ES2255064T3 - Procedimientos de produccion de helicobacter sp antigenico potenciado y vacunas que comprenden el mismo. - Google Patents
Procedimientos de produccion de helicobacter sp antigenico potenciado y vacunas que comprenden el mismo.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN METODOS DE UTILIZACION DE PROCEDIMIENTOS IN VITRO PARA INDUCIR O MEJORAR LA EXPRESION DE ANTIGENOS BACTERIANOS ENTERICOS O FACTORES DE VIRULENCIA. LOS METODOS, POR TANTO, PRODUCEN BACTERIAS ENTERICAS ANTIGENICAMENTE MEJORADAS. TAMBIEN SE DESCRIBEN METODOS DE UTILIZACION DE LA BACTERIA ANTIGENICAMENTE MEJORADA, ASI COMO VACUNAS QUE CONTIENEN LA BACTERIA ENTERICA. ESPECIFICAMENTE, UNA BACTERIA ENTERICA O COMPONENTES DE LA MISMA ESTAN PROVISTAS POR ESPECIES HELICOBACTER. ADEMAS HAY OTRAS BACTERIAS ENTERICAS QUE SON UTILES PARA LA INVENCION DESCRITA. UN TIPO, CAMPYLOBACTER JEJUNI, SE DESCRIBE GRAFICAMENTE EN DONDE SE MUESTRAN LOS RESULTADOS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO DE MONOSACARIDOS DE HIDROLISATOS DE EXTRACTO DE SUPERFICIE DE C. JEJUNI.
Description
Procedimientos de producción de Helicobacter
sp antigénico potenciado y vacunas que comprenden el mismo.
Esta invención se refiere en general a
procedimientos in vitro para inducir o incrementar la
expresión de antígenos bacterianos entéricos y/o factores de
virulencia produciendo así bacterias entéricas potenciadas
antigénicamente, con procedimientos para utilizar bacterias
entéricas potenciadas antigénicamente y con vacunas que comprenden
bacterias entéricas potenciadas antigénicamente.
Es ampliamente reconocido que las bacterias
cultivadas in vitro utilizando medios y condiciones
convencionales expresan características que son diferentes de las
características expresadas durante el crecimiento en sus ambientes
naturales, lo que incluye el crecimiento in vivo de la
microflora normal o de patógenos en un huésped animal. Por lo
tanto, tales bacterias patogénicas crecidas in vitro podrían
no ser apropiadas para utilizar como componentes de vacunas. Sin
embargo, si fuera posible definir condiciones que provoquen o
incrementen la expresión de los factores de virulencia, la
fisiología pertinente o los antígenos, incluidos los antígenos de
la superficie externa, se podría entonces identificar rápidamente
importantes productos terapéuticos (por ejemplo, nuevos antígenos
para vacunas, nuevas dianas para antibióticos y características
microbianas novedosas para aplicaciones de diagnóstico).
Se han identificado diversos factores ambientales
que influyen en la expresión de los determinantes de virulencia en
bacterias (Mekalanos, J.J. J. Bacteriol.
174:1-7, 1992). Por ejemplo, existe una larga
historia de investigación de la relación entre el hierro y la
virulencia de las bacterias, particularmente de la Shigella
(Payne, Mol. Microbiol., 3:1301-1306, 1989).
Neisseria (Payne y Finkelstein, J. Clin. Microbiol.,
6:293-297, 1977) y Pasteurella (Gilmour y
col., Vaccine, 9:137-140, 1991).
Otras señales ambientales de las que se ha
demostrado que controlan la expresión de los determinantes de
virulencia regulados de manera coordinada de una amplia variedad de
bacterias en plantas y animales incluyen compuestos fenólicos,
monosacáridos, aminoácidos, temperatura, osmolaridad y otros iones
(Mekalanos, J. Bacteriol. 174:1-7, 1992).
Los patógenos bacterianos que entran en un
huésped animal a través del intestino (es decir, por vía oral)
encuentran numerosos componentes y condiciones ambientales del
huésped que pueden afectar a la fisiología bacteriana y a la
expresión de los factores de virulencia. Estos componentes y
condiciones incluyen la bilis, los ácidos o sales biliares, el pH
del estómago, las condiciones microaerófilas (el intestino tiene
niveles altos de CO_{2} y bajos de O_{2}), osmolaridad y muchos
otros no definidos todavía. Los patógenos entéricos invasivos
requieren una síntesis de novo de proteínas para lograr la
internalización (Headley y Payne, Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA, 87:4179-4183, 1990). Por lo tanto, las
bacterias pueden producir de manera óptima estos factores invasivos
solamente como respuesta a ciertas señales ambientales que no se
encuentran normalmente presente in vitro. Esta hipótesis
recibe el respaldo de un informe reciente que demuestra que los
antisueros preparados contra C. jejuni cultivado
convencionalmente tuvieron solamente un efecto marginal sobre el
bloqueo de la internalización in vitro (Konkel y col., J.
Infect. Dis., 168:948-954, 1993). Sin embargo,
la inmunización de conejos con extractos de Campylobacter
cultivados en presencia de monocapas de células epiteliales, una
condición que incrementa la invasión, resultó en la producción de un
antisuero que inhibió pronunciadamente la internalización de las
bacterias.
Varios investigadores han estado estudiando el
crecimiento de bacterias en el ambiente intestinal para identificar
los factores de virulencia pertinentes. Por ejemplo, la cepa
81-176 de Campylobacter crecida en los asas
ileales de conejo expresa proteínas que no expresa en condiciones
convencionales de laboratorio de cultivo in vitro (Panigrahi
y col., Infect. Inmun., 60:4938-4944, 1992).
Se ha visto una síntesis de proteínas nueva o potenciada en
Campylobacter cultivado con monocapas de células INT 407 en
comparación con bacterias cultivadas en ausencia de células
epiteliales (Konkel y col., J. Infect. Dis.,
168:948-954, 1993). Más aún, estos cambios se
asociaron temporalmente con una invasividad potenciada del C.
jejuni. Otros cambios tales como la morfología celular, la
pérdida de flagelos, la expresión de una nueva proteína de membrana
externa y la alteración de los carbohidratos de la superficie
celular fueron inducidos o potenciados en una cepa no virulenta de
C. jejuni cuando fueron pasados intravenosa y
corioalantoidea a través de embriones de pollo (Field y col., J.
Med. Microbiol., 38:293-300, 1993).
Otros componentes intestinales, tales como los
ácidos sales biliares, son conocidos como inhibidores de algunas
bacterias, pero los ácidos biliares pueden desempeñar otro papel que
afecta la expresión de la virulencia por la bacteria.
Pope y Payne (93º Am. Soc. Microbiol.,
B-147, 1993) informaron que la Shigella
flexneri cultivada en medios de cultivo con quenodesoxicolato
de sodio muestran un incremento de tres a cinco veces la capacidad
de infección de las monocapas de células HeLa. Los autores
informaron, sin embargo, que otros detergentes y sales biliares
incluyendo colato, glicocolato, taurodesoxicolato, las series CHAPS,
digitonina y Tritón X100 y las sales de sodio de los mismos, no
tienen efecto sobre la invasividad de S. flexneri. Más aún,
un medio de cultivo con quenodesoxicolato tampoco tiene ningún
efecto sobre la invasividad del E. coli u otras cepas no
virulentas de Shigella.
La síntesis de proteínas nuevas por el S.
flexneri también es inducida mediante cambios del pH, la
temperatura y la composición iónica del medio de cultivo iones
(Mekalanos, J. Bacteriol. 174:1-7, 1992).
La publicación de solicitud de patente PCT número
WO 93/22423, publicada el 11 de noviembre de 1993, divulga
procedimientos para el crecimiento de bacterias en lípidos, tales
como fosfatidilserina o moco y para el aislamiento de proteínas
cuya expresión se incrementa mediante el crecimiento ante la
presencia de fosfatidilserina. Esta referencia no divulga ni
sugiere los procedimientos de la presente invención para producir
bacterias entéricas que tengan virulencia o propiedades antigénicas
potenciadas.
Todavía no se encuentran disponibles vacunas
contra muchos patógenos entéricos, tales como Campylobacter y
Shigella, pero la epidemiología de estos agentes infecciosos
hacen que dichas vacunas sean un objetivo de importancia. La
shigelosis es endémica en todo el mundo y en los países en
desarrollo representa aproximadamente un 10% de las 5 millones de
muertes infantiles anuales debidas a la diarrea. Se sabe ahora que
Campylobacter, aunque sólo recientemente haya sido
identificada como un patógeno entérico, es una de las causas
principales de la enfermedad diarreica tanto en los países
desarrollados como en los países en desarrollo. Se estima que
anualmente se producen entre 400 a 500 millones de diarreas causadas
por Campylobacter, y más de 2 millones de casos tienen lugar
en los Estados Unidos.
La shigelosis es una consecuencia de la invasión
bacteriana de la mucosa del colon. Esta invasión está asociada con
la presencia de un plásmido que se encuentra en todos los aislados
invasivos (Sansonetti y col., Infect. Inmun.,
35:852-860, 1982). Un fragmento de este plásmido
contiene los genes del antígeno de invasión del plásmido (Ipa), Ipa
A, -B, -C y -D. Las proteínas Ipa B, -C y -D son esenciales para el
proceso de entrada (Baudry y col., J. Gen. Microbiol.,
133:3403-3412, 1987).
Las proteínas Ipa son candidatos lógicos para
vacunas aunque no se ha establecido claramente su eficacia
protectora. Las Ipa B e Ipa C son proteínas inmunodominantes (Hale
y col., Infect. Inmun., 50:620-629, 1985).
Más aún, la proteína Ipa B de 62 kDa (la invasora que inicia la
entrada celular y funciona en la lisis de la vacuola fagocítica
vinculada a la membrana) (High y col., EMBO J.,
11:1991-1999, 1992) está altamente conservada entre
las especies de Shigella. La enfermedad prolongada que se
observa en los niños malnutridos que no tienen de manera
significativa un anticuerpo de mucosa anti Ipa de la Shigella
sugiere que la presencia de un anticuerpo de mucosa anti Ipa puede
limitar la diseminación y la seriedad de la infección.
Aunque se ha probado varios candidatos para la
vacuna contra la Shigella tanto en animales como humanos, no
se ha encontrado ninguno con éxito. A pesar del significado
potencial de las proteínas Ipa en la virulencia, la mayoría de los
candidatos para vacunas contra la shigelosis que se han desarrollado
están basados en el antígeno de lipopolisacárido, que tiene
determinantes específicos de serotipo. Se ha desarrollado una vacuna
del conjugado polisacárido-proteína administrada
parenteralmente, pero aún no ha demostrado una protección
significativa en los animales (Robbins y col., Rev. Inf.
Dis., 13:S362-365, 1991). Una vacuna ribosómica
que se administra de una manera similar induce la inmunidad de
mucosa, pero aún no se ha demostrado su eficacia protectora
(Levenson y col., Arch. Allergy Appl. Inmunol.,
87:25-31, 1988).
La patogénesis de las infecciones por
Campylobacter no se conoce tan bien como las de las
infecciones por Shigella. Los estudios de invasión celular
in vitro (Konkel y col., J. Infect. Dis.,
168:948-954, 1993) y los exámenes histopatológicos
(Russell y col., J. Infect. Dis.,
168:210-215, 1993) sugieren que la invasión colónica
también es importante. Esta conclusión concuerda con la observación
de que la diarrea causada por Campylobacter puede ser grave
y estar asociada con sangre en las heces fecales. Estas actividades
pueden estar asociadas con la proteína flagelina de 62 kDa
inmunodominante. Un informe reciente indica que la presencia de
flagelos es esencial para que Campylobacter cruce las
monocapas de células epiteliales polarizadas (Grant y col.,
Infect. Inmun., 61:1764-1771, 1993).
No se ha establecido ningún antígeno de
Campylobacter que sea protector. Sin embargo, se piensa que
las proteínas de bajo peso molecular (28-31 kDa), o
proteínas PEB, y la proteína flagelar inmunodominante son
prometedoras en este respecto (Pavlovskis y col., Infect.
Inmun., 59:2259-2264, 1992; Blaser y Gotschilch,
J. Biol. Chem., 265:14529-14535, 1990). La
importancia de la proteína flagelar está indicada por su asociación
con la colonización del intestino y con la protección de cepa
cruzada contra la infección dentro de los subgrupos Lior (Pavlovskis
y col., Infect. Inmun., 59:2259-2264, 1992).
Sin embargo, una vacuna para Campylobacter que se base en
proteínas flagelares puede tener que incluir el antígeno de la
proteína flagelar de los 8 a 10 serogrupos Lior de mayor relevancia
clínica.
En el Resumen B-147 del 93º
Encuentro de la Sociedad Estadounidense de Microbiología, Sesión
133, de 1993, Pope y col. divulgan que el cultivo de Shigella
flexneri en un medio que contenga desoxicolato de sodio
demuestra una infecciosidad potenciada de las monocapas de células
HeLa.
Panigrari y col., Infection and Immunity, 1992,
p4938-4944 describen la respuesta inmunitaria humana
a las proteínas de Campylobacter jejuni expresadas in
vivo.
El buscador de Taxonomía del NCBI identifica que
Campylobacter pylori y Helicobacter pylori son
sinónimos.
Por lo tanto, los objetos de la presente
invención incluyen 1) las condiciones de cultivo in vitro
para cultivar o tratar bacterias entéricas que óptimamente induzcan
o incrementen las actividades invasivas y/o ciertas características
celulares incluyendo características de la superficie celular; 2) la
correlativa invasividad modificada o características celulares que
incluyen características de la superficie con cambios en los
perfiles antigénicos; 3) la virulencia potenciada de estos
organismos en modelos de animales pequeños; y 4) los antisueros
contra organismos con invasividad potenciada o características
modificadas que incluyen características de la superficie que son
más eficaces para neutralizar organismos vivos utilizados para
desafíos in vitro o in vivo que los antisueros
preparados contra bacterias que se han hecho crecer de manera
convencional. Esta invención se dirige a estas necesidades, entre
otras.
Ninguna de las referencias que se tratan
anteriormente enseñan ni sugieren los procedimientos in vitro
de la presente invención ni las vacunas de dicha invención que
comprenden bacterias entéricas potenciadas antigénicamente. La cita
o identificación de cualquier referencia en esta sección o en
cualquier otra sección de esta solicitud no deberá interpretarse
como una indicación de que dicha referencia esté disponible como
técnica anterior a la invención.
Esta invención proporciona condiciones de cultivo
definidas y componentes incorporados en un medio de cultivo de
Helicobacter pylori o Helicobacter felis para inducir
o incrementar la presencia de factores de virulencia y otros
antígenos. Preferentemente, tales antígenos son inmunogénicos. Más
preferentemente, tales antígenos inmunogénicos se correlacionan con
los índices de virulencia.
Las bacterias se hacen crecer en presencia de
condiciones y componentes que simulan ciertas condiciones in
vivo a las cuales los organismos están expuestos en la
naturaleza. Los procedimientos de la presente invención producen
bacterias entéricas potenciadas antigénicamente con cambios
fenotípicos tales como un incremento de proteína total por célula,
proteínas individuales nuevas o potenciadas, carbohidratos de
superficie modificados o aumentados, lipopolisacáridos de
superficie modificados, capacidad de adhesión potenciada, capacidad
de invasión potenciada y/o escape intracelular aumentado. Más aún,
los procedimientos de la presente invención son adaptables a
fermentaciones para usos comerciales mediante prácticos aumentos de
escala progresivos.
Dichas bacterias antigénicamente potenciadas
pueden utilizarse para producir vacunas protectoras, tales como
vacuna de célula entera inactivada o subunidades, o para fines de
diagnóstico tales como la producción de anticuerpos y la detección
de bacterias patogénicas o para producir antibióticos. Además, los
antibióticos inducidos por las bacterias entéricas potenciadas de
la presente invención pueden ser usados como vacunas pasivas.
Por lo tanto, un aspecto de la presente invención
es un procedimiento para producir Helicobacter pylori o
Helicobacter felis de acuerdo con la reivindicación 1.
Un aspecto adicional de la invención es
Helicobacter pylori o Helicobacter felis de acuerdo
con la reivindicación 4.
Otro aspecto de la invención es una vacuna de
acuerdo con la reivindicación 4.
Aún otro objeto adicional de la invención es un
procedimiento in vitro para detectar la producción por parte
de un huésped de antibióticos para bacterias en una muestra animal o
biológica del mismo, procedimiento que comprende los pasos de la
puesta en contacto una muestra biológica de un huésped con bacterias
de la presente invención que tengan propiedades antigénicas
potenciadas y la evaluación de las interacciones
anticuerpo-antígeno.
Otro objeto de la presente invención se relaciona
con un kit de diagnóstico para detectar la producción de
anticuerpos de la bacteria por parte de un huésped.
La presente invención está basada, en parte, en
el descubrimiento sorprendente de que las bacterias antigénicamente
potenciadas de la invención inducen respuestas inmunitaria que
proporcionan una protección cruzada contra una amplia gama de cepas
o serotipos de la misma especie bacteriana que son inducidas por las
mismas bacterias pero que se haya hecho crecer utilizando
condiciones de cultivo convencionales. En al menos una ocasión, la
respuesta inmunitaria inducida por las bacterias entéricas
antigénicamente potenciadas es la protección cruzada contra una
especie diferente de bacteria entérica.
La Figura 1 presenta gráficamente el efecto de la
concentración de la bilis y de la fase de crecimiento del cultivo
de Helicobacter pylori sobre la adhesividad de células
NB3-2 de Helicobacter pylori. Se hicieron
crecer células NB3-2 de H. pylori en un
medio de cultivo que contenía bilis al 0%, 0,025%, 0,05% o 0,1% y se
recogieron a las 8, 10, 12 y 18 horas después de la inoculación. Se
muestra la invasividad de estas distintas preparaciones de células
NB3-2 de H. pylori contra las células
INT-407. Véase el Ejemplo 38 en la Sección 14 para
mayores detalles.
La Figura 2 presenta gráficamente el efecto de la
concentración de la bilis y de la fase de crecimiento del cultivo
de Helicobacter pylori sobre la adhesividad de células
G1-4 de Helicobacter pylori. Se hicieron
crecer células G1-4 de H. pylori en un medio
de cultivo que contenía bilis al 0%, 0,1% o 0,2% y se recogieron a
las 6, 8, 10, 12, 14 y 16 horas después de la inoculación. Se
muestra la invasividad de estas distintas preparaciones de células
G1-4 de H. pylori contra las células
INT-407. Véase el Ejemplo 38 en la Sección 15 para
mayores detalles.
Los procedimientos de la presente invención se
relacionan con el crecimiento de bacterias Helicobacter
pylori o Helicobacter felis en presencia de una
combinación de ciertas condiciones con ciertos componentes
seleccionados para inducir o incrementar la expresión de antígenos
y/o los factores de virulencia.
Los términos "componentes" y
"condiciones" de la manera en que se utilizan en la presente
memoria descriptiva y en las reivindicaciones se relacionan con
muchos factores asociados con un ambiente in vivo natural de
una bacteria y otros factores. Tales componentes y condiciones
incluyen, entre otros, bilis, ácidos biliares o sales de los mismos
o sus precursores biológicos tales como el colesterol, pH, condición
microaerófila, osmolaridad y la cosecha o recolección de las
bacterias en la fase de crecimiento bacteriano deseada.
El término "antígenos" y el término
relacionado "antigénico" de la manera en que se utilizan en la
presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones incluyen
antígenos o características antigénicas incluidas, entre otras,
macromoléculas que contribuyen a la morfología o motilidad celular;
proteínas; más particularmente proteínas, lipopolisacáridos y
carbohidratos de la superficie. Preferentemente dichos antígenos son
inmunogénicos.
El término " inmunogénico" de la manera en
que se lo utiliza en la presente memoria descriptiva y en las
reivindicaciones se refiere a la capacidad de inducir en un animal
la producción de anticuerpos después de que dicho animal haya sido
expuesto a una composición que comprenda bacterias enteras
producidas por la presente invención o un fragmento de dicha
bacteria entera.
El término "potenciado antigénicamente" o
"propiedades antigénicas potenciadas" o "potenciado/a" de
la manera en que se utiliza en la presente memoria descriptiva y en
las reivindicaciones se refiere al estado antigénico de bacterias
entéricas crecidas de acuerdo con los procedimientos de la presente
invención. Tales bacterias tienen niveles más altos de ciertos
antígenos inmunogénicos y/o antígenos inmunogénicos nuevos en
comparación con las mismas bacterias crecidas utilizando
procedimientos convencionales.
El término "convencional" de la manera en
que se utiliza en la presente memoria descriptiva y en las
reivindicaciones se relaciona con lo conocido en la técnica
anterior.
El término "condiciones microaerófilas" de
la manera en que se utiliza en la presente memoria descriptiva y en
las reivindicaciones se refiere a condiciones anaeróbica o a niveles
altos de CO_{2}, tales como del 5% al 20% de CO_{2} con del 80
al 95% de aire; o 5% de O_{2} con 10% de CO_{2} y 85% de
N_{2}.
El término "virulencia" de la manera en que
se utiliza en la presente memoria descriptiva y en las
reivindicaciones se refiere a aquellos factores de una bacteria
entérica asociados con la capacidad de adherirse y/o invadir a un
huésped y/o sobrevivir en el mismo y/o causar una condición
patológica.
El término "inmunoprotector cruzado" de la
manera en que se utiliza en la presente memoria descriptiva y en
las reivindicaciones se refiere a la capacidad de la respuesta
inmunitaria inducida por una cepa o serotipo bacteriano, célula
entera o de otra manera, de evitar o atenuar una infección de dicho
huésped por una cepa o serotipo bacteriano diferente o una especie
distinta del mismo género.
El término "inmunoreactivo cruzado" de la
manera en que se utilizan la presente memoria descriptiva y en las
reivindicaciones se refiere a la capacidad de la respuesta
inmunitaria humoral (es decir, anticuerpos) inducidos por una cepa
o serotipo bacteriano, célula entera o de otra manera, para
reaccionar de forma cruzada (es decir, enlazando el anticuerpo) con
una cepa o serotipo bacteriano diferente o una especie distinta del
mismo género. La inmunoreactividad cruzada es indicativa del
potencial del inmunógeno bacteriano para inmunoproteger de manera
cruzada y viceversa.
El término "huésped" de la manera en que se
utiliza en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones
se refiere tanto a un animal in vivo como a cultivos de
células del animal in vitro. El término "animal" de la
manera en que se utiliza en la presente memoria descriptiva y en las
reivindicaciones incluye, entre otras, animales de sangre caliente
tales como mamíferos y aves (por ejemplo, pollos, pavos, patos,
etc.).
De acuerdo con la invención, en una vacuna que
comprenda bacterias potenciadas antigénicamente, las bacterias
pueden estar tanto vivas como inactivadas y pueden además comprender
un adyuvante, tal como, entre otros, alumbre, una emulsión de
aceite y agua, la toxina termolábil de E. coli
enterotoxigénica (LT, por sus siglas en inglés), formas no
toxigénicas de la misma (por ejemplo, mLT) y/o subunidades
individuales de la misma, bacilo Calmette-Guerin
(BCG) o adyuvante de Freund y también pueden comprender además un
vehículo farmacéutico apropiado incluidos, entre otros, solución
salina, dextrosa o otras soluciones acuosas. Hay otros vehículos
farmacéuticamente apropiados descritos en Remington's
Pharmaceutical Sciences, Merck Publishing Company, un texto de
referencia estándar en este campo.
El término "bacterias inactivadas", de la
manera en que se utiliza en la presente memoria descriptiva y en
las reivindicaciones, se refiere a bacterias que son incapaces de
infección y/o colonización y abarca tanto bacterias atenuadas como
bacterias muertas. Las bacterias atenuadas pueden replicarse pero no
pueden causar infecciones ni enfermedades. La inactivación de
dichas bacterias puede lograrse por cualquier procedimiento
conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, las bacterias
pueden ser inactivadas químicamente, por ejemplo mediante fijación
con formalina, o inactivadas físicamente, como por ejemplo por medio
del calor, ultrasonidos o radiación, de tal manera que se impide su
replicación y/o capacidad de infección y/o de causar
enfermedades.
Se debe administrar una cantidad eficaz de la
vacuna, donde "cantidad eficaz" se define como una cantidad de
bacterias que sea capaz de producir una respuesta inmunitaria en un
sujeto. La cantidad necesaria variará con la antigenicidad de la
bacteria utilizada y la especie y el peso del sujeto que se va a
vacunar, pero puede determinarse mediante técnicas estándar. En
realizaciones preferidas pero no limitantes de la invención, una
cantidad eficaz de vacuna produce un incremento del título de
anticuerpos antibacterianos de al menos dos veces el título de
anticuerpos antes de la vacunación. En una realización preferida,
específica pero no limitante, de la invención se administran a un
huésped aproximadamente entre 10^{7} y 10^{11} bacterias y,
preferentemente, entre 10^{8} y 10^{10}. Se prefieren vacunas
que comprendan bacterias enteras inactivadas.
El término "cantidad eficaz" cuando se
aplica a vacunas pasivas es la cantidad de anticuerpo que es capaz
de prevenir o atenuar una enfermedad o infección bacteriana. La
cantidad necesaria dependerá del tipo de anticuerpo y del título
del mismo, y de la especie y el peso del sujeto que se va a vacunar,
pero puede determinarse utilizando técnicas estándar.
Las vacunas de la presente invención pueden
administrarse local y/o sistemáticamente por cualquier procedimiento
conocido en la técnica, incluido, entre otros, procedimientos que
empleen las vías intravenosa, subcutánea, intramuscular,
intravaginal, intraperitoneal, intranasal, oral u otras rutas a
través de la mucosa.
Las vacunas pueden administrarse en un vehículo
apropiado, farmacéuticamente no tóxico y pueden estar comprendidas
en microcápsulas y/o implantes de liberación controlada.
Puede ser conveniente que las vacunas se
administren a diversos intervalos para mantener los niveles del
anticuerpo.
Las vacunas de la invención pueden utilizarse
junto con otros procedimientos bactericidas o bacteriostáticos.
Los procedimientos para detectar anticuerpos en
un huésped incluyen inmunoensayos. Estos inmunoensayos son
conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, radioinmunoensayos
(RIA, por sus siglas en inglés), ensayos de inmunoadsorción
enzimática (ELISA, por sus siglas en inglés), inmunoensayos
fluorescentes e inmunoensayos de polarización de fluorescencia
(FPIA, por sus siglas en inglés).
Otra realización incluye equipos (kits) de
diagnóstico que comprenden todos los reactivos esenciales requeridos
para llevar a cabo un inmunoensayo deseado de acuerdo con la
presente invención. El equipo de diagnóstico puede presentarse en
una forma empaquetada comercialmente como una combinación de uno o
más recipientes que contengan los reactivos necesarios. Tales
equipos comprenden una bacteria de la presente invención, en
combinación con diversos componentes convencionales de equipos. Los
componentes convencionales de equipos serán fácilmente
identificables para aquellas personas capacitadas en la técnica y
son divulgados en numerosas publicaciones, incluyendo
Antibodies. A Laboratory Manual (E. Harlow, D. Lane, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Los componentes de equipos
convencionales pueden incluir artículos tales como, por ejemplo,
placas de microtitulación, amortiguadores para mantener el pH de la
mezcla de prueba (tales como, entre otros, Tris, HEPES, etc.) y
similares y otros reactivos estándar.
Los procedimientos de la presente invención
incluyen el crecimiento de bacterias en un medio de cultivo esencial
basal apropiado, tales como, entre otros, medios disponibles
comercialmente de medio de cultivo de infusión de cerebro y corazón
("BHI", por sus siglas en inglés), medio de cultivo de
Luria-Bertani ("LB", por sus siglas en
inglés), agar de sangre de oveja ("SBA", por sus siglas en
inglés), medio de cultivo de Brucella, medio de cultivo de
Meuller-Hinton, medio de cultivo con extracto de
carne y peptona Proteose, etc., con diversas condiciones y
componentes incluyendo, entre otras, bilis del 0,025% al 0,25%, a
una temperatura de 37ºC, hasta una fase de crecimiento de
aproximadamente la fase logarítmica temprana, entre la fase
logarítmica temprana y la estacionaria o aproximadamente la fase
estacionaria, en aire o en condiciones microaerófilas, tales como
del 5% al 20% de CO_{2}, con un 80% a 95% de aire o 5% de O_{2}
con 10% de CO_{2} y 85% de N_{2}; y opcionalmente en presencia
de un agente quelante de cationes divalentes tal como, entre otros,
de 0 a 100 \muM, preferentemente 25 \muM, de BAPTA/AM (ácido
2'(etilendioxi)dianilino n, n, n',
n'-tetraacético/éster acetoximetílico; Molecular
Probes, Eugene, OR), de 0 a 10 mM de EGTA (ácido
etilenbis(oxietilenonitrilo)-tetraacético;
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), de 0 a 100 \muM de EGTA/AM
(ácido
etilenbis(oxietilenonitrilo)-tetraacético/éster
acetoximetílico; Molecular Probes, Eugene, OR); donde la combinación
de condiciones y componentes resultante produce bacterias entéricas
potenciadas antigénicamente.
La sal de bilis útil para la presente invención
es glicocolato (GC).
Los cultivos pueden prepararse como soluciones
madre congeladas mediante procedimientos generalmente conocidos por
las personas capacitadas en la técnica y se mantienen a -80ºC para
un uso futuro. Las soluciones madre de Helicobacter pylori
pueden prepararse haciendo crecer el organismo en medio de cultivo
de infusión de cerebro y corazón ("BHI"). Las bacterias se
pueden recoger congelando mediante cualquier procedimiento conocido,
por ejemplo, limpiando el cultivo y volviéndolo a suspender en BHI
que contenga glicerol al 30%. Los cultivos para los experimentos
analíticos o para la producción de fermentaciones pueden prepararse
por cualquiera de los procedimientos generalmente conocidos, tales
como el crecimiento del organismo en BHI con agar al 1,5% a 37ºC
bajo MC o condiciones atmosféricas y luego transfiriendo una colonia
única al medio de cultivo y cultivando de acuerdo con los
procedimientos de la presente invención que se describen en la
presente memoria descriptiva. Las bacterias se pueden recoger
utilizando cualquiera de los procedimientos generalmente conocidos
por aquellas personas capacitadas en la técnica, por ejemplo
mediante centrifugación.
En realizaciones adicionales preferidas, se hacen
crecer células de Helicobacter pylori potenciadas
antigénicamente, preferentemente de las cepas ATCC 49503,
NB3-2 o G1-4, en un medio de cultivo
esencial basal, preferentemente medio de cultivo BHI, que además
comprende desde aproximadamente 0,05% hasta aproximadamente 0,2% de
bilis o aproximadamente 0,05% de glicocolato (GC) a 37ºC en una
mezcla de aproximadamente del 5% al 20% de CO_{2} con
aproximadamente del 80% al 95% de aire, o de aproximadamente del 10%
de CO_{2} con aproximadamente el 5% de O_{2} y aproximadamente
el 85% de N_{2} y recogida después de que el crecimiento del
cultivo haya alcanzado aproximadamente la fase logarítmica o
aproximadamente la fase estacionaria. En una realización más
preferida, las células se cosechan después de que el cultivo haya
alcanzado aproximadamente la fase logarítmica.
Las bacterias cultivadas de acuerdo con los
procedimientos de la presente invención tienen alteradas la
morfología y/o la motilidad celular y/o producen ciertas nuevas
proteínas, lipopolisacáridos y/o carbohidratos y/o tales
macromoléculas a niveles alterados en comparación con células
cultivadas solamente en un medio basal. Se pueden identificar las
condiciones de cultivo óptimas que incrementen la producción celular
y los índices de patogenicidad. Utilizando estas condiciones de
cultivo, se pueden identificar los antígenos asociados con la
virulencia que son potenciados o inducidos.
Los cambios de motilidad y morfológicos brutos
pueden observarse mediante un examen microscópico ya sea de
bacterias no tratadas o de bacterias teñidas. Es posible que
pudieran aparecer otros cambios morfológicos a partir de los
procedimientos de la presente invención como podría observarse por
medio de microscopía electrónica o microscopía de
fluorescencia.
La morfología y las características similares al
moco de las bacterias entéricas cultivadas de acuerdo con los
procedimientos de la presente invención sugieren que se podría
inducir la expresión de la capa superficial y/o de la cápsula. Para
verificar la producción de la cápsula se pueden preparar extractos
fenólicos de los componentes de la superficie, tales como
proteínas, carbohidratos y lipopolisacáridos. Los carbohidratos
potenciados pueden observarse mediante cromatografía líquida de
alta presión (HPLC, por sus siglas en inglés).
Se pueden caracterizar los perfiles de las
proteínas de las membranas externas preparadas a partir de bacterias
entéricas, crecidas bajo las condiciones de cultivo de la presente
invención que incrementan la virulencia, mediante electroforesis en
gel de dodecilsulfato de sodio y poliacrilamida
(SDS-PAGE, por sus siglas en inglés) y compararse
con los correspondientes a organismos crecidos en medios
convencionales. La SDS-PAGE se realiza para evaluar
los cambios inducidos en las proteínas celulares y extraídas de
bacterias en respuesta a condiciones que incrementan o alteran
antígenos. Estos datos presentan información cualitativa y
cuantitativa con respecto a los cambios de la superficie asociados
con una invasividad incrementada o una antigenicidad alterada.
El potencial inmunogénico de antígenos de
proteínas inducidas o alteradas puede identificarse mediante el
ensayo Western Blotting. La inmunogenicidad de las proteínas
bacterianas inducidas o alteradas identificadas mediante
SDS-PAGE puede evaluarse mediante las técnicas de
Western Blotting generalmente aceptadas como se describe a
continuación. Se puede utilizar cualquier fuente de anticuerpos, tal
como suero de hurón o de conejo inmune convaleciente (fuente de
anticuerpo de animales infectados oralmente con organismos vivos
crecidos de manera convencional o de acuerdo con los procedimientos
de la presente invención), moco intestinal (fuente de anticuerpo
IgA) o antisuero policlonal.
La producción potenciada de varios de estos
antígenos bacterianos está acompañada por el incremento de las
propiedades asociadas con la virulencia. Estas propiedades incluyen
la adhesión a células epiteliales del intestino humano cultivadas y
la invasión de las mismas y unión de colorante rojo Congo. La prueba
de unión de colorante rojo Congo es un procedimiento predictivo de
virulencia generalmente aceptado y se describe a continuación así
como en Andrews y col., Infect. Inmun.,
60:3287-3295, 1992; y Yoder, Avian Dis.,
33:502-505, 1989. La unión bacteriana de rojo Congo
indica la capacidad de unirse a la hemina, capacidad que se
correlaciona con la virulencia. La unión de rojo Congo también se
correlaciona con una invasión bacteriana potenciada de las células
epiteliales.
Los procedimientos de la presente invención para
la producción de bacterias potenciadas antigénicamente se
correlacionan con la virulencia potenciada en modelos de animales
pequeños. Junto con Helicobacter pylori, el modelo de
colonización gástrica del Helicobacter felis descrito por
Chen y col., Lancet, 339:1120-1121, 1992, se
utiliza para evaluar el potencial de la vacuna de H. pylori
producida por los procedimientos de la presente invención.
Las bacterias potenciadas antigénicamente
producidas por los procedimientos de la presente invención se
utilizan para preparar prototipos de vacunas de células enteras
muertas o de subunidades. Cuando se administran estas vacunas a
animales, se puede demostrar que inducen anticuerpos y, por lo
tanto, se establece el potencial protector de las vacunas. La
elevación o inducción de estos antígenos en una célula bacteriana
produce células de las que se hacen vacunas más eficaces.
Las preparaciones que son candidatas para vacunas
producidas por los procedimientos de la presente invención pueden
utilizarse con diversas estrategias de inmunización de mucosa para
inducir una respuesta inmunitaria intestinal. Los protocolos de
inmunización exitosos pueden entonces ser utilizados para proteger
animales expuestos a los patógenos con o sin antigenicidad
potenciada. Las vacunas también pueden formularse y probarse como
vacunas combinadas.
Los enfoques experimentales escritos a
continuación permiten la detección de cambios en los antígenos de
superficie y otras características que están asociadas con una
invasividad potenciada. Estos cambios son tanto cualitativos como
cuantitativos. De modo más importante, estos experimentos establecen
que los procedimientos de la presente invención incrementan la
invasividad e inducen antígenos inmunogénicamente relevantes. Tales
bacterias antigénicamente potenciadas inducen una respuesta
inmunogénica que es protectora contra infecciones de una gama más
amplia de cepas, serotipos y/o especies bacterianas y son por lo
tanto útiles como vacunas eficaces en comparación con bacterias
crecidas de manera convencional.
Existen diversos modelos bien establecidos y
generalmente conocido por aquellas personas capacitadas en la
técnica que son útiles para evaluar las propiedades antigénicas,
virulencia de las bacterias y eficacia de la vacuna potenciadas
como se describe a continuación.
A continuación se describen ejemplos no
limitantes de la presente invención.
Se agregó Helicobacter pylori a un medio
de cultivo BHI junto con suero de ternero bovino al 4%. Después de
la inoculación, los matraces se lavaron con O_{2} al 5%, CO_{2}
al 10% y N_{2} al 85% y se incubaron durante 22 horas a 37ºC con
agitación. Después de la incubación, se transfirieron 2,5 ml del
cultivo a un matraz que contenía medio de cultivo BHI con suero de
ternero bovino al 4% o el mismo medio que contenía además
glicocolato de sodio al 0,05%. Estos cultivos se lavaron nuevamente
con la mezcla gaseosa (O_{2} al 5%, CO_{2} al 10% y N_{2} al
85%) y se incubaron durante 20 a 24 horas a 37ºC. Las células se
recogieron como se describe con anterioridad.
Se agregó Helicobacter pylori a un medio
de cultivo BHI más suero de ternero bovino al 4%. Después de la
inoculación, los matraces se lavaron con O_{2} al 5%, CO_{2} al
10% y N_{2} al 85% y se incubaron durante 22 horas a 37ºC con
agitación. Después de la incubación, se transfirieron 2,5 ml del
cultivo a un matraz que contenía medio de cultivo BHI con suero de
ternero bovino al 4% o el mismo medio que contenía además bilis
bovina entre aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,2%. Estos
cultivos se lavaron nuevamente con la mezcla gaseosa microaerófila
(O_{2} al 5%, CO_{2} al 10% y N_{2} al 85%) y se incubaron
durante 20 a 24 horas a 37ºC. Las células se recogieron como se
describe con anterioridad.
Se potencia la adherencia de H. pylori
mediante el crecimiento en glicocolato o bilis. Se agregaron
células de las cepas NB3-2 o G1-4 de
H. pylori a un medio de cultivo BHI más suero de ternero
bovino al 4%. Después de la inoculación, los matraces se lavaron
con CO_{2} al 10%, O_{2} al 5% y N_{2} al 85% y se incubaron
durante 22 horas a 37ºC con agitación. Después de esta incubación,
el cultivo se diluyó 1 a 10 en un matraz que contenía 1 litro del
medio BHI con suero de ternero bovino al 4% con varias
concentraciones de bilis bovina (de 0,025% a 0,2%). Estos cultivos
se lavaron nuevamente con la misma mezcla gaseosa y se incubaron a
37ºC. Las células se recogieron a diversos tiempos hasta 18 horas y
se probó su adherencia a las células INT-407
utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 28. Los resultados
mostraron que cultivando con bilis incrementó la adhesividad de
H. pylori a las células INT-407 (vea la
Figura 1 y la Figura 2). Para la cepa NB3-2, el
pico de adhesividad, un incremento de 4 a 6 veces la correspondiente
a un cultivo no potenciado, ocurrió después de las aproximadamente
8 horas de crecimiento (Figura 1). Para la cepa
G1-4, la el pico de adhesividad, un incremento de 2
a 3 veces la correspondiente a un cultivo no potenciado, ocurrió
después de entre 12 a 14 horas de crecimiento en 0,2% de bilis
(Figura 2). Estos tiempos "pico" generalmente corresponden al
período en que el cultivo de cada cepa se encontraba en la fase
logarítmica de crecimiento.
Se determinó la eficacia protectora de células
enteras de Helicobacter pylori fijadas con formalina y
crecidas de acuerdo con los procedimientos de la presente invención
utilizando el modelo de colonización gástrica de Helicobacter
felis en ratones descrito por Chen y col. (Lancet,
339:1120-1121, 1992). La cepa G1-4
de Helicobacter pylori creció como preinóculo durante
aproximadamente 22 horas a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 10%
y aire al 90% en un medio BHI que contenía suero de ternero bovino
al 4%. Se utilizó una alícuota de este cultivo para inocular un
volumen 10 veces mayor del mismo medio, el que contenía bilis bovina
al 0,1% (v/v). Tras 12 a 14 horas de crecimiento a 37ºC, las
células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en
1/10 del volumen original de la solución de sales de Hank
equilibradas (HBSS, por sus siglas en inglés) a temperatura
ambiente. Las células se volvieron a centrifugar y nuevamente se
suspendieron en 1/100 del volumen original de HBSS. A la suspensión
celular amortiguada, se agregó formalina a una concentración del
0,075% y se inactivaron las células agitando la suspensión a
temperatura ambiente durante 6 horas y luego enfriando la solución a
4ºC durante 18 horas.
El potencial protector se midió de manera
habitual administrando 3 dosis de esta vacuna de células enteras
inactivadas por vía oral a ratones hembras Balb/c, libres de
Helicobacter, de 6 a 8 semanas de edad, a los días 0, 7 y 14
o a los días 0, 7 y 21. Se evaluaron dosis de 10^{9} partículas de
bacterias por dosis en combinación con la enterotoxina de E.
coli termolábil. Catorce días después de la tercera dosis de
inmunización, los animales fueron expuestos oralmente con una dosis
única (10^{7} UFC/dosis) de H. felis vivo.
Dos semanas después de la exposición, los
animales se sacrificaron y se analizó la actividad ureasa en
segmentos de estómago antral para determinar la presencia de H.
felis. Se determinó la actividad ureasa incubando muestras de
tejido antral en 0,5 ml de medio de cultivo de ureasa de Stuart
(Remel) a temperatura ambiente durante 4 a 24 horas. El cambio de
color de claro a rojo que se produjo durante este período se tomó
como un resultado positivo para la ureasa.
Como se muestra en la Tabla 1, la administración
de una vacuna de células enteras de Helicobacter potenciadas
preparada utilizando la cepa G1-4 de H.
pylori protegió a los animales contra la exposición oral a H.
felis.
\vskip1.000000\baselineskip
| Organismos | |||
| Agentes | Expuestos | Colonizado/ | Porcentaje de |
| Inmunizantes^{a} | (10^{7} UFC) | Total | Protección |
| Experimento 1 | |||
| \hskip0,5cm H. pylori^{b} | H. felis | 4/13 | 71 |
| \hskip0,5cm PBS + LT | H. felis | 9/9 | 0 |
| Experimento 1 | |||
| \hskip0,5cm H. pylori^{b} | H. felis | 2/15 | 87 |
| \hskip0,5cm PBS + LT | H. felis | 10/10 | 0 |
| ^{a} \begin{minipage}[t]{152mm} Todos los agentes fueron dados con 10 \mug de LT (toxina lábil de ETEC, LT por sus siglas en inglés) como adyuvante en tres dosis orales a intervalos de 7 días. \end{minipage} | |||
| ^{b} Dado como 1 x 10^{9} UFC de cepa G1-4 en una dosis de 0,25 ml |
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de estos experimentos muestran la
relevancia de las propiedades bacterianas entéricas potenciadas para
la inmugenicidad in vivo.
Los procedimientos de la presente invención
producen bacterias capaces de inducir una respuesta inmunogénica que
es protectora y por lo tanto son útiles como vacunas.
Claims (16)
1. Un procedimiento para producir bacterias
Helicobacter pylori o Helicobacter felis que tengan
propiedades antigénicas potenciadas que comprende el crecimiento de
un cultivo de bacterias Helicobacter in vitro con cerebro y
corazón en una combinación de condiciones que comprenden:
- a)
- de 0,025% a 0,2% de bilis o 0,05% de sal glicocolato; y
- b)
- a una temperatura de 37ºC; y
- c)
- en una condición microaerófila, caracterizada porque la condición microaerófila comprende i) de 5% a 20% de CO_{2} con de 80% a 95% de aire; o ii) 5% de O_{2}, 10% de CO_{2} con 85% de N_{2};
durante un tiempo suficiente como
para que el cultivo se encuentre en la fase logarítmica
caracterizado porque la propiedad antigénica potenciada es
un nivel más alto de un antígeno inmunogénico o un antígeno
inmunogénico nuevo cuando se compara con la propiedad antigénica de
bacterias de un cultivo de la especie Helicobacter en un
medio de cultivo de infusión de cerebro y corazón complementado con
suero de ternero
bovino.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque las condiciones
comprenden 0,05% de sal biliar de glicocolato.
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, caracterizado porque dicho
Helicobacter es la cepa de NB3-2 de
Helicobacter pylori que tiene el No. de registro de ATCC
55174 o la cepa G1-4 que tiene el No. de registro de
ATCC 55173.
4. Una bacteria Helicobacter pylori o
Helicobacter felis que tenga propiedades antigénicas
potenciadas, que se obtiene cultivando bacterias Helicobacter
in vitro en un medio de cultivo de infusión de cerebro y
corazón complementado con suero de ternero bovino bajo una
combinación de condiciones que comprenden:
- a)
- de 0,025% a 2% de bilis bovina o 0,05% de sal glicocolato; y
- b)
- a una temperatura de 37ºC; y
- c)
- en una condición microaerófila, caracterizada porque la condición microaerófila comprende i) de 5% a 20% de CO_{2} con de 80% a 95% de aire; o ii) 5% de O_{2}, 10% de CO_{2} con 85% de N_{2};
durante un tiempo suficiente como
para que el cultivo se encuentre en la fase logarítmica donde la
propiedad antigénica potenciada es un nivel más alto de un antígeno
inmunogénico o un antígeno inmunogénico nuevo cuando se compara con
la propiedad antigénica de bacterias de un cultivo de la especie
Helicobacter en un medio de cultivo de infusión de cerebro y
corazón complementado con suero de ternero
bovino.
5. La bacteria Helicobacter de acuerdo
con la reivindicación 4, caracterizada porque dichas
condiciones comprenden 0,05% de glicocolato de sodio.
6. La bacteria Helicobacter de acuerdo con
la reivindicación 4, caracterizada porque dicha
Helicobacter es la cepa NB3-2 de
Helicobacter pylori que tiene el No. de registro de ATCC
55174 o la cepa G1-4 que tiene el No. de registro de
ATCC 55173.
7. Una vacuna que comprende la bacteria
Helicobacter de la reivindicación 4; y que comprende además
un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
8. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 7,
caracterizada porque dicha bacteria Helicobacter está
inacti-
vada.
vada.
9. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 8
caracterizada porque dicha bacteria Helicobacter se
inactiva mediante un tratamiento con formalina.
10. La vacuna de acuerdo con la reivindicación
7, caracterizada porque dicha vacuna es apropiada para una
administración vía mucosa o parenteral o para una administración vía
mucosa y parenteral.
11. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 7
que comprende además un adyuvante.
12. Un procedimiento para analizar un potencial
agente antimicrobiano caracterizado porque el procedimiento
comprende la puesta en contacto in vitro de la bacteria
Helicobacter de la reivindicación 4 con dicho agente y
analizar los efectos bactericidas o bacteriostáticos de dicho agente
sobre la bacteria Helicobacter.
\newpage
13. Un procedimiento para detectar los
anticuerpos de un huésped contra la bacteria Helicobacter en
un animal o una muestra biológica del mismo, que comprende los pasos
de a) poner en contacto in vitro dicha muestra biológica con
la bacteria Helicobacter de la reivindicación 4 y b) examinar
el enlace a anticuerpo de la bacteria Helicobacter o un
fragmento de la misma.
14. Un equipo de inmunoensayo de diagnóstico para
detectar en un huésped la producción a la bacteria
Helicobacter o para detectar la bacteria Helicobacter,
que comprende la bacteria Helicobacter de la reivindicación
4.
15. Un procedimiento para producir anticuerpos
anti Helicobacter en un animal no humano donde el
procedimiento comprende el uso de una cantidad eficaz de un
inmunógeno que comprende la bacteria Helicobacter de la
reivindicación 4, caracterizado porque los anticuerpos anti
Helicobacter se unen a dicha bacteria Helicobacter o a
un componente de la misma.
16. Un inmunógeno que comprende la bacteria
Helicobacter de la reivindicación 4 para estimular una
respuesta inmunitaria en un animal caracterizado porque dicho
inmunógeno se administra al animal y dicha respuesta inmunitaria
evita, atenúa o cura enfermedades o infecciones por
Helicobacter en el animal.
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