. De esta forma, la secuencia(s) antígeno será manipulada, desde luego, para tener sitios de restricción contiguos, los cuales se corresponden con el sitio diana en la secuencia del HBcAg. De esta manera, las secuencias del antígeno pueden ser fácilmente introducidas y sacadas de la secuencia del HBcAg.

Alternativamente, la secuencia híbrida portador/antígeno puede ser producida sintéticamente, mejor que clonada. La secuencia nucleotídica puede ser diseñada con los codones adecuados para la secuencia aminoacídica en particular deseada. En general, se seleccionarán los codones preferidos para el huésped previsto, en el cual será expresada la secuencia. La secuencia completa puede entonces ser ensamblada de oligonucleótidos que se solapen, preparados por medio de métodos estándar y ensamblados en una secuencia codificadora completa. Ver, por ejemplo, Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science (1984) 223:1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311.

De cualquier forma que sea preparada la molécula de ácido nucleico recombinante, se prefiere que la inserción de la secuencia del antígeno(s) en el portador HBcAg se realice de tal manera que no trastorne la habilidad del producto de expresión portador central híbrido de autoensamblarse en partículas. La habilidad de un producto de expresión de molécula híbrida de HBcAg-antígeno de formar partículas puede ser determinada utilizando técnicas conocidas (ver, por ejemplo, Schödel et al., supra, electron micrographs of fixed particles, negative stain).

Una vez que la secuencia de antígeno ha sido insertada dentro de la secuencia del HBcAg para obtener la molécula de ácido nucleico recombinante, esta secuencia codificadora híbrida puede ser insertada en un vector que incluya secuencias control ligadas operativamente a la secuencia insertada, permitiendo de esta forma la expresión de la molécula híbrida HBcAg-antígeno in vivo en una especie sujeto diana. Por ejemplo, promotores usuales para la expresión de células de mamífero incluyen al promotor temprano SV40, un promotor CMV como el promotor temprano inmediato CMV, el promotor LTR del virus de tumor mamario murino, el promotor tardío mayor de adenovirus (Ad MLP), y otros sistemas promotores eficientes adecuados. Pueden ser utilizados también para la expresión en mamíferos promotores no virales, tales como un promotor derivado del gen de la metalotioneína murina. Usualmente se encontrarán también presentes las secuencias de finalización transcripcional y de poliadenilación, situadas en el extremo 3' del codón de finalización de traducción. Preferiblemente se encuentra también presente una secuencia para optimizar la iniciación de la traducción, situada en el extremo 5' de la secuencia codificadora. Ejemplos de señales de finalización transcripcional/poliadenilación incluyen aquéllas derivadas del SV40 -conforme es descrito en Sambrook et al., supra-, así como una secuencia de finalización de hormona de crecimiento bovino. Pueden ser diseñados también en el casete de expresión intrones conteniendo sitios de empalme donante y receptor.

Además, pueden ser incluidos elementos de mejora dentro de los casetes de expresión, con el fin de incrementar los niveles de expresión. Ejemplos de mejoradores adecuados incluyen el reforzador genético temprano SV40 (Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761), el reforzador/promotor derivado de la repetición terminal larga (LTR) del virus del Sarcoma de Rous (Gorman et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777), y elementos derivados de CMV murino o humano (Boshart et al. (1985) Cell 41:521), por ejemplo, elementos incluidos en la secuencia del intrón A del CMV.

Una vez completos, estos constructos son usados para la inmunización por ácido nucleico, utilizando protocolos estándar de suministro génico. Los métodos para el suministro génico son conocidos en este campo. Ver, por ejemplo, las Patentes americanas núms. 5.399.346, 5.580.859, 5.589.466. Los genes pueden ser suministrados directamente a un sujeto o, alternativamente, suministrados ex vivo a células derivadas del sujeto, siendo reimplantadas después las células en el sujeto.

Han sido desarrollados un número de sistemas basados en virus con el fin de transfectar células de mamífero. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico recombinante seleccionada puede ser insertada en un vector y empaquetada como partículas retrovirales, utilizando técnicas conocidas en este campo. El virus recombinante puede entonces ser aislado y suministrado a las células del sujeto bien in vivo o ex vivo. Han sido descritos un número de sistemas retrovirales (Patente americana nº 5.219.740; Miller et al. (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A.D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; y Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037).

Han sido descritos también un número de vectores de adenovirus (Haj-Ahmad et al. (1986) J. Virol. 57:267-274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717-729; y Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461-476). Adicionalmente, han sido desarrollados varios sistemas vectoriales de virus adeno-asociado (AAV). Los vectores AAV pueden ser construidos fácilmente utilizando técnicas de sobra conocidas en este campo. Ver, por ejemplo, las Patentes americanas núms. 5.173.414 y 5.139.941; las Publicaciones Internacionales núms. WO 92/01070 (publicada el 23 de enero de 1992) y la WO 93/03769 (publicada el 4 de marzo de 1993); Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; y Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801. Vectores virales adicionales, los cuales encontrarán uso para el suministro de las moléculas de ácido nucleico recombinantes de la presente invención, incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, aquéllos derivados de virus de la familia de la viruela, incluyendo virus vaccinia y virus de la viruela aviar.

Si los vectores virales no son deseados, pueden ser utilizadas alternativamente preparaciones liposomales para suministrar las moléculas de ácido nucleico de la invención. Preparaciones liposomales útiles incluyen preparaciones catiónicas (cargadas positivamente), aniónicas (cargadas negativamente) y neutras, siendo particularmente preferidos los liposomas catiónicos. Se ha demostrado que los liposomas catiónicos median en el suministro intracelular de ADN plásmido (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7416) y de ARNm (Malone et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Scie. USA 86:6077-6081).

Como otra alternativa más a los sistemas de vector viral, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser encapsuladas, absorbidas o asociadas a portadores particulados. Portadores particulados adecuados incluyen aquéllos derivados de polímeros de polimetil metacrilato, así como micropartículas de PLG derivadas de polilácticos y poliláctico-co-glicólicos. Ver, por ejemplo, Jeffrey et al. (1993) Pharm. Res. 10:362-368. Pueden ser utilizados también otros sistemas particulados y polímeros, por ejemplo, polímeros tales como la polilisina, la poliarginina, la poliornitina, la espermina, la espermidina, así como conjugados de estas moléculas.

La formulación de una composición comprendiendo las moléculas de ácido nucleico recombinantes anteriores puede ser llevada a cabo utilizando metodologías y químicas estándar de formulación farmacéutica, todas ellas fácilmente disponibles para una persona razonablemente experta en este campo. Por ejemplo, las composiciones conteniendo una o más moléculas de ácido nucleico pueden ser combinadas con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Pueden encontrarse presentes en el excipiente o vehículo substancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificadores, substancias tamponadoras de pH y similares. Estos excipientes, vehículos y substancias auxiliares son usualmente agentes farmacéuticos que no inducen una respuesta inmune en el individuo que recibe la composición, y que pueden ser administrados sin toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin estar limitados a los mismos, líquidos tales como agua, solución salina, polietilenoglicol, ácido hialurónico, glicerol y etanol. Pueden ser incluidas también aquí las sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales minerales ácidas, tales como los hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Pueden ser incluidos también en las composiciones ciertos facilitadores de captación y/o expresión de ácido nucleico, por ejemplo, facilitadores tales como la bupivacaina, la cardiotoxina y la sucrosa. Un pormenorizado estudio de excipientes, vehículos y substancias auxiliares farmacéuticamente aceptables se encuentra disponible en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991), aquí incorporado como referencia.

Las composiciones formuladas incluirán una cantidad del antígeno de interés, la cual es suficiente como para montar una respuesta inmunológica, conforme es definido más arriba. Una cantidad efectiva apropiada puede ser determinada fácilmente por una persona experta en este campo. Tal cantidad puede encontrarse en un amplio rango, que puede ser determinado a través de pruebas rutinarias. Las composiciones pueden contener desde alrededor del 0,1% a alrededor del 99,9% del antígeno, y pueden ser administradas directamente al sujeto o, alternativamente, suministradas ex vivo a células procedentes del sujeto, utilizando métodos conocidos para aquéllos expertos en este campo. Por ejemplo, son conocidos métodos para el suministro ex vivo y reimplante en el sujeto de las células transformadas (por ejemplo, transfección mediada por dextrán, precipitado de fosfato de calcio, electroporación, y microinyección directa al núcleo). Métodos de administración in vivo pueden conllevar inyección utilizando una jeringuilla convencional. Los constructos pueden ser inyectados bien subcutáneamente, epidérmicamente, intradermalmente, intramucosales -tales como nasalmente, rectalmente y vaginalmente-, intraperitonealmente, intravenosamente, oralmente o intramuscularmente. Otros modos de administración incluyen la administración oral y pulmonar, supositorios y aplicaciones transdérmicas.

Sin embargo, se prefiere que las moléculas de ácido nucleico sean suministradas utilizando un dispositivo de aceleración de partículas, el cual dispara micropartículas recubiertas con ácido nucleico a un tejido diana, o suministra transdérmicamente composiciones particuladas de ácido nucleico. A este respecto, la inmunización por ácido nucleico basada en pistola génica ha demostrado provocar tanto la respuesta inmune humoral como la de linfocito T citotóxico, después del suministro epidérmico de cantidades en nanogramos de ADN. Pertmer et al. (1995) Vaccine 13:1427-1430. Las técnicas de suministro mediado por partícula han sido comparadas con otros tipos de inoculación de ácido nucleico, y se ha encontrado que son marcadamente superiores. Fynan et al. (1995) Int. J. Immunopharmacology 17:79-83, Fynan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478-11482 , y Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9519-9523. Tales estudios han investigado el suministro mediado por partícula de vacunas con base de ácido nucleico, tanto en piel superficial como en tejido muscular.

Son conocidos en este campo métodos mediados por partícula para el suministro de preparaciones de ácido nucleico. De esta forma, una vez preparadas y adecuadamente purificadas, las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas pueden recubrir partículas portadores utilizando una variedad de técnicas conocidas en este campo. Las partículas portadoras son seleccionadas de entre materiales que poseen una densidad adecuada en el rango de tamaños de partícula usualmente utilizados para suministro intracelular desde un dispositivo de pistola génica. El tamaño óptimo de partícula portadora, desde luego, dependerá del diámetro de las células diana.

Para los propósitos de la invención pueden ser utilizadas partículas portadoras de tungsteno, oro, platino e iridio. Son preferidas las partículas de tungsteno y de oro. Las partículas de tungsteno se encuentran fácilmente disponibles en tamaños promedio de 0,5 a 2,0 \mum de diámetro. Las partículas de oro u oro microcristalino (por ejemplo, polvo de oro A1570, disponible en Engelhard Corp., East Newark, NJ) también encontrarán su uso con la presente invención. Las partículas de oro proporcionan uniformidad de tamaño (disponibles en Alpha Chemicals en tamaños de partícula de 1 a 3 \mum, o disponibles en Degussa, South Plainfield, NJ en un rango de tamaños de partícula incluyendo 0,95 \mum). El oro microcristalino proporciona una distribución por tamaño de partícula diversa, usualmente en el rango de 0,5 a 5 \mum. Sin embargo, el área de superficie irregular del oro microcristalino proporciona un recubrimiento altamente efectivo con los ácidos nucleicos.

Son conocidos un número de métodos, y han sido descritos, para el recubrimiento o precipitado del ADN o ARN en las partículas de oro o tungsteno. La mayoría de tales métodos combinan, por lo general, una cantidad predeterminada de oro o tungsteno con ADN plásmido, CaCl_{2} y espermidina. La solución resultante es sometida a vórtex de forma continua durante el procedimiento de recubrimiento, con el fin de asegurar uniformidad en la mezcla de la reacción. Después del precipitado del ácido nucleico, las partículas recubiertas pueden ser transferidas a membranas adecuadas y se les permite el secado con anterioridad a su utilización, recubriendo superficies de un módulo muestra o casete, o cargadas en un casete de suministro para su utilización en instrumentos particulares de pistola
génica.

Son conocidos en este campo varios dispositivos adecuados de aceleración de partículas para el suministro mediado por partícula, y todos ellos son adecuados para su utilización en la práctica de la invención. Los diseños de dispositivo actuales emplean una descarga explosiva, eléctrica o gaseosa para propulsar a las partículas portadoras recubiertas hacia las células diana. Las partículas portadoras recubiertas pueden estar unidas, de forma que puedan soltarse, a una hoja portadora móvil, o estar unidas, de forma que puedan desprenderse, a una superficie a lo largo de la cual pasa una corriente de gas, elevando las partículas desde la superficie y acelerándolas hacia la diana. Un ejemplo de un dispositivo de descarga gaseosa es descrito en la Patente americana nº 5.204.253. Un dispositivo de tipo explosivo es descrito en la Patente americana nº 4.945.050. Un ejemplo de un aparato de aceleración de partículas de tipo descarga por helio es el instrumento PowderJect XR® (PowderJect Vaccines, Inc., Madison, WI), cuyo instrumento es descrito en la Patente americana nº 5.120.657. Un aparato de descarga eléctrica, adecuado para su utilización aquí, es descrito en la Patente americana nº 5.149.655. La información sobre todas estas patentes es incorporada aquí como
referencia.

Alternativamente, las composiciones particuladas de ácido nucleico pueden ser administradas transdérmicamente utilizando un dispositivo de jeringuilla sin aguja. Por ejemplo, una composición particulada comprendiendo las moléculas de ácido nucleico de la presente invención puede ser obtenida utilizando métodos farmacéuticos generales, tales como la evaporación simple (cristalización), secado al vacío, secado por atomización o liofilización. Si así se desea, las partículas pueden ser adicionalmente densificadas utilizando las técnicas descritas en la Publicación Internacional de dominio público nº WO 97/ 48485, incorporada aquí como referencia. Estas composiciones particuladas pueden entonces ser suministradas por medio de un sistema de jeringuilla sin aguja, como los descritos en las Publicaciones Internacionales de dominio público núms. WO 94/24263, WO 96/04947, WO 96/12513 y WO 96/20022, todas ellas aquí incorporadas como referencia.

El suministro de partículas comprendiendo antígenos o alérgenos, a través de los sistemas de jeringuilla sin aguja más arriba indicados, es practicado con partículas que poseen un tamaño aproximado usualmente variando desde 0,1 a 250 \mum, preferiblemente en el rango de alrededor de 10 a 70 \mum. Pueden ser suministradas también en estos dispositivos partículas mayores que alrededor de 250 \mum, siendo el límite superior el punto al cual el tamaño de las partículas causaría un daño fatal a las células de la piel. La distancia real que penetrarán las partículas suministradas en una superficie diana dependerá del tamaño de partícula (por ejemplo, el diámetro de partícula nominal, asumiendo una geometría de partícula más o menos esférica), de la densidad de la partícula, de la velocidad inicial a la que la partícula impacta contra la superficie, y de la densidad y viscosidad cinemática del tejido tisular diana. A este respecto, las densidades óptimas de partícula para su utilización en inyecciones sin aguja varia, por lo general, entre alrededor de 0,1 y 25 g/cm^{3}, preferiblemente entre alrededor de 0,9 y 1,5 g/cm^{3}, y las velocidades de la inyección varían, por lo general, entre alrededor de 100 y 3000 m/seg. Con presión gaseosa adecuada, las partículas con un promedio de diámetro de 10 a 70 \mum pueden ser aceleradas a través del inyector a velocidades que se acercan a las velocidades supersónicas de un flujo de gas conductor.

Las composiciones de partícula, o partículas recubiertas, son administradas al individuo de una manera compatible con la dosificación de la formulación, y en una cantidad que será efectiva para los propósitos de la invención. La cantidad de la composición a ser suministrada (por ejemplo, alrededor de 0,1 \mug a 1 mg, más preferiblemente de 1 a 50 \mug del antígeno o alergén) dependerá del individuo sometido a prueba. La cantidad exacta necesaria variará dependiendo de la edad y condiciones generales del individuo a ser tratado, y puede ser determinada fácilmente por una persona experta en este campo al leer las especificaciones una cantidad efectiva apropiada.

En otra realización de la invención es proporcionado un método para provocar una respuesta inmune celular en un sujeto. El método conlleva la transfección de células del sujeto con una secuencia codificadora del híbrido recombinante de HBcAg-antígeno, utilizando una de las moléculas de la presente invención (conforme es descrito aquí más arriba) en una fase de sensibilización y, a continuación, la administración de una segunda composición al sujeto en una fase de recuerdo, en donde la composición secundaria comprende o codifica el mismo antígeno que contiene la molécula híbrida recombinante de HBcAg-antígeno. La composición secundaria puede ser cualquier composición de vacuna adecuada que contenga una molécula de ácido nucleico codificando el antígeno(s) de interés, o una composición conteniendo el antígeno(s) de interés en forma de proteína o péptido. El suministro directo de las composiciones secundarias in vivo será conseguido, por lo general, con o sin vectores virales (por ejemplo, un vector vaccinia modificado) conforme es descrito más arriba, por medio de inyección utilizando una jeringuilla convencional o utilizando un sistema de suministro mediado por partícula, conforme es descrito también más arriba. La inyección será usualmente subcutánea, epidérmica, intradérmica, intramucosa (por ejemplo, nasal, rectal y/o vaginal), intraperitoneal, intravenosa, oral o intramuscular. Otras formas de administración incluyen la administración oral y pulmonar, supositorios y aplicaciones transdérmicas. La dosificación del tratamiento puede ser un calendario de dosis única o un calendario de dosis múltiples.

C. Experimentos

Se encuentran expuestos más abajo ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos son ofrecidos únicamente a efectos ilustrativos, y no se quiere que los mismos limiten en ningún modo el ámbito de la presente invención.

Se han realizado esfuerzos con el fin de asegurar la precisión en relación a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero, desde luego, debe ser tenido en cuenta algún error experimental y alguna desviación.

Ejemplo 1 Construcción de Moléculas Híbridas de HBcAg-Antígeno

Fue obtenida una secuencia codificando una partícula de HBcAg, la cual tenía suprimida la región C-terminal rica en arginina (cuya deleción no interfiere con la formación de partículas). A continuación fue insertado un único sitio de restricción (un sitio BSP120I) dentro del ICE, con el fin de proporcionar un punto de inserción para los antígenos de interés. La secuencia resultante es representada más abajo como SECUENCIA DE ID Nº 1, en donde el sitio BSP120I se encuentra indicado por la región de secuencia recuadrada.

1

2

La proteína traducida procedente de la molécula de ácido nucleico recombinante de la SECUENCIA DE ID Nº 1 es representada más abajo como SECUENCIA DE ID Nº 2. Aquí, de nuevo, el punto de inserción (el sitio BSP120I) para la secuencia del antígeno, la cual contiene al menos un epítope CTL, es indicado por los residuos
recuadrados.

3

A continuación fue insertada en el sitio BSP120I de la SECUENCIA DE ID Nº 1 una secuencia de antígeno codificando un epítope de CTL del SIV (la secuencia gag restringida de mamu A*01: CTPYDINQML, Allen et al. (1998) J. Immunol.; Kuroda et al (1988) J. Exp. Med. 187:1373-1381), poseyendo sitios contiguos BSP120I, con el fin de proporcionar una molécula recombinante codificando una molécula híbrida de HBcAg-antígeno. El constructo resultante es representado más abajo como la SECUENCIA DE ID Nº 3. La secuencia del antígeno insertado es representada como la región de secuencia recuadrada.

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

La traducción de la molécula de ácido nucleico recombinante de la SECUENCIA DE ID Nº 3 es representada más abajo como la SECUENCIA DE ID Nº 4, con la secuencia del antígeno insertada (incluyendo el epítope CTL) además de secuencias contiguas indicadas como los residuos encuadrados.

6

A continuación fue ligada a la secuencia recombinante una tercera secuencia, comprendiendo la secuencia codificante para un péptido secretor de señal. Esta tercera secuencia es la secuencia codificadora para el péptido señal activador del plasminogeno tisular (tpa), y es representada más abajo como la SECUENCIA DE ID Nº 5.

ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTG CTG

TGT GGA GCA GTC TTC GTT TCG GCT

(SECUENCIA DE ID Nº 5)

La secuencia proteínica para este péptido señal tpa es representada más abajo como la SECUENCIA DE ID Nº 6.

MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SA

(SECUENCIA DE ID Nº 6)

La molécula recombinante resultante fue insertada a continuación en una columna plásmida conteniendo el promotor temprano y la región del Intrón A del CMV, con el fin de obtener un casete de expresión. El constructo resultante fue llamado p7262, y el mapa de este constructo es representado en la Figura 1.

Ejemplo 2 Inmunización con el Constructo p7262

Con el fin de determinar la habilidad de las moléculas recombinantes de la presente invención a la hora de provocar respuestas de célula T de alta frecuencia en sujetos inmunizados, fue llevado a cabo el siguiente estudio.

Tres sujetos macacos resus fueron inmunizados con un vector de expresión codificando la secuencia gag restringida del mamu A*01 (CTPYDINQML) sin un resto portador. Dos de los sujetos (monos 95045 y 95058) recibieron 6,0 \mug de ADN total, siendo administradas 0,5 \mug en cada uno de los 12 sitios seleccionados. El tercer sujeto (mono 96031) recibió 16,0 \mug de ADN total, siendo administradas 2,0 \mug en cada uno de los 8 sitios seleccionados. El ADN fue administrado sobre partículas de oro utilizando el dispositivo de pistola génica PowderJect XR®, siguiendo metodología de suministro conocida. Seguidamente, dos de los sujetos (monos 95045 y 95058) recibieron 4 inmunizaciones adicionales de ácido nucleico, utilizando una composición conteniendo el constructo p7262. La primera de estas inmunizaciones adicionales fue realizada 13 semanas después de la primera inmunización, siendo realizada cada una de las siguientes administraciones con una separación de 4 a 6 semanas. Fue administrada una cantidad total de 16 \mug del constructo p7262 en cada inmunización adicional (2 \mug en cada uno de los 8 sitios seleccionados), utilizando de nuevo el dispositivo de pistola génica PowderJect XR®. El tercer sujeto (mono 96031) recibió 2 inmunizaciones adicionales de ácido nucleico utilizando la composición p7262. La primera de estas inmunizaciones adicionales fue realizada 6 semanas después de la inmunización inicial, teniendo lugar la segunda administración de 4 a 6 semanas más tarde. Fue administrada una cantidad total de 16 \mug del constructo p7262 en cada inmunización adicional (2 \mug en cada uno de los 8 sitios seleccionados), utilizando el dispositivo PowderJect XR®.

Después de ser realizados los regímenes de inmunización anteriormente descritos, fueron tomadas muestras de sangre y fueron aisladas células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) y estimuladas in vitro durante 2 semanas con células B autólogas transformadas por el EBV pulsadas con péptido. Fue determinado el porcentaje de células CD8^{+} específicas para el epítope del SIV (CTPYDINQML) en cada sujeto utilizando citometría de flujo, con un epítope del SIV tetramérico acoplado a FITC (CTPYDINQML) utilizando técnicas conocidas. Kuroda et al. (1998) J. Exp. Med. 187:1373-1381. Adicionalmente, fue determinada la actividad citolítica específica del epítope del SIV (CTPYDINQML) midiendo la lisis contra células B autólogas pulsadas con péptido en un ensayo de liberación de Cr^{51}. Los resultados son representados como las Figuras 2A y 2B, respectivamente. Como puede apreciarse, la inmunización inicial dio como resultado una respuesta CTL detectable. Sin embargo, las siguientes inoculaciones con el constructo p7262 (conteniendo la molécula de ácido nucleico recombinante codificando el antígeno híbrido HBcAg) dieron como resultado un incremento significativo de la respuesta CTL. En dos de estos sujetos (monos 95058 y 96031) las respuestas CTL se vieron incrementadas hasta niveles que excedían los detectados en un mono infectado por el SIV (control).

A continuación, los tres sujetos inmunizados fueron reinmunizados con un vector recombinante de la vacuna Ankara modificada codificando el mismo epítope del SIV (CTPYDINQML). Hanke et al. (1998) Vaccine 16:439-445. Más particularmente, fue administrada a cada sujeto una segunda composición de vacuna conteniendo 5x10^{8} uni-
dades formadoras de partícula (pfu) de un vector recombinante de MVA codificando el epítope del SIV. Fueron evaluadas de nuevo en cada sujeto la tinción de tetrámeros y la muerte de dianas autólogas pulsadas con péptido. Los resultados son indicados más abajo en la Tabla 1 (tinción de tetrámeros y actividad citolítica de PBMCs no reestimuladas frescas o congeladas). Las PBMCs fueron evaluadas una semana después de la reinmunización con MVA.

TABLA 1

	Tinción de Tetrámero	Actividad Citolítica
Sujeto	(PBMC no estimulada, fresca)	(PBMC no estimulada, congelada)
95058	18,0%	14%
96031	8,3%	7%
95045	0,8%	-2%

Como puede apreciarse, las respuestas CTL de frecuencia extremadamente alta fueron vistas en 2/3 de los sujetos (monos 95038 y 96031), con un 18 y un 8,3%, respectivamente, del total de células CD8^{+} específicas para el epítope del SIV. Estos niveles exceden los niveles inducidos por infección aguda del SIV, exceden los niveles detectados en monos inmunizados y reinmunizados con dos dosis de la composición de vacuna MVA (Seth & Letvin (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA), y exceden los niveles detectados en monos inmunizados con dos inmunizaciones de ADN de un epítope del SIV basado en un no portador del HBcAg. Adicionalmente, los inventores creen que la respuesta CTL de alta frecuencia provocada por las moléculas de ácido nucleico recombinantes de la presente invención pueden ser los niveles más altos de CTL inducidos por vacuna que hayan sido nunca detectados en un modelo de primate no humano.

Los métodos generales siguientes fueron utilizados para llevar a cabo los estudios más abajo descritos en los Ejemplos 3 a 7. En cada estudio, moléculas de ADN conteniendo secuencias híbridas de HBcAg recubrieron partículas de oro con el fin de proporcionar composiciones ejemplo conforme a la presente invención. Las partículas recubiertas fueron administradas a sujetos animales, y fue evaluada la habilidad de las composiciones de provocar respuestas Th específicas de antígeno, CTL y/o de anticuerpo.

Recubrimiento de las Partículas Portadoras Centrales: Los pesos adecuados de las partículas de oro fueron pesados directamente en tubos Eppendorf de 1,5 mL. Fueron añadidas a continuación 400-500 \muL de una espermidina de 0,05 M, y fueron separadas las agrupaciones de oro en la solución de oro/espermidina utilizando un sonicador por baño de agua de 3 a 5 segundos. Fue añadida a la solución de oro/espermidina la solución de ADN stock -conteniendo la molécula de ADN plásmido relevante-, para dar como resultado una proporción de carga por partícula de 2,0 \mug de ADN por mg de Au, y los tubos fueron tapados e invertidos para mezclar y, a continuación, sometidos brevemente a vórtex. Después de disminuir la velocidad del vórtex, y al mismo tiempo que se agitaba suavemente, fue añadido un volumen de CaCl_{2} al10% en forma de gotas en una cantidad igual al volumen de espermidina añadido al oro en seco. Una vez añadido el volumen total de CaCl_{2}, la solución resultante fue sometida a vórtex a alta velocidad durante alrededor de 5 segundos. A continuación, se permitió que la solución precipitara a temperatura ambiente durante, al menos, 10 minutos. Mientras tanto, se preparó una solución stock de polivinilpirrolidona (PVP)/etanol con una concentración de 0,03 mg de PVP/mL de EtOH. Después del precipitado de 10 minutos, los tubos fueron centrifugados brevemente (10-15 segundos) para peletear todo el oro. Los sobrenadantes fueron aspirados y los tubos fueron "rastrillados" a través de un rack Eppendorf para soltar las partículas de oro. Fueron añadidas 800 \muL de EtOH, y los tubos fueron invertidos varias veces para lavar el oro recubierto de ADN. Esta fase fue repetida dos veces, después de lo cual los tubos fueron centrifugados de nuevo y el sobrenadante aspirado. Las partículas de oro recubiertas de ADN lavadas fueron añadidas a continuación a la solución stock de PVP, y fueron añadidas 50 \mug de Quil A a la solución de PVP-partículas de oro recubiertas de ADN por medio de sonicación durante 3 segundos. Las partículas resultante, las cuales se encontraban recubiertas con la composición de vacuna de ADN + Quil A, fueron cargadas a continuación en piezas largas de entubado Tefzel™, conforme es descrito con anterioridad. Ver, por ejemplo, la solicitud de patente PCT, PCT/US95/00780 y las Patentes americanas núms. 5.733.600, 5.780.100, 5.865.796 y 5.584.807, cuyas exposiciones son incorporadas aquí como referencia.

Ensayos ELISPOT con Ratón: Los materiales y reactivos fueron los siguientes.

Recubrimiento de los anticuerpos, incluidos el de rata anti IFN-\gamma Ab de ratón, el de Rata anti IL-4 Ab de ratón, o el de Rata anti IL-5 Ab de ratón (Pharmigen); detección de los anticuerpos, incluido el biotinilado de Rata anti IFN-\gamma Ab de ratón, el biotinilado de Rata anti IL-4 Ab de ratón, o el biotinilado de Rata anti IL-5 Ab de ratón (Pharmigen); tampón carbonato filtrado estéril pH 9,6 (Pierce), placas ELISPOT de 96 pocillos (Millipore), solución salina tamponada con fosfato 1X estéril (PBS, Gibco), conjugado de streptavidina-fosfatasa alcalina (Mabtech), kit de sustrato de fosfatasa alcalina (BioRad), y medio de cultivo celular FCS al 10%-RPMI (Sigma). La estimulación celular fue llevada a cabo como sigue. Para determinar la liberación de citoquinas en células T de ayuda fueron cultivados esplenocitos procedentes de los animales vacunados en 6x10^{6} células/mL en RPMI-FCS 10% suplementado con piruvato sódico y aminoácidos no esenciales. Fue transfectado a cada pocillo de una placa de 24 pocillos un mL de células y, para cada sujeto, un pocillo=sólo medio (para control), y un pocillo=antígeno de elección o péptido clase II de elección. Las placas fueron incubadas a continuación en un incubador de cultivo tisular durante 3 días. Para determinar la liberación de IFN-\gamma por precursor CTL fueron cultivados los esplenocitos procedentes de los animales vacunados con una concentración de 6x10^{6} células/mL en RPMI-FCS 10% suplementado con piruvato sódico y aminoácidos no esenciales. Fue transfectado a cada pocillo de una placa de 24 pocillos un mL de células, y la placa fue incubada durante 2 días, después de lo cual fue añadido el péptido CTL a los pocillos con el péptido. Para cada sujeto, un pocillo=sólo medio, un pocillo=péptido CTL de elección en concentración de 10^{-5}M, y un pocillo=péptido CTL irrelevante. A continuación, las placas fueron incubadas durante 24 horas más después de la adición del péptido y con anterioridad a la colocación de las células en la placa ELISPOT.

El recubrimiento y bloqueo de las placas ELISPOT fue llevado a cabo como sigue. Las placas ELISPOT fueron recubiertas un día antes de colocar las células, utilizando 50 \muL por pocillo de 15 \mug/mL de anticuerpo recubridor en tampón carbonato estéril, pH 9,6. Las placas recubiertas fueron incubadas durante la noche a 4ºC, después de lo cual fueron lavadas seis veces con 100 \muL de PBS para eliminar el recubrimiento Ab no unido y, después, sometidas suavemente a blotting. Cada pocillo fue bloqueado utilizando 200 \muL de RPMI-FCS 10% de 1 a 2 horas en un incubador de cultivo tisular a temperatura ambiente. Todo el medio de bloqueo fue retirado inmediatamente antes de colocar las células en la placa. Las células fueron colocadas en la placa como sigue. Después de 3 días, las células y el sobrenadante fueron recogidos de cada pocillo y transfectados a un tubo cónico de 15 mL. Las células fueron hechas girar en un centrifugador para recolectar el sobrenadante, el cual fue almacenado a continuación a -80ºC hasta su utilización en análisis ELISA para detección de citoquinas. Las células peleteadas fueron resuspendidas en 2-5 mL de medio y, a continuación, llevadas hasta una concentración final de 1x10^{7}/mL. Las células fueron añadidas a los pocillos de ELISPOT en concentración de 1x10^{6}/pocillo.

Las placas ELISPOT fueron desarrolladas como sigue. Las células fueron rociadas y las placas lavadas dos veces con PBS utilizando una botella atomizadora. Los pocillos fueron lavados con agua deionizada (DI) (dejando el agua en los pocillos durante unos pocos minutos para lisar las células restantes), y las placas fueron lavadas dos veces más. El anticuerpo a detectar fue diluido hasta 1 \mug/mL en PBS estéril y, a continuación, añadido en cantidad de 50 \muL/pocillo e incubado durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas cinco veces con PBS, y 50 \muL del conjugado de streptavidina-fosfatasa alcalina (diluido 1:1000 en PBS) y las placas fueron incubadas a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, las placas fueron lavadas cinco veces con PBS, y fueron añadidas 50 \muL del substrato cromogénico de fosfatasa alcalina y se permitió que las placas incubaran a temperatura ambiente hasta que emergieron puntos negros (alrededor de 2 horas). La reacción de color fue parada al lavarla tres veces con 200 \muL de agua de grifo, se permitió que las placas se secaran al aire, y las manchas fueron contadas bajo un microscopio de disección (40x).

Ensayos de CTL pulsado con Péptido Murino: Los materiales y reactivos fueron los siguientes. Medio RPMI-10 (500 mL de RPMI 1640 con L-glutamina y Hepes, 55 mL de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 0,5 mL de gentamicina, 5,5 mL de solución antimicótica antibiótica); medio de sensitización ("SM") sin IL-2 (500 mL de RPMI-10, 5,0 mL de piruvato sódico 100 mM, 5,0 mL de aminoácidos no esenciales 100X); y SM con IL-2 (SM con una concentración final de 20 U/mL de IL-2 de rata recombinante); epítope peptídico CTL (péptido disuelto en cultivo tisular grado DMSO a concentración de almacenaje de 10^{-2}M); tampón de lisis ACK (Bio Whittaker); IL-2 de rata recombinante (Collaborative); Mitomicina CC (Aldrich disuelta en PBS estéril para obtener 500 \mug/mL de solución stock); 50 mL de tubos cónicos (Falcon), pieza de copa de tamiz de malla de nylon (Falcon); placas Cromo^{51} y Luma (Packard).

Para los estimuladores pulsados con péptido, son proporcionados esplenocitos singenéicos sin tratar (aprox. 1,2x10^{7} estimuladores/ratón) por medio de la recolección de bazos y molido al presionar entre dos diapositivas congeladas sometidas a autoclave, con el fin de romper el saco y liberar las células en un pequeño disco de petri. Los agrupamientos de células son separados por medio del pipeteado hacia arriba y hacia abajo de las células con una pipeta de transferencia de 3 mL, y la suspensión celular resultante es pasada a través de un tamiz celular de nylon de 70 \mum hasta un tubo cónico de 50 mL, utilizando de 5 a 10 mL de medio RPMI-10 para lavar las células que pasan. Los esplenocitos recuperados son hechos girar a 1500 rpm durante 5 minutos para formar pelets y el sobrenadante es descartado. Los RBCs fueron lisados por medio del resuspendido de los esplenocitos en 5 mL de tampón de lisis ACK de 1 a 2 minutos, después de lo cual las células fueron lavadas dos veces con 20 mL de RPMI no suplementado, y una vez con RPMI-10. A continuación, las células fueron resuspendidas en una cantidad aproximada de 1x10^{7} células/mL. Para el ensayo CTL del HbsAg, una línea celular P815 fue transformada con la secuencia del HbsAg y utilizada como células estimuladoras. Los estimuladores fueron tratados con mitomicina C (por cada 10 mL de células, fueron añadidas 500 \muL de 0,5 mg/mL de mitomicina C), y las células fueron incubadas con la mitomicina C de 25 a 45 minutos a 37ºC, CO_{2} 5%. Después del tratamiento, las células fueron lavadas dos veces con RPMI no suplementado y una vez con RPMI-10. Las células lavadas fueron resuspendidas en una concentración de 2x10^{6} células/mL en SM con 20 U/mL de IL-2 de rata, y fue añadido el epítope peptídico CTL almacenado. Las células estimuladoras fueron dispensadas en una proporción de 3/1 respondedor/estimulador en placas de 24 pocillos, e incubadas durante la noche a 37ºC, CO_{2} 5%.

La estimulación in vitro de células respondedoras fue llevada a cabo como sigue. Los esplenocitos fueron recogidos procedentes de ratones vacunados y de control, y los esplenocitos respondedores fueron aislados por medio del molido de los bazos, conforme es descrito más arriba. Los RBCs fueron lisados con 5 mL de tampón de lisis ACK de 2 a 3 minutos, y las células fueron lavadas dos veces con 20 mL de RPMI no suplementado y una vez con RPMI-10. A continuación, los esplenocitos fueron resuspendidos en una concentración de 6x10^{6} células/mL en SM sin IL-2. Fue dispensado para cada ratón 1 mL de los esplenocitos en cada pocillo de una placa de 24 pocillos conteniendo 1 mL de las 2x10^{6} células/mL de células estimuladoras pulsadas con péptido descritas más arriba en SM sin IL-2 (concentración final del IL-2 fue de 10U/mL), y las placas fueron incubadas a 37ºC, CO_{2} 5%, de 5 a 7 días.

Ensayo de Liberación de Cromo^{51} CTL: Para determinar la lisis específica peptídica fueron utilizadas las técnicas siguientes. Fueron colocadas en placas de 96 pocillos células diana singenéicas en fase log, en una cantidad aproximada de 30.000 dianas/pocillo. Fue peleteada una cantidad adecuada de células diana en tubos cónicos y resuspendida en 20 \muL de FBS inactivado por calor. Fueron añadidas de 100 a 200 \muL de Cr^{51} (cromato sódico) a cada pelet, mezcladas bien, a continuación incubadas durante 1 hora a 37ºC. Después, las células fueron lavadas cuatro veces con de 6 a 10 mL de RPMI-10 por pelet y, a continuación, resuspendidas hasta una concentración de 3x10^{5} células/mL en RPMI-10. Para dianas pulsadas con péptido, fue añadida una cantidad adecuada de epítope peptídico CTL almacenado para alcanzar una concentración peptídica final óptima (aproximadamente 10^{-5}M). Se permitió que las células diana pulsaran con los péptidos durante, al menos, 30 minutos (a 37ºC) con anterioridad a la colocación en placas con las células efectoras. Alternativamente, fue utilizada la línea celular p815/HbsAg como la diana.

Después de 5 a 7 días de estimulación in vitro, los esplenocitos efectores fueron recogidos de las placas de 24 pocillos, y las células procedentes de cada ratón fueron juntadas en tubos cónicos de 15 mL y, a continuación, resuspendidas hasta una concentración de 1,5x10^{7} células/mL. Para su colocación en placas, los esplenocitos procedentes de cada ratón fueron colocados en placas en proporciones de 50, 17, 5,6 y 1,9 efector/diana. Después de las diluciones, fueron añadidas a cada pocillo 100 \muL de las dianas marcadas con Cr^{51}. Las placas fueron hechas girar brevemente y, a continuación, incubadas de 4 a 6 horas a 37ºC. La lisis fue medida para cada ratón contra las dianas control tanto las pulsadas con péptido como las no pulsadas.

Para determinar la lisis no específica fue seguido el mismo protocolo, a excepción de que fueron colocadas también en placas 100 \muL de las dianas no pulsadas. Después de una incubación de 4 a 6 horas, las placas fueron hechas girar con el fin de peletear las células y fueron lisadas. A continuación, 40 \muL del sobrenadante fueron transferidas a placas de 96 pocillos, conteniendo cada pocillo 200 \muL de fluido de escintilación, y se permitió que las placas secaran durante 2 horas o durante la noche. Las placas fueron selladas y contadas utilizando un programa estándar para Cr^{51} líquido. Para calcular el porcentaje de lisis (test cpm-espont. cpm) fue dividido por (max. cpm-espont. cpm) y multiplicado por 100. Para obtener el porcentaje de lisis específica, el porcentaje de lisis de dianas no pulsadas fue restado del porcentaje de lisis de dianas pulsadas con péptido.

ELISA: La respuesta de anticuerpos a las distintas composiciones de vacuna fue determinada por medio de un procedimiento ELISA estándar. Más particularmente, placas de unión de alta afinidad (Costar) fueron recubiertas con 50 \muL/pocillo con una solución stock de antígeno de 8 \mug/mL (en PBS) e incubadas durante la noche a 4ºC. La solución de antígeno fue aspirada y las placas bloqueadas con BSA 2%/PBS durante, al menos, una hora a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas tres veces con tampón de lavado (PBS/Tween 20 0,025%), y fueron añadidas 50 \muL de suero muestra, e incubadas durante dos horas a temperatura ambiente (tampón de dilución: BSA 2%/PBS). Las placas fueron lavadas tres veces e incubadas con anticuerpos de cabra marcados conjugados, específicos para IgG inmunoglobulina de ratón o subclases específicas de IgG, durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados adicionales, las placas ELISA fueron incubadas con conjugados marcados durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, las placas fueron lavadas y desarrolladas con un substrato adecuado (HRP, fosfatasa alcalina, etc. kits de Bio-Rad, Richmond, CA) y se permitió su desarrollo durante 30 minutos. Las reacciones fueron paradas con 1N de H_{2}SO_{4} o 0,4 M de NaOH, y las placas leídas a A_{450} o A_{405}, dependiendo del marcador utilizado. La absorbancia de fondo media fue determinada por medio de pocillos que recibieron todos los reactivos, a excepción del suero del test. Los títulos punto final fueron determinados como la dilución más alta resultante en una lectura de absorbancia del 50% sobre la absorbancia de fondo.

Ejemplo 3 Inducción del CTL específico del antígeno de superficie de la Hepatitis B (HbsAg) utilizando una Vacuna Híbrida de ADN de Epítope de Célula T/HBcAg

El vector de expresión pWRG7086 fue construido al insertar un epítope CTL mínimo restringido de clase I de H2-d de ratón para el antígeno de superficie de la hepatitis B (IPQSLDSWWTSL, Luca et al. Proc. Natl. Acad. Scie. USA 91:3764-68) dentro de la región lazo ICE del HBcAg. El epítope fusión HBcAg/CTL fue insertado dentro de un casete de expresión conteniendo el promotor temprano CMV y la región Intrón A. Partículas de oro fueron recubiertas con el vector, conforme es descrito más arriba.

5 ratones recibieron 2 inmunizaciones de ADN (por medio de un dispositivo de pistola génica PowderJect XR), consistiendo cada inmunización en 0,5 \mug de pWRG7086 o de pWRG7031 (control positivo) o ADN control, espaciadas cada 4 semanas.

Los esplenocitos fueron recolectados 6 meses después de la segunda inmunización, utilizando una línea celular P815 para reestimular in vitro y se evaluó la actividad citolítica utilizando el ensayo de liberación de Cr^{51} estándar describo más arriba. Los resultados son indicados en la Tabla 2 más abajo. Como puede ser observado, las respuestas de células T específicas del epítope fueron inducidas en la estrategia de inmunización.

TABLA 2

Grupo	Nº de ratón	Porcentaje promedio de lisis específica (50:1)
WRG7086	2	33
WRG7031 (HBsAg de longitud total,
control positivo)	2	61
Control negativo	1	7

Ejemplo 4 Inducción de Respuesta de Anticuerpo específico del HIV utilizando una Vacuna Híbrida de ADN de HBcAg/Antígeno

Fue construido el vector de expresión pWRG7094 al insertar secuencias inmunodominantes del lazo hipervariable V3 (RRITSGPGKVLYTTGEII) procedentes del gen de envoltura del HIV_{SF33} dentro de la región ICE del HBcAg. El epítope fusión de célula B HBcAg/HIV_{SF33} fue insertado en un casete de expresión conteniendo el promotor temprano CMV y la región Intrón A. Partículas de oro fueron recubiertas con el vector, conforme es descrito más arriba.

4 ratones recibieron 3 inmunizaciones de ADN (por medio de un dispositivo de pistola génica PowderJect XR), consistiendo cada inmunización en 0,5 \mug de pWRG7094, espaciadas de 2 a 4 semanas. Los ratones fueron sangrados 2 semanas después de cada inmunización. Fueron evaluadas las respuestas suero anti-HIVgp120_{SF33,} utilizando HIVgp120_{SF33} recombinante (Chiron Corp., Emeryville, CA) como antígeno de captura en un ELISA estándar (ver apéndice II). Las respuestas suero anti-HIVgp120_{SF33} (título de punto final recíproco) después de la inmunización con pWRG7094 son indicadas más abajo en la Tabla 3. Como puede ser observado, fue inducida una respuesta de antígeno-anticuerpo específico utilizando las moléculas híbridas de HBcAg/epítope de la presente invención.

TABLA 3

Nº Ratón	Después de la Inmunización	Después de 1ª reinmunización	Después de 2ª reinmunización
1	300	20.000	70.000
2	0	5.000	250.000
3	300	20.000	32.000
4	1000	70.000	128.000

Ejemplo 5 Inducción de Respuesta de Anticuerpo específico de Malaria utilizando una Vacuna Híbrida de ADN de HBcAg/Antígeno

Fue construido el vector de expresión pWRG7108 al insertar 2 copias en tándem del epítope de célula B inmunodominante procedente del gen circumsporozoite (CS) del Plasmodium berghei (DPPPPNPNDPPPPNPN) dentro de la región ICE del HBcAg. El epítope fusión del HBcAg/berghei fue insertado en un casete de expresión conteniendo el promotor temprano CMV y la región Intrón A. Partículas de oro fueron recubiertas con el vector, conforme es descrito más arriba.

4 ratones recibieron 3 inmunizaciones de ADN (por medio de un dispositivo de pistola génica PowderJect XR), consistiendo cada inmunización en 0,5 \mug de pWRG7110, espaciadas de 2 a 4 semanas. Los ratones fueron sangrados 2 semanas después de cada inmunización. Fueron evaluadas las respuestas suero anti-P. bergei utilizando esporozitos purificados de P. verghei (1000/pocillo) como antígeno de captura en el ELISA estándar (descrito más arriba).

Las respuestas de anticuerpos en estos ratones fueron comparadas con las respuestas de anticuerpos inducidas en ratones inmunizados con ADN expresando el gen CS del P. berghei en su longitud total (pWEG6518).

Los resultados son indicadas más abajo en la Tabla 4. Como puede ser observado, los constructos híbridos de HBcAg/Antígeno de la presente invención inducen respuestas de títulos más elevados de anticuerpos que las conseguidas con inmunización con ADN codificando el epítope en su contexto natural dentro del gen de P. berghei de longitud total.

TABLA 4 Títulos punto final recíprocos anti-PbCS

Ratón	ADN	Después de	Después de 1ª	Después de 2ª
		inmunización	reinmunización	reinmunización
n=7	CMV-Pb-CS
	(pWRG6518)	<10	<10	10-400
13	Epítope HBcAg-CS
	(pWRG7108)	3.600	13.000	40.000
14	''	900	80.000	160.000
15	''	1.800	80.000	160.000
16	''	1.800	26.000	40.000

Ejemplo 6 Inducción de la Respuesta Anticuerpo Neutralizante Específico de FMDV utilizando una Vacuna de ADN Híbrida de HBcAg/Antígeno

Fueron construidos dos vectores de expresión. El vector de expresión pWRG7159 fue construido insertando una copia única del epítope neutralizante (GSGVRGDFGSLAPRVARQLP) procedente del gen de envoltura del virus del síndrome pie-mano-boca (FMDV) dentro de cada una de las regiones ICE y carboxi del HBcAg. El vector pWRG7165 contiene una única copia del epítope neutralizante insertada en la región ICE del HBcAg. Diferentes grupos de partículas de oro fueron recubiertos con estos vectores, conforme es descrito más arriba.

8 ratones recibieron 3 inmunizaciones de ADN (por medio de un dispositivo de pistola génica PowderJect XR), consistiendo cada inmunización en 0,5 \mug de ADN de pWRG7159 o de pWRG7165, en donde las inmunizaciones fueron espaciadas de 2 a 4 semanas. Los ratones fueron sangrados 2 semanas después de cada inmunización y fue evaluado el suero para determinar el anticuerpo específico para el FMDV por medio de ELISA, utilizando péptido representando al IDR como antígeno de captura. Los anticuerpos del suero fueron analizados también para determinar la habilidad de neutralización del FMDV en un ensayo de neutralización de virus (F. Brown, Plusm Island Institute).

Los resultados son indicadas más abajo en la Tabla 5. Como puede ser observado, los constructos de ADN híbridos de la presente invención pueden inducir una respuesta de anticuerpo neutralizante contra el antígeno de interés.

TABLA 5

Ratón	ADN	Título ELISA	Título ELISA	Título ELISA	Log del Título neutralizante del virus
		después de	después de 1ª	después de 2ª	por medio de suero diluido 1/100*
		inmunización	reinmunización	reinmunización	(después de 2ª reinmunización)
5	7159	8800	52000	41000	1,5
6	7159	12000	59000	94000	3,0-3,5
7	7159	5000	44000	49000	0
8	7159	5000	62000	83000	3,5
8	7165	24000	83000	90000	3,0
10	7165	13000	42000	44000	3,0
11	7165	14000	15000	12000	1,5
12	7165	15000	36000	37000	0,5-1,0
* Un log de título neutralizante de virus de 3,0 a 3,5 es considerado un título muy bueno.

Ejemplo 7 Estudio de Inmunización utilizando una Vacuna Híbrida de ADN HBcAg/Antígeno

Es llevado a cabo el siguiente estudio con el fin de demostrar la superioridad de la inmunización por ADN utilizando las moléculas híbridas de HBcAg de la presente invención. Este estudio establecerá que la administración de ADN codificando HBcAg/epítope de fusión proporcionará una ventaja sobre las metodologías existentes. Específicamente, la inmunización por ADN de HBcAg/epítope: (1) mejorará la inmunogenicidad de los epítopes de inmunización con base de ADN; y (2) proporcionará la expresión del producto de fusión en las células huésped en su conformación natural y, además, a través de la expresión intracelular, proporcionará acceso tanto a la ruta de clase I como a la de clase II para inducción superior de las respuestas inmunes CD8+ y CD4+.

Las siguientes vacunas conteniendo el Epítope CTL mínimo restringido de clase I de H2-d (RGPGRAFVTI, Takeshita T., et al. (1995) J. Immunol. 154:1973-86) del HIV_{LAI} gp120, son construidas y comparadas para la inducción de respuestas CTL específicas del epítope en ratones.

(a) - Epítope CTL del HIV gp120, codificado en el plásmido convencional: CMV-intrón A-RGPGRAFVTI (R>I)-pal.

(b) - Epítope CTL del HIV gp120, codificado como una fusión con HBcAg: CMV-intrón A-HBcAg/ R>I-pal.

(c) - Epítope CTL del HIV gp120, codificado como una fusión con HBcAg, expresado en células de mamífero, y purificado como proteína recombinante (rHBcAg/R>I).

(d) -Gen entero del HIV gp120, expresado en el plásmido convencional CMV-intrón A-HIV gp120-pal.

Preparación de la vacuna

Los vectores de expresión para los grupos (a) y (b) son construidos conforme a los métodos previamente establecidos. El vector de expresión de (a) es expresado en una línea celular Balb/C o en levadura, y es purificado conforme es descrito previamente. El vector de expresión para el grupo (d) ha sido construido (Fuller et al. (1994) AIDS Res. and Hum. Retroviruses).

Inmunizaciones

Los ratones son inmunizados, al menos, dos veces con 0,5 \mug de ADN sobre partículas de oro de 0,5 mg, por medio del dispositivo de pistola génica PowderJect XR, o inyectados con dos dosis de 1a 5 \mug de proteína HBcAg/R>I en PBS por dosis, espaciadas 4 semanas.

Ensayos

Los esplenocitos y la sangre fueron recogidos procedentes de dos grupos de ratones dos semanas después de la primera o segunda inmunización. La frecuencia de respuestas de célula T CD8+ es comparada por medio de análisis ELISPOT (ver más arriba) y por medio de ensayo de liberación de Cr^{51} (ver más arriba).

Las respuestas de anticuerpos al HBcAg y al HIV gp120 son medidas con el fin de confirmar el éxito de la inmunización.

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Por consiguiente, han sido descritas nuevas moléculas de ácido nucleico recombinantes, composiciones comprendiendo aquéllas moléculas, y técnicas de inmunización por ácido nucleico. Aunque las realizaciones preferidas de la presente invención han sido descritas con cierto detalle, se entiende que pueden ser realizadas variaciones obvias sin que se aparten del ámbito de la invención, conforme es definida en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (33)

1. La utilización de un vector de expresión, el cual comprende una secuencia promotora y, ligada operativamente al mismo, una secuencia de ácido nucleico recombinante, comprendiendo:

una primera secuencia de ácido nucleico codificando un antígeno central del virus de la Hepatitis B, la cual incluye una región de epítope central inmunodominante primario (ICE), o de la cual toda la región ICE, o parte de ella, ha sido eliminada; y

una segunda secuencia de ácido nucleico heteróloga codificando un epítope de célula de linfocito T citolítico (CTL) procedente de un antígeno de interés, en donde dicha segunda secuencia de ácido nucleico es insertada dentro de la región ICE de la primera secuencia de ácido nucleico o reemplaza la región ICE, o parte de la misma, de la primera secuencia de ácido nucleico que ha sido eliminada, en donde dicha utilización lo es para la fabricación de un medicamento para su uso en la inmunización por ácido nucleico de un sujeto.

2. La utilización, conforme a la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico recombinante comprende adicionalmente una tercera secuencia de ácido nucleico, la cual se encuentra en una posición 5' aguas arriba en relación a las secuencias primera y segunda, y la cual codifica una secuencia peptídica líder que proporciona la secreción en una célula de mamífero del polipéptido codificado por las secuencias primera y segunda.

3. La utilización, conforme a las reivindicaciones 1 o 2, en donde el antígeno de interés es un antígeno de un patógeno viral, bacteriano, parasitario o fúngico.

4. La utilización, conforme a las reivindicaciones 1 o 2, en donde la segunda secuencia de ácido nucleico consiste, esencialmente, en nucleótidos que codifican el linfocito T citolítico (CTL).

5. La utilización, conforme a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la primera secuencia de ácido nucleico codifica un antígeno central del virus de la Hepatitis B, del cual ha sido eliminada la región C-terminal rica en arginina.

6. La utilización, conforme a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia de ácido nucleico recombinante es una secuencia de ADN.

7. La utilización, conforme a cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el vector de expresión recubre partículas portadoras.

8. La utilización, conforme a la reivindicación 7, en donde las partículas portadoras lo son para el suministro al sujeto por medio de un dispositivo acelerador de partículas.

9. La utilización, conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8, en donde el sujeto es humano.

10. Partículas recubiertas adecuadas para su utilización en la inmunización por ácido nucleico mediado por partículas, cuyas partículas comprenden partículas portadoras recubiertas con un vector de expresión, conforme es definido en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 6.

11. Un dispositivo de aceleración de partículas adecuado para la inmunización por ácido nucleico mediada por partículas, siendo cargado dicho dispositivo con partículas recubiertas conforme es definido en la reivindicación 10.

12. Un vector de expresión, el cual comprende una secuencia promotora y, ligado operativamente a la misma, una secuencia de ácido nucleico recombinante para su utilización en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal por medio de terapia, en donde la secuencia de ácido nucleico recombinante comprende:

una primera secuencia de ácido nucleico codificando un antígeno central del virus de la Hepatitis B, la cual incluye una región de epítope central inmunodominante primario (ICE), o de la cual toda la región ICE, o parte de ella, ha sido eliminada; y

una segunda secuencia de ácido nucleico heteróloga codificando el epítope CTL procedente de un antígeno de interés, en donde dicha segunda secuencia de ácido nucleico es insertada dentro de la región ICE de la primera secuencia de ácido nucleico que ha sido eliminada.

13. Un vector de expresión, conforme a la reivindicación 12, para su utilización en la inmunización por ácido nucleico.

14. Un vector de expresión, conforme a la reivindicación 12 o 13, comprendiendo adicionalmente una tercera secuencia de ácido nucleico, la cual se encuentra en una posición 5' aguas arriba en relación a las secuencias primera y segunda, y la cual codifica una secuencia líder peptídica que proporciona la secreción en una célula de mamífero del polipéptido codificado por las secuencias primera y segunda.

15. Un vector de expresión, conforme a cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde el antígeno de interés es un antígeno de un patógeno viral, bacteriano, parasitario o fúngico.

16. Un vector de expresión, conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 12 a la 15, en donde la segunda secuencia de ácido nucleico consiste, esencialmente, en nucleótidos que codifican el epítope de célula T.

17. Un vector de expresión, conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 12 a la 16, en donde la primera secuencia de ácido nucleico codifica un antígeno central del virus de la Hepatitis B, del cual ha sido eliminada la región C-terminal rica en arginina.

18. Un vector de expresión, conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 12 a la 17, en donde la secuencia de ácido nucleico recombinante es una secuencia de ADN.

19. Un vector de expresión, el cual comprende una secuencia promotora y, ligada operativamente a la misma, una secuencia de ácido nucleico recombinante comprendiendo:

una primera secuencia de ácido nucleico codificando un antígeno central del virus de la Hepatitis B, la cual incluye una región de epítope central inmunodominante primario (ICE), o de la cual toda la región ICE, o parte de ella, ha sido eliminada; y

una segunda secuencia de ácido nucleico heteróloga codificando un epítope de linfocito T citolítico (CTL) procedente de un antígeno de interés, en donde dicha segunda secuencia de ácido nucleico es insertada dentro de la región ICE de la primera secuencia de ácido nucleico, o reemplaza la región ICE, o parte de la misma, de la primera secuencia de ácido nucleico que ha sido eliminada.

20. Un vector de expresión, conforme a la reivindicación 19, comprendiendo adicionalmente una tercera secuencia de ácido nucleico, la cual se encuentra en una posición 5' aguas arriba en relación a las secuencias primera y segunda, y la cual codifica una secuencia líder peptídica que proporciona la secreción en una célula de mamífero del polipéptido codificado por las secuencias primera y segunda.

21. Un vector de expresión, conforme a la reivindicación 19 o 20, en donde el antígeno de interés es un antígeno de un patógeno viral, bacteriano, parasitario o fúngico.

22. Un vector de expresión, conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 21, en donde la segunda secuencia de ácido nucleico consiste, esencialmente, en nucleótidos que codifican el epítope de linfocito T citolítico (CTL).

23. Un vector de expresión, conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 19 a la 22, en donde la secuencia de ácido nucleico recombinante es una secuencia de ADN.

24. Una molécula de ácido nucleico recombinante comprendiendo:

una primera secuencia de ácido nucleico codificando un antígeno central del virus de la Hepatitis B, la cual incluye una región de epítope central inmunodominante primario (ICE), o de la cual toda la región ICE, o parte de ella, ha sido eliminada; y

una segunda secuencia de ácido nucleico heteróloga codificando un epítope de linfocito T citolítico (CTL) procedente de un antígeno de interés, en donde dicha segunda secuencia de ácido nucleico es insertada dentro de la región ICE de la primera secuencia de ácido nucleico, o reemplaza la región ICE, o parte de la misma, de la primera secuencia de ácido nucleico que ha sido eliminada.

25. Una molécula de ácido nucleico recombinante, conforme a la reivindicación 24, comprendiendo adicionalmente una tercera secuencia de ácido nucleico, la cual se encuentra en una posición 5' aguas arriba en relación a las secuencias primera y segunda, y la cual codifica una secuencia líder peptídica que proporciona la secreción en una célula de mamífero del polipéptido codificado por las secuencias primera y segunda.

26. Una molécula de ácido nucleico recombinante, conforme a la reivindicación 24 o 25, en donde el antígeno de interés es un antígeno de un patógeno viral, bacteriano, parasitario o fúngico.

27. Una molécula de ácido nucleico recombinante, conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 24 a la 26, en donde la segunda secuencia de ácido nucleico consiste, esencialmente, en nucleótidos que codifican el epítope de linfocito T citolítico (CTL).

28. Una molécula de ácido nucleico recombinante, conforme a cualquiera de las reivindicaciones de la 24 a la 27, la cual es una molécula de ADN.

\newpage

29. La utilización de una célula que ha sido transfectada con un vector de expresión, conforme es definido en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, para la fabricación de un medicamento para la inmunización de un sujeto.

30. Un producto conteniendo

(a)

un vector de expresión, conforme es definido en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, y

(b)

(i) un ácido nucleico, el cual codifica el epítope CTL codificado por el segundo ácido nucleico heterólogo del vector de expresión, o

(ii) un péptido o proteína, el cual comprende el epítope CTL codificado por el segundo ácido nucleico heterólogo del vector de expresión,

para su utilización simultánea, por separado o secuencial, en la inmunización de un sujeto.

31. Un producto conteniendo

(a)

una célula que ha sido transfectada con un vector de expresión, conforme es definido en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, y

(b)

(i) un ácido nucleico, el cual codifica el epítope CTL codificado por el segundo ácido nucleico heterólogo del vector de expresión, o

(ii) un péptido o proteína, el cual comprende el epítope CTL codificado por el segundo ácido nucleico heterólogo del vector de expresión,

para su utilización simultánea, por separado o secuencial, en la inmunización de un sujeto.

32. Un producto, conforme a la reivindicación 30 o 31, en donde dicho ácido nucleico se encuentra en la forma de un vector viral recombinante.

33. Un producto, conforme a la reivindicación 32, en donde el vector viral recombinante es un vector de virus vaccinia.