ES2254850T3 - Acuicultura de gusanos marinos. - Google Patents
Acuicultura de gusanos marinos.Info
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Abstract
Método para conservar larvas de poliqueto (Polychaeta) que comprende enfriar rápidamente las larvas que se han desarrollado hasta la fase en la que tienen tres parapodios que presentan cerdas bien desarrollados, y conservar o almacenar las larvas en condiciones criogénicas.
Description
Acuicultura de gusanos marinos.
Esta invención se refiere a la acuicultura de
gusanos marinos y particularmente, aunque no exclusivamente, a
métodos para la crioconservación de las larvas de gusanos
marinos.
El documento
US-A-4.155.331 describe un método
para la crioconservación de organismos pluricelulares, especialmente
crustáceos inmaduros tales como nauplius de gambas.
Los gusanos para cebos marinos son animales de la
clase de los Polychaete del filo Annelida o el filo
Sipunculida o son otros animales tales que se pueden denominar
generalmente gusanos que pueden usarse como cebos por pescadores.
Tales gusanos también se usan como alimentos para peces, crustáceos
y otros organismos, para pruebas de toxicidad y para otros fines
científicos.
Los suministros naturales de gusanos marinos no
son ilimitados y se ha reconocido la recogida de gusanos marinos
como una causa de preocupación medioambiental grave.
La acuicultura de gusanos marinos proporciona una
fuente sostenible. Sin embargo, el ciclo de reproducción estacional
de los gusanos marinos dificulta la provisión de un suministro
constante de gusanos a lo largo del año. Ya que la fecundidad
natural de los gusanos marinos hembra es muy elevada, un gran número
de huevos fertilizados están disponibles de vez en cuando, que son
un excedente de las necesidades y normalmente se desechan.
Según un primer aspecto, la presente invención
proporciona un método para conservar gusanos poliquetos según se
refiere en la reivindicación 1.
Según un segundo aspecto, la presente invención
proporciona un método para conservar gusanos poliquetos según se
refiere en la reivindicación 3.
Según un tercer aspecto, la presente invención
proporciona un método para recuperar gusanos poliquetos según se
refiere en la reivindicación 11.
La presente invención también proporciona un
método para de acuicultura de gusanos poliquetos según la
reivindicación 18.
Las características preferidas que pueden usarse
con aspectos de la invención se exponen en las reivindicaciones
dependientes.
La invención puede usarse como parte de un
programa de cría de gusanos. Un ejemplo de un programa de este tipo
se expone a continuación:
Las larvas que se van a conservar por medio de la
invención pueden derivarse de la fertilización de gusanos
marinos.
La fertilización puede llevarse a cabo mediante
la mezcla de huevos que pueden fertilizarse (ovocitos primarios,
ovocitos secundarios o fases posteriores) con espermatozoides
activos en concentraciones tales que son adecuadas para provocar una
reacción de fertilización en prácticamente todos los huevos
disponibles o mediante reproducción natural.
Los huevos que van a fertilizarse pueden
suspenderse en agua marina o en una disolución salina o constitución
similar o pueden suspenderse en agua marina una vez que se ha
llevado a cabo la reacción de fertilización. Se sabe que el método
de fertilización y la fase de diferenciación de las células
germinales en el momento de la fertilización varían entre diferentes
especies de gusanos. El método que va a seleccionarse para la
producción de huevos fertilizados debe ser apropiado para la
especie. El procedimiento puede suponer la retirada de células
germinales de la cavidad del cuerpo de los gusanos machos o hembras
cuando se ha observado que tienen características citológicas y
físicas que se sabe que están asociadas con la madurez sexual y de
desarrollo y la capacidad de tomar parte en la reacción de
fertilización, o en segundo lugar puede suponer el tratamiento de
los huevos con sustancias extraídas del sistema nervioso o de otros
tejidos corporales o con sustancias sintéticas tales como ácido
8,11,14-eicosatrienoico que se ha demostrado que
tiene un efecto en los procesos de maduración de las células
germinales de algunas especies de gusanos.
Las larvas que van a conservarse deben criarse en
condiciones adecuadas para su desarrollo y preferiblemente se habrán
dejado crecer en lotes independientes de larvas derivados de una o
un pequeño número de fertilizaciones llevadas a cabo al mismo tiempo
según el uso posterior de las larvas que puede requerir larvas de un
origen
conocido.
conocido.
Preferiblemente, las larvas estarán en la misma
fase de desarrollo cuando se seleccionen para el procedimiento de
conservación.
Las larvas deben mantenerse en condiciones
limpias, aunque no necesariamente estériles, en agua marina o algún
medio similar y apropiado con densidades lo suficientemente elevadas
como para ser económicas pero no lo suficientemente elevadas como
para producir la mortalidad. Normalmente, las larvas pueden
mantenerse en bandejas de poca profundidad que miden 75 x 45 x 7
cm, que contienen agua marina hasta una profundidad de
aproximadamente 5 cm y que contienen aproximadamente 50.000 larvas,
o alternativamente pueden suspenderse en recipientes de plástico
similares a cubos con densidades de aproximadamente 50.000 larvas
por litro con aireación suave u otro método de agitación del agua
marina.
Preferiblemente, no debe alimentarse a las larvas
y preferiblemente se las debe criar hasta la fase de desarrollo en
la cual está a punto de iniciarse la alimentación y se han absorbido
o utilizado las reservas de lípidos y de otros alimentos en los
tejidos del sistema digestivo.
Preferiblemente, las larvas que van a conservarse
deben estar en una fase uniforme de desarrollo según se determina
mediante examen microscópico. Preferiblemente, las larvas estarán en
la fase de desarrollo en la que ya pueden moverse independientemente
mediante cilios y/o mediante acción muscular y pueden haber
alcanzado la fase en la que se han formado tres segmentos
funcionales en las que han surgido cerdas pero en la que el cuarto
segmento no se ha desarrollado hasta una fase en la que están
presentes cerdas, y preferiblemente las larvas no habrán comenzado a
alimentarse aunque los tejidos del sistema digestivo pueden haber
alcanzado una fase de desarrollo en la que los animales están a
punto de comenzar a alimentarse.
Las larvas pueden concentrarse vertiéndolas en el
agua marina o en otro medio en el que se han estado desarrollando
sobre un tamiz de malla de nylon o dispositivo similar con un
espaciado de malla de aproximadamente 64 micras u otras dimensiones
tales que puedan resultar adecuadas para retener las larvas pero
permitir el movimiento libre del agua. Puede realizarse un tamiz
adecuado mediante el encolado de una malla de plástico a los bordes
de un vaso de precipitados de plástico al que se le ha cortado la
base, o puede usarse algún dispositivo similar de manera que las
larvas pueden introducirse en una serie de disoluciones y retirarse
de esas disoluciones sobre el
tamiz.
tamiz.
Preferiblemente, las larvas se introducirán sobre
el tamiz en un vaso que contiene una mezcla crioprotectora, y del
tamiz se introducirán en tubitos de plástico, que pueden recubrirse
con colesterol o bolsas de plástico, o bolsas de lámina de aluminio
u otro dispositivo tal que puede usarse con un congelador de
velocidad controlada.
Se anotará la hora a la que las larvas se
introducen en el dispositivo en el que las larvas se enfriarán, y se
controlará la duración total desde el momento de la primera
introducción hasta el momento en el que se hace funcionar el
protocolo de enfriamiento y será parte del procedimiento de la
operación.
La mezcla crioprotectora puede ser una que
contiene diversas concentraciones de dimetilsulfóxido (DMSO) o
1,2-propanodiol con o sin la adición adicional de
agentes orgánicos no penetrantes que pueden ayudar en el
procedimiento y que preferiblemente pueden ser una disolución de
DMSO 1,5 molar en agua marina.
En el caso en que el agente crioprotector es una
disolución de DMSO 1,5 molar en agua marina, normalmente el tiempo
total que debe transcurrir desde la introducción de las larvas hasta
la puesta en marcha del protocolo no debe ser superior a diez
minutos y preferiblemente puede no ser superior a cuatro
minutos.
Preferiblemente, las larvas se enfriarán a una
velocidad predeterminada que normalmente puede ser de entre 0,1 y
10ºC por minuto con o sin uno o más periodos de cambio de
temperatura nulo, y preferiblemente las larvas se enfriarán hasta
una temperatura de entre -25 y -35ºC dependiendo de la velocidad de
enfriamiento usada.
Las larvas pueden descongelarse y disponerse en
presencia de una mezcla crioprotectora congelada que conduce así a
la deshidratación de las larvas antes del enfriamiento rápido
posterior de las larvas, como por ejemplo mediante la inmersión de
las larvas en nitrógeno líquido.
En el caso en que la mezcla crioprotectora
contenga DMSO 1,5 molar en presencia de agua marina, preferiblemente
la temperatura será tal que menos del 6% del contenido en agua
isotónica en equilibrio con agua marina a 20ºC permanece antes del
enfriamiento rápido posterior de las larvas según se determina por
el cálculo previo del volumen de larvas en equilibrio con un soluto
descongelado con las características de osmolaridad de la
temperatura terminal con la debida tolerancia para la difusión de
agua y la permeabilidad de las larvas.
Las larvas de ragworm ("gusano de arena")
Nereis (Neanthes) virens pueden conservarse cuando se
encuentran en su fase de desarrollo de nechtochaete en la que están
presentes tres parapodios que presentan cerdas bien desarrollados
que funcionan por medio de músculos.
Preferiblemente, las larvas podrán moverse y
preferiblemente no habrán iniciado la formación del cuarto segmento
setígero o tendrán un cuarto segmento setígero rudimentario en el
que las cerdas no han aparecido pero pueden haberse desarrollado más
allá de cualquiera de los de las dos fases de desarrollo anteriores.
Preferiblemente, también habrán desarrollado el sistema digestivo
caudal hasta el punto en que una luz está presente según se indica
por una línea central oscura cuando se observan a través de un
microscopio. Conservar las larvas en esta fase en su desarrollo
puede potenciar su capacidad para seguir sin descongelarse en
presencia de una mezcla crioprotectora de hielo, para conservarse y
para recuperarse.
Las larvas pueden transferirse hasta una
temperatura de -196ºC mediante su inmersión en dispositivos tales
como tubitos, ampollas, bolsas y otros dispositivos tales en los que
se han enfriado en un vaso que contiene nitrógeno líquido o por
algún otro medio que pueda alcanzar las velocidades de enfriamiento
necesarias para impedir la formación de hielo y que pueda permitir
el mantenimiento permanente de las larvas a temperaturas de, o
cercanas a, -196ºC.
Las larvas pueden retirarse del recipiente en el
que se mantienen a, o cercanas a, -196ºC y mantenerlas en un baño de
agua a 20ºC o cercanas a esa temperatura durante un corto periodo
hasta que se observe que la mezcla crioprotectora congelada se
derrite. Las larvas pueden descargarse del dispositivo ya sea un
tubito, ampolla, bolsa u otra estructura sobre un tamiz. Las larvas
pueden introducirse en una disolución de agua marina u otro medio
adecuado con un volumen aproximadamente igual al volumen de mezcla
crioprotectora en la que se congelaron las larvas, y pueden
mantenerse en esta disolución durante dos minutos con agitación
suave antes de la introducción de un segundo volumen similar de
agua marina o medio similar durante otros dos minutos, tiempo el
cual se juzgará que el DMSO u otra sustancia crioprotectora ha
salido por difusión de las larvas en cantidad suficiente, y las
larvas pueden introducirse en un gran recipiente de agua marina
adecuado para el crecimiento adicional de las larvas. Las larvas
pueden lavarse dos veces mediante la sustitución del gran volumen de
agua en el que se han introducido con agua marina limpia para
retirar los restos de DMSO o tales agentes crioprotectores que
puedan haberse usado. Entonces, las larvas pueden mantenerse y
criarse hasta la fase en la que serían adecuadas para el fin
específico.
La invención puede usarse para controlar la época
del año en la que los gusanos marinos crecen y se desarrollan.
Las realizaciones que utilizan la presente
invención y se refieren a la conservación de gusanos marinos se
describen, a modo de ejemplo, en los ejemplos siguientes. Las
realizaciones de la presente invención que se describen pueden
aplicarse a las larvas del gusano poliqueto Nereis (=Neanthes)
virens, comúnmente denominado "King ragworm" en el RU.
Ejemplo
1
Etapa
1
Se retiraron ovocitos primarios, que tenían un
diámetro medio superior a 190 micras y que tenían un halo
translúcido transparente, y que se habían probado en primer lugar
con esperma maduro para confirmar que habían alcanzado una fase de
desarrollo en la que podían completar una reacción de fertilización
y desarrollarse posteriormente hasta la fase de nechtochaete, del
fluido celómico de una hembra de la especie Nereis (Neanthes)
virens criada desde el nacimiento en condiciones de producción
comercial a una temperatura en el intervalo de
18-20ºC durante toda la vida y en condiciones
fotoperiódicas ambientales.
Se mezclaron los ovocitos primarios en un número
de aproximadamente 300.000 con fluido celómico tomado de un gusano
macho que tenía espermatozoides disociados que se activarían y
mostrarían un movimiento hacía adelante tras la dilución con agua
marina en un volumen de un litro.
Etapa
2
Cinco minutos después de la adición del fluido
que contenía esperma al agua marina que contenía los ovocitos
primarios, se diluyó adicionalmente la mezcla esperma / ovocitos con
agua marina filtrada y se transfirió a una serie de bandejas que
contenían agua marina hasta una profundidad de 3 cm y se diluyó de
tal manera que el número de larvas no superó 5.000 larvas por
m^{2}.
Las larvas se desarrollaron en las bandejas
cubiertas con un fotoperiodo de 12L : 12O durante un periodo de diez
días a una temperatura de 12ºC sin alimentación ni adición de
alimentos de ningún tipo.
Etapa
3
Se tomaron muestras de larvas aleatoriamente de
la población de larvas en desarrollo en las bandejas y se determinó
la fase de desarrollo mediante el examen a través de un microscopio
binocular.
Se observó que las larvas tenían un sistema
digestivo bien desarrollado con gotitas de lípidos más bien pequeñas
en el que puede distinguirse la luz como una línea central
definida.
Se observó que las larvas tenían tres pares de
setígeros en los que habían aparecido cerdas y tan sólo un cuarto
setígero muy rudimentario en el que las cerdas no habían aparecido y
las larvas no habían empezado a alimen-
tarse.
tarse.
Se concentraron las larvas para los fines del
procedimiento sobre un tamiz de malla de nylon que se había
construido mediante el encolado de una red de 64 micras sobre un
tubo de plástico transparente, rígido, con un diámetro de 2 cm y que
se adecuaba idealmente al tratamiento de números relativamente
pequeños de larvas.
Etapa
4
Se suspendieron las larvas concentradas en agua
marina a una concentración de aproximadamente 1.000 larvas por
ml.
Se mezclaron las larvas en agua marina con una
disolución de DMSO en agua marina tal que la concentración final de
DMSO en la mezcla de agua marina / DMSO fue del 10% en volumen. Esto
se alcanzó mediante el mezclado de un volumen de agua marina /
larvas con tres volúmenes de DMSO al 13,34% en volumen en
agua
marina.
marina.
Se extrajo la mezcla que contenía las larvas en
tubitos de plástico de 0,5 ml y se cargó sobre un dispositivo para
sujetar tales tubitos y se introdujeron en una cámara de
enfriamiento de un congelador de velocidad controlada. El tiempo
total transcurrido desde la primera introducción de las larvas en la
mezcla de agua marina que contenía DMSO hasta la puesta en marcha
del proceso de enfriamiento fue de tres minutos.
Se llevaron los tubitos hasta una temperatura
inicial de 20ºC y luego se enfriaron según el siguiente protocolo.
Se enfriaron las larvas desde la temperatura inicial de 20ºC a una
velocidad de 5ºC por minuto hasta una temperatura de -5ºC, y luego
se enfriaron a una velocidad de 0,3ºC hasta una temperatura de
-25ºC.
Se introdujeron tres tubitos en la cámara del
congelador de velocidad controlada durante un periodo no superior a
tres minutos cada tubito, y habiéndose sometido las larvas en ellos
a las mismas etapas del procedimiento. De este modo se consideró que
cada tubito constituía un tratamiento repetido.
Etapa
5
Se retiraron los tubitos de la cámara del
congelador de velocidad controlada y se dejaron caer en nitrógeno
líquido en un vaso de vacío forrado en vidrio, y tras el
enfriamiento rápido de este modo se introdujeron en un recipiente
numerado en un gran vaso Dewar que contenía nitrógeno líquido en el
que debían almacenarse las larvas.
Etapa
6
Tras una semana, y en el mismo día, se retiró
cada uno de los tres tubitos del recipiente numerado y se
descongelaron mediante el mantenimiento del tubito en un baño de
agua a 20ºC hasta que se observó que el núcleo de hielo en el tubito
se fundió. Entonces se cortó el extremo del tubito y se descargaron
el líquido y las larvas en un volumen igual de agua marina en un
vaso de vidrio. Tras dos minutos, se añadió un volumen de agua
marina igual al volumen de la mezcla de mezcla de crioconservación /
agua marina / larvas combinada. Tras otros dos minutos, se añadió la
mezcla a un gran volumen (aproximadamente un litro) de agua marina
en un acuario de plástico transparente. Tras dos minutos, se
retiraron las larvas de este gran volumen de agua marina
vertiéndolas suavemente sobre un tamiz de 64 micras y se añadieron a
un volumen similar de agua marina limpia. Se repitió el
procedimiento y se mantuvieron lotes de larvas, con un número de
aproximadamente 200 larvas por lote, en agua marina esterilizada con
una densidad de aproximadamente una larva por ml en vasos de vidrio
a 12ºC durante un periodo de siete días.
El segundo día tras la alimentación, se alimentó
a las larvas mediante la introducción de 5 ml de un cultivo vivo de
tetraselmis suecica. Se agitaron y observaron diariamente los
recipientes, y se sustituyó el agua y se volvió a alimentar a las
larvas el tercer día.
Se determinó el número total de larvas
recuperadas del tubito para cada tubito tras tres horas. Tras un
periodo de siete días se determinó el número total de larvas que
podían moverse independientemente, que estaban evidentemente vivas y
que mostraban signos de una diferenciación adicional del cuarto
segmento setígero, y se calculó la tasa de supervivencia como el
número de tales larvas como un porcentaje de aquellas que se había
observado que estaban presentes tras tres horas.
Los resultados de estos exámenes se resumen en la
tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
| Nº de código | Nº total de larvas viables | Nº de larvas vivas que | Tasa de supervivencia |
| de repetición | observadas tres horas | pueden moverse el | observada (%) |
| después de retirarlas del | día siete | ||
| nitrógeno líquido | |||
| 1 | 120 | 55 | 45,8 |
| 2 | 206 | 109 | 52,9 |
| 3 | 90 | 23 | 25,6 |
| Total | 416 | 187 | 45,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Etapas 1 a
3
Las larvas seleccionadas para el ejemplo 2 eran
de origen idéntico a aquellas usadas en el ejemplo 1 y se siguieron
los mismos procedimientos para las etapas 1 a 3.
Etapa
4
Se suspendieron las larvas concentradas en agua
marina a una concentración de aproximadamente 1.000 larvas por
ml.
Se mezclaron las larvas en agua marina con una
disolución de DMSO en agua marina tal que la concentración final de
DMSO en la mezcla de agua marina / larvas / DMSO fue del 10% en
volumen. Esto se alcanzó mediante el mezclado de un volumen de agua
marina / larvas con tres volúmenes de DMSO al 13,34% en volumen en
agua
marina.
marina.
Se extrajo la mezcla que contenía las larvas en
tubitos de plástico de 0,5 ml y se cargó sobre un dispositivo para
sujetar tales tubitos y se introdujeron en una cámara de
enfriamiento de un congelador de velocidad controlada. El tiempo
total transcurrido desde la primera introducción de las larvas en la
mezcla de agua marina que contenía DMSO hasta la puesta en marcha
del proceso de enfriamiento fue de tres minutos.
Se llevaron los tubitos hasta una temperatura
inicial de 20ºC y luego se enfriaron según el siguiente protocolo.
Se enfriaron las larvas desde la temperatura inicial de 20ºC a una
velocidad de 2,5ºC por minuto hasta una temperatura de -35ºC, y
luego se mantuvieron a esa temperatura durante un minuto.
Se introdujeron tres tubitos en la cámara del
congelador de velocidad controlada durante un periodo no superior a
tres minutos cada tubito, y habiéndose sometido las larvas en ellos
a las mismas etapas del procedimiento. De este modo se consideró que
cada tubito constituía un tratamiento repetido.
\newpage
Etapa
5
Se retiraron los tubitos de la cámara del
congelador de velocidad controlada y se dejaron caer en nitrógeno
líquido en un vaso de vacío forrado en vidrio, y tras el
enfriamiento rápido de este modo se introdujeron en un recipiente
numerado en un gran vaso Dewar que contenía nitrógeno líquido en el
que debían almacenarse las larvas.
Etapa
6
Tras una semana, y en el mismo día, se retiró
cada uno de los tres tubitos del recipiente numerado y se
descongelaron mediante el mantenimiento del tubito en un baño de
agua a 20ºC hasta que se observó que el núcleo de hielo en el tubito
se fundió. Entonces se cortó el extremo del tubito y se descargaron
el líquido y las larvas en un volumen igual de agua marina en un
vaso de vidrio (vidrio de reloj de vidrio sólido y transparente).
Tras dos minutos, se añadió un volumen de agua marina igual al
volumen de la mezcla de mezcla de crioconservación / agua marina /
larvas combinada. Tras otros dos minutos, se añadió la mezcla a un
gran volumen (aproximadamente un litro) de agua marina en un
acuario de plástico transparente. Tras dos minutos, se retiraron las
larvas de este gran volumen de agua marina vertiéndolas suavemente
sobre un tamiz de 64 micras y se añadieron a un volumen similar de
agua marina
limpia.
limpia.
Se repitió este procedimiento y se mantuvieron
lotes de larvas, con un número de aproximadamente 200 larvas por
lote, en agua marina esterilizada con una densidad de
aproximadamente una larva por ml en vasos de vidrio a 12ºC durante
un periodo de siete días.
El segundo día tras la alimentación, se alimentó
a las larvas mediante la introducción de 5 ml de un cultivo vivo de
tetraselmis suecica. Se agitaron y observaron diariamente los
recipientes, y se sustituyó el agua y se volvió a alimentar a las
larvas el tercer día.
Se determinó el número total de larvas
recuperadas del tubito para cada tubito de repetición tras tres
horas. Tras un periodo de siete días se determinó el número total de
larvas que podían moverse independientemente, que estaban
evidentemente vivas y que mostraban signos de una diferenciación
adicional del cuarto segmento setígero, y se calculó la tasa de
supervivencia como el número de tales larvas como un porcentaje de
aquellas que se había observado que estaban presentes tras tres
horas.
Los resultados se resumen en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
| Nº de código | Nº total de larvas viables | Nº de larvas vivas que | Tasa de supervivencia |
| de repetición | observadas tres horas después de | pueden moverse | observada (%) |
| retirarlas del nitrógeno líquido | el día siete | ||
| 1 | 222 | 192 | 86,5 |
| 2 | 162 | 116 | 71,6 |
| 3 | 159 | 129 | 81,1 |
| Total | 543 | 437 | 80,48 |
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Etapa
1
Se seleccionó un espécimen hembra de Nereis
(Neanthes) virens criado desde el nacimiento en condiciones de
producción comercial a una temperatura en el intervalo de
18-20ºC durante toda la vida, y en condiciones
fotoperiódicas ambientales y alimentada con alimentos patentados,
para los fines de suministro de larvas para la conservación por
medio de la invención.
Se observó mediante biopsia celómica que los
ovocitos primarios de la hembra tenían un diámetro medio superior a
190 micras y que tenían un halo translúcido transparente. Se retiró
una muestra de los ovocitos mediante biopsia celómica usando una
jeringa hipodérmica acoplada con una aguja adecuada y se mezcló con
una pequeña muestra de espermatozoides diluida en agua marina para
establecer que los ovocitos podían experimentar una reacción de
fertilización tal como es característico para esta especie. Se
mantuvo adicionalmente la muestra de ovocitos durante un periodo de
diez días para garantizar que los huevos fertilizados podían
desarrollarse hasta la fase en la que han desarrollado tres pares
de parapodios en los que habían surgido cerdas (la fase
nechtochaete) y habiendo confirmado esto que las hembras se usaban
como fuente de ovocitos que, tras la fertilización, proporcionarían
una fuente de gusanos jóvenes para los fines del procedimiento.
Se llevó a cabo la fertilización de la siguiente
manera:
Se tomó una muestra de aproximadamente 2 ml de
fluido celómico de un macho en el que se observó que había numerosos
espermatozoides disociados en el fluido corporal. Se introdujo la
muestra de fluido celómico en una muestra de agua marina de
aproximadamente 100 ml de volumen. Se introdujo una alícuota de esta
mezcla de agua marina y esperma con un volumen de aproximadamente 25
ml en una muestra de agua marina de tal manera que el volumen final
fue de aproximadamente 250 ml.
Se provocó que los ovocitos primarios de la
hembra seleccionada, en un número de aproximadamente 750.000, se
liberaran en la mezcla de agua marina y esperma en la que entrarían
en contacto con los espermatozoides y se fertilizarían casi
instantáneamente.
Se examinó una muestra de los ovocitos para
confirmar que una elevada proporción de los ovocitos (casi el 100%)
mostraba la membrana de fertilización ligeramente elevada, que es
una evidencia de que ha tenido lugar una reacción de fertilización
fecunda, y se diluyeron los ovocitos en un volumen de cinco litros
de agua marina. Se tomaron muestras de esta suspensión de huevos
fertilizados / agua marina para fines de estimación del número total
de huevos presentes. Posteriormente se transfirieron los huevos a
bandejas de poca profundidad en cinco litros de agua marina con una
densidad de 20.000 huevos fertilizados por bandeja.
Etapa
2
Las larvas se desarrollaron en bandejas durante
un periodo de diez días a una temperatura de 12ºC sin alimentación
ni adición de alimentos de ningún tipo.
Etapa
3
El décimo día tras haberlas fertilizado, se
concentraron las larvas vertiendo la mezcla de agua marina y larvas
a través de un tamiz construido mediante el encolado de una malla de
64 micras a una tubería de UPVC para uso doméstico de longitud
adecuada con un diámetro interno de 15 cm. Así se concentraron un
total de 70.000 larvas. Se introdujo un número de larvas adecuado
para su introducción en un total de 12 tubitos de 0,5 ml con una
densidad máxima de 2.000 larvas por tubito en un volumen de DMSO al
13,8% en agua marina tal que la concentración final de DMSO fue del
10% en volumen, y se introdujo la mezcla resultante en doce tubitos
de plástico en un periodo de tres minutos y se cargaron en soportes
de tubitos adecuados para el aparato que debía usarse para el fin
de enfriar las larvas.
Etapa
4
Se llevaron los tubitos hasta una temperatura
inicial de 20ºC y luego se enfriaron desde la temperatura inicial de
20ºC a una velocidad de 2,5ºC por minuto hasta una temperatura de
-35ºC, y luego se mantuvieron a esa temperatura durante un
minuto.
Etapa
5
Se retiraron los tubitos de la cámara del
congelador de velocidad controlada y se dejaron caer en nitrógeno
líquido en un vaso de vacío forrado en vidrio, y tras el
enfriamiento rápido de este modo se introdujeron en un recipiente
numerado en un gran vaso Dewar que contenía nitrógeno líquido en el
que debían almacenarse las larvas.
Etapa
6
Tras un periodo de un mes (aproximadamente
treinta días) se retiraron un total de treinta y seis tubitos que
contenían larvas enfriadas del nitrógeno líquido en lotes de ocho
tubitos. Se descongelaron ocho tubitos a 20ºC en cada tratamiento de
lote y se descargaron los contenidos de los ocho tubitos en un vaso
de medidas de vidrio y se añadió un volumen igual de agua marina.
Tras dos minutos se añadió otro volumen igual de agua marina y tras
otros dos minutos, se vertió la mezcla sobre un tamiz de nylon y se
lavaron las larvas retenidas sobre el tamiz en un gran volumen
(aproximadamente cinco litros) de agua marina en el acuario de
plástico transparente. Tras dos minutos, se retiraron las larvas de
este gran volumen de agua marina vertiéndolas suavemente sobre un
tamiz de 64 micras y se añadieron a un volumen similar de agua
marina limpia. Se repitió este procedimiento hasta que se hubieron
descongelado un total de treinta y seis tubitos. Tras tres horas, se
determinó el número de larvas disponibles mediante el recuento del
número de larvas encontradas en una submuestra de una micra tomada
de un litro de agua marina en el que se habían dispersado las larvas
mediante agitación.
Se transfirieron las larvas a bandejas de poca
profundidad con una densidad de 12.000 larvas por bandeja y
aproximadamente cinco litros agua marina filtrada sobre una micra,
pero no esterilizada, por bandeja.
Tras dos días se alimentó a las larvas mediante
la introducción de una cantidad de Tetraselmis suecica. Se
agitaron y removieron las larvas mediante el levantamiento de las
bandejas dos veces al día y se cambió el agua marina y se volvió a
alimentar a las larvas el tercer día.
Se mantuvieron las larvas a 12ºC durante un
periodo de siete días, y tras este periodo se tomaron submuestras
para determinar la proporción aproximada de animales que se habían
recuperado y eran aparentemente viables.
Las submuestras mostraron que se habían
recuperado aproximadamente 70.000 del nitrógeno líquido y que de
esas larvas aproximadamente 35.000 habían sobrevivido y eran
aparentemente viables, continuando a poder moverse, alimentarse y
comenzando el proceso de diferenciación de la bolsa de cerdas en el
cuarto setígero.
En el séptimo día tras la recuperación inicial
del nitrógeno líquido se transfirieron las 35.000 larvas
supervivientes a un único lote en condiciones adecuadas para su
posterior crecimiento para fines comerciales para el suministro como
cebos para mercados de cebos para pescadores marinos mediante la
introducción en un lecho de hormigón con un área total de 2
m^{2}.
Se alimentó a los gusanos larvarios y se
mantuvieron a 18-20ºC con condiciones fotoperiódicas
de día largo (L:O 16:8).
Tras un periodo de siete semanas desde el momento
en que se introdujeron las larvas en los tanques de hormigón, se
tomaron submuestras de los animales por medio de la inserción de un
dispositivo con núcleo de plástico circular con un área de 0,00785
m^{2}. Se recuperaron los gusanos de las submuestras mediante la
agitación repetida de la mezcla de arena con agua marina y vertiendo
la mezcla tras unos minutos sobre un tamiz de malla de 64 micras,
tal como podría usarse convenientemente para recuperar pequeños
animales de una mezcla de arena y
agua.
agua.
Se determinó el número de animales recuperado.
Para dos muestras, se determinó la longitud media de los animales
recuperados cuando se relajaron en etanol al 5% en agua marina
mediante la medición de todos los animales intactos presentes.
Se determinó el número de segmentos presentes en
los animales supervivientes no dañados.
Se realizaron estas observaciones con el fin de
establecer si los animales se habían desarrollado o no
posteriormente en condiciones de cultivo adecuadas para fines
comerciales tales como para la fase de crecimiento para el fin del
suministro de ragworms pasa su uso como cebos por pescadores
marinos, y de manera comparable a gusanos jóvenes que no se habían
sometido al procedimiento de conservación.
Los números de animales recuperados se muestran
en la tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
| Muestra | Número |
| 1 | 37 |
| 2 | 40 |
| 3 | 46 |
| Nº medio | 41 |
| Desviación estándar | 4,58 |
| Área del lecho = 2 m^{2} | Área de la muestra = 0,00785 |
| Nº total estimado de supervivientes | 10.445 |
Los datos obtenidos mediante el examen de los
animales en las muestras 1 y 2 se muestran en la tabla 4.
| Muestra 1 | Muestra 2 | ||
| Longitud | Nº de segmento | Longitud | Nº de segmento |
| 0,8 | 39 | 1,5 | 43 |
| 1,7 | 31 | 1,3 | 50 |
| 1,4 | 40 | 1,2 | 42 |
| 1,8 | 42 | 0,8 | 30 |
| 1,6 | 29 | 1,0 | 36 |
| 1,5 | 36 | 0,7 | 40 |
| 0,7 | 42 | 1,1 | 41 |
| 0,8 | 40 | 2,0 | 29 |
| 0,9 | 35 | 0,6 | 35 |
| 1,2 | 45 | 1,9 | 24 |
| 1,0 | 24 | 1,5 | 30 |
| 1,1 | 39 | 1,3 | 36 |
| 1,3 | 44 | 1,2 | 27 |
| 1,9 | 46 | 1,5 | 41 |
| 1,3 | 37 | 1,6 | 36 |
| 1,5 | 41 | 1,1 | 38 |
| 0,7 | 26 | 0,7 | 45 |
| 1,7 | 0,4 | 25 | |
| 0,7 | n = 17 | 0,5 | 31 |
| 1,3 | medio = 38,12 | 1,0 | 43 |
| 0,8 | de = 5,80 | 1,1 | 44 |
| 0,6 | 1,5 | 43 | |
| 0,7 | 1,4 | ||
| 1,3 | 0,7 | n = 22 | |
| 0,5 | 1,1 | medio = 36,77 | |
| 0,4 | 0,8 | de = 7,15 | |
| 0,6 | 0,7 | ||
| 0,5 | 1,2 | ||
| 1,0 | 1,0 | ||
| 1,1 | 0,6 |
(Continuación)
| Muestra 1 | Muestra 2 | ||
| Longitud | Nº de segmento | Longitud | Nº de segmento |
| 1,3 | |||
| n = 30 | 1,1 | ||
| medio = 1,08 | 0,7 | ||
| de = 0,429 | 0,4 | ||
| 0,5 | |||
| n = 36 | |||
| medio = 1,04 | |||
| de = 0,424 |
La tasa de crecimiento y la tasa de proliferación
de los segmentos indican que los animales recuperados del nitrógeno
líquido se han desarrollado a una tasa que no es diferente de la de
animales producidos de otro modo que crecen en tales condiciones. El
número de animales recuperado indica que la mortalidad de los
animales no ha sido diferente de la de animales producidos de otro
modo introducidos a esta edad en condiciones similares.
Claims (18)
1. Método para conservar larvas de poliqueto
(Polychaeta) que comprende enfriar rápidamente las larvas que
se han desarrollado hasta la fase en la que tienen tres parapodios
que presentan cerdas bien desarrollados, y conservar o almacenar las
larvas en condiciones criogénicas.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
las larvas se conservan antes de alcanzar la fase de desarrollo en
la que su cuarto segmento se ha desarrollado hasta el punto de que
están presentes cerdas compuestas que han aparecido.
3. Método para conservar larvas de poliqueto
(Polychaeta) que comprende enfriar rápidamente las larvas que
se han desarrollado hasta la fase en la que tienen un sistema
digestivo diferenciado con una luz, y conservar o almacenar las
larvas en condiciones criogénicas.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
las larvas no han introducido alimentos en la luz del sistema
digestivo.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las larvas sustancialmente no
han ingerido alimentos.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las larvas han usado
sustancialmente todos los lípidos en el sistema digestivo.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las larvas se someten a
deshidratación a baja temperatura antes de enfriar rápidamente.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las larvas se someten a un
procedimiento que conduce a la vitrificación al enfriar
rápidamente.
9. Método según la reivindicación 8, en el que el
procedimiento se lleva a cabo atemperatura ambiente.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el enfriamiento rápido se
lleva a cabo mediante la inmersión de las larvas en nitrógeno
líquido.
11. Método para recuperar larvas conservadas
mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, que comprende retirar las larvas del almacenamiento
criogénico.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las larvas son de gusanos que
son miembros del orden de los Phyllodocida.
13. Método según la reivindicación 12, en el que
los gusanos pertenecen a la familia de los Nereidae.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
los gusanos son de la especie Nereis (Neanthes) virens.
15. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que las larvas son de gusanos que son
miembros del orden de los Eunicida.
16. Método según la reivindicación 15, en el que
los gusanos pertenecen a la familia de los Eunicidae.
17. Método según la reivindicación 16, en el que
los gusanos son miembros del género Marphysa.
18. Método de acuicultura de gusanos poliquetos
(Polychaeta), en el que las larvas de dichos gusanos se
crioconservan durante un periodo de tiempo predeterminado según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, se recuperan de la
crioconservación y se les deja desarrollarse en gusanos.
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