ES2256067T3 - Oligonucleotidos y combinaciones de los mismos utiles en la deteccion de la presencia o ausencia de secuencias de acidos nucleicos diana en una muestra. - Google Patents

Abstract

Un par de oligonucleótidos útil para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo el par de oligonucleótidos un oligonucleótido de anclaje y un oligonucleótido amplificador, incluyendo cada uno de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador una primera región que es capaz de hibridar con la secuencia de ácido nucleico diana, incluyendo además cada uno de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador una segunda región, siendo capaces dichas segundas regiones de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador de formar una estructura dúplex que incluye una secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos después de la hibridación de dichas primeras regiones de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador con la secuencia de ácido nucleido, donde dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador se seleccionan de tal forma que cuando hibridan con la secuencia de ácido nucleico diana en presenciade un agente de escisión de ácidos nucleicos que reconoce dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos, sólo se escinde dicho oligonucleótido amplificador por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos, donde dicha escisión de dicho oligonucleótido amplificador conduce a la disociación de dicho oligonucleótido amplificador de la secuencia de ácido nucleico diana mientras que dicho oligonucleótido de anclaje permanece hibridado con la secuencia de ácido nucleico diana para formar un híbrido estabilizado de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana, permitiendo de esta manera que un segundo oligonucleótido amplificador no escindido hibride con dicho híbrido de oligonucleótido de anclaje-ácido nucleico diana, con lo que se posibilita el reciclado de dicho híbrido de oligonucleótido de anclaje-secuencia de acido nucleico diana con respecto a dicho oligonucleótido amplificador.

Description

Oligonucleótidos y combinaciones de los mismos útiles en la detección de la presencia o ausencia de secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra.

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a sondas oligonucleotídicas y a métodos para la detección de secuencias de ácido nucleico diana en una muestra. Mas particularmente, la presente invención se refiere a sondas oligonucleotídicas que se pueden escindir internamente cuando hibridan con secuencias de ácido nucleico diana, conduciendo dicha escisión tanto a la generación de señales como a la amplificación por reciclado.

La identificación de una secuencia de ácido nucleico diana tiene una gran importancia tanto en la investigación biológica como en el diagnóstico medico. La detección de una secuencia diana puede usarse para identificar y/o tipificar una molécula de ADN o ARN especifica y para descubrir mutaciones.

En la técnica existen numerosos métodos y técnicas con los cuales puede realizarse la detección y/o identificación de una secuencia diana. Por ejemplo, pueden usarse métodos de secuenciación de polinucleótidos para determinar la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN o ARN diana. Los métodos usados típicamente para la secuenciación incluyen el método didesoxi de Sanger, véase, por ejemplo, Sanger et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467, o el método de Maxam y Gilbert, véase, por ejemplo, Maxam et al., (1980) Methods in Enzymology, 65:499-559.

También puede usarse la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar la presencia de una secuencia diana en una muestra. La PCR utiliza cebadores oligonucleotídicos que se unen específicamente a regiones presentes dentro de la secuencia diana para amplificar la secuencia de ácido nucleico diana, siendo indicativa la generación de productos de amplificación de la presencia de la secuencia diana.

Otra estrategia para la identificación de ácidos nucleicos diana implica la hibridación de una sonda oligonucleotídica con la secuencia de ácido nucleico diana, siendo indicativa la hibridación de su presencia.

Una sonda oligonucleotídica se une a un ácido nucleico diana por medio de la formación de enlaces de hidrógeno entre bases de la diana y el oligonucleótido. El ADN-B común tiene pares de bases de Watson y Crick convencionales adenina-timina (A-T) y guanina-citosina (G-C), formándose dos y tres enlaces de hidrógeno entre dichas bases, respectivamente. La tecnología de hibridación convencional se basa en la capacidad de las sondas oligonucleotídicas de ADN o ARN con especificidad de secuencia de unirse a un ácido nucleico diana complementario a través de enlaces de hidrógeno de Watson-Crick. Sin embargo, se conocen otros tipos de modelos de formación de enlaces de hidrógeno internucleotídicos donde átomos no implicados en el emparejamiento de bases de Watson-Crick de un primer nucleótido pueden formar enlaces de hidrógeno con otro nucleótido. Por ejemplo, la timina (T) puede unirse a un par de bases de Watson-Crick AT a través de enlaces de hidrógeno con la adenina, formando de esta manera una tríada de bases T-AT. Hoogsteen (1959, Acta Crystallographica 12:822) describió por primera vez los enlaces de hidrógeno alternativos presentes en tríadas de bases T-AT y C-GC. Mas recientemente, se han observado tríadas de bases G-TA, donde la guanina puede formar enlaces de hidrógeno con una timina central (Griffin et al., 1989, Science 245:967-971).

Las sondas oligonucleotídicas que pueden unirse a un ácido nucleico diana tanto con enlaces de hidrógeno de Watson-Crick como con enlaces de hidrógeno de otro tipo distinto a los de Watson-Crick forman complejos extremadamente estables con el ácido nucleico diana y, de esta manera, tienen una diversidad de utilidades de investigación y diagnóstico.

Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden usarse como sondas para ácidos nucleicos diana que se inmovilizan en un filtro o membrana, o están presentes en tejidos, por ejemplo, como se describe en Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, NY). Sin embargo, la utilidad de las sondas oligonucleotídicas lineales a menudo está limitada por su deficiente estabilidad y selectividad de unión.

Otro ejemplo incluye métodos de detección en fase de solución. Se conocen varios métodos de detección en fase de solución, denominados algunas veces ensayos homogéneos. El término "homogéneo" se usa en la técnica para hacer referencia a métodos realizados sin separar las sondas oligonucleotídicas no hibridadas de los híbridos de sonda-diana. Estos métodos a menudo se basan en el hecho de que la fluorescencia de muchos marcadores fluorescentes puede verse afectada por la conformación de la sonda oligonucleotídica o por el entorno químico inmediato.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.876.930 de Livak et al. describe un método para identificar una secuencia de ácido nucleico diana. El método utiliza una sonda oligonucleotídica que incluye una molécula indicadora fluorescente y una molécula inactivadora capaz de inactivar la fluorescencia de la molécula indicadora. La sonda oligonucleotídica de acuerdo con este método se construye de tal manera que la sonda exista en al menos una conformación monocatenaria cuando no está hibridada, donde la molécula inactivadora este suficientemente cerca de la molécula indicadora como para inactivar la fluorescencia de la molécula indicadora. La sonda oligonucleotídica también existe en al menos una conformación cuando hibrida con un ácido nucleico diana en la que la molécula inactivadora no está colocada suficientemente cerca de la molécula indicadora como para inactivar la fluorescencia de la molécula indicadora. Por medio de la adopción de estas conformaciones hibridada y no hibridada, la molécula indicadora y la molécula inactivadora en la sonda presentan diferentes intensidades de señal de fluorescencia cuando la sonda está hibridada y no hibridada. Como resultado, este método permite determinar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana específica basándose en un cambio en la intensidad de fluorescencia de la molécula indicadora, la molécula inactivadora o una combinación de las mismas. La limitación de esta estrategia es que no se permite ninguna amplificación de señal, lo cual tiene como resultado la incapacidad de detectar bajas concentraciones de diana. Además, este método se caracteriza intrínsecamente por una alta señal de interferencia.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.925.517 de Tyagi et al. describe sondas de hibridación unimoleculares y bimoleculares para la detección de secuencias de ácido nucleico diana. Las sondas incluyen una secuencia de complemento diana, un par de afinidad que contiene la sonda en una conformación cerrada en ausencia de la secuencia diana, y un par marcador que interacciona cuando la sonda esta en la conformación cerrada o, en el caso de ciertas sondas unimoleculares, un marcador no interactivo. La hibridación de la secuencia diana y la secuencia complementaria de la diana cambia la sonda a una conformación abierta. El cambio es detectable debido a la reducción de la interacción del par marcador o por la detección de una señal de un marcador no interactivo. Ciertas sondas unimoleculares pueden discriminar entre secuencias diana y no diana que difieren tan sólo en un nucleótido. La limitación de esta estrategia es que no se permite la amplificación de la señal, lo cual tiene como resultado la incapacidad de detectar bajas concentraciones de diana. Además, este método se caracteriza intrínsecamente por una alta señal de inter-
ferencia.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.866.336 de Nazarenko et al. describe oligonucleótidos de amplificación de ácido nucleico marcados, que pueden ser cebadores lineales o de horquilla u oligonucleótidos de bloqueo. Los oligonucleótidos descritos por Nazarenko están marcados con restos donadores y/o aceptores de pares de transferencia de energía molecular. Los restos pueden ser fluoróforos, de tal forma que la energía fluorescente emitida por el donador se absorbe por el aceptor. El aceptor puede ser un fluoróforo que emite fluorescencia a una longitud de onda diferente de la del resto donador, o puede ser un inactivador. Estos oligonucleótidos se configuran de manera que en el producto de amplificación se incorporan un resto donador y un resto aceptor. La invención también proporciona métodos y kits para detectar directamente los productos de amplificación empleando los cebadores de amplificación de ácidos nucleicos. Cuando se usan cebadores lineales marcados, el tratamiento con exonucleasa o mediante el uso de una temperatura específica elimina la necesidad de separación de los cebadores no incorporados. Este formato de "tubo cerrado" reduce en gran medida la posibilidad de transmitir contaminación con los productos de amplificación, proporciona un alto rendimiento de muestras y puede automatizarse totalmente.

La Patente de Estados Unidos Nº 4.766.062 de Diamond et al. describe un reactivo de diagnóstico que contiene un complejo de una sonda polinucleotídica unida a través de enlaces de hidrógeno de purina/pirimidina a un polinucleótido marcado. La sonda contiene una región de unión diana que puede unirse a una secuencia diana de una muestra biológica. La Patente de Estados Unidos Nº 4.766.062 describe además un método en el que el contacto con una muestra que contiene la secuencia de nucleótidos diana origina la unión, inicialmente entre la diana y una porción monocatenaria de la región de unión a la diana. Posteriormente, el polinucleótido marcado se desplaza del complejo por migración de ramificaciones dentro de la región de unión. La determinación del polinucleótido marcado desplazado da un valor que es una función de la presencia y concentración de la secuencia de nucleótidos diana en la muestra.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.451.503 de Hogan et al., que se trata con mas detalle en la sección de realizaciones preferidas que se presenta mas adelante, enseña sondas de hibridación de ácidos nucleicos que tienen al menos una cadena de ácido nucleico que tiene al menos dos regiones especificas diana separadas que hibridan con una secuencia de ácido nucleico diana, y al menos dos regiones de brazo distintas que no hibridan con el ácido nucleico diana pero poseen regiones complementarias que pueden hibridar entre sí. Estas regiones están diseñadas de tal manera que, en las condiciones de hibridación apropiadas, las regiones de brazo complementarias no hibridarán entre sí en ausencia del ácido nucleico diana; pero en presencia del ácido nucleico diana, las regiones con especificidad de diana de la sonda hibridarán con el ácido nucleico diana, y las regiones de brazo complementarias hibridarán entre sí, formando de esta manera una estructura de ácido nucleico ramificada que es útil para la detección de la secuencia de ácido nucleico diana.

Aunque los métodos mencionados anteriormente son menos complicados de realizar que los métodos de detección con una sonda oligonucleotídica sencilla tal como los descritos por Sambrook et al. en los que se usan sondas oligonucleotídicas para dirigirse a ácidos nucleicos que están inmovilizados sobre un filtro o una membrana, se presentan algunas limitaciones. Por ejemplo, un método que es fácil de realizar tal como el descrito por Livak et al. puede producir resultados falsos positivos, ya que la hibridación con secuencias no diana también producirá, en algunos casos, un resultado positivo.

En general, los métodos anteriores se caracterizan por una baja señal y un alto efecto de interferencia. Hogan et al. enseña la amplificación de señales por reciclado de plantilla y la reducción del efecto de interferencia por medio de la selección apropiada de la longitud de las regiones de brazo de los oligonucleótidos empleados de este modo. Los métodos destinados a producir resultados más precisos algunas veces son más complicados de realizar. Sin embargo, como se demuestra y se ejemplifica adicionalmente mas adelante, aún se requieren métodos mejorados para la amplificación de la señal y la reducción de las interferencias.

De esta manera, la presente invención describe nuevos oligonucleótidos que pueden utilizarse en un método de detección homogéneo de secuencias de ácido nucleico diana, dependiendo este método de la generación de un sitio de escisión especifico en un oligonucleótido cambiado conformacionalmente, hibridado, y de este modo, la presente invención proporciona un método sencillo para detectar ácidos nucleicos diana y que retiene al mismo tiempo un alto nivel de especificidad.

Compendio de la invención

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un par de oligonucleótidos útil para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo el par de oligonucleótidos un oligonucleótido de anclaje y un oligonucleótido amplificador, incluyendo cada uno de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador una primera región que es capaz de hibridar con la secuencia de ácido nucleico diana, incluyendo además cada uno de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador una segunda región, siendo capaz dicha segunda región de dicho oligonucleótido de anclaje y dicho oligonucleótido amplificador de formar una estructura dúplex que incluye una secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos después de la hibridación de dichas primeras regiones de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador con la secuencia de ácido nucleico diana, donde dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador se seleccionan de tal manera que cuando hibridan con la secuencia de ácido nucleico diana en presencia de un agente de escisión de ácidos nucleicos que reconoce dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos, sólo se escinde dicho oligonucleótido amplificador por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos, conduciendo dicha escisión de dicho oligonucleótido amplificador a la disociación de dicho oligonucleótido amplificador de la secuencia de ácido nucleico diana mientras que dicho oligonucleótido de anclaje permanece hibridado con la secuencia de ácido nucleico diana para formar un híbrido estabilizado de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana, permitiendo de esta forma que un segundo oligonucleótido amplificador no escindido hibride con dicho híbrido de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana permitiendo de esta forma el reciclado de dicho híbrido de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana con respecto a dicho oligonucleótido amplificador.

Preferiblemente, en condiciones de hibridación predeterminadas, dicha primera región de dicho oligonucleótido amplificador puede hibridar de forma estable con dicha secuencia de ácido nucleico diana sólo si dicha primera región de dicho oligonucleótido de anclaje puede hibridar de manera estable con dicha secuencia de ácido nucleico diana.

Preferiblemente, al menos un nucleótido o enlace internucleotídico de dichos oligonucleótidos de anclaje que forman parte de dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos incluye una modificación seleccionada para prevenir la escisión de dicho oligonucleótido de anclaje por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos.

Preferiblemente, dicha estructura dúplex se forma en parte por auto-hibridación de una porción de dicha segunda región de dicho oligonucleótido amplificador.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un kit útil para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo el kit oligonucleótido de anclaje y oligonucleótido amplificador, incluyendo cada uno de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador una primera región única que es capaz de hibridar con la secuencia de ácido nucleico diana, incluyendo además cada uno de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador una segunda región, siendo capaces dichas segundas regiones de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador de formar una estructura dúplex que incluye una secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos después de la hibridación de dichas primeras regiones de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador con la secuencia de ácido nucleico diana, donde dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador se seleccionan de tal forma que cuando hibridan con la secuencia de ácido nucleico diana en presencia de un agente de escisión de ácidos nucleicos que reconoce dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos, sólo se escinde dicho oligonucleótido amplificador por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos, conduciendo dicha escisión de dicho oligonucleótido amplificador a la disociación de dicho oligonucleótido amplificador de la secuencia de ácido nucleico diana mientras que dicho oligonucleótido de anclaje permanece hibridado con la secuencia de ácido nucleico diana para formar un híbrido estabilizado de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana, permitiendo de esta manera que un segundo oligonucleótido amplificador no escindido hibride con dicho híbrido de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana, lo cual permite el reciclado de dicho híbrido de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana con respecto a dichos oligonucleótidos amplificadores.

Preferiblemente, en condiciones de hibridación predeterminadas, dicha primera región de dicho oligonucleótido amplificador puede hibridar de forma estable con dicha secuencia de ácido nucleico diana sólo si dicha primera región de dicho oligonucleótido de anclaje puede hibridar de forma estable con dicha secuencia de ácido nucleico diana.

Preferiblemente, la cantidad de dicho oligonucleótido amplificador es 250 nM y la cantidad de dicho oligonucleótido de anclaje es 50 nM.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo el método las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra con un sistema de oligonucleótidos en condiciones de hibridación para formar una mezcla de reacción, incluyendo dicho sistema de oligonucleótidos un oligonucleótido de anclaje y un oligonucleótido amplificador, incluyendo cada uno de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador una primera región que es capaz de hibridar con la secuencia de ácido nucleico diana, incluyendo además cada uno de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador una segunda región, siendo capaz dicha segunda región de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador de formar una estructura dúplex que incluye una secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos después de la hibridación de dichas primeras regiones de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador con la secuencia de ácido nucleico diana, donde dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador se seleccionan de tal forma que cuando hibridan con la secuencia de ácido nucleico diana en presencia de un agente de escisión de ácidos nucleicos que reconoce dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos, sólo se puede escindir dicho oligonucleótido amplificador por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos, conduciendo la escisión de dicho oligonucleótido amplificador a la disociación de dicho oligonucleótido amplificador de la secuencia de ácido nucleico diana mientras que dicho oligonucleótido de anclaje permanece hibridado con la secuencia de ácido nucleico diana para formar un híbrido estabilizado de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana, permitiendo de esta manera que un segundo oligonucleótido amplificador no escindido hibride con dicho híbrido de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana, lo cual permite el reciclado de dicho híbrido de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana con respecto a dicho oligonucleótido amplificador;

(b) añadir dicho agente de escisión de ácidos nucleicos a dicha mezcla de reacción en condiciones de reacción predeterminadas de tal forma que, si la secuencia de ácido nucleico diana esta presente en la muestra, dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos se escinde por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos; y

(c) controlar la escisión de dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos; donde la escisión de dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos indica hibridación del sistema de oligonucleótidos con la secuencia de ácido nucleico diana y, por lo tanto, la presencia del ácido nucleico diana en la muestra.

Preferiblemente, en dichas condiciones de hibridación, dicha primera región de dicho oligonucleótido amplificador puede hibridar de forma estable con dicha secuencia de ácido nucleico diana solo si dicha primera región de dicho oligonucleótido de anclaje puede hibridar de forma estable con dicha secuencia de ácido nucleico diana.

Preferiblemente, al menos un nucleótido o enlace internucleotídico de dicho oligonucleótido de anclaje que forma una parte de dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos incluye una modificación seleccionada para prevenir la escisión de dicho oligonucleótido de anclaje por dicho agente de escisión de ácido nucleico.

Preferiblemente, dicha estructura dúplex se forma en parte por auto-hibridación de una porción de dicha segunda región de dicho oligonucleótido amplificador.

Preferiblemente, una secuencia de dicha primera región de dicho oligonucleótido de anclaje se selecciona de tal manera que dicho oligonucleótido de anclaje permanezca hibridado con dicha secuencia de ácido nucleico diana en dichas condiciones de reacción predeterminadas, mientras que dicha secuencia de dicha primera región de dicho oligonucleótido amplificador se selecciona de tal manera que dicho oligonucleótido amplificador se disocie de dicha secuencia de ácido nucleico diana en dichas condiciones de reacción predeterminadas, después de la escisión de dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos.

Preferiblemente, la Tm de dicha primera región de dicho oligonucleótido de anclaje es mayor que la Tm de dicha primera región de dicho oligonucleótido amplificador.

La presente invención trata de forma satisfactoria los defectos de las configuraciones conocidas actualmente proporcionando oligonucleótidos o conjuntos de oligonucleótidos que permiten una detección sencilla y eficaz de secuencias de ácido nucleico diana reduciendo al mismo tiempo el orden de reacción o la generación de señales de interferencia.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describe en este documento, sólo a modo de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos adjuntos. Haciendo referencia específica ahora a los dibujos con detalle, se subraya que las particularidades mostradas son a modo de ejemplo y sólo tienen el fin de describir de manera ilustrativa las realizaciones preferidas de la presente invención, y se presentan para proporcionar lo que se considera la descripción más útil y más comprensible de los principios y aspectos conceptuales de la invención. A este respecto, no se intentan mostrar detalles estructurales de la invención con más detalle del necesario para una comprensión fundamental de la invención, esclareciendo la descripción considerada con los dibujos a los especialistas en la técnica cómo pueden poner en práctica las diversas formas de la invención.

En los dibujos:

La Fig. 1 es una representación esquemática que muestra las etapas de un método de detección de acuerdo con un aspecto preferido de la presente invención.

La Fig. 2 representa la estructura de un solo oligonucleótido y un conjunto de nucleótidos de la presente invención cuando hibridan con una secuencia de ácido nucleico diana.

Las Fig. 3a-b representan la estructura de dominios y regiones de un oligonucleótido emparejado (Figura 3a) y un oligonucleótido con bucle (Figura 3b) de acuerdo con la presente invención, que muestra la temperatura de fusión (Tm) y la energía libre (\DeltaG) de las regiones de hibridación diana (primera y segunda regiones) y las regiones de formación de tallo (tercera y cuarta regiones).

La Fig. 4 es un mapa de restricción que muestra las regiones de las diversas preparaciones de ADN de CMV (1-8) procedentes de un fragmento de plantilla de ADN de CMV de 263 pb y que se usaron como secuencias de ácido nucleico diana mientras se reducía la presente invención a la práctica. Las flechas indican el sitio de escisión enzimática. A = AflII; D = DdeI; F = Fnu4HI; H = HaeIII.

Las Fig. 5a-e son fotografías de geles de poliacrilamida nativos al 12,5% que representan los efectos de las regiones de tallo y brazo sobre la hibridación de sondas oligonucleotídicas biotiniladas emparejas al ADN de CMV. Los oligonucleótidos biotinilados se visualizaron como se describe en la sección de Ejemplos que se presenta más adelante. El número en la parte inferior de cada calle representa la temperatura de incubación de hibridación. Asterisco - señal de biotina.

La Fig. 6 es una fotografía de un gel de poliacrilamida nativo al 12,5% que representa el efecto de la longitud de la región de brazo sobre el reciclado de ADN de CMV por sondas oligonucleotídicas emparejadas. El par 2 y el par 3 se incubaron en presencia (+) o en ausencia (-) de ADN plantilla. Después de la etapa de hibridación, a cada tubo se le añadieron 0,17 unidades/\mul de BstBI y se dejó que continuara la escisión durante dos horas. Los fragmentos biotinilados se visualizaron como se describe en la sección de Ejemplos que se presenta mas adelante. Asterisco - señal de biotina.

La Fig. 7 es una fotografía de un gel de poliacrilamida nativo al 12,5% que representa la separación cromatográfica de una sola sonda oligonucleotídica con bucle, prehibridada con ADN plantilla (+) o no prehibridada (-) y escindida por TaqI (T) BstBI (B) o no escindida (H). Asterisco - señal de biotina.

Las Fig. 8a-b son fotografías de geles de poliacrilamida nativos al 12,5% que representan la separación cromatográfica de un oligonucleótido biotinilado con bucle hibridado y no hibridado que ha reaccionado con un ADN diana bicatenario largo (p.CMV-263.ds, Tabla 1) (Figura 8a) o un ADN diana bicatenario mas corto (p.CMV-2.st, Tabla 1) (Figura 8b). El oligonucleótido biotinilado se visualizó como se describe en la sección de Ejemplos que se presenta mas adelante. El número en la parte superior de cada calle representa la temperatura de incubación de hibridación. Asterisco - señal de biotina.

Las Fig. 9a-b son fotografías de geles de poliacrilamida nativos al 12,5% que representan la separación cromatográfica de oligonucleótidos biotinilados con bucle que han reaccionado con ADN diana monocatenario (CMV-2.st antisentido, Tabla 1) o con ADN diana bicatenario de la misma longitud (syn.CMV-2.st, Tabla 1). El oligonucleótido biotinilado y los productos de hibridación se visualizaron como se describe en la sección de Ejemplos que se presenta mas adelante. Asterisco - señal de biotina.

Las Fig. 10a-c son fotografías de geles de poliacrilamida al 12,5% que representan la separación cromatográfica de una sonda oligonucleotídica con bucle después de la hibridación con concentraciones decrecientes de ADN diana monocatenario y después de la escisión enzimática. El ensayo constaba de dos series idénticas de 7 tubos, cada uno suplementado con cantidades decrecientes de ADN diana de CMV monocatenario (35 nucleótidos de longitud) (CMV-2.st antisentido, Tabla 1). Las relaciones molares entre CMV-2.st antisentido y las sondas oligonucleotídicas con bucle fueron 1:1, 1:4, 1:10, 1:40, 1:100 y 1:400 en los tubos 1 a 6, respectivamente. No se añadió ningún ADN de CMV al tubo número 7. La figura 10a representa muestras al final de una etapa de hibridación. La figura 10b representa muestras después de la escisión del oligonucleótido durante dos horas y la separación en condiciones desnaturalizantes para detectar fragmentos biotinilados monocatenarios. La Figura 10c representa muestras idénticas a las de la Figura 10b pero separadas en un gel nativo, para detectar tanto los fragmentos bicatenarios como los fragmentos monocatenarios. Los fragmentos biotinilados se visualizaron como se describe en le sección de Ejemplos que se presenta mas adelante. Asterisco - señal de biotina.

Las Fig. 11a-c ilustran el efecto de anclajes oligonucleotídicos largos y cortos sobre la acumulación de producto escindido. Se transfirió una electroforesis en gel de poliacrilamida al 12,5% de miembros diana y de sonda después de la escisión, sobre una membrana (Figura 11a) que se exploró y analizó. Las Figuras 11b-c ilustran la eficacia de escisión (Figura 11b) y el aumento en la escisión del miembro de oligonucleótido amplificador (Figura 11c) cuando se utilizaron miembros de anclaje más largos.

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La Fig. 12 es un gráfico que ilustra el producto de escisión del amplificador en función de la concentración de ADN diana; los factores de amplificación se presentan a la derecha de cada punto. El recuadro ilustra una separación en gel de poliacrilamida desnaturalizante al 15% de muestras que contienen 0,2 amol, 20 amol, 200 amol, 2 fmol y 20 fmol de la diana.

Descripción de las realizaciones preferidas

La presente invención se refiere a oligonucleótidos y a un método que los emplea que puede usarse para la detección de secuencias de ácido nucleico diana. Específicamente, la presente invención puede usarse para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana específica utilizando sondas oligonucleotídicas que cuando se hibridan con la secuencia o secuencias plantilla forman un sitio de escisión intrínseco (endógeno) entre ellas. La posterior escisión de este sitio de escisión conduce a la generación de una señal detectable y también puede disociar uno o más de los oligonucleótidos de la secuencia de ácido nucleico diana, y de esta manera permite el reciclado de la plantilla y la amplificación de la señal.

Los principios y el funcionamiento de los oligonucleótidos y métodos de acuerdo con la presente invención pueden entenderse mejor haciendo referencia a los dibujos y descripciones adjuntas.

Antes de explicar al menos una realización de la invención con detalle, debe entenderse que la invención no se limita en su aplicación a los detalles indicados en la siguiente descripción o ejemplificados por los Ejemplos. La invención puede tener otras realizaciones o puede ponerse en práctica o realizarse de diversas formas. Además, debe entenderse que la fraseología y terminología empleadas en este documento sólo tienen fines descriptivos y no deben considerarse limitantes.

Como se usa en este documento, los términos "oligonucleótido" y "sonda" y la frase "sonda oligonucleotídica" se usan indistintamente para hacer referencia a una molécula de ácido nucleico monocatenaria o conjunto de moléculas de ácido nucleico monocatenarias que pueden presentar una o más conformaciones bicatenarias parciales. Esta molécula o moléculas pueden usarse de acuerdo con la presente invención para la detección de la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana monocatenaria o bicatenaria (después de la desnaturalización apropiada) como se describe con más detalle en este documento.

Como se usa a lo largo de este documento, el término "plantilla" o la frase "secuencia de ácido nucleico diana" se refiere a una plantilla de ácido nucleico que está naturalmente en forma monocatenaria, tal como un ARN mensajero, o está desnaturalizada en una forma monocatenaria, tal como ADN. La secuencia de ácido nucleico diana de acuerdo con la presente invención puede estar en una forma bruta, parcialmente purificada o purificada y puede tener un grado variable de complejidad dependiendo de su origen. Como se usa en este documento, una secuencia de ácido nucleico diana específica puede diferir de otra secuencia de ácido nucleico diana específica en un solo nucleótido, por ejemplo, una mutación puntual, o en una pluralidad de nucleótidos.

En este documento, la frase "complementario o sustancialmente complementario" se refiere a secuencias que pueden formar pares de bases en condiciones de hibridación predeterminadas de temperatura e intensidad iónica y/o la presencia de la plantilla. "Sustancialmente complementario" se refiere a una complementariedad de al menos 50%, preferiblemente una complementariedad de al menos 60%, mas preferiblemente una complementariedad de al menos 70%, y aún mas preferiblemente una complementariedad de al menos 80%, ventajosamente una complementariedad comprendida entre 90% y 100%.

Como se detalla adicionalmente mas adelante, para permitir la detección, el oligonucleótido o el conjunto de oligonucleótidos de la presente invención preferiblemente se señala con un resto o restos de detección. Sin embargo, se apreciara, y se detalla adicionalmente mas adelante, que la detección de acuerdo con la presente invención también puede realizarse sin la incorporación de estos restos de detección en esos oligonucleótidos.

Los siguientes párrafos describen sondas oligonucleotídicas que se enseñan por la técnica anterior pero que se usan de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención con ciertas restricciones que se subrayarán adicionalmente mas adelante, dando resultando estas restricciones una detección bastante superior de los ácidos nucleicos diana debido a la amplificación de señales y/o la reducción de la señal de interferencia.

De esta manera, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un oligonucleótido o un conjunto de oligonucleótidos útil para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra. El oligonucleótido o el conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con este aspecto de la presente invención puede formar una estructura dúplex intrínseca para el oligonucleótido o el conjunto de oligonucleótidos tras la hibridación con la secuencia de ácido nucleico diana, lo que significa que la estructura dúplex formada como resultado de la hibridación de la plantilla incluye sólo secuencias aportadas por el oligonucleótido o el conjunto de oligonucleótidos.

La estructura dúplex formada de esta manera incluye una secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos (sitio), de tal forma que la escisión posterior de este sitio es detectable, por ejemplo, por la producción de una señal detectable. Los puntos específicos de una reacción de detección, incluyendo condiciones y soluciones preferidas y relaciones preferidas de secuencia de ácido nucleico diana-oligonucleótido(s), y similares, se describen con más detalle a lo largo de la sección de Ejemplos que se presenta mas adelante en el contexto de una diversidad de oligonucleótidos particulares que corresponden a los criterios anteriores.

Una configuración típica del oligonucleótido o el conjunto de oligonucleótidos de la presente invención incluye una primera región y una segunda región. Al menos una porción de la primera región y al menos una porción de la segunda región son complementarias independientemente a al menos una porción de la secuencia de ácido nucleico diana. Es decir, porciones de la secuencia de ácido nucleico diana pueden co-hibridar con al menos una porción de la primera región y al menos un porción de la segunda región al mismo tiempo. De esta manera, al menos una porción de la primera región y al menos una porción de la segunda región hibridan con subregiones diferentes, típicamente adyacentes, de la secuencia de ácido nucleico diana.

El oligonucleótido o el conjunto de oligonucleótidos de este aspecto de la presente invención incluye además una tercera región y una cuarta región que están unidas respectivamente, directamente o a través de una región espaciadora de, por ejemplo, 1-6 bases de nucleótido, a la primera región y la segunda región, preferiblemente a través de un enlace fosfodiéster covalente o un análogo del mismo.

La tercera y cuarta regiones están configuradas de tal manera que tras la hibridación de la primera región y la segunda región con la secuencia de ácido nucleico diana, al menos una porción de la tercera región y al menos una porción de la cuarta región hibridan para formar una estructura dúplex entre ellas. Esta estructura dúplex incluye una secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos que se describe con mas detalle mas adelante en este documento y en la sección de Ejemplos que se presenta posteriormente.

La escisión de la secuencia de reconocimiento por un agente de escisión de ácidos nucleicos apropiado conduce a la separación de al menos una porción de al menos una de la tercera y cuarta regiones de la primera y segunda regiones, respectivamente.

Como se detalla adicionalmente más adelante, esta escisión y separación, que tiene lugar de acuerdo con la presente invención sustancialmente sólo o preferiblemente en casos en los que el oligonucleótido o el conjunto de oligonucleótidos hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana, se usa para detectar la presencia de esa secuencia de ácido nucleico diana específica.

Se apreciará que como la primera y la segunda regiones del oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos son responsables de la hibridación con una secuencia de ácido nucleico plantilla especifica, estas regiones se sintetizan en consecuencia para reconocer e hibridar con la secuencia de ácido nucleico diana. De esta forma, cuando se sintetizan sondas de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, la primera y segunda regiones deben diseñarse de acuerdo con la secuencia de ácido nucleico diana específica que se desea detectar. Por otra parte, como la tercera y cuarta regiones son responsables de la formación del dúplex intrínseco y la secuencia de reconocimiento de agente de escisión, estas regiones típicamente son universales y de esta manera pueden utilizarse por muchos oligonucleótidos específicos de la presente invención. Sin embargo, hay casos en los que la tercera y cuarta regiones "universales" no pueden usarse con una primera y segunda regiones específicas diana; por ejemplo, cuando este uso no es energéticamente favorable o cuando la secuencia de reconocimiento de agente de escisión incluida dentro del dúplex también esta presente en la primera y/o la segunda regiones cuando hibridan con la diana. En estas circunstancias, la tercera y cuarta regiones deben rediseñarse de manera conveniente.

De acuerdo con una realización de la presente invención, el conjunto de oligonucleótidos es un oligonucleótido bimolecular que incluye dos moléculas oligonucleotídicas, de tal forma que un primer oligonucleótido del conjunto incluye la primera y tercera regiones mencionadas anteriormente y además de tal forma que un segundo oligonucleótido del conjunto incluye la segunda y cuarta regiones mencionadas anteriormente.

De acuerdo con otra realización de la presente invención, se emplea una sola molécula oligonucleotídica. En este caso, la tercera y cuarta regiones están unidas entre sí, preferiblemente a través de un enlace fosfodiéster covalente, de tal forma que se forma una estructura de tallo y bucle por la tercera y cuarta regiones cuando al menos una porción de la tercera región y al menos una porción de la cuarta región hibridan para formar el dúplex descrito anteriormente.

De acuerdo con otra realización de la presente invención, tanto la primera como la segunda región del oligonucleótido se disocian de la secuencia de ácido nucleico diana tras la separación de al menos una porción de la tercera y cuarta regiones de la primera región y la segunda región. En este caso, la escisión y la posterior separación de la tercera o cuarta regiones, o ambas, conduce a la disociación de la primera y/o segunda regiones de la secuencia de ácido nucleico diana. Esta disociación permite que una segunda molécula oligonucleotídica idéntica hibride con la secuencia de ácido nucleico diana y entre en un proceso similar de escisión y separación.

Se apreciará que en el caso de una sonda bimolecular en la que la tercera y cuarta regiones no están unidas entre sí, su separación de la primera y segunda regiones, respectivamente, después de la escisión no es interdependiente.

Según se ha descrito hasta el momento actual, las sondas oligonucleotídicas anteriores que se describen adicionalmente y cuyo uso se ejemplifica en el Ejemplo 3 con el título "Sondas emparejadas-Primera generación" y en el Ejemplo 6, con el título "Sondas individuales-Primera generación" son similares en estructura y función a las sondas oligonucleotídicas descritas por Hogan et al., (Patente de Estados Unidos Nº 5.451.503).

Aunque estas configuraciones de sondas oligonucleotídicas pueden utilizarse para la detección de secuencias de ácido nucleico diana, tendrán varias limitaciones intrínsecas tales como, por ejemplo, una baja generación de señales y escisión independiente de plantilla y generación de señales.

De esta manera, mientras se reducía la presente invención a la práctica, los inventores experimentaron con diversas configuraciones de sondas oligonucleotídicas en un esfuerzo por superar las limitaciones intrínsecas a las sondas oligonucleotídicas descritas anteriormente en este documento y en la Patente de Estados Nº 5.451.503.

Como se describe adicionalmente en los Ejemplos 3-6 presentados más adelante, la experimentación realizada por los inventores de la presente invención produjo nuevas configuraciones de sonda que (i) permiten reducir sustancialmente la escisión independiente de plantilla; (ii) reducen el orden de reacción; (iii) permiten el reciclado de la plantilla y la amplificación de la señal.

De esta manera, de acuerdo con un aspecto preferido actualmente de la presente invención, y como se describe específicamente en el Ejemplo 6 de la sección de Ejemplos que se presenta más adelante (véanse las secciones "Variantes de sonda con bucle" y "Sondas bloqueadas"), se proporciona una sonda oligonucleotídica individual o una sonda oligonucleotídica bimolecular (sistema o conjunto de oligonucleótidos) que están configuradas para formar una primera estructura dúplex que carece de la secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos cuando no hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana, mientras que después de la hibridación forma una segunda estructura dúplex que incluye una secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos.

Esta característica de este aspecto de la presente invención se posibilita diseñando la sonda de tal forma que después de la hibridación con la secuencia diana, la primera estructura dúplex esté menos favorecida energéticamente que una segunda estructura dúplex. Esto asegura que la primera estructura dúplex sólo se forma en ausencia de la secuencia de ácido nucleico diana. Como se detalla adicionalmente y como se ejemplifica en el Ejemplo 6, la formación de esta primera estructura dúplex que carece de la secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos reduce sustancialmente la señal de interferencia generada por el dúplex independiente diana y la formación del sitio de escisión que puede producirse cuando se utilizan las sondas descritas, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.451.503.

Como se detallada adicionalmente en los Ejemplos 3-4 de la sección de Ejemplos que se presenta más adelante, una sonda oligonucleotídica bimolecular preferida de la presente invención se configura de tal manera que la hibridación con la plantilla de un primer miembro de oligonucleótido de la sonda bimolecular depende de la hibridación precedente con la plantilla de un segundo miembro de oligonucleótido de la sonda bimolecular que preferiblemente sirve como anclaje no reciclado o permanente.

De esta manera, y de acuerdo con otro aspecto preferido actualmente de la presente invención, se proporciona una sonda bimolecular que está configurada de tal manera que la región complementaria diana de uno de sus miembros de oligonucleótido se selecciona para permitir su hibridación sólo después de la hibridación del otro miembro de oligonucleótido con la diana, para reducir de esta manera el orden de reacción global en una sola unidad o cerca de una sola unidad. A este respecto, se apreciará que el oligonucleótido que se selecciona para hibridar de forma estable con la diana se recicla junto con la diana. No se requiere ninguna hibridación/disociación adicional del mismo para mantener la hibridación/disociación del otro oligonucleótido y, por lo tanto, se reduce el orden de reacción, aumenta su especificidad y se amplifica la señal generada. Además, esta configuración redujo en una gran medida el agotamiento de diana monocatenaria debido a la reasociación de la diana.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la sonda bimolecular está diseñada de tal forma que después de la hibridación de los dos miembros de oligonucleótido, sólo el primer miembro de oligonucleótido de la sonda oligonucleotídica bimolecular se escinde por el agente de escisión (véase SpltRE y ModRE/MutRE del Ejemplo 3). Como resultado de esta escisión, sólo este miembro de oligonucleótido se disocia de la plantilla mientras que el otro miembro de oligonucleótido no escindido permanece anclado a la plantilla y se recicla con la misma para efectuar la reducción del orden de reacción.

Preferiblemente, en este caso, la región complementaria diana del miembro de oligonucleótido no escindible se selecciona de forma que tenga una temperatura de fusión mayor que la del miembro de oligonucleótido escindible, para permitir que este miembro permanezca hibridado con la plantilla después de la disociación del primer miembro de oligonucleótido.

Para permitir la escisión de un solo miembro, los conjuntos oligonucleotídicos bimoleculares de la presente invención pueden configurarse de tal forma que se forme una porción de la estructura dúplex por auto-hibridación de una porción del miembro de oligonucleótido escindible que no participa en la hibridación con la diana (véase la Figura 1). Entonces, la porción de la estructura dúplex formada puede incluir al menos una porción de la secuencia de reconocimiento de agente de escisión que permite, de esta manera, la escisión únicamente del oligonucleótido del conjunto de oligonucleótidos bimolecular que forma dicha auto-hibridación mientras que el otro oligonucleótido sirve como un anclaje similar al descrito anteriormente en este documento. En este caso, el dúplex escindible está diseñado para incluir un corte que reemplaza a uno de los enlaces internucleotídicos escindibles por el agente de
escisión.

Como alternativa, la secuencia de reconocimiento de agente de escisión en el oligonucleótido no escindible puede incluir al menos un nucleótido o enlace internucleotídico modificado, bloqueando de esta manera la escisión de una cadena deseada del dúplex.

Además, como alternativa, puede emplearse una endonucleasa caracterizada por una actividad de corte una sola cadena del ADN bicatenario (en lugar de la actividad de restricción completa de corte doble), siempre que los oligonucleótidos incluyan la secuencia de reconocimiento apropiada. Un ejemplo de dicha endonucleasa es N.BstNBI distribuida por New England Biolabs.

Por ejemplo, puede emplearse cualquiera de varios modificadores de los que algunos se indican más adelante en este documento, durante o después de la síntesis del oligonucleótido para construir una secuencia de reconocimiento de agente de escisión que se reconozca por un agente de escisión específico pero que se escinda sólo en una cadena del dúplex. En el caso de un agente de escisión de endonucleasa, la secuencia de reconocimiento de la cadena no escindible puede incluir metilación o acetilación en uno o más de los nucleótidos incluidos dentro de la secuencia de reconocimiento, de tal manera que una endonucleasa específica reconozca y se una a la secuencia de reconocimiento bicatenaria pero sólo escinda (corte) la cadena no modificada.

En otra realización de la presente invención se mantiene el orden de reacción de una sonda oligonucleotídica bimolecular, sin embargo, los miembros de oligonucleótido de la sonda se seleccionan de manera que, en una gran medida, reduzcan el nivel de interacciones bimoleculares entre los miembros de oligonucleótido entre sí o entre cualquiera de los miembros y la secuencia de ácido nucleico diana. Como resultado, se reduce significativamente el nivel de interferencias y también se consigue un reciclado de la plantilla después de la escisión, dando como resultado una detección mucho mejor y específica.

Los siguientes párrafos describen varios aspectos de la presente invención que se distinguen claramente y son claramente ventajosos con respecto a la técnica anterior, y a la Patente de Estados Unidos Nº 5.451.503 en particular, ya que cada uno proporciona (i) amplificación de señal por reducción del orden de reacción; (ii) amplificación de señal por reciclado de la plantilla; y/o (iii) reducción de la interferencia por prevención de la escisión independiente de la plantilla.

De esta manera, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos útil para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo el oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con este aspecto de la presente invención una primera región y una segunda región. Al menos una porción de la primera región y al menos una porción de la segunda región pueden hibridar en condiciones de hibridación predeterminadas con la secuencia de ácido nucleico diana. El oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con este aspecto de la presente invención comprende además una tercera región y una cuarta región. La tercera región y la cuarta región están unidas a la primera región y la segunda región, respectivamente. Se selecciona una primera porción y una segunda porción del oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos capaces de forma una primera estructura dúplex entre ellas en las condiciones de hibridación predeterminadas. Preferiblemente, la primera porción y la segunda porción del oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos que pueden formar la primera estructura dúplex entre ellas en las condiciones de hibridación predeterminadas derivan de la tercera y cuarta regiones, respectivamente. En cualquier caso, la primera, segunda, tercera y cuarta regiones del oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos de este aspecto de la presente invención se seleccionan de tal forma que tras la hibridación en las condiciones de hibridación predeterminadas de la primera región y la segunda región con la secuencia de ácido nucleico diana, la primera estructura dúplex se disocie y una porción de la tercera región y una porción de la cuarta región formen una segunda estructura dúplex entre ellas. La segunda estructura dúplex incluye una secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos que está ausente en la primera estructura dúplex y que, cuando se escinde, indica hibridación del oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos con la secuencia de ácido nucleico diana y, por lo tanto, indica la presencia del ácido nucleico diana en la muestra. Como resultado, se reduce en gran medida la señal de interferencia asociada con la escisión independiente de la plantilla. En una realización preferida de este aspecto de la presente invención, la primera, segunda, tercera y cuarta regiones del oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos se seleccionan adicionalmente de tal forma que después de la escisión de la secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos, la primera y segunda regiones se disocien de la secuencia de ácido nucleico diana, permitiendo de esta manera el reciclado de la secuencia de ácido nucleico diana y la amplificación y de la señal.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema de oligonucleótidos útil para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra. El sistema de oligonucleótidos de acuerdo con este aspecto de la invención comprende al menos un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, de los que cada uno incluye una primera región capaz de hibridar con la secuencia de ácido nucleico diana en condiciones de hibridación predeterminadas. Cada uno del primer oligonucleótido y el segundo oligonucleótido incluye además una segunda región, donde tras la hibridación, al menos una porción de las segundas regiones del primer y segundo oligonucleótidos forman una estructura dúplex que incluye una secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos, por lo que las segundas regiones del primer oligonucleótido y el segundo oligonucleótido se seleccionan de tal forma que en presencia de un agente de escisión de ácidos nucleicos que reconoce la secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos, sólo se puede escindir el primer oligonucleótido por el agente de escisión de ácidos nucleicos. En este caso, la selección del segundo oligonucleótido que tenga suficiente estabilidad para hibridar con la secuencia de ácido nucleico diana en ausencia del primer oligonucleótido daría como resultado la reducción del orden de reacción, contribuyendo a un aumento en la formación de la señal. De esta manera, preferiblemente, la primera y segunda regiones del primer y segundo oligonucleótidos se seleccionan de tal forma que después de la escisión de primer oligonucleótido, la primera región del primer oligonucleótido se disocia de la secuencia de ácido nucleico diana. Preferiblemente, la primera región del segundo oligonucleótido se selecciona de tal forma que en las condiciones de hibridación predeterminadas y después de la disociación del primer oligonucleótido, la primera región del segundo oligonucleótido permanece hibridada con la secuencia de ácido nucleico diana, permitiendo de esta manera el reciclado de la secuencia de ácido nucleico diana con respecto al primer
oligonucleótido.

De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un sistema de oligonucleótidos útil para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra. El sistema de oligonucleótidos comprende al menos un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, de los que cada uno incluye una primera región que es complementaria o sustancialmente complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y cada uno incluye además una segunda región, siendo las segundas regiones complementarias o sustancialmente complementarias y seleccionándose de tal manera que tras su hibridación, forman una estructura dúplex que incluye una secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos, con lo que en condiciones de hibridación predeterminadas, la primera región del primer oligonucleótido puede hibridar de forma estable con la secuencia de ácido nucleico diana sólo si la primera región del segundo oligonucleótido puede hibridar de forma estable con la secuencia de ácido nucleico diana, reduciéndose de esta manera el orden de reacción, reduciéndose la señal de interferencia y aumentando la especificidad. En este caso, el reciclado de la plantilla se permite seleccionando el otro oligonucleótido de tal manera que después de su restricción, se libere de la diana. Preferiblemente, en las condiciones de hibridación predeterminadas, las segundas regiones del primer y segundo oligonucleótidos son sustancialmente no hibridables entre sí per se, de forma que se reduce adicionalmente la señal de interferencia. Preferiblemente, las segundas regiones del primer oligonucleótido y el segundo oligonucleótido se seleccionan de tal manera que en presencia de un agente de escisión de ácidos nucleicos que reconoce la secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos, sólo se puede escindir el primer oligonucleótido por el agente de escisión de ácidos nucleicos. Ventajosamente, la primera y segunda regiones del primer y segundo oligonucleótidos se seleccionan de tal forma que, en las condiciones de hibridación predeterminadas y tras la escisión del primer oligonucleótido, la primera región del primer oligonucleótido se disocia de la secuencia de ácido nucleico diana. Ventajosamente, al menos un nucleótido o enlace internucleotídico del segundo oligonucleótido que forma parte de la secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos es un nucleótido o enlace internucleotídico modificado o análogo seleccionado para prevenir la escisión del segundo oligonucleótido por el agente de escisión de ácido nucleico. Opcionalmente, la estructura dúplex se forma en parte por auto-hibridación de una porción de la segunda región del primer oligonucleótido. Preferiblemente, las segundas regiones del primer y segundo oligonucleótidos se seleccionan de tal forma que la secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos se caracterice por un corte que reemplaza a un enlace internucleotídico escindible por el agente de escisión de ácidos nucleicos.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema de oligonucleótidos útil para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra. El sistema de oligonucleótidos comprende al menos un primer oligonucleótido y un segundo oligonucleótido, incluyendo cada uno de ellos una primera región seleccionada complementaria o sustancialmente complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana e incluyendo cada uno de ellos además una segunda región, siendo las segundas regiones complementarias o sustancialmente complementarias y seleccionándose de tal forma que tras su hibridación, las segundas regiones formen una estructura dúplex que incluye una secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos, con lo que en condiciones de hibridación predeterminadas, las primeras regiones del primer oligonucleótido y el segundo oligonucleótido pueden hibridar de forma estable con la secuencia de ácido nucleico diana, y la segundas regiones del primer oligonucleótido y el segundo oligonucleótido hibridan de forma estable sólo cuando el primer oligonucleótido, el segundo oligonucleótido y la secuencia de ácido nucleico diana se co-hibridan, para permitir el reciclado de la plantilla y la reducción de la señal de interferencia.

El principio general de un método de detección de ácidos nucleicos diana de acuerdo con un aspecto preferido de la presente invención se ejemplifica por la Figura 1.

En una primera etapa (marcada como A), se incuban oligonucleótidos (13) y (15) del sistema de oligonucleótidos (12) con una secuencia de ácido nucleico diana (14) en condiciones de hibridación predeterminadas. El oligonucleótido (13) incluye un par de fluorescente - inactivador (17) que, cuando se separa más allá de una distancia sin interacción, conduce a la generación de una señal detectable.

En una segunda etapa (marcada como B), tiene lugar la hibridación entre los oligonucleótidos (13) y (15) y la diana (14). Dicha hibridación puede ser secuencial o simultánea dependiendo de la secuencia y de la longitud de cada región de los oligonucleótidos (13) y (15). Por ejemplo, las regiones (16) y (18) del oligonucleótido (15) y las regiones (20) y (22) del oligonucleótido (13) pueden seleccionarse de tal forma que la hibridación de la región (20) con la diana (14) sea dependiente de la hibridación anterior de la región (16) con la diana (14).

En cualquier caso, en una tercera etapa (indicada por C), la estructura dúplex que incluye la secuencia de reconocimiento de agente de escisión, que de acuerdo con este aspecto está formada en parte por la auto-hibridación de la región (22) del oligonucleótido (13) y de esta forma está cortada en una cadena (como se indica por (26)), se escinde por un agente de escisión (24) (descrito adicionalmente más adelante). De esta manera, sólo la región (22) se escinde por el agente de escisión (24) (indicado por (28)) conduciendo la liberación de una porción de región (22) y la posterior disociación de la región (20) de la diana (14).

Como resultado de la escisión, la región (22) se separa de la región (20) conduciendo de esta manera a la separación entre el fluorescente y el inactivador y a la generación de una señal detectable.

Como el oligonucleótido (15) no se escinde y como permanece hibridado con la diana (14), se recicla con la misma, reduciendo de manera el orden de reacción del método de detección del ácido nucleico diana de acuerdo con este aspecto de la presente invención.

Como se muestra en la Figura 1, de acuerdo con una realización actualmente preferida de la presente invención, para cualquiera de estos aspectos, todos los ingredientes de reacción se premezclan en lugar de añadirse por etapas. En algunas realizaciones, esto requiere estabilidad térmica de la enzima de restricción empleada, tal como Bstb1 o Taq1.

De esta manera, los aspectos descritos anteriormente de la presente invención proporcionan sondas o conjuntos de oligonucleótidos que son útiles en la detección de secuencias diana y que carecen de las limitaciones intrínsecas a la sondas oligonucleotídicas de la técnica anterior, tales como las descritas en la Patente de Estados Unidos Nº 5.451.503.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el agente de escisión es un agente químico.

De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, el agente de escisión es una nucleasa que incluye, pero sin limitación, una endonucleasa, una exonucleasa o una ribonucleasa. Preferiblemente, se selecciona una nucleasa termoestable, de tal forma que pueda usarse en el intervalo de temperaturas usado para la hibridación de oligonucleótido-secuencia diana.

De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, la nucleasa es una endonucleasa capaz de reconocer y escindir una secuencia de reconocimiento formada, por ejemplo, por un híbrido de ADN-ADN o ADN-ARN.

La secuencia de reconocimiento típicamente es una secuencia palindrómica con una longitud de al menos cuatro pares de bases y, típicamente, con una longitud no mayor de ocho pares de bases. La presente invención también puede utilizar endonucleasas que reconocen tramos mayores de nucleótidos o endonucleasas que escinden en un sitio que está lejos de la secuencia de reconocimiento. Normalmente, una endonucleasa específica reconocerá una secuencia con pares de bases específicos, se unirá a ella y escindirá una o las dos cadenas de la secuencia de ácido nucleico dúplex dependiendo del agente de escisión usado y de los nucleótidos que constituyen cada cadena de la secuencia de reconocimiento de agente de escisión.

Sin embargo, se apreciará que varias endonucleasas presentan características de escisión que cambian de acuerdo con las condiciones o concentración de la endonucleasa empleada. Esto incluye la denominada actividad "estrella" de las endonucleasas, donde en condiciones subóptimas, algunas endonucleasas escinden secuencias además de las secuencias específicas que típicamente se escinden por ellas. De esta manera, las endonucleasas deben seleccionarse cuidadosamente, aunque como apreciará un especialista habitual en la técnica, en ocasiones, se prefieren condiciones subóptimas/no recomendadas para permitir una escisión concomitante, hibridación y disociación.

Se apreciará que para diseñar un oligonucleótido o un conjunto de oligonucleótidos que formen la estructura dúplex y, de esta manera, la secuencia de reconocimiento de agente de escisión sólo cuando hibrida con la secuencia o secuencias de ácido nucleico diana, deben tenerse en cuenta varios parámetros y consideraciones. En primer lugar, los oligonucleótidos de la presente invención deben poder hibridar con secuencias de ácido nucleico diana en condiciones de hibridación que permitan la diferenciación entre dianas casi idénticas que, por ejemplo, varían en secuencia tan sólo por un nucleótido. De esta manera, por ejemplo, puede diferenciarse y detectarse una forma mutada de un gen que contiene una sola mutación puntual. En segundo lugar, al menos algunos de los oligonucleótidos deben sintetizarse con regiones de hibridación con la diana que sean suficientemente largas como para permitir la hibridación pero suficientemente cortas como para disociarse de la diana después de la escisión del tallo y para minimizar la complicidad global de la molécula y, de esta manera, la posibilidad de que se formen estructuras secundarias indeseables. Además, los brazos con especificidad de diana no deben contener un sitio de reconocimiento de agente de escisión. En tercer lugar, las regiones que son responsables de la formación de estructuras dúplex deben diseñarse tanto en el oligonucleótido individual como en el conjunto de oligonucleótidos de tal manera que se forme una estructura dúplex sustancialmente sólo o preferiblemente después de la hibridación del oligonucleótido o el conjunto de oligonucleótidos con la secuencia de ácido nucleico diana. Si no es así, se producirá una alta señal de interferencia resultante de la escisión de oligonucleótidos no hibridados diana. Además, la secuencia de reconocimiento de escisión debe elegirse de acuerdo con condiciones de ensayo y una longitud del tallo preferidas. Además, el tallo no debe interaccionar con los brazos con especificidad de diana. Estas y otras consideraciones se describen adicionalmente con detalle en la sección de Ejemplos que se presenta más adelante.

El oligonucleótido o el conjunto de oligonucleótidos de la presente invención puede ser de ADN, ARN o PNA, o mezclas quiméricas, derivados o versiones modificadas de los mismos, siempre que sea capaz de hibridar con la secuencia de ácido nucleico diana y capaz de formar una secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos escindible al menos en una cadena por el agente de escisión. Los oligonucleótidos pueden modificarse en el resto de base, en el resto de azúcar o en el esqueleto de fosfato, y pueden incluir otros grupos o marcadores colgantes, siempre que sean capaces de funcionar como oligonucleótidos de detección de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. Además, un oligonucleótido también puede incluir restos que no hibridan interpuestos entre sus restos de hibridación.

De esta manera, un oligonucleótido de acuerdo con la presente invención incluye nucleótidos o análogos de nucleótido hibridables con las nucleobases naturales y además también puede incluir restos no hibridables.

Por ejemplo, el oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos puede comprender al menos un resto de base modificada tal como, pero sin limitación, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-aetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina.

Los ejemplos de restos de azúcar modificados incorporables en el oligonucleótido o el conjunto de oligonucleótidos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa y hexosa.

Los ejemplos de esqueleto de fosfato modificado incorporables en el oligonucleótido o el conjunto de oligonucleótidos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosfordiamidato, un metilfosfonato, un alquil fosfotriéster y un formacetal o análogo del mismo.

Los oligonucleótidos o el conjunto de oligonucleótidos de la presente invención pueden obtenerse por métodos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de la síntesis clínica de novo de polinucleótidos usando un sintetizador de ADN automático (tal como el disponible en el mercado en Biosearch, Applied Biosystems, etc.) y la química de fosforamidita convencional.

Un método preferido para la síntesis de oligonucleótidos se realiza usando un sintetizador de ADN automático por métodos conocidos en la técnica. Como ejemplos, pueden sintetizarse oligonucleótidos de fosforotioato por el método de Stein et al., (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209-3221), pueden prepararse oligonucleótidos de metilfosfonato por medio del uso de soportes poliméricos de vidrio de poros controlados (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451), etc. Una vez sintetizado el oligonucleótido deseado, se escinde del soporte sólido sobre el cual se sintetizó y se trata, por métodos conocidos en la técnica, para retirar cualquier grupo protector presente. El oligonucleótido después puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo extracción, purificación en gel y cromatografía en columna. La concentración del oligonucleótido sintetizado después puede verificarse por métodos bien conocidos en la técnica.

Se apreciará que los oligonucleótidos de la presente invención también pueden unirse a un soporte sólido después de la síntesis o directamente sintetizando los oligonucleótidos en un soporte sólido apropiado. Se apreciará que cuando se unen a un soporte sólido, los oligonucleótidos preferiblemente incluyen un espaciador de tal forma que un oligonucleótido unido o un conjunto de oligonucleótidos unidos pueda funcionar como se ha descrito anteriormente en este documento sin padecer limitaciones espaciales, que pueden limitar la hibridación de los oligonucleótidos con una secuencia de ácido nucleico diana y la formación de la estructura dúplex intrínseca.

Como ya se mencionado anteriormente, el oligonucleótido o el conjunto de oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención preferiblemente incluye al menos un resto de detección unido al oligonucleótido o al conjunto de oligonucleótidos de una manera que permita la detección de la separación de la región o regiones del oligonucleótido o conjunto de oligonucleótidos.

Los oligonucleótidos de la invención pueden marcarse con restos durante la síntesis química del oligonucleótido o el marcador puede unirse después de la síntesis por métodos conocidos en la técnica.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, un resto de detección es un resto de detección detectable directamente o un resto detección detectable indirectamente. Los ejemplos de restos de detección detectables directamente incluyen un ion radiactivo tal como ^{32}P, ^{35}S, ^{3}H y similares, o un fluorescente (más adelante se indican ejemplos de fluorescentes). En este caso, la escisión puede detectarse controlando simplemente la formación y acumulación de productos de escisión por diversas técnicas de fraccionación o técnicas de cromatografía y electroforesis que pueden incluir, por ejemplo, cromatografía en columna, cromatografía en gel o electroforesis en gel.

Los ejemplos de restos de detección detectables indirectamente incluyen miembros de pares de unión y/o interacción química tales como, pero sin limitación, un anticuerpo, un antígeno, un epítopo, un ligando, un receptor, un ion, un quelante y similares. Estos tipos de restos de detección también pueden detectarse usando cromatografía o electroforesis, pero producen señales detectables sólo cuando se realiza una reacción química particular, tal como una reacción enzimática. Estos restos de detección preferiblemente se seleccionan para que sean estables al calor, de forma que sobrevivan a las etapas de desnaturalización e hibridación de la reacción de detección. Por ejemplo, un oligonucleótido puede marcarse indirectamente por medio de la incorporación en el mismo de un nucleótido unido covalentemente a un hapteno o a una molécula tal como biotina, a la que puede unirse una molécula de avidina marcada, o digoxigenina, a la que puede unirse un anticuerpo anti-digoxigenina marcado. Como se ejemplifica adicionalmente en la sección de Ejemplos que se presenta más adelante y mientras se reducía la presente invención a la práctica, se detectó un oligonucleótido marcado con biotina a través de una enzima conjugada con estreptavidina por medio de uso de electroforesis en gel convencional.

Además, también pueden usarse restos detectables indirectamente en columnas de afinidad en las que una secuencia hibridada de oligonucleótido-diana unida a la columna sólo se libera tras la escisión. Estos oligonucleótidos se marcan durante o después de la síntesis como se ha mencionado anteriormente.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, un oligonucleótido o un conjunto de oligonucleótidos también pueden marcarse con al menos un par de restos de detección de interacción resonante. Por ejemplo, pueden unirse un primer resto de detección y un segundo resto de detección de un par a un oligonucleótido o un conjunto de oligonucleótidos que flanquean la secuencia de reconocimiento de escisión, de tal forma que después de la escisión de la secuencia de reconocimiento por el agente de escisión, se produce la separación de estos restos. Los restos de detección se seleccionan de tal forma que al menos uno de estos restos pueda producir una señal detectable cuando se separa del otro resto de detección una distancia a la que no hay interacción.

Los ejemplos de pares de interacción resonante de restos de detección que pueden usarse mientras se realiza la presente invención incluyen, pero sin limitación, un fluorescente y un inactivador y cualquier otro tipo de pares de transferencia de energía resonante fluorescente (FRET) (como referencia, véase, por ejemplo, "Fluorescence resonance energy transfer" por Paul R. Selvin, 1995, Methods in Enzymol. Vol. 246, Cap. 13, pág. 300; y "Handbook of fluorescent probes and research chemicals", por Richard P. Haugland, sexta ed. Molecular probes. Más adelante se indican ejemplos específicos de moléculas que pueden usarse en la transferencia de energía resonante fluorescente.

La distancia óptima entre un primer y un segundo restos de detección de un par cuando están unidos a la sonda oligonucleotídica será la distancia en la que las emisiones del primer resto se absorben por el segundo resto. Esta distancia óptima varía con los restos específicos usados y se define por el radio de Forster. El radio de Forster (Ro) es la distancia entre un donador y un aceptor que permite la inactivación de 50% de las moléculas donadores excitadas por el inactivador. Ro puede definirse por cualquier par FRET dado, y puede usarse como pauta para diseñar una sonda marcada por FRET.

Un especialista habitual en la técnica puede determinar fácilmente, usando técnicas de espectrofotometría conocidas en la técnica, los fluoróforos que crearán pares FRET adecuados de donador-aceptor. Por ejemplo, FAM (que tiene un máximo de emisión de 525 nm) es un donador adecuado para TAMRA, ROX y R6G (teniendo todos ellos un máximo de excitación de 514 nm) en un par FRET. Otros ejemplos de restos que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, acridina del ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico y derivados tales como acridina, isotiocianato de acridina, ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS), 3,5-disulfonato de 4-amino-N-3-(vinilsulfonil)fenil-naftalimida (Amarillo Lucifer, VS), N-4-anilino-1-naftil)maleimida, antranilamida y Amarillo Brillante; cumarina y derivados tales como cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Coumarin 120), 7-amino-4-trifluorometilcumarina (Coumaran 151), cianosina, 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI), 5',5''-dibromopirogalolsulfoneftaleína (Rojo de Bromopirogalol), 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina, pentaacetato de dietilentriamina, ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfónico, ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico, cloruro de 5-dimetilamino naftalen-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo), ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL) y 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocinato (DABITC); eosina y derivados tales como eosina e isotiocianato de eosina; eritrosina y derivados tales como eritrosina B y eritrosina isotiocianato etidio; fluoresceína y derivados: tales como 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2',7-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, QFITC (XRITC), fluorescamina, IR144, IR1446, isotiocianato de Verde Malaquita, 4-metilumbeliferona, orto cresolftaleína, nitrotirosina, pararosanilina, Rojo Fenol, B-ficoeritrina y o-ftaldialdehído; pireno y derivados tales como pireno, butirato de pireno, butirato de succinimidil 1-pireno y Rojo Reactivo 4 (Cibracron RT. Rojo Brillante 3B-A); rodamina y derivados tales como 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), cloruro de lisamina rodamina B sulfonilo, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforodamina B, sulforodamina 101, sulforodamina 101 (Rojo Texas), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), tetrametil rodamina, isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC), riboflavina, ácido rosólico y derivados de quelato de
terbio.

Los oligonucleótidos preferiblemente se modifican durante la síntesis de tal forma que se introduce una base T modificada en una posición designada por medio del uso de Amino Modifier C6 dT (Glen Research), y se incorpora un grupo amino primario en la base T modificada como se describe por Ju et al., (1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 92:4347-4351). Estas modificaciones pueden usarse para la incorporación posterior de colorantes fluorescentes en posiciones designadas de los oligonucleótidos.

Se apreciará que aunque la presente invención prefiere el uso de un solo resto de detección o un par de restos de detección para la detección de la separación resultante de la escisión, esta detección también puede realizarse en oligonucleótidos y conjuntos de oligonucleótidos que no están señalizados por estos restos. En este caso, los productos de escisión resultantes puede detectarse específicamente por diversas técnicas cromatográficas tales como HPLC y similares o técnicas electroforéticas.

De esta manera, la presente invención proporciona oligonucleótidos y conjuntos de oligonucleótidos que son útiles en métodos para la detección de dianas de ácidos nucleicos. Los oligonucleótidos de la presente invención son particularmente ventajosos con respecto a los diseños de la técnica anterior para la detección de secuencias diana ya que después de la producción de una señal detectable, los oligonucleótidos de la presente invención o porciones de los mismos se disocian del ácido nucleico diana. Esta disociación permite que ácidos nucleicos adicionales hibriden con la diana y posteriormente produzcan señales detectables adicionales. De esta manera, si se usan cantidades en exceso de oligonucleótidos, se permite el reciclado de la diana y se genera amplificación de la señal.

Además, los oligonucleótidos o conjuntos de oligonucleótidos descritos en este documento anteriormente son ventajosos con respecto a los diseños de la técnica anterior ya que reducen sustancialmente las señales de interferencia asociadas con la escisión independiente de la diana.

Además, como la restricción y, de esta manera, la generación de una señal es independiente del tipo y secuencia del polinucleótido diana, las sondas oligonucleotídicas de la presente invención pueden incluir una estructura universal en la región de escisión que facilite su síntesis y aplicabilidad. Una ventaja añadida a la escisión independiente de la diana es que las sondas de la presente invención pueden usarse para detectar tanto secuencias diana de ADN como secuencias diana de ARN.

Finalmente, como la presente invención es un procedimiento isotérmico, facilita la detección de secuencias diana a través de un procedimiento fácil y relativamente barato.

Otros objetos, ventajas y nuevas características adicionales de la presente invención serán evidentes para el especialista habitual en la técnica tras el examen de los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes. Además, cada una de las diversas realizaciones y aspectos de la presente invención como se han indicado anteriormente en este documento y como se reivindica en la sección de reivindicaciones encuentra confirmación experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos que conjuntamente con las descripciones anteriores ilustran la invención de una manera no limitante.

En general, la nomenclatura usada en este documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Estas técnicas se explican meticulosamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I, ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317 Academic Press.

Ejemplo 1 Materiales y métodos generales Oligonucleótidos

Después de un diseño cuidadoso, los oligonucleótidos y conjuntos de oligonucleótidos descritos más adelante en este documento se adquirieron en Biotechnology General Ltd., Israel o Genset, Francia. La predicción de la estructura y la estabilidad termodinámica de los oligonucleótidos en diferentes condiciones de ensayo, se realizó usando el software Gene runner, versión 3.00. La Figura 2 resume las estructuras secundarias y las características de todos los oligonucleótidos sintetizados y ensayados mientras se reducía la presente invención a la práctica.

Reacciones de PCR

Las reacciones de PCR se realizaron usando el Controlador Térmico Programable PTC-100™ (MJ Research, Inc.). El ADN utilizado como plantilla en las reacciones de PCR se preparó a partir de un lisado de células enteras de fibroblastos de embrión humano (HEF) infectados con citomegalovirus (CMV, ATCC cepa AD169).

Endonucleasas de restricción y ADN de soporte

Las enzimas de restricción usadas para la plantilla de ADN y la escisión de las sondas oligonucleotídicas se adquirieron en New England BioLabs, Inc., USA. Las preparaciones de ADN de soporte (ARNt, ADN de esperma de salmón y ADN de placenta humana) se adquirieron en Sigma Israel, Ltd.

Ensayos de hibridación y de escisión

Los ensayos de hibridación comparativos realizados a un intervalo de temperaturas de 44ºC-66ºC se realizaron en Stratagene Robocycler/gradient 96 Temperature Cycler.

Se incubó ADN de CMV con una o más sondas oligonucleotídicas en presencia de NaCl de 50 a 200 mM, MgCl_{2} 10 mM y Tris-HCl 10 mM. Las reacciones se realizaron a un pH de 7,8 ó 8,5 en un volumen final de 25 \mul. La concentración de sales, las relaciones molares entre la sonda o sondas oligonucleotídicas y el ADN diana y la temperatura del ensayo variaron de acuerdo con los requisitos específicos de cada ensayo, como se detalla adicionalmente más adelante.

Para la determinación de la escisión dependiente de CMV de la sonda o sondas, también se añadieron enzimas de restricción. Las reacciones de restricción se detuvieron usando tampón de carga de gel que contenía EDTA, y se almacenaron a 4ºC hasta que se sometieron a electroforesis. La evaluación de la escisión independiente de CMV de las sondas oligonucleotídicas (escisión de interferencia) se realizó en ausencia de ADN de CMV. Como control adicional para la escisión independiente de CMV, se intentó realizar una digestión enzimática de sondas oligonucleotídicas en presencia de productos de PCR no relevantes, ARNt, ADN de esperma de salmón o ADN de placenta humana. No se detectó la escisión dependiente de ADN de la sonda en ninguno de estos experimentos de control negativo. La determinación de la eficacia máxima de hibridación se realizó en ausencia de enzima, usando electroforesis en gel no desnaturalizante. La concentración de sal se cambió para influir tanto en la rigurosidad de la hibridación como en la actividad enzimática.

Los ensayos se realizaron a temperaturas seleccionadas dentro del intervalo de 44ºC a 66ºC. En general, y como se muestra para la sonda emparejada (Figura 3a) y la sonda con bucle (Figura 3b), la temperatura del ensayo se seleccionó como se indica a continuación: (i) 5-30ºC mayor que la Tm del tallo de oligonucleótido (región formadora de dúplex), preferiblemente 10-15ºC mayor, para permitir la formación del tallo dependiente de la diana; (ii) de 10ºC por debajo a 25ºC por encima de la Tm de cada uno de los brazos con especificidad de diana (regiones de hibridación con el ADN diana) de las sondas oligonucleotídicas, preferiblemente 5-10ºC por encima de la Tm de los brazos con especificidad de diana individuales, para permitir la disociación de las sondas del ácido nucleido diana después de la escisión enzimática; (iii) de 0-40ºC por debajo a 5ºC por encima de la Tm del híbrido de longitud completa, preferiblemente 10-20ºC por debajo de este valor para inducir la formación de híbridos en presencia de secuencias de ácido nucleico diana; y (iv) de 25ºC por debajo a 10ºC por encima de la temperatura óptima para las enzimas de restricción, para permitir una actividad enzimática entre 30 y 100%.

Detección

Los productos de reacción se analizaron por electroforesis en gel en geles de poliacrilamida nativos y que contenían urea (desnaturalizantes). El análisis del gel se realizó usando un aparato de electroforesis en gel Xcell™ Mini-cell usando poliacrilamida adquirida en Serva Electrophoresis, GmbH, (Nº de Catálogo 10680). La transferencia de Southern se realizó usando módulos de transferencia y cassettes de plástico desechables (Novex, USA) y membranas de nylon Hybond-N+ o NX (Amersham, UK).

Para la determinación de la conformación monocatenaria, las muestras se hirvieron antes de su carga en geles y se añadió urea 7 M tanto al gel como al tampón de carga del gel. Para la determinación de los híbridos y las estructuras secundarias, se emplearon condiciones de electroforesis nativa. Después, los geles se transfirieron a membranas de nylon Hybond-N+ o NX y el ADN se inmovilizó en las membranas por irradiación UV. Las membranas se incubaron con fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina y después se visualizaron los reactivos biotinilados usando el sustrato BCIP/NBT.

Secuencias de ácido nucleico diana

Se apreciará que cualquier secuencia de ácido nucleico diana es detectable siempre que se prepare una sonda oligonucleotídica hibridable especializada de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención para permitir su detección.

Se detectaron homólogos de regiones elegidas de forma arbitraria de ADN de CMV en la base de datos de NCBI usando el algoritmo BLAST. Se detectaron secuencias homólogas en diversos organismos, incluyendo el ser humano, patógenos y otros organismos. Las secuencias más largas contenían 17 pares de bases. La temperatura de fusión (Tm) de la secuencia homóloga a CMV que compartía el mayor grado de homología con el ADN de CMV fue 50ºC. La región de los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención que es complementaria al ácido nucleico diana (es decir, el brazo) se sintetizó de manera que incluyera secuencias que sólo son homólogas en parte a las secuencias homólogas a CMV mencionadas anteriormente. Esto asegura que cada brazo de la sonda oligonucleotídica tiene una Tm inferior cuando hibrida con estas secuencias que no están presentes en CMV. Además, cada uno de los dos brazos con especificidad de diana se diseñó de manera que tuviera valores de Tm por encima de 50ºC. Como la temperatura de reacción es superior a 50ºC, ninguno de los brazos con especificidad de diana solo puede formar un híbrido estable con la secuencia de polinucleótido diana. Como el valor de Tm de los dos brazos conjuntamente es mayor que la Tm de cada brazo solo, y también es mayor que la temperatura de reacción, se necesitan los dos brazos para la hibridación con la secuencia de ADN de CMV bicatenaria. Por lo tanto, el reconocimiento de un ADN que no está presente en CMV por medio de una sonda que sólo es parcialmente complementaria a estas secuencias es muy poco probable en las condiciones de ensayo descritas anteriormente. De hecho, cuando se usó ADN de placenta humana o ADN de esperma de salmón como ADN diana de control en lugar de ADN de CMV, no se detectó hibridación de sondas con el ADN de control (sondas emparejadas) o se detectó ligeramente (sondas con bucle), sin embargo, en ambos casos ni la hibridación del ADN de CMV con las sondas ni la escisión de la sonda dependiente de ADN se vio afectada de forma sustancial.

Ejemplo 2 Ácidos nucleicos diana Preparaciones de ADN de CMV

Se usó un fragmento de 263 pares de bases (SEC ID Nº: 1) derivado del genoma de CMV (Nº de Acceso VRL Nº X17403) como plantilla para diversas preparaciones de ADN de CMV que se usaron como secuencia de ADN diana (Figura 4). Las características principales de las diversas preparaciones se indican en la Tabla 1 y se detallan adicionalmente más adelante.

ADN de CMV bicatenario amplificado por PCR (p.CMV-263.ds)

Este único fragmento de CMV se amplificó usando 5'-AGACCTTCATGCAGATCTCC-3' (cebador de PCR de CMV con sentido, SEC ID Nº: 2) como cebador con sentido y 5'- GGTGCTCACGCACATTGATC-3' (cebador de PCR antisentido, SEC ID Nº: 3) como cebador antisentido, junto con una preparación de ADN procedente de un lisado de células enteras de células HEF infectadas con CMV como plantilla de PCR. La reacción de PCR incluía una primera etapa de desnaturalización de 5 minutos a 94ºC, seguida de 30 ciclos de un minuto a 94ºC; 30 segundos a 58ºC, 30 segundos a 72ºC y una etapa de extensión final de 5 minutos a 72ºC.

TABLA 1 Las características principales de diversas preparaciones de ADN de CMV utilizadas como secuencia de ADN diana en reacciones de hibridación de oligonucleótidos

Prep.	Longitud	Cadena	Síntesis	Designación y observaciones	SEC
	(pb)				ID Nº:
1	263	bc	PCR	p.CMV-263.ds	1
2	263	mc,	PCR asimétrica	p.CMV-263.ss. También Incluye una	4
		antisentido		cantidad considerable de bicatenario
3	50	bc	PCR+DdeI	p.CMV-1.ds	5
4	35	bc	PCR+HaeIII/Fnu4HI	p.CMV-2.st.ds	6
5	59	bc	PCR+HaeIII/AflII	p.CMV-2.lg.ds	7
6	36	mc,	Sec como en la Prep. 3	CMV-2.st con sentido	8
		con sentido		Biotinilado en el extremo 5'
7	36	mc,	Sec como en la Prep. 3	CMV-2.st antisentido	9
		antisentido
8	36	bc	Sec como en la Prep. 3	syn. CMV-2.st.ds	10
				Biotinilado en el extremo 5' de la mezcla
				1:1 con sentido de las preparaciones 6 y 7.
9	ADN viral	bc	g. CMV-1/2-st/2.lg	n.a
			ADN genómico de HEF infectado con
			CMV tratado con DdeI, HaeIII + Fnu4HI
			o HaeIII + AflII
Prep = preparación; mc = monocatenario; bc = bicatenario; n.a. no aplicable.

ADN de CMV antisentido monocatenario amplificado por PCR (p.CMV-263.ss)

La cadena antisentido se amplificó usando el mismo programa de PCR, plantilla y cebadores que se usaron para la amplificación del ADN bicatenario, con la excepción de que el cebador antisentido se añadió en un exceso de 20 veces con respecto al cebador con sentido y el programa de PCR se realizó durante 40 ciclos. El producto de PCR final se enriqueció con una cadena antisentido de CMV monocatenario (263 pb) pero también contenía ADN bicatenario (263 pb).

ADN de CMV bicatenario amplificado por PCR escindido (p. CMV-1, 2.st, 2.lg. ds)

Como se muestra en la Figura 4, el fragmento de CMV bicatenario amplificado por PCR (263 pb) se digirió usando DdeI (preparación 3), HaeIII + Fnu4HI (preparación 4) o AflII + HaeIII (preparación 5) para producir fragmentos de restricción que coinciden con la secuencia exacta hibridable por los brazos de las diversas sondas oligonucleotídicas. Como estos fragmentos de restricción de CMV (50, 35 y 61 pb) son considerablemente más cortos que el producto de PCR de 263 pb, las diversas sondas oligonucleotídicas competían mejor por la cadena con sentido de CMV nativa por la hibridación que la cadena de CMV antisentido, y de esta forma impedían la auto-hibridación del ADN de CMV bicatenario.

ADN de CMV monocatenario y bicatenario sintético (CMV-2 st. y syn. CMV-2 st. ds con sentido/antisentido)

Se sintetizaron químicamente dos fragmentos de ADN de CMV monocatenarios complementarios. Se añadieron una cadena con sentido biotinilada sintética (SEC ID Nº: 8) y una cadena antisentido no biotinilada complementaria sintética (SEC ID Nº: 9) en concentraciones equimolares para producir un fragmento de CMV bicatenario sintético (SEC ID Nº: 10). Estas secuencias de ADN bicatenarias sintéticas se sintetizaron de forma que tenían un tamaño correspondiente al de la mayoría de los brazos de sonda. Como se conoce la concentración exacta de cada una de las cadenas sintéticas, puede determinarse una medida cuantitativa para la reacción. Además, la cadena antisentido no biotinilada puede usarse por separado para mejorar la hibridación de la sonda-ADN, ya que la complejidad introducida por la auto-hibridación de las dos cadenas del ADN de CMV bicatenario no es un factor. Además, la cadena con sentido biotinilada permitió el control de la complejidad introducida en una reacción por auto-hibridación de las dos cadenas del ADN de CMV bicatenario.

Mezcla de ADN viral/humana digerido enzimáticamente (g.CMV/1, 2. st, 2. lg)

Se digirió completamente una preparación de ADN procedente de un lisado de células enteras de fibroblastos de embrión humano (HEF) infectados con CMV usando DdeI, HaeIII + Fnu4HI o HaeIII + AflII.

Se han diseñado cinco categorías principales de sondas oligonucleotídicas y se han estudiado mientras se reducía la presente invención a la práctica, y se denominan en este documento: sondas emparejadas, sondas bivalentes, sondas individuales, sondas bloqueadas y sondas ModRE/MutRe. La Figura 2 resume las características principales de estas categorías de sonda.

Ejemplo 3 Sondas Bi-moleculares - emparejadas Sondas emparejadas - Primera generación

En las sondas oligonucleotídicas emparejadas (conjuntos de oligonucleótidos bimoleculares), cada miembro de oligonucleótido del par contiene un brazo que está diseñado para reconocer específicamente una porción de la secuencia diana. Sin embargo, cada brazo se selecciona preferiblemente con una longitud suficientemente corta como para impedir la formación de un híbrido estable con la secuencia diana. La hibridación concomitante de los brazos de los dos miembros de oligonucleótido del par con el ADN diana permite la formación de un tallo bicatenario (de 11-18 pb de longitud) entre los dos miembros de oligonucleótido. Este tallo es esencial para la estabilización de la hibridación entre los brazos de los dos miembros de oligonucleótido y el ADN diana. Además, este tallo está diseñado para proporcionar sitios de restricción escindibles que se forman como resultado de la formación de la estructura de tallo. Las características específicas se detallan adicionalmente más adelante.

Efectos de las regiones de tallo y brazo sobre la hibridación de sondas emparejadas con el ADN de CMV

En placas de 96 pocillos se añadieron 1 picomol (pm) de cada uno de los dos miembros de tres sondas emparejadas diferentes (Figuras 5b, 5c y 5e (par 1 y 2, y SpltRE, respectivamente, Tabla 2), uno de los cuales está biotinilado, o del miembro biotinilado de diferentes sondas emparejadas (Figura 5a (miembro de oligonucleótido biotinilado del par 1 y 2, Tabla 2) y 5d (miembro de oligonucleótido biotinilado de SpltRE, Tabla 2)) y 500 femtomoles (fm) de ADN de CMV bicatenario (p.CMV-1.ds para 5a-c, p.CMV-2.lg, para 5d-e, véase la Tabla 1 anterior). Los ensayos de hibridación se realizaron en NaCl 200 mM, pH = 8,5, a un volumen final de 25 \mul. Las mezclas de reacción se cubrieron con aceite mineral y las placas se calentaron a 95ºC durante 10 minutos para permitir la separación de las cadenas en el Robocycler/gradient 96 Temperature Cycler (Stratagene). Las placas después se transfirieron a un bloque de gradiente de temperaturas en el que cada columna de las placas se incubó a una temperatura diferente, empezando a 44ºC y terminando a 66ºC, con incrementos de 2ºC. Después de una hora de incubación, se analizó una alícuota de 10 \mul tomada de cada muestra por un gel nativo de poliacrilamida al 12%. Los conformantes biotinilados se visualizaron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en las Figuras 5a-e.

Como puede verse claramente en las Figuras 5a-e, la hibridación de cada sonda emparejada al ADN de CMV, como es evidente por las bandas de migración lenta, depende de la presencia de los dos miembros de oligonucleótido del par en la reacción. No se observa la hibridación de un oligonucleótido biotinilado en ausencia de su miembro de oligonucleótido emparejado aunque la Tm del brazo con especificidad de diana sea bastante superior que la temperatura de reacción (por ejemplo, Figuras 5a y 5d). Con la adición del miembro de oligonucleótido no biotinilado (Figuras 5b, 5c y 5e) se observa hibridación, lo que sugiere que la formación del tallo es crucial para la hibridación de los miembros de oligonucleótido de las sondas emparejadas con el ADN de CMV. Además, se observó que en el caso de los pares de oligonucleótido en los que la Tm de los brazos con especificidad de diana se mantuvo constante, pero en los que la Tm de la región del tallo se redujo de 58ºC (Figura 5b) a 42ºC (Figura 5c), la eficacia de hibridación a altas temperaturas fue considerablemente menor. Además, se observó que la elevación de la Tm del brazo con especificidad de diana no biotinilado de 61ºC (Figuras 5b-c) a 87ºC (Figura 5e) puede compensar una baja Tm del tallo, y de esta manera permitir la hibridación incluso cuando el valor de Tm del tallo es tan sólo de 12ºC.

TABLA 2 Sondas emparejadas Bimoleculares

Par Nº	Secuencia 5'-3'	SEC ID Nº:
1	b-TGGTTATCAGAGGCCGCTTAAAATTCGAAGGGTTCAC	11
	GTGAACCCTTCGAATTCACAGCATCACACTAGTCTCC	12
2	b-TGGTTATCAGAGGCCGCTTAAAATTCGAAGGG	13
	CCCTTCGAATTCACAGCATCACACTAGTCTCC	14
3	b-GGCTTGGTTATCAGAGGCCGCTTAAAATTCGAAGGG	15
	CCCTTCGAATTCACAGCATCACACTAGTCTCCTCTAA	16
4	b-TGGTTATCAGAGGCCGCTTAAAATTCGAAGGGTTCACGA	17
	TCGTGAACCCTTCGAATTCACAGCATCACACTAGTCTCC	18
spltRE-5'	b-CAGCATCACACTAGTCTCCAGCTAGTTCGACGCGCCACGCGTC	19
spltRE-3'	GAACTAGCTACTCTAAGACATAGCAGCACAGCACCCGACAGA	20
	A CTCACTTAAG
B = 5' biotinilación

Eficacia de la escisión de diversas sondas emparejadas a diferentes temperaturas

La estructura del tallo de cada sonda emparejada de las sondas emparejadas 1-4 indicadas en la Tabla 2 se diseñó para incluir dos sitios de restricción, uno para BstBI y otro para TaqI. La Tabla 3 presentada a continuación resume la eficacia de escisión de las sondas emparejadas 1-4 de la Tabla 2 anterior a temperaturas diferentes por estas enzimas. Como puede verse claramente, la eficacia de escisión de las enzimas de restricción BstBI y TaqI aumenta con tallos de mayor tamaño. Cuando la región del tallo es demasiado larga, se pierde especificidad debido a la formación de tallos independiente de plantilla. Sin embargo, si la temperatura de reacción se eleva, la estabilización del tallo depende de nuevo de la hibridación de la sonda emparejada con la plantilla de ADN de CMV, lo cual conduce a una reducción en la escisión independiente de plantilla. De esta forma, cuando se diseñan sondas con regiones de tallo más cortas, la escisión es dependiente de CMV a temperaturas inferiores, aumentando la temperatura a 65ºC, una temperatura aún óptima para la escisión enzimática, se inhibe la formación del tallo para estas sondas emparejadas y, por lo tanto, no se observa escisión. La Tabla 3 también demuestra la importancia de la longitud del brazo con especificidad de diana. Como puede verse, el par 2 se escinde de forma más eficaz que el par 3, aunque los dos pares tienen el mismo tallo. Una posible explicación para esto es que los brazos más cortos del par 2 se disocian más fácilmente del ADN de CMV después de la escisión, permitiendo de esta forma un mejor reciclado de la diana y un mayor porcentaje de sonda intacta se convierte en su forma escindida.

TABLA 3 Características y eficacia de escisión de cuatro sondas emparejadas en presencia o ausencia del ADN diana

Eficacia de la escisión de diversos pares a diferentes temperaturas
Temperatura		51°C	56°C	59°C	65°C
Sonda	Características	ER	-CMV	+CMV	-CMV	+CMC	-CMV	+CMV	-CMV	+CMC
empa-	de la sonda*
rejada
1	tallo: 16 pb 55°C	Bstbl	50%	60%	50%	70%	N.D	N.D	0%	25%
	Brazos: b-19 pb,	Taql	30%	40%	40%	50%	N.D	N.D	10%	20%
	67°C/19 pb,58°C
2	tallo: 11 pb, 39ºC	Bstbl	10%	10%	5%	30%	0%	40%	0%	0%
	brazos: b-19 pb,	Taql	10%	10%	10%	70%	5%	30%	0%	0%
	67ºC/19 pb,58ºC
3	tallo: 11 pb,39ºC	Bstbl	5%	5%	0%	10%	0%	0%	0%	0%
	brazos: 23 pb,	Taql	5%	5%	10%	10%	5%	10%	0%	0%
	75ºC 24 pb, 64ºC
4	tallo: 18 pb, 63ºC	Bstbl	80%	80%	80%	85%	N.D	N.D	20%	40%
	brazos: 19 pb,	Taql	50%	50%	50%	60%	N.D	N.D	N.D	N.D
	67ºC 19 pb, 58ºC
b = biotinilación 5'; ER: enzima de restricción; B = BstBI; T = TaqI

La Figura 6 demuestra la importancia de la longitud del brazo con especificidad de diana. Se incubaron sondas emparejadas 2, 3, o ambas, cada una a una concentración de 100 nM, en presencia (+) o ausencia (-) de una concentración aproximadamente 100 nM de ADN de CMV enriquecido monocatenario (263 pb). Se realizó una etapa de hibridación inicial a pH 7,8, 60ºC durante 15 minutos, en un volumen de 30 \mul. Después de la etapa de hibridación inicial, se añadieron 0,17 unidades/\mul de BstBI a cada cubo y se dejó que continuara la escisión durante 2 horas. Se analizaron alícuotas de 8 \mul en un gel de acrilamida-urea al 15%. Los fragmentos biotinilados se visualizaron como se ha descrito en el Ejemplo 1 anteriormente. La longitud (pb) y la Tm (ºC) del tallo y los brazos de los pares 2 y 3 se indican en la Tabla 3 presentada anteriormente.

Como puede verse en la Figura 6, el par 2 se escindió en presencia de ADN de CMV (calle 2), mientras que el par 3 se escindió en una medida mucho menor (calle 4). Sin embargo, en presencia del par 3, la escisión del par 2 se bloqueó (calle 6). De esta forma, parece ser que la accesibilidad del par 2 a la plantilla se bloquea por el par 3. El par 3 inhibe la hibridación del par 2 con el ADN diana debido a su secuencia de brazo específica de CMV de mayor longitud. Además, no se pudo realizar un reciclado del ADN relevante porque la escisión del par 3 no ocasionó la disociación del complejo híbrido de sonda-ADN de CMV. El híbrido se mantuvo intacto incluso después de la escisión enzimática y se bloqueó la accesibilidad del par 2 al ADN. De esta forma, se ha demostrado claramente el reciclado de la plantilla y, por lo tanto, la amplificación de la señal con las sondas emparejadas diseñadas de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención.

Sondas emparejadas - segunda generación

El diseño de la segunda generación de sondas emparejadas pretendía aumentar la eficacia de la escisión dependiente de CMV dirigiendo la reacción para que prefiriera la formación del tallo con respecto a la disociación del tallo o reduciendo el número de interacciones necesarias para la formación de tallos bicatenarios o, en otras palabras, reduciendo el orden de reacción. De esta forma, el miembro de oligonucleótido no biotinilado de la sonda emparejada se alargó para permitir una hibridación permanente con el ADN diana, y el sitio de reconocimiento de restricción de esta cadena se hizo resistente a la escisión. De esta manera, el miembro de oligonucleótido no biotinilado de la sonda emparejada debe reciclarse junto con el ADN de CMV con el que hibrida. Se ensayaron dos estrategias: sondas de sitio de restricción dividido (spltRE) y sondas de sitio de restricción modificado ("MutRE o ModRe"). En ambos casos, el sitio de restricción estaba flanqueado por al menos cinco pares de bases en cada lado, para permitir un mejor contacto de las enzimas de restricción con sus sitios de restricción, con el fin de aumentar la eficacia de escisión. La estructura de la segunda generación de sondas emparejadas se representa en la Figura 2.

Sondas de sitio de restricción dividido (SpltRE)

En la sonda emparejada spltRE, el brazo 3' del miembro de oligonucleótido no biotinilado se alargó para permitir una hibridación permanente con el ADN diana (p.CMV-2.lg, 41 bases de longitud, Tm = 90ºC). El extremo 5' de este miembro de oligonucleótido participa en la formación del tallo, pero aporta sólo dos de las bases que forman el sitio TaqI (5'-GA-3'). Las otras dos bases que constituyen el sitio de reconocimiento, incluyendo el propio sitio de escisión (5'-T/C-3'), están ausentes en esta cadena. Como resultado, el miembro de oligonucleótido no biotinilado sirve como anclaje en el ADN diana para el miembro de oligonucleótido biotinilado. El resto de los nucleótidos que se necesitan para completar el sitio de restricción dividido están presentes en el miembro de oligonucleótido biotinilado. El miembro de oligonucleótido biotinilado contiene un brazo 5' específico de CMV que es similar en longitud y Tm al de la primera generación de sondas emparejadas (19 bases de longitud, Tm = 63ºC). Por lo tanto, es de esperar que este brazo se disocie del ADN diana después de la escisión enzimática. En su extremo 3', el miembro de oligonucleótido biotinilado está diseñado para plegarse y crear una estructura de horquilla intramolecular estable (6 bases de longitud, Tm = 87ºC) que aporta las dos bases necesarias para el reconocimiento de sitio por TaqI (5'-T/C-3'). Éstos son los nucleótidos que están ausentes en el extremo 5' del miembro no biotinilado de la sonda emparejada. De forma similar a lo que ocurre en la primera generación de sondas emparejadas, la enzima reconoce y escinde el sitio de restricción completo (5'-T/CGA-3') en una configuración bicatenaria sólo cuando los dos miembros de la sonda emparejada hibridan. Sin embargo, en este caso sólo se escinde el miembro biotinilado del par, mientras que el miembro no biotinilado permanece sin escindir e hibridado con la plantilla diana. Por lo tanto, es de esperar que el complejo del oligonucleótido alargado hibridado con el ADN diana se recicle por el oligonucleótido biotinilado, cuando está presente en exceso en la mezcla de reacción.

Sondas de sitio de restricción modificado (MutRE/ModRe)

Introduciendo una modificación en el sitio de reconocimiento de la mitad no biotinilada de la sonda emparejada, puede prevenirse la escisión enzimática de la cadena modificada. Se introdujeron modificaciones de 5'-T/CGA-3' a 5'-T/CTA-3' y de 5'-T/CGA-3' a 5'T/CG(N^{6}-metil)A en los miembros de oligonucleótido no biotinilado de sondas emparejadas, en el sitio de reconocimiento de TaqI/BstBI para producir 5 sondas MutRe (SEC ID Nº: 21-25). De forma similar al diseño de SpltRE, la sonda emparejada MutRE se aproxima a los efectos beneficiosos de una mayor concentración de los reactivos a lo largo de la incubación y, por lo tanto, debe dar como resultado una mayor eficacia de formación de producto.

Los dos conceptos indicados anteriormente en este documento (spltRE/ModRE y brazo con especificidad de diana alargado) se ensayaron por separado, sin embargo, los dos pueden coaplicarse a la misma sonda. La naturaleza de hibridación de un par de sondas al ADN diana y la disociación del brazo biotinilado escindido del ADN pueden estudiarse usando miembros de oligonucleótido modificado/alargado de una sonda emparejada. Por ejemplo, el miembro de oligonucleótido alargado/modificado de las sondas emparejadas puede combinarse con diversos miembros de oligonucleótido biotinilados que tienen diferentes longitudes de brazo y valores de Tm. En estas reacciones combinatorias, la eficacia de hibridación puede estudiarse independientemente (usando geles nativos, como se muestra, por ejemplo en la Figura 5) o junto con la eficacia de escisión (usando geles desnaturalizantes como se muestra, por ejemplo, en la Figura 6).

Ejemplo 4 Sondas emparejadas de segunda generación - Resultados experimentales

El miembro de oligonucleótido no biotinilado de una sonda emparejada se alargó para permitir una hibridación permanente con el ADN diana (denominado en este documento cebador de anclaje). El extremo 5' de este miembro de oligonucleótido participa en la formación del tallo, pero aporta sólo 4 de 6 bases (5-CGAA-3') de un sitio de reconocimiento BstBI (5-TTCGAA-3'). Las otras dos bases que forman el sitio de reconocimiento (TT), incluyendo el propio sitio de escisión (T/C) están ausentes en esta cadena. Como resultado, el miembro de oligonucleótido no biotinilado es un anclaje hibridado con la diana no escindible que sirve para orientar la hibridación del miembro de oligonucleótido biotinilado al ADN diana.

La porción restante de la secuencia de reconocimiento está presente en el miembro de oligonucleótido biotinilado 3' que contiene un brazo 5' con especificidad de CMV. Este brazo está diseñado para disociarse del ADN diana después de la escisión. En su extremo 3', el miembro de oligonucleótido biotinilado está diseñado para plegarse y crear una estructura de horquilla intramolecular estable (6 bases de longitud, Tm = 87ºC) que aporta las dos bases necesarias para el reconocimiento del sitio por BstBI (5'-TT-3'). Éstos son los dos nucleótidos que faltan del extremo 5' del miembro no biotinilado de la sonda emparejada.

De forma similar a lo que ocurre en la primera generación de sondas emparejadas, la endonucleasa de restricción reconoce y escinde el sitio de restricción completo (5'-TT/CGAA-3') sólo cuando los dos miembros de la sonda emparejada hibridan para formar el sitio de restricción bicatenario. Sin embargo, sólo en este caso el miembro biotinilado del par se escinde y libera de la diana, mientras que el miembro no biotinilado sigue sin escindirse y anclado al ADN diana con el que se recicla.

Se sintetizaron diversos cebadores de anclaje (hibridados de forma estable) y amplificadores (Genosys England) para ensayar la eficacia de las secuencias de anclaje cortas y largas sobre la acumulación del amplificador escindido (Tablas 4-5).

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TABLA 4

Cebador	Secuencia (5' a 3')
Diana	TTGTATGATGACCA (SEC ID Nº: 42)
Anclaje Largo	CGAATT/TGACCTTGTACTCATTACACATTGTTTCCACACAT (SEC ID Nº: 43)
Anclaje Corto	CGAATT/TGACCTTGTACTCATTACACAT (SEC ID Nº: 44)
Amplificador 1	b-TGGTCATCATACAAGCGTCACTAG/TAATTCGAACGGTTTTTTCCGTT (SEC ID Nº:
	45)
Amplificador 2	b-CATCATACAAGCGTCACTAG/AATTCGAACGGTTTTTTTCCGTT (SEC ID Nº: 46)
Amplificador 3	b-ATACAAGCGTCACTAG/AATTCGAACGGTTTTTTTCCGTT (SEC ID Nº: 47)
Las secuencias en negrita representan la parte del tallo del cebador; b = biotinilación 5'

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TABLA 5

Cebador	Orientación	Longitud (nuc.)	Longitud del brazo
Diana	Antisentido	59	n.r.
Anclaje Largo	Con sentido	41	35
Anclaje Corto	Con sentido	28	22
Amplificador 1	Con sentido	47	24
Amplificador 2	Con sentido	43	20
Amplificador 3	Con sentido	39	16
Se calculan las Tm de hibridación entre los cebadores y el ADN diana; n.r. = no relevante.

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La reacción de amplificación se realizó como se describe en el Ejemplo 1 anterior. En resumen, se mezclaron una concentración 50 nM de ADN diana, una concentración 50 nM de oligonucleótido de anclaje corto o largo y una concentración 250 nM de cada oligonucleótido amplificador (cebadores 1, 2 o 3) conjuntamente en tampón de reacción (Tris-HCl 10 mM, MgCl_{2} 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7,9) a un volumen final de 30 \mul. Se añadió una gota de aceite mineral y la temperatura se elevó a 95ºC durante 5 minutos para efectuar la desnaturalización. Las mezclas de reacción después se incubaron a 65ºC durante 15 minutos, se añadió una enzima de restricción BstBI a una concentración final de 1 unidad/\mul y las mezclas de reacción se mantuvieron en las mismas condiciones durante una hora más. El análisis y la detección de la muestra se realizaron como se describe en el Ejemplo 1. Los productos de escisión se separaron en un gel de poliacrilamida al 12,5% y se transfirieron a una membrana (Figura 11a) que se exploró y analizó usando el software Kodak Digital Science 1D; los resultados se resumen en las Figuras 11b-c.

Cuando se usa el anclaje largo, se observa una mayor acumulación del producto de escisión con los tres amplificadores (Figura 11a). Estos resultados demuestran que el uso de un anclaje largo con una mayor Tm del brazo (19ºC mayor que las sondas bimoleculares de primera generación) conduce a una escisión y disociación del amplificador significativamente mayor (Figura 11b). Como puede verse en la Figura 11c, el uso del anclaje largo ha aumentado la escisión de 2,3 a 6,9 veces dependiendo del amplificador usado.

De esta manera, la sonda bimolecular de segunda generación de la presente invención que tiene un miembro de oligonucleótido no escindible anclado es particularmente ventajosa para la identificación de la secuencia diana, ya que la escisión y disociación de sólo un miembro de oligonucleótido reduce el orden de reacción, aumentando de esta manera notablemente la proporción de ciclos de reacción y, por lo tanto, la generación de señales.

Ejemplo 5 Reciclado en sondas emparejadas de segunda generación - Resultados Experimentales

El nivel de reciclado de las sondas emparejadas de segunda generación se determinó midiendo la cantidad de moléculas de producto (amplificador escindido) acumuladas frente a la cantidad de las moléculas diana presentes en la reacción. De esta manera, para determinar el nivel de reciclado, se añadieron diferentes concentraciones de ADN diana (0, 0,5 pM, 5 pM, 50 pM, 500 pM y 5.000 pM) que tenían la siguiente secuencia: 5'-TTGTATGATGACCA-3 (SEC ID Nº: 48) a una solución de ensayo tamponada (Tris\cdotHCl, 10 mM, pH 7,9) que contenía MgCl_{2} 10 mM, NaCl 50 mM y una concentración 50 nM del oligonucleótido de anclaje largo (Tablas 4 y 5). Las mezclas de reacción resultantes se precalentaron a 95ºC durante 5 minutos y posteriormente se incubaron a 65ºC durante 10 minutos para permitir la saturación por hibridación del ADN diana con el oligonucleótido de anclaje. Después se añadió el oligonucleótido amplificador 1 (Tabla 4 y 5) a cada reacción a una concentración final de 250 nM y la incubación se continuó durante 15 minutos más, completando de esta manera una hibridación trimolecular de diana-anclaje-amplificador. Se añadió endonucleasa BstBI a la reacción a una concentración final de 1 unidad/\mul. Las muestras se incubaron durante una hora más para permitir la escisión del oligonucleótido amplificador.

Las muestras que contenían cantidades conocidas de un fragmento de oligonucleótido biotinilado, idéntico en longitud y secuencia al producto de escisión del amplificador (biotina-5'-TTTCATCATAAAAGCGTCACTAGAATT-3' (SEC ID Nº: 49) se sometieron a electroforesis a través de un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 15% en presencia de urea y sirvieron para crear una curva patrón. Junto con este producto se sometieron a electroforesis muestras de 4 \mul (que contenían 0,2 amol, 20 amol, 200 amol, 2 fmol y 20 fmol de diana, Figura 12, recuadro). El gel se transfirió a una membrana de nylon y la detección de biotina fue como se describe en el Ejemplo 1. La mancha de transferencia después se exploró y se analizó usando el software Kodak Digital Science ID. Basándose en los resultados, se calculó el factor de amplificación como la relación molar entre el producto y la diana. Los factores de amplificación calculados para cada una de las concentraciones de la diana se muestran en la Figura 12. Se detectaron aproximadamente 50 fmol de producto con tan sólo 20 amol de ADN diana, mostrando una amplificación de aproximadamente 2.500 veces. Los resultados mostrados en la Figura 12 demuestran que, efectivamente, el reciclado del ADN diana se produce en una amplia serie de concentraciones diana.

Ejemplo 6 Sondas de una sola molécula Sondas individuales - Primera generación

Para reducir el número de interacciones necesarias para la formación de un tallo bicatenario, se diseñaron sondas oligonucleotídicas de una sola molécula (Tabla 6, Figura 2). En las sondas de una sola molécula, el tallo se forma por interacciones intramoleculares. La primera serie de sondas de una sola molécula reconoció una secuencia de 32-43 nucleótidos en el CMV (cada brazo de 16-23 bases de longitud) y tenía tallos de 10-16 pb de longitud.

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TABLA 6 Sondas de una sola molécula

Nº	Secuencia 5'-3'	SEC ID Nº:
1	b-TTATCAGAGGCCGCTTGAAAATTCGAATTGACCAAGAATTCGA A	26
	TTCACAGCATCACACTAGTC
2	b-GTTATCAGAGGCCACTTGAAAATTCGAATTGACCAAGAATTC GA	27
	ATTCACAGCATCACACTAGTC

TABLA 6 (continuación)

Nº	Secuencia 5'-3'	SEC ID Nº:
3	b-TGGTTATCAGAGGCCGCTTGTTATAATCGAATAAATGGAG	28
	GAAG ATTAATTCGAATATAAGCCAGCATCACACTAGTCTCCTC
4	b-TGGTTATCAGAGGCCGCTTGTTATATTCGAATAAATGACCGAG	29
	GAGGAAGATTAATTCGAATATAAGCCAGCATCACACTAGTCTCCTC
b = biotinilación 5'

La Tm de las regiones de tallo o brazo de las diversas sondas de una sola molécula se modificó por la introducción de desacoplamientos en esas secuencias, para hacer que fueran "sustancialmente complementarias". Sin embargo, la Tm del tallo era demasiado alta en todos los casos (Tm = 65-92ºC) y dio como resultado una alta escisión de interferencia de la sonda libre en ausencia del ADN diana.

El análisis informático de la secuencia de ADN diana reconocida por la primera generación de sondas de una sola molécula sugirió que esta secuencia particular podría ser poco adecuada para este tipo de sondas de una sola molécula. En primer lugar, los brazos con especificidad de CMV de la sonda tendían a formar dímeros. En segundo lugar, la secuencia diana seleccionada dicta una alta Tm (Tm = 82ºC) que induce la auto-hibridación del ADN diana bicatenario. Finalmente, la estructura primaria del ADN diana monocatenario permitía una configuración autoplegada estable que podría interferir con la hibridación de la sonda.

Como se muestra en la Figura 7, para ensayar la capacidad de las sondas de una sola molécula de primera generación para detectar una plantilla de ADN diana, la sonda 1 de una sola molécula (Tabla 6) se incubó a 55ºC en NaCl 600 mM en presencia (+, calles 1-3) y ausencia (-, calles 4-6) de p.CMV1-ss (enriquecido monocatenario, 263 pb, véase la Tabla 1 anterior). Las mezclas de reacción se incubaron durante 15 minutos, después de lo cual las mezclas de reacción se diluyeron a una concentración final de NaCl 100 mM, sonda 100 nM y ADN de CMV enriquecido monocatenario 42 nM (263). Después de la dilución, se añadieron TaqI (T) o BstBI (B) a una concentración final de 0,17 unidades/\mul y se dejó que continuaran las restricciones enzimáticas durante 2 horas a 65ºC. Posteriormente, se tomaron alícuotas de 12 \mul para el análisis del gel de desnaturalización. Además, las reacciones de hibridación (H) se incubaron durante 2 horas a 55ºC y NaCl 600 mM en ausencia de enzimas de restricción, y también se analizaron alícuotas de 2 \mul de las mismas en gel nativo al 8%. En ambos casos, la visualización de los fragmentos biotinilados se realizó como se describe en el Ejemplo 1.

Los resultados se presentan en la Figura 7. Como es evidente, una porción considerable de la sonda se escindió en ausencia de ADN de CMV. Además, la presencia de ADN diana no aumentó la eficacia de escisión, sugiriendo que la formación de un tallo estable era independiente de la hibridación del ADN diana para este tipo de sonda. Sin embargo, la reducción de la concentración de híbrido tras la adición de enzimas sugiere que el híbrido puede servir como sustrato para las enzimas.

Sondas con bucle

Basándose en los resultados obtenidos a partir de la primera generación de sondas de una sola molécula, se diseñó una segunda generación de sondas de una sola molécula. En estas sondas, la formación del tallo intramolecular en ausencia de ADN diana se reduce considerablemente. La Figura 2 representa la estructura de una sonda con bucle de segunda generación hibridada.

Los tallos de las sondas de una sola molécula de segunda generación se diseñaron de manera que tuvieran una menor Tm y una mayor accesibilidad a las enzimas en comparación con los tallos de las sondas de una sola molécula de primera generación. En estas sondas, sólo una secuencia de 4 a 6 pares de bases de la región del tallo forma una verdadera doble hélice. Estos pares de bases incluyen el sitio de reconocimiento de TaqI (T/CGA) (en el caso de 6 pb, el sitio RE de 4 pb está flanqueado por un solo par de bases en cada lado). La región de doble hélice verdadera de este tallo estaba flanqueada por una pseudo-doble hélice (emparejamiento de bases entre C-A o G-T en lugar de G-C y A-T como en la doble hélice normal). Se calculó que longitud del tallo entero (suma de la doble hélice real y la pseudo-doble hélice) era suficientemente grande (15 pb) como para permitir que la sonda sirviera como sustrato para TaqI. La Tm del tallo se manipuló cambiando la longitud del bucle de poli-A formado tras la formación del tallo. Las 6 variantes de sonda con bucle variaban en el tamaño de la pseudo-doble hélice, en el tamaño del bucle de poli-A (4-21 bases de longitud), en la Tm de la región del tallo (Tm = 44-53ºC) y en la longitud total del tallo (10-15 bases de longitud).

Además de los cambios en la región del tallo, la secuencia diana para estas nuevas sondas cambió de p.CMV-1 a p.CMV-2, que solapaba en alguna medida con la secuencia de p.CMV-1. La secuencia reconocida por el brazo 5' biotinilado de las sondas con bucle solapa con la secuencia reconocida por el brazo 3' no biotinilado de las sondas de una sola molécula de primera generación. El brazo 3' no biotinilado de las sondas con bucle reconoce la secuencia que está inmediatamente cadena abajo de la región reconocida por el brazo biotinilado de esta sonda. En las sondas con bucle, los dos brazos tenían la misma Tm y eran idénticos en las seis variantes.

TABLA 7 Sondas con bucle

Nº	Secuencia 5'-3'	SEC ID Nº:
1	b-CAGCATCACACTAGTCTCTACTCGAGCAAAAAAAAAAAAAAA	30
	AA AAAAACACTCGAGCGCTCTAAGACATAGCAGCA
2	b-AGCATCACACTAGTCTCTACACACACATCGAGCATTCGACA	31
	CAC ACACGCTCTAAGACATAGCAGCA
3	b-CAGCATCACACTAGTCTCTACACTCGAGCACACAAAAAAAA	32
	AAA ACACACTCGAGCACGCTCTAAGACATAGCAGCA
4	b-CAGCATCACACTAGTCTCTACTCGAGCACACACAAAAAAAA	33
	AAA ACACACACTCGAGCGCTCTAAGACATAGCAGCA
5	b-CAGCATCACACTAGTCTCTACACACCTCGAGCAAAAAAAAAA	34
	AAAAAAAAAAAACACTCGAGACACACGCTCTAAGACATAGCAGCA
6	b-CAGCATCACACTAGTCTCTACACTCGAGCACACAAAAAAAAAA	35
	AAAAAACACACTCGAGCACGCTAAGACATAGCAGCA
b = biotinilación 5'.

Para ensayar la eficacia de hibridación de una sonda con bucle con un ADN de CMV bicatenario, se emplearon fragmentos de diferentes longitudes de ADN de CMV en reacciones de hibridación separadas.

Se añadieron aproximadamente 1 pm de bucle 3 (Tabla 7) y 500 fm de un fragmento de ADN de CMV bicatenario de 263 pb a una fila de 12 pocillos de una placa de 96 pocillos. Se añadieron 1 pm de sonda de bucle 3 y 500 fm de un fragmento de ADN de CMV bicatenario de 35 pb a otra fila de 12 pocillos de la misma placa.

El ensayo de hibridación se realizó como se ha descrito anteriormente, con la excepción de que se añadieron 100 ng/ml de ARNt como vehículo. Las reacciones se cubrieron con aceite mineral y las placas se calentaron a 95ºC durante 10 minutos para permitir la separación de las cadenas. La placa después se transfirió a un bloque de gradiente de temperaturas en el que cada columna de la placa se incubaba a una temperatura diferente, que variaba de 44ºC a 66ºC, con incrementos de 2ºC. Después de la incubación en el bloque de gradiente de temperaturas, se analizaron alícuotas de 10 \mul de cada muestra por un gel de poliacrilamida nativo al 12%. Los fragmentos biotinilados se visualizaron como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en las Figuras 8a-b.

En el intervalo de temperaturas ensayado (44ºC a 66ºC), no se observó hibridación con el fragmento de CMV bicatenario de 263 pb (Figura 8b), mientras que se observó una hibridación eficaz de la sonda con el fragmento de ADN de CMV bicatenario de 35 pb a temperaturas de hasta 58ºC (Figura 8a). Estos resultados sugieren que la re-hibridación dependiente de la longitud de la diana puede afectar a la eficacia de hibridación de la sonda a altas temperaturas. Para solucionar la re-hibridación del ADN diana, deben emplearse una mayor concentración de sonda y menores temperaturas de reacción. Sin embargo, como se muestra en el siguiente experimento, estos problemas se superan cuando se usa una sola plantilla de ADN monocatenaria.

También se examinó la eficacia de hibridación de la sonda del bucle 2 (Tabla 7) con un fragmento de ADN monocatenario o un fragmento de ADN bicatenario. Los resultados se presentan en las Figuras 9a-b.

Se incubaron aproximadamente 1 pm de sonda 2 con bucle y 500 fm de un ADN de CMV sintético bicatenario (Figura 9a) o monocatenario (Figura 9b) (syn.CMV-2st.ds o CMV-2.st antisentido, respectivamente) en NaCl 200 mM en un volumen final de 25 \mul. La preparación de ADN de CMV monocatenario (CMV-2.st antisentido) es una cadena antisentido sintética no biotinilada que corresponde perfectamente al tamaño de los brazos con especificidad de diana de la sonda del bucle 2. La preparación de ADN de CMV bicatenario (syn.CMV-2st.ds) es una mezcla 1:1 de esta cadena antisentido con una cadena con sentido biotinilada de la misma secuencia de ADN de CMV (CMV-2.st con sentido). Se emplearon las siguientes condiciones de hibridación: 1 hora a 44ºC (calle 1); una hora a 44ºC seguido de 10 minutos a 95ºC (calle 2); 1 hora a 44ºC seguido de 10 minutos a 95ºC y una hora a 68ºC (calle 3); 1 hora a 68ºC (calle 4). Como puede verse en las Figuras 9a-b, cuando la sonda con bucle se incubó sólo con cadena de CMV-2.st antisentido (Figura 9b), el híbrido fue estable tanto a 44ºC como a 68ºC y pudo reformarse a 68ºC, después de un calentamiento de 10 minutos a 95ºC (calle 3). En presencia de la cadena complementaria del ADN diana (CMV-2.st con sentido, Figura 9a), el híbrido bucle-antisentido se formó a 44ºC (calle 1) y permaneció estable después de 10 minutos de incubación a 95ºC (calle 2). Sin embargo, cuando se aplicaron tiempos de incubación prolongados a 68ºC, no se formó ningún híbrido estable (calles 3 y 4). Esto ocurre a pesar del hecho de que la sonda estaba en presente en un exceso de 20 veces con respecto al ADN diana bicatenario. De esta manera, a partir de estos resultados se concluyó que a una relación de concentraciones dada entre un ADN diana y una sonda, se requiere una menor temperatura de reacción para permitir que la sonda con bucle hibride eficazmente con el ADN diana en presencia de las dos cadenas.

Para analizar adicionalmente la eficacia de hibridación de sondas con bucle con el ADN de la plantilla, se analizó el grado de hibridación de la sonda y la escisión a diversas concentraciones de ADN de plantilla monocatenario. Los resultados se muestran en la Figura 10a-c.

El ensayo consistía en 2 series idénticas de 7 tubos, conteniendo cada tubo 500 fm de la sonda de bucle 5 (Tabla 7) y cantidades decrecientes de un fragmento de ADN de CMV de 35 pb monocatenario (CMV-2.st antisentido) en un volumen final de 25 \mul. La relación molar entre CMV-2.st antisentido y la sonda fue 1:1, 1:4, 1:10, 1:40, 1:100, 1:400 en los tubos 1 a 6, respectivamente. No se añadió ADN de CMV al tubo Nº 7. El ensayo se realizó en presencia de 100 ng/\mul de ARNt como vehículo, a pH = 8,5 y NaCl 200 mM. Los tubos se incubaron a 53ºC para permitir la hibridación de la sonda-ADN. A partir de una serie de tubos, se analizaron alícuotas de 10 \mul de cada muestra por medio de un gel nativo de poliacrilamida al 12% (Figura 10a). Al final de la etapa de hibridación, se añadió TaqI a cada tubo de la segunda serie de tubos, a una concentración final de 0,15 u/\mul, y las muestras se incubaron durante 2 horas. Se analizó una alícuota de 10 \mul de cada muestra de la segunda serie de tubos en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 15% que contenía urea 7 M (Figura 10b) para detectar los fragmentos biotinilados monocatenarios. Las mismas muestras también se analizaron por un gel nativo al 12% para detectar tanto los fragmentos bicatenarios como los fragmentos monocatenarios (Figura 10c).

Como se muestra en las Figuras 10a-c, la escisión de la sonda dependiente de CMV puede detectarse con tan sólo 50 fm de ADN. Además, la eficacia de escisión de la sonda no se redujo tras la reducción de 4 a 10 veces en la concentración del híbrido, lo que sugiere la presencia de amplificación de la sonda. Esta conclusión se confirma adicionalmente cuando se cargan las mismas mezclas de reacción en un gel de acrilamida nativo al 12%, como se muestra en la Figura 10g. En estas condiciones, se detectaron los productos de escisión que presentaban menor movilidad en el gel. Este resultado sugiere que los productos de la sonda escindida permanecen unidos al ADN de CMV. Sin embargo, en presencia de altas concentraciones de sonda libre, los productos de la sonda escindida que hibridan con el ADN de CMV se reemplazan por la sonda intacta, indicando que efectivamente se produce el reciclado del ADN diana. De esta manera, este experimento demuestra que pueden conseguirse un reciclado de la plantilla y amplificación de señales usando sondas con bucles sintetizadas de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención.

Variantes de sonda con bucles

Las variantes de las sondas con bucle incluían cambios en las regiones de tallo y de bucle para reducir la escisión independiente de ADN de CMV y permitir un mejor reconocimiento, asociación y escisión del tallo por las enzimas de restricción utilizadas. Pueden realizarse varias estrategias para reducir la escisión independiente del ADN de CMV: puede generase una región de bucle que asuma la configuración de bucle y tallo en presencia del ADN diana y se pliegue para bloquear el sitio de restricción en ausencia del ADN plantilla. La región del tallo puede acortarse sólo a 4 pb, reduciendo de esta manera la formación del tallo independiente de la plantilla. Pueden realizarse varias estrategias para mejorar la eficacia de la escisión: la porción de base de la pseudo-doble hélice puede cerrarse por debajo del sitio de restricción por un dúplex real (de 2 pb de longitud) para formar un pseudo-dúplex/bucle abultado, de 10 pb de longitud. El sitio de restricción puede estar situado entre 2 pseudo-dúplex/bucles abultados, cada uno de 7 pb de longitud. Un nucleótido del sitio de restricción puede modificarse sólo en una cadena, en cuyo caso la pérdida de estabilidad producida por esta modificación puede compensarse aumentando la longitud del tallo. Finalmente, la escisión dependiente del ADN de CMV puede mejorarse por la adición de un dúplex real (de 3 pb de longitud) en cada lado del sitio de restricción y por el reemplazo del bucle poli-A por un bucle pseudo-dúplex.

Sondas bloqueadas

Las sondas bloqueadas se caracterizan por la capacidad de la sonda no hibridada de plegarse para formar una estructura dúplex intrínseca que no contiene sitios de restricción (SEC ID Nº: 36-37, véase la Figura 2). Una sonda bloqueada es estable debido a la alta Tm de las interacciones intramoleculares de esta estructura dúplex. Cuando se pliega de esta manera, la sonda puede hibridar con una molécula diana, sin embargo, sólo parte del brazo no biotinilado estará disponible para esta hibridación y, por lo tanto, dicho híbrido de diana/sonda será inestable. De esta manera, debe favorecerse energéticamente un estado híbrido estable de tal forma que la fuerza directora para un cambio configuracional de esta sonda sea una reducción de su estado de energía. Para que el brazo de longitud completa esté disponible para la hibridación con el ADN diana, debe disociarse la estructura dúplex que no contiene sitios de restricción. Esta disociación produciría una pérdida temporal de estabilidad de la sonda (por ejemplo, cambio de la Tm de Tm = 52ºC/69ºC a Tm = 41ºC/64ºC, respectivamente), sin embargo, la hibridación con una diana podría compensar esta pérdida de estabilidad.

Ejemplo 7 Sondas bivalentes (BIV)

Como se muestra en la Figura 2, las sondas bivalentes son sondas emparejadas diseñadas para reconocer conjuntamente dos secuencias de ADN diana. Cada miembro de oligonucleótido del par tiene una secuencia de tallo flanqueada por un brazo de reconocimiento de la diana en cada extremo. Cada miembro de oligonucleótido está biotinilado en su extremo 5'. Este diseño de sonda tiene el objetivo de estabilizar adicionalmente la formación del tallo y de aumentar la dependencia de la formación del tallo en presencia del ADN diana. Las sondas BIV pueden usarse para detectar dos secuencias monocatenarias idénticas (BIV1), dos cadenas complementarias de una secuencia bicatenaria dada (BIV2) o dos regiones del mismo polinucleótido o dos secuencias monocatenarias no relacionadas (BIV3). Se diseñó y se sintetizó una sonda BIV 3 que se dirigía a una mezcla de CMV-2 antisentido/con sentido, a CMV-6 (SEC ID Nº: 38) o a la secuencia p.CMV-263.ds. La sonda comprende 5'-b-CAGCATCACACTAGTCTCAATTCGAAGCGGATGACCATG TACGG-3, (SEC ID Nº: 39) y 5'-b-CACTAGTGACGCTTGTATCGCTTCG AATTCTCTAAGACATAGCAGCA-3, (SEC ID Nº: 40).

Co-detección de dos cadenas individuales idénticas (BIV1)

Para la detección de dos cadenas individuales idénticas, cada miembro de la sonda bivalente incluye un brazo que reconoce el extremo 3' de una secuencia diana y un brazo que reconoce el extremo 5' de la secuencia diana. Como con las sondas BIV1 se necesitan dos veces más moléculas diana para formar un tallo estable, puede reducirse la sensibilidad del ensayo. Sin embargo, como los dos miembros del par están marcados, la escisión de cada par producirá dos productos de escisión marcados, compensando de esta manera la mayor necesidad de moléculas diana.

Co-detección de dos cadenas complementarias para una secuencia bicatenaria dada (BIV2)

Para la detección de dos cadenas complementarias de una secuencia bicatenaria, el brazo 5' de un miembro de la sonda bivalente y el brazo 3' del segundo miembro se diseñan para hibridar con la cadena antisentido de una secuencia diana, mientras que los otros brazos de los dos miembros se diseñan para reconocer la cadena con sentido del mismo ADN diana. La ventaja de este diseño con respecto a las sondas emparejadas descritas anteriormente es que las sondas BIV2 pueden competir con la reacción de re-hibridación de un ADN diana bicatenario, lo cual tiene como resultado una mayor sensibilidad del ensayo.

Co-detección de dos cadenas individuales no relacionadas (BIV3)

BIV3 permite la detección de dos secuencias monocatenarias independientes, y de esta manera presenta dos nuevas opciones de detección. En primer lugar, pueden co-detectarse dos secuencias no adyacentes del mismo ADN diana, aumentando de esta manera la especificidad del ensayo y reduciendo falsos positivos sin necesidad de aumentar la concentración de ADN. Como alternativa, puede usarse un par de sondas para reconocer dos moléculas diana independientes. Para este fin, el brazo 5' de un miembro de la sonda bivalente y el brazo 3' del segundo miembro están diseñados para reconocer una diana, mientras que los otros brazos de los dos miembros están diseñados para reconocer un segundo ADN diana independiente.

Ejemplo 8 Estrategias de detección fluorescente

Como se ha detallado anteriormente en este documento, la detección de una sonda y de sus productos de restricción se efectuó usando sondas biotiniladas y métodos colorimétricos. Aunque este método de detección es adecuado para detectar diversas configuraciones de hibridación cuando se combina con separación en gel, detecta tanto la sonda hibridada como la sonda no hibridada y, por lo tanto, no es adecuado para fines de diagnóstico. Para proporcionar un diagnóstico adecuado pueden usarse varios métodos de detección.

Por ejemplo, puede usarse un colorante indicador fluorescente y un grupo inactivador que flanquea el sitio de restricción de la misma cadena. El inactivador puede capturar la energía emitida por el grupo fluorescente y, por lo tanto, siempre que los dos grupos estén suficientemente próximos entre sí, no se emitirá fluorescencia cuando se excite el grupo fluorescente. Para permitir una hibridación intra-sonda y la formación de un tallo bicatenario en presencia del ADN diana, el colorante indicador fluorescente y el grupo inactivador pueden colocarse en los extremos de la región del tallo, en la secuencia entra la primera y tercera regiones en sondas mono- y bimoleculares, y en el bucle en sondas monomoleculares o en el extremo de la región del tallo en sondas bimoleculares. En estas posiciones, se minimiza el efecto de los colorantes sobre la hibridación (véanse las Figuras 3a-b). Para una escisión eficaz del tallo por una endonucleasa de restricción, se necesita un espaciador de 4-18 bases entre el colorante indicador fluorescente y un grupo inactivador, dependiendo de la enzima de restricción que se vaya a usar. Después de la escisión enzimática, el colorante indicador fluorescente y el grupo inactivador se separan entre sí y se dispersan en solución. Como consecuencia, no existe la transferencia de energía desde el grupo fluorescente al inactivador y puede detectarse fluorescencia.

Como la fluorescencia puede detectarse según avanza la reacción, es posible una medición a tiempo real de la amplificación. La intensidad y velocidad de aumento de fluorescencia puede permitir la estimación del número de moléculas diana presentes en la mezcla y la velocidad de amplificación. Esto, a su vez, implica que las sondas sintetizadas de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención también pueden usarse como reactivos complementarios para el seguimiento de ensayos de PCR a tiempo real, en los que la detección de la diana típicamente se realiza sólo después de que se haya completado la amplificación. Además, como las señales generadas por estas sondas se autoamplifican, las sondas pueden aumentar la sensibilidad de un ensayo de PCR y permitir la reducción en el número de ciclos térmicos requeridos para la detección de la diana.

Las sondas de la presente invención pueden utilizar muchas combinaciones de fluorescente/inactivador. En la técnica comúnmente se usan combinaciones en las que el donador procede del grupo xanteno de colorantes, incluyendo fluoresceínas, y el inactivador procede del grupo de colorantes de rodamina (6-FAM y TAMRA, por ejemplo). Cy5 y ROX son otro par de colorantes que pueden usarse. Usando este par, puede obtenerse un cambio de 20 veces en la fluorescencia en presencia de la diana.

También pueden usarse inactivadores no fluorescentes tales como DABSYL y QSF-7. Estos inactivadores permiten un mayor grado de flexibilidad en la elección de los colorantes fluorescentes. La elección del par de colorantes requiere que el inactivador absorba la energía del colorante fluorescente cuando los dos están cerca. Es preferible que el aumento de fluorescencia tras la separación del colorante sea lo más grande posible (se notificó un aumento de 3-20 veces en fluorescencia para diversos sistemas de transferencia de energía). Cuando sólo se usa un colorante fluorescente, debe elegirse un colorante con la mayor intensidad de fluorescencia (que normalmente tiene un amplio espectro de emisión). Si se diseñan dos sondas que llevan los mismos grupos fluorescente/inactivador para la detección de dos regiones distintas de la misma diana, puede aumentarse la sensibilidad del ensayo. Como alternativa, también pueden usarse dos o más sondas que se dirigen a diferentes dianas siempre que se utilice una diferente combinación de colorantes fluorescentes/inactivadores. Sin embargo, cuando se usan dos o más colorantes fluorescentes, la sensibilidad del ensayo puede comprometerse para distinguir entre la fluorescencia de los diversos colorantes. Esto puede conseguirse por medio de la detección de espectros de emisión más estrechos, en los que la fluorescencia de los diversos colorantes no debe solapar.

Ejemplo 9 Detección por fluorescencia de ADN diana

Como plantilla de ADN diana se usó una muestra de 25 ó 250 fm de un segmento de 50 pb derivado de CMV (p.CMV-1). La secuencia de la plantilla de ADN fue la siguiente: 5,-TCAGGCTTGGTTATCAGAGGCCGCT TGGC
CAGCATCACA CTAGTCTCCTC-3, (SEC ID Nº: 41).

Una sonda emparejada se marcó covalentemente con un grupo fluorescente 6-FAM en el extremo 5' del miembro de oligonucleótido que corresponde a la región 3' de la secuencia diana. 10 bases cadena abajo del grupo FAM, un grupo inactivador QSY-7 se unió covalentemente a un resto de timidina en la base del tallo de la sonda emparejada 2 (secuencia en la Tabla 2).

El ensayo se realizó en presencia de NaCl 200 mM, Tris 10 mM, pH 7,8 y MgCl_{2} 10 mM, a 62ºC, en un volumen final de 25 \mul.

Las muestras se hirvieron durante 5 minutos para permitir la separación de las cadenas y después se enfriaron a 62ºC durante 15 minutos para permitir la hibridación de la sonda con su secuencia complementaria en el ADN diana. Después de la hibridación de la sonda, se añadió endonucleasa TaqI en una concentración final de 0,17 u/\mul para permitir la digestión de la sonda. Después un periodo de incubación de dos horas, las reacciones se detuvieron con EDTA 10 mM.

La fluorescencia de FAM se midió usando un fluorómetro que tenía una lámpara de arco de xenón y monocromadores de rejilla para controlar las longitudes de onda de excitación y de emisión (496 nm y 516 nm, respectivamente). Como blanco se usaron muestras tomadas antes de la adición de las enzimas. La diferencia en fluorescencia en presencia de ADN de CMV y en su ausencia indicó la escisión dependiente de CMV de la sonda y, de esta manera, también puede estimarse la cantidad de ADN de CMV.

Se aprecia que ciertas características de la invención que, por claridad, se describen en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. A la inversa, diversas características de la invención que, por brevedad, se describen en el contexto de una sola realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada.

Aunque la invención se ha descrito junto con sus realizaciones específicas, es evidente que para los especialistas en la técnica serán evidentes muchas alternativas, modificaciones y variaciones. Por consiguiente, se pretende incluir todas estas alternativas, modificaciones y variaciones que están dentro del amplio alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Además, la cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no deberá considerarse una admisión de que tal referencia está disponible como técnica anterior para la presente invención.

<110> Alajem, Sara et al.

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<120> OLIGONUCLEÓTIDOS Y COMBINACIONES DE LOS MISMOS ÚTILES EN LA DETECCIÓN DE LA PRESENCIA O AUSENCIA DE SECUENCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS DIANA EN UNA MUESTRA

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<130> 00/21340

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<151> 29-11-1999

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<160> 47

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<170> PatentIn versión 3.0

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<210> 1

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<211> 263

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<212> ADN

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<213> Citomegalovirus humano (cepa AD169)

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<400> 1

6

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<210> 2

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial;

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<220>

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<221> característica_diversa

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<223> cebador

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

agaccttcat gcagatctcc

\hfill

20

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<210> 3

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial;

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<220>

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<221> característica_diversa

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<223> cebador

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<400> 3

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ggtgctcacg cacattgatc

\hfill

20

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<210> 4

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<211> 263

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<212> ADN

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<213> Citomegalovirus humano (cepa AD169);

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<220>

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<221> característica_diversa

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<223> antisentido;

\newpage

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<400> 4

7

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<210> 5

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<211> 50

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<212> ADN

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<213> Citomegalovirus humano (cepa AD169);

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<400> 5

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tcaggcttgg ttatcagagg ccgcttggcc agcatcacac tagtctcctc

\hfill

50

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<210> 6

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Citomegalovirus humano (cepa AD169);

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<400> 6

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ggccagcatc acactagtct cctctaagac atagc

\hfill

35

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<210> 7

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<211> 59

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<212> ADN

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<213> Citomegalovirus humano (cepa AD169);

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<400> 7

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ggccagcatc acactagtct cctctaagac atagcagcac agcacccgac agaactcac

\hfill

59

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<210> 8

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> característica_diversa

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<223> oligonucleótido sintético;

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<220>

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<221> característica_diversa

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<222> (1)..(1)

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<223> Biotinilado en el extremo 5'

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

cagcatcaca ctagtcctcct ctaagacata gcagca

\hfill

36

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<210> 9

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial;

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<220>

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<221> característica_diversa

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<223> oligonucleótido sintético

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<400> 9

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tgctgctatg tcttagagga gactagtgtg atgctg

\hfill

36

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<210> 10

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial;

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<220>

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<221> característica_diversa

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<223> oligonucleótidos hibridados

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<220>

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<221> característica_diversa

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<222> (1)..(1)

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<223> Biotinilado en el extremo 5' de la cadena con sentido

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<400> 10

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cagcatcaca ctagtctcct ctaagacata gcagca

\hfill

36

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<210> 11

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<221> característica_diversa

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<223> oligonucleótido sintético;

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<220>

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<221> característica_diversa

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<222> (1)..(1)

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<223> Biotinilado en el extremo 5'

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<400> 11

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tggttatcag aggccgctta aaattcgaag ggttcac

\hfill

37

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<210> 12

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial;

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<220>

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<221> característica_diversa

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<223> oligonucleótido sintético;

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtgaaccctt cgaattcaca gcatcacact agtctcc

\hfill

37

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggttatcag aggccgctta aaattcgaag gg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccttcgaat tcacagcatc acactagtct cc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcttggtta tcagaggccg cttaaaattc gaaggg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccttcgaat tcacagcatc acactagtct cctctaa

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggttatcag aggccgctta aaattcgaag ggttcacga

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgtgaaccc ttcgaattca cagcatcaca ctagtctcc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcatcaca ctagtctcca gctagttcga cgcgccacgc gtc

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaactagcta ctctaagaca tagcagcaca gcacccgaca gaactcactt aag

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> m6a

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtacgggggc ataaattcaga acgc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtacgggggc ataaattcga acgc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttttttttg cgttcgaaatt tctctctctt aagtgagt

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcactagtga cgcttgtatg atgaccatgt acgggggcat aaattcgaac gc

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (48)..(48)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> m6a

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcactagtga cgcttgtatg ataccatgt acgggggcat aaattcgaac gc

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccagcatca cactaccccc tcgaggattc gaaaaaacct ctaagacata gcag

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcatcaca ctagtcactc gaggagaccc gtgtcgaacc tcctctaaga catagcag

\hfill

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaactcactt aagagagaga tgcccccgta catggtcatc atacaagcgt cactagtgac

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcatcaca ctagtctcaa ttcgaagcgg atgaccatgt acgg

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cactagtgac gcttgtatcg cttcgaattc tctaagacat agcagca

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Citomegalovirus humano (cepa AD169);

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaggcttgg ttatcagagg ccgcttggcc agcatcacac tagtctcctc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgtgtggaa acaatgtgta atgagtacaa ggtcactagt gacgcttgta tgatgacca

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggtttgac ccttgtactca ttacacattg tttccacaca t

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgaatttgac cttgtactca ttacacat

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggtcatcat acaagcgtca ctagaattcg aacggttttt ttccgtt

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catcatacaa gcgtcactag aattcgaacg gtttttttcc gtt

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atacaaagcgt cactagcaatt cgaacggttt ttttccgtt

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgtgtggaa acaatgtgta atgagtacaa ggtcagtagt gacgcttgta tgatgacca

\hfill

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético;

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_diversa

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Biotinilado en el extremo 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttcatcata aaagcgtcac tagaatt

\hfill

27

Claims (13)

1. Un par de oligonucleótidos útil para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo el par de oligonucleótidos un oligonucleótido de anclaje y un oligonucleótido amplificador, incluyendo cada uno de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador una primera región que es capaz de hibridar con la secuencia de ácido nucleico diana, incluyendo además cada uno de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador una segunda región, siendo capaces dichas segundas regiones de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador de formar una estructura dúplex que incluye una secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos después de la hibridación de dichas primeras regiones de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador con la secuencia de ácido nucleido, donde dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador se seleccionan de tal forma que cuando hibridan con la secuencia de ácido nucleico diana en presencia de un agente de escisión de ácidos nucleicos que reconoce dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos, sólo se escinde dicho oligonucleótido amplificador por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos, donde dicha escisión de dicho oligonucleótido amplificador conduce a la disociación de dicho oligonucleótido amplificador de la secuencia de ácido nucleico diana mientras que dicho oligonucleótido de anclaje permanece hibridado con la secuencia de ácido nucleico diana para formar un híbrido estabilizado de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana, permitiendo de esta manera que un segundo oligonucleótido amplificador no escindido hibride con dicho híbrido de oligonucleótido de anclaje-ácido nucleico diana, con lo que se posibilita el reciclado de dicho híbrido de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana con respecto a dicho oligonucleótido amplificador.

2. El par de oligonucleótidos de la reivindicación 1, donde en condiciones de hibridación predeterminadas, dicha primera región de dicho oligonucleótido amplificador puede hibridar de forma estable con dicha secuencia de ácido nucleico diana sólo si dicha primera región de dicho oligonucleótido de anclaje puede hibridar de forma estable con dicha secuencia de ácido nucleico diana.

3. El par de oligonucleótidos de la reivindicación 1, donde al menos un nucleótido o enlace internucleotídico de dichos oligonucleótidos de anclaje que forma parte de dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos incluye una modificación seleccionada para prevenir la escisión de dicho oligonucleótido de anclaje por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos.

4. El par de oligonucleótidos de la reivindicación 1, donde dicha estructura dúplex se forma en parte por auto-hibridación de una porción de dicha segunda región de dicho oligonucleótido amplificador.

5. Un kit útil para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo el kit oligonucleótido de anclaje y oligonucleótido amplificador, incluyendo cada uno de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador una única primera región que es capaz de hibridar con la secuencia de ácido nucleico diana, incluyendo además cada uno de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador una segunda región, siendo capaces dichas segundas regiones de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador de formar una estructura dúplex que incluye una secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos después de la hibridación de dichas primera regiones de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador con la secuencia de ácido nucleico diana, donde dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador se seleccionan de tal forma que cuando hibridan con la secuencia de ácido nucleico diana en presencia de un agente de escisión de ácidos nucleicos que reconoce dicha secuencia de reconocimiento de escisión de ácidos nucleicos, sólo se escinde dicho oligonucleótido amplificador por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos, donde dicha escisión de dicho oligonucleótido amplificador conduce a la disociación de dicho oligonucleótido amplificador de la secuencia de ácido nucleico diana mientras que dicho oligonucleótido de anclaje permanece hibridado con la secuencia de ácido nucleico diana para formar un híbrido estabilizado de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana, permitiendo de esta manera que un segundo oligonucleótido amplificador no escindido hibride con dicho híbrido de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana, con lo que se posibilita el reciclado de dicho híbrido de oligonucleótido de anclaje-ácido nucleico diana con respecto a dichos oligonucleótidos amplificadores.

6. El kit de la reivindicación 5, donde en condiciones de hibridación predeterminadas, dicha primera región de dicho oligonucleótido amplificador puede hibridar de forma estable con dicha secuencia de ácido nucleico diana sólo si dicha primera región de dicho oligonucleótido de anclaje puede hibridar de forma estable con dicha secuencia de ácido nucleico diana.

7. El kit de la reivindicación 5, donde la cantidad de dicho oligonucleótido amplificador es 250 nM y la cantidad de dicho oligonucleótido de anclaje es 50 nM.

8. Un método para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, comprendiendo el método las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra con un sistema de oligonucleótidos en condiciones de hibridación para formar una mezcla de reacción, incluyendo dicho sistema de oligonucleótidos un oligonucleótido de anclaje y un oligonucleótido amplificador, incluyendo cada uno de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador una primera región que es capaz de hibridar con la secuencia de ácido nucleico diana, incluyendo además cada uno de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador una segunda región, siendo capaces dichas segundas regiones de dichos oligonucleótido de anclaje y amplificador de formar una estructura dúplex que incluye una secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos después de la hibridación de dichas primeras regiones de dichos oligonucleótidos de anclaje y amplificador con la secuencia de ácido nucleico diana, donde dichos oligonucleótido de anclaje y amplificador se seleccionan de tal forma que cuando hibridan con la secuencia de ácido nucleico diana en presencia de un agente de escisión de ácidos nucleicos que reconoce dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos, sólo dicho oligonucleótido amplificador se escinde por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos, donde la escisión de dicho oligonucleótido amplificador conduce a la disociación de dicho oligonucleótido amplificador de la secuencia de ácido nucleico diana mientras que dicho oligonucleótido de anclaje permanece hibridado con la secuencia de ácido nucleico diana para formar un híbrido estabilizado de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana, permitiendo de esta manera que un segundo oligonucleótido amplificador no escindido hibride con dicho híbrido de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana, con lo que se posibilita el reciclado de dicho híbrido de oligonucleótido de anclaje-secuencia de ácido nucleico diana con respecto a dicho oligonucleótido amplificador;

(b) añadir dicho agente de escisión de ácidos nucleicos a dicha mezcla de reacción en condiciones de reacción predeterminadas de tal forma que, si la secuencia de ácido nucleico diana está presente en la muestra, dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos se escinde por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos; y

(c) controlar la escisión de dicha secuencia de escisión de ácidos nucleicos por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos; donde la escisión de dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos indica hibridación del sistema de oligonucleótidos a la secuencia de ácido nucleico diana y, por lo tanto, la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana en la muestra.

9. El método de la reivindicación 8, donde en dichas condiciones de hibridación, dicha primera región de dicho oligonucleótido amplificador puede hibridar de forma estable con dicha secuencia de ácido nucleico diana sólo si dicha primera región de dicho oligonucleótido de anclaje puede hibridar de forma estable con dicha secuencia de ácido nucleico diana.

10. El método de la reivindicación 8, donde al menos un nucleótido o enlace internucleotídico de dicho oligonucleótido de anclaje que forma parte de dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos incluye una modificación seleccionada para prevenir la escisión de dicho oligonucleótido de anclaje por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos.

11. El método de la reivindicación 8, donde dicha estructura dúplex se forma en parte por auto-hibridación de una porción de dicha segunda región de dicho oligonucleótido amplificador.

12. El método de la reivindicación 8, donde una secuencia de dicha primera región de dicho oligonucleótido de anclaje se selecciona de tal forma que dicho oligonucleótido de anclaje permanezca hibridado con dicha secuencia de ácido nucleico diana en dichas condiciones de reacción predeterminadas, mientras que dicha secuencia de dicha primera región de dicho oligonucleótido amplificador se selecciona de tal forma que dicho oligonucleótido amplificador se disocie de dicha secuencia de ácido nucleico diana en dichas condiciones de reacción predeterminadas, después de la escisión de dicha secuencia de reconocimiento de agente de escisión de ácidos nucleicos por dicho agente de escisión de ácidos nucleicos.

13. El método de la reivindicación 8, donde la Tm de dicha primera región de dicho oligonucleótido de anclaje es mayor que la Tm de dicha primera región de dicho oligonucleótido amplificador.