ES2257082T3 - Nuevas secuencias de aminoacidos, adn que codifica las secuencias de aminoacidos, anticuerpos dirigidos contra tales secuencias y los diferentes usos de ello. - Google Patents
Nuevas secuencias de aminoacidos, adn que codifica las secuencias de aminoacidos, anticuerpos dirigidos contra tales secuencias y los diferentes usos de ello.Info
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Abstract
Un péptido de epitopos de células B, que comprende la secuencia de aminoácidos indicada mediante la SEQ ID Nº 1.
Description
Nuevas secuencias de aminoácidos, ADN que
codifica las secuencias de aminoácidos, anticuerpos dirigidos
contra tales secuencias y los diferentes usos de ello.
La presente invención se refiere a diversos
péptidos, homólogos a las regiones de la proteína de choque por
calor (HSP), a secuencias de ADN que codifican dichos péptidos, a
constructos de ADN que comprenden las secuencias de ADN, y a
anticuerpos dirigidos contra los péptidos de la invención. La
invención se refiere también a vacunas activas que comprenden un
péptido, una secuencia de ADN o un constructo de ADN de la
invención, y a una composición de inmunización pasiva que comprende
un anticuerpo de la invención.
En toda esta solicitud, diversas publicaciones
son referidas con números cardinales entre paréntesis. Estas
publicaciones son incorporadas a la presente memoria descriptiva en
su totalidad y constituyen parte de la descripción.
La artritis adyuvante (AA) es un modelo
experimental de artritis autoinmune que puede ser inducida en cepas
de ratas susceptibles como cepas Lewis o Wistar endocriadas tras
vacunación con Mycobacterium tuberculosis (MT) inactivada
con calor en adyuvante completo de Freund (CFA)
[1-3]. La enfermedad no puede ser inducida en cepas
resistentes de ratas (por ejemplo, Brown-Norway;
Fisher [5, 6] y las ratas Lewis desarrollan resistencia a la
reinducción de la enfermedad después de recuperarse de la
artritis).
Los inventores han mostrado previamente que la
resistencia a AA puede ser transferida a una cepa susceptible de
ratas mediante infusión intravenosa de inmunoglogulinas a partir de
las cepas resistentes, y que la resistencia está asociada con la
presencia de anticuerpos contra la proteína de choque por calor MT
de 65 kD. (HSP 65) [4].
Las proteínas de choque por calor son una familia
de proteínas altamente conservadas. Hay \sim50% de identidad de
aminoácidos entre la HSP 65 micobacteriana y la HSP 60 de mamífero
[21]. La función de la proteína de choque por calor de 65 kD (HSP
65) de MT en la patogénesis de la artritis autoinmune, tanto en
animales experimentales [7, 8] como en seres humanos
[9-11], ha sido investigada intensivamente en el
pasado durante varios años. Por ejemplo, Barker et al. [32]
describen la supresión de las respuestas inmunes artritogénicas en
ratones a los que proporcionó HSP65 y pristano. El antígeno usado
para provocar la respuesta fue HSP65 de longitud completa, y no se
hizo ningún intento de investigar el efecto de subdominios
específicos o péptidos que deriven de esta proteína.
La AA puede ser transferida pasivamente mediante
un reactivo de clones de células T a los residuos
180-188 de la MT HSP 65, y en pacientes que padecen
de artritis reumatoide (RA), ha sido encontrada una asociación
entre respuestas de células T a HSP 65 y etapas tempranas de
inflamación de articulaciones [7, 12-14].
Paradójicamente, la pre-inmunización con la HSP 65
micobacteriana conduce a una resistencia a la inducción de la
enfermedad por MT, y este efecto protector se cree que está mediado
por células T específicas para HSP 65 [7, 15-16].
Análogamente, aunque las ratas artríticas desarrollan respuestas
vigorosas de células T a auto-HSP y a los péptidos
180-188 de la MT HSP, ninguna de éstas es
artritogénica cuando es inyectada a ratas susceptibles a artritis
[15, 17]. Estos resultados y otros sugieren que la HSP puede
contener epitopos que están relacionados con la enfermedad y otros
epitopos que confieran resistencia [5, 19, 20]. Tanto la respuesta
inmune patogénica como el efecto protector fueron atribuidos a
células T anti-HSP. Los siguientes Ejemplos
ilustran la especifidad de epitopos finos de los anticuerpos
anti-HSP de ratas susceptibles y resistentes a
artritis.
Además, los inventores han encontrado que las
ratas Lewis desprovistas de sistema inmune carecen de anticuerpos
para ciertos epitopos de la HSP 65 micobacteriana que se encuentran
de forma natural en ratas BN jóvenes y Lewis desprovistas de
sistema inmune viejas, y que los adquiridos por ratas Lewis jóvenes
después de recuperarse de la enfermedad. Un análisis de la
estructura primaria y terciaria de la molécula completa de 65 kD de
MT HSP indicó que estos epitopos "protectores" son epitopos
potenciales de células B con secuencias de aminoácidos no
conservadas que se encuentran en la superficie externa de la
molécula.
La pre-inmunización de ratas
Lewis con uno de los epitopos "protectores" antes de la
inducción de la enfermedad indujo anticuerpos contra la molécula
completa así como resistencia a la inducción de la enfermedad. Este
péptido se corresponde también con el epitopo
auto-HSP 60 con el que los anticuerpos fueron
encontrados en las ratas resistentes a la artritis, pero no en las
ratas Lewis desprovistas de sistema inmune susceptibles a la
artritis.
La presente invención se refiere a un péptido de
epitopos de células B que comprende la secuencia de aminoácidos
sustancialmente como se indica mediante la SEQ ID Nº 1 y sus
homólogos y derivados biológicamente funcionales.
Más particularmente, la invención se refiere a un
péptido de epitopos de células B que tiene la secuencia de
aminoácidos sustancialmente como se indica mediante la SEQ ID Nº 2
y sus homólogos y derivados biológicamente funcionales y a un
péptido de epitopos de células B que tiene la secuencia de
aminoácidos sustancialmente como se indica mediante la SEQ ID Nº 3
y sus homólogos y derivados biológicamente funcionales.
Además, la invención se refiere a un péptido de
epitopos de células B que comprende la secuenciado de aminoácidos
sustancialmente como se indica mediante la SEQ ID Nº 4 y sus
homólogos y derivados biológicamente funcionales.
Los péptidos de epitopos de células B de la
invención pueden ser péptidos sintéticos y péptidos químicamente
modificados.
Los péptidos de epitopos de células B de la
invención son capaces de conferir inmunidad contra trastornos
autoinmunes y/o inflamatorios.
En un aspecto adicional, la invención se refiere
a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una péptido de
epitopos de células B de la invención y a constructos de ADN que
comprenden el mismo.
Todavía, en un aspecto adicional, la invención se
refiere a vacunas que comprende como ingrediente activo una
cantidad eficaz de vacunación de al menos un péptido de epitopos de
células B de la invención, o un ácido nucleico según la invención.
Las vacunas de la invención son particularmente útiles para
conferir inmunidad contra trastornos autoinmunes o
inflamatorios.
Todavía adicionalmente, la invención se refiere a
anticuerpos dirigidos contra péptidos de epitopos de células B de
la invención y las composiciones que los comprenden. Las
composiciones de la invención son particularmente útiles para la
vacunación pasiva contra trastornos autoinmunes o inflamatorios.
Figura
1
Mycobacterium Tuberculosis, HSP 60 de
rata y HSP 60 humana (secuencias P06806, P19227 y P10809,
correspondientes a SEQ ID Nº 6, 7 y 8, respectivamente) se
compararon con el programa de apilamiento de
GCG-Wisconsin Package v9.0. Las regiones
conservadas están indicadas (consenso). Los residuos en negrita y
subrayados representan los péptidos preferidos.
Figura
2
El anillo heptámero de GroES es mostrado en gris
oscuro. Los dos anillos heptámeros de GroEL son mostrados en gris
claro. Los péptidos 6-7 (aminoácidos
31-52) y 31 (aminoácidos 181-197)
también están indicados.
Figuras
3a-3b
La ubicación de los péptidos 6, 7 y 31 en el
monómero de HSP 65 está indicada en una configuración de estructura
secundaria (Fig. 3a) y en el modo de relleno espacial (Fig.
3b).
Figura
4
Se muestra la vacunación contra AA con péptidos
6, 7 y R5 de HSP. Se empleó PBS (solución salina tamponada con
fosfato) como testigo.
Figura
5
Se muestra el resto común
V-E-WG-P en los
péptidos 6, 7 y R5.
Figura
6
Se muestra el mapa de restricción del plásmido
pTARGET.
La presente invención se refiere a péptidos de
epitopos de células B que comprenden la secuencia de aminoácidos
sustancialmente como se indica en la SEQ ID Nº 1, y sus homólogos y
derivados biológicamente funcionales.
Preferentemente, el péptido de epitopos de
células B según la primera realización de la invención tiene la
secuencia de aminoácidos sustancialmente como se indica mediante la
SEQ ID Nº 2 o la secuencia de aminoácidos sustancialmente como se
indica mediante la SEQ ID Nº 3.
La invención se refiere adicionalmente a un
péptido de epitopos de células B que comprende la secuencia de
aminoácidos sustancialmente como se indica mediante la SEQ ID Nº 4
y sus homólogos y derivados biológicamente funcionales.
La invención se refiere también a una secuencia
de ácidos nucleicos que codifica un péptido de epitopos de células
B según la invención.
Más particularmente, la invención se refiere a
una secuencia de ADN que comprende la secuencia de ácidos nucleicos
sustancialmente como se indica mediante la SEQ ID Nº 5, y sus
derivados biológicamente funcionales. Esta secuencia de ácidos
nucleicos codifica un péptido de epitopos de células B que tiene la
secuencia sustancialmente como se indica mediante la SEQ ID Nº
4.
Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos
se presentan en la Tabla 1.
| SEQ ID Nº | PÉPTIDO Nº | Secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos |
| 1 | GPKGRNVVLEKKWGAPTITNDG | |
| 2 | 6 | GPKGRNVVLEKKWGAP |
| 3 | 7 | VVLEKKWGAPTITNDG |
| 4 | R5 | TVIIEQSWGSPKVTKDGVTV |
| 5 | GCCGCCATGGGACCAAAGGGACGCAACGTGG | |
| TACTAGAGAAGAAATGGGGCGCGCCGTAGCT | ||
| CGAGA |
Mediante la expresión "homólogos y derivados
biológicamente funcionales" se quieren indicar cualesquiera
variaciones, incluyendo deleción, sustitución y/o inserción de un
residuo de aminoácido en las secuencias de aminoácidos o un ácido
nucleico en las secuencias de ácidos nucleicos de la invención que
no alterarían la actividad biológica de los péptidos, o péptidos
codificados por las secuencias de ácidos nucleicos, contra
enfermedades autoinmunes. Por tanto, esta expresión debe ser
adoptada para indicar péptidos con estructura similar, péptidos o
sus derivados que son reconocidos por los anticuerpos protectores
y/o péptidos o sus derivados que pueden inducir anticuerpos
protectores tras inmunización.
La invención se refiere adicionalmente a
constructos de ADN que comprenden la secuencia de ácidos nucleicos
de la invención o sus homólogos y derivados funcionales. Los
constructos de la invención pueden comprender además elementos
adicionales tales como promotores, elementos reguladores y de
control, señales de traducción, expresión y otras, funcionalmente
asociadas a la secuencia de ácidos nucleicos de la invención.
La invención se refiere también a una vacuna que
comprende como ingrediente activo una cantidad de vacunación eficaz
de al menos un péptido de epitopos de células B de la invención.
Las vacunas de la invención están particularmente destinadas a
conferir inmunidad contra enfermedades inflamatorias y autoinmunes,
por ejemplo, artritis reumatoide o artritis adyuvante.
Mediante la expresión "cantidad de vacunación
eficaz" se quiere indicar una cantidad suficiente para estimular
el sistema inmune, directa o indirectamente, y conferir inmunidad
contra enfermedades inflamatorias y autoinmunes. Dicha cantidad
eficaz está determinada por la gravedad de la enfermedad, la edad,
sexo y peso del paciente, así como el estado general del paciente,
y por otras consideraciones conocidas por el facultativo encargado.
Las dosis preferidas, por inyección, pueden ser
0,02-2 mg/kg de peso corporal.
Las vacunas de la presente invención pueden
comprender alternativamente como el ingrediente activo al menos una
secuencia de ácidos nucleicos según la invención.
Las vacunas según la invención pueden comprender
además opcionalmente vehículos farmacéuticamente aceptables,
aditivos diluyentes, excipientes y adyuvantes. Mediante las
expresiones "vehículos farmacéuticamente aceptables, aditivos
diluentes, excipientes y adyuvantes" se quiere indicar cualquier
material inerte no tóxico que pueda ayudar al suministro eficaz del
ingrediente activo.
La expresión "anticuerpo", como se usa en
relación con la presente invención, se refiere a anticuerpos tanto
policlonales como monoclonales. Los anticuerpos policlonales pueden
ser generados en conejos, pollos, ratones, ratas, ovejas o
mamíferos similares. La generación de anticuerpos policlonales
contra péptidos es descrita en los anteriormente indicados
"Current Protocols in Immunology", Wiley and Sons Inc.
capítulo 9.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser
preparados a partir de células B tomadas del bazo o nódulos
linfáticos de animales inmunizados, en particular de ratas o
ratones, mediante fusión con células B inmortalizadas bajo
condiciones que favorezcan el crecimiento de células híbridas. Para
fusión de células B de murina, es preferida la línea celular
Ag-8.
Ag-8.
La técnica para generar anticuerpos monoclonales
es descrita en muchos artículos y libros de texto, tales como el
anteriormente indicado capítulo 2 de "Current Protocols in
Immunology". El capítulo 9 del mismo describe la inmunización de
animales de laboratorio con péptidos. Las células de bazo o nódulos
linfáticos de estos animales pueden ser usadas de la misma forma
que las células de bazo o nódulos linfáticos de animales
inmunizados con proteínas, para la generación de anticuerpos
monoclonales como se describe en el capítulo 2 de esta
publicación.
La expresión "anticuerpo" está destinada
también a incluir tanto moléculas intactas como sus fragmentos
como, por ejemplo, Fab y F(ab')2, que son capaces de unir
antígenos. Los fragmentos de Fab y F(ab')2 carecen del
fragmento Fc del anticuerpo intacto, desaparecen más rápidamente de
la circulación y pueden tener menos unión no específica a tejidos
que un anticuerpo intacto.
Un anticuerpo se dice que está "dirigido
contra" una molécula si es capaz de reaccionar específicamente
con la molécula y unir así la molécula al anticuerpo. La expresión
"epitopo" está destinada a hacer referencia a aquella parte de
cualquier molécula capaz de ser unida por un anticuerpo que puede
ser también reconocido por aquel anticuerpo. Los epitopos o
"determinantes antígenos" consisten habitualmente en
agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales
como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y tienen
características estructurales tridimensionales específicas así como
características específicas de carga.
Una "antígeno" es una molécula o parte de
una molécula capaz de ser unida por un anticuerpo que es
adicionalmente capaz de inducir que un animal produzca un
anticuerpo capaz de unirse a un epitopo de ese antígeno. Un antígeno
puede tener uno o más de un epitopo. La reacción específica
referida anteriormente está previsto que indique que el antígeno
reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su
correspondiente anticuerpo y no con la multitud de otros
anticuerpos que pueden ser evocados por otros antígenos.
Los anticuerpos de la invención pueden ser
proporcionados en la forma de composiciones para uso en
inmunización pasiva. Aunque dichas composiciones son administradas
generalmente por inyección, no está previsto que la presente
invención esté limitada a esta vía solamente. En general, sin
embargo, las composiciones de la invención son administradas por
inyección intramuscular o subcutánea. Ocasionalmente, las vías
intravenosa o intraperitoneal pueden ser usadas también para
administrar las composiciones de la invención.
Además del ingrediente activo (es decir, el
anticuerpo), las composiciones de la invención pueden comprender
también un agente tamponante, un agente que ajuste su osmolaridad
y, opcionalmente, uno o más aditivos adicionales, tales como
vehículos, como es conocido en la técnica.
Un agente tamponante preferido es solución salina
tamponada con fosfato (PBS), solución que está también ajustada en
cuanto a la osmolaridad.
Una composición preferida es una que carezca de
un vehículo. Dichas formulaciones son usadas preferentemente para
administración por inyección, incluyendo inyección intramuscular e
intravenosa.
La preparación de composiciones farmacéuticas e
inmunizantes es bien conocida en la técnica y ha sido descrita en
muchos artículos y libros de texto, véase, por ejemplo,
"Remignton's Pharmaceutical Sciences", Gennaro A. R. ed. Mack
Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990.
Se ha mostrado que el desarrollo de diabetes
autoinmune en el ratón NOD está marcado por la presencia de células
T reactivas al péptido p277 de la HSP 60. Se ha mostrado
adicionalmente que el péptido p277 puede ser usado como una vacuna
terapéutica para detener la diabetes NOD [28]. El péptido p277 se ha
mostrado también que detiene la diabetes autoinmune inducida por la
toxina Streptozotocina [29]. Análogamente, las vacunas según la
invención pueden ser usadas también para suprimir una enfermedad
autoinmune.
Además de ello, las vacunas de la invención
pueden ser usadas también para prevenir recaídas de enfermedades
autoinmunes, que caracterizan muchas enfermedades autoinmunes. Por
lo tanto, la prevención de una recaída es parte de la aproximación
terapéutica de estos trastornos. El péptido p277 anterior se ha
mostrado que previene la diabetes de ratones NOD desactivando la
inmunidad anti-p277 en etapas tempranas de la vida.
Posteriormente se mostró que detiene el procedimiento autoinmune
incluso después de estar bastante avanzado [28].
Otra posibilidad es que los anticuerpos contra la
molécula de HSP supriman la inflamación inhibiendo el efecto
pro-inflamatorio de la HSP en el sistema inmune
innato. Se ha mostrado que la HSP65 micobacteriana induce la
liberación de citoquinas pro-inflamatorias a partir
de células monocíticas humanas [18] y se ha mostrado que la HSP60
de mamífero tiene un efecto sinérgico con INF-g y
favorece las citoquinas pro-inflamatorias como
IL-12 e IL-15 [31]. La inducción de
anticuerpos
anti-micobacterianos/anti-auto-HSP
puede suprimir esos efectos proinflamatorios.
Las inmunoglobulinas específicas (anticuerpos)
son comúnmente usadas para la prevención y el tratamiento de
enfermedades infecciosas (es decir, hepatitis vírica). Esto se
denomina vacunación pasiva. Las inmuglobulinas también pueden ser
usadas para suprimir o prevenir recaídas de enfermedades
autoinmunes como ITP (Púrpura Trombocitopénica Inmune), Miastenia
Grave (MG) y otras enfermedades autoinmunes [30].
Por tanto, todavía en un aspecto adicional, la
invención se refiere a un anticuerpo dirigido contra al menos un
péptido de epitopos de células B según la invención o sus homólogos
y derivados funcionales, que pueden inducir la producción de dicho
anticuerpo.
Los anticuerpos de la invención pueden ser
anticuerpos policlonales o monoclonales.
Todavía en un aspecto adicional, la invención se
refiere a una composición para la inmunización pasiva que comprende
al menos un anticuerpo según la invención, y puede comprender
además opcionalmente vehículos, diluyentes, aditivos, excipientes y
adyuvantes farmacéuticamente aceptables. La composición de la
presente invención está destinada particularmente a la vacunación o
inmunización pasiva y al tratamiento de trastornos autoinmunes o
inflamatorios, por ejemplo, artritis reumatoide.
La invención se describirá más en detalle sobre
la base de los siguientes ejemplos, que son solamente ilustrativos
y no limitan en modo alguno la invención. Son posibles muchas
modificaciones y variaciones de la presente invención considerando
las presentes exposiciones. Por lo tanto se entiende, que dentro
del alcance de las reivindicaciones anejas, la invención puede
llevarse a cabo de formas distintas a las específicamente
descritas.
Los siguientes Ejemplos muestran la respuesta del
anticuerpo anti-MT HSP de diversas ratas y su
correlación con la susceptibilidad a la inducción de la artritis.
Solamente un número limitado de epitopos en la molécula de HSP
bacteriana es reconocido por los anticuerpos de ratas. El repertorio
de este anticuerpo difiere entre cepas resistentes y susceptibles.
Las cepas resistentes se encontró que respondían a los péptidos que
se encontraban en la superficie externa de la molécula, así como a
la molécula completa. Por otra parte, los anticuerpos de ratas
Lewis desprovistas de sistema inmune reaccionaban con un número
menor de péptidos, que están menos expuestos en la superficie
externa de la molécula y no reaccionaban con la HSP intacta. La
presencia de anticuerpos contra algunos de los epitopos, así como la
MT-HSP completa, pueden estar asociadas con la
resistencia a la inducción de artritis y, por lo tanto, fueron
denominadas epitopos "protectores".
Se ha informado previamente que la respuesta de
células T a HSP bacteriana muestra una extensión determinante. Los
presentes datos, proporcionados en los siguientes Ejemplos,
muestran que hay una extensión determinante y clara de células B
también, y esta extensión puede producir también espontáneamente, a
saber, sin vacunación intencional. Los epitopos de células B, como
se mostrará, son diferentes de los epitopos de células T. Esta
observación es particularmente significativa para la presente
invención.
Las ratas Lewis jóvenes desprovistas de sistema
inmune reconocían solamente dos epitopos bacterianos: los péptidos
40 y 63. Las ratas Lewis de cuatro meses reconocían, además, los
péptidos 6, 36 y 45 y las ratas Lewis de nueve meses reconocían los
péptidos 7 y 31, además de todos los demás péptidos mencionados. El
reconocimiento de estos péptidos está asociado también con el
reconocimiento de la molécula de HSP de la molécula completa.
El repertorio de epitopos de células B de las
ratas BN jóvenes es similar al de las ratas Lewis viejas que
incluye solamente un péptido adicional, el péptido 59. Las ratas
Lewis que fueron inmunizadas con el CFA respondieron a todos los
péptidos anteriormente mencionados, así como a dos péptidos
adicionales, a saber 21 y 84.
Aunque todos los anticuerpos de péptidos de HSP
encontrados en ratas Lewis viejas desprovistas de sistema inmune y
en ratas BN jóvenes desprovistas de sistema inmune son denominados
anticuerpos naturales, es posible que sean provocados como una
respuesta a la exposición de estas ratas a agentes patógenos
medioambientales (como anticuerpos "naturales" que de hecho
siempre pueden ser) y que el epitopo que se extiende en respuesta a
estos agentes patógenos se produzca en la rata BN más rápidamente,
más temprano y más intensamente que en la rata Lewis. Las ratas
Lewis tienen que ser inmunizadas con CFA con el fin de emular la
respuesta natural de las ratas BN. La similitud del repertorio de
anticuerpos de las ratas BN desprovistas de sistema inmune a la de
la rata Lewis inmunizada apoya esta posibilidad.
La naturaleza de los epitopos de células B y la
correlación entre el reconocimiento de ciertos epitopos y la
molécula completa pueden ser mejor comprendidos a partir de un
análisis de las estructuras primarias y terciarias de la molécula,
mostrado con posterioridad.
Para observar si los anticuerpos protectores
anti-HSP pueden ser inducidos por inmunización con
los péptidos "protectores", fueron inmunizadas ratas Lewis con
los diversos péptidos, sin adyuvante de Freund. La inmunización con
tres péptidos, los péptidos bacterianos 6 y 7, y el péptido 5 de
mamífero, condujo a la producción de anticuerpos contra el péptido
bacteriano 6, así como a una respuesta anti-HSP,
que mostró que los anticuerpos contra un péptido "externo"
conducirán al reconocimiento de la molécula completa. La inducción
de estos anticuerpos condujo también a la resistencia a la
enfermedad.
Aunque el mecanismo de la resistencia a la
enfermedad inducida por los anticuerpos anti-HSP
naturales así como inducido todavía no ha sido clarificado, es
posible que los anticuerpos contra la MT HSP inhiban las etapas
tempranas de la inducción de células T patógenas al péptido
interviniendo en el tratamiento con antígenos o el reconocimiento
de células T de los epitopos patógenos. Alternativamente, pueden
prevenir las etapas efectoras de la respuesta patógena uniéndose al
antígeno diana de reacción cruzada con auto-HSP.
La respuesta a las células T de ratas Lewis
susceptibles a AA y WKA Wistar resistentes a AA respecto a la HSP
bacteriana de 65 kD ha sido estudiada a fondo. Se ha mostrado que
en las etapas tempranas de post-inmunización, las
células T Lewis responden a varios determinantes encontrados en el
terminal N, así como en el terminal carboxilo de la molécula,
mientras que posteriormente se ha desarrollado un desplazamiento
hacia epitopos carboxi-terminales. La respuesta
temprana de las células T de ratas Wistar fue similar a la de la
respuesta tardía de las ratas Lewis. Como la estructura 3D de la
molécula no muestra que los sitios terminales en carboxi y en N
estén en ubicaciones diferentes de la molécula, no es sorprendente
que los epitopos de células B fueran encontrados a todo lo largo de
la molécula sin ninguna selección del terminal carboxilo o el N de
la molécula.
Una comparación entre los epitopos de células T
dominantes publicados y los epitopos de células B presentes no puso
de manifiesto epitopos comunes. Por el contrario, la falta de
anticuerpos naturales para ciertos epitopos como 6, 7 ó 31 en la
rata Lewis desprovista de sistema inmune está asociada con una
respuesta temprana de células T a estos epitopos, mientras que la
presencia de anticuerpos para los epitopos como 40 y 63 está
asociada con la falta de una respuesta temprana de células T.
Basándose en estas correlaciones, puede ser sugerido que la
presencia de anticuerpos naturales para ciertos epitopos puede
inhibir realmente la respuesta de células T a ellos, mientras que la
falta de anticuerpos hace posible que las células T respondan a
estos epitopos. Por ejemplo, las ratas Lewis susceptibles a AA que
no tengan anticuerpos naturales para el péptido 31 bacteriano
pueden desarrollar una respuesta de células T a este péptido, y
estas células T patógenas pueden inducir la artritis.
Como se mencionó previamente, hubo una
correlación clara entre la resistencia a las enfermedades y la
presencia de anticuerpos anti-HSP. Las ratas Lewis
jóvenes desprovistas de sistema inmune no tenían anticuerpos
detectables contra la molécula de HSP, mientras que las ratas Lewis
de nueve meses desarrollaron estos anticuerpos en un título
significativo. Paralelamente al desarrollo de la respuesta
anti-HSP, las ratas viejas se hicieron también
resistentes a la inducción de artritis. Las ratas Lewis jóvenes
adquirieron tanto los anticuerpos como la resistencia a la
enfermedad después de una inmunización con CFA y las ratas BN
resistentes de forma natural tenían anticuerpos
anti-HSP espontáneamente, sin necesidad de
inmunización. Por lo tanto, es posible que estos anticuerpos se
unan a la HSP bacteriana inmediatamente después de la inmunización
y eviten que se hagan accesibles al brazo celular del sistema
inmune.
Como se indicó previamente, los epitopos
"escogidos" por las células B de la HSP bacteriana son
epitopos que tienen relativamente poca homología con la
auto-HSP, lo más probablemente como consecuencia de
una tolerancia a auto-antígenos.
Un análisis del repertorio de anticuerpos
anti-auto HSP (de ratas) mostró de hecho que hay un
número limitado de epitopos reconocidos por las inmunoglobulinas de
rata en la molécula de auto-HSP. Las ratas Lewis
jóvenes desprovistas de sistema inmune no respondieron a ningún
autopéptido ni respondieron a la molécula de auto HSP 60 completa.
Las ratas BN y Lewis post-AA que reaccionaron con
epitopos de HSP bacteriana respondieron solamente a dos epitopos en
la auto-HSP, péptidos M5 y M30, así como a la
molécula de auto-HSP completa.
La expresión de (auto)-HSP de
mamífero está regulada en sentido ascendente en sinovias inflamadas
de ratas con AA [22] y se ha encontrado un
inmuno-reconocimiento reactivo cruzado entre la HSP
micobacteriana de 65 kD y la auto-HSP endógena de
60 kD al nivel de las células T [23-25].
Como los anticuerpos anti-autos
se encontraron solamente en las ratas resistentes, es posible que
los anticuerpos que tienen reacción cruzada con la
auto-HSP puedan enmascararlos respecto a las células
T patógenas y por tanto actuar como anticuerpos protectores.
Es interesante apreciar que uno de los dos
epitopos auto-protectores es el auto- péptido 5, que
es el epitopo de rata homólogo al péptido 6 protector bacteriano.
Además de ello, la inmunización con los péptidos 6 y 7 bacterianos y
con el péptido 5 de mamífero condujeron a la producción de HSP 6
anti-bacteriana y anticuerpos de HSP
anti-bacteriana, así como a una protección contra la
inducción de la enfermedad. La observación de la estructura
primaria de estos tres péptidos conduce a la conclusión de que
expresan un resto común (V-E-W
G-P) que puede ser el resto protector de estos
péptidos (Figura 5).
Por lo tanto, la respuesta inmune humoral a la
HSP bacteriana puede estar dirigida a un número limitado de
epitopos de células B potenciales. Estos epitopos son extensiones
de péptidos ubicadas entre los aminoácidos que sirven como recodos
y separadores, y se encuentran en las partes no conservadas de la
molécula. El reconocimiento de epitopos de células B que están
expuestos en la superficie de la molécula conduce a la unión de la
molécula completa y está asociado con la resistencia a la inducción
de artritis.
Esta resistencia se produce de forma natural en
algunas cepas de ratas, mientras en otras puede ser adquirida con
la edad o tras una inmunización con HSP. La inmunización con
algunos de los epitopos "protectores" puede conducir tanto a
una resistencia a la enfermedad como al perfil serológico que está
presente en las cepas resistentes.
La presente invención puede proporcionar también
un método para la predicción de la
susceptibilidad/predisposi-
ción a desarrollar artritis autoinmune. En el sistema de ratas, se ha mostrado que las ratas Lewis desprovistas de sistema inmune no tienen anticuerpos contra el péptido 6 de la HSP, y que son susceptibles al desarrollo de la artritis después de una exposición o inmunización por HSP. De una manera similar, los individuos sanos que carecen de los subgrupos de anticuerpos contra péptidos específicos de HSP pueden ser susceptibles a la aparición de la artritis. La presente invención proporciona un ensayo para la valoración y determinación de la susceptibilidad/predisposición a la artritis. El ensayo puede ser realizado mediante un sistema ELISA, en el que los péptidos se unirán a la fase sólida y las muestras de suero añadidas, seguido de la adición de Igs (inmunoglobulinas) anti-humanas. Pueden ser usadas también otras técnicas de análisis inmunológicos conocidas.
ción a desarrollar artritis autoinmune. En el sistema de ratas, se ha mostrado que las ratas Lewis desprovistas de sistema inmune no tienen anticuerpos contra el péptido 6 de la HSP, y que son susceptibles al desarrollo de la artritis después de una exposición o inmunización por HSP. De una manera similar, los individuos sanos que carecen de los subgrupos de anticuerpos contra péptidos específicos de HSP pueden ser susceptibles a la aparición de la artritis. La presente invención proporciona un ensayo para la valoración y determinación de la susceptibilidad/predisposición a la artritis. El ensayo puede ser realizado mediante un sistema ELISA, en el que los péptidos se unirán a la fase sólida y las muestras de suero añadidas, seguido de la adición de Igs (inmunoglobulinas) anti-humanas. Pueden ser usadas también otras técnicas de análisis inmunológicos conocidas.
La invención se describirá más en detalle por
medio de lo siguientes ejemplos, que son solamente ilustrativos y
no limitan la invención.
Animales: Ratas Lewis sin nutrir hembras,
de 6 semanas o 9 meses, fueron obtenidas de Harlan Lab. Israel.
Ratas hembras Brown-Norway (BN) de 6 semanas,
fueron obtenidas de Harlan Sprague-Dawley,
EE.UU.
Antígenos y anticuerpos: HS P65
recombinantes de Mycobacterium Tuberculosis fue un obsequio
del Dr. M. Singh (The WHO Recombinant Protein Bank, Alemania). HSP
60 de mamífero recombinantes fueron adquiridas de StressGen Biotech.
Corp. (Victoria, BC, Canadá). Péptidos sintéticos de MT HSP 65
fueron un obsequio del Dr. L. Adorini (The Roche Milano Ricerche,
Milán, Italia). Péptidos sintéticos de MT HSP 60 fueron un obsequio
del Dr. I. Cohen (The Weizmann Institute, Rehovot, Israel). IgG de
cabra anti-rata conjugada a fosfatasa alcalina fue
adquirida de Jackson ImmunoResearch Lab. Inc. (Avonsdale, PA).
Inducción y valoración clínica de artritis
adyuvante: Ratas Lewis fueron inyectadas con 1 mg de
Mycobacterium Tuberculosis H37Ra (Difco, Detroit, MI) en
adyuvante completo de Freund (Difco) por vía subcutánea en la base
de la cola. La gravedad de la artritis (índice artrítico) se valoró
al azar como sigue: 0 - sin artritis; 1 - enrojecimiento de la
articulación; 2 - enrojecimiento e hinchazón de la articulación.
Fueron valorados el tobillo y las articulaciones
tarsianas-metatarsianas de cada pata. Puede ser
obtenida una puntuación máxima de 16, pero una puntuación por encima
de 8 indica una enfermedad grave.
Ensayo de transferencias de puntos: Fueron
disueltos antígenos en PBS y muestras de 1 mg fueron adsorbidas en
papel de nitrocelulosa. El papel fue secado con aire e incubado con
BSA al 1% en PBS durante 20 minutos para bloquear la unión no
específica. Las muestras fueron seguidamente lavadas en
PBS-Tween al 0,05% e incubadas con sueros de rata
diluidos a 1:100 en BSA-PBS, durante 90 minutos a
temperatura ambiente. Las muestras fueron lavadas e incubadas con
anticuerpo de cabra anti-rata conjugado a fosfatasa
alcalina diluida 1:1000 en BSA-PBS durante 90
minutos a TA. Después de volver a lavar, se reveló la reacción
coloreada añadiendo una mezcla de BCIP-NBT
(Sigma-Fast, Sigma) a las células durante 15
minutos. La reacción fue detenida mediante la adición de agua
corriente.
Elisa: Placas de 96 pocillos de fondo liso
(Corning) fueron revestidas con HSP 60 de mamífero, o HSP 65
micobacteriana (10 \mug/ml) en tampón de carbonato de pH 9,6
durante una noche a 4ºC.
Después de un lavado intensivo con
PBS-Tween al 0,05%, las placas fueron incubadas con
tampón bloqueador que contenía 1% de BSA (Sigma) durante 60 minutos
a TA.
Péptidos de HSP fueron unidos a placas
previamente tratadas con glutaraldehído según Kasprzyk et
al. [26]. Brevemente, las placas fueron revestidas con 100
\mul/pocillo de 5% p/v de glutaraldehído en PBS durante 1 hora a
temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas a fondo con PBS y
fueron añadidos péptidos (1 \mug/100 \mul) a cada pocillo y
fueron incubados durante una noche a 4ºC. Las placas fueron
agitadas en seco y bloqueadas con BSA al 1% en PBS.
Las placas revestidas con HSP o péptidos fueron
nuevamente lavadas e incubadas con sueros de rata diluidos 1:100
con PBS-Tween al 0,01% durante 90 minutos a
temperatura ambiente. Después de volver a lavar, las placas fueron
incubadas con IgG anti-rata de cabra o IgM
conjugada con fosfatasa alcalina durante 60 minutos a temperatura
ambiente. La presencia de anticuerpos se puso de manifiesto
mediante la adición del sustrato PNP (NP 100, Chemicon, Temecula,
CA) a las placas. La densidad óptica se midió fotométricamente a
405 nm.
Comparación de aminoácidos: Se usaron
programas "Pileup" y "pretty" (GCG - Winconsin package,
v. 9.0) para comparar secuencias de aminoácidos en tres HSP 60
(Mycobacterium Tuberculosis, rata y humana).
Análisis de estructuras: Se usaron el
programa RasMol v. 2.6 y la estructura 3D del complejo de E.
coli GroEL-GroES (referencia pdb ID: 1AON) para
analizar la posición de los epitopos.
Como la estructura cristalina de MT HSP de 65 kD
todavía no es completamente conocida, se usó como plantilla un
modelo tridimensional para la estructura terciaria de MT HSP 65 kD
basada en la estructura cristalina resuelta de GroEL de E.
coli (pbd ID: 1 GRL). Este modelo fue construido mediante
programas para modelar proteínas comparativas.
Modulación de AA mediante péptidos de HSP
micobacteriana y de mamífero: Péptidos derivados de HSP 65
fueron ensayados en cuanto a su capacidad para modular la
apariencia o gravedad de AA en ratas Lewis. Las ratas fueron
inmunizadas con 100 \mug de cada péptido en PBS, tres semanas
(3W), 2W y 1W antes de la inducción de AA mediante MT. Las ratas
testigos recibieron PBS. Las ratas fueron sometidas a hemorragia
para ensayar la presencia de anticuerpos antes de una inyección de
MT y 30 días después de la inyección de MT.
Preparación de vacunas de ADN: Un oligoADN
sintético, que tenía la SEQ ID Nº 5, que codificaba el oligopéptido
Mycobacterium Tuberculosis HSP 65 kD Nº 6, presentado en la
Tabla 1, fue clonado en el vector de expresión de mamífero
disponible en el comercio pTARGET (Programa, Madison, WI, EE.UU.)
que tenía el mapa de restricción expuesto en la Fig. 6. La clonación
se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante.
El constructo de plásmidos fue seguidamente
transferida en E. coli JM109 y expandido a gran escala para
una purificación adicional del plásmido, usando el estuche de
ensayo del sistema de purificación de ADN Wizard Plus Maxipreps
(Programa, Madison, WI, EE.UU.).
Vacunación de animales: Ratas Lewis fueron
previamente tratadas con Bupivaccine (Astra) dos días antes de la
vacunación y posterior inducción de la enfermedad. Las ratas fueron
inyectadas seguidamente dos veces con 100 \mug del constructo de
ADN, en el músculo anterior tibial, con un intervalo de una semana
entre las inyecciones.
Experimentos previos realizados por los
inventores mostraron que las Ig de ratas desprovistas de sistema
inmune resistentes a AA (es decir, BN o Fisher) así como ratas
Lewis que se recuperaron de AA (ratas Lewis
post-AA), fueron capaces de suprimir la inducción
de AA en ratas Lewis desprovistas de sistema inmune y unidas a la
HSP 65 bacteriana en un ensayo de transferencia de puntos. Para
obtener una evaluación más cuantitativa de esta unión, la
interacción de Igs de estas ratas con la molécula completa de la HSP
65 micobacteriana, que se conoce que está asociada con la AA en
ratas Lewis, fue ensayada mediante transferencia de puntos y
ELISA.
Se encontró que las Igs de ratas BN de
6-8 semanas de edad y ratas Lewis
post-AA reaccionaban fuertemente con la HSP
mientras que no se encontró ninguna reacción cuando fueron
ensayadas Igs de ratas Lewis desprovistas de sistema inmune.
Interesantemente, se encontró que las Igs de ratas Lewis
desprovistas de sistema inmune de nueve meses también reaccionaron
con la HSP.
Para definir los epitopos reconocidos por los
anticuerpos de HSP anti-bacteriana, los inventores
ensayaron mediante transferencia de puntos la interacción de Igs a
partir de ratas BN jóvenes desprovistas de sistema inmune y ratas
Lewis post-AA con 90 péptidos sintéticos
16-meros de HSP micobacteriana de 65 kD. Las Igs de
ratas Lewis jóvenes desprovistas de sistema inmune sirvieron como
testigo.
Solamente 10 péptidos de los 90 péptidos
ensayados (Tabla 2) reaccionaron con las inmunoglobulinas
ensayadas. Todas las inmunoglobulinas de ratas reaccionaron con dos
péptidos: 40 (residuos 235-250) y 63 (residuos
373-388). Cuando estas ratas envejecen, adquieren
anticuerpos contra péptidos adicionales, y se encuentra un perfil
similar al de las ratas Lewis viejas en ratas BN jóvenes
desprovistas de sistema inmune, y ratas Lewis que fueron inmunizadas
con CFA reaccionaron también con los péptidos 21 (residuos
121-136) y 84 (residuos 499-514).
Se aprecia que aunque la ratas Lewis desprovistas de sistema inmune
no reconocen la molécula completa de HSP 65 kD, sus Igs pueden
interaccionar con ciertos péptidos de esta molécula, sin ningún
efecto sobre la susceptibilidad a la AA.
\newpage
Los estudios previos han mostrado que ciertos
péptidos de HSP bacteriana pueden activar células T reactivas con
auto-HSP con capacidad potencial reguladora y
supresora de enfermedades. Para analizar el repertorio de
anticuerpos anti auto-HSP de estas ratas, la
reactividad de Igs de ratas Lewis desprovistas de sistema inmune y
post-AA así como de ratas BN desprovistas de sistema
inmune a HSP 60 de mamífero completa fue ensayada mediante
ELISA.
Los resultados presentados en la Tabla 3 indican
que las ratas Lewis desprovistas de sistema inmune y de cuatro
meses no poseen anticuerpos
anti-auto-HSP 60, mientras que las
ratas Lewis de nueve meses, ratas BN jóvenes y ratas Lewis
post-AA tenían una unión significativa a la
auto-HSP (Tabla 3). Algunas ratas Lewis
desprovistas de sistema inmune tenían concentraciones muy bajas de
los anticuerpos.
| Secuencia | M 5 | M 30 | M-HSP 60 | Susceptibilidad |
| de péptido | 61-80 | 436-455 | a la enfermedad | |
| Cepa | ||||
| Lew-6w | - | - | - | 8/10 |
| Lew-4m | - | - | - | 3/3 |
| Lew-9m | ++ | ++ | + | 0/7 |
| BN-6w | + | + | + | 0/10 |
| Lew-6w | +++ | ++ | + | 0/10 |
| O.D.: <0,15=-; 0,16-0,45=+; 0,46-0,75=++; >0,75=+++ |
Las inmunoglobulinas de ratas Lewis y BN y ratas
Lewis post-AA fueron ensayadas en cuanto a la unión
a 38 péptidos 20-meros sintéticos de la HSP 60 de
mamífero mediante transferencia de puntos. Se encontró que las Igs
derivadas de ratas BN y Lewis post-AA, pero no las
ratas Lewis desprovistas de sistema inmune, reaccionaron con 2
péptidos solamente: el péptido 5 (residuos 61-80) y
el péptido 30 (residuos 436-455). Un análisis
cuantitativo de esta unión, así como la unión de inmunoglobulinas
de ratas Lewis de cuatro y nueve meses de edad confirmaron los
descubrimientos de la transferencia de puntos (Tabla 3).
La familia de HSP 60 está altamente conservada:
MT-HSP 65 y sus homólogos de mamíferos (ratas o
humanos) muestran una identidad de 48%. En la Fig. 1, se comparan
las tres secuencias de aminoácidos de las MT-HSP 65,
HSP 60 de rata y humana. Se muestra también la secuencia de
consenso de estas tres proteínas. Los epitopos que se encontró que
eran relevantes en este estudio se muestran en negrita y
subrayado.
La estructura terciaria desempeña una función
importante para el reconocimiento de epitopos de células B. En una
primera aproximación, se proporcionó un programa de ordenador
sencillo, que podría predecir dónde encontrar epitopos de células B
seleccionando la estructura primaria del péptido. El algoritmo está
basado en un análisis previo por Warren et al. [27] de la
proteína básica de mielina para ubicar epitopos potenciales para
células B. Según su análisis, pueden ser definidas dos clases de
aminoácidos:
\bullet"Separadores moleculares": Estos
son residuos de cadena corta (cadenas laterales de un átomo de
carbono o menos) que podrían proporcionar un espacio molecular para
aminoácidos adyacentes de cadena larga. Tres aminoácidos que se
ajustan a esta definición son: glicina (G), alanina (A) y serina
(S).
\bullet"Recodos moleculares": Residuos de
prolina (P) que pueden provocar interrupciones en la estructura
secundaria.
Se ajustó una longitud mínima de 9 residuos para
estos epitopos potenciales. Siguiendo estas normas, se encontraron
seis series de residuos consecutivos de cadena larga (cadenas
laterales de dos átomos de carbono o más) ubicados entre los
separadores moleculares y/o recodos moleculares (Tabla 4).
| Ubicación del péptido | Secuencia del péptido | Longitud | Coincidencia experimental |
| (residuos aa) | de péptidos | ||
| 35-43 | G-RNVVLEKKW-G | 9 | 6,7 |
| 123-132 | A-VEKVTETLLK-G | 10 | 21 |
| 135-143 | A-KEVETKEQI-A | 9 | 21 |
| 319-332 | RKVVVTKDAETTIVE | 14 | ninguno |
| 357-367 | S-DYDREKLQERL-A / | 11 | 59 |
| 383-396 | A-TEVELKERKHRIED-A | 14 | 63 |
| 183-195 | G-LQLELTEGMRFDK-G | 13 | 31 |
| 259-270 | S-TLVVNKIRGTFK-S | 12 | 45 |
El péptido fue seleccionado mediante un programa
de ordenador y se muestran los residuos consecutivos de cadena
larga (cadenas laterales de dos átomos de carbono o más) ubicados
entre los separadores moleculares y/o recodos moleculares (los 6
primeros péptidos). Los dos péptidos por debajo de ellos son la
cadena consecutiva que contiene como máximo un separador molecular
(glicina).
Cinco o seis series que fueron identificadas por
estos normas coinciden con las secuencias de aminoácidos que se
encontró que eran experimentalmente reconocidas por anticuerpos de
células B (Tabla 1). Consecuentemente, con el fin de encontrar más
epitopos, el programa se llevó a cabo con un ligero cambio, a
saber, la búsqueda de epitopos que contienen como máximo un
separador molecular (G, S o A). La longitud mínima se ajustó a 12
residuos (en lugar de 9 como previamente) con el fin de rebajar el
fondo (es decir, se ajustó una penalización de tres residuos para
compensar el espacio). Fueron identificadas dos nuevas secuencias,
que se encontró también que eran experimentalmente reconocidas por
anticuerpos de células B (31, 45; véase la Tabla 1). El separador
molecular era glicina en estos dos casos.
Con el fin de comprender mejor las implicaciones
de la estructura terciaria de MT HSP 65 kD y ubicar estas
secuencias de aminoácidos diferentes en la molécula completa, se
usó un modelo para la estructura terciaria de MT HSP 65 kD basado
en la estructura cristalina de E. coli GroEL (Fig. 3).
El análisis estructural confirmó que los epitopos
experimentalmente reconocidos ubicados en la superficie de la
proteína pueden proporcionar un sitio potencial para la unión de
anticuerpos. Los péptidos 6, 7, 21, 31 y 59 fueron los que encontró
que eran los más expuestos mientras que los péptidos 36, 40, 45, 63
y 84 estaban parcialmente expuestos.
El único epitopo potencial que no fue
experimentalmente reconocido (residuos 318-331)
parece que está "enterrado" en la molécula.
Aunque hay una considerable homología entre MT
HSP 65 kD y HSP 60 kD, la mayoría de los péptidos que se encontró
que eran reconocidos por los anticuerpos de HSP 65
anti-MT no mostraron una elevada homología de
residuos con la HSP de mamífero. Esto puede ser debido a la
tolerancia al tipo auto, que protege las ratas de desarrollar una
respuesta de auto-anticuerpos a su propia HSP 60.
Dos péptidos, 6 y 45, parece que no cumplían esta norma, ya que
tenían sitios que mostraban una elevada homología a la
auto-HSP.
Estos descubrimientos pueden ser explicados para
ambos péptidos como sigue:
En cuanto al péptido 6 (residuos
31-46): los anticuerpos se encontró que se unían al
péptido 7 (residuos 37-52) que se solapa a la parte
polimórfica de este péptido, pero no al péptido 5 (residuos
25-40) que representa la región homóloga con la HSP
de mamífero. Por lo tanto, parece que estos anticuerpos están
dirigidos contra la región polimórfica (no auto) del péptido 6
(residuos 40-46). Puede proporcionar también una
hipótesis referente a la capacidad "protectora" de este
péptido, la homología parcial a la secuencia de HSP 60 de mamífero
puede ser responsable de este efecto protector.
En cuanto al péptido 45 (residuos
265-280): este péptido puede ser dividido en dos
regiones consecutivas: una polimórfica (residuos
265-271) y la segunda altamente conservada
(residuos 271-280). Un análisis de la estructura
tridimensional muestra que la región polimórfica es la región
expuesta, mientras que la región conservada parece estar
"enterrada" en la molécula completa (no mostrada). Por lo
tanto, es posible que los anticuerpos que se unen al péptido 45
estén dirigidos principalmente contra la región polimórfica
expuesta.
No se apreció ninguna particularidad referente a
la estructura secundaria y el reparto de los residuos
hidrófobos/polares en estos epitopos (ambos reconocidos
experimentalmente y por ordenador). Generalmente, los epitopos
experimentalmente reconocidos tienden a ser hidrófobos
(9-12 residuos hidrófobos de 16), excepto para el
péptido 59 que es altamente polar (13 residuos de 16).
Con referencia a las Figuras, la Fig. 2 muestra
la ubicación de péptidos bacterianos 6, 7 y 31 en la estructura
tridimensional del complejo GroEL-GroES de E.
Coli y la Fig. 3, como se establece, muestra los mismos péptidos
en un modelo de la MT HSP 65 basado en la estructura de GroEL E.
coli con un relleno espacial y representaciones de estructuras
secundarias.
Para ensayar si la inmunización activa con
péptidos de HSP bacteriana o de mamífero que son reconocidos por
inmunoglobulinas protectoras puede inducir protección contra AA,
fueron inmunizadas ratas Lewis con los péptidos micobacterianos 6,
7, 21, 31, 36, 45 y 84 que se unieron a anticuerpos de ratas Lewis
resistentes (péptidos "protectores"), con algunos péptidos de
HSP 65 micobacterianos no reactivos: péptido 26 (residuos
151-166), 28 (residuos 163-178) o
péptido 70 (residuos 415-430), y con el péptido 5 de
mamífero.
Las ratas fueron inyectadas 3 veces por vía
intraperitoneal (IP) con intervalos de una semana entre inyecciones
antes de la inducción de AA con MT.
La Fig. 4 muestra que solamente la
pre-inmunización de ratas con los péptidos
bacterianos 6 y 7 y el péptido 5 de mamífero dio lugar a una
supresión significativa de la gravedad de la enfermedad.
La inmunización con estos péptidos
"protectores" dio lugar también a la producción de anticuerpos
contra el péptido 6 así como contra la MT HSP 65 completa (Tabla
5).
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<110> Hadasit Medical Research Services
& Development Ltd
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevas secuencias de aminoácidos, ADN
que codifica las secuencias de aminoácidos, anticuerpos dirigidos
contra dichas secuencias y los diferentes usos de los mismos.
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 6433/WO/99
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<140>
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<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/107,213
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<151>
1998-11-05
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<160> 8
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<170> Patentin Ver. 2.1
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium tuberculosis
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Lys Gly Arg Asn Val Leu Glu Lys Lys Trp
Gly Ala Pro}
\sac{Thr Ile Thr Asn Asp Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> PRT
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<213> Mycobacterium tuberculosis
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys
Lys Trp Gly Ala Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> PRT
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<213> Mycobacterium tuberculosis
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr
Ile Thr Asn Asp Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<400> Humano
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Val Ile Ile Glu Gln Ser Trp Gly Ser Pro
Lys Val Thr Lys Asp}
\sac{Gly Val Thr Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 67
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 540
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<212> PRT
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<213> Mycobacterium tuberculosis
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 573
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rata
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 573
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<212> PRT
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<213> Mycobacterium tuberculosis
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (23)
1. Un péptido de epitopos de células B, que
comprende la secuencia de aminoácidos indicada mediante la SEQ ID
Nº 1.
2. Un péptido de epitopos de células B según la
reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos indicada
mediante la SEQ ID Nº 2.
3. Un péptido de epitopos de células B según la
reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos indicada
mediante la SEQ ID Nº 3.
4. Un péptido de epitopos de células B, que
comprende la secuencia de aminoácidos indicada mediante la SEQ ID
Nº 4.
5. Un péptido de epitopos de células B según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es un péptido
sintético.
6. Un péptido químicamente modificado, según la
reivindicación 5.
7. Un péptido de epitopos de células B según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, capaz de conferir
inmunidad frente a trastornos autoinmunes y/o inflamatorios.
8. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica
un péptido de epitopos de células B, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
9. Una secuencia de ADN, según la reivindicación
8.
10. Una secuencia de ADN según la reivindicación
9, que comprende la secuencia de ácidos nucleicos indicada mediante
la SEQ ID Nº 5.
11. Un constructo de ADN, que comprende la
secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 8.
12. Un constructo de ADN, que comprende la
secuencia de ADN según la reivindicación 9 ó 10.
13. Una de vacunación eficaz de al menos un
péptido de epitopos de células B según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende además opcionalmente un
vehículo, diluyente, aditivo o adyuvante farmacéuticamente
aceptable.
14. Una vacuna que comprende como ingrediente
activo una secuencia de ADN según una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 10 o el constructo de ADN según una cualquiera
de las reivindicaciones 11 y 12, que comprende además opcionalmente
un vehículo, diluyente, aditivo o adyuvante farmacéuticamente
aceptable.
15. Una vacuna según la reivindicación 13 o la
reivindicación 14, para conferir inmunidad contra trastornos
autoinmunes o inflamatorios.
16. La vacuna según la reivindicación 15, para
conferir inmunidad contra artritis.
17. Un anticuerpo dirigido contra un péptido de
epitopos de células B, que comprende la secuencia de aminoácidos
indicada mediante la SEQ ID Nº 1.
18. Un anticuerpo dirigido contra un péptido de
epitopos de células B, que tiene la secuencia de aminoácidos
indicada mediante la SEQ ID Nº 2.
19. Un anticuerpo dirigido contra un péptido de
epitopos de células B, que tiene la secuencia de aminoácidos
indicada mente la SEQ ID Nº 3.
20. Un anticuerpo dirigido contra un péptido de
epitopos de células B, que comprende la secuencia de aminoácidos
indicada mediante la SEQ ID Nº 4.
21. Una composición para la inmunización pasiva
contra un trastorno autoinmune o inflamatorio, que comprende una
cantidad farmacéuticamente eficaz de un anticuerpo según una
cualquiera de las reivindicaciones 17 a
20.
20.
22. Una composición según la reivindicación 21,
para la prevención o el tratamiento de un trastorno autoinmune o
inflamatorio.
\newpage
23. Un método para predecir la
susceptibilidad/predisposición de un individuo a la artritis
ensayando una muestra de suero de dicho individuo en cuanto a la
presencia de anticuerpos dirigidos contra un péptido como se
reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,
mediante técnicas adecuadas de inmunoensayos.
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